ESTUDIO FITOQUÍMICO DEL EXTRACTO ETANÓLICO DEL

ESTUDIO FITOQUÍMICO DEL EXTRACTO ETANÓLICO DEL LIQUEN Usnea
antarctica, PROCEDENTE DE LA ANTÁRTIDA
Por
Rafael Viteri Espinoza.
Trabajo de Grado presentado como requisito parcial para optar
al título de Magister Scientiarum, mención Química.
INSTITUTO VENEZOLANO DE INVESTIGACIONES CIENTÍFICAS
I.V.I.C
CENTRO DE ESTUDIOS AVANZADOS
ALTOS DE PIPE
ENERO, 2015.
Resumen del Trabajo de Grado presentado como requisito parcial para optar al
título de Magister Scientiarum, mención Química.
ESTUDIO FITOQUÍMICO DEL EXTRACTO ETANÓLICO DEL LIQUEN Usnea
antarctica, PROCEDENTE DE LA ANTÁRTIDA
Por
Rafael Viteri Espinoza.
CENTRO DE ESTUDIOS AVANZADOS
INSTITUTO VENEZOLANO DE INVESTIGACIONES CIENTÍFICAS
I.V.I.C
ALTOS DE PIPE, ENERO, 2015
Franklin Salazar
Tutor del Trabajo de Grado
Los líquenes son asociaciones simbióticas entre un hongo y un alga, lo
que les permite obtener características morfológicas y fisiológicas distintas a
aquellas que presentan sus componentes por separado. En la Antártida existen
cerca de 200 especies de líquenes, no obstante el continente antártico sigue
siendo inexplorado en comparación con los territorios terrestres, lo que indica
que hay mayor probabilidad de encontrar nuevos productos naturales. Los
estudios químicos realizados al género Usnea son muy variados, sin embargo,
de la especie Usnea antarctica, no hay reportes publicados.
En este trabajo se realizó el estudio químico del extracto etanólico del
liquen U. antarctica recolectado en la Isla Greenwich, una de las Islas Shetland
del Sur en la Antártida. A partir de la fracción soluble en CHCl3 se aislaron
cuatro compuestos, los cuales fueron caracterizados por UV, IR, EM, RMN 1H,
RMN 13C, COSY, NOESY, HMQC y HMBC. Tres dibenzonfuranos uno reportado
en la literatura y nombrado como ácido úsnico (Compuesto A), y dos reportados
en este trabajo por primera vez, llamados ácido desmetil seudoplacodiólico
(Compuesto C1) y ácido desmetil placodiólico (Compuesto C2), aislados como
una mezcla en una proporción 72:28, (respectivamente). Y una depsidona
conocida, llamada ácido cetrárico (Compuesto B).
A Dios.
A mis padres y hermanos.
AGRADECIMIENTOS
A Dios primero que nada, por todas sus bendiciones.
A mis padres, pilares fundamentales en mi vida, hermanos, tíos y primos.
A mi novia Brenda López, por ser incondicional conmigo.
A mi tutor de Tesis, Dr. Franklin Salazar por su apoyo, tiempo y paciencia.
Al Dr. José Villamizar, por su valioso aporte.
Al Dr. Alberto Quintero por todo su apoyo.
Al Centro de Investigaciones Biotecnológicas del Ecuador CIBE-ESPOL,
especialmente a la Dra. Esther Lilia Peralta, Patricia Manzano y Juan Manuel
Cevallos.
Al Centro de Oceanología y Estudios Antárticos (COEA) especialmente al Dr.
Juan Alfonso por su apoyo constante, a la Dra. Soraya Silva, Abraham Mora,
Marie Rose, Helga Handt, Juan Manuel (100 pal cochino) y disculpen si se me
olvida alguno, muchas gracias.
A mi asesor en cromatografía liquida de alta eficiencia (HPLC), Carlos Ibarra.
Muy especialmente a mis amigas Fátima Rodríguez y Libia Julio (madre y
abuela en Venezuela), Kellysinha, José Mora, Jennifer, Mariel.
A mis compañeros de laboratorio, por ser tan especiales, la Sra. Eleonora,
Alejandra Ugarte, Dioni Arrieche, Raúl Cedeño, Wilmer Mendoza, Favio
Contreras (El zurdo).
Al laboratorio de RMN del IVIC, muy especialmente a Ligia Llovera, Daniela
Briceño, María Nuñez y Alberto Fuentes, por el gran servicio prestado.
vi
Al laboratorio de Espectrometría de Masas, especialmente a Janeth Salas y Ana
Angarita, por su colaboración.
Al laboratorio de Análisis Instrumental del Centro de Química del IVIC,
especialmente a Liz Cubillán por el servicio prestado en la realización de los
espectros infrarrojos.
Al laboratorio de Fisicoquímica orgánica (Dr. Gabriel Chuchani), especialmente
a Alexis Maldonado y Loriett Cartaya por su colaboración en la realización de los
de los GM y UV-Vis.
Al laboratorio de Fotoquímica (Dra. Tamara Zoltan), especialmente a Marcel
Inojosa por su colaboración en la realización de los GM.
A la biblioteca Marcel Roche del IVIC y a todo su personal, por sus servicios.
Al Instituto Antártico Ecuatoriano (INAE) por el auspicio y apoyo brindado
durante de XVII Expedición Ecuatoriana a la Antártida, especialmente al
Comandante José Olmedo.
A la Secretaria de Educación Superior, Ciencia Tecnología e Innovación de
Ecuador por el financiamiento prestado durante el postgrado.
Al IVIC por el apoyo logístico y financiero que me permitió el desarrollo y
culminación de este trabajo.
Al CEA, y al Centro de Química, especialmente el Laboratorio de Síntesis
Orgánica y Productos Naturales.
vii
ÍNDICE GENERAL
Página
Resumen………………………………………………………………………..
iii
Agradecimientos……………………………………………………………….
vi
Lista de Tablas…………………………………………………………………
ix
Lista de Figuras………………………………………………………………..
xi
Lista de abreviaturas y símbolos……………………………………………..
xiv
1. Introducción………………………………………………………………….
1
2. Objetivos……………………………………………………………………..
35
3. Parte experimental………………………………………………………….
36
4. Resultados y discusión……………………………………………………..
45
5. Conclusiones………………………………………………………………..
89
6. Bibliografía…………………………………………………………………..
90
7. Hoja Curricular………………………………………………………………
99
viii
LISTA DE TABLAS
Tabla
Página
I
Valores de ICM del acido úsnico………………………………………..
16
II
Concentracion minima inhibitora (ICM, mg/mL) del compuesto 35…
17
III Actividad antimicrobial de extractos de Protousnea poeppigii y
compuestos 36, 37, 38, 40 y 26 (ICM, µg/mL)……………………......
18
IV Efectos de los compuestos 51-55 contra epimastigotes de T.
cruzi………………………………………………………………………...
22
Efecto inhibitorio de los compuesto 56, 57, 23 y extracto MeOH
después de 24 y 72 horas (expresado en IC50, µg/mL)………………
23
VI Actividad antibacterial (zona de inhibicion, cm) de diferentes
extractos de Usnea ghattensis y antibióticos estándares……………
24
VII Zona de inhibición (mm) de extractos de Usnea ghattensis contra
microorganismos patógenos.…………………………………………...
25
VIII Actividad antibacterial (zona de inhibicion, cm) de diferentes
extractos de Usnea ghattensis y antibióticos estándares……………
25
IX Distribucion de los valores de ICM50 y ICM90 para aislado de H.
pylori………………………………………………………………………..
27
Comparacion de resistencia a claritromicina y el compuesto 26……
27
XI Valores calculados en ICM de los compuestos 75-79, 35, 48 y 52…
32
XII Origen de los metabolitos ensayados………………………………….
32
XIII Análisis químico del extracto etanólico de Usnea antarctica………..
45
XIV Análisis químico de la fracción hexánica y clorofórmica de Usnea
antarctica…………………………………………………………………..
47
XV Peso de las subfracciones obtenidas de la Fracción Clorofórmica
(FCUa)……………………………………………………………………..
47
XVI Subfracciones obtenidas de FCSF5……………………………………
48
V
X
ix
XVII Comparación de los resultados obtenido por RMN del compuesto
A……………………………………………………………………………
53
XVIII Resultados del experimento RMN-2D HMBC para el compuesto A..
55
XIX Comparación de las señales obtenidas en RMN del compuesto B
con datos reportados en la literatura…………………………………...
64
XX Resultados del experimento RMN-2D HMBC para el compuesto B..
69
XXI Comparación de los desplazamientos químicos de RMN 1H del
compuesto A con los desplazamientos del compuesto C1………….
75
XXII Comparación de los desplazamientos químicos de RMN 13C del
compuesto A con los desplazamientos del compuesto C1………….
78
XXIII Resultados de los experimentos de RMN correspondiente al
compuesto C1……………………………………………………………
84
XXIV Desplazamientos químicos de RMN 1H y RMN 13C para los ácidos
seudoplacodiólico (C1) y placodiólico (C2) en CDCl3 (ppm)………..
86
x
LISTA DE FIGURAS
Figura
Página
1
Representacion grafica de diferentes tipos de drogas
(1981-2010)……………………………………………………………..
4
2
Vía del Ácido Shikímico para la biosíntesis de polifenoles………..
9
3
Vía del Mevalonato para la biosíntesis de monoterpenos…………
10
4
Vía del Mevalonato para la biosíntesis de di y triterpenos………...
11
5
Ciclación del escualeno para formar triterpenos……………………
12
6
Vía del Polimalonato para la biosíntesis de depside y depsidones
12
7
Vía del Polimalonato para la biosíntesis de polifenoles……………
13
8
Estructura del liquen Usnea antarctica. med: médula, cor:
corteza, al: alga, axis: axis central……………………………………
15
9
Actividad captadora del radical DPPH de los compuestos 41-45,
47, 26, 48 y BHT……………………………………………………….
19
10
Proceso de extracción separación y purificación del extracto
etanólico liquen Usnea antarctica…………………………………….
46
11
Cromatograma de la subfracción FCSF5-4 (en columna analítica)
48
12
Espectro ultravioleta del compuesto A………………………………
49
13
Espectro infrarrojo del compuesto A…………………………………
50
14
Espectro de masas del compuesto A………………………………..
50
15
Espectro de RMN 1H del compuesto A: Completo (a), ampliación
a campo bajo (b) y campo alto (c). (300 MHz, CDCl3)……………..
51
16
Espectro de RMN 13C del compuesto A: Completo (a),
ampliación a campo bajo (b) y campo alto (c). (125 MHz, CDCl3)
52
17
Ampliación del espectro de RMN 13C del compuesto A, a campo
alto. (125 MHz, CDCl3)………………………………………………...
53
xi
18
Espectro de HMQC del compuesto A: Completo (a) y ampliación
(b). (500 MHz, CDCl3)…………………………………………………
54
19
Espectro de HMBC del compuesto A: completo (a) y ampliación
(b). (500 MHz, CDCl3)…………………………………………………
56
20
Ampliaciones del espectro de HMBC del compuesto A (a-b). (500
MHz, CDCl3)…………………………………………………………….
57
21
Correlaciones parciales (a-b) del compuesto A (HMBC)…………..
58
22
Estructura química del compuesto A………………………………...
58
23
Espectro ultravioleta del compuesto B………………………………
59
24
Espectro infrarrojo del compuesto B…………………………………
60
25
Espectro de Masas del compuesto B………………………………..
60
26
Espectro de RMN 1H del compuesto B. (600 MHz, CDCl3)………..
61
27
Espectro de RMN 1H del compuesto B, a campo bajo (a) y campo
alto (b). (600 MHz, CDCl3)………………………………………….…
62
28
Espectro de RMN 13C del compuesto B, completo (a), a campo
bajo (b) y a campo alto (c). (125 MHz, CDCl3)……………………...
63
29
Espectro de HMQC del compuesto B, completo (a) y ampliación
(b). (500 MHz, CDCl3)………………………………………………….
65
30
Ampliaciones del espectro de HMQC del compuesto B (a-b).
(500 MHz, CDCl3)………………………………………………………
66
31
Espectro HMBC del compuesto B, completo (a) y ampliación (b).
(500 MHz, CDCl3)………………………………………………………
67
32
Ampliación del espectro de HMBC del compuesto B (a-b). (500
MHz, CDCl3)…………………………………………………………….
68
33
Ampliación del espectro de HMBC del compuesto B. (500 MHz,
CDCl3)…………………………………………………………………...
69
34
Espectro de NOESY del compuesto B (a) y ampliación (b). (500
MHz, CDCl3)…………………………………………………………….
Correlaciones parciales (a-b) del compuesto B (HMBC).
35
xii
70
(500 MHz, CDCl3)………………………………………………………
71
36
Estructura química del compuesto B………………………………...
72
37
Espectro ultravioleta del compuesto C1 y C2……………………….
73
38
Espectro infrarrojo del compuesto C1-C2…………………………...
74
39
Espectro de Masas del compuesto C1-C2…………………………..
74
40
Espectro de RMN 1H del compuesto C1. (500 MHz, CDCl3)……...
75
41
Espectro de RMN 1H del compuesto C1, a campo bajo (a) y
campo alto (b). (500 MHz, CDCl3)……………………………………
76
42
Espectro de RMN 13C del compuesto C1, completo (a), campo
bajo (b) y campo alto (c). (75.47 MHz, CDCl3)……………………...
77
43
Ampliación del Espectro HMQC del compuesto C1, donde se
observan las correlaciones de los carbonos metílicos con sus
respectivos protones. (500 MHz, CDCl3)…………………………….
79
44
Espectro HMBC del compuesto C1, completo (a) y ampliación
(b). (500 MHz, CDCl3)………………………………………………….
80
45
Ampliaciones del espectro HMBC del compuesto C1 (a-b).
(500 MHz, CDCl3)………………………………………………………
81
46
Correlaciones parciales (a-b) del compuesto C1 (HMBC)…………
82
47
Estructura química del C1……………………………………………..
83
48
Espectro de RMN 1H a campo alto para la mezcla C1-C2..............
84
49
Cromatograma de FCSF5-4-49 por GC-MS………………………...
85
50
Espectro de NOESY de FCSF5-4-49. (600 MHz, CDCl3)…………
87
51
Espectro de HMBC de FCSF5-4-49. (600 MHz, CDCl3)…………..
88
xiii
LISTA DE ABREVIATURAS Y SÍMBOLOS
AC
Antes de Cristo
AcOEt
Acetato de etilo
ADN
Ácido desoxirribonucleico
CC
Cromatografía en columna
CCF
Cromatografía de capa fina
CCFP
Cromatografía de capa fina preparativa
CH2Cl2
Diclorometano
CDCl3
Cloroformo deuterado
CHCl3
Cloroformo
c
Cuarteto
d
Doblete
DC
Después de Cristo
DMSO
Dimetilsulfóxido
DPPH
1,1-difenil-2-picrilhidrazil
EM
Espectro de Masas
HPLC
Cromatografía liquida de alta resolución
IC50
Concentración inhibitoria 50
ICM
Concentración mínima inhibitoria
IR
Infrarrojo
m
Multiplete
MeOH
Metanol
xiv
nm
Nanómetro
RMN 13C
Resonancia Magnética Nuclear de 13C
RMN 1H
Resonancia Magnética Nuclear de 1H
ROS
Especies reactivas de oxigeno
t
Triplete
s
Singlete
sa
Singlete ancho
TLC
Cromatografía de capa fina
xv
1
INTRODUCCIÓN
La Naturaleza, el maestro artesano de moléculas ha creado un arsenal de
sustancias químicas que se encuentran como un recurso infinito para el
descubrimiento de nuevos quimiotipos, farmacóforos y andamios para el
desarrollo de diferentes fármacos eficaces para una gran variedad de
enfermedades.1 Desde tiempos inmemorables, los productos naturales han sido
la columna vertebral del sistema de curación en todo el mundo. El uso de la
medicina a base de hierbas ha sido una forma tradicional para curar
enfermedades y se ha aplicado desde hace más de cinco milenios. Las plantas,
en particular, han sido la base de los sistemas de la medicina tradicional, con los
registros más antiguos, que datan de alrededor de 2600 AC, documentando los
usos de aproximadamente 1.000 sustancias derivadas de plantas en
Mesopotamia. Estos incluyen aceites de especies Cedrus (cedro) y Cupressus
sempevirens (ciprés), Glycyrrhiza glabra (regaliz), Commiphora especies (mirra),
y Papaver somniferum (adormidera), los cuales todavía se utilizan hoy en día
para el tratamiento de dolencias que van desde la tos y los resfriados a las
infecciones parasitarias y la inflamación.2 Además del uso de remedios a base
de hierbas para el tratamiento de muchas enfermedades, los productos
naturales han contribuido enormemente al desarrollo de importantes drogas
terapéuticas que se utilizan actualmente en la medicina moderna. 3 Por citar
algunos ejemplos: La planta nombrada Ma Huang, por el emperador chino Shen
Nung en su libro de hierbas llamado Pen Ts’ao hace 5100 años atrás,
tradicionalmente usada como estimulante del corazón, agente diaforético, para
el tratamiento del asma, fiebre de heno, congestión nasal y pulmonar; dicha
planta es ahora conocida como Ephedra sínica, y se sabe que contiene efedrina
1, una droga que eleva la presión sanguínea y alivia el espasmo bronquial.
Theophrasto en el siglo III AC mencionó el jugo de amapola opio como un
agente anestésico, y en el siglo X DC, Rhazes de Persia, introdujo la píldora de
opio para la tos, desórdenes mentales, dolores y molestias. Ahora, se conoce
que la amapola opio, Papaver somniferum, contiene morfina 2, un potente
2
analgésico y codeína 3, el cual es prescrito hoy en día como un supresor de la
tos.4
1
2
3
Otro ejemplo, es la corteza del árbol de quina, que era conocida por sus
propiedades curativas por los nativos americanos, pero no fue sino hasta 1638,
que sus propiedades fueron descubiertas por la Condesa de Chinchón (esposa
del Virrey, Luis Fernández de Cabrera) en Perú, cuando observó que los
curanderos nativos la empleaban para tratar las fiebres. En 1820, los químicos
franceses Pierre Pelletier y Joseph Caventou aislaron los alcaloides quinina 4 y
cinchonina 5. Desde mediados del siglo XIX hasta la década de 1940, la quinina
4 se convirtió en el tratamiento para la fiebre intermitente en todo el mundo.
Actualmente la quinina 4 cumple un papel importante en la gestión de la
malaria.5,6
4
5
El hallazgo de la penicilina es uno de los ejemplos más clásicos del
descubrimiento de drogas sin planificación ni búsqueda sistemática. 7 Fue un
encuentro accidental en 1928 cuando Alexander Fleming notó el crecimiento
espontaneo de un hongo alrededor de cultivos de Staphylococcus aureus,
comprobando que las colonias bacterianas que se encontraban alrededor del
3
hongo eran transparentes debido a una lisis bacteriana. Este hongo fue
identificado como Penicillium notatum, y produce la penicilina, una sustancia
natural con efectos antibacterianos. Fleming trabajó con este hongo durante un
tiempo pero la obtención y purificación de la penicilina a partir de los cultivos de
Penicillium notatum resultaron difíciles y más apropiados para los químicos.
Aunque Fleming sugirió que la penicilina podría ser útil como antiséptico tropical,
no tuvo éxito en la producción de penicilina en una forma adecuada para tratar
las infecciones. No fue sino hasta que Sir Howard Florey en la Universidad de
Oxford reinvestigó la posibilidad de producir penicilina en una forma útil. En
1940 se logró producir penicilina, que podría ser administrado por vía tópica y
sistemática, pero la magnitud del valor de la penicilina no fue revelada sino
hasta finales de los años 1940. Por otro lado, la estructura real de la penicilina
solo fue aclarada por Dorothy Crowfoot Hodgkin en 1944 por medio de la
realización de un Rayos-X a la estructura cristalina, y no se publicó hasta 1949.
Varios análogos diferentes fueron aislados desde entonces, pero solo dos de
ellos están todavía en uso hoy en día, penicilina V 6 y G 7.
6
7
Un análisis realizado por Newman y col. en el 2012,8 sobre fuentes de
nuevas drogas desde enero de 1981 hasta diciembre 2010 indicó que solo el
36% de 1073 drogas (figura 1), no son derivados de un producto natural sino
completamente sintéticas (S). El 64% restante son drogas inspiradas en algún
producto natural, donde un 5% contienen el farmacóforo de un producto natural
(S*), un 5.5% son productos naturales no modificados (N), un 0.5% son
productos naturales de origen botánico (recientemente aprobados), un 11%
presentan el farmacóforo de un producto natural con inhibición competitiva
(S*/NM), otro 14% son derivados de un producto natural que inhibe el blanco
4
biológico de interés o imita el substrato endógeno del sitio activo (S/NM) y un
28% corresponden a productos naturales modificados (ND). De tal forma que
más de un 60% de los medicamentos prescritos en la clínica fueron inspirados
en algún producto natural, lo que implica que diversas sustancias aisladas de
medios naturales, posteriormente han sido lo suficientemente aptas para ser
lanzadas al mercado farmacéutico, y en otros casos han sido empleadas como
estructuras prototipos en el diseño de un nuevo fármaco.


