Método para la determinación de bacterias coliformes, coliformes

Método para la determinación de bacterias coliformes, coliformes fecales
y Escherichia coli por la técnica de diluciones en tubo múltiple (número
más probable o NMP)
OBJETIVOS
 Evaluar la calidad sanitaria de muestras de agua o alimentos mediante la búsqueda de
microorganismos coliformes totales, coliformes fecales y Escherichia coli.
 Diferenciar los organismos coliformes totales de los microorganismos coliformes fecales.
 Organizar e interpretar los resultados.
GENERALIDADES
Debido a que un gran número de enfermedades son transmitidas por vía fecal-oral utilizando
como vehículo los alimentos y el agua, es necesario contar con microorganismos que
funcionen como indicador de contaminación fecal. Estos deben de ser constantes,
abundantes y exclusivos de la materia fecal, deben tener una sobrevivencia similar a la de
los patógenos intestinales y deben ser capaces de desarrollarse extraintestinalmente.
El grupo coliforme constituyen un grupo heterogéneo con hábitat primordialmente intestinal
para la mayoría de las especies que involucra, es constante, abundante y casi exclusivo de la
materia fecal, su capacidad de sobrevivencia y multiplicación fuera del intestino también se
observan en aguas potables, por lo que este grupo se utiliza como indicador de
contaminación fecal en agua; encontrandose que mientras mayor sea el número de
coliformes en agua, mayor será la probabilidad de estar frente a una contaminación reciente.
Cuando los coliformes llegan a los alimentos, no sólo sobreviven, sino que se multiplican, por
lo que en los alimentos el grupo coliforme adquiere un significado distinto al que recibe en el
agua.
Cuando los productos alimenticios
han recibido un tratamiento térmico
(pasteurización, horneado, cocción, etc.), estos microorganismos se utilizan como
indicadores de malas prácticas sanitarias.
Para su estudio, se dividen en dos grupos. El grupo de bacterias coliformes totales el cual
comprende a todos los bacilos Gram-negativos aerobios o anaerobios facultativos, no
esporulados, que fermentan la lactosa con producción de gas en un lapso máximo de 48 h. a
35°C ± 1ºC. Este grupo está conformado por 4 géneros principalmente: Enterobacter,
Escherichia, Citrobacter y Klebsiella.
El grupo de coliformes fecales, está constituido por bacterias Gram-negativas capaces de
fermentar la lactosa con producción de gas a las 48 h de incubación a 44.5 ± 0.1°C. Este
grupo no incluye una especie determinada, sin embargo la más prominente es Escherichia
coli.
La demostración y el recuento de organismos coliformes, puede realizarse mediante el
empleo de medios de cultivo líquidos y sólidos con características selectivas y diferenciales.
Escherichia coli es un bacilo corto Gram negativo que se encuentra clasificado dentro de la
familia Enterobacteriaceae (bacterias entéricas), existe como comensal en el intestino
delgado de humanos y animales. Sin embargo, existen algunas cepas de E. coli patógenas
que provocan enfermedades diarreicas. Estas se clasifican con base en las características
que presentan sus factores de virulencia únicos, cada grupo provoca enfermedad mediante
un mecanismo diferente. Se sabe que sus propiedades de adherencia a las células
epiteliales de los intestinos grueso y delgado son codificadas por genes situados en
plásmidos. De manera similar las toxinas son mediadas por plásmidos o fagos.
Este grupo de bacterias se encuentra constituido por las siguientes cepas: E. coli
enterotoxigénica (ETEC), E. coli enteropatógena (EPEC), E. coli enterohemorrágica (EHEC),
