leishmaniosis

CAPÍTULO 2.1.8.
LEISHMANIOSIS
RESUMEN
La leishmaniosis no es una entidad única y comprende una variedad de síndromes debidos
fundamentalmente a por lo menos 16 especies y subespecies de Leishmania. Los perros son
afectados generalmente por L. infantum y L. chagasi (que ahora se consideran sinónimas), pero se
han descrito también las infecciones caninas por L. tropica, L. major y L. braziliensis. En el hombre,
el espectro clínico varía desde las infecciones asintomáticas a otras con elevada mortalidad, con
tres formas clásicas descritas: visceral (LV), cutánea (LC) y mucocutánea (LMC). Los vectores de
estas enfermedades son mosquitos que pertenecen a los géneros Phlebotomus y Lutzomyia.
Identificación del agente: Cuando en el hombre y en los animales afectados se presentan los
síntomas clínicos y las lesiones características, la demostración del parásito en frotis teñidos de
biopsia esplénica, de médula ósea y de nódulos linfáticos, en raspados cutáneos y en biopsias
tisulares, constituye un diagnóstico positivo. Si la infección es de un grado bajo, la detección del
parásito solo es posible mediante los intentos de aislamiento in vitro o in vivo o por la reacción en
cadena de la polimerasa (PCR). Como existen pocas diferencias entre las distintas especies,
cualquier Leishmania aislada debe identificarse por métodos moleculares, bioquímicos e
inmunológicos. Varios centros en el mundo utilizan en la actualidad la caracterización de los
isozimas, el ADN y los antígenos para identificar el agente.
Pruebas serológicas: La serología es el método de diagnóstico preferido para la leishmaniosis
canina y la LV, incluso durante las primeras fases de la enfermedad. En las formas subclínicas, los
casos seropositivos se confirman mediante el diagnóstico parasitológico o la PCR. La serología
tiene menos valor en la LC y LMC. De entre las diversas técnicas serológicas disponibles, la
prueba de inmunofluorescencia indirecta y el enzimoinmunoensayo son las más adecuadas. Los
antígenos para el serodiagnóstico deben prepararse en el laboratorio, aunque se están evaluando
algunos productos comercializados.
Prueba de hipersensibilidad retardada: La prueba cutánea de la leishmanina es útil para
determinar la distribución de las infecciones humanas, y sirve para distinguir los casos inmunes de
los no inmunes. La prueba es positiva en LC, LMC y LV curada, pero es negativa en la LV activa.
Requisitos para las vacunas y el material de diagnóstico: No hay en la actualidad ninguna
vacuna eficaz disponible para su uso en el hombre y en los perros. La leishmanina, que ya no está
disponible comercialmente, precisa ser estandarizada.
A. INTRODUCCIÓN
La lesihmaniosis está causada por el protozoo parásito Leishmania, que es transmitido por vectores. Se han
descrito varias formas de manifestaciones clínicas de la leishmaniosis humana (38), que se han dividido en tres
entidades: leishmaniosis visceral (LV, kala azar), lesihmaniosis cutánea (LC, llaga de oriente, uta, pian bois,
úlcera de chiclero) y leishmaniosis mucocutánea (LMC, espundia) (50). En el Nuevo Mundo1, la leishmaniosis
está causada por el complejo de L. braziliensis (LMC y LC), el complejo de L. mexicana (LC), L. peruviana (LC) y
L. infantum (LV y LC); en el Viejo Mundo, los agentes etiológicos son L. donovani (LV), L. infantum (LV y LC),
L. tropica (LC), L. major (LC) y L. aethiopica (LC). Leishmania infantum y L. chagasi son idénticas en cuanto a su
genotipificación bioquímica y deberían considerarse como sinónimas (20, 29). Las enfermedades son zoonosis,
con dos excepciones que son la LC debida a L. tropica en las áreas urbanas del Próximo Oriente y Oriente Medio
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En este capítulo, el término ‘Nuevo Mundo’ indica América del Norte, Central y del Sur, y el término ‘Viejo Mundo’ se
refiere a Europa, África y Asia.
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y la LV debida a L. donovani en el subcontinente indio (norte de la India, Nepal y Bangladesh). La leishmaniosis
canina (LCan) es una enfermedad crónica viscero-cutánea causada por L. infantum (= L. chagasi), en la que el
perro actúa como reservorio. En algunos casos, los parásitos del complejo L. braziliensis, L. major y L. tropica se
han aislado de este hospedador (27, 31, 40). Los vectores de la leishmaniosis son mosquitos que pertenecen a
los géneros Lutzomyia (Nuevo Mundo) y Phlebotomus (Viejo Mundo).
B. TÉCNICAS DE DIAGNÓSTICO
1.
