cuantificación de los grupos bacterianos de cinco inoculos

CUANTIFICACIÓN DE LOS GRUPOS BACTERIANOS DE CINCO INOCULOS USADOS
EN LA PRUEBA DE BIODEGRADABILIDAD ANAEROBIA
Iván Moreno Andrade
Coordinación de Bioprocesos Ambientales, Instituto de Ingeniería, UNAM.
C.U., Apdo. Postal 70-472 Coyoacán. México D.F. CP.04510 FAX: +(52) 55 5616-2798,
e-mail: [email protected]
Germán Buitrón Méndez*
Coordinación de Bioprocesos Ambientales, Instituto de Ingeniería, UNAM.
C.U., Apdo. Postal 70-472 Coyoacán. México D.F. CP.04510 FAX: +(52) 55 5616-2798.
e-mail: [email protected]
Dirección del autor principal: Coordinación de Bioprocesos Ambientales, Instituto de Ingeniería, UNAM.
C.U., Apdo. Postal 70-472 Coyoacán. 04510 México, D.F. FAX: 56162798, e-mail [email protected]
Ingeniero Químico, UNAM (1987), Maestría y doctorado INSA-Toulouse, Francia (1990, 1993). Actualmente
Investigador Titular y Coordinador de Bioprocesos Ambientales.
RESUMEN
Existen factores que se deben cuidar para la realización de las pruebas de biodegradabilidad anaerobia, los cuales son
principalmente las condiciones fisicoquímicas, la cantidad de sustrato que se desea degradar, y la cantidad de inóculo en
la prueba. Los dos primeros factores pueden controlarse fácilmente, pero el inóculo es un factor que presenta variaciones
debido a su origen, lo que se traduce en una baja confiabilidad de los resultados de la prueba de biodegradabilidad. Por
ello, es de suma importancia realizar una buena elección del inóculo, para así obtener las mejores respuestas la prueba de
biodegradabilidad anaerobia (PBA). Por lo anterior es importante conocer la composición microbiológica del inóculo y
conocer cual es el inóculo apropiado para la realización de las pruebas. En este trabajo se estudiaron cinco inóculos de
distintos orígenes con objeto de determinar su influencia en los resultados de las pruebas de biodegradabilidad. Se
determinó la composición microbiológica de cada uno. En particular se cuantificaron los grupos de bacterias:
fermentativas, acetogénicas productoras obligadas de hidrogeno consumidoras de propionatos y butiratos,
metanogénicas hidrogenófilas y acetoclásticas y sulfato-reductoras, por medio de la técnica de número más probable
(NMP). Se llevaron a cabo pruebas de biodegradabilidad anaerobia con dos tipos de sustrato, glucosa (fácilmente
biodegradable) y fenol (difícil de degradar) para cada uno de los inóculos evaluados. Los resultados mostraron que
existen diferencias significativas en la composición biológica de los inóculos y en la respuesta en la PBA debido al
origen del inóculo. El inóculo proveniente de una planta de tratamiento anaerobia de la industria cervecera, fue el
inóculo con la mayor cantidad de bacterias por gramo de SSV, en los seis grupos microbianos, así mismo tuvo la mejor
respuesta de para los dos sustratos evaluados en la prueba de biodegradabilidad anaerobia. Se concluye que existe una
relación entre la cantidad de bacterias y el resultado de la PBA.
Palabras clave: NMP, inóculo, biodegradabilidad, caracterización, actividad metanogénica.
INTRODUCCIÓN
Los procesos de degradación anaerobia son realizados por un consorcio de microorganismos que actúan de una forma
secuencial. Para que el proceso se realice adecuadamente debe existir una cantidad y actividad adecuada de todos los
grupos bacterianos involucrados puesto que el producto de las reacciones de un grupo sirve de sustrato para el siguiente,
así se mantiene un equilibrio en las velocidades de formación y eliminación de intermediarios evitando así su
acumulación. Los grupos que llevan a cabo estas reacciones son las bacterias fermentativas, acetogénicas,
metanogénicas y sulfato-reductoras.
Las bacterias fermentivas son las primeras en actuar después de que se ha realizado la hidrólisis de polímeros presentes
en el agua residual (carbonatos, proteínas y lípidos) convirtiéndolos a compuestos de bajo peso molecular como
azúcares, aminoácidos, alcoholes, ácidos carboxílicos y compuestos aromáticos.. Las bacterias fermentativas
transforman estos compuestos en ácidos grasos volátiles (acetato, propionato, butirato, valerato), dióxido de carbono,
hidrógeno y células, mientras que los lípidos y los ácidos grasos de cadena larga son convertidos en ácidos grasos
volátiles, a través del mecanismo de β-oxidación (Saval y Noyola, 1996).
