DESARROLLO DE LOS SISTEMAS DE REGENERACION in vitro Y

DESARROLLO DE LOS SISTEMAS DE REGENERACION in vitro Y TRANSFORMACIÓN
GENÉTICA DEL NARANJO DULCE cv. VALENCIA (Citrus sinensis [L.] Osbeck)
BIOL. CARLOS ANTONIO DAVILA FIGUEROA
DR. EUGENIO PÉREZ MOLPHE BALCH
Universidad Autónoma de Aguascalientes
INTRODUCCIÓN
Los cítricos son los frutales más extensamente
cultivados alrededor del mundo. La Naranja Dulce
representa aproximadamente el 58% y 64% de la
producción citrícola mundial y nacional
respectivamente. El cultivo de los cítricos se
enfrenta a serios problemas por lo que el
incremento en la producción es críticamente
dependiente de la disponibilidad de cultivares
superiores. Las cruzas tradicionales como una
estrategia para el mejoramiento genético de
cultivares de cítricos enfrenta serias limitaciones
(Conejero 2003). La Ingeniería Genética de
Plantas representa una alternativa muy atractiva
para el fitomejoramiento de cítricos. Para utilizar
esta tecnología es necesario desarrollar antes los
sistemas de regeneración y transformación para la
introducción de genes útiles en cultivares
específicos (Pérez-Molphe-Balch & Ochoa-Alejo
1998).
OBJETIVOS
El objetivo de esta investigación fue el desarrollar
los sistemas de regeneración in vitro y
transformación
genética
mediada
por
Agrobacterium rhizogenes del Naranjo Dulce cv.
Valencia (Citrus sinensis (L.) Osbeck).
MATERIALES Y MÉTODOS
Para la obtención de raíces transformadas se
evaluaron diferentes tiempos de cocultivo y
concentraciones de acetosiringona de segmentos
internodales de tallo de plántulas germinadas in
vitro con A. rhizogenes cepa A4 con el plásmido
ESC4, el cual contiene los genes nptII y gus. Se
evaluó el efecto de las condiciones de incubación
en el crecimiento de las raíces transformadas. Para
la regeneración se utilizó el mismo tipo de
explantes sometidos a diferentes combinaciones
de reguladores del crecimiento vegetal para
observar su efecto en la inducción de brotes
adventicios. Con los resultados se llevó a cabo un
análisis estadístico ANOVA para determinar
diferencias significativas entre los tratamientos y
compararlos de acuerdo a la Prueba de
Comparación Múltiple Tuckey Kramer. El mejor
tratamiento de organogénesis fue utilizado para la
regeneración de brotes transformados. La
presencia de los genes foráneos se efectuó por el
ensayo histoquímico para la enzima GUS y por
análisis PCR.
RESULTADOS
La mayor eficiencia se obtuvo al usar un
preacondicionamiento de los explantes con un
pulso de 45 min con AS y 72 h de cocultivo en
medio suplementado con AS con 67% de los
explantes con raíces transformadas con un
promedio de 5.18 raíces por explante. Las raíces
transformadas se desarrollan mejor bajo
condiciones de fotoperíodo de 16 h en medio de
selección sólido. El mejor tratamiento de
organogénesis en tejidos no transformados fue con
explantes heridos longitudinalmente, inoculados
de manera horizontal en u medio con BA:NAA
(7.5:1 mg L–1) en el cual 92% de los explantes
diferenciaron brotes en un promedio de 5.13. La
regeneración de brotes transformados se obtuvo
en segmentos de raíz transformada cultivados en
medio con 2.5 mg L–1 de BA (BA). La actividad
de gus fue evidente en las raíces transformadas y
los brotes y plantas regeneradas. La presencia de
los genes foráneos fue confirmada por análisis
PCR.
CONCLUSIONES
El cocultivo de 72 hrs en medio líquido probó ser
suficiente para obtener la mejor eficiencia de
transformación y los menores problemas para
eliminar a la bacteria. La adición de AS al medio
de cocultivo facilitó que Agrobacterium
rhizogenes fuera más eficiente al mediar la
transformación de naranja dulce y el
preacondicionamiento de los explantes incrementó
el número de células competentes para la
transformación por explante. Los cultivos de
raíces en medio sólido, bajo condiciones de
iluminación continua, tienen un crecimiento más
acelerado que los cultivos en medio líquido. Los
genes transferidos influencian el efecto de los
reguladores sobre el proceso de organogénesis. La
metodología desarrollada puede ser utilizada para
la introducción de genes de interés agronómico en
el Naranjo Dulce.
BIBLIOGRAFÍA
Conejero-Tomás V (2003) Draft of International
Citrus Genome Consortium. White Paper
Pérez-Molphe-Balch
E
(2003)
Genetic
Transformation and Regeneration of Citrus
species. In: Jaiwal Pawan K & Singh Rana P (eds)
Improvement of Fruit Crops. Plant Genetic
Engineering Vol. 6, SCI TECH PUBLISHING
LLC, USA 2003.