Free Energy of Electron Transport

Fosforilación Oxidativa
Carlos I. González, Ph.D.
Catedrático Asociado
Departamento de Biología
Universidad de Puerto Rico – Río Piedras
CHAPTER 19
Oxidative Phosphorylation and
Photophosphorylation
Key topics:
–
–
–
–
Electron-transport chain in mitochondria
Capture of light energy in photosynthesis
Building up the proton-motive force
Synthesis of ATP in mitochondria and chloroplasts
Fosforilación Oxidativa
Convergencia de rutas catabólicas - glucólisis,
Ciclo de Krebs, β-oxidación, degradación de
amino ácidos.
Energía liberada de oxidación de estas
moléculas→ síntesis ATP.
En células eucarióticas ocurre en mitocondrio,
envuelve reducción de O2 a H2O con electrones
donados por NADH y FADH2.
Fosforilación Oxidativa
Se conoce también como cadena respiratoria transporte de e- por moléculas en la membrana
del mitocondrio.
Electrones vienen de dehidrogenasas en rutas
metabólicas. Dehidrogenasas remueven e- de
intermediarios. Donan e- a aceptadores (NAD y
FAD)
Energy Flow in Cellular Respiration
Oxidative Phosphorylation
• Electrons from the reduced cofactors NADH and FADH2
are passed to proteins in the respiratory chain
• In eukaryotes, oxygen is the ultimate electron acceptor
for these electrons
• Energy of oxidation is used to phosphorylate ADP
Oxidative Phosphorylation
Photophosphorylation
• In photosynthetic organisms light causes charge
separation between a pair chlorophyll molecules
• Energy of the oxidized and reduced chlorophyll
molecules is used to drive synthesis of ATP
• Water is the source of electrons that are passed via a
chain of protein transporters to the ultimate electron
acceptor, NADP+
• Oxygen is the byproduct of water oxidation
Photophosphorylation
Chemiosmotic Theory
Peter Mitchell 1961
1978 Nobel Prize
Mitocondrio
Mitochondria – site of
oxidative phosphorylation
Origen endosimbiótico
(mit.DNA, ribosomas,
tRNAs)
Structure of a Mitochondrion
1,100 proteins (300 still unknown function)
Tipos de Transferencia de Electrones:
1) como electrones Fe3+ a Fe2+
2) átomo de hidrógeno (H+ y e-)
3) hydride ion (2 e- y 1 H+)
Aceptadores de electrones:
Dehidrogenasas asociadas a NAD electrones transferidos como “hydride ion”
a NAD+ y otro H+ es liberado al medio.
Sust. red. + NAD+
H+
Sust. ox. + NADH +
NAD+ también obtiene e- de NADPH:
NADPH + NAD+
NADP+ + NADH
NADH (catabolismo) y NADPH (anabolismo)
- solubles, asociación a enzimas (reversible)
Ninguno cruza membrana interna.
Flavoproteínas - asociado, a veces
covalente, nucleótido de flavina
(FAD, FMN)
FAD o FMN acepta 1 o 2 e- participan
en rxns. de transferencia de 1 o 2 e-.
Transferencia - Flavoproteína tiene
más afinidad por e- que compuesto
oxidado.
Afinidad por e- de flavina depende
de proteína asociada. FAD es parte
de sitio activo de la enzima.
Ubiquinona (Coenzima Q) –
hidrofóbica, acepta 1 o 2 eCitocromos - contienen grupo
prostético heme.
Proteínas ferrosulfuradas - átomo de
hierro NO en grupo heme
Ubiquinona (coenzima Q)
Como flavoproteínas,
funciona en transferencias
de donante de 2 e- y aceptador
de 1 e-.
Pequeña, hidrofóbica,
difusible en membrana,
transporta e- de otros
transportadores menos
móviles.
Transporta e- y H+,
imp. en acoplamiento.
Citocromos
Iron-containing heme prosthetic groups
a y b asociado a su proteína,
no covalente, integrales
c – covalente, cisteínas, soluble
Afinidad átomo de hierro por e- depende de su
asociación a diferentes proteínas.
