BIOQUÍMICA MÉTODOS GENERALES DE ANAÁLISIS DE

BIOQUÍMICA
MÉTODOS GENERALES DE ANAÁLISIS
DE ALIMENTOS
Dra Roxana Verdini
Dra.
[email protected]
2016
Esquema
q
de Wendler
Proteínas
Cenizas
Materia seca
Lípidos
Materia
Orgánica
Alimento
Humedad
Fibra
Ext. no
nitrogenados
Preparación
p
de la muestra
ALIMENTOS SECOS
ALIMENTOS DUROS
Ej.: Chocolate
ALIMENTOS
HÚMEDOS
Ej.: carne, pescado,
vegetales
t l
•
•
•
•
•
MOLINILLO
MORTERO
TAMIZ
CUARTEO
MUESTRA DE ENSAYO
• RALLAR
• MUESTRA DE ENSAYO
•
•
•
•
PICADORA MECÁNICA
MORTERO
RECIPIENTE CERRRADO
REFRIGERAR
Preparación
p
de la muestra
ALIMENTOS EMBEBIDOS EN
LÍQUIDOS
• PROCESADO A ALTA
VELOCIDAD
Ej: conserva de frutas y
hortalizas, salsas
ACEITES Y GRASAS
ACEITES Y GRASAS
TURBIOS
EMULSIONES GRASAS
Ej.: manteca, margarina
• FILTRADO EN CALIENTE
• FUNDIR
• FILTRAR EN CALIENTE
• CALENTAR A 35 ºC
• HOMOGENEIZAR POR
AGITACIÓN
Determinación de humedad
Utilidad de la determinación:
Permite conocer la composición del alimento y
su relación con el peso seco.
seco
Permite conocer las posibilidades de deterioro
junto con la aw.
Es útil en el caso de materiales que deben
someterse a molienda.
En algunos alimentos existe un límite legal.
Es un modo sencillo de controlar etapas de
elaboración.
Métodos p
para la determinación de
humedad
QUÍMICOS
CALOR
SOLAMENTE
INDIRECTOS
DIRECTOS
TITRIMÉTRICOS
(KARL FISCHER)
FÍSICOS DESECACIÓN
CALOR Y P
REDUCIDA
DESTILACIÓN
((DEAN- STARK))
DESECANTES Y
P REDUCIDA
Determinación de humedad
Método de Karl Fischer:
El método Karl Fischer se utiliza como método
de referencia para numerosas sustancias.
sustancias
A diferencia de otras técnicas, éste método
puede detectar bajos niveles de agua libre,
emulsionada y disuelta (mismos que no pueden
ser detectados por otros métodos, como el de
crepitación).
Es capaz de medir niveles de agua tan bajos
como 1 ppm o 0.0001
0 0001 % en volumen.
volumen
Aconsejado para determinar cantidades de
agua por debajo de 0.1% Ej.: grasas, productos
deshidratados.
Determinación de humedad
Método de Karl Fischer:
La determinación de agua por el método de
Karl Fischer se basa en la reacción cuantitativa
entre el agua y un reactivo constituido por
dióxido de azufre y iodo en presencia de metanol
y una base orgánica como la piridina.
Actualmente los reactivos comerciales no
contienen piridina y la reemplazan por el
imidazol.
La reacción no es estequiométrica por lo que
debe valorarse frente a una cantidad conocida de
agua.
Determinación de humedad
Método de Karl Fischer:
El punto final se determina por la coloración
propia del exceso de yodo (o con la presencia de
almidón) o bien coulombimétricamente.
La principal diferencia entre ambos es que en
el método volumétrico el reactivo titulador se
agrega directamente a la muestra por medio de
una bureta.
Inversamente, con el otro método el reactivo
titulador se genera electroquímicamente en la
celda de titulación.
El método instrumental mide niveles de agua
mucho más bajos que el método volumétrico.
Determinación de humedad
Método de Karl Fischer:
Existen aparatos comerciales basados en este
método donde se cuidan especialmente algunos
detalles operativos indispensables para la
utilización del método,
método especialmente referido a
la humedad atmosférica y el secado de equipo.
Determinación de humedad
Métodos indirectos - Desecación:
La pérdida de peso observada representa la
humedad de la muestra y el peso obtenido
corresponde a los sólidos totales.
con
sustancia
inerte
Calor solamente
sin sustancia
inerte
Se utiliza en alimentos con alto contenido
q
que no se descomponen
q
p
a
acuoso y en aquellos
altas temperaturas.
