Replicación del DNA

BIOLOGÍA MOLECULAR:
GENÓ
GENÓMICA,
PROTEÓ
PROTEÓMICA Y
METABOLÓ
METABOLÓNICA
T-replicación
(1)
(2)
(3)
Proteina
Genoma
Transcriptoma
Proteoma
Metabolitos y
macromoléculas
Metaboloma
La información que contiene el DNA se transmite
BIOLOGÍA
Estructura 1iªMOLECULAR:
del DNA
toda la informació
información está
está en el DNA
y a partir de ella se sintetizan los RNAs y las
T-replicación
proteinas
(1)
(1)
(2)
(2)
(3)
(3)
T-replicación
Enlaces fosfodiester
Enlaces N-glicosídicos
Puentes de H para la
Doble hélice
Estructura 1iª del DNA
DNA:
DOBLE HÉLICE
T-replicación
Surco
mayor
Surco
menor
Desenrollado
Superenrollado
Apareamiento de bases en el DNA
e influencia en su estructura
C = G 3 puentes de H
A = T 2 puentes de H
y
Estos apareamientos son la base de la estructura y de
las funciones de los ácidos nucleicos.
Cara del surco mayor
Enlace
glicosídico
Enlace
glicosídico
Cara del surco menor
Adenina-Timina
Cara del surco mayor
Enlace
glicosídico
Enlace
glicosídico
Cara del surco menor
Citosina-Guanina
Tipos de DNA
T43-replicación
DNA lineal de doble hebra
DNA circular
T43-replicación
Super-enrollamiento
del DNA en eucariotas
El DNA (2 nm)
se encuentra superempaquetado
en los cromosomas (1µ
µm)
en el nucleo celular
1µ
µm = 1000 nm
(1) Replicación del DNA
El DNA se duplica,
T43-replicación
Cada una de las
hebras se duplica
mediante la síntesis
de otra hebra
complementaria
Molécula padre original
Horquilla de replicación
semiconservadora
Moléculas hijas de 1ª generación
Replicación del DNA
T43-replicación
FASES y enzimas:
INICIACIÓN: topoisomerasa, helicasa, proteínas unidas
a hebra sencilla (SSB), primasa y cebador
ELONGACIÓN: DNA polimerasa, horquilla de
replicación
TERMINACIÓN: maduración y unión de los fragmentos
de Okazaki
(1) Replicación del DNA
La replicación del DNA es semiconservadora,
||||||||||||
||||||||||||
hebra 5’
nueva
3’
hebra
nueva
||||||||||||
||||||||||||
||||||||||||
semiconservadora
||||||||||||
||||||||||||
dispersante
||||||||||||
||||||||||||
||||||||||||
||||||||||||
conservadora
La replicación
semiconservadora
del DNA es
coherente con el
modelo de doble
hélice
molécula
de DNA
progenitora
||||||||||||
nuevos nucleótidos
||||||||||||
||||||||||||
cada cadena se replica, actuando como molde una hebra
se sintetiza otra hebra complementaria.
hebra
hija
hebra
paterna
hebra
paterna
hebra
hija
Replicación del DNA:
es semidiscontinua y
asimétrica, una hebra de sintetiza en continuo y la otra en
fragmentos que luego se unen
T43-replicación
DNA progenitor
Hebra conductora
Horquilla de replicación
Fragmentos de Okazaki
Replicación
semiconservadora
semidiscontinua y
asimétrica
Hebra retardada
Replicación del DNA:
elongación
La replicación del DNA o síntesis de nuevo
DNA necesita de sustratos activados, dNTP.
DNA molde,
n1 dATP + n2 dGTP + n3 dCTP + n4 dTTP
RNA cebador,
DNA polimerasa
DNA + (n1+n2+n3+n4) PP
Mg2+,
hebra molde (DNA)
5’
3’
P
3’
P
P
P
P
P
3’
P
P
P
P
5’
C
G
A
G
C
U
OH
OH
T
C
A
OH
5’
5’
cebador (RNA) para la
hebra de DNA naciente
T
G
C
U
A
OH
OH
P
3’
P
5’
P
P
P
3’
P
P
C
...