Identificación del agente
Los métodos de rutina disponibles para el diagnóstico de la leishmaniosis son el examen clínico de los casos
sospechosos, el diagnóstico parasitológico y el inmunodiagnóstico. Sin embargo, la demostración del parásito es
el único medio para confirmar la enfermedad de modo concluyente. En la LV y la LCan se recomienda el
aislamiento e identificación del parásito de las biopsias (nódulos linfáticos, médula ósea, y biopsia del bazo) junto
con pruebas moleculares y de inmunodiagnóstico. Para la confirmación de LC (mediante el raspado de las
lesiones o aspiración con aguja del borde de la lesión), es necesario el diagnóstico parasitológico, ya que ni el
examen clínico ni la serología resultan adecuados. Los frotis del material de las biopsias se tiñen con tinción de
Giemsa y se examinan al microscopio a ×600-1.000 aumentos. El material también debe cultivarse en medios
apropiados a 22–26°C.
Las características morfológicas de los amastigotes (en los hospedadores humanos y mamíferos) y de los
promastigotes (en los mosquitos y en cultivo) son las siguientes:

Amastigote: pequeño cuerpo intracelular redondeado u oval, de 1,5-3 × 2,5-6,5 µm, localizado en las
vacuolas del citoplasma de los macrófagos. No existen flagelos libres. El microorganismo tiene un núcleo
relativamente grande y un quinetoplasto que consiste en un cuerpo alargado y un cuerpo basal puntual.

Promastigote: microorganismo extracelular alargado, de 15–20 × 1,5-3,5 µm con un único flagelo de 15–
28 µm de longitud, que sale de las proximidades del quinetoplasoto en la parte anterior. El núcleo se sitúa
centralmente.
La elección de los métodos de aislamiento y de cultivo dependerá de las circunstancias inmediatas y de la
capacidad técnica y la experiencia del personal de laboratorio (45). El aislamiento in vitro presenta ciertas
ventajas respecto a los métodos in vivo: los cultivos son positivos más rápidamente (5-30 días en comparación
con los meses que tardan las lesiones en aparecer en un animal) y los materiales son menos costosos. Sin
embargo, para el aislamiento in vitro, las técnicas utilizadas deben llevarse a cabo en condiciones estériles
estrictas; por tanto, no siempre son fácilmente realizables en condiciones de campo. Por desgracia, no existe
todavía un medio de cultivo “universal” en que crezcan con facilidad todas las leishmanias y es casi imposible
predecir qué medio será el más apropiado para el crecimiento de un aislamiento particular de Leishmania. Cada
laboratorio tiene que encontrar el medio más adecuado entre los medios bifásicos de agar sangre y los medios
de cultivo de tejidos suplementados con suero fetal bovino (14). Cuando se intenta el aislamiento primario de
microorganismos desconocidos, se debe utilizar un medio con agar sangre –con preferencia el medio NNN
(Novy, McNeil y Nicolle) o, en su defecto, el medio sólido de infusión de cerebro y corazón (BHI) o el medio
EMTM (medio de Tobie modificado por Evans). En la sección B.1.a. se describen varios medios adecuados para
el cultivo en masa de los aislamientos establecidos, (véase la ref. 14 para la composición de los medios). Los
microorganismos de los pacientes con LV y LMC pueden ser muy difíciles de cultivar. A veces, incluso cuando el
aislamiento inicial tiene éxito, los parásitos pueden morir cuando se subcultivan. Esto parece especialmente
frecuente cuando el aislamiento inicial se hace en un medio rico. A menudo esto se puede superar si los
subcultivos se realizan en medios nutritivos menos ricos, como el NNN, o uno de los medios semisólidos, como
el “Evans mojado” o el agar sangre semisólido de Locke.
El hámster (Misocricetus auratus) es el animal más utilizado para los aislamientos in vivo (27). En caso de
detectar parásitos dermatotrópicos, las suspensiones de los tejidos o las biopsias se inoculan por vía
intradérmica en la nariz y/o los extremos de las patas. Cuando se sospecha que el material está infectado con los
parásitos que causan la LV, se debe hacer la inoculación preferiblemente por la vía intraperitoneal. La infección
que resulta aparece visible semanas o meses después por el desarrollo de un nódulo o úlcera en el sitio de la
inoculación, y en el caso de los parásitos viscerotrópicos, la infección se manifiesta meses después por la
infección masiva de los órganos internos. El examen de los frotis de las suspensiones de tejidos o biopsias de
hámster mostrará amastigotes con tinción de Giemsa. Para el diagnóstico de L. major, se utilizan generalmente
ratones BALB/c.
En muchos centros se están utilizando varias técnicas para identificar las diferentes especies, subespecies y
cepas de Leishmania.
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a)
La caracterización de isozimas, también conocida como electroforesis de enzimas multigénicos, es el
método de referencia para la identificación de las especies (23, 29, 45, 50), aunque esta técnica requiere
cultivar un gran número de parásitos (5 × 109–1 × 1010). Los principios de la electroforesis de enzimas son
los siguientes: se extraen los enzimas solubles de los microorganismos crecidos en medio para cultivo en
masa (medio BHI, medio MEM/FCS/EBLB [medio mínimo esencial/suero fetal bovino/caldo de Evans con
sangre lisada], medio Drosophila de Schneider). Se coloca después una pequeña cantidad del extracto en
una sustancia inerte de soporte, la matriz, que contiene un tampón a un pH determinado. Generalmente, la
matriz es un gel de almidón, pero puede ser también acetato de celulosa absorbente, acrilamida o agarosa.
