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CONSEJERÍA DE INNOVACIÓN, CIENCIA Y EMPRESA
CONSEJERÍA DE AGRICULTURA Y PESCA. 2005
Editan:
IFAPA
Empresa Pública Desarrollo Agrario y Pesquero
Financia:
Programa de Mejora de la Calidad de la Producción de Aceite de Oliva y de Aceitunas de Mesa
Diseño y maquetación:
Ideagonal diseño gráfico
Imprime:
Egondi Artes Gráficas, S.A.
Depósito legal:
SE-2499-05
MARCADORES MOLECULARES PARA LA MEJORA GENÉTICA, IDENTIFICACIÓN Y
TRAZABILIDAD DEL OLIVO, LA ACEITUNA Y EL ACEITE DE OLIVA
Gabriel Dorado1*, Pilar Rallo2, Pilar Hernández3, María José Giménez3, Yoselín Benítez4, Aurora
Díaz3, Raúl de la Rosa5, José Luis Caballero1, Juan Muñoz-Blanco1, Antonio Martín3
1Dep. Bioquímica y Biología Molecular, Campus Rabanales C6–1–E17, Universidad de Córdoba, 14071
Córdoba; 2Dep. Ciencias Agroforestales, Ctra. Utrera km 1, Universidad de Sevilla, 41013 Sevilla;
3Instituto de Agricultura Sostenible (IAS), Consejo Superior de Investigaciones Científicas (CSIC),
Alameda del Obispo s/n, 14071 Córdoba; 4Delbruck Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory,
One Bungtown Road, ZIP 11724, New York (USA); 5Instituto de Investigación y Formación Agraria,
Pesquera, Alimentaria y de la Producción Ecológica (IFAPA), Alameda del Obispo s/n, 14071 Córdoba
*Autor para correspondencia: Gabriel Dorado, Dep. Bioquímica y Biología Molecular,
Campus Rabanales C6–1–E17, Universidad de Córdoba, 14071 Córdoba (Spain);
eMail <[email protected]>; Tel: +34 957 218689; Fax: +34 957 218592
INTRODUCCIÓN Y OBJETIVOS
Los marcadores moleculares son patrones proteicos o de ácidos nucleicos que pueden servir para identificar individuos, cultivares o especies. Asimismo, pueden emplearse para identificar características de interés,
as las que pueden estar asociados. Hace algunos años se emplearon bastante los marcadores basados en
proteínas (como enzimas y proteínas de reserva). Actualmente son más populares los marcadores basados
en ácidos nucleicos; sobre todo DNA, por lo que este trabajo versará sobre los mismos. Los marcadores de
DNA se pueden clasificar en dos grandes grupos: marcadores moleculares anteriores a la tecnología de
amplificación in vitro, como la “Reacción en Cadena de la Polimerasa” (PCR; del inglés “Polymerase Chain
Reaction”) y los posteriores a dicha tecnología.
El “Polimorfismo de Longitud de Fragmentos de Restricción” (RFLP; del inglés,“Restriction Fragment Length
Polymorphism”) es un marcador molecular basado en DNA que no emplea metodologías de amplificación
in vitro como la PCR. Entre sus ventajas destaca el hecho de presentar una herencia codominante que
permite diferenciar al heterocigoto de cada uno de los homocigotos, así como el hecho de ser transferible.
No obstante, requieren disponer previamente de las sondas apropiadas (idealmente homólogas, aunque
a veces pueden emplearse sondas heterólogas). Su gran inconveniente es el tiempo y mano de obra que
requiere. Este tipo de marcador molecular está siendo sustituido por otros basados en PCR, por su comodidad, rapidez, posibilidad de automatización, etc.
Entre los marcadores moleculares basados en PCR cabe destacar el “DNA Polimórfico Amplificado al Azar”
(RAPD; del inglés, “Random Amplified Polymorphic DNA”), que presenta la ventaja de no requerir conocimiento previo de la secuencia. Es por ello particularmente útil en especies como el olivo, en que se conoce
muy poco de su genoma. Sin embargo, puede ser poco consistente entre experimentos o laboratorios, a
menos que se controlen las diferentes condiciones experimentales (enzima polimerasa de DNA empleada,
perfiles de amplificación, soporte electroforético, etc). Los RAPDs suelen presentar una herencia dominante
que no diferencia al heterocigoto de uno de los homocigotos, no siendo transferibles. Además, su patrón
de bandas en el gel puede ser difícil de interpretar en algunos casos.
