Pruebas Bioquímicas: diferenciación de bacterias coliformes

Pruebas Bioquímicas: diferenciación de bacterias coliformes:
Las bacterias son capaces de modificar el ambiente que las rodea captando sustancias
necesarias para su multiplicación y liberando al medio producto de desecho, enzimas,
exotoxinas, etc.
Las interacciones que cada genotipo bacteriano establece con el entorno son propias
y características.
Continuamos con la técnica de búsqueda de miembros del grupo de los
coliformes: prueba completa
Objetivo: Identificar a las bacterias que forman el grupo de coliformes fecales para
establecer la naturaleza de la contaminación de las aguas muestreadas
(rio, arroyo, etc.)
Características de los coliformes:
 Bacilos Gram. negativos
 No formadores de esporas
 Utilizan la lactosa como fuente de carbono y energía, dando formación de gas en 48
hs a 35 ºC.
Pero no todas las cepas asignadas taxonómicamente al grupo de los coliformes se
ajustan necesariamente a la definición de los mismos, pues a veces no fermentan la
lactosa o no producen gas al fermentarla…
Pasos previos…preparación del material
Pruebas IMViC
I=Producción de Indol
M=Reaccióón de Rojo de Metilo
V=Reaccióón de Voges-Proskauer
C=Utilización del Citraton
Pruebas bioquímicas adicionales……prueba de la oxidasa, motilidad, catalasa.
Cultivo joven y puro
Tinción de Gram
Gram Negativo
Siembro en diferentes medios para
Identificar su interacción con el medio y los
desechos que produce
Prueba Indol
El indol es uno de los productos de degradación metabólica del aminoácido triptófano.
Las bacterias que poseen la enzima triptofanasa son capaces de hidrolizar y
desaminar el triptófano (presente en el medio) con
producción de indol.
Medio SIM (agar) -Reactivo de Kovacs
Luego de la siembra incubar durante 24 hs a 35 ºC. Al cabo
de este tiempo añadir dos gotas del reactivo. Esperar 10
minutos para observar el color del halo formado
 Halo rojo: reacción +
 Halo amarillo: reacción Prueba del Rojo de Metilo y Voges-Proskauer
Esta prueba se fundamenta en el tipo y la proporción de productos de fermentación
que se originan de la fermentación de la glucosa
 La fermentación n ácido-mixta
 La fermentación del 2,3 n-butanodiol
Rojo de Metilo  busca……
Fermentación ácido-mixta
Glucosa  ácido láctico, acético y succínico, etanol, H2 y
CO2
Voges-Proskauer busca……
vía de fermentación del butanodiol
Glucosa  acetil-metil-carbinol  butanodiol
Medio RM/VP o Clark y Lubs
Se siembran dos tubos del mismo medio y con el mismo material. Uno para prueba de
RM y el otro para la prueba de VP. Incubar a 35°C durante 5 días
Reactivo prueba de VP: Solución de naftol e K(OH)
 Color rojo/fucsia: reacción (+)
 Color marrón: reacción (–)
Reactivo prueba de RM: solución indicadora Rojo de Metilo
 Halo rojo: reacción (+)
 Halo amarillo: reacción (-)
Prueba del Citrato
Determinación sobre la capacidad de un organismo de utilizar citrato como única
fuente de carbono y energía. Únicamente las bacterias capaces de metabolizar el
citrato podrán multiplicarse en este medio y, al hacerlo, liberarán iones amonio lo cual
basificará el medio. El medio utilizado contiene citrato como única fuente de carbono,
fosfato de amonio como única fuente de fosfato y azul bromotimol, como indicador de
pH.
Agar citrato de Simons
Siembra en una sola estría en pico de flauta. Incubar
durante 48 hsa 35 ºC. Al cabo de este tiempo añadir dos
gotas del reactivo. Esperar 10 minutos para observar el color
del halo formado
 Crecimiento a lo largo de la estría y color azul: reacción
+
 Sin crecimiento y color verde: reacción –
Prueba TSI
El agar triple azúcar hierro es un medio de cultivo diferencial que permite estudiar la
capacidad de producción de ácido y gas a partir de glucosa, sacarosa y lactosa en un
único medio.
Además permite averiguar la producción de sulfhídrico, muy común en Salmonella
El medio es un agar, ubicado en pico de flauta.
Se siembra por punción y por estría. Incubar 24 hs. a 35ºC.
Los resultados son indicados por el viraje de color del medio de rojo a amarillo. Según
la ubicación del color se leerá fermentación de la glucosa, la lactosa y/o la manosa. El
desplazamiento fermentación del medio hacia arriba indica la producción de gas. La
aparición de color negro indica la producción de H2S.