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Cátedra de Parasitología General-FCNyM
Técnicas para el estudio de parasitosis en sangre y otros tejidos
La sangre se examina en busca de los siguientes parásitos:
- Protozoos apicomplejos (especies de Plasmodium, Leucocytozoon, Haemoproteus, Babesia,
Theileria)
- Protozoos hemoflagelados (especies de Trypanosoma, Leishmania)
- Microfilarias
TÉCNICAS UTILIZADAS
Para la detección de microfilarias y tripanosomas suelen utilizarse preparaciones húmedas
de sangre entera fresca o sangre centrifugada. Esto sólo consigue demostrar la existencia
de infección y es preciso examinar extensiones teñidas para confirmar la especie de que se
trata.
Examen de sangre en fresco
Es la manera más fácil y económica de revelar parásitos en sangre, pero es también la prueba
menos sensible. Se la utiliza cuando se quiere detectar parásitos móviles (Trypanosoma spp.,
microfilarias).
Procedimiento: Colocar una gota de sangre sobre un portaobjetos y añadir una gota de igual
tamaño de solución salina. Mezclar con una esquina del cubreobjetos y tapar con este último
la preparación. Examinar todo el preparado al microscopio. El primer signo de presencia de
trypanosomas o microfilarias vivos es un movimiento rápido entre los glóbulos rojos. Los
trypanosomas pueden visualizarse mejor con 400X totales y para las microfilarias es
suficiente con 100X totales.
Este método es útil en el caso de alta concentración de parásitos en sangre pero no permite la
diferenciación de caracteres morfológicos.
Examen de sangre en preparados fijos
Material necesario: portaobjetos (limpios y desengrasados en alcohol-éter), algodón, lancetas
estériles, guantes.
- Preparaciones de gota gruesa
Procedimiento:
-Poner 2-3 gotas grandes de sangre (recién tomada) sobre un portaobjetos.
-Unir estas gotas y extenderlas en un diámetro de 1 cm, con la esquina de otro portaobjetos
(este procedimiento permite la desfibrinación del material).
-Secar a 37°C durante 1-2 horas o a temperatura ambiente al menos 8-10 horas al abrigo del
polvo e insectos.
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- Extendido o frotis en capa fina
Procedimiento:
-Colocar una gota pequeña de sangre recién tomada en un extremo del portaobjetos.
-Apoyar en un ángulo de 45° por delante de la gota otro portaobjetos y dejar que la sangre se
extienda a lo ancho del mismo
-Deslizar hacia adelante el segundo portaobjeto a lo largo del primero con un movimiento
suave y firme, sin levantarlo y manteniendo una inclinación de 45º. Esto arrastrará la sangre
en una capa fina quedando así listo el extendido.
-Dejar secar al aire.
Para el examen microscópico rutinario del paludismo (Plasmodium spp.), se hace una
extensión fina y otra de gota gruesa en el mismo portaobjetos.
Ambos tipos de preparados deben ser teñidos.
Tinción de los preparados
El colorante más comúnmente utilizado es el colorante de Giemsa (1)
Material necesario: Alcohol metílico, solución de Giemsa, cubetas de tinción, soportes para
los portaobjetos.
Fijación previa: Debe fijarse sólo la extensión fina, añadiendo 2-3 gotas de metanol o
sumergiéndola en metanol durante algunos segundos. La preparación de gota gruesa no debe
fijarse, para poder permitir la deshemoglobinización durante el proceso de tinción. Se debe
entonces evitar que esta parte del preparado entre en contacto con el metanol o con sus
vapores.
Coloración:
- Método normal:
-Colocar los portaobjetos en la cubeta de tinción.
-Cubrirlos con una solución de Giemsa al 3% en agua amortiguada, destilada o desionizada,
pH 7,2 y dejar actuar el colorante 30-45 min.
-Lavar suavemente con agua corriente o sumergir la cubeta en un recipiente con agua limpia,
hasta que no quede más colorante.
-Retirar los portaobjetos, colocarlos en un soporte con la extensión hacia abajo y dejar secar al
aire.
- Método rápido:
-Preparar una solución de Giemsa al 10% en agua amortiguada, destilada o desionizada, pH
7,2 (3 gotas de colorante/ml de agua). Cada portaobjetos necesitará aprox. unos 3 ml. de
colorante preparado.