N, 5.5%

NB, 0.5%
S*, 5%


S*/NM, 11%

ND, 28%
S/NM, 14%

S, 36%
8
Figura 1. Representación gráfica de diferentes tipos de drogas (1981-2010).
Entre algunos productos naturales empleados actualmente en la
medicina, nos podemos encontrar con la lovastatina 8, aislada desde el hongo
Aspergillus terreus, usada para disminuir el colesterol y prevenir enfermedades
cardiovasculares.9 La reserpina 9, aislado de las raíces de Rauwolfia serpentina,
usado como un anti-hipertensivo y sedativo.10 El galantamino 10, un alcaloide
aislado de Galantathus nivalis, usado en el tratamiento del Alzheimer.11 La
artemisinina 11, aislada de las hojas de Artemisia annua, usada como
antimalárico.12 Y el taxol 12, aislado de la corteza del árbol de tejo del Pacífico
Taxus brevofolia,13 un inhibidor de la mitosis celular utilizado en la quimioterapia
del cáncer.14
5
8
9
H3CO
O
N
H
HO
10
11
12
13
14
15
H
H
OH
H
OH
OH
O
H
O
O
O
O
H
O
O
H
H
H
H
O
O
H
O
O
H
O
H
O O
O
O
16
6
Y entre algunas drogas inspiradas en productos naturales, tenemos la
pravastatina 13, derivado sintético de la lovastatina. El arteeter 14, un
antimalárico desarrollado a partir de la artemisinina. Y el agente oncolítico
eribulina 15,15 actualmente utilizado para el tratamiento de cáncer de mamas
metastático y avanzado, un derivado de la halichondrina B 16, aislada de la
esponja marina Halichondria okadai.16 En ese sentido, se puede ver que es de
suma importancia el estudio de extractos de plantas con actividad biológica para
lograr el aislamiento de principios activos prometedores. No sólo plantas
pertenecientes a la angiospermas sino también plantas inferiores como, briofitas
y líquenes que tienen potencial curativo.
Los líquenes son asociaciones simbióticas formadas por un hongo
(micobionte) y por un par fotosintético (fotobionte), que puede ser un alga
(ficobionte), una cianobacteria (cianobionte) o ambos.17 El liquen posee
características morfológicas y fisiológicas distintas a aquéllas que presentan sus
componentes por separado, en especial por la tolerancia a las condiciones
extremas. Es así que ellos son pioneros en la colonización de diversos hábitats
terrestres, encontrándose en una gran diversidad de ambientes desde la región
Ártica hasta la región Antártica. Los líquenes son encontrados desde el nivel del
mar hasta en las altas montañas, también se encuentran en los desiertos donde
la temperatura es variable o en regiones polares donde las temperaturas son
extremadamente bajas.18 Crecen sobre rocas, corteza, hojas de árboles, suelos,
etc. Sin embargo, en el caso de las asociaciones tripartitas, hay una clara
separación de las funciones de los fotobiontes, donde la cianobacteria tiene
como función principal fijar nitrógeno y el alga realiza mayoritariamente la
fotosíntesis. Estas capacidades permiten que los líquenes sobrevivan en
ambientes pobres en nutrientes, donde son escasos otros fijadores de nitrógeno,
ya sean simbiontes o de vida libre.19
A lo largo de los siglos, los líquenes se han utilizado para diversos fines,
especialmente en la fabricación de colorantes, perfumes y remedios en
medicinas populares.20,21 Por ejemplo, el pigmento púrpura de especies de
Roccella se utilizó para el teñido de “togas” por los romanos. Los antiguos
7
romanos también extrajeron un pigmento marrón, llamado “crottal” de Evernia,
Ochrolechia y especies Parmelia. El papel de pH impregnado con tornasol, una
mezcla de colorantes soluble en agua que se extraen de líquenes del género
Roccella, todavía es utilizado por los químicos.22 En adición a la tintura, los
líquenes se han utilizado con fines cosméticos.23 También, han sido
ampliamente utilizados como biodetectores debido a su alta sensibilidad a los
contaminantes del aire, tales como azufre, diferentes metales pesados, y
nitrógeno.24,25 Además, en el mercado de especies de la India se venden con el
nombre de “Chharila”, que consiste en la mezcla de dos o más especies de
Parmelia,
tremulans.
Usnea
longissima,
Chharila
tiene
Ramalina
subcomplanata
propiedades astringentes,
y
Heterodermia
resolutivo,
laxante,
carminativas y afrodisíacas.26
Diferentes géneros de líquenes se utilizan en la curación de muchas
dolencias. Especies de Evernia, Peltigera, Parmelia, Cladonia, Rocella y
Pertusaria, se utilizaron para controlar la fiebre, diarrea, infecciones,
enfermedades de la piel, epilepsia, convulsiones y como purgante.27 Peltigera
caninna es un tónico y se utiliza contra enfermedades del hígado debido a su
alto contenido de metionina.28
En el sistema de la medicina Ayurvédica (medicina tradicional a base de
plantas de influencia Hindú), los líquenes se utilizan para el tratamiento de la
bronquitis, el asma, la lepra, bazo, y enfermedades del corazón. Algunos
también se utilizan como “purificador de la sangre”. En el sistema de medicina
Unani (un sistema médico greco-árabe modificado, que se desarrolló producto
de la influencia que produjo la filosofía, la ciencia y la medicina griega en los
árabes) los líquenes se utilizan para el tratamiento de diversos trastornos
estomacales, dolor, inflamación del hígado, vómitos, etc.29–31 Los líquenes
Parmelia sulcata (Taylor) y Peltigera apthosa (L.) se utilizan para el tratamiento
de la rabia y “Tordo” (infección oral causada por el hongo Candida),
respectivamente.31 Actualmente se han descrito más de un millón de productos
naturales aislados a partir de diferentes fuentes, de los cuales, los líquenes
constituyen una de las menos estudiadas, obteniéndose alrededor de 1.000
8
compuestos, sin embargo, muchos otros aún no se han caracterizado.32,33
La región Antártica es de particular interés para la química de productos
naturales, ya que sigue siendo relativamente inexplorada comparada con los
ambientes terrestres, lo que indica que las probabilidades de descubrir nuevas
moléculas activas es mayor. Se calcula que existen aproximadamente 25.000
especies de líquenes dentro de 600 géneros.33 Hoy en día se han identificado en
la Antártida más de 200 especies de líquenes. El crecimiento de líquenes en la
región polar esta inhibido por las bajas temperaturas, pobre calidad solar,
sequías prolongadas, altas radiaciones solares, en especial de rayos UV-B, y
por la oscuridad del invierno.34 Estas condiciones extremas incrementan la
formación de especies reactivas del oxígeno (ROS), por lo que los líquenes
deben contener importantes cantidades de antioxidantes para protegerse del
daño causado por la oxidación.35 Para poder sobrevivir en estas condiciones
extremas, los líquenes han desarrollado varios mecanismos de defensa, algunos
de ellos involucran biosíntesis de metabolitos secundarios.36
Los metabolitos secundarios, aislados de líquenes caen en diferentes
familias de compuestos, los cuales son un grupo distinto de las producidas por
las
plantas
superiores.
Estos
incluyen:
diterpenos,
triterpenos,
dibenbenzofuranos, dibenzopiranona, depsidos, depsidonas, antraquinona,
xantonas, ácidos úsnicos y ácidos pulvínicos. Además, exhiben numerosas
actividades biológicas incluyendo: antimicobacterial,37 antiviral,38 antioxidante,39
analgésico,40 citotóxico, antimicrobiano, fungicida, herbicida, antialimentaria e
inhibidor del fotosistema.41 Por lo tanto, hay un interés considerable en el
estudio de metabolitos a partir de líquenes como fuentes potenciales en el
descubrimiento y desarrollo de agentes farmacológicos.42
1.1. Biosíntesis
Las rutas del ácido shikímico, ácido mevalónico y polimalonil, son
conocidas por ser las principalmente involucradas en la biosíntesis de
metabolitos secundarios producidos por líquenes.43
9
1.1.1. Vía del ácido shikímico. El ácido gálico 17 y otros derivados fenólicos se
sintetizan principalmente a través de la vía del ácido shikímico en líquenes
(figura 2). Esta clase de compuestos están ampliamente distribuidos en los
líquenes de la familia Cactaceae y por lo general se obtienen por la fusión de
dos unidades de fenilpiruvato. El fosfoenolpiruvato (PEP) y D-eritrosa-4-fosfato,
reaccionan para formar 3-deoxi-D-arabinoheptulosanato-7-fosfato (DAHP) en
una reacción catalizada por la enzima DAHP sintasa. El DAHP es transformado
a 3-dehidroquinato (DHQ) en una reacción catalizada por la enzima DHQ
sintasa y la coenzima dinucleótido de nicotinamida y adenina (NAD). El DHQ es
deshidratado por acción de la enzima 3-dehidroquinato deshidratasa para formar
el ácido 3-dehidroshikímico, el cual es reducido por la enzima shikimato
deshidrogenasa usando la coenzima dinucleótido de nicotinamida y adenina
fosfato (NADPH), para generar el ácido shikímico.
O
CO2H
PO
Fosfoenolpiruvato
(PEP)
PO
PO
H
HO
CO2H
DAHP sintasa
O
OH
D-Eritrosa-4-P
HO
HO
CO2H
DHQ sintasa
NAD
OH
O
OH
OH
OH
Ácido D-Arabino-heptulosonico
7 fosfato (DAHP)
DHQ
3-DHQ deshidratasa
H2O
CO2H
O
P=
P OH
OH
CO2H
Shikímato
deshidrogenasa
HO
OH
NADPH
OH
O
OH
OH
Ácido Shikímico
Deshidratación y
enolización
Ácido
3-Deshidroquinico
-H2O
CO2H
HO
OH
OH
Ácido gálico 17
y otros compuestos
fenolicos
Figura 2. Vía del ácido shikímico para la biosíntesis de polifenoles
Compuestos fenólicos
10
1.1.2. Vía del ácido mevalónico. Esta vía esta principalmente involucrada en la
biosíntesis de los diferentes tipos de terpenos, como por ejemplo, el 16βaceteoxihopano-α-22-diol 18 y el zeorin 19. Sin embargo, sólo unos pocos di- y
triterpenos se reportan de diferentes especies de líquenes.29 La vía se describe
en las figuras 3, 4 y 5.
O
O
CoAS
CoAS
O
ACAT
O
CoAS
Aceto acetil-CoA
O
Acetil CoA
Acetil CoA
(Nucleófilo)
Condensación biológica
Tipo-Aldol
(Electrófilo)
H2O - HSCoA
SCoA
HMG-CoA sintasa
HMG-CoA reductasa
(NADPH + H+)
HO
PP=
O
O
P O P OH
OH OH
- HSCoA
O
HO
OH
Ácido 3R-Mevalonico
(ATP)
HO
PPO
MK
PMK
O
OH
Mevalonato-5-pirofosfato
- CO2 - H2O
Mevalonato-5-PP descarboxilasa
Isopentil-PPIsomerasa
OPP
Gamma, gammadimetil alil-pirofosfato
OPP
Isopentenil-5-pirofosfato
(isopreno activado)
Farnesil pirofosfato sintasa (FPPS)
OPP
Geranil pirofosfato
(precursor de monoterpenos)
Figura 3. Vía del mevalonato para la biosíntesis de monoterpenos
11
Figura 4. Vía del mevalonato para la biosíntesis de di- y triterpenos
12
H
H
OH
OH
H
H
H
CO2CH3
18
H
H
OH
H
H
H
H
OH
19
Figura 5. Ciclación del escualeno para formar triterpenos
1.1.3. Vía del polimalonato. La clase de compuestos dépsidos como el ácido
olivetórico 20, y depsidonas como el ácido fisódico 21, estructuralmente únicos
de metabolitos liquénicos, se sintetizan a través de la vía del polimalonato
(figura 6). A esta vía también corresponden los metabolitos liquénicos que
pertenecen a derivados de terfenilquinona, por ejemplo, emidiantrona 22,
emodina 23, hidroxiemodina 24 y ácido emódico 25 (figura 7).
O
CoAS
Acetil Co-A
O
O
CoAS
OH
Malonil CoA
O
CO2H
CO2H
O
O
HO
OH
Ácido orselénico
C5H11OCH2C
O
O
OH
HO
OH
CO2H
C5H11
Ácido olivetórico 20
C5H11OCH2C
O
O
O
HO
OH
CO2H
C5H11
Ácido fisódico 21
Figura 6. Vía del polimalonato para la biosíntesis de dépsidos y depsidonas.
13
O
CoAS
Acetil Co-A
4 HSCoA
O
4 CO2
S CoA
O
4
O
O
O
OH
CoAS
Malonil CoA
O
O
3 Malonil CoA
3 HSCoA, 3 CO2
3 H2O, HSCoA, CO2
O
O
O
O
SCoA
O
O
O
O
3 H2O
O
O
O
O
SCoA
O
OH O
OH O
SCoA
HO
Hidrolasa
OH O
OH O
OH
HO
CO2
OH O
HO
OH
22
Monooxigenasa
OH O
OH
HO
OH O
OH
HO
O
23
Figura 7. Vía del polimalonato para la biosíntesis de polifenoles.
R
O
24 R= CH2OH
25 R= CO2H
14
1.2 Usnea antarctica
1.2.1. Taxonomía y Características botánicas
Reino: Fungi
División: Ascomycota
Clase: Lecanoromycetes
Orden: Lecanorales
Familia: Parmeliaceae
Género: Usnea
Especie: antarctica
Usnea antarctica Du Rietz (1926)
Usnea antarctica, es una especie liquénica muy llamativa, de especial
abundancia en la península Antártica (Redon 1985), su talo erguido y fruticuloso
de 2 a 10 cm de altura, es de color amarillo verdoso bandeado de negro, el
extremo apical de las lacinias pueden presentarse pigmentado cuando los talos
viven expuestos al sol, por lo general parte de un disco adhesivo delimitado,
erguido, ramificado dorsalmente con numerosas ramas atenuadas (figura 8).
Ramas cilíndricas, generalmente con una pigmentación negra heterogénea.
Superficie de tono mate, subpapilado a bruscamente papilado. Soralia (grupo de
soredios) a lo largo del talo, plano al escarbar, con un margen crateriforme.
Médula compacta, eje con grosor. Apotecios muy raros, subterminales, de 10
mm de diámetro, cóncavos y la superficie externa en forma de silla
irregularmente arrugada, arrugas sorediosas, sin fibrillas. Margen talino delgado
e irregular. Disco suave y un poco arrugado, de color marrón pálido. Las
ascosporas simples, elipsoide incoloro, 9-10 x 6-7 µm.44
15
Figura 8. Estructura del liquen Usnea antarctica. med: médula, cor: corteza, al: alga, axis:
axis central.
1.2. Antecedentes
1.2.1. Extractos y metabolitos secundarios bioactivos aislados de líquenes.
Los líquenes constituyen una fuente original de moléculas bioctivas, entre
ellas, compuestos con actividad antibacteriana. Aunque más de 1.000
sustancias liquénicas son conocidas y sus estructuras se han dilucidado,45
muchos otros aún no se han caracterizado. El interés primordial en estos
compuestos ha sido con respecto a su potencial como fuente de farmacóforos
prospectivos.46 En este sentido, Karthikaidevi y col. en el 2009,47 a partir del
extracto clorofórmico del liquen Roccella belangeriana, demostraron la actividad
antibacteriana contra Enterococcus sp. con valores de inhibición de 29 mm de
diámetro.
16
Tay y col. en el 2004,48 aislaron el (+)-ácido úsnico 26, ácido norstístico
