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CAPÍTULO 2.2.11.
LEISHMANIOSIS
RESUMEN
La leishmaniosis no es una entidad única y comprende una variedad de síndromes debidos
fundamentalmente a por lo menos 16 especies y subespecies de Leishmania. Los perros son
afectados generalmente por L. infantum y L. chagasi (que ahora se consideran sinónimos), pero se
han descrito infecciones por L. tropica, L. major y L. braziliensis. En el hombre, el espectro clínico
varía desde infecciones asintomáticas a otras con elevada mortalidad, con tres formas clásicas
descritas: visceral (LV), cutánea (LC) y mucocutánea (LMC). Los vectores de estas enfermedades
son moscas flebotomicas que pertenecen a los géneros Phlebotomus y Lutzomyia.
Identificación del agente: Cuando en el hombre y en los animales afectados se presentan los
síntomas clínicos y las lesiones características, la demostración del parásito en frotis teñidos de
aspirados esplénicos, de médula ósea y de nódulos linfáticos, o en raspados cutáneos y en
biopsias tisulares, constituye un diagnóstico positivo. Si la infección es de un grado bajo, la
detección del parásito es solo posible mediante intentos de aislamiento in vitro o in vivo o por la
reacción en cadena de la polimerasa (PCR). Como existen pocas diferencias entre las distintas
especies, cualquier Leishmania aislada debe identificarse por métodos moleculares, bioquímicos e
inmunológicos. Varios centros en el mundo utilizan en la actualidad la caracterización de isozimas,
ADN y antígenos para identificar el agente.
Pruebas serológicas: La serología es el método de diagnóstico preferido para la leishmaniosis
canina y la LV, incluso durante las primeras fases de la enfermedad. En las formas subclínicas, los
casos seropositivos se confirman por diagnóstico parasitológico o por PCR. La serología tiene
menos valor en la LC y LMC. De entre las diversas técnicas inmunológicas disponibles, la prueba
de inmunofluorescencia indirecta y el enzimoinmunoensayo son las más adecuadas. Los antígenos
para serodiagnóstico deben prepararse en el laboratorio, aunque actualmente se están evaluando
algunos productos comercializados.
Prueba de hipersensibilidad retardada: La prueba cutánea de la leishmanina es útil para
determinar la distribución de las infecciones humanas, y sirve para distinguir casos inmunes o no
inmunes. La prueba es positiva en LC, LMC y LV curada, pero es negativa en la LV activa.
Requisitos para las vacunas y los materiales de diagnóstico: No hay en la actualidad ninguna
vacuna eficaz disponible para uso en humanos y perros. La leishmanina, que ya no está disponible
comercialmente, precisa estandarización.
A. INTRODUCCIÓN
La lesihmaniosis está causada por el protozoo parásito Leishmania, que es transmitido por vectores. Se han
descrito varias formas de manifestaciones clínicas de la leishmaniosis humana (33), que se han dividido en tres
entidades: leishmaniosis visceral (LV, kala azar), lesihmaniosis cutánea (LC, llaga de oriente, uta, pian bois,
úlcera de chiclero) y leishmaniosis mucocutánea (LMC, espundia). En el Nuevo Mundo 1 , la leishmaniosis está
causada por el complejo de L. braziliensis (LMC y LC), el complejo de L. mexicana (LC), L. peruviana (LC) y
L. chagasi (LV y LC); en el Viejo Mundo la leishmaniosis está causada por L. donovani (LV), L. infantum (LV y
LC), L. tropica (LC), L. major (LC) y L. aethiopica (LC). Leishmania infantum y L. chagasi son idénticas en
1
En este capítulo, el término "Nuevo Mundo" indica América del Norte, Central y del Sur, y el término "Viejo Mundo" se
refiere a Europa, África y Asia.
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genotipado bioquímico y deberían considerarse como sinónimas (20). Con escasa excepciones, las
enfermedades son zoonosis. La lesihmaniosis canina (CanL) es una enfermedad crónica víscero–cutánea
causada por L. infantum (= L. chagasi), donde el perro actúa como reservorio. En algunos casos, los parásitos
del complejo L. braziliensis, L. major y L. tropica se han aislado de este hospedador (27). Los vectores de la
leishmaniosis son moscas flebotómicas que pertenecen a los géneros Lutzomyia (Nuevo Mundo) y Phlebotomus
(Viejo Mundo).
B. TÉCNICAS DE DIAGNÓSTICO
1.
