Transformación genética de Solanum cardiophyllum mediada

XII JORNADAS DE INVESTIGACIÓN
Revista Investigación Científica, Vol. 4, No. 2, Nueva época. Mayo - Agosto 2008
ISSN 1870-8196
Transformación genética de Solanum cardiophyllum mediada
por Agrobacterium rhizogenes
Ana María Reyes Contreras
Leticia Almanza Sánchez
José C. Sánchez Pérez
Miguel Alvarado Rodríoguez
Unidad Académica de Agronomía
Universidad Autónoma de Zacatecas
Saúl Fraire Velázquez
Unidad Académica de Biología Experimental
Universidad Autónoma de Zacatecas
Resumen
Para contribuir a al preservación y al mejoramiento genético de la papita de
campo, se desarrolló una metodología de micropropagación y transformación
genética vía Agrobacterium rhizogenes. Se utilizó el medio de cultivo MurashigeSkoog con diversas concentraciones de la auxina AIA (0-0.4 mg/l), de la citocinina
BA (0-4.0 mg/l) y del ácido giberélico AG3 (0-1.0 mg/l) y un incremento del 10% en
las sales de nitrógeno, para establecer el sistema de regeneración in vitro; las
plántulas obtenidas se subcultivaron para establecer la tasa de multiplicación y
evaluar el mejor balance hormonal para su micropropagación. Para la
transformación genética se utilizó la cepa bacteriana A4 de Agrobacterium
rhizogenes, que contiene el plásmido silvestre pRiA4 y además el vector binario
pESC4. Se cocultivó a concentraciones de 107, 108 y 109 bacterias/ml con
segmentos nodales de plántulas micropropagadas. Se realizaron de manera
exitosa las pruebas histológica (GUS) y de Biología Molecular (PCR) para comprobar
la incorporación de transgenes. En esta última prueba se identificaron un
segmento de 780 pb del gen rol B del plásmido silvestre y un segmento de 517 pb
del gen nptII del vector binario.
Palabras claves: cardiophyllum, micropropagación, Agrobacterium
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Introducción
La transformación genética en plantas, es un proceso por el cual el ADN exógeno
y de interés, es introducido al núcleo de las células vegetales que pueden ser
parte de un explante en un cultivo morfogénico o protoplasto y una vez que el
ADN es introducido mediante una serie de procedimientos, se regenera una planta
completa
transformada
genéticamente,
partiendo
de
dichas
células
transformadas (van der Salm et al., 1996).
Existen varios métodos para incorporar genes exógenos al genoma de las
células vegetales y uno de los más utilizados es mediante Agrobacterium
rhizogenes (Tzfira, 2008). La técnica requiere el desarrollo previo de una
metodología de regeneración in vitro de la especie vegetal que se desee
transformar genéticamente (Pérez et.al., 1999).
Entre las especies no cultivadas en peligro de extinción se encuentran las
papas silvestres, consideradas entre las primeras plantas utilizadas como alimento
por los antiguos pobladores de América (Ugent, 1987) aunque, actualmente el uso
de implementos de labranza modernos, provocan abatimiento de las poblaciones
de estas especies arvenses (Davis y Bye, 1982), siendo las más afectadas en el
altiplano Potosino-Zacatecano Solanum cardiophyllum y S. ehrenbergii.
Estas especies silvestres muestran cualidades que las distinguen de otras
especies de papas, tales como la resistencia a condiciones de baja humedad y
un alto valor nutrimental, pues contiene 3.2% de proteína, alta riqueza en
carbohidratos y vitamina C, además de una gran resistencia a la agresividad de
patógenos como Phytophtora infestans
y Alternaria solani (Galindo, 1982). Las
especies arvenses S. brachistotricum, S. cardiophyllum Lindley subesp. Ehrenbergii
Bitter resisten el ataque a todos los virus que afectan a las variedades de S.
tuberosum, por lo que son una fuente potencial de germoplasma para programas
de fitomejoramiento de papa cultivada (Luna-Cabazos et al, 2007).