27 y el ácido protocetrático 28 a partir del liquen Ramalina farinacea recolectado
en el Bosque TEMA, Provincia Eskisehir, Turquía a 1100 msnm. El ácido úsnico
presentó la mayor actividad antibacteriana contra Bacillus subtilis, Listeria
monocytogenes, Proteus vulgaris, Staphylococcus aureus, Streptococcus
faecalis, Yersinia enterocolitica, Candida albicans, y Candida glabrata con
valores muy bajos de concentración mínima inhibitoria (ICM) que varía de 0.80
µg/mL a 49.60 µg/mL (tabla I), siendo el agente antimicrobiano más importante
en Ramalina farinacea. A su vez Fazio y col. en el 2007,49 reportaron la actividad
antiviral del ácido úsnico 26.
26
27
28
Tabla I. Valores de ICM del acido úsnico.
7
ICM (contra células 10 )
Microorganismo
Bacillus subtilis
Listeria monocytogenes
Proteus vulgaris
Staphylococcus aureus
Streptococcus faecalis
Yersinia enterocolitica
Candida albicans
Candida glabrata
28
[µg/mL]
12.48
6.24
12.48
49.60
25.60
6.24
0.80
0.80
([mM])
0.036
0.018
0.036
0.15
0.073
0.018
0.002
0.002
17
Manojlovic y col. en el 2005,50 aislaron siete derivados de antraquinona,
eritroglaucina 29, parietin 30, fallacinal 31, fallacinol 32, emodina 19, y dos
derivados O-alquilado de parietin (33-34) a partir del extracto de cloruro de
metileno de Caloplaca láctea recolectada en Mt. Kopaonik, Serbia. El compuesto
32 mostró los mejores efectos contra Staphylococcus aureus y Bacillus subtilis
(ICM= 20 y 40 µg/mL, respectivamente), a partir del cual se pudo inferir que una
antraquinona con un grupo hidroximetileno en la posición C-6 muestra una
mayor actividad antibacteriana que otros derivados. 1-O-metil parietin 33 y 8-Ometil parietin 34 mostraron efecto antibacteriano hacia especies de bacterias
Gram positivas como Bacillus cereus, Bacillus subtilis, y Staphylococcus aureus
con un ICM de 40-160 µg/mL. Los metabolitos 33 y 34 fueron aislados por
primera vez del género Caloplaca.
R
1
2
3
4
5
R
R
R
R
29
OH
OCH3
OH
CH3
OH
30
OH
OCH3
H
CH3
OH
31
OH
OCH3
H
CHO
OH
32
OH
OCH3
H
CH2OH
OH
19
OH
OCH3
H
OH
OH
33
OCH3
OCH3
H
CH3
OH
34
OH
OCH3
H
CH3
OCH3
Por otro lado, Rankovié y col. en el 2008,51 aislaron el ácido
fumarprotocetrárico 35 a partir del liquen Cladonia furcata recolectado en el
Monte Kopaonik, Serbia. Este compuesto presentó actividad antibacteriana
contra diferentes patógenos (tabla II), con valores de ICM de 0.031 a 0.062
mg/mL.
Tabla II. Concentración mínima inhibitoria (ICM, mg/mL) del compuesto 35
Compuesto
35
Estreptomicina
Organismo
Klebsiella
Bacillus subtilis Escherichia coli
pneumoniae
0.062
0.062
0.031
7.81
31.25
1.95
Staphiloccocus
aureus
0.062
31.25
18
35
Schmeda y col.52 en el 2008, evaluaron la actividad antifúngica y
antiprotozoaria de los extracto en CH2Cl2 y MeOH del liquen Protousnea
poeppigii recolectado en los Andes, La Trancas, Chile, contra los hongos
Microsporum gypseum, Trichophyton rubrum y Trichophyton mentagrophytes
con valores de ICM entre 50-100 µg/mL y contra los protozoos de Leishmania
amazonensis, Leishmania brasiliensis y Leishmania infantum con valores de 90100 µg/mL (tabla III). A partir de este liquen, se aisló un nuevo depsido, el ácido
isodivaricático 36 y tres metabolitos conocidos, el 5-propilresorcinol 39, ácido
divaricárinico 40 y el ácido úsnico 26. El compuesto 36 fue acetilado y metilado,
obteniendo asi los derivados 37 y 38. La actividades de los compuestos se
muestran en la tabla III, en donde se observó que los compuestos 36 y 40
fueron los más activos.
Tabla III. Actividad antimicrobial de extractos de Protousnea poeppigii y compuestos 36,
37, 38, 40 y 26 (ICM, µg/mL)
Microorganismo
Hongo
Microsporum gypseum
Trichophyton rubrum
Trichophyton mentagrophytes
Protozoa
Leishmania amazonensis
Leishmania brasiliensis
Leishmania infantum
a
Anfotericina B.
b
Sin ensayar.
Extracto
CH2Cl2 MeOH
36
37
Compuestos
38
40
26
Antibiótico
a
Anf B
50
50
50
100
50
100
50
50
50
200
100
100
250
250
250
100
50
50
250
100
200
0.125
0.075
0.075
100
100
100
<90
<90
<90
100
100
100
100
100
100
SE
b
SE
b
SE
b
100
100
100
100
100
100
100
100
100
19
1
R
36 H
37 Ac
38 Ac
2
R
OH
OH
OCH3
1
R
39 H
40 CO2H
2
R
H
CH3
Atalay y col.53 en el 2011, aislaron una nueva depsidona, pulmonarianin
45 y siete metabolitos conocidos (acido stíctico 41, isidioforín 42, rhizonaldehído
43, alcohol rizonil 44, ácido vesuvianico 46, peroxido de ergosterol 47 y ácido
úsnico 26), a partir del extracto en acetona del liquen Lobaria pulmonaria,
recolectada en el área de Giresun (norte Anatolia), Turquía. En el mismo trabajo,
pero a partir del extracto etereo del liquen Usnea longissima, se aisló ácido
úsnico 26 y ácido difractaico 48. Se evaluó la actividad atrapadora de radicales
DPPH (1,1-difenil-2-picrilhidrazil) a todos los compuestos, con excepción del
ácido vesuvianico 46 debido a la baja cantidad. Todos los compuestos
mostraron actividad captadora del radical DPPH (actividad antioxidante) con
excepción del ácido úsnico y el ácido diffractico (figura 9). El compuesto 42,
mostró la mayor actividad captadora de radicales en comparación con
Butilhidroxitolueno (BHT, antioxidante sintético, utilizado como control positivo).
Figura 9. Actividad captadora del radical DPPH de los compuestos 41-45, 47, 26, 48 y BHT.
20
41
42
43
44
45
46
47
48
Ren Hong,54 en el 2011, aisló mediante un fraccionamiento biodirigido, un
nuevo inhibidor de la topoisomerasa I de ADN, el ácido secalónico D 49, a partir
del caldo de fermentación del liquen marino Gliocladium sp. recolectado en el
polo sur (estación antártica Zhong-shan). El compuesto 49, inhibió de manera
considerable la topoisomerasa I de ADN (enzima que cataliza la ruptura
independiente de ATP de un ADN de cadena simple, seguida por el paso y
reagrupamiento de otra hebra simple del ADN), de una manera dosisdependiente con ICM de 0.4 µM, siendo así un posible candidato
anticancerígeno.
21
49
Pejin y col.55 en el 2012, aislaron una nueva depsidona en la forma de un
derivado de diacetato 50, a partir del liquen Lobaria pulmonaria recolectada en
la montaña de Zelengora en Bosnia. Este compuesto mostró una moderada
actividad inhibitoria de la acetilcolinesterasa (enzima humana cuya función
principal es hidrolizar al neurotransmisor acetilcolina) con un valor de 1 µg/mL,
en comparación con el alcaloide galantamina que inhibió la enzima a 0.01
µg/mL.
50
Cuellar y col.56 en el 2013, aislaron los compuestos metil evernate 51,
tenuiroin 52 y tres triterpenoides tipo hopano, hopano-22-ol 53, hopano-16β,22diol 54 y hopano-6α,7β,22-triol 55 a partir del liquen Pseudocyphellaria coriifolia,
recolectada de la corteza del árbol Nothofagus antarctica, en el Parque Nacional
Conguillio, al sur de Chile. Los compuesto 51-53 presentaron la mayor actividad
antitripanosómica contra epimastigotes de Trypanosoma cruzi con porcentajes
de inhibición entre el 78 y el 84% de lisis de los parasitos, a una concentración
de 50 µM (tabla IV). La inhibición de los compuestos 54 y 55 fueron menores
que los derivados hopano, con 34-35% de lisis. Tambien se evaluó su efecto a
una concentración de 10 µM, el cual fue muy bajo para todos los compuestos
22
ensayados, el cual oscilo entre el 8 y el 14%. El fármaco de referencia utilizado
fue nifurtimox.
Tabla IV. Efectos de los compuestos 51-55 contra epimastigotes de T. cruzi.
Porcentaje de inhibición (%)
50 µM
10 µM
80
8.5
78
8.0
84
8.5
35
7.5
34
14.0
100
97.0
Compuestos
51
52
53
54
55
Nifurtimox
51
52
1
53
54
55
R
H
H
OH
2
R
H
H
OH
3
R
H
OH
H
Stojanovic y col.57 en el 2014, aislaron tres depsidonas, el ácido fisodálico
56, ácido fisódico 21 y ácido 3-hidroxi fisódico 57, a partir del extracto en MeOH
del liquen Hypogymnia physodes recolectado en el monte Selicevica en Serbia.
Se evaluó la actividad anti-proliferativa de los compuestos 56, 21, 57 y del
extracto de MeOH contra una línea celular de cáncer humano (HeLa), a
concentraciones de 10-1000 µg/mL obteniendo valores de IC50 de 964, 171, 97 y
254 µg/mL respectivamente a 24 horas de incubación, mientras que a 72 horas
los valores de IC50 fueron de 283, 66, 63 y 68 µg/mL respectivamente (tabla V).
23
Tabla V. Efecto inhibitorio de los compuestos 56, 57, 21 y extracto MeOH después de 24 y
72 horas (expresado en IC50, µg/mL).
IC50 ± DS (µg/mL)
Compuesto
56
21
57
Extracto MeOH
a
5-Fluorouracil
a
Medicamento usado contra el cáncer
24 h
964.38 ± 104.23
170.50 ± 72.81
97.35 ± 4.84
253.54 ± 13.11
8.38 ± 0.72
1
56
57
R
CH3
CH2COC5H11
2
R
CHO
OH
72 h
282.91 ± 5.43
65.96 ± 2.40
63.41 ± 9.12
67.74 ± 6.76
0.84 ± 0.11
3
R
CH3
C5H11
4
R
CH2O2CCH3
H
1.2.2. Extractos y metabolitos secundarios bioactivos aislados de líquenes
del genero Usnea.
El género Usnea (Usneaceae) es muy amplio, conocido también como el
liquen de pelo colgante (parte hongo, parte algas), crece a lo largo de las zonas
templadas del hemisferio norte, especialmente en los bosques tropicales subárticos y costeras de Europa, Asia y América del Norte. Debido a una larga
tradición de su uso como agente antimicrobiano por las comunidades indígenas,
como los Andes venezolanos,58 los líquenes han atraído la atención como una
fuente de nuevos antibióticos.59 las especies de Usnea también se han utilizado
tradicionalmente para el alivio del dolor y el control de la fiebre.60 Son también
eficaces en la tuberculosis, así como otras infecciones de las vías respiratorias
inferiores.59 En este sentido, Gutkind y col.61 en 1982, reportaron la actividad
antibacteriana del extracto acuoso de los líquenes Usnea campestris y Usnea
densirostra recolectada en diferentes regiones de la República de Argentina y
Paraguay. Ambos extractos fueron activos contras las cepas Gram positivas
Bacillus subtilis, Micrococcus luteus, Staphylococcus aureus y contras las Gram
negativas Pseudomonas aeruginosa y Escherichia coli.
24
Behera y col.62 en el 2005, reportaron la actividad inhibitoria de los
extractos acetónico, metanólico y de éter de petróleo de Usnea ghattensis
contra las bacterias patógenas Bacillus licheniformis, Bacillus megaterium,
Bacillus subtilis y Staphylococcus aureus, tal como se muestra en la tabla VI. El
liquen fue recolectado de árboles de roble, en el estado de Maharashtra, en la
India. Además, el tamaño de la zona de inhibición aumenta dependiente de la
concentración de extracto.
Tabla VI. Actividad antibacterial (zona de inhibicion, cm) de diferentes extractos de Usnea
ghattensis y antibióticos estándares.
Extracto
Bacteria
S. aureus
B. licheniformis
B. subtilis
B. megaterium
Metanol
(µg)
5
2.0
1.6
1.5
1.5
10
2.2
1.8
2.0
1.7
20
2.6
2.5
2.3
2.2
Acetona
(µg)
5
2.0
1.6
1.9
1.9
10
2.2
2.0
2.1
2.0
20
3.0
2.5
2.4
2.4
Eter de
Ampicilina Estreptomicina
Petróleo
(10 µg)
(10 µg)
(µg)
5 10 20
2.5 2.7 3.5
5.0
2.6
2.0 2.7 3.0
1.0
2.1
1.6 1.9 2.1
1.8
2.4
1.3 1.7 2.0
2.0
2.2
En un estudio similar Srivastava y col.63 en el 2013, utilizando el liquen
Usnea ghattensis, pero recolectada en el bosque de Lingmala, estado
Mahabaleshwar, en la India, evaluaron la actividad inhibitoria in vitro de los
extractos acetónico, metanólico y etanólico utilizando el método de difusión en
disco de Kirby-Bauer contra las bacterias patógenas Staphylococcus aureus,
Streptococcus
faecalis,
Bacillus
cereus,
Escherichia
coli,
Salmonella
typhimurium y Pseudomonas aeruginosa, siendo el extracto etanólico el más
eficaz contra B. cereus y P. aeruginosa, con una zona de inhibición de 29.8 ±
0.6 y 12.3 ± 0.5 mm a una concentración de 0.2 mg/mL. El extracto de acetona y
metanol demostró actividad casi similar contra S. aureus con zonas de inhibición
de 24.6 ± 0.5 y 24.7 ± 0.4 mm, respectivamente. Y solo el extracto de metanol
mostró actividad contra S. faecalis con una zona de inhibición de 13.5 ± 0.8 mm
(tabla VII). En este reporte el autor indicó que este liquen podría ser una fuente
rica de agentes antimicrobianos eficaces. Como control positivo se utilizó
gentamicina a una concentración de 10 µg/mL y ceftriaxona a una concentración
de 30 µg/mL.
25
Tabla VII. Zona de inhibicion (mm) de extractos de Usnea ghattensis contra algunos
micoorganismos patógenos*
Bacteria
patógena
Acetona
Extracto (mg/mL)
Metanol
Control positivo
Etanol
(Gentamicina y
Ceftriaxona)
S. aureus
13.8 ± 0.7 24.6 ± 0.5 15.2 ± 0.9 24.7 ± 0.4 8.8 ± 0.8 19.1 ± 0.8
25.6 ± 0.7
S. faecalis
0.0 ± 0.0 0.0 ± 0.0 8.3 ± 0.5 13.5 ± 0.8 0.0 ± 0.0 0.0 ± 0.0
24.8 ± 0.6
B. cereus
20.6 ± 0.5 23.9 ± 1.1 19.1 ± 1.1 23.6 ± 0.5 20.4 ± 0.5 29.8 ± 0.6
29.1 ± 1.1
E. coli
0.0 ± 0.0 0.0 ± 0.0 0.0 ± 0.0 0.0 ± 0.0 0.0 ± 0.0 0.0 ± 0.0
25.0 ± 0.4
P. aeruginosa
0.0 ± 0.0 8.4 ± 0.6 0.0 ± 0.0 8.7 ± 0.4 0.0 ± 0.0 12.3 ± 0.5
26.6 ± 0.7
S. typhimurium
0.0 ± 0.0 0.0 ± 0.0 0.0 ± 0.0 0.0 ± 0.0 0.0 ± 0.0 0.0 ± 0.0
24.0 ± 0.6
*Los valores están en media ± desviación estándar, � = 3
0.1
0.2
0.1
0.2
0.1
0.2
Dos nuevos compuestos fenólicos, longissiminona A 58 y longissiminona
B 59 fueron aislados por Choudhary y col. en el 2005,64 a partir del liquen Usnea
longissima. Compuesto 58 mostró la mayor actividad comparado con los
estándares, mientras que el compuesto 59 no mostró ninguna actividad
significativa a una concentración de 400 µg/mL. La tabla VIII resume los valores
de IC50, es decir, la concentración de compuesto que inhibe el 50% de la
producción de ion superóxido.
Tabla VIII. Valores de IC50 (µg/mL) de los compuesto 58, 59 y los controles positivos a 400
µg/mL
a
% Inhibición
a 400 g/mL
58
72.13
59
34.34
b
Indometacina
58.82
b
Aspirina
70.45
a
SEM fue el promedio de error estándar de cinco ensayos
b
Controles positivos usados en el ensayo
IC50 ± SEM
(µg/mL)
165.070 ± 0.848

