ENZIMAS DE RESTRICCIÓN
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ENZIMAS DE RESTRICCIÓN Sitio de corte Secuencias de reconocimiento Sitio de corte ADN cromosómico Extremos cohesivos Extremos romos ADN Ligasa Vector de clonación digerido con EcoRI y PvuII Tipos de enzimas de restricción Tipo IIs: Reconocen secuencias no palindrómicas, 4-7 pb. Sitio de corte en la secuencia y hasta 20 pb de distancia Restricción-modificación EcoRI m G-A-A-T-T-C C-T-T-A-A-G m m G-A-A-T-T-C C-T-T-A-A-G m G-A-A-T-T-C C-T-T-A-A-G EcoRI G-A-A-T-T-C C-T-T-A-A-G EcoRI m G-A-A-T-T-C C-T-T-A-A-G m G C-T-T-A-A A-A-T-T-C G La metilación del ADN en eucariotas superiores está relacionada con la regulación de la transcripción. El uso de algunas enzimas de restricción específicas permite distinguir entre ADN metilado y no metilado, obteniéndose de esta manera información sobre la posible regulación de la expresión de un gen por metilación del ADN Vertebrados: metilación de la C en secuencias CG en el C5, generando 5metilcitosina: m5CG. Secuencias (islas) CpG, implicadas en regulación de la transcripción. HpaII, MspI: isosquizómeros, reconocen C/CGG Plantas: metilación m5CG y m5CNG. Uso de endonucleasas con diferente sensibilidad a metilación: McClelland M. 1983. The frequency and distribution of methylatable DNA sequences in leguminous plant protein coding genes. J. Mol. Biol. 19: 346-354 Metilación del ADN y digestión con enzimas de restricción Sistema dam: metila la A de la secuencia GATC en el N6, generando 6-metiladenina: Gm6ATC. PvuI, BamHI, BclI, BglII, XhoII, MboI y Sau3AI (/GATC) ClaI: AT/CG*AT XbaI: T/CTAG*A Sistema dcm: metila la C interna de la secuencia CC(A/T)GG en el C5, generando 5-metilcitosina: Cm5CWGG EcoRII: /CCWGG, BstNI: CC/WGG StuI: AGG/C*CT DpnI: Es una enzima de restricción que corta en la secuencia GATC sólo si está metilada por dam (Gm6ATC). Utilizada en algunos protocolos de PCR para eliminar ADN plasmídico proveniente de la bacteria sin afectar al sintetizado in vitro. ENZIMAS DE RESTRICCIÓN • Reconocen secuencias concretas • Simetría (palíndromes) Ejemplos de palíndromes • Dabale arroz a la zorra el abad • La ruta natural • A man, a plan, a canal: Panama Enzimas de restricción • Reconocen secuencias concretas • Simetría (palíndromes) • Número de nucleótidos en la secuencia N1N2N3N4 N1N2N3N4N5N6 N1N2N3N4N5N6N7N8 44 46 48 256 4096 65536 Sitios de corte de las endonucleasas de restricción del tipo II Tipo IIs: MboII Extremos protuberantes 5’ protuberantes EcoRI G-3’ CTTAA-5’ GAATTC CTTAAG 5’-AATTC 3’-G Extremos protuberantes 3’ protuberantes PstI CTGCA-3’ G-5’ CTGCAG GACGTC 5’-G 3’-GACGTC Extremos romos SmaI CCC-3’ GGG-5’ CCCGGG GGGCCC 5’-GGG 3’-CCC Extremos compatibles (I) EcoRI GAATTC CTTAAG EcoRI GAATTC CTTAAG GAATTC CTTAAG Extremos compatibles (II) SalI GTCGAC CAGCTG XhoI CTCGAG GAGCTC GTCGAG CAGCTC Extremos romos (siempre compatibles) SmaI CCCGGG GGGCCC EcoRV GATATC CTATAG CCCATC GGGTAG Extremos no compatibles rellenados, transformados en romos (siempre compatibles) EcoRI GAATTC CTTAAG G-3’ AATT-3’ CTTAA-5’ + dNTPs XhoI CTCGAG GAGCTC GAATT TCGAG CTTAA AGCTC 5’-TCGAG GCT 3’-A3’-C •Degradado de cadena sencilla Extremos no compatibles transformados en compatibles • Rellenado parcial HindIII AAGCTT TTCGAA A-3’ AG-3’ TTCGA-5’ + dATP, + dGTP XbaI TCTAGA AGATCT 5’-CTAGA 3’-T 3’-C C + dCTP, + dTTP AAGCTAGA TTCGA TCC Precauciones • Actividad “star” • Metilación Aspectos prácticos Unidad: Cantidad de enzima que digiere 1 g de ADN en 1 hora a la temperatura y condiciones óptimas. Inhibición: Adición de 20 mM EDTA. Inactivación: Por calor o tratamiento con fenol-CIA Dos enzimas de restricción pueden utilizarse simultáneamente siempre que compartan las mismas condiciones de digestión (temperatura, pH, concentración de sales)