Identificación del agente
Los métodos de rutina disponibles para el diagnóstico de la leishmaniosis son el examen clínico de casos
sospechosos, el diagnóstico parasitológico y el inmunodiagnóstico. Sin embargo, la demostración del parásito es
el único medio de confirmar la enfermedad de modo concluyente (23). En LV y CanL se recomienda el
aislamiento e identificación del parásito de las biopsias (nódulos linfáticos, médula ósea, y aspirados del bazo)
junto a pruebas moleculares y de inmunodiagnóstico. Para la confirmación de LC (mediante raspado de las
lesiones o aspiración con aguja del borde de la lesión) es necesario el diagnóstico parasitológico, ya que ni el
examen clínico ni la serología resultan adecuados. Los frotis del material de las biopsias se tiñen con tinción de
Giemsa y se examinan al microscopio a x600–1.000 aumentos. El material también debe cultivarse en medios
apropiados a 22–26°C.
Las características morfológicas de los amastigotes (en hospedadores humanos y mamíferos) y de los
promastigotes (hospedadores invertebrados y en cultivo) son las siguientes:
•
Amastigote: pequeño cuerpo intracelular redondeado u oval, de 1,5–3 x 2,5–6,5 µm, localizado en las
vacuolas del citoplasma de los macrófagos. No existen flagelos libres. El organismo tiene un núcleo
relativamente grande y un cinetoplasto que consiste en un cuerpo alargado y un cuerpo basal puntual.
•
Promastigote: organismo extracelular alargado, de 15–20 x 1,5–3,5 µm con un único flagelo de 15–28 µm
de longitud, que sale de las proximidades del cinetoplasto en la parte anterior. El núcleo se sitúa
centralmente.
La elección de los métodos de aislamiento y de cultivo dependerá de las circunstancias inmediatas y de la
capacidad técnica y la experiencia del personal de laboratorio (34). El aislamiento in vitro presenta ciertas
ventajas respecto a los métodos in vivo: los cultivos son positivos más rápidamente (5–30 días en comparación
con los meses que tardan las lesiones en aparecer en un animal y los materiales son menos costosos. Sin
embargo, para el aislamiento in vitro, las técnicas utilizadas deben llevarse a cabo en condiciones estériles
estrictas; por tanto, no es siempre realizable en condiciones de campo. Por desgracia, no existe todavía un
medio de cultivo “universal” en que crezcan con facilidad todas las leishmanias y es casi imposible predecir qué
medio será el más apropiado para el crecimiento de un aislamiento particular de Leishmania. Cada laboratorio
tiene que encontrar el medio más adecuado entre los medios bifásicos de agar sangre y los medios de cultivo de
tejidos suplementados con suero fetal bovino (7). Cuando se intenta el aislamiento primario de organismos
desconocidos, se debe utilizar un medio con agar sangre –con preferencia el medio NNN (Novy, McNeil y
Nicolle) o, en su defecto, medio sólido de infusión de cerebro y corazón (BHI) o medio EMTM (medio de Tobie
modificado por Evans). En la Sección B.1.a. se describen medios adecuados para el cultivo en masa de
aislamientos establecidos, (ver ref. 7 para la composición de los medios). Los organismos de pacientes con LV y
LMC pueden ser muy difíciles de cultivar. A veces, incluso cuando el aislamiento inicial tiene éxito, los parásitos
pueden morir cuando se subcultivan. Esto parece especialmente frecuente cuando el aislamiento inicial se hace
en medio rico. A menudo esto se puede superar si los subcultivos se realizan en medios nutritivos menos ricos,
como el NNN, o unos de los medios semisólidos, como el “Evans mojado” o el agar sangre semisólido de Locke.
El hámster (Misocricetus auratus) es el animal más utilizado para aislamientos in vivo (27). En caso de detectar
parásitos dermatotrópicos, las suspensiones de tejidos o los aspirados se inoculan intradérmicamente en la nariz
y/o los pies. Cuando se sospecha que el material está infectado con parásitos que causan LV, se debe hacer la
inoculación preferiblemente por la ruta intraperitoneal. La infección que resulta se hace aparente semanas o
meses después por el desarrollo de un nódulo o úlcera en el sitio de la inoculación, y en el caso de parásitos
viscerotrópicos la infección se evidencia meses después por la infección masiva de los órganos internos. El
examen de frotis de suspensiones de tejidos/aspirados de hámster mostrará amastigotes con tinción de Giemsa.
Para el diagnóstico de L. major se usan generalmente ratones BALB/c.
En muchos centros se están utilizando varias técnicas para identificar las diferentes especies, subespecies y
cepas de Leishmania.