Por ello hemos desarrollado marcadores de “Región Amplificada de Secuencia Caracterizada” (SCAR; del
inglés “Sequence–Characterized Amplified Region”) para evitar dichos problemas. Estos marcadores derivan de los RAPD, pero son codominantes, transferibles y consistentes, mostrando un patrón de bandas
sencillo de interpretar. No obstante, en algunos casos puede ser difícil o imposible que mantengan el polimorfismo de los RAPD de los que derivan (perdiendo entonces su interés como marcadores moleculares
del polimorfismo genético).
Por su parte, los marcadores moleculares de tipo microsatélite o “Secuencias Repetidas Simples” (SSR; del
inglés, “Simple Sequence Repeat”) presentan herencia codominante y son transferibles incluso entre géneros y grupos bastante alejados evolutivamente. Además, son consistentes en su patrón, incluso cuando se
alteran las condiciones experimentales de amplificación o detección. No obstante, al menos las secuencias
que flanquean la zona repetitiva del microsatélite propiamente dicho debe ser conocida a fin de diseñar
los correspondientes cebadores de PCR que permitan amplificarlos y detectar su polimorfismo entre individuos, cultivares o especies.
Para resolver estos problemas y conseguir lo mejor de los RAPD y los SSR, se diseñaron y patentaron los marcadores de “Polimorfismo de Longitud de Fragmento Amplificado” (AFLP; del inglés, “Amplified Fragment
Length Polymorphism”). No requieren conocimiento previo de la secuencia y aunque inicialmente se describieron y comercializaron como marcadores moleculares codominantes y consistentes, la práctica suelen
mostrar una herencia dominante y otros problemas. Así, son muy costosos y complejos técnicamente, requiriendo DNA de muy alta calidad que pueda ser digerido con restrictasas. Su puesta a punto y optimización
para uso rutinario puede ser muy compleja. No obstante, cuando todos estos problemas se resuelven, pueden representar el marcador molecular que más información polimórfica aporta.
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Por todo ello en los últimos tiempos han ganado popularidad los marcadores moleculares de tipo
“Polimorfismo de Nucleótido Sencillo” (SNP; del inglés, “Single Nucleotide Polymorphism”), ya que son los
más abundantes, presentan herencia codominante, son transferibles y consistentes. Además se prestan al
análisis automatizado a gran escala mediante matrices de DNA (del inglés, “microarrays”), que permite analizar miles de ellos en un solo experimento. Los estudios genómicos generan gran cantidad de información
sobre SNPs que pueden ser rentabilizados de esta forma. Así, dependiendo de la especie y región considerada, cada pocos cientos de pares de bases (de 50 a 500) se espera encontrar un SNP.
Nuestro equipo investigador ha desarrollado y aplicado marcadores moleculares desde 1999 para la
mejora genética, identificación y trazabilidad del olivo, la aceituna y el aceite de oliva. Estos objetivos han
sido alcanzados con diferentes metodologías a lo largo del tiempo, como se indica a continuación. Hemos
propuesto además una nueva estrategia genómica para solucionar los problemas actualmente existentes
en este campo.
METODOLOGÍA DE TRABAJO EMPLEADA
Marcadores RFLPs y RFLPs de expresión. La técnica RFLP es una modificación y optimización de la metodología del “papel secante de “Southern” (del inglés, “Southern blotting”), descrita en 1975 por E. M. Southern.
Sin embargo, cuando se usan sondas genómicas no codificantes, los RFLPs no suelen generar datos concluyentes o útiles en “Selección Asistida por Marcadores” (MAS; del inglés, “Marker Assisted Selection”).
Por ello, hemos realizado una modificación de la técnica, empleando como sondas los fragmentos (cDNAs)
previamente obtenidos en nuestros laboratorios mediante clonación y secuenciación previa “Amplificación
Rápida de Extremos de cDNA” (RACE-PCR; del inglés “Rapid Amplification of cDNA Ends-PCR”). Asimismo, los
cDNAs se generaron mediante “Expresión Diferencial” (DD; del inglés, “Differential Display”), también conocida como “Expresión Diferencial de la PCR de la Transcripción Reversa” (DDRT–PCR; del inglés, “Differential–
Display Reverse Transcription–PCR”).
