Contaminación del Cultivo Celular Fuentes, consecuencias

Contaminación del Cultivo Celular
Fuentes, consecuencias, prevención y eliminación Contaminación: es un componente del sistema de cultivo celular que tiene un impacto negativo sobre éste y/o su uso. ü  Sigue siendo un problema común e importante en la investigación básica así como en la fabricación de productos biológicos.
ü  Frecuentemente es crónica, dado que la mayoría de los eventos de contaminación son ignorados.
ü  Pone en peligro el uso de los cultivos celulares como herramienta válida y confiable en estudios dónde se los utiliza.
ü  Puede ingresar al sistema de cultivo celular como un contaminante químico o biológico del medio ambiente. ü  La contaminación biológica representa la mayor amenaza al sistema de cultivo celular dado que los organismos vivos metabolizan y se replican.
Fuentes de Contaminación:
v Técnica: manipulación, pipeteo, etc. v Superficie de trabajo.
v Operador: cabello, manos, vestimenta. Para reducir la frecuencia y gravedad de la contaminación es necesario conocer su fuente y v Materiales y reactivos: recipientes, tapones, pipetas, frascos de seguir una serie de técnicas de trabajo que cultivo, medios de cultivo, reactivos.
suponen la máxima asepsia así como la esterilización del material y el trabajo en v Equipamiento e instalaciones: aire de la habitación, campanas de flujo laminar, incubadores.
ambientes perfectamente estériles, cabinas de flujo laminar. v La importación de materiales biológicos: muestras de tejidos, ingreso de líneas celulares.
Técnica de manipulación estéril: diseñada para proporcionar una barrera entre los microorganismos del medio ambiente y el cultivo celular estéril.
A-­‐‑ Área de trabajo estéril: campana de cultivo celular o flujo laminar ,
v Debe estar correctamente configurada y colocada en un área restringida al cultivo celular.
v  Cambiar regularmente el filtro, de acuerdo a las instrucciones del fabricante.
v Debe estar despejada y contener sólo los elementos necesarios para un procedimiento en particular.
v Antes y después de su uso debe desinfectarse a fondo.
v Limpiar la superficie de trabajo con etanol al 70% antes y durante el trabajo, especialmente después de cualquier derrame.
v Utilizar luz ultravioleta para esterilizar el aire y superficies de trabajo expuestas entre los usuarios.
v Dejar la campana de cultivo celular funcionando en todo momento, sólo apagarla cuando no se utilice por períodos prolongados de tiempo.
Técnica de manipulación estéril: diseñada para proporcionar una barrera entre los microorganismos del medio ambiente y el cultivo celular estéril.
B-­‐‑ Buena higiene personal:
v  Lavarse las manos antes y después de trabajar con cultivos celulares.
v  Uso de equipo de protección personal.
C-­‐‑ Reactivos y Medios estériles:
v  Siempre esterilizar cualquier reactivo, medios de cultivo o soluciones preparadas en el laboratorio utilizando el procedimiento de esterilización apropiado (autoclave, filtro estéril, etc).
v Los reactivos comerciales y medios de cultivo deben ser sometidos a estrictos controles de calidad para garantizar su esterilidad.
Técnica de manipulación estéril: diseñada para proporcionar una barrera entre los microorganismos del medio ambiente y el cultivo celular estéril.
D-­‐‑ Manipulación estéril:
v Limpiar siempre las manos y el área de trabajo con etanol al 70%.
v Limpiar el exterior de los recipientes, frascos, placas y platos con etanol al 70% antes de colocándolos en la campana de cultivo celular.
v Evitar verter medios y reactivos directamente desde botellas o frascos.
v Utilizar pipetas de vidrio estériles o de plástico descartables y una propipeta para trabajar con líquidos. Utilizar cada pipeta sólo una vez para evitar contaminación cruzada.
v Tapar siempre las botellas y frascos inmediatamente después de su uso.
v Nunca destapar un frasco estéril, botella, caja de Petri, etc., hasta el momento en que esté listo para usarlo y nunca dejarlo abierto al medio ambiente.
Técnica de manipulación estéril: diseñada para proporcionar una barrera entre los microorganismos del medio ambiente y el cultivo celular estéril.
D-­‐‑ Manipulación estéril (continuación):
v Utilizar sólo material de vidrio y otros equipamientos estériles.
v No hablar, cantar, o silbar cuando se está realizando procedimientos estériles.
v Realizar los experimentos lo más rápido posible para minimizar la contaminación.
v Si se descubre un recipiente contaminado, no se lo debe abrir. Si se va a tomar muestras para su análisis hacerlo en ambiente estéril y después limpiar cuidadosamente el área de trabajo y encender la iluminación UV.
