nmx-f-070-1964. método de prueba para la determinación

RECOPILADO POR:
EL PROGRAMA UNIVERSITARIO DE ALIMENTOS
NMX-F-070-1964. MÉTODO DE PRUEBA PARA LA DETERMINACIÓN DE
TIAMINA. THIAMINE DETERMINATION. TEST METHOD. NORMAS
MEXICANAS. DIRECCIÓN GENERAL DE NORMAS.
ASUNTO
Con fundamento en lo dispuesto en los Artículos 1o., 2o., 4o., 23 inciso C y 26 de la
Ley General de Normas y de Pesas y Medidas, publicada en el Diario Oficial de la
Federación con fecha 7 de abril de 1961, esta Secretaría ha aprobado la siguiente Norma
de MÉTODO DE PRUEBA PARA LA DETERMINACIÓN DE TIAMINA.
1.
DEFINICIÓN Y GENERALIDADES
1.1
Definición
Esta Norma establece el Método para la determinación de Tiamina, las condiciones en
las que deberá realizarse, sus especificaciones y campo de aplicación.
1.1.1
Tiamina
Se conoce con el nombre de Tiamina, la vitamina B1, que forma parte del complejo
vitamínico B.
1.2
Generalidades
1.2.1
Campo de aplicación
Este método es aplicable en los análisis físico-químicos de productos terapéuticos o
dietéticos.
1.2.2
Fundamento
Se basa en la transformación que sufre la Tiamina pasando a Tiocromo por la acción
que sobre ella ejerce el reactivo oxidante, siendo en esta forma determinada su
fluorescencia y por consiguiente la valoración de la Tiamina.
2.
CLASIFICACIÓN Y ESPECIFICACIONES
2.1
Clasificación
Esta Norma establece un sólo método para la determinación de la Tiamina, el método
del tiocromo.
2.2
Especificaciones
2.2.1
Equipo
Potenciómetro, centrífuga, autoclave o baño de vapor, fluorímetro, refrigerador, balanza
analítica, estufa eléctrica y material usual de laboratorio.
Tubo para cambio de bases.- El tubo de vidrio para cambio de bases, tiene una longitud
total de 200 mm con un depósito en el extremo superior de 50 mm de largo y 20 mm de
diámetro y convergente del tubo de adsorción que es de 5 a 6 mm de diámetro interno y
unos 140 mm de longitud. El extremo inferior del tubo termina en un capilar de 10 mm
de longitud y de un diámetro tal que, cuando está cargado, la velocidad del flujo no será
superior a un ml/min.
Acondiciónese el tubo para usarse, colocando sobre el extremo superior del tubo capilar
y con ayuda de una varilla de vidrio, un tapón frío de lana de vidrio fina. Agréguese una
suspensión acuosa de 1 a 2 g de silicato de sodio purificado para cambio de base al tubo
de adsorción cuidando de arrastrar por lavado el silicato de las paredes del recipiente.
Para mantener el aire fuera de la columna de adsorción, se mantendrá una capa del
líquido sobre la superficie del silicato durante el proceso de adsorción. Se evitará que el
tubo se vacíe colocándole un casquete de hule (lleno de agua para evitar la inclusión del
aire) en el extremo inferior del tubo capilar.
2.2.2
Material
2.2.2.1 Reactivos
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•
•
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•
•
•
•
•
•
Silicato de sodio.
Acetato de Sodio.
Verde de Bromocresol.
Hidróxido de Sodio.
Azul de timol.
Enzima diastásica.
Acido Acético.
Cloruro de potasio.
Ferricianuro de potasio.
Sulfato de quinina.
Acido Sulfúrico.
Clorhidrato de Tiamina.
Pentóxido de fósforo.
Alcohol etílico.
Acido clorhídrico.
Alcohol Isobutílico.
Sulfato de sodio anhidro.
2.2.2.2
Preparación de soluciones
2.2.2.2.1
Solución 2 N de acetato de sodio
(NaC2H3O2 3H2O). Disuélvanse 275 g de acetato de sodio reactivo en suficiente agua
para hacer 100 ml.
2.2.2.2.2
Indicador verde de bromocresol para pH
Disuélvase 0.1 g de indicador con 2.8 ml de NaOH 0.05 N y dilúyase a 200 ml con agua
destilada.
2.2.2.2.3
Indicador azul de timol para pH
Disuélvase 0.1 g de indicador cpn 4.3 ml de NaOH 0.05N y dilúyase a 200 ml con agua
destilada.