Determinación de humedad
Métodos indirectos - Desecación:
En alimentos líquidos es necesario evaporar
previamente a Baño María.
María
Usualmente se calienta en estufa a 100-105ºC
por dos horas.
Se enfría y se pesa.
pesa
Se repite
p la operación
p
hasta p
peso constante
Determinación de humedad
Métodos indirectos - Desecación:
Calor y presión reducida
Se utiliza en alimentos que contiene azúcares
especialmente
p
fructosa.
Ej.: miel, mermeladas, jugos de fruta, frutas
secas, vegetales.
t l
El alimento se coloca en estufa parcialmente
destapado alrededor de 5 hs a 70ºC y a una
presión de 25 a 100 mm de Hg,
p
g, dependiendo
p
de
la naturaleza del material. Se repite la operación
a intervalos de 1 h hasta p
peso constante.
Determinación de humedad
Métodos indirectos - Desecación:
Desecantes y presión reducida
Se usa en alimentos que se descomponen o
volatilizan p
por calentamiento.
Ej.: especias o productos que contienen
aceites
it volátiles
látil
El método es similar al anterior pero se utiliza
H2SO4 como desecante y una P no mayor a 10
mm de Hg.
g
Determinación de humedad
Expresión de resultados:
Extracto seco: en materiales con alto
contenido acuoso ( leche,
leche cremas,
cremas cremas
heladas, bebidas alcohólicas y no alcohólicas,
productos vegetales enlatados,
enlatados se determina por
pesada los sólidos totales y se expresa en
porcentaje.
Humedad: En productos sólidos o semi
sólidos, con menor contenido acuoso, se
establece que el contenido acuoso corresponde
a la
l pérdida
é did de
d peso durante
d
t la
l desecación.
d
ió
Debe indicarse la temperatura del ensayo.
Determinación de humedad
Expresión de resultados:
Causas de error
eliminación incompleta del agua
descomposición
de
temperatura inadecuada.
azúcares
por
oxidación de aceites.
eliminación
li i
ió de
d otros
t
principios
i i i volátiles.
látil
la
Determinación de humedad
Métodos directos – Dean Stark:
Destilación azeotrópica: consiste en realizar
una destilación a reflujo
con solventes no
miscibles con el agua, de mayor punto de
ebullición y menor peso específico que ésta (Ej.:
(Ej :
tolueno, heptano, xileno).
Normalmente se utiliza el tolueno que destila
como un azeótropo con el agua, se condensan
en el refrigerante y caen en la trampa de Dean
Stark donde se separan en dos capas por la
dif
diferencia
i de
d peso.
Determinación de humedad
Métodos directos – Dean Stark:
Determinación de humedad
Métodos directos – Dean Stark:
El agua se sitúa en la parte inferior del tubo
graduado que permite leer el contenido de agua
en forma directa, mientras el tolueno pasado el
límite de la trampa vuelve al balón de destilación.
destilación
Determinación de humedad
Métodos directos – Dean Stark:
Alimentos en que se utiliza:
aquellos con gran contenido en fructosa,
especias y productos
sustancias volátiles.
que
contienen
Causas de error:
Adherencia de agua
g
a las p
paredes del
refrigerante o tubo colector.
Eliminación incompleta del agua del material
en estudio.
Cenizas – Contenido mineral
El método general para la determinación de
cenizas
i
t t l
totales,
i
involucra
l
l oxidación
la
id ió de
d toda
t d la
l
materia orgánica presente en una cantidad
exactamente
t
t pesada
d de
d la
l muestra
t previamente
i
t
homogeneizada y la posterior pesada de las
cenizas blancas.
blancas
Para la incineración se usan cápsulas
p
de
porcelana, platino o cuarzo que deben tararse.
Se
S pesa la
l muestra.
t
Se coloca la cápsula en el mechero y se
calienta
suavemente
para
después
ir
aumentando la llama de modo de carbonizar la
muestra.
Cenizas – Contenido mineral
 Luego se pasa a la mufla cuya temperatura
normalmente
l
t debe
d b ser de
d 500 - 550ºC.