Métodos de Esterilización :
v  Calor húmedo: autoclave (sólidos-­‐‑líquidos).
v  Calor seco: estufas (sólidos).
v  Filtración (líquidos).
Controles de esterilización:
v  Controles físicos.
-­‐‑ Controlan el funcionamiento del equipo mediante los parámetros: Tº, presión, tiempo.
-­‐‑ Se utilizan: termómetros, manómetros, sensores de carga, válvulas y sistemas de registros.
-­‐‑ Los parámetros deben registrarse al incio y durante todo el proceso.
-­‐‑ Los instrumentos de medición deben calibrarse periódicamente. v  Controles químicos.
-­‐‑Indicadores de punto de fusión conocido y similar a la Tº de esterilización que viran de color en contacto con el agente esterilizante.
-­‐‑Indican si un paquete o envase ha sido sometido al proceso de esterilización pero NO garantizan esterilidad. Controles de esterilización:
v  Integradores.
-­‐‑Son controles fisico-­‐‑químicos que están diseñados para integrar la acción de Tº, tiempo y agente esterilizante.
-­‐‑Evidencian si el ciclo ha transcurrido en forma correcta.
-­‐‑Material sensible a los tres parámetros, si se combinan en forma adecuada.
v  Controles Biológicos (los más aceptables).
-­‐‑Dispositivos inoculados con diferentes microorganismos que se someten a los procesos esterilizantes. Tipos de Contaminaciones Biológicas:
v  Bacterias
v  Hongos y Levaduras
v  Micoplasmas
v  Virus
o  Contaminación con organismos de rápido crecimiento: son menos problemáticos, ya que suelen manifestarse y detectarse fácilmente, con lo cual el cultivo puede ser descartado inmediatamente. o  Contaminación críptica (‘escondida’ u ‘oculta’): es la más dificultosa, porque es demasiado pequeña como para ser visualizada en el microscopio o por su crecimiento lento, tal que, por el nivel bajo de microorganismos escapa a la detección y permanece no detectable. Tipos de contaminación
E
A
Bacteria
B
Levadura
C
Hongo (Moho)
D
Colonias de Micoplasmas crecidas sobre un agar nutritivo especial
F
Micrografía electrónica de micoplasmas creciendo sobre la superficie de las células en cultivo.
A
D
B
E
C
F
Contaminación bacteriana, por hongos y levaduras
Características de la contaminación microbiana:
Los medios de cultivo proporcionan un medio ideal para el A-­‐‑ Cambio repentino en el pH.
crecimiento de los contaminantes microbianos y los procedimientos habituales de manipulación son susceptibles de provocar B-­‐‑ Nubosidad en el medio o manchas en la superficie de crecimiento que se contaminación por estos organismos. disipan cuando se mueve el frasco.
C-­‐‑ Bajo un microscopio con bajo aumento (10x):
-­‐‑contaminación bacteriana: los espacios entre las células se observan granular y pueden brillar.
-­‐‑contaminación por hongos: producen finas micelas filamentosas y, a veces, grupos más densos de esporas. -­‐‑contaminación por levaduras: aparecen como esferas individuales o partículas ovoides con brotes.
D-­‐‑ Bajo un microscopio con más aumento (40x), puede observarse bacterias individuales y distinguir entre bacilos y cocos. Algunas bacterias están asociadas a las células en cultivo.
E-­‐‑ Con una preparación en portaobjeto, la morfología de la bacteria puede observarse a 100x, esto a veces es necesario ya que la contaminación bacteriana puede ser confundida con precipitados o detritus celular.
Erradicación de la contaminación bacteriana, por hongos y levaduras.
ü  El método más confiable de eliminación de una contaminación microbiana es descartar el cultivo, el medio de cultivo y los reactivos usados con el. ü  La descontaminación del cultivo debería ser utilizada únicamente en situaciones extremas. Sin embargo, la descontaminación completa es difícil de lograr y puede conducir al desarrollo de microorganismos resistentes.
Micoplasmas
Ø  Son células procariotas diminutas (0.3 a 0.5 µμm de diámetro) que en agar forman colonias pequeñas, con una zona central densa y una zona periférica menos densa, observándose una colonia con aspecto de “huevo frito”.
Ø  Los requerimientos nutricionales son complejos y, en general, sólo crecen en medios donde hay células en crecimiento. Ø  Los contaminantes responsables de las infecciones de los cultivos celulares proceden mayoritariamente de 4 especies: M. orale (humano), M. hyorhinis (cerdo), M. arginini (bovino) y A. laidlawii (bovino y también de roedores). Ø  Debido a su tamaño extremadamente pequeño, son muy difíciles de detectar hasta que alcanzan densidades considerables y hacen que el cultivo celular se deteriore.