Posteriormente el grupo de las bacterias acetogénicas productoras obligadas de hidrógeno (OHPA) transforman los
ácidos grasos de cadena corta en acetato, dióxido de carbono, e hidrógeno. El hidrogeno es un intermediario importante
en los organismos acetogénicos, este se produce durante la fermentación de carbohidratos y otros sustratos, y en la
subsecuente degradación del ácido propiónico y otros AGVs de alto peso molecular.
Las bacterias metanogénicas acetoclásticas tienen como función el convertir el ácido acético en biogás compuesto por
metano y en menor proporción por dióxido de carbono y las metanogénicas hidrogenófilas coexisten con las bacterias
acetogénicas pues catalizan la reacción entre el hidrógeno producido por estas últimas y el dióxido de carbono para
producir metano. Estas bacterias controlan el potencial de oxido reducción (ORP) permitiendo a las bacterias
acetogénicas recuperar el NAD necesario para la producción de acetato.
Por último otro grupo que se encuentra presente en los inóculos anaerobios son la bacterias sulfato-reductoras, la
importancia de este grupo depende da la presencia de sulfatos en el agua residual a tratar. Este grupo se caracteriza por
su capacidad para reducir los sulfatos a sulfuro de hidrógeno. Algunas de estas bacterias realizan una relación sintrófica
con las OPHA (de igual forma que las bacterias metanogénicas) para la obtención de los precursores necesarios para
llevar a cabo su metabolismo. Así en presencia de sulfatos en el sustrato, las bacterias sulfatorreductoras sustituyen a las
metanogénicas.
Las pruebas de biodegradabilidad anaerobia permiten evaluar la susceptibilidad de un efluente a ser tratado por esta vía,
así mismo se pueden conocer los tiempos de latencia, los posibles efectos inhibitorios y las máximas eficiencias de
remoción esperadas durante el tratamiento del efluente (Moreno y Buitrón, 1997). Para obtener resultados confiables en
las pruebas de biodegradabilidad anaerobia existen ciertos factores que se deben cuidar, entre ellos, se encuentran las
condiciones fisicoquímicas (pH, temperatura, etc.), la composición del medio, la cantidad de sustrato a degradar, y el
inóculo. Los tres primeros factores pueden ser fácilmente controlados, pero la cantidad de inóculo es un factor que puede
variar por su origen (Nyholm et al 1984) lo que va a repercutir en la población de bacterias vivas (Thouand et al 1995) y
la adaptación de las bacterias al sustrato a degradar (Barkay y Pichard 1988, Thouand y Block 1993). El número de
células usadas en la prueba va a determinar las tasas de biodegradabilidad (Simpkins y Alexander 1984), el tiempo de
latencia (Chudoba et al 1992) y la probabilidad de que la degradación del sustrato se realice en el tiempo de duración de
la prueba (Thouand et al 1995). Por lo cual es importante controlar la cantidad de las células, en especial de organismos
degradadores presentes que se van a adicionar a la prueba (Nyholm 1991).
Por lo anterior es importante conocer la cantidad de microorganismos presentes en un inóculo, así la cuantificación de
estos microorganismos es una herramienta la cual puede ayudar a elegir el inóculo con las mejores características para
llevar a cabo una prueba de biodegradabilidad anaerobia. El objetivo de este trabajo fue estudiar cinco inóculos de
distintos orígenes con objeto de determinar su influencia en los resultados de las pruebas de biodegradabilidad. Se
determinó la composición microbiológica de cada uno.
METODOLOGÍA
Fuentes de inóculo
Se estudiaron cinco inóculos de distintos orígenes (tabla 1). Cada inóculo fue caracterizado con el fin de conocer las
condiciones iniciales para cada inóculo: La concentración de sólidos suspendidos totales (SST), concentración de sólidos
suspendidos volátiles (SSV), concentración de sólidos suspendidos fijos (SSF) (de acuerdo a Standard Methods ,1992),
actividad metanogénica específica (AME), índice volumétrico de lodos (IVL), velocidad de sedimentación (VS), análisis
granulométrico y el potencial de oxido-reducción (ORP).
