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[TARJETA DE INICIO RÁPIDO DEL SISTEMA ACQUITY UPLC]
El sistema ACQUITY UPLC le permite aprovechar los importantes
beneficios cromatográficos de la LC con partículas de menos de 2 µm.
La UltraPerformance LC® (UPLC®) de Waters® se basa en las mismas reglas y principios cromatográficos a los que
estamos acostumbrados con la HPLC con columnas de 5 μm y 3 μm, pero añade un diseño instrumental innovador
específicamente creado para reducir al mínimo y controlar el ensanchamiento de la banda cromatográfica. Para
aprovechar plenamente la química de las partículas de menos de 2 µm, el sistema ACQUITY UPLC® exige caudales
de la fase móvil generalmente más elevados para garantizar el funcionamiento en la región adecuada de la curva de
rendimiento del caudal, así como algunas consideraciones básicas acerca de la transferencia y optimización de métodos.
Siguiendo estos sencillos pasos, aprenderá usted a aprovechar al máximo el sistema para obtener magníficos resultados
cromatográficos.
RECOMENDACIONES AC E RCA DE LAS CONDICIONES O P ERAT IVAS GENERAL ES DE LA U P LC
Puntos de partida del caudal
Para columnas de 2,1 mm D.I., los puntos de partida del caudal adecuados suelen ser 0,60 mL/min para moléculas pequeñas y 0,1 mL/min para compuestos
de elevado peso molecular, como péptidos y proteínas.
Puntos de partida generales del gradiente para moléculas pequeñas
Nº de analitos
Longitud de la
columna (mm)
1a3
30
Caudal (mL/min)
Tiempo del gradiente
(minutos)
1,20
¿Necesita más resolución? Aumente la longitud de la
columna.
¿Necesita más rapidez? Aumente el caudal.
1
3 a 10
50
1,00
5
10 a 25
100
0,60
10
> 25
150
0,40
25
[INDICACIONES]
Velocidad lineal de la UPLC a diferentes caudales con columnas de 2,1 mm D.I.
Columnas de 2,1 mm D.I. (40 °C)
Velocidad lineal de la
UPLC (mm/s)
Dimensiones de la
columna (mm)
3
Caudal
(mL/min)
4
Contrapresión
(psi)
Caudal
(mL/min)
5
Contrapresión
(psi)
Caudal
(mL/min)
6
Contrapresión
(psi)
Caudal
(mL/min)
Contrapresión
(psi)
2,1 x 30
0,45
3000
0,60
4100
0,75
5100
0,90
6100
2,1 x 50
0,45
4800
0,60
6400
0,75
8000
0,90
9500
2,1 x 100
0,45
9100
0,60
12.100
0,75
15.200
0,90
18.200
2,1 x 150
0,45
13.400
0,60
17.900
0,75
22.400
0,90
26.900
Nota:A) Columnas de fase reversa con partículas de 1,7 μm ACQUITY UPLC BEH C18.
B) Gradiente ACN/acuoso, Pmax a ~30% ACN.
C) Se indica la contrapresión total máxima aproximada del sistema.
Para obtener más información acerca de ACQUITY UPLC,
junto con una copia de esta tarjeta en su idioma, visite:
Comunidad en línea de ACQUITY UPLC®
Aprenda, comparta y potencie su cromatografía.
[TARJETA DE INICIO RÁPIDO DEL SISTEMA ACQUITY UPLC]
RECOMENDACIONES PA RA LA T RANSF E RENCIA Y O PT IMIZACIÓN DE MÉTODOS DE H P LC A U P LC
Proceso paso a paso
1. Recopilar información acerca del método
de HPLC existente
Utilizar exactamente la misma fase móvil:
n Modificador
n pH
n Fuerza iónica
n Eluyente orgánico
n Composición porcentual
2. Comparar los instrumentos
3. Seleccionar la columna nueva o objetivo
Química: consultar el gráfico de selectividad.
Dimensiones: calcular la longitud/tamaño
de partícula (L/dp) de la columna original y
seleccionar una longitud de columna de UPLC
adecuada.
Si el objetivo principal es:
Velocidad extrema
30 mm de longitud para empezar (L/dp = 17.770)
Anotar y ajustar el volumen del sistema o
volumen de retraso del gradiente.
Velocidad con resolución
50 mm de longitud para empezar (L/dp = 29.500)
Resolución con velocidad
100 mm de longitud para empezar (L/dp = 58.900)
Resolución extrema
150 mm de longitud para empezar (L/dp = 88.300)
4. Seleccionar las nuevas condiciones basándose en las consideraciones geométricas
5. Optimizar a los intervalos de caudal de UPLC
Volumen de inyección:
n Nuevo volumen de inyección = volumen de inyección original x (volumen de la nueva columna/volumen
de la columna original).
Los caudales óptimos son más elevados
para las partículas de 1,7 µm.
n Caudal
n Nuevo
La pérdida de eficiencia es mínima a
caudales superiores al óptimo para las
partículas de 1,7 µm.