3’
OH
:
OH
3’
A
+
P
OH
:
P
G
5’
:
P
C
OH
3’
P
5’
5’
dNTP
3’
hebra de DNA en
crecimiento ( 5’ → 3’ )
PPi
P
Datos de la replicación del DNA
Hebra conductora
Hebras progenitoras
RNA cebador
T43-replicación
Horquilla de replicación
Hebra retardada
Replicación
semiconservadora
asimétrica y
semidiscontinua
Hebra de DNA
sintetizada de novo
Dirección del
desplazamiento de la
horquilla de replicación
hebra conductora:
3’
sentido de síntesis y
de avance coinciden 5’
hebra retardada:
3’
sentido de síntesis y
de avance opuestos 5’
avance de la horquilla
y de la polimerasa
3’
5’
5’
3’
Replicación del DNA
T43-replicación
FASES y enzimas:
Iniciación: topoisomerasa, helicasa, proteínas unidas
a hebra sencilla, primasa y RNA cebador
Elongación: DNA polimerasa, horquilla de replicación
Terminación, maduración y unión de los fragmentos
de Okazaki
Replicación
semiconservadora
asimétrica y
semidiscontinua
Replicación del DNA: elementos de la
iniciación
topoisomerasa
T43-replicación
RPA, proteína de
unión a hebra
sencilla
Replicación
semiconservadora
asimétrica y
semidiscontinua
helicasa
horquilla de
replicación
dirección de avance
Replicación del DNA:
iniciación
DNA molde
T-replicación
Primasa
Elementos
que
intervienen
en la
replicación
RNA
cebador
DNA polimerasa III
Replicación
semiconservadora
asimétrica y
semidiscontinua
Nuevo DNA
Replicación del DNA
Topoisomerasa
Helicasa
T-replicación
T43-replicación
Proteínas ligadas a
la hebra sencilla
Replicación
semiconservadora
asimétrica y
semidiscontinua
Primosoma
Primasa
DNA polimerasa
III
DNA polimerasa
I
Hebra
conductora
DNA ligasa
Hebra
retardada
hebra
conductora
T-replicación
La hebra conductora necesita
un cebador sólo al comenzar,
sintetizado por la actividad
primasa de la DNApol α
doble hebra
hija nº1
molde de
la hebra
conductora
La DNApol α inicia la
elongación, como DNA,
del RNA cebador de la
hebra conductora
La DNApol δ (o la ε) continúa la
síntesis de la hebra conductora de
forma continua, en sentido 5’→3’,
recorriendo su hebra molde de 3’ a 5’
helicasa
RPA, proteína de
unión a hebra sencilla
aquí comenzó el 1er fragmento de Okazaki,
y hasta aquí llegará la elongación del 2o
(el que δ está sintetizando ahora)
molde de la hebra retardada
(sentido 5’→3’ indicado
por las flechas azules)
hebra retardada
(en fragmentos de Okazaki)
doble hebra
hija nº2
doble hebra
progenitora
molde de
la hebra
conductora
molde de
la hebra
retrasada
La hebra retardada necesita un
cebador para cada fragmento de
Okazaki, sintetizado por la
actividad primasa de la DNApol α
La hebra retardada se sintetiza de forma
discontinua, en fragmentos de Okazaki; cada
fragmento lo inicia (cebador + DNA) la
DNApol α y luego lo continúa la DNApol δ
Replicación del DNA
Experimento de Meselson y Stahl
•Separación por
centrifugación en
CsCl de DNA de
cadenas en doble
hélice sintetizados
en presencia de 15N
(cadena pesada) o
de 14N (cadena
ligera) o de una
mezcla de ambas o
de una doble hélice
híbrida (hebra ligera
y hebra pesada).
Densidad
T-replicación
ambas hebras
ligeras
ambas hebras
pesadas
ligera/ligera
pesada/pesada
1ª
2ª
Ligera/pesada
3ª
Replicación del DNA
Experimento de Meselson y Stahl
•Se crecen E. Coli en
presencia de 15N y
después de 14N;
•se toman muestras
de DNA después de
1, 2 y 3
generaciones,
•se mezclan con
CsCl y se
centrifugan.
•Así se separan las
cadenas de
diferentes
densidades.