550ºC
Aún a esa temperatura puede haber pérdidas
de cloruros y a temperaturas más altas se
pueden volatilizar algunos otros elementos como
Na, K, S y P o bien producirse fusiones.
Cenizas – Contenido mineral
Errores en la determinación
Oxidación
incompleta de
orgánica (agregado de agua).
la
materia
Descomposición de sales con liberación de
CO2, agua , HCl, etc..
Volatilización de ciertos elementos.
elementos
Pérdidas mecánicas.
Determinación de blancos en caso de usar
sustancias para favorecer la incineración.
incineración
Determinación de Grasas
 La FAO y la OMS recomendaron que se
ttuviera
i
amplio
li acceso a los
l
d t
datos
apropiados
i d
d
de
composición de alimentos referidos a las grasas
y que en los
l
análisis
áli i sobre
b
ell contenido
t id de
d
ácidos grasos de los alimentos y en la
elaboración de bases de datos de nutrientes se
emplearan métodos normalizados y materiales
de referencia.
referencia
 En el sistema pproximal de análisis, las
GRASAS se miden como la FRACCIÓN DEL
ALIMENTO QUE ES SOLUBLE EN DISOLVENTES
DE LÍPIDOS.
Determinación de Grasas
 El material extraído contiene una serie de
clases
l
dif
diferentes
t de
d sustancias.
t
i
A efectos nutricionales, la medición de las
GRASAS TOTALES tiene un valor limitado.
No obstante, se sigue notificando con
frecuencia y se mantiene en muchos requisitos
d
de
etiquetado
ti
t d
d
de
l
los
alimentos
li
t
y en la
l
reglamentación sobre la composición de los
productos
d t alimenticios.
li
ti i
Determinación de Grasas
 Los diversos MÉTODOS
É
DE EXTRACCIÓN
Ó
disponibles permiten determinar como grasa
todo el material soluble en el solvente que se usa
para la extracción, además de la grasa
propiamente
i
t dicha,
di h incluyendo:
i l
d
 esteroles,,
ácidos
grasos
g
libres,,
pigmentos, carotenoides, clorofila, etc.
Por esta razón,
razón los resultados de éste análisis
se informan frecuentemente
CRUDA o EXTRACTO ETÉREO.
ETÉREO
como
GRASA
Determinación de Grasas
CONTINUO
BUTT
DIRECTOS
GRAVIMÉTRICO
VIA SECA
DISCONTINUO
SOXHLET
VOLUMÉTRICO
DE GERBER
HIDRÓLISIS
ALCALINA (ROSE
(ROSEGOTTLIEB)
GRAVIMÉTRICO
VIA HÚMEDA
HIDRÓLISIS
ÁCIDA: (SCHMIDTSONDZYNSKI
MODIFICADO).
MODIFICADO)
CON ATAQUE
PREVIO
HIDRÓLISIS
COMBINADA:
ALCALINA Y
ÁCIDA.
Determinación de Grasas
Métodos de extracción
 Los diversos MÉTODOS
É
DE EXTRACCIÓN
Ó
disponibles permiten determinar como grasa
todo el material soluble en el solvente que se usa
para la extracción, además de la grasa
propiamente
i
t dicha,
di h incluyendo:
i l
d
 esteroles,,
ácidos
grasos
g
libres,,
pigmentos, carotenoides, clorofila, etc.
Por esta razón,
razón los resultados de éste análisis
se informan frecuentemente
CRUDA o EXTRACTO ETÉREO.
ETÉREO
como
GRASA
Determinación de Grasas
Métodos directos de extracción
Los lípidos no pueden ser extraídos con
efectividad de los alimentos húmedos y
ya q
que el
solvente no puede penetrar fácilmente a los
tejidos
j
húmedos del alimento.
El éter es higroscópico, se satura con el agua y
se vuelve ineficiente para la extracción de las
grasas.
El material a analizar debe ser totalmente
desecado en estufa y el solvente a usar debe ser
anhidro para impedir que la presencia de agua
posibilite la extracción de material hidrosoluble
que sería determinado junto con la grasa.