2.2.2.2.4
Solución de enzima
Prepárese para ser usada el mismo día una solución acuosa al 10% de un producto de
actividad patente diastásica como fosforolítica.
2.2.2.2.5
Sulfato para cambio de bases
Purifíquese un silicato de sodio preparado artificialmente en polvo granuloso del tipo
para cambio de bases, que pase por un tamiz de malla de 50 a 80 hilos/cm2 de la manera
siguiente: Póngase una cantidad conveniente de 100 a 500 g de silicato para cambio de
bases, en un vaso de precipitados apropiado, agréguese suficiente ácido acético caliente
al 3% hasta cubrir el material y hiérvase de 10 a 15 minutos, agitando con frecuencia.
Déjese sedimentar y decántese el líquido sobrenadante. Repítase este lavado tres veces.
Lávese tres veces de la misma manera con una solución de cloruro de potasio caliente al
20% y finalmente lávese con agua hirviente, hasta que el último lavado no dé reacción
de cloruro. Deséquese el material a unos 100°C y guárdese en vasos bien tapados.
2.2.2.2.6
Solución neutra de cloruro de potasio
Disuélvase 250 g de cloruro de potasio reactivo en suficiente agua para hacer 1000 ml.
2.2.2.2.7
Solución ácida de cloruro de potasio
Agréguese 8.5 ml de ácido clorhídrico a 1000 ml de solución neutra de cloruro de
potasio.
2.2.2.2.8
Solución de hidróxido de sodio al 15%
Disuelvase 15 g de hidróxido de sodio en suficiente agua para hacer 100 ml.
2.2.2.2.9
Solución de ferricianuro de potasio al 1%
Disuélvase 1 g de ferricianuro de potasio en suficiente agua para hacer 100 ml. Esta
solución tiene que prepararse el día de su uso.
2.2.2.2.10
Reactivo oxidante
Prepárese mezclando 4.0 ml de solución de ferricianuro de potasio al 1% con suficiente
solución de hidróxido de sodio al 15% para hacer 100 ml. Esta solución deberá usarse
dentro de las cuatro horas de su preparación.
2.2.2.2.11
Solución madre de sulfato de quinina
La solución de sulfato de quinina se prepara disolviendo 10 mg de sulfato de quinina en
suficiente solución 0.1 N de ácido sulfúrico, para hacer 1000 ml. Consérvese esta
solución en recipientes de vidrio color ámbar.
2.2.2.2.12
Solución tipo de sulfato de quinina
Dilúyase un volumen de la solución madre de sulfato de quinina con 3 volúmenes de
solución 0.1 N de ácido sulfúrico. Esta solución presenta una fluorescencia
aproximadamente del mismo grado que el tiocromo obtenido de una microgramo de
tiamina. Consérvese esta solución en recipientes de vidrio color ámbar.
2.2.2.2.13
Solución madre de clorhidrato de tiamina
Pésense con precisión de 0.1 mg por lo menos 25 g de clorhidrato de tiamina patrón,
que se ha mantenido en un desecador con pentóxido de fósforo, por lo menos durante 16
horas. Siendo el patrón higroscópico, se tomarán precauciones para impedir la absorción
de humedad. Disuélvase en alcohol etílico al 20% ajustado a un pH de 3.5 a 4.3 con
ácido clorhídrico y llévese hasta un volumen de 1000 ml. La solución madre de
clorhidrato de tiamina, podrá prepararse también empleando alcohol etílico al 25% y
ácido clorhídrico en cantidad suficiente para obtener una solución 0.5 N
aproximadamente. Póngase en el refrigerador a 4°C aproximadamente en un recipiente
bien cerrado, de color ámbar.
2.2.2.2.14
Solución tipo de clorhidrato de tiamina
De una porción de la solución madre, a la temperatura ambiente, transfiérase un alícuota
conteniendo precisamente 100 microgramos de clorhídrato de tiamina a un matraz
aforado de 100 ml y dilúyase a 100 ml con agua destilada ajustada a pH de 3.5 a 4.3 con
ácido clorhídrico. Cada ml de esta solución contiene un microgramo de tiamina. Las
diluciones que se efectúan con esta solución serán tratadas de la misma manera que las
empleadas en la preparación de la solución para determinación, con respecto a la
digestión con ácido. Tratamiento con enzimas, adsorción, elusión de la tiamina del
silicato para cambio de bases.
3.