Perfil del gradiente:
n Expresar la duración del gradiente en cambio porcentual por unidad de volumen de la columna (cv).
n Calcular
n Calcular
n Calcular
= los métodos isocráticos solo requieren el ajuste del flujo y de la inyección.
caudal = caudal original x (π x r2 de la nueva columna/π x r2 de la columna original).
cada segmento como un número de volúmenes de la columna.
el tiempo necesario para suministrar el mismo número de volúmenes de columna a la nueva
columna con el caudal escalado geométricamente.
el tiempo necesario para suministrar el mismo número de volúmenes de columna a la nueva
columna con el caudal de UPLC.
DIREC T RIC ES O P ERAT IVAS ADICIONAL ES
Eluyente de lavado del sistema de gestión de
muestras para cromatografía de fase reversa
Lavado suave: Modo de bucle completo Modo de bucle parcial (asistido por presión)
Modo de sobrellenado de
aguja con bucle parcial
Condiciones iniciales
del gradiente
Condiciones iniciales
del gradiente
Metanol o acetonitrilo/
agua 1:1
Lavado fuerte: Todos los modos de inyección
Metanol/agua/IPA
70:20:10
Metanol, acetonitrilo, agua, IPA, 25% de cada
Se puede añadir un 0.1% de ácido fórmico a cualquiera de ellos
En todos los casos, los eluyentes de lavado deben ser compatibles con la
muestra y con su diluyente.
INDICACIÓN: Utilice la calculadora para cambio de
columnas ACQUITY UPLC Column Calculator para
facilitar estos cálculos. La ACQUITY UPLC Column
Calculator está diseñada para orientar fácilmente la
metodología de transferencia de HPLC a ACQUITY
UPLC. La calculadora da tres opciones diferentes para
los métodos de UPLC: condiciones de igual eficacia,
máxima eficacia y mínimo tiempo de análisis.
Preparación de las muestras
Preparar las muestras utilizando uno de los siguientes métodos:
n Extracción en fase sólida (p. ej., cartuchos Oasis ® o Sep-Pak ®)
para eliminar impurezas antes del análisis. Estas impurezas
contribuyen con frecuencia a la contaminación de la columna.
n La placa de precipitación de proteínas (p. ej., placas Sirocco™)
ofrece un extracto más limpio por UV y MS que la centrifugación
y que muchos otros métodos, al tiempo que facilita la eliminación
de partículas.
n Centrifugación (20 minutos a 8000 rpm) y transferencia cuidadosa del líquido sobrenadante.
Filtrar las muestras a través de un filtro compatible de 0,2 µm para
eliminar partículas.
Cuando sea posible, disolver las muestras en la fase móvil de partida (o
en un modificador más débil, esto es, menos orgánico).
Para garantizar la limpieza y evitar picos fantasma, utilizar viales
certificados para LC/MS de Waters.
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[INDICACIONES]
Estabilización de la columna
Por ejemplo:
Estabilizar con el número adecuado de volúmenes de columna, normalmente
cinco veces el volumen de la columna.
Columna: 2,1 x 50 mm; 1,7 μm con un caudal de 0,8 mL/min
Volumen de la columna = ∏ x r2l = ∏ (0,105 cm)2 x (5 cm) = 0,173 mL
Volumen del sistema = 0,080 mL
Estabilización del sistema
Tiempo de estabilización del sistema:
= (5 volúmenes de la columna + 3 volúmenes del sistema)/caudal
= (0,865 mL + 0,240)/(0,80 mL/min)
= 1,4 min
En general, hace falta un total de tres veces el volumen del sistema
y cinco veces el volumen de la columna para la estabilización de la
columna y del sistema tras una cromatografía en gradiente.
Componentes del sistema ACQUITY UPLC
Sistema de gestión de eluyentes
binario (BSM)
Sistema de gestión de muestras
Detectores
Utilizar eluyentes, tampones y aditivos de
la máxima calidad y agua ultrapura (libre Mantenerse dentro de los límites recomendados para
de partículas, químicamente limpia, con cada modo de inyección y tamaño de bucle.
una resistividad de 18 megaohmios/cm).
Comprobar siempre que esté instalado el regulador de contrapresión si
el detector de UV es el último de la línea.
Vigilar el nivel del recipiente de
desechos.
Utilizar el modo de bucle completo cuando precisión y
exactitud son críticas.
Retirar el regulador de contrapresión del TUV o PDA si el último de la
línea es un MS (u otro segundo detector).
Filtrar los tampones (se recomienda una
membrana de filtración de 0,2 µm).
Utilizar el modo de bucle parcial (asistido por presión)
cuando el consumo de muestra es crítico.
Elegir una frecuencia de adquisición adecuada para obtener 25 a 50
puntos a lo ancho del pico.
No bloquear el conducto de purga del
desgasificador.
Utilizar el modo de inyección con sobrellenado de
la aguja y bucle parcial cuando se requiere la mejor
exactitud, precisión y linealidad del bucle parcial para
una amplia gama de muestras.