Normalmente se escoge el pH del tampón de la matriz de modo que los isozimas estén cargados
negativamente. A través de la matriz se pasa una corriente directa llevada por los iones del tampón.
Cuando se completa la electroforesis, la mayoría de las proteínas se habrán desplazado hacia el ánodo en
la matriz, dependiendo de la carga negativa. Si se tiñen en esta fase con un colorante general de proteínas,
se aprecian muchas bandas. No obstante, la elevada especificidad de los enzimas como substrato y como
cofactor hace posible teñir solo estas proteínas. Por tanto, se puede comparar la movilidad electroforética
de un enzima particular en varios microorganismos. La matriz con el conjunto de las bandas de isozimas
teñidas se denomina zimograma. Por lo general, para ayudar a la interpretación de los resultados, se
incluyen en el gel uno o más extractos de microorganismos de referencia, cuyo modelo de bandas de
enzimas está bien documentado. La mayoría de los enzimas utilizados para fines de caracterización se
tiñen por métodos que incorporan una reacción de deshidrogenación. Se deberían examinar por lo menos
12 enzimas; los microorganismos con zimogramas idénticos se consideran como zimodemos de una
especie determinada.
b)
La técnica de los anticuerpos monoclonales (MAb) se aplica al análisis y la clasificación de las especies y
subespecies (20). Para la producción de anticuerpos, se inmunizan ratones BALB/c con preparaciones de
membranas de promastigotes o amastigotes. Después se seleccionan y se clonan por diluciones limitantes
los cultivos de hibridoma que secretan anticuerpos. La especificidad para las cepas de Leishmania se
determina por inmunofluorescencia o por pruebas inmunoradiométricas. Estos análisis deberían ser
cuantitativos, pues la cantidad de un mismo antígeno superficial puede variar entre distintas especies de
Leishmania. Se han utilizado también los anticuerpos monoclonales en las técnicas inmunohistoquímicas
con aplicación a los tejidos de las biopsias.
c)
Las sondas de hibridación de ADN son un instrumento muy específico cuyo principio es permitir que las
secuencias marcadas del ADN nuclear o del quinetoplasto, de una sola cadena, procedentes de cepas
estándar bien caracterizadas, se encuentren e hibriden con secuencias de ADN homólogas de un
aislamiento de Leishmania desconocido (19,44). Solo las secuencias de ADN complementario formarán
ADN de cadena doble, que se puede detectar por autoradiografía si la sonda está marcada
radiactivamente, o por una reacción inmunoenzimática. Estas técnicas son lo suficientemente sensibles
como para identificar 102–103 microorganismos depositados en filtros de nailon. Se necesitan muchos
menos parásitos (<10) para la identificación por la técnica de hibridación in situ.
d)
Se utilizan los métodos basados en la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) para diagnosticar y/o
identificar Leishmania en diferentes tipos de muestras procedentes de humanos o de perros. En esencia,
las técnicas desarrolladas para detectar los microorganismos en biopsias recientes congeladas, fijadas con
formol e incluidas en parafina, o para identificar aislamientos de Leishmania, comprenden: (a) la digestión
del material con proteinasa K y extracción de ADN; (b) la amplificación del estándar por PCR utilizando
secuencias oligonucleotídicas (cebadores) seleccionadas del gen del ARNr de la subunidad pequeña (28),
minicírculos del ADN del quinetoplasto (25) u otras secuencias altamente repetitivas del ADN genómico (9,
36); (c) el análisis de los productos de amplificación en geles de agarosa al 1–2%. Se puede realizar una
PCR anidada o semianidada utilizando cebadores internos de las secuencias anteriores para aumentar la
sensibilidad. En la LV humana, la PCR tiene una sensibilidad comparable a la de los métodos de cultivo,
pero suministra resultados mucho más deprisa. En la CanL, la eficacia diagnóstica de la PCR en
comparación con la serología depende del curso natural de la enfermedad, siendo la sensibilidad mayor
poco después de la infección (37). En la LC y LMC americana, la PCR parece ser más sensible que
cualquier otro método de diagnóstico recomendado previamente (13). Se han descrito varias técnicas que
mejoran la sensibilidad y la especificidad del método, como el análisis mediante la PCR-RFLP (polimorfismo
de fragmentos grandes de restricción) donde los productos de la PCR se digieren con enzimas de
restricción adecuados y se analiza el patrón resultante para la identificación de la especie o cepa (30, 46).
También se han descrito métodos de PCR en tiempo real que permiten el análisis continuo de la
acumulación de los productos de la PCR durante la amplificación y que están comercializados. Pueden ser
más sensibles que la PCR convencional, y están principalmente orientados al estudio de la cinética de la
infección y al control de la respuesta terapéutica (3, 7). Además, se ha descrito que la PCR en tiempo real
es útil para evaluar las infecciones en muestras menos invasivas como la sangre (15).
2.