a)
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La caracterización de isozimas es el método más común (1, 13, 27, 34). Esta técnica requiere un gran
número de parásitos (5 x 109–1 x 1010). Los principios de la electroforesis de enzimas son los siguientes: se
extraen los enzimas solubles de los organismos crecidos en medio para cultivo en masa (medio BHI, medio
MEM/FCS/EBLB [medio mínimo esencial/suero fetal bovino/caldo de Evans con sangre lisada], medio
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Drosophila de Schneider). Se coloca después una pequeña cantidad del extracto en una substancia inerte
de soporte, la matriz, que contiene un tampón a un pH determinado. Generalmente la matriz es gel de
almidón, pero puede ser también absorbente, acetato de celulosa, acrilamida o agarosa. Normalmente se
escoge el pH del tampón de la matriz de modo que los isozimas estén cargados negativamente. A través de
la matriz se pasa una corriente directa llevada por los iones del tampón. Cuando se completa la
electroforesis, la mayoría de las proteínas se habrán desplazado hacia el ánodo en la matriz, dependiendo
de la carga negativa. Si se tiñen en esta fase con un colorante general de proteínas, se verán muchas
bandas. No obstante, la elevada especificidad de substrato y de cofactor de los enzimas hace posible teñir
solo estas proteínas. Por tanto, se puede comparar la movilidad electroforética de un enzima particular en
varios organismos. La matriz con el conjunto de bandas de isozimas teñidas se denomina un zimograma.
Por lo general, para ayudar a la interpretación de los resultados, se incluyen en el gel uno o más extractos
de organismos de referencia cuyo modelo de bandas de enzimas está bien documentado. La mayoría de
los enzimas utilizados para fines de caracterización se tiñen por métodos que incorporan una reacción de
deshidrogenación. Se deberían examinar por lo menos 12 enzimas.
b)
La técnica del anticuerpo monoclonal (MAb) se aplica al análisis y clasificación de especies y subespecies
de Leishmania tanto del Nuevo como del Viejo Mundo (13, 27, 34). Para la producción de anticuerpos, se
inmunizan ratones BALB/c con preparaciones de membranas de promastigotes o amastigotes. Después se
seleccionan y se clonan por diluciones limitantes los cultivos de hibridoma que secretan anticuerpo. La
especificidad para las cepas de Leishmania se determina por inmunofluorescencia o por pruebas
inmunoradiométricas. Estos análisis deben ser cuantitativos, pues la cantidad de un mismo antígeno
superficial puede variar entre distintas especies de Leishmania. Se han utilizado también anticuerpos
monoclonales en técnicas inmunohistoquímicas con aplicación a los tejidos de las biopsias.
c)
El análisis del ADN del cinetoplasto con enzimas de restricción se basa en el análisis, mediante
electroforesis en gel, de los fragmentos que generan las endonucleasas en el abundante ADN mitocondrial
que constituye el cinetoplasto (10, 13, 15, 27, 32). El patrón electroforético que se obtiene, conocido como
“huellas” de restricción, es un marcador del orgánulo a nivel genotípico que permite la identificación y
clasificación de las cepas de Leishmania en esquizodemos –poblaciones que tienen secuencias similares en
el ADN del cinetoplasto. Esta técnica también requiere un gran número de parásitos (1 x 1010).
d)
Las sondas de hibridación de ADN son un instrumento prometedor cuyo principio es permitir que las
secuencias marcadas del ADN nuclear o del cinetoplasto, de una sola cadena, procedentes de cepas
estándar bien caracterizadas, se encuentren e hibriden con secuencias de ADN homólogas de un aislado de
Leishmania desconocido (13, 33). Solo las secuencias de ADN complementario formarán ADN de cadena
doble, que se puede detectar por autoradiografía si la sonda está marcada radiactivamente, o por una
reacción inmunoenzimática. Estas técnicas son lo suficientemente sensibles como para identificar 102–103
organismos depositados en filtros de nylon. Se necesitan muchos menos parásitos (<10) para la
identificación por la técnica de hibridación in situ.
e)
En la actualidad se utilizan los métodos basados en la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) para
diagnosticar y/o identificar Leishmania en muestras procedentes de humanos o de perros. En esencia, las
técnicas desarrolladas para detectar organismos en biopsias recientes o congeladas, o para identificar
aislamientos de Leishmania, comprenden: (a) digestión del material con proteinasa K y extracción de ADN;
(b) amplificación del estándar por PCR utilizando secuencias oligonucleotídicas seleccionadas del gen del
ARNr de la subunidad pequeña como molde (19), minicírculos del ADN del cinetoplasto (16) u otras
secuencias altamente repetitivas del ADN genómico (25); (c) análisis de los productos de amplificación en
geles de agarosa al 1–2%. Se puede realizar una PCR anidada o semianidada utilizando cebadores internos
de las secuencias anteriores para aumentar la sensibilidad. En la LV humana, la PCR tiene una sensibilidad
comparable a la de los métodos de cultivo, pero suministra resultados mucho más deprisa. En la CanL, la
eficacia diagnóstica de la PCR en comparación con la serología depende del curso natural de la
enfermedad, siendo la sensibilidad mayor poco después de la infección (88%) y decayendo después (50%)
(26). En la LC y LMC americana, la PCR parece ser más sensible que cualquier otro método de diagnóstico
recomendado previamente (5).
2.
