GUIÓN PRACTICA Nº 2: TÉCNICAS DE LABORATORIO (II).

PARASITOLOGÍA
Práctica Nº 2 : Técnicas de Laboratorio (II).
GUIÓN PRACTICA Nº 2: TÉCNICAS
DE LABORATORIO (II).
1- FIJACIÓN Y CONSERVACIÓN DE PARÁSITOS.
2- PREPARACIÓN Y MONTAJE “in toto”DE PARÁSITOS DE PEQUEÑO TAMAÑO.
3- ESTUDIO DE LAS PREPARACIONES MICROSCÓPICAS.
MATERIAL: EL MISMO QUE EL DE LA PRÁCTICA Nº 1.
1-FIJACIÓN Y CONSERVACIÓN DE PARÁSITOS.
1º) Relajación: Con frío, calor, soluciones alcohólicas.
2º) Conservación indefinida: Los parásitos se pueden conservar indefinidamente en
recipientes herméticos con líquidos fijadores como el formol 4% o el alcohol 70 %.
La cantidad de líquido fijador con respecto a la masa del material fijado será aprox
10:1.
Otros fijadores especiales para:
Fijación de Platelmintos y Acantocéfalos:.
 Formol al 4% : gran penetración en el tejido.
 Fijador de Gilson:
 Formol - acético - alcohol (F.A.A.)
 Fijador de Bouin.
Fijación de Artrópodos, Nematodos:
o Alcohol de 70%.
o Líquido de Trasvasos (Prefijación, durante 1 hora, después alcohol 70%)
o Solución de glicerina – alcohol.
3º Etiquetado de la muestra: una muestra NO IDENTIFICADA es una muestra
CIENTIFICAMENTE NO VÁLIDA
Para que una muestra tenga valor científico todo parásito debe de ir acompañado de etiqueta
identificativa en la que se indiquen:
Nombre del hospedador, ubicación del parásito, lugar y fecha de recogida, nombre del
colector.
Con posterioridad, después de identificar el mismo, se añade a la etiqueta o se
acompaña de otra en la que se reseñe: Nombre específico, nombre del determinador;
3- PREPARACIÓN Y MONTAJE “in toto”DE PARÁSITOS DE PEQUEÑO TAMAÑO.
Los pequeños ejemplares fijados que, por sus especiales características de transparencia,
puedan ser estudiados bajo lupa o microscopio, deberán ser montados en portaobjetos de
cristal, realizando así preparaciones para su posterior estudio microscópico y determinación.
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 PREPARACIONES PERMANENTES: EN RESINA
Procedimiento básico:
1) Fijación: Con formol, o alcohol, según el tipo de animal.
2) Coloración: En ocasiones resulta indicado, para resaltar las estructuras internas
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que se ven por transparencia, una coloración sencilla con carmín, iodo, u otros
colorantes. Cuando los colorantes están disueltos en agua, (es preciso lavar el
ejemplar fijado con agua destilada.
Deshidratación. Baños sucesivos de alcoholes de gradación creciente: (
70%90% absoluto absoluto) El tiempo se fija según tamaño.
Intermediario.Una vez escurrido el alcohol, sin que el ejemplar se seque, se
coloca sobre el portaobjetos y se añade una gota de xilol.
Aclarado.Escurrido el xilol, se puede añadir una gota de creosota de haya, que
vuelve transparente la preparación.
Inclusión. Escurrido la creosota (sin que nunca se seque) se pone la resina
necesaria para el montaje (Bálsamo de Canadá, resina Damar, o resinas sintéticas
como Eukit, , etc). Sobre la resina se coloca el cubreobjetos, procurando que no
queden burbujas de aire. (Apoyando el borde del mismo sobre el porta con un
ángulo de 40 º y se deja caer suavemente).
Etiquetado.En una etiqueta adhesiva de tamaño adecuado se identifica la
preparación indicando: Hospedador; Autor del montaje y fecha. Posteriormente
se añadirá el Nombre de la especie y el del determinador.
Secado.Se dejan secar en posición horizontal en estufa durante 24 horas.
Identificación de la especie: La determinación se realizará posteriormente.
 PREPARACIONES SEMIPERMANENTES en Lactofenol-azúl de toluidina.
Tras la fijación, el especimen se puede montar rápidamente, para su determinación, en
preparaciones semipermanentes.
Es indicado con especimenes muy pequeños en los que realizar las deshidrataciones
supongan grave riesgo de pérdida. Presentan la ventaja de la rapidez, ya que no es
necesario la deshidratación de la pieza, al tiempo que el azul de toluidina colorea las
estructuras.