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Objetivos
Desarrollar una metodología para transformar genéticamente la papa de campo
Solanum cardiophyllum vía Agrobacterium rhizogenes. Para lograr lo anterior, los
objetivos particulares planteados son los siguientes:
•
Determinar un balance de reguladores del crecimiento vegetal para
establecer, inducir brotación múltiple y enraizar in vitro la papa de campo.
•
Desarrollar una metodología para transferir genes exógenos al genoma de
la papa de campo a través de Agrobacterium rhizogenes.
•
Realizar pruebas histoquímicas y de Biología Molecular para comprobar la
transformación genética.
Materiales y métodos
La investigación se realizó entre marzo de 2006 y abril de 2008 en el laboratorio de
Cultivo de Tejidos en la Unidad Académica de Agronomía y en el Departamento
de Biología Molecular de Plantas de la Unidad Académica de Biología
Experimental, ambos pertenecientes a la Universidad Autónoma de Zacatecas.
Se utilizaron papitas de monte provenientes del municipio de Pinos, Zac, haciendo
una selección previa de las que se encontraron en mejor estado físico, de color
claro y superficie regular.
Se empleó la bacteriana A4 de A. rhizogenes, la cual es del tipo agropina. Esta
bacteria contiene el plásmido silvestre pRiA4 y el vector binario pESC4.
Los tubérculos se lavaron en agua corriente con detergente y cepillo de fibras
suaves. Se secaron, posteriormente se les dio un baño en una solución de NitrasanD al 2% y con 300 mg/l de AG3 durante una hora y se secaron al medio ambiente.
Luego se colocaron en frascos cerrados y se mantuvieron a 4°C hasta que se
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observó la aparición de yemas en los tubérculos, aproximadamente a las dos
semanas.
Los tubérculos se colocaron en una solución de Nitrasan-D al 1%, en agitación
continua durante 1 h, luego se enjuagaron con agua destilada estéril.
Posteriormente se repitió el mismo procedimiento pero en una solución de
kanamicina al 0.2 %. Durante este proceso, cada 5 min se dio un pulso de 1 min
de vacío.
Se aislaron las yemas y a continuación se lavaron con detergente y agua
corriente, utilizando un cepillo de cerdas suaves. Posteriormente se llevaron a
condiciones de asepsia, bajo campana de flujo laminar, para esterilizar
externamente las yemas en una solución de alcohol etílico al 70% durante un
minuto, enjuagándolas tres veces con agua destilada estéril, a continuación se
colocaron en una solución acuosa de hipoclorito de sodio comercial al 10% (V/V)
durante 30 minutos, y finalmente se enjuagaron 4 veces con agua destilada estéril.
Se eliminaron las partes dañadas por los agentes desinfectantes, obteniéndose
yemas de aproximadamente 4 mm, las que se inocularon en frascos tipo gerber
con el medio de cultivo MS (Murashige y Skoog, 1962) sin reguladores del
crecimiento vegetal, con 30 g/l de sacarosa y gelificado con 7.5 gr/l de Agar, los
que previamente se esterilizaron en autoclave a 121ºC durante 15 min. Se colocó
un explante por frasco con 30 ml de medio de cultivo. A las seis semanas, las
yemas que tuvieron una respuesta favorable se subcultivaron en el medio MS
suplementado con las combinaciones de BA y AIB a concentraciones de 0-4 mg/l
y 0-0.4 mg/l respectivamente, con el fin de inducir brotación múltiple en los
explantes.
Con el propósito de obtener brotes más vigorosos para llevar a cabo el
enraizamiento de plántulas y el proceso de transformación genética, se sembraron
segmentos nodales de los multiplicados en el paso anterior, en el medio de cultivo
MS, suplementado con diversas concentraciones de 0 y 100 mg/l de glutamina, y
de 0 y 1 mg/l de AG3 y 10% más de las sales de nitrógeno del medio MS. A las seis
semanas se realizó la evaluación.