Pruebas serológicas
Se usan varias pruebas serológicas para detectar anticuerpos anti-leishmania. Los valores de sensibilidad
indicados más abajo para cada prueba se aplican, no obstante, a individuos que no están inmunocomprometidos.
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Capítulo 2.1.8. — Leishmaniosis
Se ha descrito un alto porcentaje de pacientes con LV que están co-infectados con el virus de la
inmunodeficiencia humana (HIV) y que son seronegativos para anticuerpos contra leishmanias (18).
a)
Prueba de inmunofluorescencia indirecta
La prueba de inmunofluorescencia indirecta (IFI) es de amplio uso por su facilidad de aplicación. La prueba
es específica de género, aunque se han descrito reacciones cruzadas significativas en individuos infectados
con Tripanosoma cruzi. Para estos casos, serían más apropiadas las pruebas serológicas basadas en los
antígenos específicos recombinantes de Leishmania (véase la sección B.3.2b y d más adelante). En áreas
libres de la enfermedad de Chagas, la prueba IFI para el diagnóstico clínico de LV o CanL tiene una
sensibilidad del 96% y una especificidad del 98%, es decir, similares a las del enzimoinmunoensayo
(ELISA). Aunque se pueden usar como antígenos los amastigotes de los cortes congelados o de los frotis
de órganos infectados, los promastigotes cultivados representan la fuente de antígeno más común.

Preparación de antígeno
i)
Se recogen 3–4 ml del medio líquido de un cultivo de 3 días que muestre un buen crecimiento de
promastigotes (véase la sección B.1. para los medios de cultivo).
ii)
Se lavan los microorganismos tres veces con solución salina tamponada con fosfato (PBS), pH 7,2–
7,4, mediante centrifugación a 350 g durante 15 minutos a temperatura ambiente.
iii)
Se resuspende el sedimento final en PBS y, con la ayuda de un hemocitómetro, se ajusta la
concentración de promastigote a aproximadamente 4 × 106/ml.
iv)
Se distribuyen 30 µl de la suspensión de promatigotes en cada círculo de un porta de muestra múltiple
y se deja secar a temperatura ambiente.
v)
Se fijan los promastigotes con acetona fría durante 10 minutos, luego se pasan los portas a una caja
de plástico y se guardan en un congelador (–35°C) durante menos de 2–3 meses.

Procedimiento de la prueba
i)
Los portas congelados recubiertos con el antígeno se lavan con PBS y se dejan secar a temperatura
ambiente.
ii)
Se inactivan los sueros durante 30 minutos en un baño de agua a 56°C.
iii)
Se hacen diluciones dobles de los sueros de ensayo desde 1/80 a 1/10.240 para la LV en humanos y
desde 1/40 a 1/5.120 para la LCan. Se incluyen también en la prueba sueros control positivos y
negativos a diluciones de 1/80 y 1/160 para la LV en humanos y de 1/40 y 1/80 para LCan. No hay
sueros estándar disponibles, pero se deben preparar y titular estándares internos.
iv)
Se distribuyen 30 µl de muestras de suero diluido en cada círculo del porta y se incuba durante
30 minutos a 37°C.
v)
Se eliminan las muestras de suero mediante un lavado vigoroso con PBS y se sumergen los portas en
PBS durante 10 minutos. Se deja que se sequen los portas.
vi)
Se distribuyen 30 µl de solución diluida de antinmunoglobulina conjugada a isotiocianato de
fluoresceína (FITC) en cada círculo del porta y se incuba 30 minutos a 37°C. Existen inmunoglobulinas
comercializadas anti-perro y anti-humanos conjugadas a FITC. Para las diluciones apropiadas,
síganse las instrucciones.
vii)
Se repite el paso v y se monta con un cubre en unas cuantas gotas de PBS/glicerol (50% [v/v] de cada
componente).
viii) Se observan los portas en un microscopio de fluorescencia. El título de los anticuerpos es la mayor
dilución que muestra promastigotes fluorescentes. En la LV humana, el título umbral normalmente
varía de 1/80 a 1/160 mientras que en la LCan varía de 1/40 a 1/60. Como la realización de la prueba
IFI puede variar en distintos laboratorios, es mejor que cada laboratorio defina su propio título umbral
utilizando sueros definidos de referencia positivos y negativos.
b)
Enzimoinmunoensayo
Los ensayos ELISA se pueden hacer con suero o con un volumen medido de sangre. La sangre se recoge
por punción con aguja en tiras de papel absorbente adecuado y se deja secar. La muestra se eluye y se
prueba a una dilución única determinada previamente para dar una especificidad y sensibilidad aceptables.
Esta prueba se puede utilizar para los estudios epidemiológicos en condiciones de campo.
En el método clásico, el antígeno se prepara como sigue: los promastigotes recogidos del cultivo se lavan
cuatro veces con PBS, pH 7,2, a 1.000 g durante 15 minutos. El paquete de promastigotes se resuspende
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al doble de su volumen en agua destilada y se sonica a amplitud media en un baño de hielo. La suspensión
se deja toda la noche a 4°C para dejar que las proteínas pasen a la solución. Después de una
centrifugación final a 4.000 g durante 10 minutos para eliminar los restos celulares, la capa superior, que
contiene el antígeno soluble concentrado, se distribuye en viales y se guarda a –20°C hasta su utilización.