E. coli enteroinvasiva (EIEC), E. coli enteroagregativa (EAEC) y E. coli enteroadherente
difusa (DAEC). Existen otras cepas que no han sido perfectamente caracterizadas; de las
cepas anteriores, las 4 primeras están implicadas en intoxicaciones causadas por el
consumo de agua y alimentos contaminados.
Escherichia coli enterotoxigénica ETEC es reconocida como el agente causal de la diarrea
del viajero, la cual se caracteriza por diarreas acuosas con o sin fiebre. Este tipo de
infecciones es muy frecuente en países subdesarrollados y afecta principalmente a los
niños.
Patogénesis: El microorganismo es capaz de producir dos tipos de toxina. Una toxina
termolábil de aproximadamente 89 kDa cuya secuencia, antigenicidad y función es similar a
la toxina del cólera, la otra toxina que produce es termoestable y es de bajo peso molecular
(4 kDa) y es capaz de resistir temperaturas de ebullición hasta por 30 minutos.
La infección puede ser adquirida por el consumo de alimentos tales como vegetales frescos
(lechuga en ensaladas) y agua. La dosis infectiva para adultos ha sido calculada en
aproximadamente 108 bacterias, por otra parte en jóvenes y ancianos la dosis infectiva
puede ser más baja.
Escherichia coli enteropatógena ECEP. Es causa importante de diarrea en los lactantes
particularmente en los países en vías de desarrollo. La ECEP se adhiere a las células de la
mucosa del intestino delgado. Sus factores de virulencia favorecen la adhesión y en
ocasiones penetra a las células mucosas. La infección por ECEP provoca diarrea acuosa
generalmente autolimitada aunque en ocasiones puede ser crónica.
Patogénesis. El microorganismo produce dos proteínas: la intimina que es codificada por el
gen eae y un factor de adherencia que es codificado por un plásmido, ambas proteínas
permiten su unión a los enterocitos y la destrucción de las microvellosidades intestinales.
Las epidemias causadas por este microorganismo se deben al consumo de agua
contaminada y productos cárnicos. En estudios con voluntarios se encontró que la dosis
infectiva es de 106 microorganismos. La diarrea por ECEP se ha vinculado con múltiples
serotipos específicos de E. coli los cuales pueden ser identificados mediante la tipificación
del antígeno O (somático) y en ocasiones del antígeno H (flagelar).
Escherichia coli enteroinvasiva EIEC. Este microorganismo se encuentra estrechamente
relacionado con el género Shigella, produce una enfermedad similar a la shigelosis. La
enfermedad se presenta comúnmente en niños de países subdesarrollados y en personas
que viajan a dichos lugares. La EIEC provoca la enfermedad (diarrea disentérica invasiva) al
invadir las células epiteliales de la mucosa intestinal.
A pesar de que la dosis infectiva para Shigella es de 10 a 100 microorganismos, en el caso
de EIEC la dosis infectiva es de aproximadamente 106 bacterias. Algunas características
importantes de este microorganismo que permiten diferenciarlo de la cepa típica de E. coli
son: No utiliza la lactosa como fuente de carbono, no descarboxilan la lisina, es inmóvil y
anaerogénicas.
La patogenicidad de este organismo se debe a su capacidad para invadir y destruir el epitelio
del colon debido a que es capaz de evadir la lisis en los fagolisosomas.
Escherichia coli enterohemorrágica EHEC produce verotoxina, denominada así por su
efecto citotóxico sobre las células Vero, una línea de células renales de mono verde africano.
Existen al menos dos variantes antigénicas de la toxina. La ECEH se ha asociado con colitis