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Para
el
cocultivo
(papita-bacteria)
se
seleccionaron
brotes
de
aproximadamente 4 cm de longitud. La bacteria se sembró en el medio YMA
(sólido), se cultivó durante 48 h a 28ºC, para multiplicarla. Luego ésta sembró en el
medio YMB (líquido), el que se mantuvo en agitación a 120 rpm, a una
temperatura de 28°C durante 48-56 h. hasta que alcanzó una concentración igual
o ligeramente mayor de 1x109 bacterias/ml. La concentración se determinó a partir
de la absorbancia del cultivo bacteriano a una longitud de onda de 620 nm en un
espectrofotómetro (Jofre-Garfias et al, 1997). Se realizaron diluciones para obtener
concentraciones de 1x108 y 1x107 bacterias/ml. Los brotes se colocaron durante 5
minutos en el medio líquido bacteriano con las tres diferentes concentraciones,
realizando tres perforaciones con una aguja de jeringa a cada explante. A las 72
h se enjuagaron los explantes en agua destilada estéril, se secaron en papel filtro
estéril y, se colocaron en el medio de cultivo MS suplementado con 300, 500 y
1,000 mg/l del antibiótico cefotaxima, para eliminar las bacterianas. En este medio
los explantes permanecieron durante 72 h, posteriormente éstos se transfirieron al
medio de cultivo MS sin antibióticos y sin reguladores del crecimiento, donde
permanecieron 4 semanas a una temperatura de 24ºC y un fotoperiodo de 16 h
de luz por 8 de oscuridad.
La transformación genética de las plántulas inoculadas, se determinó
mediante tres formas:
Fenotipo.- Se comparó el fenotipo de los explantes inoculados con A. rhizogenes y
los explantes usados como control negativo
Prueba de GUS (Prueba histoquímica). El vector binario transfiere la región GUS
(gen uid A), que es un gen reportero, que sintetiza la enzima ß-Glucoronidasa, por
lo que se tomó una muestra de raíces axénicas de cada una de las plántulas. Se
pusieron en contacto con el reactivo X-Gluc, el cual contiene el sustrato de la
mencionada enzima. Se incubaron segmentos de las raíces adventicias a 37°C
durante 48 h de cada una de las plántulas.
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Análisis molecular
Se realizó la extracción del ADN de las raíces pilosas obtenidas en el cocultivo,
empleando el método llamado CTAB (Doyle and Doyle, 1987).
Para realizar esta prueba se adicionó a cada muestra de ADN a amplificar:
Agua desionizada estéril
Buffer TAE
Desoxinucleótido
15.75 μl
2.50 μl
2.00 μl
Primers up
1.25 μl para rolB y 1.25 μl para nptII
Primers low
1.25 μl para rolB y 1.25 μl para nptII
Templado ADN
1.00 μl
Taq ADN polimerasa
2.50 μl
Para la amplificación se programaron 30 ciclos bajo las siguientes condiciones:
•
Desnaturalización del templado a 94 °C 1 minuto
•
Alineamiento de primers a 55 °C por 2 minutos
•
Extensión de la cadena a 72°C por 3 minutos
Los productos de la amplificación se analizaron en un gel de agarosa al 1.2%
cargando de 5-10 μl del producto de PCR.
Resultados
Regeneración in vitro
El tratamiento previo a la desinfección superficial permitió realizar una esterilización
más eficiente. Durante la etapa de establecimiento hubo una respuesta del
15.6%, solamente el 1 % se contaminó con bacterias, y el resto no tuvo respuesta.
Las plántulas generadas en la etapa de establecimiento, se segmentaron para
aislar los entrenudos, desechando la parte basal y apical. Las yemas se transfirieron
a los medios de cultivo con diversas concentraciones de BA y AIB. Luego de seis
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semanas los explantes presentaron un crecimiento de aproximadamente de 5 cm,
con diversas cantidades de brotes adventicios. El mejor resultado que se obtuvo,
estadísticamente, fue en el medio de cultivo suplementado con 4 mg/l de BA y 0.4
mg/l de AIB, el cual generó un promedio de 4.7 brotes por explante. En el
tratamiento control no hubo la aparición de brotes adventicios; en los tratamientos
que tuvieron AIB sin la citocinina se generaron callos en la parte basal, sin brotes
adventicios. En el resto de los tratamientos se generaron brotes pero en menores
cantidades que el primer tratamiento señalado. Por lo que en lo sucesivo este
tratamiento fue el que se usó para la micropropagación de la papita de campo,
obteniéndose resultados similares en los siguientes subcultivos.