Pruebas serológicas
Actualmente se usan varias pruebas serológicas para detectar anticuerpos anti–leishmania (2, 12, 13, 29). Los
valores de sensibilidad indicados abajo para cada prueba se aplican, no obstante, a individuos que no están
inmunocomprometidos. Se ha descrito un alto porcentaje de pacientes con LV que están co–infectados con el
virus de la inmunodeficiencia humana (HIV) y que son seronegativos para anticuerpos contra leishmanias (9).
a)
Prueba de inmunofluorescencia indirecta
La prueba de inmunofluorescencia indirecta (IFI) es de amplio uso por su facilidad. La prueba es específica
de género, aunque se han descrito reacciones cruzadas significativas en individuos infectados con
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Tripanosoma cruzi. Para estos casos, serían más apropiadas pruebas serológicas basadas en antígenos
específicos recombinantes de Leishmania (ver Sección B.3. más adelante). En áreas libres de la
enfermedad de Chagas, la prueba IFI para el diagnóstico clínico de LV o CanL tiene una sensibilidad del
96% y una especificidad del 98%, lo que es similar a la del enzimoinmunoensayo (ELISA). Aunque se
pueden usar como antígenos los amastigotes de cortes congelados o frotis de órganos infectados, los
promastigotes cultivados representan la fuente de antígeno más común.
•
Preparación de antígeno
i)
Recoger 3–4 ml del medio líquido de un cultivo de 3 días que muestre un buen crecimiento de
promastigotes (ver Sección B.1. para medios de cultivo).
ii)
Lavar los organismos tres veces con solución salina tamponada con fosfato (PBS), pH 7,2–7,4,
mediante centrifugación a 350 g durante 15 minutos a temperatura ambiente.
iii)
Resuspender el sedimento final en PBS y con ayuda de un hemocitómetro ajustar la concentración de
promastigote a aproximadamente 4 x 106/ml.
iv)
Distribuir 30 µl de la suspensión de promatigotes en cada círculo de un porta de muestra múltiple y
dejar secar a temperatura ambiente.
v)
Fijar los promastigotes con acetona fría durante 10 minutos, luego se pasan los portas a una caja de
plástico y se guardan en un congelador (–35°C) por menos de 2–3 meses.
•
Procedimiento de la prueba
i)
Lavar con PBS los portas congelados recubiertos con el antígeno y dejar secar a temperatura
ambiente.
ii)
Inactivar los sueros 30 minutos en un baño de agua a 56°C.
iii)
Hacer diluciones dobles de los sueros de ensayo desde 1/80 a 1/10.240 para la LV en humanos y
desde 1/40 a 1/5.120 para CanL. Se incluyen también en la prueba sueros control positivos y
negativos a diluciones de 1/80 y 1/160 para la LV en humanos y de 1/40 y 1/80 para CanL. No hay
sueros estándar disponibles, pero se deben preparar y titular estándares internos.
iv)
Distribuir 30 µl de muestras de suero diluido en cada círculo del porta e incubar durante 30 minutos a
37°C.
v)
Eliminar las muestras de suero por lavado vigoroso con PBS y sumergir los portas en PBS durante
10 minutos. Dejar que se sequen los portas.
vi)
Distribuir 30 µl de solución diluida de antinmunoglobulina conjugada a isotiocianato de fluoresceína
(FITC) en cada círculo del porta e incubar 30 minutos a 37°C. Existen inmunoglobulinas
comercializadas anti–perro y anti–humanos conjugadas a FITC. Para las diluciones apropiadas, seguir
las instrucciones.
vii)
Repetir el paso (v) y montar con un cubre en unas cuantas gotas de PBS/glicerol (50% [v/v] de cada
componente).
viii) Observar los portas en un microscopio de fluorescencia. El título de anticuerpo es la mayor dilución
que muestra promastigotes fluorescentes. En la LV humana, el título umbral normalmente varía de
1/80 a 1/160; en la CanL varía de 1/40 a 1/60. Como la realización de la prueba IFI puede variar en
distintos laboratorios, es mejor que cada laboratorio defina su propio título umbral utilizando sueros
definidos de referencia positivos y negativos.
b)
Enzimoinmunoensayo
Los ensayos ELISA se pueden hacer con suero o con un volumen medido de sangre. La sangre se recoge
por punción con aguja en tiras de papel absorbente adecuado y se deja secar. La muestra se eluye y se
prueba a una dilución única determinada previamente para dar una especificidad y sensibilidad aceptables.
Esta prueba se puede utilizar para estudios epidemiológicos en condiciones de campo.
En el método clásico, el antígeno se prepara como sigue: los promastigotes recogidos del cultivo se lavan
cuatro veces con PBS, pH 7,2, a 1.000 g durante 15 minutos. El paquete de promastigotes se resuspenden
al doble de su volumen en agua destilada y se sonican a amplitud media en un baño de hielo. La
suspensión se deja toda la noche a 4°C para dejar que las proteínas pasen a la solución. Después de una
centrifugación final a 4.000 g durante 10 minutos para eliminar los restos celulares, la capa superior, que
contiene el antígeno soluble concentrado, se distribuye en viales y se guarda a –20°C hasta su utilización.