271.212 ± 5.900
50.30 ± 4.42
Compuestos
58
59
Lohézic y col. en el 2007,65 aislaron dos nuevas β-orcinol depsidonas, el
compuesto 60 y cryptostictinolide 61 junto a tres compuestos conocidos, ácido
stíctico 41, ácido norstístico 27 y ácido fumarprotocetrárico 35, a partir del liquen
Usnea articulata recolectada al Este de Sumatra, Indonesia, a una altitud de
26
1.500 m. Se evaluó la actividad captadora de radicales DPPH y anión
superóxido a todos los metabolitos. Los compuestos 60, 61 y 35 exhibieron una
actividad antirradical moderada al ensayo del DPPH con valores de 30, 20 y
18% respectivamente a 3000 µM, mientras que los compuestos 27 y 35
mostraron una mejor actividad al ensayo del anión superóxido con valores IC 50
de 566 y 580 µM respectivamente, actividades más altas que el flavonoide
conocido, quercetina con valor IC50 de 754 µM. Por lo tanto, los líquenes podrían
ser una fuente interesante de compuestos antioxidantes que podrían actuar
como fotoprotectores mediante la limitación de los efectos nocivos de la luz UV
a través de la formación de especies reactivas de oxigeno (ROS).
60
61
Rezanka y col.66 en el 2007, aislaron un nuevo dímero asimétrico
tetrahidroxantona glicosídico, hirtusneanosida 62, a partir del liquen Usnea hirta
recolectada en Javorová skála, Republica Checa. El compuesto 62 inhibió el
crecimiento de bacterias gram-positivas S. aureus y B subtilis.
62
27
Safak y col.67 en el 2009, evaluaron los efectos in vitro del ácido úsnico
26 aislado del liquen Usnea dasypoga en contra de aislados clínicos y cepas
estándar de Helicobacter pylori. La cepa H. pylori fue sensible al ácido úsnico y
claritromicina con valores de ICM < 0.128 μg/mL. Los valores de ICM50 y ICM90
se dan en la tabla IX. Un total de 37 cepas se utilizaron para evaluar la actividad
anti-H. pylori, seis (16.2%) que correspondían a aislados clínicos resistentes a
ácido úsnico y cinco (13.5%) fueron resistentes a la claritromicina y por último se
detectó en una cepa resistencia dual a ácido úsnico y claritromicina (tabla X). El
sinergismo entre el ácido úsnico y claritromicina puede ser eficaz en el
tratamiento de la infección por H. pylori.
Tabla IX. Distribucion de los valores de ICM50 y ICM90 para aislado de H. pylori
Número de cepas no inhibidas
Ácido úsnico 26
Claritromicina
13
9
5
6
4
5
4
4
3
3
2
2
1
2
2
2
1
1
1
1
1

1



0.064
0.064
2.0
4.0
Dosis (µg)
≤ 0.016
0.032
0.064
0.128
0.256
0.512
1.0
2.0
4.0
8.0
16.0
32.0
≥ 64.0
ICM50 (µg/mL)
ICM90 (µg/mL)
Tabla X. Comparación de resistencia a claritromicina y el compuesto 26
Agente
a
N
5
6
1
Claritromicina
Ácido úsnico
Claritromicina y ácido úsnico
a
Numero de aislados de H. pylori
Resistente
%
13.5
16.2
2.7
Sensible
n
%
32
86.5
31
83.8
36
97.3
En el 2011 Sultana y col.68 estudiaron el liquen Usnea undulata Stirton
(Usneaaceae),
un
liquen
fruticoso
utilizado
localmente
en
medicina
etnoveterinaria para tratar las infecciones mamarias en el ganado, mientras que
28
los seres humanos lo usan para el tratamiento de heridas en Eastern Cape,
Sudáfrica. El fraccionamiento biodirigido de sus extractos condujo al aislamiento
y caracterización de una nueva depsidona, el ácido 20-O-metillhipostíctico 63.
Este compuesto mostró actividad inhibidora frente a Bacillus cereus, Bacillus
subtilis, y Staphylococcus epidermidis con valores de ICM de 31, 62.5 y 62.5
mg/mL, respectivamente. Por otro lado, Yildirim y col. en el 2012, reportaron la
actividad insecticida del ácido difractaico 48 aislado de Usnea longissima.69
63
1.2.3. Extractos y metabolitos secundarios bioactivos aislados de Líquenes
antárticos.
En la búsqueda de compuestos bioactivos, Ivanova y col.70 en el 2002,
reportaron la estructura y actividad biológica de tres nuevas depsidonas,
neuropogonines A 64, B 65 y C 66, los cuales fueron aislados del liquen
Antártico Neuropogon sp. recolectado en la Isla Livingstone, Antártida. Estos
compuestos mostraron una actividad moderada contra Mycobacterium vaccae
con valores de ICM de 50 µg/mL. Mycobacterium vaccae es una especie no
patogénica de la familia de las bacterias Mycobacteriaceae que viven
naturalmente en el suelo.
64
65
29
66
Por otro lado, Paudel y col.71
en el 2008, estudiaron la actividad
antibacterial de 5 extractos de líquenes antárticos recolectados en Isla Rey
Jorge, Antártida (Stereocaulon alpinum, Ramalina terebrata, Caloplaca sp.,
Lecanora sp. y Caloplaca regalis) contra las bacterias Gram (+) Staphyloccocus
aureus y Bacillus subtilis. La ICM de los extractos de líquenes se observó a
partir de 36.7 ± 0.3 mm a 953.8 ± 85.8 mg/mL y 68.5 ± 0.6 a > 1000 μg/mL,
respectivamente.
A partir del reporte anterior, C. Seo y col.72 en el 2008, aislaron un nuevo
depsipéptido cíclico, stereocalpin A 67, a partir del extracto metanólico del liquen
Stereocaulon alpinum recolectado en la península Barton cerca de la estación
Rey Sejong en Isla Rey Jorge, Antártida. El compuesto 67, mostró citotoxicidad
moderada contra tres líneas celulares de carcinomas: colon humano (HT-29,
IC50 = 6.5 µM), piel humana (B16/F10, IC50 = 11.9 µM), e hígado humano
(HepG2, IC50 = 13.4 µM).
OH
N
O
N
O
O
O
67
En otro trabajo, C. Seo y col.73 en el 2008, aislaron 3 nuevos compuestos
derivados del ácido úsnico, Usimines A 68, B 69 y C 70, a partir del extracto
metanólico del liquen Stereocaulon alpinum recolectado en la península Barton
cerca de la estación Rey Sejong en Isla Rey Jorge, Antártida. Los compuestos
30
inhibieron moderadamente la actividad de tirosina fosfatasa (PTP1B) en una
manera dosis-dependiente, y sus valores de IC50 fueron 15.0 ± 0.1, 27.7 ± 2.1 y
23.2 ± 3.2 µM, respectivamente. Los inhibidores de la PTP1B, una de las
principales pro tirosina fosfatasa en los tejidos humanos y un regulador negativo
de la vía de señalización de la insulina, se consideran como agentes potenciales
en los esfuerzos para desarrollar nuevos tratamientos para la diabetes tipo 2 y
síndromes metabólicos relacionados.
HO2C
OH
O
HO2C
N
CO2CH3
O
OH
N
OH
HO
CO2H
OH
HO
O
O
O
O
68
69
N
OH
O
CO2H
CO2H
OH
O
HO
O
70
Cui y col.74 en el 2012, aislaron cuatro nuevos diterpenos furanoides,
hueafuranoides A-D (71-74), mediante un fraccionamiento biodirigido del
extracto en MeOH del liquen Huea sp. recolectado en la Antártida. El compuesto
71 mostró actividad inhibitoria dosis-dependiente contra la proteína tirosina
fosfatasa (PTP1B) con un valor de ICM de 13.9 µM, utilizando como control
positivo al ácido ursólico con un IC50 de 3.08 µM. Por otro lado, a los
compuestos 72-74 no se le evaluaron su actividad debido a la poca cantidad. El
análisis cinético de la inhibición de PTP1B por el compuesto 71 sugiere que el
31
diterpeno furanoide encontrado inhibió la actividad PTP1B en una forma no
competitiva.
OH
O
HO
HO
O
HO
71
O
O
72
OH
O
HO
73
O
74
Celenza y col.75 en el 2013, evaluaron la actividad antibacteriana de ocho
compuestos
(atranorin
75,
tenuiorin
52,
ácido
difractaico
48,
ácido
fumarprotocetrárico 35, ácido psorómico 76, ácido variolárico 77, vicanicina 78 y
sphaerophorin 79) aislados de liquenes recolectados al sur de Chile y en la
Antártida. La actividad antibacteriana se llevo a cabo frente a cepas de aislados
clínicos
resistentes
a
meticilina,
entre
ellas
Staphylococcus
aureus,
Staphylococcus haemolyticus y Staphylococcus warneri. El ICM, calculado por
microdilución fue en el rango de 8 µg/mL para el compuesto 79 a 1024 µg/mL
para el compuesto 35, el resto de resultados se presentan en la tabla XI. Estos
hallazgos sugieren que los compuestos naturales de liquenes podrían ser
buenos candidatos para el desarrollo de nuevos agentes antimicrobiales.
32
Tabla XI. Valores calculados en ICM de los compuestos 75-79, 35, 48 y 52.
Cepa
75
b
S. aureus ATCC43300
16
S. aureus AQ004SA
64
S. aureus AQ013SA
128
S. aureus AQ014SA
64
S. haemolyticus AQ007SH
32
S. haemolyticus AQ012SH
32
S. warneri AQ011SW
32
S. warneri AQ012SW
32
a
Oxacilina, usado como control.
b
Cepa de referencia
52
48
35
256
128
>1024
>1024
64
256
64
64
128
128
128
64
128
256
128
128
1024
1024
1024
1024
1024
128
256
256
75
ICM (µg/mL)
76
77
1024
1024
1024
1024
512
512
512
512
256
256
512
256
512
128
256
256
78
79
Antibiótico
128
64
128
128
128
256
64
64
32
64
128
128
16
16
8
8
8
128
256
128
256
512
512
512
76
78
a
77
79
Tabla XII. Origen de los metabolitos ensayados.
Compuesto
Atranorin 75
Especie
Acarospora macrocyclos Vain.
Origen geográfico
Robert Island, Shetland del Sur,
Antártica
Tenuiorin 52
Pseudocyphellaria nitida (Taylor) Malme, P.
meyenii (Trevisan) D. Galloway, P.
exanthematica Lamb, P. divulsa (Taylor)
Imshaug
Puyehue National Park, Región de
Los Lagos
Ácido difractaico 48
Protousnea magellanica (Mont.) Krog
Laguna Icalma, Región de La
Araucanía
Cladonia cornuta (L.) Hoffm.
Ácido
fumarprotocetrárico 35
Robert Island, Shetland del Sur,
Antarctica
Ácido psorómico 76
Copermine Cove, Robert Island,
Shetland del Sur, Antarctica
Rhizocarpon geographicum L. DC
33
Tabla XII (Continuación). Origen de los metabolitos ensayados.
Compuesto
Ácido variolárico 77
Especie
Ochrolechia deceptionis (Hue) Darb.
Origen geográfico
King George Island, near Teniente
Marsh Base, Shetland del Sur,
Antarctica
Vicanicina 78
Psoroma pallidum Nyl., P. pulchrum
Malme
Southern of Chile (Villarrica),
Region de La Araucania
Sphaerophorin 79
Sphaerophorus globosus (Huds.) Vain
Robert Island, Shetland del Sur,
Antarctica
Bhattarai y col. en el 2013,76 aislaron un nuevo compuesto del tipo
pseudodepsidona llamado lobastin 80, a partir del liquen Stereocaulon alpinum
recolectado en la Antártida. El compuesto 80 presentó actividad antibacteriana
contra las bacterias Gram positivas Bacillus subtilis y Staphylococcus aureus
empleando la prueba de difusión en disco de papel a una concentración de 100
µg/mL, obteniendo un halo de inhibición de 20 mm de diámetro contra Bacillus
subtilis y 16 mm contra Staphylococcus aureus. Además, exhibió un ICM de 44
µM contra Bacillus subtilis y 35.2 µM contra S. aureus.
80
Aunque múltiples actividades biológicas de metabolitos de líquenes han
sido reconocidas, su potencial todavía no se ha explorado completamente. A
pesar de varios informes sobre los compuestos bioactivos a partir de especies
de líquenes de las regiones tropicales y templadas, pocos son los informes
sobre los compuestos bioactivos a partir de líquenes antárticos, cuya causa
podría ser debido a la dificultad de obtener muestras de líquenes en tales
regiones. Por lo tanto, los líquenes Antárticos han permanecido inexplorados, en
34
este sentido, es de interés estudiar el liquen Usnea antarctica como posible
fuente para el aislamiento de metabolitos secundarios. Esta investigación
presenta el aislamiento y la caracterización de los metabolitos secundarios
presentes en el extracto etanólico del liquen Usnea antarctica recogida en la Isla
Greenwich, una región polar Antártica.
35
OBJETIVOS
2.1. General:
Identificar el o los metabolitos secundarios mayoritarios presentes en el
extracto etanólico del liquen Usnea antarctica, proveniente de la Antártida.
2.2. Específicos:

Obtener el extracto etanólico de la especie del liquen Usnea antarctica
procedente de la Isla Greenwich, Antártida.

Aislar el(los) metabolito(s) secundario(s) presente(s) en el extracto
etanólico del liquen Usnea antarctica.

Determinar la estructura química de los metabolitos secundarios aislados.
36
PARTE EXPERIMENTAL
3.1. Recolección del liquen: El liquen estudiado fue recolectado del suelo
(sobre rocas), en el sector Punta Ambato, Isla Greenwich, en la Antártida,
coordenadas UTM 3073247. La identificación del material estuvo a cargo del Dr.
Manuel Caballer, investigador del Instituto Venezolano de Investigaciones
Científicas (IVIC) del Centro de Oceanología y Estudios Antárticos (COEA).
3.2. Reactivos y solventes.
 Na2SO4
 Ácido clorhídrico (HCl)
 Hexano
 Magnesio metálico
 Cloroformo (CHCl3)
 Alcohol amílico
 Acetato de etilo (AcOEt)
 Reactivo de Dragendorff
 Etanol (EtOH)
 Reactivo de Mayer
 Acetonitrilo (CH3CN) grado
 Reactivo de Wagner
HPLC
 Metanol
 Hidróxido de sodio (NaOH)
 Sílica gel
 Anhídrido acético (CH3CO)2O
 H2O destilada
 Ácido sulfúrico conc. (H2SO4)
 H2O desionizada
 Sulfato cúprico
 CDCl3
 Tartrato de sodio y potasio
 Ácido fórmico (HCO2H)
 Cloruro férrico (FeCl3)
 Ninhidrina
3.3. Obtención del extracto recolectado.
La muestra fresca (460 g) se colocó en un envase con etanol, se dejó macerar a
temperatura ambiente por 72 h, se licuó, se filtró y el residuo se reextrajo
sucesivamente (3 veces). Los filtrados combinados fueron evaporados y
concentrados a presión reducida para la obtención del extracto etanólico.
37
3.4. Fraccionamiento del extracto etanólico.
El extracto etanólico fue disuelto en 100 mL de una mezcla de agua-etanol 1:1 y
se extrajo con solventes de diferentes polaridades (Hexano, Cloroformo y
Acetato de Etilo). Luego cada fracción fue rotaevaporada a presión reducida
obteniendo las fracciones FHUa, FCUa, FAUa, respectivamente. Y la fracción
acuosa FAcUa.
3.5. Pruebas químicas preliminares.
La determinación de las diferentes familias químicas se realizó siguiendo la
metodología descrita por Miranda y Cuellar.77
3.5.1. Quinonas: A una alícuota del extracto disuelto en CHCl3 (1 mL), se le
adicionó una solución acuosa de NaOH, hidróxido de potasio o hidróxido de
amonio (1 mL, 5 %). Se agitó mezclando las fases y se dejó en reposo hasta su
ulterior separación. El ensayo se considera positivo, si la fase acuosa alcalina
(superior) se colorea de rosado o rojo.
3.5.2. Triterpenos y/o Esteroides: A una alícuota del extracto disuelto en
cloroformo (1 mL), se le adicionó de anhídrido acético (1 mL) y se mezcló. Por la
pared del tubo de ensayos se dejaron correr 2-3 gotas de H2SO4 (conc) sin
agitar. El ensayo se considera positivo al observar un cambio rápido de
coloración:

Rosado-azul.

Verde intenso.