Determinación de Grasas
Métodos directos de extracción
PRESECADO
Frecuentemente
esta determinación se lleva a
cabo a continuación de humedad, sobre la misma
muestra desecada.
desecada
No secar las muestras a altas temperaturas ya que
algunos
l
lí id
lípidos
se ligan
li
a proteínas
t í
y a
carbohidratos, por consiguiente no se pueden
extraer fácilmente con solventes orgánicos.
orgánicos
El secado en estufa de vacío a baja temperatura o
lla liofilización
li fili
ió son recomendables
d bl
ya que aumentan
t
la superficie de área de la muestra y proporciona una
mejor extracción de lípidos.
lípidos
El secado en estufa a 105°C también es adecuado.
Determinación de Grasas
Métodos directos de extracción
PRESECADO
El secado
d hace
h
que la
l muestra
t sea más
á fácil
fá il de
d
moler para una mejor extracción.
Rompe las emulsiones aceite-agua para que la
grasa se disuelva fácilmente en el solvente
orgánico.
á i
Ayuda a que se libere la grasa de los tejidos de
los alimentos.
La eficiencia de la extracción de los lípidos
p
de
los alimentos secos depende del tamaño de la
partícula: una molienda eficiente es importante.
Determinación de Grasas
Métodos directos de extracción
EXTRACCIÓN CONTINUA
La muestra se coloca en un dedal poroso de
extracción hecho de cerámica.
Se añade el solvente al frasco de ebullición.
Se produce una extracción continua debido al
goteo del disolvente que se condensa sobre la
muestra contenida en el dedal,
dedal alrededor del cual
pasa el vapor caliente del disolvente.
Proporcionan una extracción eficiente y rápida.
Pueden ocasionar canalizaciones en la muestra
y, por tanto una extracción incompleta.
Determinación de Grasas
Métodos directos de extracción
EXTRACCIÓN CONTINUA – Equipo tipo BUTT
Determinación de Grasas
Métodos directos de extracción
EXTRACCIÓN CONTINUA – Equipo tipo BUTT
Determinación de Grasas
Métodos directos de extracción
EXTRACCIÓN INTERMITENTE – SOXHLET
En el aparato de extracción intermitente el tubo
de extracción está equipado con un sifón.
sifón
Cada 5 o 10 minutos,
minutos el solvente más la grasa
extraída es arrastrado y se vuelca en el balón
inferior.
La muestra estará así en contacto con nuevo
solvente (sin grasa) cada pocos minutos.
Determinación de Grasas
Métodos directos de extracción
SOXHLET
Determinación de Grasas
Métodos directos de extracción
EXTRACCIÓN INTERMITENTE – SOXHLET
 Se pesa el balón presecado.
presecado
 Se coloca el solvente en balón.
 Se ensambla el balón con el dispositivo de Soxhlet y el
condensador.
 Se extrae la grasa de la muestra a una velocidad de
condensación de 5 ó 6 gotas por segundo calentando el
solvente en el balón durante el tiempo estipulado.
Se seca balón con la grasa extraída en un horno de
secado por aire a 100ºc por 30 minutos.
 Se enfría el balón en un desecador.
 Se pesa el balón con el resto de la muestra.
Determinación de Grasas
Métodos directos de extracción
SOXHLET
www.cenunez.com.ar
SOXHLET
http://www.biol.unlp.edu.ar/bromatologia/tp.htm
Determinación de Grasas
Métodos directos de extracción
SOXHLET
Determinación de Grasas
Métodos directos de extracción
EXTRACCIÓN INTERMITENTE – SOXHLET
Alimentos en que se emplea: cereales y
productos derivados,
derivados carnes,
carnes vegetales y nueces.
nueces
Expresión de resultados: se puede expresar en
base seca o en base húmeda:
 para expresarlo en base húmeda (muestra
original) se debe tener en cuenta el contenido
de humedad determinado previamente.
Determinación de Grasas
Métodos directos de extracción
EXTRACCIÓN INTERMITENTE – SOXHLET
Errores de la determinación:
extracción de materiales no lipídicos por
disolución de estos en el agua proveniente del
alimento no deshidratado o del solvente no
anhidro.
 extracción incompleta: uso de solventes,
aparatos o tiempos no adecuados.
adecuados
 descomposición u oxidación (por calor y
aire) del material en extracción.
Determinación de Grasas
Métodos directos de extracción
EQUIPOS SEMIAUTOMÁTICOS
 La extracción viene realizada de acuerdo al
método de Soxhlet mejorado
j
según
g Randall.