Para su utilización en la prueba, se reconstituye con PBS a la concentración de proteína óptima
predeterminada (aproximadamente 20 µg/ml) medida por el método de Lowry. El método ELISA es útil para
diagnosticar la leishmaniosis del Viejo y del Nuevo Mundo. No existe o hay poca reacción cruzada con otras
enfermedades y, dependiendo de la cepa de Leishmania utilizada, la sensibilidad varía del 86% al 99%.
Se considera que una variante de ELISA, llamada prueba de análisis por ensayos Falcon y
enzimoinmunoensayo (FAST-ELISA), que utiliza bolas recubiertas de antígeno, es una prueba sensible,
específica y adaptable a las condiciones de campo para la CanL visceral, con una sensibilidad y una
especificidad que son comparables a las de las pruebas IFI y ELISA. La sangre completa o el plasma se
pueden evaluar rápidamente sin el uso de un microscopio o de un espectrofotómetro (1).
Para el diagnóstico de la LCan mediante el ELISA, se ha utilizado un antígeno del promastigote soluble en
detergente en vez de lisados totales. El detergente fue Tritón X-100 y el extracto proteico se protegió con
inhibidores de proteasas. Utilizando este método, la sensibilidad del ELISA aumentó hasta el 99,5%,
mientras que su especificidad fue comparable con la de la prueba IFI (97%) (26).
Los métodos ELISA descritos anteriormente se basan en preparaciones antigénicas crudas. Más
recientemente, se ha descrito un antígeno recombinante de una proteína clonada de L. infantum, llamada
rK39, que es muy reactiva con sueros procedentes de casos de leishmaniosis visceral humana y canina
cuando se emplea en un formato ELISA. Utilizando 25-50 ng del antígeno, se detectó un 99% de
especificidad y de sensibilidad para pacientes humanos inmunocompetentes con LV clínica y para perros
con la enfermedad parasitológica demostrada (2, 41). En pacientes positivos para el HIV, el ELISA-K39
mostró una mayor sensibilidad (82%) que la prueba IFI (54%) (24). El antígeno K39, que posee una
estabilidad y reproducibilidad notables, se produce ahora comercialmente.
c)
Prueba de aglutinación directa
Para el diagnóstico de la LV y la CanL, se ha descrito la prueba de la aglutinación directa (DAT). Después
de mejoras, la DAT se ha validado como una prueba específica y sensible para investigaciones de campo
(4, 10, 35). El antígeno consiste en promastigotes recogidos de cultivos, lavados con PBS, pH 7,2, tratados
con 0,4% de tripsina (durante 45 minutos a 37°C y luego lavados de nuevo), y teñidos con 0,02% de azul
brillante Coomassie. En pocillos con fondo en V de placas de microtitulación se preparan diluciones dobles
seriadas de suero en PBS; se añaden a cada pocillo 50 µl de preparación de antígeno y se agita la placa
cuidadosamente con la mano y se deja 18 horas a temperatura ambiente. La prueba se estima visualmente
contra un fondo blanco. Las reacciones positivas indican un botón azul de bordes limpios.
Para los trabajos epidemiológicos y ecológicos a gran escala y para el diagnóstico de la CanL, resulta muy
adecuada una prueba DAT modificada para la detección de anticuerpos específicos contra leishmanias en
hospedadores caninos, mostrando una sensibilidad del 100% y una especificidad del 98,9% (21, 22). La
fiabilidad de esta prueba se ha mejorado tratando los sueros de ensayo con 0,2 M de 2-mercaptoetanol e
incubándolos a 37°C.
d)
Prueba inmunocromatográfica rápida (en varilla o tira)
En diferentes condiciones endémicas de la LV, se ha evaluado una prueba inmunocromatográfica rápida en
la que se usa rK39 como antígeno (prueba comercializada K39 en varilla o en tira). La membrana de
nitrocelulosa del kit de la prueba tiene una almohadilla absorbente en un extremo, una banda de anticuerpo
inmovilizado anti-proteína A en el otro (para detectar IgG) (zona de control) y una banda de antígeno rK39
en el centro (zona de prueba). Se emplea un conjugado proteína-A-oro coloidal como reactivo de detección
inmunocromatográfica. Se coloca una pequeña gota (20 µl) del suero a examinar sobre la almohadilla
absorbente antes de añadir dos gotas mayores (100 µl) del tampón de la prueba y se deja que la mezcla
emigre por la tira mediante capilaridad. Tras 2–10 minutos, el resultado es positivo si aparecen dos líneas
rojas definidas (una en la zona de la prueba y otra en la zona del control), es negativo cuando no aparece la
línea roja en la zona de la prueba, y se considera inválido si no aparece ninguna línea en la zona del
control.