Para su utilización en la prueba, se reconstituye con PBS a la concentración de proteína óptima
predeterminada (aproximadamente 20 µg/ml) medida por el método de Lowry. El método ELISA es útil para
diagnosticar la leishmaniosis del Viejo y del Nuevo Mundo. No existe o hay poca reacción cruzada con otras
enfermedades y, dependiendo de la cepa de Leishmania utilizada, la sensibilidad varía del 86% al 99%.
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Se considera que una versión de ELISA, llamada prueba de análisis por ensayos Falcon y
enzimoinmunoensayo (FAST–ELISA), que utiliza bolas recubiertas de antígeno, es una prueba sensible,
específica y adaptable a las condiciones de campo para la CanL visceral, con sensibilidad y especificidad
que son comparables a las de las pruebas IFI y ELISA. La sangre completa o el plasma se pueden evaluar
rápidamente sin el uso de un microscopio o de un espectrofotómetro (2).
Para el diagnóstico en ELISA de la CanL, se ha utilizado un antígeno del promastigote soluble en
detergente en vez de lisados totales. El detergente fue Tritón X–100 y extracto proteico se protegió con
inhibidores de proteasas. Utilizando este método, la sensibilidad del ELISA aumentó hasta el 99,5%,
mientras que su especificidad fue comparable con la de la prueba IFI (97%) (17).
Los métodos ELISA descritos anteriormente se basan en preparaciones antigénicas crudas. Más
recientemente, se ha descrito un antígeno recombinante de una proteína clonada de L. chagasi, llamada
rK39, que es muy reactiva con sueros de casos de leishmaniosis visceral humana y canina cuando se
emplea en un formato ELISA. Utilizando 25–50 ng del antígeno, se detectó un 99% de especificidad y de
sensibilidad para pacientes humanos inmunocompetentes con LV clínica y para perros con enfermedad
parasitológica demostrada (3, 28). En pacientes positivos para HIV el ELISA–K39 mostró mayor sensibilidad
(82%) que la prueba IFI (54%) (14). El antígeno K39, que posee una estabilidad y reproducibilidad notables,
se produce ahora comercialmente.
c)
Prueba de aglutinación directa
Para el diagnóstico de la LV y la CanL se ha descrito la prueba de la aglutinación directa (DAT). Después
de mejoras, la DAT se ha validado como una prueba específica y sensible para investigaciones de campo
(4, 24). El antígeno consiste en promastigotes recogidos de cultivos, lavados con PBS, pH 7.2, tratados con
0,4% de tripsina (durante 45 minutos a 37°C y luego lavados de nuevo), y teñidos con 0,02% de azul
brillante Coomassie. En pocillos con fondo en V de placas de microtitulación se preparan diluciones dobles
seriadas de suero en PBS; se añade a cada pocillo 50 µl de preparación de antígeno y la placa se agita
cuidadosamente con la mano y se deja 18 horas a temperatura ambiente. La prueba se estima visualmente
contra un fondo blanco. Las reacciones positivas indican un botón azul de bordes limpios.
Una prueba DAT modificada para la detección de anticuerpos específicos contra leishmanias en
hospedadores caninos resulta muy adecuada para trabajos epidemiológicos y ecológicos de campo a gran
escala y para el diagnóstico de CanL, mostrando una sensibilidad del 100% y una especificidad del 98,9%
(11, 12). La fiabilidad de esta prueba se ha mejorado tratando los sueros de ensayo con 0,2 M de 2–
mercaptoetanol e incubándolos a 37°C.
d)
Contra—inmunoelectroforesis (CIEP)
El principio general de esta prueba es que el movimiento de la mayoría de las moléculas de proteína es
hacia el ánodo, excepto las gamma–globulinas, que se mueven hacia el cátodo. Esta propiedad se utiliza
en la prueba de contra–inmunoelectroforesis (CIEP). El anticuerpo se mueve hacia el cátodo bajo el flujo
electrosmótico y los antígenos cargados negativamente se mueven hacia el ánodo y precipitan en contacto
con el antisuero. El procedimiento es el siguiente: se vierten en portas 3–5 ml de agarosa y se preparan
pocillos cuando la agarosa solidifica. El suero se coloca en el pocillo del ánodo y el antígeno de leishmania,
preparado como si fuera para ELISA, en el pocillo del cátodo. El porta se coloca en una cubeta de
electroforesis con tampón barbitona, pH 8,2, y se conecta a las cámaras de tampón con tiras de papel de
filtro. Se aplica una corriente de aproximadamente 8 mAmp (miliamperios) y después de 2–3 horas se
examina el porta para líneas de precipitación. La prueba CIEP es un diagnóstico fiable y en el caso de CanL
ha dado mejores resultados que el ELISA.
3.