hemorrágica, una variedad grave de diarrea; y con el síndrome urémico hemolítico,
enfermedad capaz de producir insuficiencia renal aguda, anemia hemolítica microangiopática
y trombocitopenia. La verotoxina tiene propiedades similares a la toxina shiga producida por
algunas cepas de Shigella dysenteriae tippo 1; De los serotipos de E. coli que producen la
verotoxina el más común y el único que puede identificarse en muestras clínicas es el
O157:H7. La E. coli O157:H7 no emplea sorbitol y es negativa a la prueba de MUG.
La causa más común de esta infección es el consumo de carne sin cocinar o poco cocinada,
particularmente carne picada procesada en grandes cantidades. Los casos de colitis
hemorrágica y sus complicaciones asociadas pueden prevenirse mediante la cocción
completa de la carne
En la siguiente tabla se resumen algunas propiedades y síntomas causados por las cepas de
Escherichia coli antes descritas.
Propiedades y síntomas causados por algunas cepas de Escherichia coli
patógenas
ETEC
EPEC
EHEC
EIEC
Toxina
Lábil/estable
Shiga o vero
Invasiva
Intiminas
Enterohemolisina
Aspecto de las
heces
Presencia de
leucocitos en
heces
Fiebre
-
-
-
+
-
+
+
-
-
-
+
-
Aguadas
Aguadas
Aguadas muy
Mucoides y
sanguinolentas sanguinolentas sanguinolentas
-
-
-
+
baja
+
-
+
Intestino
involucrado
Dosis infectiva
Serotipos
Delgado
Delgado
Colon
Alta
Alta
O26, O111 y
otros
baja
O157:H7, O26,
O111 y otros
varios
Colon y parte
baja del
delgado
Alta
Varios
FUNDAMENTO
La determinación de microorganismos coliformes totales por el método del Número más
Probable (NMP), se fundamenta en la capacidad de este grupo microbiano de fermentar la
lactosa con producción de ácido y gas al incubarlos a 35°C  1C durante 48 h., utilizando
un medio de cultivo que contenga sales biliares. Esta determinación consta de dos fases, la
fase presuntiva y la fase confirmativa.
En la fase presuntiva el medio de cultivo que se utiliza es el caldo lauril sulfato de sodio el
cual permite la recuperación de los microorganismos dañados que se encuentren presentes
en la muestra y que sean capaces de utilizar a la lactosa como fuente de carbono. Durante la
fase confirmativa se emplea como medio de cultivo caldo lactosado bilis verde brillante el
cual es selectivo y solo permite el desarrollo de aquellos microorganismos capaces de tolerar
tanto las sales biliares como el verde brillante.
La determinación del número más probable de microorganismos coliformes fecales se realiza
a partir de los tubos positivos de la prueba presuntiva y se fundamenta en la capacidad de
las bacterias para fermentar la lactosa y producir gas cuando son incubados a una
temperatura de 44.5  0.1C por un periodo de 24 a 48 h.
Finalmente, la búsqueda de Escherichia coli se realiza a partir de los tubos positivos de caldo
EC, los cuales se siembran por agotamiento en medios selectivos y diferenciales (Agar Mac
Conkey, Agar eosina azul de metileno) y posteriormente realizando las pruebas bioquímicas
básicas (IMViC) a las colonias típicas.
MEDIOS DE CULTIVO Y DILUYENTES
1. Para análisis de agua
Para la preparación del medio de cultivo utilizado en la prueba presuntiva de muestras de
agua o hielo, consultar el cuadro 1.
 5 ó 10 tubos de 22 x 175 mm con 10.0 mL de caldo lauril sulfato de sodio o caldo
lactosado concentración doble o triple con campana de Durham a.
 5 ó 10 tubos de 16 x 150 mm con 10.0 mL de caldo bilis verde brillante con campana de
Durhamb.
 5 ó 10 tubos de 16 x 150 mm con 10.0 mL de caldo EC y campana de Durham o caldo EC
MUG con campana de Durham b.