2
Tabla 1.- Fuentes de inóculo
INÓCULO
Planta de tratamiento anaerobia de la
industria cervecera
Planta de tratamiento anaerobia de una
industria química
Planta de tratamiento anaerobia
municipal
Estiércol de vaca
Planta de tratamiento de lodos
activados municipal
CLAVE
A
B
C
D
E
INFLUENTE
Aguas residuales de la industria
cervecera
Aguas residuales de la
producción de ácido tereftálico
Aguas residuales de una
universidad
Agua residual municipal
Cuantificación de bacterias anaerobias
La cuantificación de las bacterias anaerobias se llevó a cabo utilizando la técnica del número más probable (NMP)
descrita por García et. al. (1982), en la cual se contabiliza el número más probable de bacterias existentes de cada uno de
los grupos: fermentativas (F), acetogénicas productoras obligadas de hidrogeno consumidoras de propionatos (OHPAp)
y butiratos (OHPAb) metanogénicas hidrogenófilas (MH) y acetoclásticas (MA) y sulfato-reductoras (SR). La
preparación de los medios, transferencia de sustratos y técnicas de inoculación realizadas dentro de una cámara
anaerobia marca McCoy. Se realizaron 10 diluciones con 5 repeticiones por dilución para cada uno de los grupos de
cada inoculo. Los grupos F y SR se incuban durante una semana y los otros grupos se incuban de un mes a mes y medio.
Al final de la incubación se contabiliza el número de tubos de cada dilución en donde existió crecimiento microbiano, la
característica distintiva de este crecimiento en el grupo F es un color lechoso en el medio, las SR deberán mostrar un
color negro por la formación de FeS y el indicador positivo de los otros grupos es la producción de metano, la cual es
cuantificada por medio de un cromatógrafo de gases. Al tener estos resultados es posible realizar el cálculo para
determinar el número mas probable de bacterias existentes pos cada gramo de SSV.
Prueba de biodegradabilidad anaerobia
Cada prueba de biodegradabilidad anaerobia se llevo a cabo en botellas serológicas de 160 ml de acuerdo con Shelton y
Tiedje (1984). Se utilizó el medio de nutrientes según Balch et al. (1979), y se adicionó de resarzurina como indicador
de contaminación por oxígeno. Se eliminó el oxígeno en las botellas purgándolas con nitrógeno para asegurar la
obtención de ambiente anaerobio. Posteriormente se esterilizo en autoclave para lograr la completa reducción del medio.
Se inocularon 10 ml de medio, mas la cantidad de sustrato y lodo necesario para cada prueba, completando el volumen
requerido con agua reducida. La inoculación se realizó en una cámara anaerobia McCoy en condiciones de anaerobiosis.
La incubación se llevó a cabo a temperatura controlada de 35ºC, con agitación a 120 rpm por medio de un agitador
orbital. La cuantificación del biogás producido se realizó con un transductor de presión. La producción teórica de
metano se calculó empleando la ecuación de Tarvin y Brusswell (Birch et al. 1989). Cada prueba se realizó por
duplicado. Adicionalmente por cada prueba con distinto inóculo se corrieron botellas únicamente con medio y la
cantidad de biomasa necesaria, con el fin de conocer la producción endógena de metano (estas pruebas son llamadas
blancos). La cuantificación del carbono remanente se realizo por medio del análisis del carbono orgánico total al inicio y
final de la prueba con un analizador de carbono orgánico total (Shimatzu TOC 5000). Los resultados se expresan como
producción neta de metano (valores promedio), es decir restando la producción de metano en el blanco. Los resultados
obtenidos de la da la curva de producción de biogás en la prueba de biodegradabilidad anaerobia fueron el tiempo de
latencia, Tl(10) el cual es definido como el tiempo necesario para obtener el 10% de la degradación del sustrato probado y
el porcentaje de biodegradabilidad el cual es calculado por medio de la fórmula 1.
% Biod =
CE
× 100
CT
fórmula 1
donde:
%Biodeg = % de biodegradabilidad
CT = producción de CH4 teórico
CE = producción de CH4 experimental
3
RESULTADOS
Caracterización de los inóculos
La caracterización de los inóculos mostró diferencias para cada uno de los parámetros determinados, sobresaliendo las
diferencias encontradas en la actividad metanogénica específica inicial (tabla 1). La caracterización mostró que el
inóculo con un mayor número de SSV y mayor actividad metanogénica específica fue el inóculo A
Tabla 1.- Caracterización de inóculos de distintos orígenes
INÓCULO
A
B
C
D
E
SST (g/l)
SSF (g/l)
SSV( g/l)
IVL (ml/gSSV)
VS (m/h)
ORP
AME
(gCH4/gSSV.d)
Granulometría
(%):
<.6 mm
>.6 -<.42 mm
>.42-<.149 mm
>.149 mm
25.2
11.4
13.8
82.51
8.77
-312
32.7
15.3
17.4
43.23
1.019
-232.1
121.8
74.32
47.48
13.95
0.76
-258.7
28.4
17.06
11.34
----4.6
3.8
0.82
2.98
98.4
11.4
-204.6
0.48
0.42
0.34
0.14
0.23
20.32
11.37
23.49
44.73
20.47
21.33
28.87
29.36
33.2
22.3
17.9
26.6
---------
4.7
12.45
36.72
48.13
Cuantificación de bacterias anaerobias
La cuantificación de bacterias anaerobias por medio de la prueba de NMP demostró que existen diferencias en la
composición microbiológica entre cada uno de los grupos de los inóculos (figura 1). Existe una mayor cantidad de
bacterias por gramo de SSV en los grupos del inóculo A que en los demás inóculos, lo que concuerda con los resultados
de la AME mostrado en la tabla 1. La menor cantidad de cantidad de bacterias por grupo fue el de las sulfato-reductoras
debido a que las reacciones de sulfato-reducción en los inóculos evaluados no se presentaban, ya que estas reacciones
tienden a competir con las metanogénicas cuando existen sustratos propios para ellas.