Verde oscuro-negro al final de la reacción.
3.5.3. Fenoles y/o taninos: A una alícuota del extracto en etanol (1 mL), se le
adicionó una solución acuosa de FeCl3 (3 gotas, 5%). El ensayo se considera
positivo al observar un cambio de coloración.
 Rojo-vino, compuestos fenólicos en general.
 Verde intensa, taninos del tipo pirocatecólicos.
38
 Azul, taninos del tipo pirogalotánicos.
3.5.4. Azúcares reductores: A una alícuota del extracto disuelto en agua (1 mL),
se le adicionaron 2 mL del reactivo y la mezcla se calentó en un baño de agua
durante 5-10 minutos. El ensayo se considera positivo si la solución se colorea
de rojo o aparece un precipitado rojo.
3.5.5. Alcaloides: A una alícuota del extracto acuoso (1 mL), se le añadió 1 gota
de HCl (conc.), se calentó suavemente y se dejó enfriar hasta acidez. Con la
solución acuosa ácida, se realizó el ensayo, añadiendo 3 gotas del reactivo de
Dragendorff, Mayer o Wagner. El ensayo se considera positivo si hay
opalescencia, turbidez o precipitado.
3.5.6. Aminoácidos: A una alícuota del extracto en etanol (1 mL), se le
adicionaron 2 mL de una solución de ninhidrina al 2%. La mezcla se calentó
entre 5-10 minutos en baño de agua. Este ensayo se considera positivo cuando
se desarrolla un color azul violáceo.
3.5.7. Coumarinas: A una alícuota del extracto en CHCl3 (1 mL), se le adicionó
una solución acuosa de NaOH (1 mL, 5%). Se agitó mezclando las fases y se
dejó en reposo hasta su separación. El ensayo se considera positivo si la fase
acuosa alcalina (superior) se colorea de rosado o rojo. Coloración rosada (++),
coloración roja (+++).
3.5.8. Flavonoides: Una alícuota del extracto en etanol (1 mL), se diluyó con HCl
conc. (1 mL) y un pedacito de cinta de magnesio metálico. Después de la
reacción se esperó 5 minutos y se añadió alcohol amílico (1 mL), se mezclaron
las fases y se dejaron reposar hasta su separación expontanea. El ensayo se
considera positivo, cuando el alcohol amílico se colorea de amarillo, naranja,
carmelita o rojo; intenso en todos los casos.
39
3.6. Fraccionamiento cromatográfico de los extractos.
La separación y aislamiento de los metabolitos secundarios, provenientes del
liquen se realizó mediante el fraccionamiento de las fracciones y subfracciones
obtenidas, usando las siguientes técnicas cromatográficas.
3.6.1. Cromatografía de columna (CC): La separación de los componentes de
las diferentes fracciones se realizó en una columna cromatográfica de
dimensiones acorde con la masa de la fracción, utilizando sílica gel como fase
estacionaria, a una proporción 1:40 (g extracto: g sílica) y como fase móvil
disolventes o mezclas de solventes de polaridad creciente. Las cromatografías
en columna se realizaron empleando Silica gel Merck 60 (70-230 mesh).
3.6.2. Cromatografía de capa fina (CCF) y capa fina preparativa (CCFP): La
técnica de CCF se empleó con fines cualitativos, para la combinación de las
fracciones provenientes de la cromatografía de columna (CC). Se utilizaron
placas de silica gel Analtech HLF de 0.2 mm de espesor como fase estacionaria,
y como fase móvil, el solvente o mezcla de solventes con el cual se eluyeron las
subfracciones. Luego se midieron los factores de retención (Retention factor, Rf)
de las subfracciones, utilizando luz ultravioleta de onda corta o yodo como
agentes reveladores, y aquellas que mostraron un comportamiento similar según
sus Rf, se combinaron en una sola subfracción.
La CCFP se utilizó para separar y purificar los compuestos provenientes de las
subfracciones obtenidas. Esta técnica es semejante a la CCF, con la diferencia
de que el espesor de la sílica gel de la placa es mayor. Seguidamente se
desprendió la sílica de la placa correspondiente con la zona del compuesto
deseado. Luego, la sílica se colocó en un beaker o fiola y se agregó solvente,
para asegurar la extracción total del componente de la sílica gel, procediendo a
filtrar la solución y evaporando el solvente para obtener así el compuesto.
3.6.3. Cromatografía liquida de alta eficiencia (HPLC): Se utilizó un cromatógrafo
liquido de alta eficiencia WATERS, dotado con un detector de arreglo de diodo
40
(PDA) para el monitoreo de los compuestos presentes en el extracto obtenido,
utilizando una columna analítica fase reversa (Symmetry300 TM C18, 5µm - 3.9 ×
150 mm), y una columna preparativa de fase reversa (Symmetry300 TM C18
Prep. 5µm - 19 × 150 mm), para la purificación de los compuestos.
3.7. Caracterización General.
Todos los compuestos fueron caracterizados a través de las técnicas
espectroscópicas de UV, RMN 1H, RMN
13
C, COSY, HMQC, HMBC, Masas e
IR.
3.7.1. Resonancia Magnética Nuclear (RMN): En la realización de los espectros
de RMN, se contó con los espectrómetros Bruker AVANCE 300, AVANCE 500 y
Ascend 600. El solvente empleado fue CDCl3. Realizando experimentos
unidimensionales (RMN
1
H, RMN
13
C) y bidimensionales (COSY, NOESY,
HMQC, HMBC).
3.7.2. Infrarrojo (IR): Los espectros de IR se tomaron en un espectrómetro
Nicolet Magna 560 IRFT.
3.7.3. Espectrometría de Masas (EM): Los espectros de masas se llevaron a
cabo en un Thermo finnigan TSQ Quantum Ultra AM por medio de la técnica de
Ionización por electrospray (ESI).
3.7.4. Espectrometría UV-Vis: Los espectros UV fueron tomados en un
espectrofotómetro Agilent Technologies Cary 60 UV-Vis. Utilizando como blanco
el solvente con el que fue disuelta cada muestra.
3.7.5. Rotación óptica: La rotación óptica específica se midió en un polarímetro
digital PERKIN ELMER 341.
41
3.8. Separación, purificación, caracterización e identificación de los
compuestos mayoritarios.
El fraccionamiento de la fracción FCUa fue realizada por cromatografía en
columna (30 cm × 25 mm de diámetro), para obtener 9 subfracciones (FCSF1,
FCSF2,… FCSF9). La fracción FCSF3, obtenida como un sólido amarillo
utilizando como fase móvil: CHCl3 100%, fue repurificada por cromatografía en
columna utilizando Sephadex LH-20 (15 × 10 mm), fase móvil: Cl3CH/MeOH 9:1,
obteniéndose el compuesto A, el cual fue caracterizado.
La separación de los compuestos mayoritarios de la subfracción FCSF5 fue
realizada por TLC preparativa de silica gel (Placas de 20 × 20 cm, 2 mm de
espesor), fase móvil, CHCl3/MeOH 9:1, obteniendo ocho bandas (FCSF5-1,
FCSF5-2, … FCSF5-8). La banda mayoritaria FCSF5-4 fue removida de la placa
preparativa y retomada en CHCl3, finalmente el solvente fue evaporado en un
rotavapor hasta sequedad. La subfracción FCSF5-4 fue repurificada por HPLC
obteniéndose la subfracción FCSF5-4-44 (compuesto B) y FCSF5-4-49
(compuestos C1 y C2), bajo las siguientes condiciones:
- Columna semi-preparativa fase reversa C18
- Fase móvil: A: CH3CN
B: H2O (0.1% HCO2H)
- Gradiente: desde 10% hasta 100% de A en 80 minutos
- El flujo: 4 mL/min.
Una vez separados y purificados los compuestos, fueron realizados los
análisis necesarios para lograr su elucidación. El compuesto A resulto ser
conocido como el ácido úsnico, el compuesto B como el ácido cetrárico y la
subfracción FCSF5-4-49, resultó ser una mezcla inseparable de dos
metabolitos, C1 y C2, nombrados como ácido desmetil seudoplacodiólico C1 y el
ácido desmetil placodiólico C2, respectivamente, aislados por primera vez de la
naturaleza.
42
Compuestos A
RO
IR v max (cm-1):
= +445 (c 2.98, CHCl3)
3421 (O-H); 2925 (Csp3-H);
1692 (C=O); 1632 (C=C);
1289 (C-O-C)
EM (m/z):
C18H16O7 (344.09 g/mol)
ESI (+): [M + H]+ = 345.08
RMN 1H δ (ppm):
1.73, 2.08, 2.64, 2.65 (s, 3H c-u, H-10, H-15, H-12 y H-14); 5.95
(s, 1H, H-4); 11.00, 13.28, 18.81 (s, 1H c-u, 9-OH, 7-OH y
3-OH).
RMN 13C δ (ppm):
201.76 (C-11); 200.32 (C-13); 198.05 (C-1); 191.70 (C-3);
179.37 (C-4a); 163.88 (C-7); 157.50 (C-9); 155.20 (C-5a);
109.32 (C-8); 105.22 (C-2); 103.94 (C-9a); 101.52 (C-6); 98.32
(C-4); 59.07 (C-9b); 31.26 (C-14); 31.10 (C-10); 27.08 (C-12);
7.53 (C-15).
Compuestos B
IR v max (cm-1):
3378 (O-H); 2962 (Csp3-H);
1717 (C=O); 980 (C=C);
1284 (C-O-C)
EM (m/z):
C20H18O9 (402.19 g/mol)
ESI (-): [M - H]- = 401.08
RMN 1H δ (ppm):
1.21 (t, 3H, J = 6.9 Hz, H-2’’); 2.49, 2.62 (s, 3H c-u, H-8, H-8’);
3.61 (c, 2H, J = 6.9 Hz, H-1’’); 4.72 (s, 2H, H-9’); 6.69 (s, 1H,
43
H-5); 10.69 (s, 1H, H-9); 12.18 (s, 1H, 4-OH).
RMN 13C δ (ppm):
192.86 (C-9); 171.35 (C-7’); 165.76 (C-4); 163.88 (C-2); 159.43
(C-2’); 151.46 (C-7); 154.10 (C-6); 147.91 (C-4’); 142.82 (C-5’);
133.38 (C-6’); 117.81 (C-5); 110.99 (C-1’); 116.40 (C-3’); 112.60
(C-1); 110.99 (C-3); 66.48 (C-1’’); 61.57 (C-9’); 22.23 (C-8);
15.56 (C-8’); 15.27 (C-2’’).
Compuesto C1
IR v max (cm-1):
3252 (O-H); 2923 (Csp3-H);
1711 (C=O); 1631 (C=C);
1291 (C-O-C)
EM (m/z):
C18H18O8 (362.10 g/mol)
ESI (-): [M - H]- = 361.02
RMN 1H δ (ppm):
1.63, 2.00, 2.53, 2.55 (s, 3H c-u, H-10, H-15, H-12 y H-14); 3.22
(d, 1H, J = 17.0 Hz, H-4); 3.14 (d, 1H, J = 16.5 Hz, H-4); 3.84,
9.60, 13.29, 18.16 (s, 1H c-u, 4a-OH, 9-OH, 7-OH y 3-OH).
RMN 13C δ (ppm):
202.51 (C-11); 201.48 (C-13); 197.70 (C-1); 194.89 (C-3);
163.47 (C-7); 159.30 (C-9); 156.09 (C-5a); 110.46 (C-2); 107.72
(C-4a); 107.19 (C-8); 104.27 (C-9a); 101.67 (C-6); 58.73 (C-9b);
42.18 (C-4); 31.36 (C-14); 27.48 (C-12); 17.98 (C-10); 7.24
(C-15).
44
Compuesto C2
IR v max (cm-1):
3252 (O-H); 2924 (Csp3-H);
1711 (C=O); 1631 (C=C);
1291 (C-O-C).
EM (m/z):
C18H18O8 (362.10 g/mol)
ESI (-): [M - H]- = 361.02
RMN 1H δ (ppm):
1.64, 1.94, 2.63, 2.64 (s, 3H c-u, H-10, H-13, H-12 y H-15); 3.18
(d, 1H, J = 17.0 Hz, H-4); 3.13 (d, 1H, J = 17.0 Hz, H-4); 3.74,
9.86, 14.34, 18.20 (s, 1H c-u, 4a-OH, 9-OH, 7-OH y 3-OH).
RMN 13C δ (ppm):
203.97 (C-14); 202.55 (C-11); 198.20 (C-1); 195.09 (C-3);
165.60 (C-7); 159.72 (C-5a); 156.53 (C-9); 110.46 (C-2); 109.58
(C-4a); 106.73 (C-8); 103.71 (C-9a); 100.49 (C-6); 59.36 (C-9b);
42.22 (C-4); 32.90 (C-15); 27.56 (C-12); 17.79 (C-10); 7.58
(C-13).
45
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
4.1. Aislamiento y Caracterización
química del extracto etanólico del
liquen Usnea antarctica.
4.1.1. Recolección: el liquen Usnea antarctica (< 15 cm), fue recogido a mano e
inmediatamente colocado en etanol. La recolección se realizó durante el mes de
enero del 2013, en el sector de Punta Ambato, Isla Greenwich, Antártida,
coordenadas UTM 3073247.
4.1.2. Tratamiento de la muestra: La muestra fresca y limpia, se sometió a una
extracción con etanol por maceración (3 veces). Se concentró el extracto en un
rotavapor, y se obtuvo 3.8 g de extracto etanólico.
4.2. Análisis químico preliminar: Al extracto etanólico obtenido se le realizó un
análisis químico preliminar para detectar la posible presencia de diferentes
familias de compuestos tales como: quinonas, fenoles, alcaloides, coumarinas,
esteroles y triterpenos, entre otros. Mediante la metodología descrita por
Martínez M. y Cuellar A.77 El análisis de los metabolitos dio como resultado la
presencia de fenoles y azúcares reductores. Los resultados obtenidos se
muestran en la tabla XIII.
Tabla XIII. Análisis químico del extracto etanólico de Usnea antarctica.
Familia de metabolitos
Quinonas (Borntranger)
Triterpenos y Esteroles (LiebermanBurchard)
Fenoles y Taninos (Cloruro Férrico)
Azucares Reductores (Fehling)
Alcaloides (Dragendorff)
Alcaloides (Wagner)
Alcaloides (Mayer)
Aminoácidos
Coumarinas
Flavonoides
Extracto Etanólico
++
+
-
46
4.3. Fraccionamiento del extracto etanólico: Esto se realizó con el fin de
simplificar la composición del extracto, dividiendo los grupos de compuestos que
comparten características fisicoquímicas similares. Para esto se empleó el
método desarrollado por Kupchan.78 El fraccionamiento comenzó con la
distribución del extracto acuoso entre solventes inmiscibles y de diferentes
polaridades de menor a mayor polaridad. Los solventes empleados fueron:
Hexano, cloroformo y Acetato de Etilo (figura 10). Para luego eliminar el solvente
por rotaevaporación y liofilizar la fracción acuosa.
Figura 10. Proceso de extracción, separación y purificación del extracto etanólico del
liquen Usnea antarctica.
4.3.1. Análisis químico preliminar de las fracciones obtenidas: Una vez eliminado
el solvente a las diferentes fracciones, se les realizó un análisis químico
preliminar. Para la fracción hexánica FHUa, se observó resultados positivos para
esteroles y triterpenos evidenciándose una coloración verde claro a la prueba de
Liebermann-Burchard, así como un resultado positivo para Azúcares Reductores
y el test para Fenoles-Taninos. Por su parte la fracción clorofórmica FCUa,
arrojó la presencia de Fenoles-Taninos y Azúcares Reductores. Para la fracción
47
de Acetato de Etilo (FAUa), no se realizaron pruebas químicas debido a su bajo
rendimiento. Y la fracción acuosa (FAcUa) no fue considerada para el desarrollo
de este trabajo de grado. Los resultados obtenidos se muestran en la tabla XIV.
Tabla XIV: Análisis químico de la fracción hexánica y clorofórmica de Usnea antarctica.
Familia de metabolitos
FHUa
FCUa
Quinonas (Borntranger)
Triterpenos y Esteroles (Liebermann-Burchard)
++
Fenoles y Taninos (Cloruro Férrico)
+
+++
Azucares Reductores (Fehling)
+++
++
Alcaloides (Dragendorff)
Alcaloides (Wagner)
Alcaloides (Mayer)
Aminoácidos
Coumarinas
Flavonoides
FHUa: Fracción Hexánica, FCUa: Fracción Clorofórmica. (+): poca presencia, (++): presencia moderada,
(+++): presencia cuantiosa
4.4.1. Purificación de la fracción clorofórmica FCUa: La fracción FCUa (910 mg),
fue fraccionada empleando cromatografía de columna (30 cm x 25 mm de
diámetro). La elución se inició utilizando Cloroformo (100%), variando las
mezclas en polaridad creciente: CHCl3/CH3OH (95:5, 9:1, 4:1, 7:3, 1:1, 1:3) y
CH3OH 100%, obteniéndose 40 subfracciones. Estas subfracciones fueron
agrupadas de acuerdo a su similitud al analizarlos por TLC y revelados con luz
UV y yodo (figura 10, tabla XV).
Tabla XV. Peso de las subfracciones obtenidas de la fracción clorofórmica (FCUa)
Subfracciones
FCSF1
FCSF2
FCSF3
FCSF4
FCSF5
FCSF6
FCSF7
FCSF8
FCSF9
Subfracciones reagrupadas
1
2
3-13
14-15
16-21
22
23-25
26-33
34-40
Masa (mg)
35.8
140.3
295.8
38.0
92.3
42.5
55.0
79.0
65.0
Porcentaje (%)
4.08
15.99
33.71
4.33
10.52
4.84
6.27
9.00
7.41
4.4.1.1. Purificación de la subfracción FCSF3: La subfracción FCSF3, obtenida
de la fracción clorofórmica FCUa como un sólido amarillo, fue repurificada por
cromatografía en columna (15 x 10 mm), utilizando Sephadex LH-20 como fase
48
estacionaria y como fase móvil: CHCl3/CH3OH (9:1), obteniéndose el compuesto
A.
4.4.1.2. Purificación de la subfracción FCSF5: La subfracción FCSF5, obtenida
de la fracción clorofórmica FCUa, se sometió a una separación por
Cromatografía en placa preparativa (CPP) utilizando como eluyente una mezcla
de Hexano/AcOEt (7:3) obteniendo ocho bandas principales correspondientes a
las subfracciones FCSF5-1, FCSF5-2, … y FCSF5-8, destacando la subfracción
FCSF5-4 (28.4 mg, 32.27%; figura 10, tabla XVI).
Tabla XVI. Subfracciones obtenidas de FCSF5
Subfracciones
FCSF5-1
FCSF5-2
FCSF5-3
FCSF5-4
FCSF5-5
FCSF5-6
FCSF5-7
FCSF5-8
Masa (mg)
8.6
10.0
9.2
28.4
9.7
9.9
5.3
6.9
Porcentaje (%)
9.77
11.36
10.45
32.27
11.02
11.25
6.02
7.84
Finalmente la subfracción FCSF5-4 se purificó por HPLC (Parte
experimental, sección 3.8, figura 11), obteniéndose las subfracciones FCSF5-444 (compuesto B) y FCSF5-4-49 (compuestos C1 y C2), para su posterior
caracterización espectroscópica.
FCSF5-4-44
FCSF5-4-49
Figura 11. Cromatograma de la subfracción FCSF5-4 (en columna analítica).
49
5.5. Caracterización química de los metabolitos aislados de la fracción
clorofórmica (FCUa) del liquen Usnea antarctica.
Una vez separados y purificados los compuestos mayoritarios presentes
en extracto clorofórmico se procedió a la caracterización espectroscópica de los
mismos.
Compuesto A
El compuesto A fue aislado como un sólido amarillo y se disolvió en
CDCl3 para la realización de los análisis espectroscópicos de RMN de una y dos
dimensiones,
específicamente
RMN
1
H,
RMN
13
C,
HMQC
y
HMBC.
Adicionalmente, se realizó Espectroscopia Infrarroja y Espectrometría de Masas.
El espectro de ultravioleta del compuesto A (figura 12), tomado en
cloroformo, presentó absorciones a 240 y 284 nm, sugiriendo la presencia de un
grupo cromóforo conjugado.
Figura 12. Espectro ultravioleta del compuesto A.
En el espectro infrarrojo (figura 13) pudo verse la banda de absorción
para los grupos hidroxilo en 3421 cm-1, una banda en 2925 cm-1 debido a la
absorción del enlace C-H con hibridación sp3. Una banda en 1692 cm-1 debido al
estiramiento del doble enlace C=O del grupo carbonilo. Una banda en
1632 cm-1, correspondiente al alargamiento del doble enlace C=C y finalmente
50
una banda de absorción en 1289 cm-1 del alargamiento del C-O-C en el anillo.
100
Muest ra Au
90
1632.37
0
-10
3500
3000
2500
2000
1069.98
1039.45
10
1289.08
1190.54
1143.59
1117.60
20
1609.50
1542.74
1692.73
30
1453.171419.60
1375.26 1357.67
956.67
40
1500
696.25
596.36
567.82
532.15
50
924.56
3107.80
%Transmit tance
60
840.63
818.55
799.70
70
2925.86
3421.73
80
1000
500
Wavenumbers (cm-1)
Figura 13. Espectro infrarrojo del compuesto A.
El espectro de masas (figura 14) mediante la técnica ESI, exhibió un ión
molecular [M + H]+ a 345.08 m/z, concordante para una formula molecular
C18H16O7 (344.09 g/mol). Además, al comparar los datos espectroscópicos
obtenidos en los análisis de MS-ESI, y RMN de 1H y de
13
C para la fracción
FCSF3, con los reportados en la literatura79 para el ácido úsnico, se pudo inferir
que este compuesto estaba presente en la misma.
T: + c ESI Q1MS [50.000-800.000]
345.08
100
95
90
85
80
75
70
65
60
55
50
45
40
35
30
25
20
15
10
5
0
371.10
87.04
100
115.02
195.13
200
257.20
327.16
300
391.24
445.15
400
519.25
500
593.19
600
667.20
742.57
700
787.43
800
m/z
Figura 14. Espectro de masas del compuesto A.
El espectro de RMN
1
H del compuesto A (figura 15a), reveló tres
singletes a 11.0, 13.28 y 18.81 ppm, que integraron para un protón cada uno,
correspondientes a los grupos hidroxilos 9-OH, 7-OH y 3-OH, respectivamente
51
(figura 15b). En la región olefinica se observó la presencia de un singlete a 5.95
ppm, que integró para un protón, asignable a H-4. Y a campo alto, se
observaron cuatro singletes a 2.66, 2.64, 2.08 y 1.74 ppm que integraron para
tres protones cada uno, atribuibles a los protones metílicos H-14, H-12, H-15 y
H-10, respectivamente (figura 15c, tabla XVII).
0.98
20
15
2.6566
2.6415
2.0839
1.7389
11.0101
0.96
5.9575
13.2928
1.00
7.2400
18.8205
(a)
0.94
6.11 3.06
10
ppm
5
0
18.8205
13.2928
11.0101
(b)
1.00
0.96
0.98
19
18
17
16
15
ppm
14
13
12
11
2.7
2.6566
2.6415
2.0839
1.7389
(c)
6.11
2.95
3.06
2.6
2.5
2.4
1
2.3
2.2
ppm
2.1
2.0
1.9
1.8
1.7
Figura 15. Espectro de RMN H del compuesto A: Completo (a), ampliación a campo bajo
(b) y campo alto (c). (300 MHz, CDCl3).
52
Por otro lado, en el espectro de RMN
13
C (figura 16a), se corroboró la
presencia de 18 desplazamientos químicos bien definidos, dos metilos a 7.53 y
27.08 ppm correspondiente C-10 y C-15, y dos metilos unidos a carbonilos a
31.27 y 32.11 asignados a C-11 y C-14, respectivamente (figura 17). A 59.07
ppm, presentó una señal característica de un carbono cuaternario asignado a
C-9b. A campo bajo se observó señales de grupos carbonilos en 198.05, 200.32
y 201.77 ppm correspondientes a C-1, C-13 y C-11, respectivamente (figura
16b). En la tabla XVII se puede observar que los desplazamientos químicos de
los espectros de RMN1H y
13
C del compuesto A, son comparables a los
reportados en la literatura por Correche y col.79
200
150
100
ppm
7.5212
32.0997
31.2542
27.8721
59.0618
109.3195
105.2230
103.9402
101.5202
98.3203
157.4998
155.1965
163.8777
179.3668
201.7659
200.3154
198.0485
191.7071
(a)
50
200
190
180
170
Figura 16. Espectro de RMN
(b). (125 MHz, CDCl3).
160
13
150
ppm
140
130
120
110
105.2230
103.9402
101.5202
98.3203
109.3195
157.4998
155.1965
163.8777
179.3668
191.7071
201.7659
200.3154
198.0485
(b)
100
C del compuesto A: Completo (a), ampliación a campo bajo
60
55
50
45
40
35
30
ppm
Figura 17. Ampliación del espectro de RMN
CDCl3).
13
7.5212
27.8721
32.0997
31.2542
59.0618
53
25
20
15
10
5
0
C del compuesto A, a campo alto. (125 MHz,
Tabla XVII. Comparación de los resultados obtenido por RMN del compuesto A.
C
1
Compuesto A
1
13
H (ppm)
C (ppm)
(300 MHz, CDCl3)
(125 MHz, CDCl3)
198.05