En casos clínicos de LV humana, la prueba K39 mostró un 100% de sensibilidad y un 93% de especificidad
en la India (43), un 90% de sensibilidad y un 100% de especificidad en Brasil (11), y un 100% de
sensibilidad y especificidad en la cuenca mediterránea (8). En la L. canina demostrada parasitológicamente,
la sensibilidad de la prueba fue del 97% y la especificidad del 100%, tanto en los casos sintomáticos como
en los asintomáticos (34).
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3.
Prueba de la hirpersensibilidad retardada
La hipersensibilidad retardada es una característica importante de todas las formas de leishmaniosis humanas y
se puede medir por la prueba de la leishmanina, también conocida como la reacción de Montenegro (27). La
prueba cutánea de la leishmanina carece de valor diagnóstico para la LCan. La leishmanina es una suspensión
de promastigotes muertos y completos (0,5–1 × 107/ml) o desintegrados (250 µg de proteína/ml) en una solución
salina libre de pirógenos que contiene fenol. Se desarrolla una reacción retardada que aparece a las 48–
72 horas.
La tasa de reacciones positivas falsas en personas sanas es de aproximadamente el 1%, pero puede ser mayor
en las áreas donde existe un fondo de leishmaniosis, pues muchas personas sanas pueden mostrar una elevada
sensibilidad a la leishmanina. Existe una reacción cruzada completa entre todas las cepas de Leishmania,
aunque a menudo los antígenos heterólogos dan una reacción menor, pero esto puede estar originado por las
dificultades de estandarización. Se utiliza en el diagnóstico clínico de LC y LMC. En la LV solo indica infecciones
pasadas porque, durante la enfermedad activa, se produce una anergia completa. Las leishmaninas ya no están
disponibles en el mercado.
C. REQUISITOS PARA LAS VACUNAS Y EL MATERIAL DE DIAGNÓSTICO
1.
Vacuna
No hay una vacuna efectiva disponible para la inmunización profiláctica contra la leishmaniosis. Hasta ahora, la
única vacunación segura contra Leishmania se ha limitado a la protección de los humanos contra L. tropica y
L. major mediante la infección previa inducida por una inyección de microorganismos de L. major. Los
promastigotes se inyectan en el brazo y en otras partes del cuerpo. Los promastigotes vivos que se utilizan
deben proceder de cultivos recientes o estar conservados en nitrógeno líquido. Se deja que la infección prosiga
su curso normal y, después de la recuperación, el individuo queda inmune frente a una infección subsecuente
con ambas especies de leishmanias. Este tipo de inmunización se ha practicado a escala limitada en áreas
hiperendémicas de LC (causada por L. major) en Israel, Irán y la antigua URSS (42). Leishmania major origina
una protección cruzada contra L. tropica, pero lo inverso probablemente no sucede. No obstante, esta especie no
puede considerarse segura y este tipo de inmunización debe utilizarse solo en los humanos que se desenvuelvan
en áreas de alto riesgo. Además, no resulta beneficioso en áreas muy endémicas porque los individuos contraen
la infección mucho antes de que este tipo de preparación confiera protección (se tarda aproximadamente 3
meses en adquirir la inmunidad). La estandarización y el control de calidad de tales vacunas, que no están
disponibles en la actualidad, constituyen una necesidad urgente. En el momento presente, están en fase de
desarrollo varias vacunas prometedoras contra las leishmanias (12, 16). Entre las vacunas de primera
generación, la fracción de L. donovani enriquecida en glicoproteína y conocida como “ligando fucosa-manosa”
(FML), desarrollada en Brasil, representa la primera vacuna veterinaria autorizada contra la Lcan. Los estudios
de campo han mostrado cerca del 80% de protección clínica debida al antígeno suministrado con saponina QuilA
como adyuvante (5), y también una buena eficacia inmunoterapéutica cuando se usó en perros enfermos (6). Se
han experimentado microorganismos muertos de Leishmania, mezclados con una baja concentración de BCG
como adyuvante, en ensayos en fases I-II y en fase III para inmunizar contra los agentes de la LC en los
humanos y contra los de la LV en los humanos y en los perros, con éxito limitado (32, 33).
Las vacunas de segunda generación, la mayor parte de las cuales está en fase de predesarrollo, consisten en
parásitos de Leishmania genéticamente reconstruidos e incapaces de producir la enfermedad, en moléculas
recombinantes de sus respectivos ADN, o en microorganismos recombinantes que llevan genes de leishmanias y
expresan antígenos del parásito. Un antígeno quimérico, generado de tres antígenos recombinantes de
Leishmania ensayados en cuanto a la capacidad de inducir respuestas inmunes celulares (conocido como
Leish-111f), se sometió a la fase I de prueba clínica en voluntarios sanos en enero de 2003 (38). El mismo
antígeno poliproteico, administrado con una emulsión estable de monofosforil-lípido A (MPL-SE) o con Adjuprime
como adyuvantes, no fue capaz de proteger a los perros infectados por L. infantum en una prueba en fase III
(17).
2.