Operan en dos fases mas una de recuperación
del solvente destilado y permiten:
 reducir
los tiempos
p
de extracción ((solvente
caliente),
 salvaguardar la contaminación atmosférica,
atmosférica
 reducir el costo de los análisis.
Determinación de Grasas
Métodos directos de extracción
EQUIPOS SEMIAUTOMÁTICOS
Determinación de Grasas
Métodos directos de extracción
EQUIPOS SEMIAUTOMÁTICOS
Determinación de Grasas
Métodos con ataque previo
¿Cuándo se usan?
Se usan cuando los métodos gravimétricos por
extracción seca no son aconsejables.
aconsejables
Esto puede deberse a la presencia de proteínas
y elevadas cantidades de glúcidos puede impedir
la extracción total de la grasa presente en algunos
alimentos, especialmente productos lácteos.
En alimentos con elevado contenido acuoso.
Determinación de Grasas
Métodos con ataque previo
FUNDAMENTO
Los sólidos que rodean a los glóbulos de
grasa de algunos alimentos,
alimentos son destruidos con
agentes ácidos o alcalinos para permitir la
coalescencia y posterior
medida volumétrica de la grasa (métodos
butirométricos),
la extracción por solventes mediante
técnicas gravimétricas.
g
Determinación de Grasas
Métodos con ataque previo
 Métodos
gravimétricos
por
extracción
húmeda:
 Método por hidrólisis alcalina (RoseGottlieb, método de referencia)
 Método por hidrólisis ácida: (SchmidtSondzynski modificado).
modificado)
 Método ppor hidrólisis combinada: alcalina
y ácida.
Determinación de Grasas
Métodos con ataque previo
MÉTODO DE ROSE-GOTTLIEB
En este método, una cantidad exactamente
medida o p
pesada de la muestra se trata con
alcohol etílico e hidróxido de amonio y se extrae
posteriormente la grasa por agitación con éter
etílico y éter de petróleo, en tubo de Rörig o
frasco de Mojonnier.
Determinación de Grasas
Métodos con ataque previo
MÉTODO DE ROSE-GOTTLIEB
Los volúmenes etéreos conteniendo la grasa
disuelta se vuelcan o sifonan a un balón
previamente tarado.
Se hacen cuatro o cinco extracciones y luego
se evaporan los solventes y se determina la
grasa extraída por pesada.
pesada
El alcohol etílico,, soluble en agua
g
y éter,,
permite que este último entre en contacto más
íntimo con la grasa.
Determinación de Grasas
Métodos con ataque previo
MÉTODO DE ROSE-GOTTLIEB
En los productos lácteos permite además la
p
precipitación
p
de la caseína en forma muy
y
finamente dividida y por consiguiente la rápida
disolución de ésta en el hidróxido de amonio.
El éter de petróleo reduce la solubilidad del agua
en el éter etílico y previene la extracción por el éter
de materiales hidrosolubles.
Alimentos en que se emplea: leche, leche
condensada, leche en polvo, helados, dulce de
leche, crema.
Determinación de Grasas
Métodos con ataque previo
MÉTODO DE HIDRÓLISIS ÁCIDA
Este método se diferencia fundamentalmente
del anterior en q
que el ataque
q p
previo se realiza con
ácido clorhídrico, también en medio alcohólico.
 Se calienta la mezcla y la proteína se disuelve
en el medio ácido y la porción lipídica se separa
en la parte superior.
superior
Se pprosigue
g
la determinación del mismo modo
que en el método por hidrólisis alcalina.
Determinación de Grasas
Métodos con ataque previo
MÉTODO DE HIDRÓLISIS ÁCIDA
La hidrólisis ácida es menos aconsejable que
el método de Rose-Gottlieb si el material
contiene una proporción elevada de azúcar.
Alimentos en que se emplea: pan,
pan pastas,
pastas
productos de panificación, productos de la
pesca huevos,
pesca,
huevos etc.
etc
Determinación de Grasas
Métodos con ataque previo
MÉTODO DE HIDRÓLISIS COMBINADA
Se realiza la digestión en primer lugar con
hidróxido de amonio y después
p
de neutralizar,,
con ácido clorhídrico.
El resto del procedimiento es igual al ya
mencionado y la determinación de la grasa es
también gravimétrica.
gravimétrica
Determinación de Grasas
Métodos con ataque previo
UNIDADES DE HIDRÓLISIS
Determinación de Grasas
Métodos con ataque previo
UNIDADES DE HIDRÓLISIS
 La unidad de hidrólisis permite hidrolizar
varias muestras simultáneamente.