Prueba de hirpersensibilidad retardada
La hipersensibilidad retardada es una característica importante de todas las formas de leishmaniosis humanas y
se puede medir por la prueba de la leishmanina, también conocida como la reacción de Montenegro (18). La
prueba cutánea de la leishmanina no tiene valor diagnóstico para la CanL. La leishmanina es una suspensión de
promastigotes muertos y completos (0,5–1 x 107/ml) o desintegrados (250 µg de proteína/ml) en una
solución salina libre de pirógenos que contiene fenol. Se desarrolla una reacción retardada que aparece a las
48–72 horas.
La tasa de reacciones positivas falsas en gente sana es de aproximadamente el 1%, pero puede ser mayor en
áreas donde existe un fondo de leishmaniosis, pues mucha población sana puede mostrar una elevada
sensibilidad a la leishmanina. Existe una reacción cruzada completa entre todas las cepas de Leishmania,
aunque a menudo los antígenos heterólogos dan una reacción menor, pero esto puede estar originado por
dificultades de estandarización. Se utiliza en el diagnóstico clínico de LC y LMC. Solo indica infecciones pasadas
porque durante la enfermedad activa se produce una anergia completa. Las leishmaninas ya no están
disponibles en el mercado.
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C. REQUISITOS PARA LAS VACUNAS Y LOS MATERIALES DE DIAGNÓSTICO
1.
Vacuna
No hay una vacuna efectiva disponible para la inmunización profiláctica contra la leishmaniosis. Hasta ahora, la
única vacunación segura contra Leishmania se ha limitado a la protección de los humanos contra L. tropica y
L. major por infección previa inducida por inyección de organismos de L. major. Los promastigotes se inyectan en
el brazo y otras partes del cuerpo. Los promastigotes vivos que se utilizan deben proceder de cultivos recientes o
estar conservados en nitrógeno líquido. Se deja que la infección prosiga su curso normal y, después de la
recuperación, el individuo queda inmune frente a una infección subsecuente con ambas leishmanias. Este tipo de
inmunización se ha practicado a escala limitada en áreas hiperendémicas de LC (causada por L. major) en Israel,
Irán y la antigua URSS (31). Las preparaciones inmunizantes contenían promastigotes vivos, infecciosos y
virulentos. Sin embargo, en Irán se han realizado ensayos controlados al azar con una vacuna de L. major
muerta más el bacilo de Calmette y Guerin contra la leishmaniosis cutánea animal y humana (22, 30), pero los
resultados han sido decepcionantes.
Leishmania major origina protección cruzada contra L. tropica, pero lo inverso no sucede. No obstante, esta
especie no puede considerarse segura por completo y puede convertir al hospedador inmunizado en un
reservorio que será una fuente potencial de infección mientras la lesión quede sin curar. Por tanto, este tipo de
inmunización debe utilizarse solo en humanos que se desenvuelvan en áreas de alto riesgo. Además, no resulta
beneficioso en áreas muy endémicas porque los individuos contraen la infección mucho antes de que este tipo
de preparación confiera protección. Se tarda aproximadamente 3 meses antes de que se adquiera inmunidad. La
estandarización y el control de calidad de tales vacunas, que no están disponibles en la actualidad, constituye
una necesidad urgente. En el momento presente, están en fase de desarrollo varias vacunas prometedoras
contra las leishmanias (8). Las vacunas de primera generación consisten en organismos muertos de Leishmania
mezclados con una baja concentración de BCG como adyuvante. Varias preparaciones que utilizan
promastigotes enteros (autoclavados) o desintegrados por ultrasonicación están actualmente en ensayos en fase
I–II y en fase III para inmunizar contra los agentes de la LC en humanos y contra los de la LV en humanos y en
perros (6, 21). Recientemente se han utilizado en Brasil vacunas de subunidades como candidatos terapéuticos,
con varios antígenos clonados, uno de los cuales es un poderoso adyuvante, para tratar en humanos
L. braziliensis resistente a drogas en las mucosas.
Las vacunas de segunda generación, que están en fase de predesarrollo, consisten en parásitos de Leishmania
genéticamente reconstruidos e incapaces de producir la enfermedad, en moléculas recombinantes de sus ADNs
correspondientes, o en organismos recombinantes que llevan genes de leishmanias y expresan antígenos del
parásito.
2.
Antígenos de inmunodiagnóstico
Ni la leishmanina utilizada para pruebas cutáneas ni los antígenos empleados en el serodiagnóstico de la
leishmaniosis están estandarizados internacionalmente. La prueba de la leishmanina es específica de grupo, no
de especie, y la leishmanina preparada a partir de un tipo clínico de leishmaniosis causará el desarrollo de
hipersensibilidad retardada al mismo o a otros tipos clínicos. De modo similar, las reacciones serológicas
cruzadas son comunes entre las especies de leishmanias.
a)
Leishmanina
La prueba de la leishmanina se describe en la Sección B.3. Para las preparaciones de leishmanina se
requieren pruebas de esterilidad, inocuidad y potencia.
b)
Antígenos para pruebas serológicas
Los antígenos comerciales que se han producido para las pruebas IFI y ELISAs están aún bajo evaluación.
