2º bioquímica

2º BIOQUÍMICA
CUESTIONES
1. ¿Por qué la PCR convencional no es cuantitativa?
En la PCR convencional, la cuantificación del ADN de la muestra es complicada
debido a que la eficacia de amplificación va disminuyendo con el tiempo, hasta que la
reacción llega a una fase de saturación en la que ya no se produce incremento de ADN.
Además, la cantidad de ADN amplificado se detecta al final de la PCR cuando la
mayoría de reacciones han alcanzado ya la fase de saturación y por tanto, la cantidad de
ADN obtenido no guarda mucha relación con la concentración inicial de ADN en la
muestra. La PCR a tempo real en cambio, si es cuantitativa ya que permite saber la
cantidad de ADN tras cada ciclo de amplificación, debido a que dicho ADN está
marcado con fluorescencia.
2. Componentes de la PCR.
En la PCR podemos diferenciar los siguientes componentes:
- Tampón: buffer de amplificación. Los más utilizados contienen KCl, Tris y MgCl2.
Éste último es esencial para la actividad de la Taq polimerasa ya que el Mg2+ actúa
como cofactor de ésta. No obstante, hay que tener cuidado con las cantidades de Mg ya
que un exceso de este dará lugar a productos inespecíficos y a una cantidad insuficiente.
- Primers o cebadores: deben ser complementarios a cada uno de los extremos 3' de la
región que queremos amplificar y son necesarios para la actividad de la polimerasa.
- Desoxinucleótidos trifosfatos (dNTPs): son necesarios para que la polimerasa los use
como sustrato y pueda llevar a cabo la reacción de amplificación. Se añaden los cuatro
tipos de dNTPs que componen el ADN en una mezcla equimolar.
- Taq-polimerasa: polimerasa resistente a las altas temperaturas a las que vamos a
someter nuestro tubo de reacción. Es una polimerasa aislada de la bacteria
termoresistente, Thermus aquaticus.
- ADN muestra: ADN que queremos amplificar.
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3. ¿Por que son necesarios tres tipos de cebadores en la RT-PCR?, ¿para qué
sirven cada uno de ellos?
-
Random primers pd (N) 6: son cebadores cortos (10 KB) que se utilizan para
secuenciar al azar cuando el ADN es desconocido. El cebador se unirá al ADN
patrón en secuencias complementarias de ubicación desconocida, por lo tanto no se
conocerá la naturaleza de los productos obtenidos.
-
Oligo (dT): se unen a las colas de poli (A) presentes en los mRNAs. Se utilizan
para secuenciar RNAm.
-
Cebadores específicos: se utilizan para secuenciar ADN conocido. Tienen una
secuencia complementaria a dicho ADN.
4.- Fundamentos para la cuantificación de RNA por PCR a tiempo real
Permite cuantificar, la cantidad de ADN o ARN amplificado en cada momento
mediante el marcaje con fluorocromos y detectar la fluorescencia emitida cuando se
genera el fragmento específico durante la amplificación. Existen diversos formatos de
detección:
- Uso de moléculas fluorescentes que se intercalan en el ADN de cadena doble. Ej.
SYBR-GREEN:
- Doble sonda marcada o sondas de hibridación (sondas "LightCycler"). En este caso se
emplean dos sondas marcadas con moléculas fluorescentes en posición 5' (sonda A) y 3'
(sonda B) y que hibridan en regiones adyacentes del DNA diana. Cuando se produce la
hibridación, la primera sonda emite fluorescencia que excita al colorante de la segunda
sonda, produciendo una señal detectable
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- Cebadores fluorescentes ("Molecular Beacons"). En estos tipos, la molécula
fluorescente y la molécula que absorbe la fluorescencia se mantienen próximas
mediante la formación de una horquilla de hibridación. Esta horquilla se abre durante la
amplificación, aumentando la emisión de fluorescencia.
- Sondas Taqman®. Diseñadas por Applied Biosystems, hacen uso de la actividad 5'
exonucleasa de la Taq (Thermus aquaticus) DNA polimerasa. Estas sondas tienen un
marcador fluorescente en el extremo 5' y una molécula que absorbe ("quencher") la
fluorescencia emitida por el marcador en el otro extremo. La sonda hibrida con el
fragmento específico (si está presente) y, a medida que se sintetiza la hebra
complementaria al fragmento, la sonda se va degradando por la acción exonucleasa,
liberando el marcador que ahora sí emite fluorescencia.
-Fundamentos para la cuantificación de RNA por PCR a tiempo real
En la RT-PCR el molde inicial es ARN y mediante la retrotranscriptasa se obtiene el
ADNc (ADN complementario). Este ADNc es posteriormente amplificado. De esta
forma, se puede medir la expresión génica mediante una técnica alternativa al Northern
blot o Dot Blot, ensayos de protección de RNasa, hibridación in situ, y ensayos de
nucleasa S1.
5. Universal ProbeLibrary. Ejercicio con cebadores.
Cebador Sncaα:
Izquierdo: 5’TGGCAGTGAGGCTTATGAAA3’
Sí funciona en el ratón ya que se une desde el primer hasta el último nucleótido. No
funciona en la rata porque no se une en todos los nucleótidos.