MÉTODO DE PRUEBA
3.1
Procedimiento
3.1.1
Preparación de la solución para valoración
La cantidad de material tomada para la determinación será tal, que la proporción del
volumen de solución 0.1 N de ácido sulfúrico, usado para la extracción, sea por lo
menos 15 a 1 con respecto a la cantidad de muestra y al contenido de tiamina
equivalente de 3 a 100 microgramos de clorhidrato de tiamina. Póngase la cantidad de
material por determinar, pesado con precisión de 0.1 mg, en 65 ml de solución 0.1N de
ácido sulfúrico contenidos en un tubo de centrífuga de 100 ml y digiérase a baño de
vapor, mezclándose con frecuencia durante 30 minutos o caliéntase en autoclave de
121°C a 123°C durante 15 minutos. El líquido tiene que quedar ácido durante la
digestión, si no es francamente ácido al indicador azul de timol, agréguese suficiente
ácido sulfúrico diluido para hacerlo ácido. Enfríese y ajústese el pH entre 4 y 4.5 por la
adición de la solución 2N de acetato de sodio usando verde de bromocresol como
indicador externo en placa adecuada. Agréguense 5 ml de la solución de enzima,
mézclese e incúbese de 455 a 50°C durante 3 horas. Enfríese, centrifúguese la mezcla
hasta que el líquido sobrenadante sea limpio o plásticamente límpido, transfiérase
cuantitativamente el líquido sobrenadante a un matraz aforado de 100 ml. Lávese el
residuo centrifugado con 10 ml y luego con 5 ml de ácido sulfúrico 0.1N y agréguense
los lavados al líquido sobrenadante y dilúyase con agua hasta aforo de 100 ml. Pásese
por el tubo para cambio de bases ya acondicionado, una parte alícuota de la solución
conteniendo de 5 a 10 microgramos de tiamina; lávese el tubo con tres porciones de
agua destilada hirviente de 5 ml cada una, teniendo cuidado de evitar que la superficie
del líquido baje de la superficie del silicato. Hágase la elución de la tiamina del silicato
para cambio de bases pasando por el tubo sucesivamente pequeñas porciones de la
solución ácida caliente de cloruro de potasio. Recójanse los primeros 15 ml o 20 ml de
líquido en un matraz aforado de 25 ml, enfríese y dilúyase a un volumen de 25 ml, con
solución ácida de cloruro de potasio. Esta solución constituye la solución para la
valoración.
3.1.2
Oxidación de la Tiamina a Tiocromo y medición de la Fluorescencia
Determínese el contenido de Tiamina en la solución para valoración ya oxidada,
comparando la intensidad de fluorescencia de un extracto de esta solución expuesta a
los rayos ultravioleta de la longitud de onda de 350 mm y a 400 mm con la solución tipo
de clorhidrato de tiamina. La intensidad de la fluorescencia es proporcional a la cantidad
de tiamina presente y puede ser medida con ayuda de un instrumento para tal objeto.
Para oxidar la tiamina o tiocromo, agréguense a cantidades que contengan de 0.10 a 2.0
microgramos de tiamina en la solución tipo de clorhidrato de tiamina tratada de manera
similar, suficiente solución ácida de cloruro de potasio para hacer un volumen de 5 ml.
Luego agréguense mezclando, 3 ml de residuo oxidante y dentro del lapso de 2 minutos
añádanse 13 ml de alcohol isobutílico y agítese vigorosamente durante 2 minutos.
Cetrifúguese la mezcla a baja velocidad hasta que el líquido sobrenadante sea límpido.
Mídase en un fluorímetro la intensidad de la fluorescencia de la solución isobutílica
directamente, si es límpida o si es turbia después de agitar con 2 g de sulfato de sodio
anhidro. Compárese con ésta, la intensidad de fluorescencia, producida después de
oxidar la solución tipo de clorhidrato de tiamina. La solución tipo de sulfato de quinina
es usada para controlar la igualdad de resultados con el del instrumento. Tendrá que
hacerse una corrección para la fluorescencia producida por otras substancias que no son
la tiamina y de la solución que se valora, tratada como se indico antes, pero empleado
solución de hidróxido de sodio al 15% que reemplazará al reactivo oxidante.
3.1.3
Cálculos
mg de tiamina
=
1.0 x (A - B) (S - D)
Donde:
A
B
=
=
S
=
D
=
al 15%.
fluorescencia del alcohol isobutílico.
Fluorescencia del extracto de la solución de ensayo tratado con 3 ml de
NaOH al 15%.
Medida de fluorescencia del extracto de la solución tipo.
Fluorescencia del extracto de la solución tipo tratado con 3 ml de NaOH
Fecha de aprobación y publicación: Julio 25, 1964