La principal razón de los resultados poco satisfactorios con estos antígenos es su baja estabilidad. Se
pueden obtener en el laboratorio creciendo una cepa de Leishmania en un medio de cultivo adecuado. Para
la prueba IFI y la DAT, se necesitan antígenos crudos particulados, es decir, promastigotes intactos,
mientras que para las pruebas ELISAs y CIEP se necesita una forma soluble del antígeno.
3.
Control del inóculo
a)
Características del inóculo
Las cepas de especies de Leishmania que se usan para preparar productos biológicos deben identificarse a
nivel de especie y subespecie mediante las pruebas de identificación pertinentes dadas en la sección B.1.
Una vez que los organismos se han aislado y establecido en el laboratorio, se les debe asignar un Código
Internacional (27, 34, 38). Este código consta de cuatro elementos separados por barras oblicuas: (a) el tipo
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Capítulo 2.2.11. − Leishmaniosis
de hospedador del que la cepa se aísla (M para mamíferos e I para insectos, seguido de tres letras que
indican el nombre genérico del hospedador); (b) el país donde se aísla , indicado por un código de dos
letras; (c) el año del aislamiento indicado por los dos últimos dígitos, y (d) el código original del laboratorio
dado al aislamiento (por ejemplo, MHOM/IN/80/DD8). Los parásitos deben estar libres de organismos
contaminantes y ser capaces de originar un producto adaptado a las normas. Las cepas estándar están
disponibles previa petición a la los Centros Colaboradores de la Organización Mundial de la Salud (OMS)
en Londres, Reino Unido, Montpellier, Francia y Jerusalén, Israel. La OMS ha publicado una lista de
Centros de Identificación (38).
b)
Método de cultivo
La cepa de parásito utilizada para preparar leishmanina debe ser capaz de producir un producto que se
adapte a las normas nacionales/internacionales. Debe carecer de ingredientes que causen reacciones
tóxicas o alérgicas. No hay un antígeno único estandarizado para utilización en las pruebas
serodiagnósticas, pero cuando estos antígenos se preparan en el laboratorio deben estandarizarse en
cuanto a sensibilidad dependiendo de las necesidades. Tanto para la preparación de leishmanina como
para la de antígenos de serodiagnóstico, los organismos deben crecerse en un medio de cultivo adecuado
(como los recomendados en la Sección B.1. para aislamiento y crecimiento en masa de Leishmania).
Normalmente, se obtiene un buen crecimiento de los parásitos a los 7 días de la inoculación y se debe
tener cuidado de que los stocks de leishmanias no se pierdan por sobrecrecimiento de los flagelados, lo
que puede ocurrir después de aproximadamente 10 días.
c)
Crioconservación
Los cultivos de promastigotes y los tejidos infectados con amastigotes se pueden conservar fácilmente en
estado vivo a bajas temperaturas. Ambas formas se pueden crioconservar durante años a temperaturas
bajas en congeladores mecánicos (–70°C), en contenedores de dióxido de carbono sólido (–76°C) o en
recipientes de nitrógeno líquido (–196°C) (34). Se necesita un agente crioprotector - glicerol, a una
concentración final de 7,5–10%, o dimetil sulfóxido (DMSO) a una concentración final de 5–7,5%.
Las muestras se transfieren a los contenedores estériles en los que van a ser congeladas. Estos pueden
ser tubos de plástico de 2 ml para congelación con tapón de rosca ajustado, vidrio duro, ampollas cerradas
al fuego, o capilares de vidrio/plástico. Para la crioconservación de Leishmania es esencial una velocidad
de enfriamiento lenta (aproximadamente 1°C/minuto). Esto se puede conseguir enfriando las muestras a
4°C y manteniéndolas a esta temperatura por un tiempo mínimo de 1 hora; luego se pasan a un congelador
a –20°C y se dejan durante 24 horas, a continuación se llevan a un congelador a –70°C y se dejan por lo
menos 24 horas. Pueden guardarse de modo permanente a esta temperatura o transferirse a nitrógeno
líquido o a dióxido de carbono sólido. Si es posible, se debe utilizar una unidad congeladora con
programación. Cuando se necesita el material crioconservado, se saca la muestra y se descongela
rápidamente en un baño a 37°C.
d)
Validación
Antes de su utilización, los cultivos para leishmanina o antígenos de serodiagnóstico deben examinarse
para esterilidad. La leishmanina se guarda a 4°C y los antígenos de serodiagnóstico a –20°C o –70°C hasta
que se necesiten. Los últimos se deben reconstituir con PBS, pH 7,2, antes de su utilización. Los cultivos
viables de Leishmania se pueden mantener a –70°C durante 3–4 años o indefinidamente a –196°C. Debido
a la falta de disponibilidad de una vacuna adecuada, no ha sido posible validar los agentes inmunizantes
actualmente desarrollados. Los promastigotes vivos o atenuados de L. major que se utilizan en algunas
áreas están lejos de resultar satisfactorios. La lesihmanina debe ser probada para su capacidad alérgica en
cobayas antes de utilización. Los antígenos de serodiagnóstico deben probarse para eficacia y sensibilidad
mediante estandarización propia para cada prueba particular. Si un lote de antígeno no se ha utilizado
desde hace mucho tiempo, debe volverse a comprobar antes de utilizarlo en una prueba.