 La hidrólisis se puede realizar en ambiente
ácido o en ambiente básico a temperatura
controlada.
 La muestra hidrolizada se filtra y se lava con
agua
g
desionizada p
para eliminar cualquier
q
rastro
de ácido o de álcali; se somete después a la
extracción por solvente.
Determinación de Grasas
Métodos con ataque previo
UNIDADES DE HIDRÓLISIS
Ver video en http://www.youtube.com/watch?v=jkxD5Tvt9Is
Determinación de Grasas
Métodos con ataque previo
UNIDADES DE HIDRÓLISIS
Determinación de Grasas
Métodos con ataque previo
UNIDADES DE HIDRÓLISIS
Ver video en http://www.youtube.com/watch?v=jkxD5Tvt9Is
Determinación de Grasas
Métodos con ataque previo
MÉTODO DE GERBER - VOLUMÉTRICO
Consiste en disolver la fracción proteica por
medio de un ácido para dejar la materia grasa en
libertad y poder reunirla por centrifugación.
Se utiliza H2SO4 de densidad 1,82 que rompe el
glóbulo graso disolviendo la caseína y alcohol
amílico que es ayuda a romper la emulsión,
antiespumígeno y previene la carbonización de la
materia orgánica
Determinación de Grasas
Métodos con ataque previo
MÉTODO DE GERBER
Determinación de Grasas
Métodos con ataque previo
 Tubo
que comunica por un
extremo con un vástago
aplanado
aplanado,
graduado
que
termina en una pequeña
cámara.
 Un
extremo con una boca que
se cierra mediante un tapón de
goma que puede enroscarse
más o menos profundamente.
 Cada
graduación
gruesa
corresponde
p
a 1 % de g
grasa.
Determinación de Grasas
Métodos con ataque previo
MÉTODO DE GERBER
 Alimentos en que se emplean: leche, leche
descremada cremas,
descremada,
cremas etc.
etc
 El empleo de estos métodos para el análisis
de cremas requiere del uso de butirómetros
especialmente calibrados al efecto.
Determinación de Proteínas
 La
determinación de la CANTIDAD DE
PROTEÍNA de
d un alimento
li
t no es sencilla
ill y ell valor
l
obtenido en cada caso depende del MÉTODO
utilizado.
utilizado
Muchos ensayos dependen de la PRESENCIA DE
UNA
DETERMINADA
CADENA
AMINOACÍDICA (Lowry, Biuret).
LATERAL
los
resultados analíticos se verán
condicionados por la proporción del
aminoácido en cuestión en las proteínas
sometidas al ensayo y necesitarán ser
referidos
f id a alguna
l
proteína
t í estándar.
tá d
Otros métodos se basan en la determinación del
contenido de NITRÓGENO TOTAL (Kjeldahl).
Determinación de Proteínas
Existen numerosas fuentes de NITRÓGENO
NO PROTEICO que pueden interferir en algunos
métodos de análisis:
aminoácidos libres, péptidos pequeños,
ácidos
nucleicos
nucleicos,
fosfolípidos
fosfolípidos,
aminoazúcares,
porfirina,
algunas
vitaminas, alcaloides, ácido úrico, urea,
iones amonio, etc.
Otras fuentes de interferencia pueden ser los
otros macronutrientes presentes en los
alimentos
li
t como hidratos
hid t de
d carbono
b
y lípidos.
lí id
Determinación de Proteínas
Es un método oficial descrito en múltiples
normativas: AOAC, ISO, Farmacopeas y distintas
Directivas Comunitarias.
Se basa en los siguientes supuestos:
la proporción de nitrógeno no proteínico en
un producto alimenticio es
pequeña
ñ para ser significativa,
i ifi ti
demasiado
una
determinación del contenido de
nitrógeno total (refleja con suficiente precisión
el contenido de proteína del alimento,
la
proporción que representa el nitrógeno
en la mayor parte de las proteínas alimenticias
es de 16%.