Su inconveniente radica en que el lactofenol no llega a secarse totalmente, por lo que
las preparaciones deben sellarse por los bordes con esmalte de uñas y conservarse en
posición horizontal.
TRATAMIENTOS ESPECIALES.
 ACLARACIÓN DE LOS NEMATODOS. A veces, por las características de los
animales, estos no son transparentes, por lo que, antes de proceder al montaje en
necesario hacerlos transparentes mediante un proceso de “aclarado”.
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La impermeabilidad de su cutícula hace que los colorantes no penetren con facilidad,
por lo que, para el estudio de sus órganos internos, deben de hacerse transparentes y
montarse provisionalmente en glicerina, glicerina-gelatina, fenol al 88% o lactofenol.
 PREPARACIÓN DE ARTRÓPODOS.
Dípteros: Las larvas y pupas se matan metiéndolas en agua hirviendo, y pasándolas al cabo de
1 o 2 minutos a alcohol de 70%, donde se conservan. Los adultos se pinchan con
alfileres entomológicas.
Siphonaptera: (Pulgas). Para aclararlas se sumergen en solución acuosa de Hidróxido potásico
al 10%, durante 24-36 horas. Se pasan después a agua acidificada con unas gotas de
clohídrico. Se deshidratan con pases de 30 minutos en alcoholes de gradación
creciente, se aclara en creosota de haya, quitando su exceso con xilol y se montan en
goma de Damar o resina sintética.
Garrapatas y piojos: Se matan con agua hirviendo (unos segundos).Se estiran las patas, (con
pinzas o agujas), se pasan a alcohol de 70%. Para su montado en portas, se sigue el
procedimiento empleado con las pulgas, omitiendo el paso por Hidróxido sódico.
Ácaros: Pueden montarse vivos o a partir de alcohol de 70% en líquido de Hoyer.
Piezas bucales de Artrópodos picadores-chupadores: Para hacer la disección de la boca de
un artrópodo, se coloca la cabeza en una gota de glicerina bajo lupa y con agujas, se separan
los músculos que unen las piezas quitinizadas.
mueren y se distorsionan.
3- ESTUDIO DE PREPARACIONES MICROSCÓPICAS.
CALIBRACIÓN DEL MICROSCOPIO.
El tamaño de los diferentes huevos y estadios de los parásitos es
importante para su correcta identificación, por lo que se hace necesario
obtener mediciones precisas. Para ello debe de usarse una escala ocular en
el microscopio, cuya calibración ha de ser individual y para cada aumento.
La escala ocular se calibra para cada aumento, colocado en la platina del microscopio, un
micrómetro patrón, cuyas divisiones tienen una medida calibrada y conocida ( 0.01 mm =
10µm.) Ejemplo: Para 40x (aumentos)
1º- Se enfoca la línea del micrómetro patrón.
2º- La línea de la escala ocular debe quedar paralela a la del micrómetro de la platina.
3º- Se alinea el extremo izquierdo ( 0 ) de ambas escalas.
4º- Se cuenta el nº de unidades de la escala ocular coinciden con el micrómetro patrón.
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(Ejemplo: 40 ocular y 30 patrón)
40 unidades de la escala miden 30x0.01 mm = 0.3 mm en el patrón.
5º- Se hace una regla de tres para saber la equivalencia de cada unidad del ocular con respecto
a la medida real, dato que servirá de factor de aumento real.
40 unidades ocular
1 espacio ocular
------- 0.3 mm
1 espacio = 0.3/40 = 0.0075 = 7.5 micras
----------- x mm
6º- Para calibrar otro objetivo de diferente aumento se repite la operación
EXAMEN SISTEMÁTICO DE UNA PREPARACIÓN. SE UTILIZAN LAS REALIZADAS
EN LA PRÁCTICA ANTERIOR.
1) La observación en fresco permite ver el movimiento de los trofozoitos.
2) Se debe utilizar baja intensidad luminosa.
3) Se inicia la observación con objetivo 10 x comenzando en el extremo inferior del
portaobjetos y se observa cada campo hasta llegar al extremo superior, según se muestra
en el diagrama.
4) Después se mueve la preparación un campo hacia la derecha y se examina cada campo
hacia abajo hasta alcanzar el extremo izquierdo. ( ver esquema)
5) Se continúa de este modo hasta examinar el portaobjetos entero.
6) Se examinan varios campos al azar con aumentos superiores y objetivo seco.
7) Mejora la visualización de huevos y quiste la tinción con Yodo, aunque los trofozoitos
mueren y se distorsionan.
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EL TAMAÑO DE LOS PARÁSITOS
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