Elegir la constante inicial del filtro digital en función de los requisitos
del método. Si la velocidad es más importante, empezar con FAST
(RÁPIDO). Si la sensibilidad es más importante, empezar con NORMAL.
Mantener cebados los cuatro tubos de
eluyente (mantiene la eficiencia del
desgasificador).
Definir los volúmenes de la aguja y del bucle al cambiar
los eluyentes de lavado suave, así como los bucles y
agujas.
Optimizar las constantes del filtro digital una vez desarrollado el
método, para equilibrar la sensibilidad y la resolución.
Mantener cebado el lavado de juntas
(aumenta la duración de la junta del
BSM).
Utilizar siempre el tubo del estabilizador de columnas,
aunque no se utilice la temperatura.
Volver a cebar los tubos de eluyente
antes de empezar (utilizar System Prep
Utilizar Load Ahead (Carga adelantada) cuando se
[Preparación del sistema] o System Start- requieren ciclos más largos.
up [Puesta en marcha del sistema]).
Iniciar el gradiente con un pequeño
porcentaje de solvente orgánico, 0,1%
como mínimo, (ofrece una formación de
gradiente más constante y predecible que
empezar desde 0%).
Modos de inyección del sistema ACQUIT Y UPLC***
Volumen de inyección de muestra (µL)
Modo de bucle parcial
Volumen del bucle (µL)
1
2
5
10
20
50**
Sobrellenado de aguja
Intervalo de inyección (µL) 0,20 a 0,75
0,40 a 0,150
1,00 a 3,80
2,00 a 7,50
4,00 a 15,00
10,00 a 37,50
Asistencia por presión*
Intervalo de inyección (µL) N.R.
N.R.
N.R.
2,00 a 5,00
4,00 a 10,00
10,00 a 25,00
2
5
10
20
50**
Modo de bucle completo asistido por
presión (utilizar el factor de sobrellenado predeterminado)****
1
N.R. = No recomendado.
* Modo de bucle parcial: debe reservarse para las situaciones en que el tiempo de análisis tiene preferencia sobre cualquier otra consideración, en que el volumen de muestra
es muy limitado o en que el volumen de inyección es muy grande.
** Hay que utilizarlo con una jeringa de carga de 250 µL.
*** La exactitud/recuperación para el diseño de inyector de bucle fijo en el modo de bucle parcial depende de los parámetros/límites de volumen para garantizar la máxima exactitud/recuperación.
**** % RSD del área < 1,0 para los modos parcial y parcial con sobrellenado de la aguja (PLNO).
% RSD del área < 0,3% para el modo de bucle completo.
[TARJETA DE INICIO RÁPIDO DEL SISTEMA ACQUITY UPLC]
Función de preparación del sistema
ACQUIT Y UPLC
En la consola del sistema ACQUITY UPLC seleccionar Start-up (Puesta
en marcha) en el menú desplegable principal y cumplimentar cada
ficha; una vez cumplimentados los parámetros, hacer clic en Start
(Inicio).
Función de puesta en marcha: todos los pasos necesarios para
acondicionar el sistema combinados en una sola función:
n Cebar/purgar todas las bombas y tubos de eluyente.
n Cebar/purgar todas las jeringas.
n Equilibrar el sistema y la columna con parámetros personalizados
(eluyente, caudal, temperatura).
n Desde la consola o incluidos en la secuencia de muestras
del software Empower™, o haciendo clic con el botón
derecho del ratón en analizar muestras.
Puesta en marcha del sistema ACQUITY UPLC.
Cumplimentar cada ficha de la consola del
sistema ACQUITY UPLC; después hacer clic en
Start (Inicio).
Función de actualización de condiciones del sistema
(preparación del sistema):
n Cebar los eluyentes A1 y B1 (2 min).
n Cebar todas las jeringas una vez.
[HERRAMIENTAS]
Visite la comunidad en línea de ACQUITY UPLC en www.waters.com/myuplc para obtener recursos y herramientas para
aprovechar al máximo la UltraPerformance LC.
ACQUITY UPLC Column Calculator: Automatiza los cálculos de escalado necesarios para convertir métodos HPLC isocráticos o de gradiente
en métodos UPLC.
n
Gráfico de selectividad de las columnas de fase reversa de Waters: Seleccione de forma interactiva kits de columnas de desarrollo de métodos, elija columnas por proveedor o por tipo de ligando y busque con rapidez químicas de columna equivalentes para métodos existentes.
n
Tarjeta de referencia rápida para el sistema ACQUITY UPLC: Procedimientos diarios de puesta en marcha y números de referencia importantes
del sistema.
n
n
Consejos y trucos, P+F y foros de usuarios: Temas presentados por los usuarios, preguntas más frecuentes y debates científicos.
n
Notas y pósteres sobre aplicaciones.
n
Presentaciones y vídeos de expertos.
...y mucho más.
Waters, ACQUITY UPLC, UltraPerformance LC, Oasis, Sep-Pak, y UPLC son
marcas registradas de Waters Corporation. The Science of What’s Possible,
Empower y Sirocco son marcas comerciales de Waters Corporation. Todas
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