Correche y col.
1
79
13
H (ppm)
(200 MHz, CDCl3)

C (ppm)
(25 MHz, CDCl3)
197.97
2

105.22

105.19
3
18.87 (s, 1H)
191.70
18.87 (s, 1H)
191.75
4
5.95 (s, 1H)
98.32
6.01 (s, 1H)
98.27
4a

179.37

179.31
5a

155.12

155.20
6

101.52

101.46
7
13.28 (s, 1H)
163.88
13.35 (s, 1H)
167.92
8

109.32

109.34
9
11.00 (s, 1H)
157.50
11.08 (s, 1H)
157.50
9a

103.94

103.94
9b

59.07

59.03
10
1.73 (s, 3H)
31.10
1.81 (s, 3H)
32.10
11

201.76

201,70
12
2.64 (s, 3H)
27.08
2.72 (s, 3H)
27.85
13

200.32

200.10
14
2.65 (s, 3H)
31.26
2.73 (s, 3H)
31.20
15
2.08 (s, 3H)
7.53
2.17 (s, 3H)
7.10
A pesar de concordar los datos de RMN 1H y
13
C con la literatura para el
ácido úsnico, se realizaron espectros HMQC y HMBC para corroborar nuestros
resultados. En este sentido, por medio del HMQC, se logró obtener las
correlaciones directas existentes entre las señales observadas en los espectros
54
de RMN de 1H y
13
C del compuesto A (figura 18a), entre las cuales, cabe
destacar la de los protones metílicos H-10, H-12, H-14 y H-15 con C-10, C-12,
C-14 y C-15, respectivamente. Y la del protón H-4 olefinico con C-4 (figura 18b).
(a)
J.
Villamizar / R. Vitieri / AU / CDCl3 / HMQC
ppm
0
20
40
60
80
100
120
140
160
180
200
24
22
20
18
16
14
12
10
8
6
4
2
0
-2
-4
ppm
(b)
J.
Villamizar
/
R.
Vitieri
/
AU
/
CDCl3
/
HMQC
ppm
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
6.0
5.5
5.0
4.5
4.0
3.5
3.0
2.5
2.0
1.5
1.0
ppm
Figura 18. Espectro de HMQC del compuesto A: Completo (a) y ampliación (b). (500 MHz,
CDCl3).
55
Así mismo, el espectro HMBC realizado al compuesto A (figura 19-20),
mostró las correlaciones entre protones y carbonos, a través de dos y tres
enlaces (correlaciones indirectas). Se observó que el protón 3-OH se
correlacionaba con C-3 a dos enlaces, y con C-2 y C-4 a tres enlaces. El protón
de 7-OH se correlacionaba con C-7 a dos enlaces y, con C-6 y C-8 a tres
enlaces. De la misma manera 9-OH, se correlaciona con C-9 a dos enlaces y
con C-8 y C-9a a tres enlaces. El protón H-4 mostró correlación con C-3 y C-4a
a dos enlaces y con C-2 y C-9b a tres enlaces. Para el caso de los protones
metílicos, H-10 se correlacionó con C-9b a dos enlaces y, con C-1, C-4a y C-9a
a tres enlaces. El protón metílico aromático H-15 se correlacionó con C-8 a dos
enlaces y con C-7 y C-9 a tres enlaces. Los protones metílicos alfa carbonilo
(H-12) se correlacionaron con C-11 a dos enlaces y con C-2 a tres enlaces y
H-14 se correlacionó con C-13 a dos enlaces y con C-6 a tres enlaces. Estos
resultados se resumen en la tabla XVIII.
Tabla XVIII. Resultados del experimento RMN-2D HMBC para el compuesto A.
C
1
H (ppm)
13
C (ppm)
HMBC (ppm)
1

198.05

2

105.22

3
18.87 (s, 1H)
191.70
191.70 (C-3); 98.32 (C-4); 105.22 (C-2)
4
5.95 (s, 1H)
98.32
191.70 (C-3); 179.37 (C-4a); 105.22 (C-2); 59.07 (C-9b)
4a

179.37

5a


155.20
6

101.52

7
13.28 (s, 1H)
163.88
101.52 (C-6); 163.88 (C-7); 109.32 (C-8)
8

109.32

9
11.00 (s, 1H)
157.50
157.50 (C-9); 109.32 (C-8); 103.94 (C-9a)
9a

103.94

9b

59.07

10
1.73 (s, 3H)
31.10
59.07 (C-9b); 198.05 (C-1); 179.37 (C-4a); 103.94 (C-9a)
11

201.76

12
201.76 (C-11); 105.22 (C-2)
2.64 (s, 3H)
27.08
13

200.32

14
2.65 (s, 3H)
31.26
200.32 (C-13); 101.52 (C-6)
15
2.08 (s, 3H)
7.53
109.32 (C-8); 163.88 (C-7); 157.50 (C-9)
56
(a)
Villamizar
/
R. J.Vitieri
Villamizar /
/ R.
AU
Vitieri
/ CDCl3
/ AU / /
CDCl3
HMBC
/ HMBC
ppm
0
20
40
60
80
100
120
140
160
180
200
18
16
14
12
10
8
6
4
2
ppm
(b)
J.
Villamizar
/
R.
Vitieri
/
AU
/
CDCl3
/
HMBC
ppm
90
95
100
105
110
115
120
2.9
2.8
2.7
2.6
2.5
2.4
2.3
2.2
2.1
2.0
1.9
1.8
1.7
1.6
1.5
ppm
Figura 19. Espectro de HMBC del compuesto A: completo (a) y ampliación (b). (500 MHz,
CDCl3).
57
(a)
J.
Villamizar
/
R.
Vitieri
/
AU
/
CDCl3
/
HMBC
ppm
155
160
165
170
175
180
185
2.9
2.8
2.7
2.6
2.5
2.4
2.3
2.2
2.1
2.0
1.9
1.8
1.7
1.6
1.5
ppm
(b)
J.
Villamizar
/
R.
Vitieri
/
AU
/
CDCl3
/
HMBC
ppm
185
190
195
200
205
210
215
2.9
2.8
2.7
2.6
2.5
2.4
2.3
2.2
2.1
2.0
1.9
1.8
1.7
1.6
1.5
ppm
Figura 20. Ampliaciones del espectro de HMBC del compuesto A (a-b). (500 MHz, CDCl3).
El análisis de los resultados mostrados nos llevó a corroborar el
aislamiento del ácido úsnico en la fracción FCSF3. Sin embargo, el centro quiral
ubicado en C-9b nos apuntó a realizar la medición de la rotación óptica de este
compuesto para conocer su configuración absoluta (figura 21), en vista de que
desde la naturaleza se han aislado las formas R-(+)-ácido úsnico y S-(-)-ácido
úsnico. En este sentido, el valor obtenido fue de
= +445, que al comparar
con datos previos,79 nos permitió concluir que la fracción FCSF3 correspondía
con la forma R-(+)-ácido úsnico (figura 22).
58
(a)
(b)
Figura 21. Correlaciones parciales (a-b) del compuesto A (HMBC).
Las correlaciones a larga distancia del resto de los protones mostraron
coherencia con la estructura química definitiva propuesta para el compuesto A
(figura 22).
Figura 22. Estructura química del compuesto A.
59
Detalles del aislamiento del ácido úsnico junto con las observaciones
sobre sus características físicas y químicas básicas, fueron descritas por
primera vez por Knop en 1844.80 El ácido úsnico es un compuesto amarillo y se
produce en dos formas enantioméricas, dependiendo de la proyección del metilo
en la posición angular C-9b quiral. La configuración absoluta del (+)-ácido
úsnico en 9b fue establecida como R- por Huneck en 1981 a través de un
análisis de rayos X. Además, entre los tautómeros posibles, es decir dos formas,
1,3 ceto-enol y una forma 1,3-dioxo, la conformación de baja energía de 1-oxo,
3-hidroxi se prefiere de acuerdo a los cálculos AM1.79
Compuesto B
El compuesto B fue aislado como un sólido blanco, y disuelto en CDCl3
para la realización de los análisis espectroscópicos de RMN 1H, RMN
HMQC,
HMBC,
COSY
y
NOESY,
para
su
posterior
13
C,
identificación.
Adicionalmente, se realizó Espectroscopia Infrarroja y Espectrometría de Masas.
El espectro de ultravioleta del compuesto B (figura 23), tomado en metanol,
presenta absorciones a 204, 235 y 298 nm.
Figura 23. Espectro ultravioleta del compuesto B.
En el espectro infrarrojo (figura 24) pudo verse la banda de absorción
para los grupos hidroxilo en 3378 cm-1, una banda en 2962 cm-1 debido a la
60
absorción del enlace C-H con hibridación sp3. Una banda en 1717 cm-1 debido al
estiramiento del doble enlace C=O del grupo aldehído. Una banda en 980 cm-1,
correspondiente al alargamiento del doble enlace C=C y finalmente una banda
de absorción en 1284 cm-1 del alargamiento del C-O-C en el anillo.
Figura 24. Espectro infrarrojo del compuesto B.
El espectro de masas (figura 25) mediante la técnica ESI, exhibió un ión
molecular [M - H]- a 401.08 m/z calculado para una formula molecular C20H18O9
(402.19 g/mol).
T: - c ESI Q1MS [50.000-1000.000]
401.08
100
95
90
85
80
75
70
65
60
55
50
45
40
35
30
25
20
15
10
5
0
61.90
100
195.30
200
255.10
325.20
300
373.02
417.06
400
500.94
500
m/z
Figura 25. Espectro de masas del compuesto B.
613.30
600
693.10
700
803.13
825.15
796.93
800
888.24
900
939.35
1000
61
Los datos espectroscópicos obtenidos de los análisis por MS-ESI y RMN
de 1H y de
13
C en CDCl3 son característicos del ácido cetrárico (comparando
con revisión bibliográfica).81,82 El espectro de RMN 1H del compuesto B (figura
26) reveló a 1.21 ppm un triplete que integró para tres protones, asignable a
H-2’’ (J = 6.9 Hz). A 3.61 ppm, un cuarteto que integró para dos protones,
correspondiente a H-1’’ (J = 6.9 Hz), que junto al triplete en 1.21 ppm son
característico de un grupo etilo. A 2.49 y 2.62 ppm, dos singletes que integraron
para tres protones cada uno, atribuibles a C-8 y C-8’, respectivamente (figura
27b). A 4.72 ppm, un singlete que integró para dos protones, concordante con
H-9’. En la zona aromática, se observó la presencia de un singlete a 6.69 ppm,
que integró para un protón, debido a H-5. Finalmente, a campo bajo se
observaron dos señales características del grupo aldehídico (H-9) y fenólico
(4-OH) a 10.69 y 12.18 ppm, respectivamente integrando para un protón cada
12
11
10
9
8
1
7
ppm
6
5
2.11
4
Figura 26. Espectro de RMN H del compuesto B. (600 MHz, CDCl3).
1.2239
1.2121
2.00
2.6202
2.4928
1.04
3.6309
3.6194
3.6076
3.5962
4.7186
1.04
6.6851
10.6893
1.07
7.2400
12.1756
una (figura 27a, tabla XIX).
3.10
3
3.09
2
1
62
1.04
12.0
11.5
11.0
6.6851
10.6893
1.07
7.2400
12.1756
(a)
1.04
10.5
10.0
9.5
ppm
9.0
8.5
8.0
7.5
7.0
2.6202
2.4928
1.2239
1.2121
1.2006
(b)
3.10
2.99
3.09
2.5
2.0
1.5
ppm
1
Figura 27. Espectro de RMN H del compuesto B, a campo bajo (a) y campo alto (b). (600
MHz, CDCl3).
Por otro lado, en el espectro de RMN
13
C (figura 28a), se observó la
presencia de 20 desplazamientos químicos, tres metilos a 15.27, 15.56 y 22.23
ppm correspondientes a C-2’’, C-8’ y C-8, respectivamente (figura 28c). Se
observaron señales características de carbonos metilénicos a 61.57 y 66.48
ppm, asignables a H-9’ y H-1’’, respectivamente. Al encontrar trece señales
entre 110 y 165 ppm se corroboró que la estructura tiene dos anillo aromáticos
multisustituídos (figura 28b). A campo bajo se observó una señal de grupo
carbonilo de aldehído (C-9) en 192.86 ppm. El resto de las señales se pueden
apreciar en la tabla XIX.
(a)
(b)
(c)
192.8588
190
65
192.8588
61.5692
60
180
150
55
170
50
13
171.3562
160
45
159.4314
150
ppm
40
ppm
154.1031
151.4645
171.3562
165.7655
163.8777
159.4314
154.1031
151.4645
147.9147
142.8197
133.3805
165.7655
163.8777
100
ppm
117.8111
116.7324
116.3971
112.5995
110.9813
147.9147
35
142.8197
140
30
66.4820
61.5692
133.3805
130
25
50
22.2304
120
20
15
110
15.5537
15.2621
117.8111
116.7324
116.3971
112.5995
110.9813
22.2304
15.5537
15.2621
10
63
Figura 28. Espectro de RMN C del compuesto B, completo (a), a campo bajo (b) y a
campo alto (c). (125 MHz, CDCl3).
66.4820
64
En la tabla XIX se presentan los resultados de RMN 1H y
13
C obtenidos
en este trabajo para el compuesto B y los reportados en la literatura para el
ácido cetrárico por Stepanenko y col.81. Sin embargo, a pesar de concordar los
datos de RMN 1H y
13
C con la literatura, se realizaron espectros HMQC, HMBC
y NOESY para corroborar inequívocamente el aislamiento del mismo. En este
sentido por medio del HMQC, se lograron obtener las correlaciones directas
existentes entre las señales observadas en los espectros de RMN de 1H y
13
C
del compuesto B (figura 29a), entre las cuales, cabe destacar la de los protones
metílicos H-8, H-8’ y H-2’’ con C-8, C-8’y C-2’’, respectivamente (figura 29b). La
de los protones metilénicos H-9’ y H-1’’ con C-9’ y C-1’’, respectivamente (figura
30a). Y la correlación del protón aldehídico H-9 con C-9 (figura 30b).
Tabla XIX. Comparación de las señales obtenidas en RMN del compuesto B con datos
reportados en la literatura.
C
1
81
Compuesto B
Stepanenko y col.
13
1
H (ppm)
C (ppm)
H (ppm)
(600 MHz, CDCl3) (125 MHz, CDCl3) (250 MHz, CDCl3)
112.6