De esta forma, los RFLPs “de expresión” sirven para cartografiar regiones expresadas del genoma. Ello
incrementa la probabilidad de localizar características agronómicas de interés y en particular los “Loci de
Caracteres Cuantitativos” (QTLs; del inglés, “Quantitative Trait Loci”). A continuación se indica la metodología empleada:
Se purificó DNA genómico de olivo y se cuantificó por absorbancia a 260/280 nm (1’8–2’0 a 260 nm). La
pureza e integridad fueron también determinadas mediante electroforesis en gel de agarosa. El DNA fue
digerido con diferentes enzimas de restricción. Dada la posible interferencia de las metilaciones del DNA,
se usaron enzimas no afectadas por este factor. Se emplearon diferentes combinaciones de enzimas, hasta
obtener el mayor grado posible de polimorfismo. Se realizó una electroforesis de la digestión en gel de
agarosa. Se comprobó la digestión mediante fluorescencia ultravioleta (UV), en presencia de bromuro de
etidio (EtBr).
El DNA digerido fue fragmentado (HCl), desnaturalizado (NaCl/NaOH) y neutralizado (NaCl/Tris–HCl, pH 7’4).
El DNA se transfirió del gel de agarosa a una membrana de nylon, mediante capilaridad. Se unió del DNA a la
membrana (secado). Se marcó la sonda mediante un sistema no isotópico basado en el uso de psoralenos.
Presenta la ventaja de ser no radiactivo y tener una alta sensibilidad (<100 fg); comparable a la de las sondas generadas con 32P. Además, la misma membrana puede ser re–hibridada con diferentes sondas, ya que
éstas pueden ser eliminadas, dejando al DNA diana (genómico) libre. Tras la exposición de una película de
rayos X a la membrana, se procedió al revelado de la primera para identificar las correspondientes bandas.
Marcadores RAPD y SCAR. Los marcadores RAPD fueron generados mediante amplificación in vitro (PCR) de
DNA genómico de distintos cultivares de olivo, empleando cebadores cortos aleatorios. Dichos marcadores son generalmente detectados mediante electroforesis en geles de agarosa y visualización bajo luz UV
tras tinción con EtBr. También se realizó la electroforesis en geles de poliacrilamida y tinción con plata, lo
cual permitió observar una mayor grado de polimorfismo. Las bandas diferencialmente amplificadas entre
cultivares fueron purificadas, clonadas y secuenciadas, lo cual permitió producir los correspondientes marcadores SCAR, si bien, como ya se ha indicado, ello eliminó el polimorfismo del marcador RAPD en algunos
casos.
Marcadores SSR. Se siguieron dos estrategias diferentes para clonar microsatélites de olivo. En ambos
casos se partió de DNA genómico de olivo digerido con enzimas de restricción. Dicho DNA fue sometido
a electroforesis y se purificó el DNA de entre 0’5 a 1 kpb aproximadamente. En la primera estrategia se fijaron a membranas de nylon secuencias repetitivas sintéticas de cadena sencilla, que permitieron capturar
mediante hibridación microsatélites complementarios de dichas secuencias.
En la segunda estrategia, las sondas fueron marcadas con biotina, lo cual permitió su captura con bolitas
paramagnéticas recubiertas de estreptavidina, una vez se realizó la hibridación con el DNA genómico (y
por tanto la captura de los microsatélites complementarios a dichas secuencias). En ambos casos, los microsatélites capturados fueron clonados y secuenciados, lo cual permitió el diseño de los correspondientes
cebadores que los flanqueaban para su posterior amplificación como marcadores SSR.
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Marcadores SNP. Se llevaron a cabo amplificaciones tanto de cDNA (mRNA) como de DNA genómico de
olivo a partir de diferentes cultivares. Dicho DNA fue secuenciado y analizado para localizar SNPs. De esta
forma se han procesado cientos de secuencias de mRNAs de genes expresados diferencialmente en la
interacción Olea europaea-Spilocaea oleagina (agente causante de la enfermedad del repilo) y DNA genómico de genes implicados en la floración y el desarrollo de las yemas del olivo (leafy e apetala).