Cytochromes
• One electron carriers
• Iron coordinating porphoryin ring derivatives
• a, b or c differ by ring additions
Proteínas Ferro – sulfuradas
Hierro NO está presente en grupo heme, asociado
a azufre inorgánico, azufre en residuos de cisteína
de la proteína. Estructura puede ser compleja
(1 Fe a 4 Cys, 4 Fe).
Envueltos en transferencias de 1 e-. Un Fe es
oxidado o reducido.
Big Picture:
Energía liberada en transporte de e(exergónica) es asociada a transporte de
protones a través de la membrana
impermeable del mitocondrio.
Electrones se mueven de NADH,
succinato u otros donantes a O2 a través
de transportadores como flavoproteínas,
ubiquinonas, citocromos y proteínas
ferro-sulfuradas.
Esta energía se conserva como
potencial electroquímico
transmembranal.
El transporte de protones a favor de
gradiente (hacia dentro) a través de
canales de transporte se utiliza para
sintetizar ATP.
ATP sintetasa acopla transporte de
protones a fosforilación de ADP.
Chemiosmotic Theory
Peter Mitchell 1961
1978 Nobel Prize
Determinación de secuencia de la
cadena respiratoria
a) Determinación experimental de potencial de
reducción (afinidad por e-) de cada uno de los
transportadores. Electrones tienden a moverse
espontáneamente de portadores con –E’o a
portadores con +E’o.
Free Energy of Electron Transport
Reduction Potential (E)
∆Eo′ = Eo′(e- acceptor) – Eo′(e- donor)
∆Go′ = –nF∆Eo′
For negative G need positive E
E(acceptor) > E(donor)
Electrons are transferred from lower (more negative)
to higher (more positive) reduction potential.
Free Energy released is used to pump proton, storing
this energy as the electrochemical gradient
Qué tienen en común estos individuos?
Jim Jones
Adolf Hitler
Rasputin
b) Inhibidores de la cadena de transporte
En presencia de O2 y donante inicial de e-, los portadores que
funcionan antes del paso inhibido se reducen, los que funcionan
después de la inhibición permanecen oxidados.
Separación de Complejos Multienzimáticos de la
Cadena Respiratoria
Flow of Electrons from Biological Fuels
into the Electron-Transport Chain
NADH:ubiquinone oxidoreductase,
a.k.a. Complex I
• One of the largest macro-molecular assemblies in the
mammalian cell
• Over 40 different polypeptide chains, encoded by both
nuclear and mitochondrial genes
• NADH binding site in the matrix side
• Noncovalently bound flavin mononucleotide (FMN)
accepts two electrons from NADH
• Several iron-sulfur centers pass one electron at a time
toward the ubiquinone binding site
Complex I
IDENTIFIQUE EL ERROR DEL LIBRO!
NADH:Ubiquinone oxidoreducase is a
proton pump
• Transfer of two electrons from NADH to ubiquinone is
accompanied by a transfer of protons from the matrix (N) to
the intermembrane space (P)
• Experiments suggest that about four protons are transported
per one NADH
NADH + Q + 5H+N = NAD+ + QH2 + 4 H+P
• Reduced coenzyme Q picks up two protons
• Protons are transported by proton wires
– A series of amino acids that undergo protonation and deprotonation to
get a net transfer of a proton from one side of a membrane to another
Complejo I: Transferencia de e- de NADH a
Ubiquinona
Positivo
Negativo
Cataliza 2 procesos simultáneos:
1) Transferencia de 2e- (hydride ion) – exergónica
2) Transferencia de 4H+ al exterior.
Complejo I: Transferencia de e- de NADH a
Ubiquinona
Positivo
Negativo
Proton Pump - utiliza energía de transporte de e- para
mover H+.
Ubiquinona reducida (Ubiquinol) se mueve de
Complejo I a III
Complejo I:
42 polipéptidos, incluyendo 1
flavoproteína que contiene FMN y 6 FeS
Amital (barbitúrico), rotenona
(insecticida) y piericidin A (antibiótico) inhiben Complejo I
Inhiben transporte de e- de Fe-S a
ubiquinona.