1
Shen y col.
1
H (ppm)
82
13
C (ppm)

116.1
2

163.8


163.7
3

110.9


111.9
4
12.18 (s, 1H)
165.7
12.2 (s, 1H

164.1
5
6.69 (s, 1H)
117.8
6.72 (s, 1H
6.82 (s, 1H)
117.1
6

154.1

154.7
7

151.4

151.5
8
2.49 (s, 3H)
22.2
2.51 (s, 3H)

21.3
9
10.69 (s, 1H)
192.8
10.71 (s, 1H)
10.59 (s, 1H)
191.6
1’

110.9


111.9
2’

159.4


161.0
3’

116.4


116.1
4’

147.9


145.5
5’

142.8


142.3
6’

133.3


130.7
7’

171.3


170.2
8’
2.62 (s, 3H)
15.5
2.67 (s, 3H)

15.2
9’
4.72 (s, 2H)
61.5
4.76 (s, 2H)
4.53 (s, 2H)
60.4
1’’
2’’
3.61 (m, 2H)
1.21 (m, 3H)
66.4
15.2
3.66 (m, 2H)
1.09 (m, 3H)
3.45 (m, 2H)
1.11 (m, 3H)
65.1
14.5
65
(a)
ppm
0
20
40
60
80
100
120
140
160
180
11
10
9
8
7
6
5
4
3
2
1
0
ppm
(b)
ppm
11
12
13
14
15
16
17
18
19
20
21
22
23
24
25
2.9
2.8
2.7
2.6
2.5
2.4
2.3
2.2
2.1
2.0
1.9
1.8
1.7
1.6
1.5
1.4
1.3
1.2
1.1
ppm
Figura 29. Espectro de HMQC del compuesto B, completo (a) y ampliación (b). (500 MHz,
CDCl3).
66
(a)
ppm
57
58
59
60
61
62
63
64
65
66
67
68
69
70
71
5.1
5.0
4.9
4.8
4.7
4.6
4.5
4.4
4.3
4.2
4.1
4.0
3.9
3.8
3.7
3.6
3.5
3.4
ppm
(b)
ppm
115
120
125
130
135
140
145
150
155
160
165
170
175
180
185
190
195
11.0
10.5
10.0
9.5
9.0
8.5
8.0
7.5
7.0
6.5
ppm
Figura 30. Ampliaciones del espectro de HMQC del compuesto B (a-b). (500 MHz, CDCl3).
Así mismo, el espectro HMBC realizado al compuesto B (figura 31-33)
mostró las correlaciones entre protones y carbonos, a través de dos y tres
enlaces (correlaciones indirectas). Se observó que el protón 4-OH se
correlacionaba con C-4 a dos enlaces, y con C-3 y C-5 a tres enlaces. El protón
H-5 mostró correlación con C-1, C-3 y C-8 a tres enlaces. El protón de H-9’ se
correlacionó con C-3’ a dos enlaces y con C-1’’, C-2’ y C-4' a tres enlaces. De la
misma manera H-1’’, se correlacionó con C-2’’ a dos enlaces y con C-9’ a tres
enlaces. Para el caso de los protones metílicos, H-8’ se correlacionó con C-6’ a
dos enlaces y, con C-1’ y C-5’ a tres enlaces. El protón metílico aromático H-8
67
se correlacionó con C-6 a dos enlaces, y con C-1 y C-5 a tres enlaces. Y el
protón metílico beta al grupo eter (H-2’’) se correlacionó con C-1’’ (tabla XX).
(a)
ppm
0
20
40
60
80
100
120
140
160
180
200
14
13
12
11
10
9
8
7
6
5
4
3
2
1
0
-1
ppm
(b)
J.
T=
Villamizar /
40 (5,4 mg)
R.
Vitieri
/
V44ZV
/
CDCl3
/
HMBC
ppm
105
110
115
120
125
130
135
140
145
150
155
160
165
170
175
180
185
190
195
200
12.4
12.2
12.0
11.8
11.6
11.4
11.2
11.0
10.8
10.6
10.4
ppm
Figura 31. Espectro HMBC del compuesto B, completo (a) y ampliación (b). (500 MHz,
CDCl3).
68
(a)
J. Villamizar / R. Vitieri / V44ZV / CDCl3 / HMBC
T= 40 (5,4 mg)
ppm
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
110
120
130
140
150
160
170
7.5
7.0
6.5
6.0
5.5
5.0
4.5
4.0
3.5
ppm
(b)
T= 40 (5,4 mg)
ppm
110
115
120
125
130
135
140
145
150
155
2.64
2.62
2.60
2.58
2.56
2.54
2.52
2.50
2.48
Figura 32. Ampliación del espectro de HMBC del compuesto B (a-b). (500 MHz, CDCl3).
ppm
69
T=
40
(5,4
mg)
ppm
61
62
63
64
65
66
67
68
69
70
71
72
73
74
1.28
1.26
1.24
1.22
1.20
1.18
1.16
1.14
1.12
1.10
ppm
Figura 33. Ampliación del espectro de HMBC del compuesto B. (500 MHz, CDCl3).
Tabla XX. Resultados del experimento RMN-2D HMBC para el compuesto B.
C
Compuesto B
1
H (ppm)
13
C (ppm)
HMBC (ppm)
1

112.60

2


163.87
3

110.99

4
12.18 (s, 1H)
165.76
110.99 (C-3); 117.81 (C-5); 165.76 (C-4)
5
6.69 (s, 1H)
117.81
112.60 (C-1); 110.99 (C-3); 22.23 (C-8)
6
154.10
7
151.40
8
2.49 (s, 3H)
22.23
112.60 (C-1); 117.81 (C-5); 154.10 (C-6)
9
10.69 (s, 1H)
192.86
165.76 (C-4)
1’

110.99

2’

159.43

3’

116.40

4’

147.91

5’

142.82

6’

133.38

7’

171.35

8’
2.62 (s, 3H)
15.56
133.38 (C-6’); 142.82 (C-5’); 110.99 (C-1’)
9’
4.72 (s, 2H)
61.57
116.40 (C-3’); 147.91 (C-4’); 159.43 (C-2’); 66.48 (C-1’’)
1’’
3.61 (c, 2H)
66.48
15.27 (C-2’’); 61.57 (C-9’)
2’’
1.21 (t, 3H)
15.27
66.48 (C-1’’)
70
Por otro lado, el experimento NOESY realizado al compuesto B (figura
34a) mostró una correlación espacial entre el protón H-9 del grupo aldehído y
los protones metílicos H-8’ (ampliación 34b). En este sentido, el análisis de
todos estos resultados mostrados nos llevaron a corroborar el aislamiento del
ácido cetrárico (figura 35).
(a)
ppm
0
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
12
11
10
9
8
7
6
5
4
3
2
1
0
ppm
(b)
ppm
2.3
2.4
2.5
2.6
2.7
2.8
2.9
3.0
11.1
11.0
10.9
10.8
10.7
10.6
10.5
10.4
ppm
Figura 34. Espectro de NOESY del compuesto B (a) y ampliación (b). (500 MHz, CDCl3).
71
(a)
15.27
(1.21)
66.48
(3.61)
22.23
(2,49)
151.40
154.10
117.81
(6.69)
61.57
(4.72)
O
112.60
O
O
116.40
OH
147.91
159.43
163.87
O
165.76
HO
163.87
(12.18)
142.83
110.99
110.99
133.38
CO2H
171.35
CHO
15.56
(2.62)
192.86
(10.69)
NOE
(b)
Figura 35. Correlaciones parciales (a-b) del compuesto B (HMBC).
A continuación se muestra en la figura 36 la estructura química definitiva
propuesto para el compuesto B. Y se puede observar que las correlaciones a
larga distancia del resto de los protones muestran coherencia con la estructura
en la figura 36.
72
2''
1''
O
8
O
7
6
3'
1
5
4'
OH
2'
5'
2
4
O
3
HO
CHO
9
O
9'
1'
6'
7'
CO2H
8'
Figura 36. Estructura química del compuesto B.
En base a la bibliografía reportada, se puede ver que hay muy poca
información disponible sobre el aislamiento del ácido cetrárico, también llamado
cetrarin o stictin. La presencia de ácido cetrárico fue reportada por O. Hesse,
quien considera que es formado a partir del ácido fumarprotocetrárico bajo la
acción de etanol durante el aislamiento.83 Stepanenko y col.81 en 1996, aisló el
ácido cetrárico a partir del liquen Cetraria islandica, reportando datos
espectroscópicos de RMN 1H muy parecidos al presente trabajo. Por otra parte,
Carlos y col.84 en el 2008, evaluaron el efecto estimulante en la producción de
peróxido de hidrogeno (H2O2) y óxido nítrico (NO) del ácido cetrárico (obtenido
como un derivado sintético del ácido protocetrárico) y otros derivados. El ácido
cetrárico mostró una producción significativa de NO (90 µmol/5 x 10 5 células).
Además, Debra Rayburn en su libro llamado Let's Get Natural with Herbs,
describe las propiedades medicinales del liquen Cetraria ericetorum como:
antibiótico, antiemético, antiinflamatorio, expectorante, estimulante y tónico. Y el
ácido cetrárico, uno de los metabolitos mayoritarios presente en este liquen, es
utilizado como estimulante a una dosis media de 0.099-0.2 g.85
73
Compuesto C1 y C2 (mezcla)
La mezcla de compuestos C1-C2 (11 mg) fue aislada como un sólido
amarillo amorfo, fue disuelto en cloroformo deuterado, para la realización de los
análisis espectroscópicos de RMN 1H, RMN
NOESY
para
su
posterior
identificación.
13
C, HMQC, HMBC, COSY y
Adicionalmente,
se
realizó
Espectroscopia Infrarroja y Espectrometría de masas. El espectro de ultravioleta
de la mezcla C1-C2 (figura 37), tomado en cloroformo, presentó absorciones a
240 y 285 nm, sugiriendo la presencia de un grupo cromóforo conjugado.
Figura 37. Espectro ultravioleta de la mezcla de compuestos C1 y C2.
El espectro infrarrojo (figura 38) del compuesto C1-C2 mostró bandas de
absorción también muy similares al espectro del compuesto A. Una banda de
absorción para los grupos hidroxilo en 3252 cm -1, una banda en 2923 cm-1
debido a la absorción del enlace C-H con hibridación sp3. Una banda en 1711
cm-1 debido al estiramiento del doble enlace C=O del grupo carbonilo. Una
banda en 1631 cm-1, correspondiente al alargamiento del doble enlace C=C y
finalmente una banda de absorción en 1291 cm -1 del alargamiento del C-O-C en
el anillo.
74
100
892.37
846.95
807.86
721.58
1463.20
1400.74
2923.91
10
1368.67
20
2852.97
2958.18
30
1630.53
40
1712.44
50
1743.35
%Transmit tance
60
3154.75
3393.46
70
1317.86
1291.94
1202.78
1259.86
1164.03
1119.62
1027.98
986.35
80
668.69
610.51
581.30 521.96
464.22
49VT1 KBr
90
0
-10
4000
3500
3000
2500
2000
1500
1000
500
Wavenumbers (cm-1)
Figura 38. Espectro infrarrojo de la mezcla de los compuestos C1-C2.
El espectro de masas (figura 39) mediante la técnica ESI-MS, exhibió un
ión molecular [M - H]- a 361.02 m/z, calculado para una formula molecular
C18H18O8 (362.10 g/mol).
T: - c ESI Q1MS [100.000-700.000]
361.02
100
95
90
85
80
75
70
65
60
55
50
45
40
35
30
25
20
15
10
5
0
157.19
150
190.13
200
235.12
265.11
250
319.05
300
379.01
350
407.05
400
m/z
459.09
450
497.00
500
539.28
550
597.24
600
659.29
650
Figura 39. Espectro de Masas del compuesto C1-C2.
Es importante mencionar que en el espectro RMN 1H se evidencio la
presencia de dos compuestos (C1 y C2) en proporción 72:28, y se asignaron las
señales mayoritarias a C1 y las minoritarias a C2. El compuesto C1, mostró
nueve señales que integraron para un total de dieciocho protones (figura 40). En
la tabla XXI se muestran los desplazamientos de RMN 1H del compuesto C1
junto con los desplazamientos del compuesto A (ácido úsnico) y como se puede
observar, este último, presentó desplazamientos químicos similares al
75
compuesto C1, con la diferencia de dos dobletes que integraron para un protón
cada uno a 3.22 y 3.14 ppm (J = 16.96 y 16.50 Hz, H-4), lo que nos permitió
inferir (con ayuda de los resultados anteriores, IR y EM) que en lugar del ácido
úsnico, el compuesto C1, posee dos protones en el carbono C-4 y un grupo
hidroxilo en el carbono C-4a (figura 41b).
1
Tabla XXI. Comparación de los desplazamientos químicos de RMN H del compuesto A
con los desplazamientos del compuesto C1
Compuesto A
1
H (ppm)
1.73 (s, 3H)
Compuesto C1
1
H (ppm)
1.63 (s, 3H)
2.08 (s, 3H)
2.00 (s, 3H)
2.64 (s, 3H)
2.54 (s, 3H)
2.65 (s, 3H)
2.55 (s, 3H)
3.14-3.11(d, 1H, J = 16.50 Hz)
3.26-3.22(d, 1H, J = 16.96 Hz)
3.84 (s, 1H)
5.95 (s, 1H)
18
17
16
15
14
12
11
10
ppm
9
8
7
3.8419
3.7439
3.2554
3.2215
3.1281
2.6763
2.5581
2.5406
2.0064
1.9367
1.6306
9.8637
9.6153
13
1
7.2400
13.31 (s, 1H)
18.16 (s, 1H)
13.3112
13.28 (s, 1H)
18.87 (s, 1H)
14.3422
9.61 (s, 1H)
18.1929
18.1645
11.00 (s, 1H)
6
Figura 40. Espectro de RMN H del compuesto C1. (500 MHz, CDCl3).
5
4
3
2
76
18
17
16
15
14
ppm
9.8637
9.6153
13.3112
14.3422
18.1929
18.1645
(a)
13
12
11
10
1
ppm
2.0
1.6416
1.6306
2.5
1.9367
2.0064
3.0
2.5581
2.5406
3.5
2.6763
2.6332
3.2554
3.2215
3.2115
3.1775
3.1427
3.1281
3.1097
3.0942
3.7439
3.8419
(b)
Figura 41. Espectro de RMN H del compuesto C1, a campo bajo (a) y campo alto (b). (500
MHz, CDCl3).
El espectro de RMN
13
C (figura 42a) presentó 18 señales bien definidas,
dos metilos a 7.24 y 17.98 ppm correspondiente a C-10 y C-15, y dos metilos
unidos a carbonilos a 27.48 y 31.36 asignables a C-12 y C-14, respectivamente.
A 58.73 ppm, se observó una señal característica de un carbono cuaternario,
concordante con C-9b (figura 42c). A campo bajo, se observaron las señales de
los grupos carbonilos en 197.70, 201.48 y 202.51 ppm, pertenecientes a C-1,
C-13 y C-11, respectivamente (figura 42b). El resto de las señales se pueden
apreciar en la tabla XXII, comparándose con las correspondientes al compuesto
A, y se puede observar que la diferencia más significativa esta entre los
carbonos C-4, C-4a y C-10.
200
(a)
(b)
200
(c)
60
202.5132
201.4731
197.6983
194.8836
190
55
50
180
150
45
40
163.4705
160
159.2957
156.0882
35
100
ppm
31.3524
150
ppm
ppm
110.5796
107.7140
107.1830
104.2665
101.6699
30
140
27.4685
25
130
58.7288
20
50
120
17.9696
42.1749
15
110
10
100
7.2344
31.3524
27.4685
110.5796
107.7140
107.1830
104.2665
101.6699
17.9696
7.2344
77
0
5
C del compuesto C1, completo (a), campo bajo (b) y campo
13
42.1749
163.4705
159.2957
156.0882
170
Figura 42. Espectro de RMN
alto (c). (75.47 MHz, CDCl3).
58.7288
202.5132
201.4731
197.6983
194.8836
78
Tabla XXII: Comparación de los desplazamientos químicos de RMN
con los desplazamientos del compuesto C1
Nº. Carbono
1
2
3
4
4a
5a
6
7
8
9
9a
9b
10
11
12
13
14
15
δ del compuesto A
198.05
105.22
191.70
98.32
179.37
155.20
101.52
163.88
109.32
157.50
103.94
59.07
31.10
201.76
27.08
200.32
31.26
7.53
13
C del compuesto A
δ del compuesto C1
197.70
110.58
194.89
42.18
107.72
156.09
101.67
163.47
107.19
159.30
104.27
58.73
17.98
202.51
27.48
201.48
31.36
7.24
El parecido entre los desplazamientos químicos en RMN
13
C del
compuesto A (ácido usnico) y el compuesto C1, ademas del masas y el IR, nos
permitieron inferir que estabamos en presencia de un precursor o derivado del
ácido úsnico. Los datos espectroscopicos de RMN
13
C nos indicaron que la
molécula tenía 18 carbonos, de los cuales tres eran carbonilos y tres
correspondían a carbonos con sustituyentes hidroxílicos, lo que nos sugirió la
presencia como mínimo de 6 átomos de oxígeno. Por otro lado, los datos de
RMN
1
H nos revelaron la presencia de 18 hidrogenos, de estos, catorce
correspondían a hidrógenos unidos a carbonos y tres a hidrógenos unidos a
oxígeno.
En este sentido, por medio del HMQC (figura 43), se lograron obtener las
correlaciones directas entre las señales observadas en los espectros de RMN
de 1H y
13
C del compuesto C1. Entre las correlaciones observadas tenemos las
del carbono en 42.18 ppm (C-4) asignada a un carbono metilénico con sus
respectivos protones centrado en 3.28 y 3.16 ppm (H-4). Las señales a campo
alto asignadas a los carbonos metílicos en 7.24 (C-15), 17.98 (C-10), 27.46
(C-12) y 31.36 ppm (C-14), con los protones en 2.00, 1.63, 2.55 y 2.53 ppm
(H-15, H-10, H-12 y H-14, respectivamente).
79
J. Villamizar / R. Vitieri / 49vt / CDCl3 / HMQC
ppm
5
10
15
20
25
30
35
40
45
4.0
3.5
3.0
2.5
2.0
1.5
1.0
ppm
Figura 43. Ampliación del Espectro HMQC del compuesto C1, donde se observan las
correlaciones de los carbonos metílicos con sus respectivos protones. (500 MHz, CDCl3).
Entre las correlaciones del espectro HMBC (figuras 44-45) se observó
que el protón 3-OH se correlacionaba con C-3, a dos enlaces y, con C-2 y C-4 a
tres enlaces. El protón de 7-OH se correlacionaba con C-7 a dos enlaces y, con
C-6 y C-8 a tres enlaces. De la misma manera, 9-OH se correlacionó con C-9 a
dos enlaces y con C-8 y C-9a a tres enlaces. El protón de 4a-OH se correlacionó
con C-4 a tres enlaces. Los protones metilénicos H-4 mostraron correlación con
C-3 y C-4a a dos enlaces y con C-2 y C-9b a tres enlaces. Para el caso de los
protones metílicos, H-10 se correlacionó con C-9b a dos enlaces y, con C-1,
C-4a y C-9a a tres enlaces. El protón metílico aromático H-15 se correlacionó
con C-8 a dos enlaces y con C-7 y C-9 a tres enlaces. Los protones metílicos
alfa a carbonilo (H-12) se correlacionaron con C-11 a dos enlaces y con C-2 a
tres enlaces y H-14 se correlacionó con C-13 a dos enlaces y con C-6 a tres
enlaces.
amizar
80
/
(a)
R. J.
Vitieri
Villamizar /
/ R.
49vt
Vitieri
/ CDCl3
/ 49vt / /
CDCl3
HMBC
/ HMBC
ppm
0
20
40
60
80
100
120
140
160
180
200
18
16
14
12
10
8
6
4
2
0
ppm
(b)
J.
Villamizar
/
R.
Vitieri
/
49vt
/
CDCl3
/
HMBC
ppm
50
55
60
65
70
75
80
85
90
95
100
105
110
115
120
3.6
3.4
3.2
3.0
2.8
2.6
2.4
2.2
2.0
1.8
1.6
1.4
ppm
Figura 44. Espectro HMBC del compuesto C1, completo (a) y ampliación (b). (500 MHz,
CDCl3).
81
(a)
J.
Villamizar
/
R.
Vitieri
/
49vt
/
CDCl3
/
HMBC
ppm
98
99
100
101
102
103
104
105
106
107
108
109
110
111
112
113
114
115
2.3
2.2
2.1
2.0
1.9
1.8
1.7
1.6
1.5
1.4
ppm
(b)
J. Villamizar / R. Vitieri / 49vt / CDCl3 / HMBC
ppm
189
190
191
192
193
194
195
196
197
198
199
200
201
202
203
204
205
206
207
208
3.5
3.4
3.3
3.2
3.1
3.0
2.9
2.8
2.7
2.6
2.5
2.4
2.3
2.2
2.1
2.0
1.9
1.8
1.7
1.6
1.5
1.4
ppm
Figura 45. Ampliaciones del espectro HMBC del compuesto C1 (a-b). (500 MHz, CDCl3).
82
El análisis de los resultados mostrados nos llevó a la construcción de la
siguiente
estructura
química,
donde
se
muestran
las
correlaciones
correspondientes (figura 46a y b).
(a)
(b)
Figura 46. Correlaciones parciales (a-b) del compuesto C1 (HMBC).
Los experimentos de RMN-2D, realizados al compuesto C1, mostraron
señales y patrones de correlaciones muy similares a los resultados obtenidos
para el compuesto A, fortaleciendo el análisis realizado hasta el momento, por lo
que puede proponerse una estructura (figura 47) a partir de estos datos y los
83
anteriores. La revisión bibliográfica nos llevó a encontrar en la literatura el
aislamiento del ácido seudoplacodiólico 81 a partir del liquen Rhizoplaca
chrysoleuca por Huneck y col.86 en 1981, que al comparar sus desplazamientos
químicos con el compuesto C1, se observó que solo difiere en un grupo metoxi
(-OCH3) en la posición C-4a para el ácido seudoplacodiólico, mientras que para
el compuesto C1 es un grupo hidroxilo (-OH) en la posición C-4a.
81
Esta estructura propuesta para el compuesto C1, puede ser nombrada
como el ácido desmetil seudoplacodiólico, un compuesto nuevo, posiblemente
precursor del ácido úsnico, aislado por primera vez a partir del liquen Usnea
antarctica. En la tabla XXIII se muestran los resultados de RMN con las
asignaciones respectivas para cada protón y carbono de la estructura.
Figura 47. Estructura química propuesta para el compuesto C1.
84
Tabla XXIII. Resultados de los experimentos de RMN correspondiente al compuesto C1
1
C
1
2
3
4
4ª
5ª
6
7
8
9
9ª
9b
10
11
12
13
14
15
a
a
13
H (ppm)