Derecho: 5’GCTTCAGGCTCATAGTCTTGG3’
Funciona tanto en rata como en ratón ya que en ambos casos se une desde el primer
hasta el último nucleótido.
Este cebador sólo funciona en ratón.
Cebador DCX:
UP: 5’GCATTACTTGTGAGGCATTTTGGAG3’
Sí funciona en el ratón ya que se une desde el primer hasta el último nucleótido. No
funciona en la rata porque no se une en todos los nucleótidos.
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DOWN: 5’GGGAGATTAACGGTCACAGGAGAT3’
Sí funciona en el ratón ya que se une desde el primer hasta el último nucleótido. No
funciona en la rata porque no se une en todos los nucleótidos.
Este cebador sólo funciona en ratón.
RESULTADOS
Aislamiento de ARN
Para ver si hemos aislado con éxito ARN de los centros de cerebro de rata se llevó a
cabo una PCR. Los resultados son los siguientes:
Nosotros cargamos en el pocillo 7 en el que no se observa ARN pero esto puede ser
debido a contaminación por ARNasas.
Pocillo 7
RT-PCR con β-actina
Para comprobar si en el aislamiento de ARN anterior, no aparecía nada porque ha sido
degradado por contaminación con ARNasas o porque verdaderamente no hemos aislado
ARN, se realizó una RT-PCR en la que se empleó β-actina como housekeeper.
Pocillos 9 y 10
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En nuestros pocillo 9 y 10 se observan dos bandas de igual tamaño aproximadamente,
lo que indica que hemos partido de la misma concentración inicial de cDNA. Además
esto indica que sí habíamos aislado ARN anteriormente por lo que su ausencia se debe a
una degradación por RNAasas.
PCR Inespecífica
Bandas específicas
En la fotografía se aprecian bandas inespecíficas y bandas específicas. Las bandas
inespecíficas se observan a bajas temperaturas de Annealing ya que los cebadores se
unen inespecíficamente.
PRC convencional de TH
Esta PCR ha salido mal en general.
A 28 ciclos debería haber salido, el
problema puede haber sido una
contaminación por estándar interno
que es una molécula muy volátil.
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PCR competitiva (muestra 1)
En esta PCR lo que se ha hecho es añadir a la muestra un estándar interno a diferentes
concentraciones: 70, 700 y 7000 fentogramos/ ??. El tubo al que añadimos el estándar
menos concentrado dará lugar a una banda grande de ADN de la muestra y a una
pequeña del estándar interno mientras que el tubo al que añadimos el estándar más
concentrado dará lugar a una banda grande de estándar interno y auna pequeña de ADN
de la muestra, ya que compite más el estándar interno. Los resultados se recogen en la
siguiente fotografía, donde la banda superior es ADNc y la banda inferior es el estándar
interno:
A continuación medimos la DO del ADNc y la del estándar interno de manera que la
relación DO de estándar interno/ DO del ADNc será mayor mientras más estándar
interno haya y al representar gráficamente dicha relación frente a la concentración de
estándar interno obtenemos una recta:
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y = mx + b
En el punto en que DO estándar interno / DO ADN c = 1: m= 0.766; b= -2.4
log (DO estándar interno / DO ADN c) = 0.766 log Estándar interno - 2.4
→ log (1) = 0.766 log Estándar interno - 2.4
→ 0 = 0.766 log Estándar interno - 2.4
→ log Estándar interno = 2.4 / 0.766 = 3.133
→ Estándar interno = 1258.9 fentogramos
PCR competitiva (muestra 2)
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Procediendo de la misma manera que en el caso anterior obtenemos:
y = mx + b
En el punto en que DO estándar interno / DO ADN c = 1: m= 0.65; b= -1.82
log (DO estándar interno / DO ADN c) = 0.766 log Estándar interno - 2.4
→ log (1) = 0.65 log Estándar interno - 1.82
→ 0 = 0. 65 log Estándar interno - 1.82
→ log Estándar interno = 1.82 / 0.65 = 2.8
→ Estándar interno = 630.96 fentogramos
→1258.9/ 630.96 = 1.99 veces mayor la expresión de TH en la muestra 1 que en la
muestra 2.
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PCR a tiempo real
Nuestro SYBR-GREEN de Roche estaba en mal estado y por tanto la RT-PCR no ha
salido bien. Para el SYBR-GREEN de BR el experimento sí ha tenido éxito. Unos de
los datos obtenidos en con éste SYBR-GREEN son los siguientes:
Mo / Ro = 2-C = 2 – (Ct muestra – Ct referencia)
Ct referencia = 6.44
Ct muestra 1 = 14.52
Ct muestra 2 = 17.44
M1 / Ro = - 2 – (14.52 – 6.44) = 0.0037
M2 / Ro = - 2 – (17.44 – 6.44) = 0.00049
M1
M2
La muestra 1 tiene 7.55 veces más que la muestra 2.
10
= 7.55