4.
Método de producción
Como no hay antígenos estandarizados para inmunodiagnóstico, es necesario prepararlos en el laboratorio. El
personal de laboratorio corre el riesgo de adquirir la infección, especialmente por inyección. Por consiguiente son
esenciales unas precauciones apropiadas de bioseguridad para reducir los riesgos (ver Capítulo I.1.6. Seguridad
humana en los laboratorios veterinarios de microbiología).
a)
Leishmanina
Las especies de Leishmania se crecen preferiblemente en medio líquido libre de sangre como el medio
Drosophila de Schneider y el medio RPMI (Rosewell Park Memorial Institute), para evitar contaminación con
antígenos de la sangre. Los promastigotes se recogen durante la fase logarítmica, se lavan cuatro veces
con solución salina libre de pirógenos a 1.000 g durante 15 minutos, y se resuspenden en solución salina
libre de pirógenos que contenga 0,5% de fenol (p/v) hasta obtener una concentración final de 0,5–1 x 107
Manual de la OIE sobre animales terrestres 2004
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Capítulo 2.2.11. − Leishmaniosis
/ml. La leishmanina también se puede obtener de promastigotes lisados obtenidos de modo similar y
sonicados. El filtrado se ajusta a una concentración final de proteína de 250 µg/ml con solución salina libre
de pirógenos que contenga Tween 80 (0,0005% [v/v]) y fenol (0,28% [p/v]).
b)
Antígenos para pruebas serológicas
Los métodos de preparación de antígeno para diversas pruebas se presentan en la Sección B.2.
5.
Control del proceso
Deben probarse en cobayas uno o más lotes de leishmanina para pruebas de alergia. La sensibilidad y la
especificidad de la leishmanina deben determinarse preferentemente realizando la prueba en modelos animales
apropiados (diferentes razas de ratones de acuerdo con las especies de Leishmania) o en pacientes que se han
recuperado de infecciones por leishmania, y en una población control no expuesta al agente infeccioso.
6.
Control de lotes
La OMS ha sugerido normas para la producción de leishmanina (36, 37). Se recomienda que el material de
origen se controle mediante análisis de isozimas para tipificar las cepas de Leishmania utilizadas en la
preparación de leishmanina.
a)
Esterilidad
Cada lote completado debe probarse para esterilidad bacteriana y micótica de acuerdo con la OMS (35). La
ausencia de leishmanias vivas se comprueba inoculando una muestra de cada lote en un medio de agar–
sangre adecuado, que luego se incuba a 23°C por lo menos durante 15 días. Se inyecta en ratones o en
hámsters una muestra intradérmicamente (para leishmanias dermotrópicas) o intraperitonealmente (para
leishmanias viscerotrópicas). Estos animales se observan durante un período de 30–90 días.
b)
Inocuidad
Las muestras de cada lote completado se deben probar para toxicidad anormal mediante
pruebas adecuadas en cobayas y conejos. Por cada lote, se inyectan subcutánea o intraperitonealmente
con una dosis humana del producto cinco ratones que pesen entre 17–22 g y dos cobayas que pesen entre
250–350 g. A continuación se observan los animales para muerte o síntomas de enfermedad por lo menos
durante 7 días.
c)
Potencia
La leishmanina se prueba en modelos animales (de acuerdo con las especies de Leishmania implicadas)
que se han infectado previamente con la misma cepa que la utilizada en la producción de leishmanina. Se
inyectan intradérmicamente grupos de al menos cinco animales infectados y animales control con 50 µl de
leishmanina en una de las patas posteriores. A los 2–3 días, todos los animales infectados deben mostrar
un notable ensanchamiento de la pata en comparación con los animales control.
Todavía tiene que establecerse una preparación estándar internacional. La Sección de Leishmaniosis del
Programa de Investigación de Enfermedades Tropicales de la OMS financia programas dirigidos a lograr
una estandarización satisfactoria de la producción de leishmanina.
7.
Pruebas sobre el producto final
a)
Inocuidad
Ver Sección C.6.b.
b)
Potencia
Ver Sección C.6.c.
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Manual de la OIE sobre animales terrestres 2004
Capítulo 2.2.11. − Leishmaniosis
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