Determinación de Proteínas
FUNDAMENTO
Involucra la conversión del nitrógeno presente
a
sulfato
de
amonio
por
DIGESTIÓN
DIGESTIÓN,
DESTRUCCIÓN OXIDATIVA O MINERALIZACIÓN
con ácido sulfúrico.
sulfúrico
Posteriormente el sulfato de amonio se
descompone
por
ALCALINIZACIÓN
Ó
con
hidróxido de sodio y DESTILACIÓN del amoníaco
liberado captándolo en una solución ácida.
Finalmente se realiza una VALORACIÓN del
amoníaco.
Determinación de Proteínas
El ácido sulfúrico OXIDA LA MATERIA
ORGÁNICA y
formado.
se
combina
bi
con
ell
amonio
i
 Los elementos carbono e hidrógeno se
convierten en dióxido de carbono y agua.
Durante la digestión se libera el nitrógeno
proteico para formar iones de amonio.
Esta determinación incluye todo el nitrógeno
reducido presente (-NH2
( NH2 y =NH),
=NH) de modo que
los
compuestos
amoniacales,
urea
y
aminoácidos libres son también valorados.
valorados
 El uso de perlas de vidrio sirve de núcleo para
la formación de burbujas.
Determinación de Proteínas
ECUACIONES
Digestión:
n-C-NH2 + mH2SO4 + catalizadores
CO2 + (NH4)2SO4 + SO2
Neutralización y destilación
(NH4)2SO4 + 2 NaOH
NH3 + H3BO3
2 NH3 + Na2SO4 + 2 H2O
NH4+ + H2 BO3-
Titulación
H2BO3- + H+
H3BO3
Determinación de Proteínas
UN POCO DE HISTORIA
En 1883 el investigador danés Johann Kjeldahl
desarrolló el proceso básico del conocido
método actual de análisis de proteínas por el
método Kjeldahl,
Kjeldahl más propiamente,
propiamente para analizar
nitrógeno orgánico.
El método original fue sufriendo luego algunas
modificaciones.
 Wilforth (1885)
 Gunning (1889)
 Arnold
 Winkler
Determinación de Proteínas
UN POCO DE HISTORIA
En el método original la digestión se efectuaba
con una mezcla de ácido sulfúrico y anhídrido
fosfórico y la oxidación se completaba mediante
la adición de permanganato de potasio.
potasio
Las modificaciones del método que han
resultado más útiles emplean:
 óxido de mercurio como catalizador de
oxidación (Wilfoth).
 K2SO4
para aumentar el punto de
ebullición del ácido sulfúrico (Gunning).
 CuSO4 también como catalizador de
oxidación (Arnold).
Determinación de Proteínas
UN POCO DE HISTORIA
 Los catalizadores permiten acortar el tiempo de
digestión
g
y actúan como transportadores
p
de O2.
Cuando
se usa Hg como catalizador, éste debe
ser precipitado mediante el agregado de tiosulfato
de sodio para liberar el NH3.
 Otra
Ot
modificación
difi
ió ampliamente
li
t aceptada
t d es la
l
introducida en la etapa de destilación propuesta
por Winkler:
 originalmente
se utilizaba ácido sulfúrico
valorado
l
d para captar
t ell amoníaco,
í
 titulando
p
posteriormente
su exceso con
NaOH valorado.
Determinación de Proteínas
UN POCO DE HISTORIA
 La modificación consiste en:
recibir el NH3 sobre una solución de ácido
bórico,
valorarlo
directamente con solución
valorada de H2SO4 (Winkler) o HCl.
Ventajas:
la solución
de ácido bórico no necesita
ser exactamente medida, eliminando los
errores en la medición del ácido valorado en
el colector y por otra parte sólo se requiere
una solución valorada H2SO4 o HCl.
Determinación de Proteínas
ESQUEMÁTICAMENTE
Determinación de Proteínas
EQUIPO DE KJELDAHL
Determinación de Proteínas
UNIDADES DE DIGESTIÓN Y DESTILACIÓN
Determinación de Proteínas
ALGUNOS EQUIPOS
 Los
equipos mas modernos vienen con un
sistema de EXTRACCIÓN Y NEUTRALIZACIÓN DE
GASES:
 una
paso
ácidas,
 una
unidad “Scrubber”
Scrubber que bloquea el
y neutraliza las condensaciones
bomba de recirculación de agua que
proporciona un gran caudal de vacío para la
aspiración de los gases.