Progenitor
densidad
T-replicación
Replicación del DNA
143a
Replicación
semiconservadora
asimétrica y
semidiscontinua
T-replicación
Alcanzado el equilibrio de
sedimentación, las moléculas
de DNA se concentran
formando una banda,
detectada por su absorción UV
DNA normal
(“ligero”, 14N)
1.71
1.73
densidad
Gradiente de
densidad formado
con CsCl
Mezcla de
DNA “pesado” y DNA “ligero”
A260
A260
1.69
DNA “pesado”
(15N)
1.75
1.69
A260
1.71
1.73
densidad
La densidad del DNA pesado es 0.016 g/cm3
mayor (un 1%) que la del DNA ligero; por
ello, se sitúa un poco más abajo en el gradiente
1.75
1.69
1.71
1.73
densidad
Es posible separar ambos
tipos de DNA (unos 0.5 mm
entre las bandas)
1.75
Se extrae su DNA
(será [15N]DNA)
células
“semimarcadas”
Se analiza por
centrifugación
isopícnica
?
(100% de la masa
de DNA)
Se transfieren las células a
un medio normal (con 14N).
Se espera a que tenga lugar
una división celular.
12- Replicación
Tras la primera
división celular,
se extrae el DNA
?
Continúan en medio
normal (con 14N)
(una división adicional)
células aún
menos marcadas
(25% de la masa
de DNA)
Tras la segunda
división celular,
se extrae el DNA
?
2ª generación
(50% de la masa
de DNA)
1ª generación
Se cultivan células de E. coli durante
muchas generaciones en un medio con
15NH Cl como única fuente de nitrógeno.
4
células marcadas
por completo
143b
inicial
1 Diseño del experimento:
144a
12- Replicación
2 Bajo las hipótesis de replicación conservadora y semiconservadora, los resultados
previsibles serían, comparativamente:
Banda de
DNA pesado
REPLICACIÓN
CONSERVADORA:
REPLICACIÓN
SEMICONSERVADORA:
Banda de
DNA pesado
DNA pesado
(marcado con 15N)
replicación
14N
Dos bandas de
DNA (ligero y
pesado, ½ y ½)
replicación
14N
Banda única de
DNA (de densidad
intermedia)
1ª generación
pesado
ligero
híbrido
híbrido
144b
12- Replicación
Dos bandas de
DNA (ligero y
pesado, ½ y ½)
Banda única de
DNA (de densidad
intermedia)
1ª generación
pesado
ligero
replicación
Dos bandas de
DNA (ligero y
pesado, ¾ y ¼)
híbrido
14N
14N
híbrido
replicación
Dos bandas de
DNA (ligero y de
densidad
intermedia, ½ : ½)
2ª generación
pesado ligero ligero ligero
híbrido ligero ligero híbrido
Aunque no se presentan los resultados, la REPLICACIÓN DISPERSANTE habría producido moléculas de DNA
con mezcla aleatoria de nucleótidos progenitores y nuevos, es decir, en la 1ª generación una sola banda en
el gradiente (densidad intermedia entre pesado y ligero) y en la 2ª también una sola banda (densidad
intermedia entre la anterior y la del ligero).
BIOLOGÍA MOLECULAR:
GENÓ
GENÓMICA,
MICA
PROTEÓ
PROTEÓMICA Y
METABOLÓ
METABOLÓNICA
T-transcripción
(1)
(2)
(3)
Proteina
Genoma
Transcriptoma
Proteoma
Metabolitos y
macromoléculas
Metaboloma
BIOLOGÍA MOLECULAR:
toda la informació
información está
está en el DNA
y a partir de ella se sintetizan los RNAs
T-transcripción
(1)
(1)
(2)
(2)
(3)
(3)
BIOLOGÍA MOLECULAR (2) :
Transcripción o síntesis del RNA
T-transcripción
DNA
RNA
transcripción
• Mensajero: mRNA
• Ribosomal: rRNA
• Transferente: tRNA
mRNA
rRNA
tRNA
Tipos y funciones de RNA
T-transcripción
•Mensajero: mRNA
•Ribosomal: rRNA
•Transferente: tRNA
•mRNA: es el que lleva el mensaje, es decir
el que codifica la secuencia de los
aminoácidos (AA) en las proteínas.
•rRNA: forma parte de lo ribosomas.
•tRNA: activa a los AA y los transporta
hasta los ribosomas, para la síntesis de las
proteínas.