Ø  Los cultivos primarios suelen estar libres de micoplasmas no obstante, muchas líneas celulares están infectadas. Micoplasmas
Ø  Fuentes de contaminación:
-­‐‑ Suero animal
-­‐‑ Tripsina
-­‐‑ Operador
-­‐‑ Cultivos contaminados
Ø  Alrededor del 50 al 95 % de las células utilizadas actualmente están contaminadas con micoplasmas. Ø  Dado que la contaminación con micoplasmas no es tan evidente como la contaminación por bacterias o levaduras, es importante tener en cuenta el posible efecto de los micoplasmas sobre el cultivo y realizar controles periódicos de su presencia. Ø  Los efectos que producen sobre el cultivo celular dependen de la especie implicada. Detección de Micoplasmas:
Ø  Una observación cuidadosa de las células en cultivo puede dar un primer aviso de la presencia de micoplasmas: aparición de gránulos oscuros en el citoplasma.
Técnicas utilizadas en la actualidad:
§  Tinción fluorescente con Hoechst o DAPI.
§  Detección mediante PCR.
Métodos alternativos:
§  Tinción con orceína.
§  Autoradiografía de cultivos incubados con timidina tritiada.
§  Test de crecimiento para micoplasmas. §  Sonda ADN para micoplasmas.
§  Tinción fluorescente con Hoechst o DAPI.
o  Esta técnica detecta el ADN extranuclear de los micoplasmas, dado que el colorante se une específicamente al ADN.
o  Se emplea la misma técnica de tinción que para la óbservación de nucleos celulares.
Cultivo Negativo
Cultivo positivo
§  Detección mediante PCR.
o  Método de detección basado en lo descrito por Wong-­‐‑Lee y LoveZ (1998), el cual utiliza una sola pareja de cebadores (primers) correspondientes al ARNr 18S de 8 especies de micoplasma.
o  Esta técnica permite amplificar los fragmentos de interés, con máxima sensibilidad y especificidad. El producto de PCR obtenido se somete a una electroforesis en gel de agarosa. Electroforesis de un control de
detección de micoplasmas. Se
incluyen muestras de 7 cultivos
y dos controles, positivo y
negativo. El control + , para
chequear que el método
funcione; el control - , para
chequear que no se ha
contaminado la solución de
amplificación. Resultados: Seis
de los problemas son negativos
y hay señal, ténue, en uno de
ellos, lo que indica su
contaminación.
Erradicación de la contaminación con micoplasmas.
-­‐‑ Si el cultivo es “reemplazable”, eliminarlo, esterilizar todo y volver a empezar. -­‐‑ Si el cultivo es “irreemplazable” o muy importante, se recomienda proceder a su eliminación del cultivo celular. Técnicas para su eliminación:
1. Tratamientos antibióticos:
ü  La kanamicina (0.1 mgr/ml) y la tilocina (6.0 ug/ml) previenen el crecimiento del micoplasma. ü Las quinolonas, tales como ciprofloxacina inhiben la ADN girasa procariota de los micoplasmas.
ü Tetraciclina, es bacteriostática a dosis bajas (habituales), aunque resultan bactericidas a altas dosis, generalmente tóxicas.
2. Tratamientos con sueros inmunes. El tratamiento del cultivo con sueros anti-­‐‑
micoplasmas se ha determinado como efectivo, pero costoso.
3. Pase por un animal. En el caso de cultivos de líneas tumorales se ha propuesto como especialmente útil la inoculación a un animal de experimentación y la recuperación posterior. El sistema inmune del animal limpia el cultivo celular de los micoplasmas.
Virus
v  La contaminación viral es un problema grave dado que su prevención y eliminación son realmente difíciles de realizar. v  Fuente de contaminación: parainfluenza-­‐‑3).
suero bovino (herpesvirus, virus v  Los sueros son controlados rutinariamente, aunque la validez de estos ensayos es limitada. v  Los virus pueden tener un efecto citopático marcado, pero los más peligrosos son aquellos que crecen a tasa baja o sólo en unas pocas células. v  La infección viral de los cultivos celulares se puede detectar mediante microscopía electrónica, inmunotinción con un panel de anticuerpos, ensayos de ELISA o PCR con cebadores virales apropiados.
Erradicación de la contaminación viral.
No existen métodos confiables para la eliminación de los virus del cultivo celular, por ello la única alternativa es el uso de medios libres de suero.
Contaminación persistente
ü Contaminación que parece ser refractaria a cualquier precaución o remedio sugerido. ü Prestar especial atención a cambios en la técnica, nuevos proveedores, nuevos equipos, y a un mantenimiento inadecuado de la campana de flujo laminar u otros equipos. ü Un aumento de la tasa de contaminación se debe a:
-­‐‑ Deterioro en la técnica de asepsia.