Determinación de Proteínas
UNIDADES
BOMBA
DE
DIGESTIÓN,
SCRUBBER
Y
Determinación de Proteínas
DESTILADORES
Determinación de Proteínas
DESTILADORES Y TITULADORES
Determinación de Proteínas
VENTAJAS DEL MÉTODO
 Apropiado para varios tipos de productos.
Alta confiabilidad.
confiabilidad
Usado como método de referencia.
DESVENTAJAS DEL MÉTODO
Interfieren
compuestos
nitrogenados
proteicos.
Uso de catalizadores tóxicos o caros.
Elección del factor de conversión.
no
Determinación de Proteínas
FACTOR DE CONVERSÓN
 El
contenido porcentual promedio de N en las
proteínas de diversos alimentos es de 16%.
p
El
factor para convertir N en proteínas sería
entonces 100/16 = 6,25.
6 25
Este
factor general de conversión no es sin
embargo
b
exacto,
t ya que las
l
proteínas
t í
d origen
de
i
animal contienen generalmente menos nitrógeno y
las de origen vegetal más.
más
Así,
el factor de conversión para la proteína del
t i es 5,7
trigo
5 7 y para la
l de
d productos
d t lácteos
lá t
es 6,38.
6 38
Determinación de Proteínas
FACTOR DE CONVERSÓN
 Actualmente se conoce el contenido de N, y por
lo tanto el factor apropiado,
p p
, de una g
gran cantidad
de productos agrícolas.
Debido
a la confusión que podría derivarse del
hecho de utilizar el factor general de conversión
6,25 o el específico para la proteína en estudio
Es
necesario aclarar siempre en los
informes el factor de conversión utilizado
para el cálculo de proteínas.
Determinación de Proteínas
FACTOR DE CONVERSÓN
 Actualmente se conoce el contenido de N, y por
lo tanto el factor apropiado,
p p
, de una g
gran cantidad
de productos agrícolas.
Debido
a la confusión que podría derivarse del
hecho de utilizar el factor general de conversión
6,25 o el específico para la proteína en estudio
Es
necesario aclarar siempre en los
informes el factor de conversión utilizado
para el cálculo de proteínas.
Determinación de Proteínas
FACTOR DE CONVERSÓN
Determinación de Proteínas
CÁLCULOS
%N = V x N x 14 x 100
1000
p
%N = V x N x 0,014 x 100
p
V: mL de ácido
N: normalidad del ácido
P: gramos de muestra
0,014: equivalente volumétrico del N
Determinación de Fibra
 La
FIBRA BRUTA es el residuo orgánico lavado
y
seco
que
queda
después
de
hervir
sucesivamente el material desengrasado con ácido
sulfúrico
lfú i
e hidróxido
hid ó id de
d sodio
di diluídos.
dil íd
Aunque
la fibra
consta en muchos casos
principalmente de celulosa, la cantidad obtenida
depende del método analítico empleado para su
d t
determinación:
i
ió
Técnica
p
para
determinar Fibra Dietaria
Total (Método enzimático gravimétrico)
Técnica de Detergente Ácido
Técnica de Detergente Neutro
Determinación de Fibra
Técnica para determinar Fibra Dietaria Total Método enzimático gravimétrico (AOAC 985.29)
Las
muestras, por duplicado,
muestras
duplicado previamente
desecadas deben desgrasarse si el contenido de
lípidos
p
es igual
g
o mayor
y a 10%.
Se
gelatinizan con Termamyl (alfa amilasa
t
termoestable)
t bl ) y luego
l
se digieren
di i
enzimaticamente
i ti
t
con proteasa y amiloglucosidasa para eliminar
proteínas y almidón.
almidón
Cuatro
volúmenes de etanol se adicionan para
precipitar la fibra dietaria soluble.
El residuo total se filtra,
filtra se lava con etanol 78%,
78%
etanol 95% y acetona.
Determinación de Fibra
Después de secado se pesa el residuo.
 Un
duplicado se emplea para determinar de
proteínas y otro se incinera a 525
525º C y se emplea
para cuantificar cenizas.
Fibra dietaria total = peso del residuo – peso
(proteína + cenizas)
Determinación de Hidratos de
carbono
 Se
pueden
determinar
por
conociendo los otros componentes.
p
 En
diferencia
general se determinan por Métodos Físicos
Indirectos:
Refractometría
Polarimetría
Aerometría
Métodos
Mét d Químicos
Q í i
Volumetría
Gravimetría