2 cajas Petri con agar para métodos estándar d
2 cajas Petri con agar Eosina azul de metileno c
6 tubos de 13 x 100 con 3.0 mL c/u de caldo RM-VPe
3 tubos de 13 x 100 con 3.0 mL c/u de caldo triptona o agar SIM (opcional) e
3 tubos de 13 x 100 con 3.5 mL c/u de caldo citrato de Koser o citrato de Simmons
(opcional)e
SOLUCIONES, REACTIVOS E INDICADORES





Frascos gotero con reactivo de Ehrlich o Kovace
Frascos gotero con indicador rojo de metiloe
Frascos gotero con reactivo alfa naftol VP1e
Frascos gotero con solución de hidróxido de potasio al 40 % VP2e
COLORANTES PARA TINCIÓN DE GRAMd
MATERIAL Y EQUIPO
















Mechero, a,b,c,d,e.
Propipetaa.
Gradillaa,b,c,e.
Lámpara de luz ultravioleta de longitud amplia 4 watts. (366 nm)c
Lentes de seguridadc
Pipetas de 10.0 mL estériles con tapón de algodóna.
Pipetas de 1.0 mL estériles con tapón de algodóna.
Pipetas Pasteur estériles a, b, c, d
Asa bacteriológicab,c,d,e
Portaobjetosd
Microscopio ópticod
Termómetro calibradob
Baño de agua a 44.5° ± 0,1°C.b
Incubadora a 35° ± 2,0ºCa.
Horno para esterilizar material de vidrio a 160-180°Ca
Autoclavea
NOTAS
a
Material necesario al inicio de la práctica.
b
Material necesario a las 48 h. de iniciada la práctica.
c
Material necesario a las 96 h. de iniciada la práctica.
d
Material necesario a las 120 h. de iniciada la práctica.
e
Material necesario a las 144 h. de iniciada la práctica.
DETERMINACIÓN DEL NMP DE COLIFORMES EN AGUA Y HIELO POTABLES
37°C
24 - 48 h
Tubos con 10.0 mL de caldo lauril sulfato
de sodio (CLSS) doble concentración (2X)
CLSS + 20.0 mL de muestra
2 a 3 asadas/tubo
Siembra con asa bacteriológica de los tubos
positivos (producción de gas) en caldo lactosa
verde brillante bilis 2% y caldo EC
2 a 3 asadas/tubo
37°C
44.5°C
24 – 48 h
24 – 48 h
-
Tubos con 10.0 mL de
caldo lactosa verde
brillante bilis 2%
Lectura de tubos positivos en
tablas. NMP de coliformes
totales /100 ml de muestra
Tubos con 10.0 mL de
caldo EC o EC-MUG
Lectura de tubos positivos en
tablas. NMP de coliformes
fecales /100 ml de muestra.
Siembra de tubos positivos en
placas de Agar EMB para la
búsqueda de Escherichia
coli
PROCEDIMIENTO
1. Agua y hielo
1.1 Prueba presuntiva

Agitar la muestra y transferir volúmenes de acuerdo con el cuadro 1, a cada uno de
los tubos con caldo lauril sulfato de sodio que se hayan seleccionado. Agitar los
tubos para homogeneizar la muestra.
CUADRO 1. Preparación de inóculo con caldo lauril sulfato de sodio
INOCULO
(mL)
CANTIDAD DE
MEDIO POR
TUBO (mL)
VOLUMEN DE CALDO LAURIL
MEDIO MAS
TRIPTOSA
INOCULO
REQUERIDO g/L
(mL)
CONCENTRACIÓN
1
10 o más
11 o más
35,6
1X
10
10
20
71,2
2X
10
20
30
53,4
1.5 X
20
10
30
106,8
3X
100
50
150
106,8
3X
100
35
135
124.6
3.5 X
100
20
120
142.4
4X
 Incubar los tubos a 35 ± 0,5°C. Examinar los tubos a las 24 h., observar si hay
formación de gas (desplazamiento del medio en la campana de Durham); si no se
observa producción de gas, incubar 24 h. más.
1.2 Prueba confirmativa de microorganismos coliformes totales

Transferir de 2 a 3 asadas de cada tubo positivo obtenido durante la prueba
presuntiva, a tubos que contiene caldo de bilis verde brillante (brila), con campana
de Durham.

Agitar suavemente los tubos para su homogeneización.

Incubar a 35  2C durante 24 a 48 h..

Registrar como positivos aquellos tubos en donde se observe turbidez (crecimiento)
y producción de gas después de un período de incubación de 24 a 48 h..

