Comparación de distintos métodos para medir la actividad

UNIVERSIDAD NACIONAL DEL NORDESTE
Comunicaciones Científicas y Tecnológicas 2000
Comparación de distintos métodos para medir la actividad enzimática
del látex de Carica papaya
Glibota, Gustavo S. - Garro, Oscar A. - Judis, María A.
Facultad de Agroindustrias - UNNE.
Cte. Fernández 755 - (3700) Pcia. R. S. Peña - Chaco - Argentina.
Tel./Fax: +54 (03732) 420137 - E-mail: [email protected]
ANTECEDENTES
La papaína es una mezcla compleja de enzimas con actividad protreolíticas y peroxidasas contenidas en el
exudado de Carica papaya (mamón). Dos son las enzimas proteolíticas mas conocidas: la papaína
propiamente dicha y la quimopapaína.
Además de las aplicaciones farmacéuticas, las proteasas son utilizadas en distintos procesos industriales, tales
como tiernización de carnes, elaboración de cueros, detergentes, cervezas, quesos, panes, proteínas
modificadas para alimentación humana y animal, procesado de fibras textiles y tratamiento de efluentes
industriales.
Su importancia económica es considerable, ya que representa las dos terceras partes del mercado de enzimas.
Con vistas al aprovechamiento integral del vegetal Carica papaya, especialmente los restos del fruto, se
analizó los distintos métodos para medir la actividad proteolítica de esta enzima bajo distintos sustratos y
condiciones.
MATERIALES Y METODOS
El buffer en que disolvió el látex fue buffer fosfato 0.05 N, Ph 7
El látex usado como testigo fue de la marca SIGMA, látex crudo secado al sol con actividad 1,7 U Baee / mg
sólido.
La enzima se disolvió en buffer, se centrifugó a 3000 g y se filtró previamente.
Se utilizó la técnica del Baee para comprobar su actividad.
La técnica consiste en la hidrólisis de un sustrato sintético BAEE (Nα-Benzoil-L-arginina Etil éster
Hidroclorídrico Método titulométrico (Shwert and Tanaka 1955).
Procedimiento: La reacción se monitorea manteniendo el Ph en 6.2 a 25°C en un recipiente conteniendo 5ml
de solución con el sustrato, 5ml de sol. 3M NaCl , 5ml de buffer activador, agregando a esto 0.1ml de enzima
en solución.
Se registró los µl agregados del titulante (NaOH 0.01-0.02 N) por minuto para mantener el PH constante.
La actividad de la enzima se calculó de la siguiente manera:
unidad/mg = ml de base adicionada/min • normalidad • 1000
mg de enzima agregado
unid/ml = 0.05 • N • df • 1000
T •V
unid/mg sol =
unid./ml. enz.
mg sol/ml enz
0.05: volumen de hidróxido en ml usado para mantener el ph en 6.2
N : normalidad del hidróxido
df: factor de dilución
T : tiempo en minutos
V: vol enzima usado en ml
Una unidad hidroliza un micromol de baee por minuto a 25°C y Ph 6.2.
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Se calculo la proteína contenida en el látex para obtener la relación de la concentración de enzima - actividad
de la misma.
La cantidad de proteína se midió por espectrofotometría ultra violeta a 280 nm. (UV) con lampara de sodio,
utilizando un espectrofotómetro BECHMAN. Para medir la concentración de proteína, la muestra se filtró y
centrifugó previamente. Se utilizó la misma solución buffer como blanco.
Para calcular la cantidad de proteínas se utilizó la siguiente formula:
mg proteína/ml = A280 nm • 0.4 (Balls, 1939).
MÉTODOS PROBADOS
Métodos de medición de actividad: Se indagó sobre las técnicas que nos permita cuantificar la actividad
enzimática de las muestras.
Método colorimétrico con precipitación de proteínas con TCA:
Este método consistió en hidrolizar un sustrato como la caseína, luego se precipitó la proteína con TCA (ácido
tricloro acético) al 30%, una vez precipitada y filtrada la proteína, se leyó el sobrenadante (aminoácidos) por
espectrofotometría a 280nm.
Se utilizó 5ml de solución de caseína al 0.1% en cada muestra y se agregó 0.1ml de enzima en cada tubo.
Método de coagulación de leche (Balls and Hoover):
Se determinó el tiempo de coagulación de una muestra de 10 ml de leche descremada, luego de agregada una
determinada concentración de enzima.
Cambio en la variación del ph:
Se midió el cambio de Ph durante la acción de la enzima en una muestra de 5ml de leche descremada.
Método del BAPA (colorimétrico):
Se disolvió el sustrato BAPA en buffer tris 0.05M y Ph 8
El BAPA (Benzoil - arginina - Paranitroanilina) en presencia de una proteasa se descompone obteniéndose la
p-nitroanilina que tiene una coloración amarilla. El cambio de coloración y la intensidad depende de la
actividad de la enzima.