18.16 (s, 1H)
3.14-3.11 (d, 1H, J = 16.5)
3.26-3.22 (d, 1H, J = 17.0)
3.84 (s, 1H)


13.31 (s, 1H)

9.61 (s, 1H)


1.63 (s, 3H)

2.55 (s, 3H)

2.54 (s, 3H)
2.00 (s, 3H)
C (ppm)
197.70
110.46
194.89
42.18
COSY
HMBC



H-4,H-4
C-3; C-4a; C-2; C-9b








C-9b; C-1; C-4a; C-9a

C-11; C-2

C-13; C-6
C-8; C-7; C-9
107.72
156.09
101.67
163.47
107.19
159.30
104.27
58.73
17.98
202.51
27.48
201.48
31.36
7.24
Las J de acoplamiento están dadas en Hz.
El nuevo compuesto C1, se obtuvo como un sólido amorfo amarillento a
partir de la fracción clorofórmica y se le asignó la formula molecular C 18H18O8
por ESI-MS. A pesar de que se apreció como una sola mancha bien definida en
el TLC, tanto el 1H y
13
C RMN, indicaron la presencia de dos compuestos, C1 y
C2, en una proporción de 72:28 (figura 48). La relación se dedujo a partir de la
integración exacta de los singletes metílicos diferenciados en 2.00 y 1.93 ppm,
respectivamente. De acuerdo con el espectro de RMN 1H para esta mezcla, se
consideró que se trataba de dos (02) isómeros, los cuales fueron confirmados
por medio de un gases masas (figura 49). Los datos de RMN, ESI-MS y UV
1.9367
2.0064
señalan similitudes entre los isómeros C1 y C2 y el ácido úsnico (compuesto A).
3.00
2.03
2.02
2.01
1.19
2.00
1.99
1
1.98
ppm
1.97
1.96
1.95
Figura 48. Espectro de RMN H a campo alto para la mezcla C1-C2.
1.94
1.93
85
Figura 49. Cromatograma de FCSF5-4-49 por GC-MS.
A
B
C
A
C1
C2
En este sentido, el compuesto principal de la mezcla (C1), mostró tres
grupos ceto (202.97, 201.48 y 197.70 ppm) y cuatro grupos metilo (31.36, 27.48,
17.98 y 7.24 ppm). Además la presencia de un grupo hidroxilo (3.84 ppm) en la
posición C-4a. Esta hipótesis fue confirmada en el espectro de RMN 1H por los
dos dobletes centrados en 3.24 y 3.13 ppm (J = 16.7 Hz) para el compuesto C1
y los dobletes centrados en 3.19 y 3.11 ppm (J = 16.9 Hz) para el compuesto
C2, ambos correspondientes al sistema metilénico geminal H2-4. Por otro lado,
la comparación entre la banda UV más alta bien definida a 285 nm para la
86
mezcla con el de 284 nm para A, sugirió similitudes estructurales, características
de la serie del ácido úsnico. Además, el ESI-MS de los isómeros, indicaron una
diferencia de 18 uma (unidad de masa atómica) mayor que el ácido úsnico ([M +
H]+ = 363 m/z), debido a la adición de un grupo hidroxilo en C-4a. Un análisis
detallado de los espectros de RMN
13
C, de C1 y C2 (tabla XXIV) sugiere el
mismo patrón del anillo C para ambos. Se encontró que solo difieren por
modificaciones de un patrón de sustitución en el anillo A (6-acetil-8-metil, para
C1 y 6-metil-8-acetil, para C2), tal como se ha señalado con claridad en los
desplazamientos químicos para C-13, C-14 y C-15. Los cambios de posición en
los grupos metilo y acetilo en el anillo A, están marcados por sus
desplazamientos químicos, C-13 en 7.58 ppm para C2 (en vez de 201.48 ppm
para C1), C-14 en 203.97 ppm para C2 (en lugar de 31.36 ppm para C1) y C-15
en 32.90 ppm para C2 (en vez de 7.24 ppm para C1).
1
13
Tabla XXIV. Desplazamientos químicos de RMN H y RMN C para los ácidos desmetilseudoplacodiólico (C1) y desmetil-placodiólico (C2) en CDCl3 (ppm).
C/H
C1
a
H



3.14-3.11
(d, 1H, J = 16.5)
3.26-3.22
(d, 1H, J = 17.0)








1.63 (s, 3H)
1
HMBC



C-2; C-3;
C-4a; C-9b
C
198.21
110.46
195.10
42.27








C-1; C-4a;
C-9a; C-9b

C-2; C-11
107.72
159.72
100.49
165.60
106.73
156.53
103.71
59.36
17.79
C2
a
H



3.10-3.13
(d, 1H, J = 16.9)
3.18-3.21
(d, 1H, J = 16.9)








1.64 (s, 3H)
202.55
27.56
7.58

2.63 (s, 3H)
1.94 (s, 3H)
203.97
32.90

2.68 (s, 3H)
18.19 (s, 1H)
1
2
3
4
C
197.70
110.46
194.89
42.18
4a
5a
6
7
8
9
9a
9b
10
107.72
156.09
101.67
163.47
107.19
159.30
104.27
58.73
17.98
11
12
13
202.51
27.48
201.48

2.55 (s, 3H)


31.36
7.24
2.54 (s, 3H)
2.00 (s, 3H)
18.16 (s, 1H)
C-6; C-16
C-7; C-8; C-9
C-2; C-3;
C-4; C-11

C-6; C-7; C-8
C-8; C-9; C-9a
14
15
3-OH
a
13
4-OH
7-OH
9-OH
3.84 (s, 1H)
13.31 (s, 1H)
9.61 (s, 1H)
Las J de acoplamiento están dadas en Hz.
13
1
3.74 (s, 1H)
14.34 (s, 1H)
9.86 (s, 1H)
HMBC



C-2; C-3;
C-4a; C-9b








C-1; C-4a;
C-9a; C-9b


C-5a; C-6;
C-7

C-8; C-14
C-2; C-3;
C-4; C11

C-6; C-7; C-8
C-8; C-9; C-9a
87
De la misma manera, la revisión bibliográfica nos llevó a encontrar en la
literatura el aislamiento del ácido placodiólico 82 a partir del liquen Rhizoplaca
chrysoleuca por Huneck y col.86 en 1981, que al comparar sus desplazamientos
químicos con el compuesto C2, se observó que solo difiere en un grupo metoxi
(-OCH3) en la posición C-4a para el ácido placodiólico, mientras que para el
compuesto C2 es un grupo hidroxilo (-OH) en la posición C-4a.
82
Por otro lado, el experimento NOESY a 30 ºC realizado a la fracción
FCSF5-4-49 (figura 50), mostró la correlación espacial entre el protón 9-OH con
los protones metílicos H-10 y H-15 para el compuesto mayoritario C1, mientras
que para el compuesto minoritario C2, solo se observó la correlación espacial
entre el protón 9-OH y los protones metílicos H-10.
9-OH (C1)
9-OH (C2)
H-10 (C1)
H-10 (C2)
H-13 (C2)
H-15 (C1)
Figura 50. Espectro de NOESY de FCSF5-4-49. (600 MHz, T = 30 °C, CDCl3).
88
Así mismo, la posibilidad de estar en presencia de los tautómeros 1-oxo3-hidroxi y 1-hidroxi-3-oxo, se descartó por medio de la realización de un HMBC
a 30 ºC (figura 51), observándose que el protón 3-OH se correlacionaba con
C-4 a tres enlaces tanto para C1 como para C2. En este sentido, el análisis de
todos estos resultados nos llevaron a corroborar la constitución de las moléculas
propuestas C1 y C2.
3-OH (C2)
3-OH (C1)
C-4 (C2)
C-4 (C1)
Figura 51. Espectro de HMBC de FCSF5-4-49. (600 MHz, T = 30 °C, CDCl3).
De los resultados anteriores, en comparación con el (+)- ácido úsnico, la
estructura nueva, el ácido desmetil seudoplacodiólico (C1) ha sido asignada a la
de mayor proporción y su isómero, el ácido desmetil placodiólico al de menor
proporción (C2). Se reporta por primera vez el aislamiento del ácido desmetil
seudoplacodiólico y del ácido desmetil placodiólico.
89
CONCLUSIONES
El análisis químico preliminar realizado al extracto etanólico y fracciones
solubles en hexano y cloroformo del liquen Usnea antarctica, evidenció la
presencia de varias familias de metabolitos secundarios, como esteroles,
triterpenos, fenoles, taninos y azúcares reductores.
El estudio fitoquímico de la fracción soluble en cloroformo del liquen
antártico Usnea antarctica, permitió el aislamiento de tres dibenzofuranos: ácido
úsnico (Compuesto A), ácido desmetil seudoplacodiólico (Compuesto C1) y
ácido desmetil placodiólico (Compuesto C2), y una depsidona: ácido cetrárico
(Compuesto B).
De acuerdo a la revisión bibliográfica, es la primera vez que se aísla desde
la naturaleza el ácido desmetil seudoplacodiólico (Compuesto C1) y el ácido
desmetil placodiólico (Compuesto C2).
Además, este es el primer reporte que identifica la presencia de ácido
cetrárico (Compuesto B) en Usnea antarctica.
Por último, es importante resaltar que este trabajo es el primero donde se
realiza el estudio fitoquímico de la especie liquénica Usnea antartica recolectada
en Isla Greenwich, Antártida, ya que en la literatura solo se ha estudiado al
género Neuropgon sp., una subespecie del genero Usnea.
90
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Curriculum Vitae
Nombre: Rafael Viteri Espinoza
Lugar y fecha de nacimiento: Guayaquil, Ecuador, 17 de julio de 1987
Nacionalidad: Ecuatoriana
Estudios realizados:
Químico-Farmacéutico (2005-2010): Universidad de Guayaquil, GuayaquilEcuador.
Cargos desempeñados:
Estudiante Graduado, Maestría en Química (Septiembre 2011 – Enero 2015),
Centro de Química, Instituto Venezolano de Investigaciones Científicas
(IVIC). Tutor: Dr. Franklin Salazar.
Asistente en investigación (Febrero del 2010 – Agosto del 2011, Centro de
Investigaciones Biotecnológicas del Ecuador, Escuela Superior Politécnica
del Litoral (CIBE-ESPOL), Guayaquil, Ecuador.
Campo en la que ha trabajado y/o publicado:
Investigación de Productos Naturales.
Honores y Distinciones
Beca Internacional. (2011-2014). Instituto Venezolano de Investigaciones
Científicas, Altos de Pipe, Estado Miranda, Venezuela.