bacterias / gSSV (log)
14
A
13
B
C
D
E
12
11
10
9
8
7
6
5
4
F
OPHAp
OPHAb
MA
MH
SR
Grupos
Fig. 1.- Resultados de la prueba de NMP.
4
Prueba de biodegradabilidad anaerobia
Se encontraron diferencias significativas en los porcentajes de biodegradabilidad para la glucosa para cada uno de los
inóculos evaluados. De igual manera, los tiempos de latencia observados tuvieron una gran variabilidad. El inóculo A
presentó los mejores resultados en el porcentaje de biodegradabilidad y el menor tiempo de latencia (tabla 2).
Tabla 2.- Resultados de la prueba de biodegradabilidad anaerobia con dos sustratos
glucosa y fenol (50 mg/L) y distintos inóculos (50 mgSSV/L)
INÓCULO
% biodegradabilidad
Tasa de reacción
T(10) latencia
(mmol/h)
(h)
GLUCOSA
(154 h)
A
B
C
D
E
100 ± 0.14
78.9 ± 0.12
95.2 ± 0.9
55.5 ± 0.07
35.0 ± 0.1
FENOL
(650 h)
A
56.8 ± 1.04
B
18.5 ± 0.84
C
21.5 ± 0.92
D
7.4 ± 0.52
E
16.0 ± 0.73
a.- No se llegó al 10% de degradación
1.1 ± 0.11
0.61 ± 0.08
0.99 ± 0.18
0.36 ± 0.06
0.11 ± 0.02
1.7 ± 0.3
3. 5 ± 0.36
5.6 ± 0.8
3.9 ± 0.12
8.5 ± 0.82
0.007 ± 0.001
0.004 ± 0.00
0.003 ± 0.001
0.002 ± 0.001
0.005 ± 0.002
70.8 ± 2.4
310 ± 8.4
2.3 ± 0.8
--150 ± 12.6
El inóculo A presentó los mejores resultados en el porcentaje de biodegradabilidad y el menor tiempo de latencia debido
a el mayor número de bacterias por gramo de SSV. Se puede observar en la figura 2 las curvas de producción de metano
para un sustrato fácilmente biodegradable (glucosa) en donde el inóculo C presentó el segundo mejor porcentaje de
biodegradabilidad debido a la presencia de un mayor número de bacterias metanogénicas que los inóculos B, D y E, ya
que éstas producen una mayor cantidad de metano.
0.7
milimoles de CH4
0.6
0.5
0.4
0.3
0.2
0.1
0
0
20
40
60
80
100
tiempo (h)
120
140
160
Fig. 2.- Resultados de la prueba de biodegradabilidad anaerobia. Sustrato =
Glucosa (50 mg/L), Biomasa (50 mg SSV /L), So/Xo=1.
5
Sin embargo, el tiempo de latencia fue mayor a los inóculos B y E, debido a la menor cantidad de bacterias
fermentativas las cuales dan una pauta al inicio de la degradación del sustrato. Así mismo, el inóculo E tuvo un corto
tiempo de latencia por la alta presencia de bacterias fermentativas, aunque el porcentaje de biodegradabilidad fue menor
que los otros inóculos por la baja cantidad de bacterias metanogénicas.