Antígenos de inmunodiagnóstico
Ni la leishmanina utilizada para las pruebas cutáneas ni los antígenos normalmente empleados en el
serodiagnóstico de la leishmaniosis están estandarizados internacionalmente (el antígeno recombinante k39, que
está virtualmente estandarizado, está protegido con una patente y no está ampliamente disponible). La prueba
de la leishmanina es específica de grupo, no de especie, y la leishmanina preparada a partir de un tipo clínico de
leishmaniosis causará el desarrollo de hipersensibilidad retardada al mismo o a otros tipos clínicos. De modo
similar, las reacciones serológicas cruzadas son comunes entre las especies de leishmanias.
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a)
Leishmanina
La prueba de la leishmanina se describe en la sección B.3. Para las preparaciones de leishmanina, se
requieren pruebas de esterilidad, inocuidad y potencia.
b)
Antígenos para pruebas serológicas
Los antígenos comerciales que se han producido para las pruebas IFI y ELISA están aún en proceso de
evaluación. La principal razón de los resultados poco satisfactorios obtenidos con estos antígenos es su
baja estabilidad. Se pueden obtener en el laboratorio creciendo una cepa de Leishmania en un medio de
cultivo adecuado. Para la prueba IFI y la DAT, se necesitan antígenos crudos particulados, es decir,
promastigotes intactos, mientras que para las pruebas ELISA y CIEP se necesita una forma soluble del
antígeno.
3.
Control del inóculo
a)
Características del inóculo
Las cepas de especies de Leishmania que se usan para preparar los productos biológicos deben
identificarse como especie y subespecie mediante las pruebas de identificación pertinentes mencionadas
en la sección B.1. Una vez que los microorganismos se han aislado y establecido en el laboratorio, se les
debe asignar un código Internacional (45, 50). Este código consta de cuatro elementos separados por
barras oblicuas: (a) el tipo de hospedador del que se aísla la cepa (M para mamíferos e I para insectos,
seguido de tres letras que indican el nombre genérico del hospedador); (b) el país donde se aísla, indicado
por un código de dos letras; (c) el año del aislamiento, indicado por los dos últimos dígitos, y (d) el código
original del laboratorio dado al aislamiento (por ejemplo, MHOM/IN/80/DD8). Los parásitos deben estar
libres de microorganismos contaminantes y ser capaces de originar un producto adaptado a las normas.
Las cepas estándar están disponibles previa petición a la los Centros Colaboradores de la Organización
Mundial de la Salud (OMS) en Madrid (España), Montpellier (Francia) y Jerusalén (Israel). La OMS ha
publicado una lista de Centros de Identificación (50).
b)
Método de cultivo
La cepa de parásito utilizada para preparar la leishmanina debe ser capaz de producir un producto que se
adapte a las normas nacionales/internacionales. Debe carecer de ingredientes que causen reacciones
tóxicas o alérgicas. No hay un antígeno único estandarizado para su utilización en las pruebas
serodiagnósticas, pero, cuando estos antígenos se preparan en el laboratorio, deben estandarizarse en
cuanto a la sensibilidad dependiendo de las necesidades. Tanto para la preparación de la leishmanina
como para la de los antígenos de serodiagnóstico, los microorganismos deben crecerse en un medio de
cultivo adecuado (como los recomendados en la sección B.1. para el aislamiento y el crecimiento en masa
de Leishmania). Normalmente, se obtiene un buen crecimiento de los parásitos a los 7 días de la
inoculación, y se debe tener cuidado de que los stocks de leishmanias no se pierdan por sobrecrecimiento
de los flagelados, lo que puede ocurrir después de aproximadamente 10 días.
c)
Crioconservación
Los cultivos de promastigotes y los tejidos infectados con amastigotes se pueden conservar fácilmente en
estado vivo a bajas temperaturas. Ambas formas se pueden crioconservar durante años a temperaturas
bajas en congeladores (–70°C), en contenedores de dióxido de carbono sólido (–76°C) o en recipientes de
nitrógeno líquido (–196°C) (45). Se necesita un agente crioprotector –glicerol, a una concentración final de
7,5–10%, o dimetil sulfóxido (DMSO) a una concentración final de 5-7,5%. Las muestras se transfieren a los
contenedores estériles en los que van a ser congeladas. Estos pueden ser tubos de plástico de 2 ml para
congelación con tapón de rosca ajustado, vidrio duro, ampollas cerradas al fuego, o capilares de
vidrio/plástico. Para la crioconservación de Leishmania es esencial una velocidad de enfriamiento lenta
(aproximadamente 1°C/minuto). Esto se puede conseguir enfriando las muestras a 4°C y manteniéndolas a
esta temperatura durante un tiempo mínimo de 1 hora; luego se pasan a un congelador a –20°C y se dejan
durante 24 horas, a continuación se llevan a un congelador a –70°C y se dejan por lo menos 24 horas.