Estos marcadores moleculares y otros obtenidos por otros autores han sido empleados también para generar mapas genéticos de ligamiento del olivo.
INNOVACIÓN Y RELEVANCIA DEL TRABAJO
Hemos empleado técnicas clásicas y modernas para desarrollar y aplicar marcadores moleculares de tipo
RFLP, RAPD, SCAR, SSR y SNP en olivo. Algunos de estas secuencias y marcadores moleculares se encuentran
disponibles en el GenBank del “National Center for Biotechnology Information” (NCBI) <http://www.ncbi.
nlm.nih.gov>.
Somos pioneros en estos estudios, como muestran las publicaciones nacionales e internacionales realizadas desde 1999. Nuestros hallazgos y desarrollos de marcadores moleculares han sido empleados por
nosotros mismos y por otros para la mejora genética, identificación y trazabilidad del olivo, la aceituna y el
aceite de oliva.
Nuestro trabajo ha cobrado especial relevancia en la era genómica en que nos encontramos, habiendo planteado una innovadora estrategia genómica para solucionar los problemas que los marcadores moleculares
de olivo presentan en la actualidad, permitiendo una identificación sin ambigüedades, incluso en productos tan particulares como el aceite de oliva.
RESULTADOS, DISCUSIÓN Y CONCLUSIONES
Hemos demostrado que la electroforesis en geles de poliacrilamida y tinción con plata permite detectar un
grado de polimorfismo RAPD mucho mayor que el que generalmente se aprecia con la técnica clásica de
electroforesis en geles de agarosa y tinción con bromuro de etidio. Ello ha permitido identificar marcadores
moleculares de tipo RAPD en geles de poliacrilamida, que de otro modo hubieran pasado inadvertidos en
geles de agarosa.
Hemos desarrollado marcadores moleculares de tipo RAPD que han sido utilizados para la identificación de
diferentes cultivares de olivo. Aunque los marcadores moleculares de tipo RAPD pueden ser poco consistentes y de difícil interpretación, hemos optimizado las condiciones experimentales (sobre todo en lo relativo a la polimerasa de DNA y el perfil de amplificación utilizados) hasta conseguir amplificaciones robustas
y consistentes.
A fin de obtener marcadores moleculares más robustos en su uso rutinario, hemos transformado marcadores moleculares de tipo RAPD en otros de tipo SCAR. Ello produce amplificaciones consistentes aunque
varíen las condiciones de amplificación (enzima polimerasa de DNA utilizada, perfil de la reacción, etc). Sin
embargo, conviene resaltar que no siempre es posible mantener el polimorfismo de los marcadores RAPD
cuando estos son transformados en marcadores SCAR. Ello es debido a que en algunos casos dicho polimorfismo reside en la zona de unión del cebador arbitrario empleado para generar el RAPD, que se pierde
en el nuevo diseño específico de la pareja de cebadores anidados que debe amplificar cada marcador
SCAR.
Al convertir algunos marcadores RAPD en otros de tipo SCAR, hemos detectado una asociación de alguno
de los mismos con una mayor relación pulpa/hueso en la aceituna. Se trata de un marcador molecular muy
interesante para ayudar a la mejora genética del olivo en relación a dicha característica agronómica. Éste
es un ejemplo típico de lo que puede aportar esta tecnología a la mejora genética asistida por marcadores
moleculares de DNA.
También hemos desarrollado un método que permite acelerar la detección de SCARs, así como abaratar su
costo, mediante su detección directa en el tubo de ensayo, sin necesidad de preparar geles de agarosa o
poliacrilamida ni llevar a cabo separaciones de los fragmentos de DNA mediante electroforesis.
Por otro lado hemos identificado entre los RAPDs convertidos a SCARs la primera y única secuencia de
retrotransposón de olivo descrita hasta la fecha. Dicha secuencia presenta identidad con otras de una gran
variedad de especies y entidades biológicas, lo cual las hace particularmente interesantes para el desarrollo
de marcadores moleculares de identificación con un espectro muy amplio.