La figura 3 muestra las curvas de producción de metano para un sustrato difícil de degradar (fenol), en donde se que el
inóculo A tuvo la mejor respuesta en cuanto al porcentaje de biodegradabilidad y el menor tiempo de latencia, se
aprecian que los resultados concuerdan con los obtenidos con la glucosa, a excepción en el porcentaje de
biodegradabilidad del inóculo D que fue el menor para el fenol, esto se puede deber a que los sustratos a los que este
inóculo esta expuestos por su origen hacen que el fenol tenga una inhibición mayor en la producción de metano.
milimoles de CH4
1
0.9
A
B
0.8
D
E
C
0.7
0.6
0.5
0.4
0.3
0.2
0.1
0
0
100
200
300
400
tiempo (h)
500
600
Fig. 2.- Resultados de la prueba de biodegradabilidad anaerobia. Sustrato =
Fenol (50 mg/L), Biomasa (50 mg SSV /L), So/Xo=1.
Las diferencias que se presentan en los resultados de la prueba de biodegradabilidad anaerobia son debidas al la cantidad
de SSV y al origen del inóculo, ya que de este último depende la composición microbiologica del inóculo, por lo cual se
debe elegir correctamente el inóculo al realizar la prueba de biodegradabilidad anaerobia.
CONCLUSIONES
Existen diferencias significativas en la composición microbiológica de los inóculos anaerobios debido a su origen. El
inóculo de una planta de tratamiento anaerobia de una industria cervecera presentó la mayor cantidad de bacterias por
gramo de SSV. Los mejores resultados de biodegradabilidad se obtuvieron también con este inóculo. Se comprobó que
existe una relación entre la cantidad de bacterias empleadas y el porcentaje de biodegradabilidad obtenido en la prueba,
independientemente de si el sustrato estudiado es tóxico o fácilmente biodegradable. Los resultados muestran la gran
variabilidad en los resultados que se pueden obtener utilizando inóculos de distintos orígenes, incluso para un sustrato
fácilmente biodegradable como lo es la glucosa. Debido a ello se debe poner mayor énfasis en la interpretación de los
resultados de la PBA y enfocar esfuerzos para su estandarización.
Agradecimientos: Iván Moreno Andrade agradece a CONACYT y DGEP por la beca otorgada. Se agradece el apoyo
financiero proporcionado por la DGAPA-UNAM (PAPIIT IN 112800) para la realización de este proyecto.
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REFERENCIAS
APHA, AWWA, WPCF. (1992) Standard Methods for the Examination of Water and Wastewater, American Public Health
Association. 18th ed. New York.
Balch W., Fox G., Magrum L., Woese C., Wolfe R. (1979). Methanogens: Reevaluation of a unique biological group.
Microbiol. Rev. 43, 260-269.
Barkay T., Pitchard T. (1988). Adaptation of acuatic microbial communities to polluant stress. Microbiology Sci. 5, 165169.
Birtch R., Biver C., Campagna R., Gledhill W., Pagga U., Steber J., Reust H., Bontinck W. (1989). Screening of chemicals
for anaerobic biodegradability, Chemosphere, Vol. 19, 10-11, pp. 1527-1550.
García J.L., Guyot J.P., Oliver B., Trad M., Paycheng C. (1982). Ecologie de la digestion anaerobia, Cha. ORSTOM, Ser.
Biol., 45, 3-15.
Moreno G y Buitrón G.(1997) Influence of So/Xo ratio and medium composition on anaerobic biodegradability test. Proc.
of 52th Industrial Waste Conference, chap. Purdue University, 5-7 Mayo.
Moreno I. y Buitrón G. (2002). Influencia del origen del inóculo en la prueba de biodegradabilidad anerobia. XIII Congreso
Nacional de La Federación Mexicana de Ingeniería Sanitaria y Ciencias Ambientales, Guanajuato, 17-20 abril.
Nyholm N. (1991) The european system of standaized legal test for assessing the biodegradability of chemicals, Environ.
Tox. Chem., Vol. 10, 1237-1246.
Saval S. y Noyola A. (1992). Aportaciones da la biotecnología al tratamiento anaerobio de aguas residuales,
Biotecnología, Vol. 2, 5-6, 155-172.
Shelton D., Tiedje J. (1984). General method for determining anaerobia biodegradation potential, Appl. Environ. Microbiol.,
Vol. 47, 4, 850-857.
Simkins S., Alexander M. (1984) Models for mineralization kinetics with the variables of substrate concentration and
population density, Appl. Environ. Microbiol., Vol. 47, 1299-1306.
Thouand G., Block J.C. (1993) The use of precultured inocula for biodegradability test, Environ. Tech., Vol. 14, 601-614.
Thouand G., Friant P., Bois F., Cartier A., Maul A., Block J.K. (1995) Bacterial inoculum density and probability of paranitrophenol biodegradability test response, Ecotox. Environ. Safety., Vol. 30, 274-282.
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