Se obtuvieron brotes más vigorosos luego de tres subcultivos, en el medio
suplementado con 3 mg/l de BA con 100 mg/l de glutamina. Los tratamiento con
AG3 produjeron explantes muy elongados y sin vigor. El uso de un 10% más de
sales de nitrógeno tampoco indujo brotes más vigorosos. Los medios de cultivo sin
reguladores del crecimiento vegetal (control), 1 mg/l de AIB sin BA y 2 mg/l AIB
también sin BA, generaron sistemas radiculares abundantes y en los tres casos de
una manera similar. En el resto de los tratamientos se produjeron raíces en menor
cantidad y más pequeñas, excepto en el tratamiento con 3 mg/l sin BA, donde se
generó un callo en la parte basal de los explantes.
Se determinó la capacidad de aclimatación de 100 plántulas vigorosas con
un sistema radicular desarrollado, de aproximadamente 8 cm de largo. Se logró
concluir la etapa de aclimatación de manera favorable, en 83 plantas, luego de
dos semanas.
Inoculación de explantes y producción de raíces pilosas
Las concentraciones bacterianas 108 y 109 bacterias/ml indujeron la generación de
raíces pilosas abundantes en un 95% de los expantes, mientras que las raíces
pilosas generadas usando el cultivo bacteriano de 107, fueron escasas y
pequeñas. En el tratamiento 109 bacterias/ml se apreciaron raíces más largas y
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más abundantes. La eliminación de bacterias de los explantes se logró en su
totalidad en los medios de cultivo que se prepararon con 1,000 mg/l del
antibiótico cefotaxima, mientras que en las concentraciones menores, la bacteria
se apreció a las cuatro semanas después de que los explantes se subcultivaron en
medios sin antibiótico.
Prueba histoquímica
Se analizaron 38 muestras, de las cuales 35 resultaron positivas a la prueba de GUS.
Todas las raíces que fueron analizadas se mantuvieron en incubación bajo luz
continua, siendo esta condición importante ya que el promotor Cab del vector
binario pESC4 que controla al gen uidA, es inducible por luz.
Las 3 muestras negativas a la prueba de GUS pero que presentaron un alto
contenido de raíces pilosas, puede indicar que no fue transferido el gen reportero
uid A que sintetiza la enzima ß-Glucoronidasa, sin embargo, es posible que el gen
rol B del plásmido de RiA4 fue incorporado al genoma del tejido de la papa de
campo.
Las raíces tomadas de plántulas axénicas no inoculadas con la bacteria no
mostraron actividad de GUS.
Prueba molecular mediante PCR
Al finalizar el proceso de amplificación del gen de interés, los productos obtenidos
se analizaron en un gel de agarosa al 1.2% cargando de 5-10 μl del producto de
PCR.
En la primera cavidad del gel se colocó 1 μl del marcador de peso molecular
conocido de 200, 400, 600, 800, 1000, 2000. 4000 pB. En la segunda y quinta
cavidades, se colocó 1 μl del amplificado de la PCR. En la sexta se colocó el
mismo volumen, pero de ADN genómico de la muestra biológica no sometida a
PCR. El tercer y cuarto pozos no se utilizaron.
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Posteriormente de corrido el gel, se fotografió y se pudieron observar las bandas
correspondientes al marcador de peso molecular, así como la presencia de las
bandas correspondientes a los segmentos de los genes rol B y nptII de 780 y 517
pB respectivamente. La presencia de estas bandas, junto con las pruebas
anteriores, son evidencias irrefutables de la incorporación de transgenes a las
células de la papita de campo por parte de Agrobacterium rhizogenes.
Conclusiones
1. Se estableció un sistema eficiente de regeneración in vitro de la papita de
campo.
2. Se demostró que Solanum cardiophyllum es susceptible de ser transformada
genéticamente por medio de Agrobacterium rhizogenes.
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