Consultar la tabla 1 ó 2 de NMP para conocer el número más probable de
organismos coliformes totales/100 mL.
1.3 Prueba confirmativa de microorganismos coliformes fecales.

Transferir de 2 a 3 asadas de cada tubo positivo obtenido durante la prueba
presuntiva a tubos con caldo EC.

Agitar suavemente los tubos para su homogeneización.

Incubar a 44.5  0.1C en incubadora o un baño de agua con circulación durante 24
a 48 h.

Registrar como positivos todos los tubos en donde se observe crecimiento y
producción de gas después de un período de incubación de 24 a 48 h.

Consultar la tabla 1 ó 2 de NMP para conocer el número más probable de
organismos coliformes fecales/ 100 mL.
Control de calidad para coliformes fecales
1. Inocular en tubos de caldo EC una cepa de E. coli como control positivo y una de
Enterobacter aerogenes como control negativo e incubar junto con las muestras.
1.4 Prueba confirmativa para Escherichia coli

Tomar una asada de cada uno de los tubos positivos de caldo EC y sembrar por
estría cruzada en agar eosina azul de metileno para su aislamiento.

Incubar las placas invertidas a 35°C por 18-24 h.

Seleccionar dos colonias de cada placa con la siguiente morfología colonial:
Colonias con centro negro, planas con o sin brillo metálico. Si no hay colonias con
morfología típica, probar una o más colonias lo más parecido E. coli de cada placa y
sembrarlas en agar cuenta estándar para realizar las pruebas de morfología
microscópica y pruebas bioquímicas.

Incubar las placas a 35°C por 18-24 h.

Hacer un frotis y teñirlo por Gram. Observar al microscopio la presencia de bacilos
cortos o cocobacilos Gram-negativos.
1.4.1 Identificación bioquímica de Escherichia coli mediante pruebas (IMViC).
A partir de las cajas de agar cuenta estándar, selecionar una colonia, resuspenderla en
2 ml de solución salina isotonica para realizar las siguientes pruebas bioqupimicas.
a. Producción de indol (I)

Tomar una asada de la suspensión bacteriana e inocular un tubo con caldo triptona,
incubarlo a 35°C por 24 ± 2 h.

Finalizada la incubación, adicionar entre 0.2 y 0.3 mL de reactivo de Kovacs o
Ehrlich.

La presencia de una coloración roja en la superficie del tubo se considera como
prueba positiva para la presencia de indol.
b. Producción de ácidos mixtos (o prueba de rojo de metilo, RM)

Tomar una asada de la suspensión bacteriana e inocular un tubo que contenga
caldo RM-VP, incubar a 35°C por 48 ± 2 h.

Finalizada la incubación, adicionar 5 gotas de solución de rojo de metilo.

Se considera una prueba positiva cuando se desarrolla un color rojo. Un color
amarillo es una prueba negativa.
c. Producción de metabolitos neutros (Voges-Proskauer VP)

Tomar una asada de la suspensión bacteriana e inocular un tubo que contenga
caldo RM-VP, incubar a 35°C por 48 ± 2 h.

Finalizada la incubación , adicionar 0.6 mL de solución KOH 40% (VP1), agiatr y 0.2
mL de solución alfa- naftol (VP2 )y agitar.

Dejar reposar el tubo destapado durante 10 minutos; se considera una prueba
positiva cuando se desarrolla un color rosa en la superficie.
d. Utilización del citrato (C)

Tomar una asada de la suspensión bacteriana e inocular un tubo que contenga
caldo citrato de Koser o agar citrato de Simmons (opcional) Incubar a 35°C por 96
h.