-­‐‑ Aumento en el contenido de esporas en la atmósfera. -­‐‑ Incubadores mantenidos en mal estado.
-­‐‑ Refrigeradores o heladeras contaminados.
-­‐‑ Falla del horno de esterilización o del autoclave.
-­‐‑ Mal envasado de los elementos y reactivos a utilizar. -­‐‑ Mal monitoreo del ciclo de esterilización. Contaminación persistente
ü Factores que contribuyen al aumento de la tasa de contaminación: -­‐‑ cambio en las prácticas de rutina -­‐‑ nuevo personal
-­‐‑ aumento de la actividad en el laboratorio ü Los procedimientos deben seguir siendo estrictos. Esto permitirá reducir la contaminación y ser detectada tempranamente.
ü El uso constante de ATB favorece la contaminación crónica. ü Es esencial que los cultivos sean mantenidos en condiciones libres de ATBs durante al menos parte del tiempo, y de preferencia todo el tiempo; de lo contrario persistirá la contaminación críptica, su origen será difícil de determinar, y su eliminación imposible.
Contaminación cruzada
ü La contaminación cruzada de muchas líneas celulares con otras líneas de células de crecimiento rápido es un problema claramente establecido con consecuencias graves.
ü Prácticas que ayudan a evitar la contaminación cruzada:
1-­‐‑ Obtención de líneas celulares a partir de bancos de células de buena reputación
2-­‐‑ Comprobación periódica de las características de las líneas celulares.
3-­‐‑ trabajar de acuerdo a la técnica aséptica
CONCLUSIONES
• Chequear los cultivos regularmente: para contaminación microbiana usando un microscopio común y de contraste de fase, y para micoplasma mediante el empleo de tinción fluorescente de preparaciones fijadas o por PCR.
• No mantener todos los cultivos rutinariamente en antibióticos. Crecer al menos un set de cultivos de cada línea celular sin antibióticos por un período mínimo de dos semanas, con el fin de permitir que las contaminaciones crípticas puedan ser evidentes.
• No intentar la descontaminación del cultivo celular a menos que sea insustituible y, en ese caso, hacerlo sólo bajo estricta supervisión.
• Mantener bajo cuarentena todas las líneas celulares nuevas que ingresen al laboratorio hasta que se esté seguro de que no están contaminadas.
• No compartir medios de cultivo u otras soluciones entre líneas celulares u operadores y chequear las características de las líneas celulares periódicamente para evitar la contaminación cruzada.
Lista de verificación de la técnica aséptica
• Área de trabajo: v  ¿Está la campana de cultivo celular configurada correctamente?
v ¿Está la campana de cultivo celular en un área libre de corrientes de aire y sin tráfico?
v Está la superficie de trabajo despejada y contiene sólo los elementos necesarios para su experimento?
v ¿Se limpió la superficie de trabajo con etanol al 70% antes de usarla?
v ¿Se limpia y esteriliza rutinariamente los incubadores, heladeras, freezers y otros equipos del laboratorio?
• Higiene personal: v ¿Se lavó las manos antes de comenzar a trabajar?
v ¿Está usando equipo de protección personal, incluyendo guantes? v Si tiene el cabello largo, ¿se lo ató hacia la espalda??
Lista de verificación de la técnica aséptica
• Reactivos y medios de cultivo: v  ¿ Esterilizó todos los reactivos, medios de cultivo y soluciones que preparó en el laboratorio utilizando el procedimiento adecuado?
v ¿Limpió el exterior de las botellas, frascos y placas con etanol al 70% antes de colocarlos en la superficie de trabajo?
v ¿Están todas las botellas, frascos y otros recipientes tapados cuando no se utilizan?
v ¿Todas sus placas están almacenadas en bolsas herméticas estériles? v ¿Algún reactivo tiene aspecto turbio? ¿Contienen partículas flotantes? Tiene mal olor? Color inusual? En caso afirmativo, ¿los ha descartado y descontaminado el lugar donde se encontraban almacenados?
Lista de verificación de la técnica aséptica
• Manejo: v ¿Está trabajando con precaución, consciente de la técnica aséptica?
v ¿Está utilizando pipetas de vidrio estériles o pipetas de plástico desecartables estériles para manipular los líquidos?
v ¿Utiliza cada pipeta estéril sólo una vez para evitar la contaminación cruzada?
v ¿Tiene cuidado de no tocar la punta de la pipeta con cualquier cosa no estéril, incluyendo el borde exterior de las roscas de la botellas?