-Verter suavemente con una pipeta el colorante sobre el portaobjetos, cubrirlo y dejar actuar
el colorante 5-10 min.
-Eliminar completamente el colorante del portaobjetos añadiendo agua gota a gota,
suavemente y sin inclinar el preparado para que no queden depósitos de colorante.
-Colocar los portaobjetos en un soporte con la extensión hacia abajo y dejar secar al aire.
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Existen otros métodos de tinción para las extensiones sanguíneas como el colorante de Field,
especial para Plasmodium spp. o la hematoxilina de Delafield (2), especial para microfilarias.
Conservación de los preparados
Los extendidos sin fijar no deben permanecer al aire libre.
Cuando están coloreados deben guardarse en cajas.
El aceite de cedro que se usa para la observación por inmersión, debe eliminarse con el
pulpejo del dedo antes de guardarse (no debe usar gasa ni algodón). Puede usarse una gota de
xilol, si el aceite de cedro está extendido.
Las preparaciones mal teñidas o decoloradas pueden decolorarse con alcohol metílico y
teñirse nuevamente.
Técnicas especiales para Plasmodium spp.
Recuento de parásitos
Por qué puede ser necesario establecer el número de parásitos?
- Para saber cuál es el grado de severidad de la malaria.
- Para saber si un tratamiento antimalárico que está siendo administrado está dando el
resultado esperado.
- Los recuentos de parásitos son especialmente importantes en infecciones por P. falciparum
que son potencialmente fatales.
Existen dos métodos para el recuento de parásitos en extensiones de gota gruesa.
Método 1: parásitos por ml de sangre.
El número de parásitos presentes en una extensión de gota gruesa se cuenta en relación a un
número estandarizado de leucocitos (8000). Se necesitan dos contadores, uno para los
parásitos y otro para los leucocitos.
Si al cabo de 200 leucocitos contados se identificaron y contaron 10 o más parásitos, los
resultados se registran como “número de parásitos por 200 leucocitos”.
Si al cabo de 200 leucocitos contados se identificaron y contaron 9 o menos parásitos, se
continúa hasta contar 500 leucocitos y los resultados se registran como “número de parásitos
por 500 leucocitos”.
En cada caso, el número de parásitos relativo al recuento de leucocitos puede convertirse a
parásitos /ml de sangre a través de esta fórmula:
nº de parásitos x 8000
nº de leucocitos
= parásitos /ml de sangre
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Es decir que, si se contaron 200 leucocitos, el nº de parásitos se multiplica por 40 y si se
contaron 500 leucocitos, el nº de parásitos se multiplica por 16.
Deben contarse todas las especies presentes.
Método 2: el método +
Es menos satisfactorio. Debería utilizarse sólo cuando no es posible realizar el otro tipo de
recuento.
Utiliza un código de signos +, como sigue:
+
=1-10 parásitos cada 100 campos examinados
++ =11-100 parásitos cada 100 campos examinados
+++ =1-10 parásitos por 1 solo campo examinado
++++ = más de 10 parásitos por 1 solo campo examinado
Técnicas especiales para microfilarias
Debe recordarse que, cuando se sospecha una filariasis, es muy importante la hora del día a la
que se toma la muestra de sangre, ya que algunas especies de filarias presentan una
“periodicidad”. Esto significa que las microfilarias estarán presentes en la sangre periférica
sólo a ciertas horas del día, de modo que para detectar su presencia debe recogerse la sangre
en el momento apropiado.
Para detectar microfilarias en sangre periférica se utilizan principalmente 3 métodos:
(1) Gota gruesa. Los procedimiento de preparación, y tinción, con ligeras variantes son
los vistos más arriba.
(2) Examen de sangre capilar en fresco (ya explicado)
(3) Examen de sangre venosa hemolizada
(1) Antes de colorear el preparado totalmente seco se debe deshemoglobinar sumergiéndolo
en agua corriente o destilada 3- 5 min. Se deja secar nuevamente y se fija en metanol 30-60
segundos. Dejar secar al aire y proceder a la tinción con Giemsa o hematoxilina de Delafield.