El desarrollo del cultivo que se observa con la turbiedad en el caldo citrato de Koser,
se considera una prueba positiva.
NOTAS
Para determinar la producción de indol, en lugar del caldo triptona puede utilizarse al
medio SIM. Este medio se inocula por picadura con el asa bacteriologíca de forma
recta. Se incuba a 35°C por 24± 2 h. Finalizado el periodo de incubación se adiciona el
reactivo de Kovac o Erlich cuyo fundamento es el mismo.
Para determinar la utilización del citrato de sodio como única fuente de carbono,
también se puede utilizar el agar citrato de Simmons en forma inclinada, el cual se
inocula en la superficie (pico de flauta). Se incuba a 35°C de 24 a 48 h. La presencia
de una coloración azul debida al vire del indicador que contiene el medio, indica prueba
positiva
Para evitar resultados falsos positivos, el inoculo no debe ser muy abundante, tanto en
el caldo citrato como en el agar citrato de Simmons
1.4.2 Prueba confirmativa opcional para Escherichia coli utilizando caldo EC-MUG
(4 metil-umbeliferil--D-glucuronido)
FUNDAMENTO
Alrededor del 94% de las cepas de Escherichia coli incluso las cepas no productoras de
gas producen la enzima beta-glucuronidasa (GUD), la cual rompe el sustrato específico
4-metilumbeliferil-beta-D-glucurónido (MUG) en 4-metilumbeliferona (MU); el cual al ser
expuesto a una fuente de luz ultravioleta (UV) de onda larga (365 nm) produce una
fluorescencia azul fácil de observar. Cuando el MUG es incorporado al caldo EC se
puede identificar Escherichia coli.
a. Prueba confirmativa

A partir de la fase presuntiva (inciso 1.1.) tomar una asada de cada tubo que
muestre formación de gas y sembrar en un número igual de tubos con medio ECMUG.

Incubar a 44,5 ± 0,2°C en baño de agua durante 24 h., observar si hay formación de
gas; si no se observa la formación de gas continuar la incubación 24 h. más.

Finalizado el periodo de incubación, irradiar los tubos con una fuente de luz UV,
observar cuantos tubos presentan fluorescencia

Utilizar estos resultados para calcular el número más probable (NMP) de E. coli.
Control de calidad
Inocular en dos tubos con caldo EC-MUG una cepa de E. coli como control positivo y K.
pneumoniae como control negativo.
CÁLCULOS Y EXPRESIÓN DE RESULTADOS
Calcular la densidad microbiana con base en el número más probable conforme al
procedimiento señalado en la tabla 1, para estimar la población de bacterias coliformes
totales, bacterias coliformes fecales y Escherichia coli en muestras de agua.
TABLA 1. Índice del NMP con 95% de límite de confianza para varias
combinaciones de resultados positivos y negativos cuando se usan 5 tubos con
20 mL de muestra de agua o hielo.
No. de Tubos
positivos
0
1
2
3
4
5
NMP/100 mL
<1,1
1,1
2,6
4,6
8,0
>8,0
95% de Límite de Confianza (aproximado)
Inferior
Superior
0
3,0
0,05
6,3
0,3
9,6
0,8
14,7
1,7
26,4
4,0
Infinito
TABLA 2. Índice del NMP con 95% de límite de confianza para varias
combinaciones de resultados positivos y negativos cuando se usan 10 tubos con
10 mL de muestra de agua o hielo.
No. de Tubos
Positivos
0
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
NMP/100 mL
<1,1
1,1
2,2
3,6
5,1
6,9
9,2
12,0
16,1
23,0
>23,0
95% de Límite de Confianza (aproximado)
Inferior
Superior
0,0
3,0
0,03
5,9
0,26
8,1
0,69
10,6
1,3
13,4
2,1
16,8
3,1
21,1
4,3
27,1
5,9
36,8
8,1
59,5
13,5
Infinito
Todos los cultivos que:
 Sean bacilos o cocobacilos Gram-negativos, no esporulados, fermenten la lactosa
con producción de gas dentro de las 48 h. a 35°C. y se obtenga las siguientes
combinaciones para las pruebas IMVIC:
Biotipo 1(++--)
Biotipo 2 (-+--)
son consideradas como Escherichia coli.
 Para calcular el NMP de E. coli utilizar a proporción de los tubos positivos de la
prueba confirmatoria en caldo EC.
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(2005)