Complejo II: Transferencia de e- de
Succinato a Ubiquinona
Dehidrogenasa de succinato – única enzima del Ciclo de
Krebs integrada en la membrana. 2 grupos prostéticos
y 4 proteínas diferentes e- pasan de succinato a FAD, a
centros Fe-S, a ubiquinona
Complejo II - Succinato a Ubiquinona
Otras formas de reducir CoQ pero no
por Complejos I y II:
β-oxidación - dehidrogenasa de acyl
CoA
glicerol - dehidrogenasa de glicerol 3P
Complejo III: Ubiquinona a citocromo c
(complejo citocromo bc1)
La CoQ transfiere e- a citocromos
(hierro en grupo heme). Citocromos
aceptan e- en forma Fe3+ y se
transforman a Fe2+.
Citocromo c ha variado muy poco en
evolución.
Complejo III: Transferencia de e- de
Ubiquinona a Citocromo c
CoQ reducida transfiere e- a Cytocromo c.Transporte
de H+ acoplado a transferencia de e-. CoQ dona 2e-,
citocromos aceptan sólo 1e-. Resultado: CoQ se
oxida, 2 citocromos c se reducen. Citocromo c es
soluble y se mueve al Complejo IV
para donar e-.
Transferencia de electrones en el Complejo III
2 moléculas de QH2 se oxidan, 4 H+ salen al exterior, cada QH2 dona
1e- via Fe-S a citocromo c1 y otro e- (via cit.b) a Q, reduciendo a QH2.
Esta reducción utiliza 2 H+ de la matriz.
Complejo IV: Citocromo c a O2
(citocromo oxidasa), reduce O2 a H2O.
Complejo de 13 subunidades, acopla
transferencia de e- a transporte de
H+
La reducción de O2 envuelve pasos
intermedios que generan radicales de
O2. Se mantienen unidos al complejo
para evitar que reaccionen con
componentes celulares.
Citocromo a3 diferente - contiene
Cu2+.
Complejo IV: Transferencia de e- de Citocromo c a O2
Por cada 4e-, el complejo consume 4H+ de la matriz
para convertir O2 en 2H2O. Por cada e- se transporta 1 H+
al exterior.
Subunidad I – 2 heme, a y a3, CuB
Subunidad II – 2 Cu2+ en complejo con SH de
cisteína (CuA)
Potencial de Reducción (E’o) - mide
afinidad por electrones.
Fuerza electromotriz (energía liberada) al
moverse de estado oxidado a reducido.
Negativo tiene menos afinidad por
electrones.
Positivo tiene más afinidad por
electrones.
Rxns. con ∆E’o positivo - exergónicas.
Transportadores de electrones
funcionan en orden de incremento en
potencial de reducción.
Electrones tienden a moverse
espontáneamente de portadores con E’o a portadores con +E’o.
Transporte de electrones - libera energía
∆G’o = -nF∆E’o
Transferencia de 2e- de NADH a O2:
NADH + H+ + ½ O2 → NAD+ + H2O
Reaccion exergónica. Si calculamos ∆G’o
vemos que:
n= 2eF=constante ∆E’o = cambio
en afinidad de e- de par Redox
Para NAD+/NADH = -.32
Para O2/H20 = 0.816
∆E’o = E aceptador - E donante
= .816-(-.32) = 1.14
Calculamos ∆G’o = -220 kJ/mol NADH
En cels. [NAD] y [NADH] no 1M, rxn. es más
negativa (exergónica).
Esta energía liberada se acopla a la salida de H+ al
exterior (endergónica).
Por cada 2e- transferidos a O2, 4H+ salen por medio de
Complejo I, 4H+ por medio de Complejo III y 2 H+ por
Complejo IV.
La energía electroquímica en esta diferencia de [H+] y
separación de cargas representa una conservación de la
mayoría de la energía liberada en la transferencia de
electrones.
La energía almacenada en este gradiente - proton
motive force (fuerza protón-motriz)
PMF - 2 componentes
1) H+ afuera alto/ adentro es bajo ya que membrana es
impermeable
2) cargas positivas afuera/negativas adentro
Por cada H+ que sale afuera ∆G = 20kJ/mol
Si por cada 2e- transportados de NADH a O2, salen 10
protones:
∆G total = 200kJ/mol
Si el transporte de 2e- tiene ∆G = -220 kJ/mol,
es termodinámicamente posible el transporte de 10
protones.