Las muestras se midieron en un espectrofotómetro a 410 nm.
El tiempo al que se midió la reacción fue de 6 hs. A 25°C
DISCUSION DE RESULTADOS
La enzima de referencia (SIGMA) fue controlada con el método de la hidrólisis titulométrica, dando una
actividad de 1,71Baee / mg de látex seco, la especificación del fabricante fue 1,70 Baee / mg de látex seco.
unid/ml = 0.05 • 0.108 • 1 • 1000
5.25 • 1
unid/mg sol =
Unid/ml = 1.028
unid/mg sol = 1.713 BAEE
1.028
0.6
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Método titrimétrico (BAEE)- Medicion de
actividad en la papaina de referencia
600
ug de proteína
50
tiempo (min)
40
30
20
y = 400x
400
R =1
2
300
200
100
y = 0,1116x
2
R = 0,9977
10
500
0
0
0
200
400
0
600
0,5
1
1,5
Abs
NaOH agregado en microlitros
La medición de proteína indicó un resultado proporcional a la concentración de látex disuelto
Punto de coagulación de las
proteínas de la leche
Evolución del PH en la hidrólisis
6,75
6,65
4
PH
ml de enzima
5
3
2
6,55
6,45
6,35
1
0
6,25
0
2000
4000
6000
0
50
tiempo (seg)
2,5
100
150
tiempo (min)
5
200
10
20
Se siguió la cinética de la hidrólisis con el punto de coagulación de la leche con los ml de enzima agregados y
el cambio de Ph a distintas concentraciones de enzima (2.5, 5, 10 y 20 mg/ml).
BAPA (método colorimétrico)
Colorimétrico con precipitación de
proteínas con TCA
0,1
0,8
0,08
Abs
Abs
0,06
0,04
0,02
0,6
0,5
0,625
0,4
0,3125
2
R = 0,984
0
0
10
ug enzima/ml
10
5
2,5
1,25
0,7
0,3
20
0
5
ug /ml
10
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CONCLUSIONES
Método colorimétrico con precipitación de proteínas con TCA:
No se obtuvo una curva regresión aceptable a la proporción de enzima en las muestras, salvo a
concentraciones muy baja de la misma y con mucho error.
Cambio en la variación del ph:
Este método permite calcular una actividad mayor o menor de una enzima y otra pero no se pudo obtener una
relación linealizada que permita calcular cuantitativamente la actividad.
Método de coagulación de la leche:
Idem al método anterior, no se tiene una relación lineal entre la concentración y el tiempo de coagulación, no
se determina muy bien el punto de coagulación (principalmente a largos tiempos) por lo que hay que realizar
muchas repeticiones con gran variabilidad.
Método colorimétrico del BAPA:
Este método es usado para medir la actividad de la tripsina, cuya actividad proteolítica bajo estas condiciones
es varias veces superior, por lo que la absorvancia medida en los ensayos fue de valores muy bajos, los que
pueden presentar un cierto error de precisión.
Método de hidrólisis del BAEE:
Permitió obtener resultados proporcionales a la concentración de enzima así como un ajuste regresional.
Este método fué usado como referencia por su exactitud.
Su inconveniente es que se tiene que realizar un ensayo por vez y su costo es elevado.
BIBLIOGRAFIA CONSULTADA
• AOAC Official Methods of Analysis(1990).
• Balls, A.K, and Lineweaver,H. Isolation and properties of crystalline papain. J. Biol. Chem. 130, 699.
(1939)
• Beacon Enzyme Assays. Sensitive Protease Assay. http://www.panvera.com/appguide/bcnprot.html.
• Bouzas,J. O. & Bertoni, M. (1980). Evaluación de la actividad antitriptica en productos de soja. Ajuste
del método de sustrato sintético. Anales Asoc. Quim. Arg., 68, 81-93.
• Kakade, M. L; Simons,N and Liener, E. (1969). An evaluation of natural vs synthetic substrates for
measuring the antitryptic activity of soybean. Agricultural Research. Vol 46. PÑ 518-526.
• Kakade,M.L, Simons,N and Liener,E; 1969 An evaluation of natural vs. Synthetic substrates for
measuring antitrryptic activity of soybean samples. Agricultural Research. Vol 46. 518-526.
• Moreno J, Gianelli M. Purificación Parcial de enzimas proteolíticas a partir de extracto de kiwi y
determinación de parámetros máximos de actividad. X Seminario latinoamericano y del Caribe de ciencia
y tecnología de alimentos. 1997. Bs. As
• Rugeiro C. 1988 Mamao. Editorial Univ. Pernanbuco.