Pueden guardarse de modo permanente a esa temperatura o transferirse a nitrógeno líquido o a dióxido de
carbono sólido. Si es posible, se debe utilizar una unidad congeladora con programación. Cuando se
necesita el material crioconservado, se saca la muestra y se descongela rápidamente en un baño a 37°C.
d)
Validación
Antes de su utilización, los cultivos para leishmanina o los antígenos de serodiagnóstico deben examinarse
para la esterilidad. La leishmanina se guarda a 4°C y los antígenos de serodiagnóstico a –20°C o –70°C
hasta que se necesiten. Los últimos se deben reconstituir con PBS, pH 7,2, antes de su utilización. Los
cultivos viables de Leishmania se pueden mantener a –70°C durante 3-4 años o indefinidamente a –196°C.
Manual de la OIE sobre animales terrestres 2008
7
Capítulo 2.1.8. — Leishmaniosis
Debido a la falta de disponibilidad de una vacuna adecuada, no ha sido posible validar los agentes
inmunizantes actualmente desarrollados. Los promastigotes vivos o atenuados de L. major que se utilizan
en algunas áreas no son muy satisfactorios. La lesihmanina debe ser probada para su capacidad alérgica
en cobayas antes de su utilización. Los antígenos de serodiagnóstico deben probarse para su eficacia y su
sensibilidad mediante una estandarización propia para cada prueba particular. Si un lote de antígeno no se
ha utilizado desde hace mucho tiempo, debe volverse a comprobar antes de utilizarlo en una prueba.
4.
Método de producción
Como no hay antígenos estandarizados para el inmunodiagnóstico, es necesario prepararlos en el laboratorio. El
personal de laboratorio corre el riesgo de adquirir la infección, especialmente por inyección. Por consiguiente son
esenciales unas precauciones apropiadas de bioseguridad para reducir los riesgos (véase el capítulo 1.1.2.
Bioprotección y seguridad humana en los laboratorios veterinarios de microbiología).
a)
Leishmanina
Las especies de Leishmania se crecen preferiblemente en medio líquido libre de sangre como el medio
Drosophila de Schneider y el medio RPMI (Rosewell Park Memorial Institute), para evitar la contaminación
con los antígenos de la sangre. Los promastigotes se recogen durante la fase logarítmica, se lavan cuatro
veces con solución salina libre de pirógenos a 1.000 g durante 15 minutos y se resuspenden en solución
salina libre de pirógenos que contenga 0,5% de fenol (p/v) hasta obtener una concentración final de 0,5-1 ×
107/ml. La leishmanina también se puede obtener a partir de promastigotes lisados obtenidos de modo
similar y sonicados. El filtrado se ajusta a una concentración final de proteína de 250 µg/ml con solución
salina libre de pirógenos que contenga Tween 80 (0,0005% [v/v]) y fenol (0,28% [p/v]).
b)
Antígenos para las pruebas serológicas
Los métodos de preparación de antígeno para diversas pruebas se presentan en la sección B.2.
5.
Control del proceso
Para las pruebas de alergia deben probarse uno o más lotes de leishmanina en cobayas. La sensibilidad y la
especificidad de la leishmanina deben determinarse preferentemente realizando la prueba en modelos animales
apropiados (diferentes razas de ratones de acuerdo con las especies de Leishmania) o en pacientes que se han
recuperado de la infección por leishmania, y en una población control no expuesta al agente infeccioso.
6.
Control de lotes
La OMS ha sugerido normas para la producción de leishmanina (48, 49). Se recomienda que el material de
origen se controle mediante el análisis de isozimas para tipificar las cepas de Leishmania utilizadas en la
preparación de la leishmanina.
a)
Esterilidad
Cada lote completado debe probarse para la esterilidad bacteriana y micótica de acuerdo con la OMS (47).
La ausencia de leishmanias vivas se comprueba inoculando una muestra de cada lote en un medio de agarsangre adecuado, que luego se incuba a 23°C por lo menos durante 15 días. Se inyecta intradérmicamente
en ratones o en hámsters una muestra (para leishmanias dermotrópicas) o intraperitonealmente (para
leishmanias viscerotrópicas). Estos animales se observan durante un período de 30–90 días.
b)
Inocuidad
Las muestras de cada lote completado se deben probar para toxicidad anormal mediante pruebas
adecuadas en cobayas y conejos. Por cada lote, se inyecta por vía subcutánea o intraperitoneal una dosis
humana del producto cinco ratones que pesen entre 17–22 g y dos cobayas que pesen entre 250-350 g. A
continuación se examinan los animales muertos, o los que presentan síntomas de la enfermedad por lo
menos durante 7 días.
c)
Potencia
La leishmanina se prueba en modelos animales (de acuerdo con las especies de Leishmania implicadas)
que se han infectado previamente con la misma cepa que la utilizada en la producción de leishmanina. Se
inyectan por vía intradérmica grupos de al menos cinco animales infectados y animales control con 50 µl de
leishmanina en una de las patas posteriores. A los 2–3 días, todos los animales infectados deben mostrar
un notable ensanchamiento de la pata en comparación con los animales control.
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Manual de la OIE sobre animales terrestres 2008
Capítulo 2.1.8. — Leishmaniosis
7.
Pruebas sobre el producto final
a)
Inocuidad
Véase la sección C.6.b.
b)
Potencia
Véase la sección C.6.c.
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