Cuando los protones fluyen espontáneamente a
favor del gradiente (de afuera hacia adentro) para
nivelar las conc., la energía liberada se utiliza para
sintetizar ATP.
Modelo Quemiosmótico de Mitchell
Energía liberada por el transporte de e- se acopla al transporte de H+
al espacio intermembranal formando un gradiente. La diferencia en
cargas y pH se transforma en energía (PMF) que produce ATP
cuando los H+ entran nuevamente a la matriz de forma pasiva y
espontánea.
Expts. que confirman Modelo Quemiosmotico
1) Requiere membrana intacta – sintesis de ATP
2) Memb. Impermeable a iones (H+, OH-, K+, Cl-)
3) Mitocondrios activos aumentan [H+] exterior
4) Inhibidores de transporte de e- (cianuro, CO) inhiben
síntesis de ATP
5) Inhibidores de síntesis de ATP inhiben transporte de e-.
6) Ionóforos – evitan fosforilación oxidativa, transportan
iones a través de la membrana y no permiten diferencia
en cargas eléctricas en la membrana (Valinomicina)
7) Desacopladores – aumentan permeabilidad de
membrana, liberan H+ y eliminan diferencia en H+
(DNP).
ATP Sintetasa o F1ATPasa (Complejo V)
Complejo multienzimático – formacion de ATP,
acoplado a transporte de H+ a través de membrana
2 componentes:
F1 – periferal, esencial para fosforilación
Fo – integral, sensitivo a oligomicina, poro de [H+]
hacia el interior
F1 o Fo – no síntesis de ATP, necesita ambos
complejos, ambos acoplan transferencia de e- y H+ a
síntesis de ATP.
F1 – hidrólisis de ATP
Mitochondrial ATP Synthase Complex
ADP + Pi ATP+H2O→ Rx. Reversible en superficie de
enzima (no convencional).
ATP se une más fuerte que los reactantes. ATP se
estabiliza y Rx. Procede aunque es un proceso
endergónico.
La estabilización de ATP libera energía para nivelar
costo de síntesis de ATP.
La energía almacenada en PMF libera ATP de la
superficie de la enzima.
Binding-change Model for ATP Synthase
Modelo de Mitchell:
Por 2e- desde NADH, 10H+ son expulsados
Por 2e- de succinato, 6H+ son expulsados
4H+ son requeridos/ 1ATP (1 de éstos es usado en
transporte de Pi, ADP y ATP)
Entonces:
Desde NADH →P/2e- ratio 10/4 = 2.5 ATP
Desde succinato→ P/2e- ratio 6/4 = 1.5 ATP
Lo superamos!
Cuántos ATP por O2 reducido?
P/O o P/2e- ratio
Expt. – Mitocondrios en presencia de NADH y O2 o
succinato y O2 → se oxida el NADH, se sintetiza ATP y
se reduce O2.
P/O ratio -> 2-3 ATP – NADH
P/O ratio -> 1-2 ATP – succinato
Proteínas Transportadoras – Membrana Interna
Mitocondrio
1) Translocasa de
nucleótido de Adenina –
ADP al matrix y ATP
hacia afuera
2) Translocasa de fosfato –
“symport” de Pi y H+
hacia adentro.
Consume energía ya que
consume H+ que pudo
haberse utilizado para
síntesis de ATP
Malato - Aspartato
NADH transfiere e- a Oxaloacetato→Malato, entra y transfiere e- a
NAD+ y NADH entonces entra a cadena de transporte. Oxaloacetato
en citoplasma se regenera por transaminación:
Aspartato + ketoglutarato
oxaloacetato + glutamato
Regulación Fosforilación Oxidativa
Produce mayoría de ATP en células aeróbicas
Regulación coordinada en otros procesos:
[ATP] bajas – aumenta actividad de glucólisis, oxidación
de piruvato, ciclo de Krebs, cadena de transporte.
[ADP] bajas – disminuye glucólisis (ATP inhibe PFK1),
oxidación de piruvato, ciclo de Krebs, cadena de
transporte.
Citrato – activo ciclo de Krebs, inhibe PFK1 cuando sale
al citoplasma
Regulación Coordinada