Si las microfilarias presentes en la sangre son escasas no serán observables en exámenes
directos, por ello se utilizan técnicas de concentración o enriquecimiento como (3). Al
centrifugar la sangre, también sedimentan los eritrocitos, por ello se debe producir primero la
hemólisis.
Examen de sangre venosa hemolizada (método de Knott)
Material necesario: Sangre venosa, formol al 2%, tubos de centrífuga, centrífuga.
Procedimiento:
-Colocar en un tubo de centrífuga 1 ml de sangre venosa y 10-12 ml de formol al 2%,
agitando enérgicamente. El formol lisa los hematíes.
-Centrifugar 2’ a aprox. 3000 rpm.
-Volcar el sobrenadante.
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-Colocar una gota de sedimento en un portaobjetos, tapar con un cubreobjetos y examinar al
microscopio. Se puede también con parte del sedimento realizar un extendido en capa gruesa
que, una vez completamente seco, se colorea con Giemsa o con hematoxilina.
Otro método de concentración es la Centrifugación de sangre citratada:
Se mezclan 10 ml de sangre venosa con 1 ml de solución fisiológica con citrato de sodio al
10%. Se centrifuga durante 30 min a 3000 rpm, se decanta el plasma y se separa la capa de
leucocitos formada sobre los hematíes. Con este material también se preparan extendidos que
se colorean con Giemsa.
Método para observar las microfilarias inmóviles y teñidas:
Se prepara una solución con:
Formol al 5%
Acido acético
Solución alcohólica concentrada de violeta de genciana (3)
95ml
5ml
2ml
A 10 ml de esta solución se agregan 3 a 5 ml de sangre venosa y se centrifuga. En el
sedimento se hallarán las microfilarias teñidas y los leucocitos.
Recuento de microfilarias
Se puede hacer un recuento preciso de las microfilarias a partir de extensiones en capa gruesa
teñidas de volúmenes de sangre determinados. Se debe hacer un cuidadoso barrido de la
extensión de sangre con el objetivo de bajo aumento del microscopio.
Técnicas especiales para Leishmania
Aunque a veces pueden detectarse amastigotes en los leucocitos mononucleares de la sangre
periférica, el examen microscópico de material aspirado de bazo, médula ósea y ganglios
linfáticos es más sensible. Cualquiera de estas técnicas es de alto riesgo y debe hacerse con
sumo cuidado por personal especializado.
Con el material resultante del aspirado se hacen extensiones que se colorean con Giemsa.
MUESTRAS CUTÁNEAS
Usualmente la piel se examina en busca de microfilarias en los casos de oncocercosis, una
filariosis presente en Africa, América Central y del Sur y algunas partes de la región
mediterránea oriental.
También se puede examinar la piel en las lesiones sospechosas de leishmaniasis cutánea.
Procedimiento para la búsqueda de microfilarias:
-Colocar una gota de solución salina en el portaobjetos
-Depositar el fragmento de piel en la gota y tapar con un cubreobjetos, sin ejercer presión.
-Dejar reposar 30 min.
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-Examinar al microscopio con el objetivo 10X. Si hay microfilarias, se las verá en
movimiento. Si no hay, dejar el fragmento de piel en solución salina una noche en estufa de
incubación a 37ºC o a temperatura ambiente y examinar nuevamente.
Si se quiere obtener preparaciones permanentes, eliminar los trozos de piel, dejar que se
evapore el líquido en el portaobjetos y cuando éste está seco, fijar las microfilarias en metanol
y teñir con Giemsa o con hematoxilina.
La muestra no debe estar manchada con sangre para evitar la posible contaminación de la
biopsia por parásitos sanguíneos.
Si el paciente presenta nódulos (usualmente en el tórax, cadera, pantorrillas y región
escapular), se toma la muestra del centro de uno de estos nódulos. Si no los presentara, se
toma la muestra de la parte alta de las nalgas, la pantorrilla o en el centro de la región
escapular.
Leishmaniasis cutánea:
Se raspa con un bisturí el borde de la lesión y se realiza un extendido con el material
obtenido.
IMPRONTA DE ÓRGANOS
Unas pocas parasitosis se pueden diagnosticar con este método. Las impresiones se pueden
realizar con material de necropsia o con lesiones cutáneas (en leishmaniasis por ej.). Se
imprime la superficie de corte del órgano problema sobre un portaobjetos perfectamente
limpio. El material que queda sobre el mismo, es fijado y coloreado como un extendido
sanguíneo. Suelen hacerse improntas de bazo en busca de Leishmania sp.