(2) Transcripción del DNA:
síntesis del RNA
T-transcripción
RNA:
RNA
Mensajero: mRNA
Ribosomal: rRNA
Transferente: tRNA
Los tres tipos de RNA
van a intervenir en la
síntesis de proteínas
(2) Transcripción:
síntesis del RNA*
DNA
RNA
RNA polimerasa
T-transcripción
DNA
RNA polimerasa
mRNA
(2) Transcripción:
síntesis del RNA
T-transcripción
Burbuja de transcripción
Doble hélice
DNA
DNA desenrollado
(17 pb abiertos)
RNA polimerasa
(2) Transcripción:
síntesis del RNA
T-transcripción
Avance de la burbuja de
transcripción
RNA polimerasa
Hebra molde
enrollado
RNA
naciente
Hélice híbrida
DNA-RNA
Movimiento de
la polimerasa
Hebra
codificante
Lugar
elongación
desenrollado
Transcripción: síntesis del RNA *
T-transcripción
Hebra de DNA no molde (codificante)
Hebra de DNA molde
RNA transcrito
(2) Transcripción:
síntesis del RNA
T-transcripción
RNA polimerasa
Proteina
Ro (ρ
ρ)
Final de la
transcripción
Hebra de DNA no molde (codificante)
Hebra de DNA molde
RNA transcrito
(2) Transcripción:
síntesis del RNA
T-transcripción
molde
(2) Transcripción:
síntesis del RNA
T-transcripción
La RNA
polimerasa
cataliza la
síntesis del
mRNA como
copia
complementa
ria de la
hebra molde
del DNA
m- RNA: RNA mensajero
T-transcripción
La RNA
polimerasa
cataliza la
síntesis del
mRNA como
copia
complementaria
de la hebra molde
del DNA
Tipos y funciones de RNA
T-transcripción
•Mensajero: mRNA
•Ribosomal: rRNA
•Transferente: tRNA
•mRNA: es el que lleva el mensaje, es decir
el que codifica la secuencia de los
aminoácidos (AA) en las proteínas.
•rRNA: forma parte de lo ribosomas.
•tRNA: activa a los AA y los transporta
hasta los ribosomas, para la síntesis de las
proteínas.
Tipos y funciones de RNA*
mRNA
rRNA
tRNA
T-transcripción
Lugar de unión
de los AA
mRNA
Codificante
Anticodón
m- RNA: RNA mensajero
T-transcripción
La cadena de
mRNA es la copia
de la hebra
codificante del
DNA; va a servir
para codificar el
orden de AA en
las proteínas
r- RNA: RNA ribosomal
T-transcripción
El rRNA
forma
parte de
los
ribosomas
junto con
varias
proteínas
PROCARIOTAS:
EUCARIOTAS :
ribosoma 70S
ribosoma 80S
t- RNA: RNA de transferencia
Lugar de unión
de los AA
T-transcripción
El tRNA es el de
menor tamaño.
Su estructura
en hoja de
trebol tiene
muchos lugares
con función
propia.
Extremo 5’
fosfato
Bucle DHU
Bucle Tψ
ψC
Bucle
anticodón
T-transcripción
t- RNA:
RNA de
transferencia
La
conformación
del tRNA es en
ángulo recto
t- RNA: RNA de transferencia
T-transcripción
Lugar de uni
de los AA
Bucle
anticodón
Bucle
anticodón
t- RNA: RNA de transferencia
T-transcripción
Lugar de
unión
de los AA
t- RNA: función
T-transcripción
El tRNA es el
transportador
de los AA
hasta el lugar
de síntesis de
las proteínas
mRNA
procesamiento de los RNAs nativos*
T-transcripción
Procesado o
maduración:
•Metilación
•Eliminación de intrones
(Corte y empalme de
exones)
•Poliadenilación
No todos los RNAs se
procesan igual.
Modificaciones post-Transcripción:
procesamiento de los RNAs nativos
T-transcripción
procesamiento de los RNAs nativos
T-transcripción
Procesado o maduración:
•Metilación
•Eliminación de intrones (Corte y empalme)
•Poliadenilación
No todos los RNAs se procesan igual.
t- RNA: final del procesamiento del
RNA de transferencia
T-transcripción
Lugar de unió
de los AA
síntesis
de proteínas
rRNA
T-transcripción
mRNA
rRNA
Los tres tipos de
RNA participan en la
síntesis de proteínas
tRNA
Replicación, Transcripción y
síntesis de proteínas en procariotas