Hemos clonado nuevos microsatélites de olivo y los hemos utilizado fundamentalmente para estudios de
paternidad y para la generación de dendrogramas (árboles filogenéticos) de numerosos cultivares de olivo
y especies del género Olea. Dada su robustez, fácil interpretación y posibilidad de automatización, se trata
de unos marcadores moleculares muy útiles en dichos análisis.
Asimismo, hemos desarrollado RFLPs de expresión, que corresponden a SNPs en cDNAs (mRNAs) de genes
expresados diferencialmente en la interacción entre el olivo y el hongo responsable de la enfermedad del
repilo. También hemos identificado SNPs en secuencias genómicas de genes implicados en la floración y
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desarrollo de yemas del olivo, como son leafy y apetala. Todos estos resultados muestran la amplia distribución de los marcadores moleculares de tipo SNP; tanto en secuencias genómicas codificantes como no
codificantes.
Estos y otros marcadores moleculares han sido empleados por nosotros y otros autores para generar los
correspondientes mapas genéticos de ligamiento del olivo. Se trata de un paso esencial en los proyectos de
mejora genética del olivo, así como en futuros proyectos de genómica de este árbol.
Por último, hemos conseguido aislar DNA de diferentes tipos de aceite de oliva a lo largo del proceso de
producción; desde la almazara hasta la botella del supermercado. Se han incluido aceites sometidos a procesos físico-químicos más o menos drásticos, como es el caso del aceite de oliva refinado. Dicho DNA ha
sido amplificado con marcadores moleculares desarrollados por nosotros y otros autores, tanto en investigaciones nacionales (proyectos CAO) como internacionales (Proyectos Oliv-Track).
Todo ello nos ha permitido detectar las limitaciones de la tecnología actual y proponer una nueva estrategia genómica para resolver dichos problemas. Ello permitirá una identificación sin ambigüedades de cultivares, incluso en aceite de oliva. Además, dicha estrategia permitirá poder realizar estudios a gran escala
mediante el empleo de metodologías de última generación como las matrices de DNA (“microarrays”), lo
cual representa un poder de resolución y análisis sin precedentes en este tipo de estudios.
En resumen y como conclusión, los marcadores moleculares representan una herramienta muy valiosa
para ayudar y acelerar la mejora genética del olivo, así como en la identificación y trazabilidad de sus cultivares, aceitunas y aceite de oliva. Nuestro equipo de investigación ha desarrollado y utilizado marcadores
moleculares de DNA de olivo desde 1999. Algunas de estas secuencias se encuentran disponibles en el
GenBank del “National Center for Biotechnology Information” (NCBI) <http://www.ncbi.nlm.nih.gov> y han
sido objeto de las correspondientes publicaciones nacionales e internacionales. Entre dichos marcadores
cabe destacar el “DNA Polimórfico Amplificado al Azar” (RAPD; del inglés, “Random Amplified Polymorphic
DNA”), la “Región Amplificada de Secuencia Caracterizada” (SCAR; del inglés, “Sequence–Characterized
Amplified Region”), los Microsatélites (SSR; del inglés, “Simple-Sequence Repeat”) y el “Polimorfismo de
Nucleótido Único” (SNP; del inglés, “Single Nucleotide Polymorphism”). Hemos desarrollado RAPDs y SCARs
que permiten una selección y mejora genética asistida por marcadores para una mayor relación pulpa/
hueso de la aceituna. Hemos aplicado SSRs a identificación de variedades y estudios de paternidad; y SNPs
a la trazabilidad del aceite de oliva. Seguimos siendo pioneros en el desarrollo y aplicación de marcadores
moleculares de olivo a nivel mundial. Esta información ha sido utilizada también para generar los correspondientes mapas genéticos del olivo. Por último, nuestra experiencia en este campo nos ha permitido proponer un nuevo enfoque genómico para resolver los problemas actuales de identificación, denominación
de origen y trazabilidad del olivo, la aceituna y el aceite de oliva.
Agradecimientos. Financiado por Proyectos CAO00-018-C7-1 y CAO00-018-C7-3, Grupo PAI CTS-413
(Junta de Andalucía) y proyecto Oliv-Track QLRT-2001-02386 (Unión Europea).
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