OTROS TEJIDOS
También se pueden detectar parásitos en los siguientes tejidos:
Líquido cefalorraquídeo. Se obtiene el LCR por punción lumbar, se centrifuga y se observa
inmediatamente. Se buscan tripomastigotas de las especies de Trypanosoma que afectan el
SNC: T. brucei gambiense y T. brucei rhodesiense en etapas avanzadas de la infección.
También se pueden buscar en LCR trofozoítos de amebas (meningitis amebianas), larvas de
Angiostrongylus cantonensis (meningoencefalitis eosinofílica), taquizoítos de Toxoplasma
(toxoplasmosis cerebral).
También pueden aparecer: larvas de Toxocara spp. y Strongyloides sp., Encephalitozoon.
Ojo. Por raspado corneal. Trofozoítos de Acanthameba sp.
Músculo. Biopsias, usualmente de bíceps, deltoides o diafragma. Larvas de Trichinella
spiralis.
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INOCULACIÓN DE ANIMALES DE LABORATORIO
Si se sospecha la existencia de una parasitosis y no es posible observar los parásitos de
manera directa puede recurrirse a la inoculación de animales de laboratorio, con el fin de
reproducir en ellos la enfermedad.
Ej: en las tripanosomiasis por Tripanosoma equinum, en las cuales el parásito no se
visualizará por otras técnicas.
Se inocula la sangre del animal enfermo en un animal de laboratorio por vía subcutánea o
intraperitoneal. Estos animales cursan la enfermedad en forma clínica. En el lapso de 6 días
pueden hallarse los tripanosomas en la sangre.
(1) La solución madre de Giemsa está compuesta por:
Azul II eosina
Azul II
Alcohol metílico
Glicerina
3 grs.
0,8 grs.
375 ml.
125 ml.
(2) Hematoxilina de Delafield:
Cristales de hematoxilina
1g
Etanol absoluto
10 ml
Sol. sat. de NH 4 Al(SO 4) en agua destilada 100 ml
Glicerol
25 ml
Metanol absoluto
25 ml
(3) El violeta de genciana se prepara al 4% en alcohol 96º.
Bibliografía
Brown, H. 1977. Parasitología clínica. Ed. Interamericana. 320 pp.
Feldmann, R. E. 1986. Diagnóstico coproparasitológico. Federación Bioquímica de la Pcia.
Buenos Aires. 26 pp.
Organización Mundial de la Salud, 1992. Métodos básicos de laboratorio en parasitología
médica. Ginebra, 116 pp.
Organización Mundial de la Salud, 1997. Medios auxiliares para el diagnóstico de las
infecciones filáricas. Ginebra, 116 pp.
World Health Organization, 1991. Basic malaria microscopy. Part I. Learner’s guide.
Geneva, 72 pp.
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Técnicas para el estudio de parásitos en líquido duodenal, orina y
secreciones
Líquido duodenal
El examen del líquido duodenal se realiza en busca de ciertos enteroparásitos de cuya
existencia se sospecha pero que, por distintos motivos, no son evidenciables en las muestras
fecales.
Hay dos maneras de obtener el líquido duodenal:
Sondaje duodenal:
Se introduce una sonda por nariz o por boca, asegurando que el extremo alcance el duodeno,
el extremo libre se coloca en un tubo de ensayo. Los parásitos se buscan en la bilis que drena
por la sonda. Preferentemente se toman las flóculas con una pipeta Pasteur y se observan al
microscopio entre porta y cubreobjetos. No se recomienda la centrifugación ya que la elevada
densidad de la bilis dificulta la acumulación de los parásitos en el sedimento.
Entero-test:
Se hace tragar al paciente un hilo de nylon enrollado dentro de una cápsula de gelatina. Un
extremo del hilo está sujeto a una pequeña pesa y el otro debe quedar fuera de la boca. Al
disolverse la cápsula en el estómago el hilo se libera y éste se va desenrollando por acción de
la pesa, que avanza por peristalsis al duodeno. Todo se recupera con las deposiciones luego de
4 horas. El hilo recuperado tiene adherido el moco intestinal, teñido de bilis. El hilo se raspa y
se recoge el material en una cápsula.
Observación:
Si es en fresco, debe ser inmediatamente a la obtención de la muestra, si se quiere comprobar
la existencia de organismos móviles.
También pueden hacerse extendidos coloreados:
Sobre un portaobjetos, homogeneizar una gota de material con una gota de solución fijadora
(PVA).
Dejar secar y colorear.
Qué se puede encontrar en el líquido duodenal?
- trofozoítos de Giardia lamblia
- huevos de Fasciola hepatica
- larvas de Strongyloides stercoralis
- larvas de Trichinella spiralis
- ooquistes de Cryptosporidium parvum e Isospora belli
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Orina
La orina se examina en busca de:
-huevos de helmintos asociados al riñón y vías urinarias
-formas quísticas y vegetativas de protozoos asociados a las vías urinarias o genitales
Las muestras de orina deben centrifugarse a 3000 rpm durante aprox. 5 minutos. Se recoge
una muestra del sedimento con una pipeta y se coloca entre porta y cubreobjetos para observar
al microscopio.
Qué se puede observar en un examen de orina?
En el hombre:
-huevos de Schistosoma haematobium
-trofozoítos de Trichomonas vaginalis (en varones)
En otros animales:
-huevos de helmintos parásitos del riñón y vías urinarias: Dioctophyma renale (perros),
Pearsonema plica (antes: Capillaria plica) (perros), Stephanurus dentatus (cerdos)
- tripomastigotes de Trypanosoma equiperdum (en caballos) en infecciones tempranas
- esporoquistes de Klossiella spp. (Coccidio) en varias especies
Métodos especiales para huevos de S. haematobium
- Método de filtración en jeringa:
Con una jeringa se hacen pasar a presión 10 ml de orina por un filtro (poro: 12-20 micras)
sujeto a un soporte que se ajusta a la jeringa.
El filtro se extrae del soporte, se coloca sobre un portaobjetos y se coloca encima una gota de
lugol.
Se examina todo el filtro al microscopio con el objetivo de 40X. Los huevos de Schistosoma
se tiñen de naranja y pueden verse claramente. La tasa de infección se mide por el número de
huevos por 10 ml de orina.
En general:
Infección leve: 1-49 huevos/10 ml de orina
Infección grave: > 50 huevos/10 ml de orina
Exudados vaginal y uretral
Se estudian para evidenciar la presencia de flagelados parásitos asociados a las mucosas
genitales. En humanos: Trichomonas vaginalis. En bovinos: Tritrichomonas foetus. En
equinos: Trypanosoma equiperdum.
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Obtención de la muestra:
Hombre: con un ansa de platino esterilizada, o con un hisopo estéril directamente del tracto
uretral.
Mujer: del tracto vaginal, con un hisopo estéril o con una espátula de madera.
En cualquier caso el hisopo con la muestra puede utilizarse directamente para realizar la
observación directa o el frotis o bien colocarse en un tubo con solución fisiológica.
En otros animales:
Vacas, yeguas: con un hisopo o cuchara de mango largo, o con una pipeta, o inyectando en la
vagina solución fisiológica y recuperando luego el líquido.
Toros, caballos: por lavado de la cavidad prepucial con solución fisiológica y posterior
recuperación del líquido, o por sondaje uretral.
Preparación de las muestras:
Para observación en fresco (en busca de parásitos móviles):
Colocar el material sobre una gota de solución salina y observar al microscopio entre porta y
cubreobjetos.
Si el material fue recuperado por lavaje o irrigación, o viene impregnado en un hisopo en
solución fisiológica se centrifuga el líquido a baja velocidad por 2 min y se examina el
sedimento.
Para realizar preparaciones fijas:
Frotar el material sobre un portaobjetos. Dejar secar, fijar y colorear como para las
extensiones de sangre.
Bibliografía
Laboratorio Veterinario Central, Weybridge, Gran Betaña, 1971. Manual de técnicas de
parasitología veterinaria, Ed. Acribia, Zaragoza, 196 pp.
Organización Mundial de la Salud, 1992. Métodos básicos de laboratorio en parasitología
médica. 116 pp.
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