aplicación resumen y explicación fundamento de la prueba

Kit de Recuento
LeukoSure™
COMPOSICIÓN DE LOS REACTIVOS
El Reactivo de Lisis LeukoSure contiene <0.1% de
cianuro potásico, <0.1% de NaN3, detergentes no iónicos,
solución salina y estabilizadores.
Para el recuento de
leucocitos en hemoderivados
leucorreducidos
175621 - 200 determinaciones
6607124 - 200 determinaciones
PN 175624-C
El Reactivo de Tinción LeukoSure contiene yoduro de
propidio 50 µg/mL (<0.5% de yoduro de propidio),
ARNasa [Tipo III-A, Pancreasa Bovina] (4 KU/mL), <0.1%
de NaN3, solución salina y estabilizadores.
Las Fluoroesferas LeukoSure consisten en fluoroesferas
de poliestireno de 10 µm (diámetro nominal) con
fluorocromo en suspensión acuosa que contiene
surfactante y formaldehído al 1%. La concentración
indicada de las Fluoroesferas LeukoSure se deriva de
múltiples análisis repetidos con un analizador de
partículas COULTER Modelo Z1/Z2.
FLUORESCENCIA
Yoduro de Propidio
Fluoroesferas LeukoSure
APLICACIÓN
El Kit de Recuento LeukoSure consta de una serie de
reactivos utilizados para preparar y contar mediante
citometría de flujo los leucocitos en los productos
eritrocitarios y plaquetarios leucorreducidos.
RESUMEN Y EXPLICACIÓN
Con objeto de prevenir diversos eventos posttransfusionales deletéreos, los productos sanguíneos
eritrocitarios (ERI) y plaquetarios son procesados para
eliminar el componente de leucocitos (LEU).1 El nivel
actualmente aceptado de LEU residuales es menor de
3.3 LEU/µL para una unidad de 300 mL de sangre.2, 3
Éste es inferior al nivel de detección de la mayoría de los
métodos típicos de recuento.4 El Kit de Recuento
LeukoSure está configurado para utilizar la sensibilidad de
la citometría de flujo en el recuento de los leucocitos
residuales a niveles que garanticen el control de calidad
de la sangre leucorreducida.5, 6
FUNDAMENTO DE LA PRUEBA
La muestra es lisada y permeabilizada utilizando el
Reactivo para Lisis LeukoSure a fin de eliminar los
eritrocitos (ERI) y preparar las células para la subsiguiente
adición del Reactivo para Tinción LeukoSure, el cual
contiene yoduro de propidio y ARNasa (para eliminar el
ácido ribonucleico, o ARN). En ausencia de ARN, el
yoduro de propidio se une únicamente al ácido
desoxirribonucleico (ADN) de doble cadena de modo que
las células nucleadas de la muestra emiten una cantidad
de fluorescencia proporcional a su contenido de ADN. El
citómetro de flujo mide la fluorescencia de cada una de
las células teñidas mientras pasan a través del rayo láser.
Dado que las plaquetas y los eritrocitos maduros no
contienen ADN, las células teñidas representan el
componente leucocitario de la sangre.
El método de recuento consiste en mezclar un volumen
(100 µL) de una concentración de Fluoroesferas
LeukoSure establecidos con un volumen idéntico de la
muestra a analizar. Tras el análisis, se calcula el recuento
absoluto de la muestra, que representa el número
absoluto de leucocitos en dicha muestra.
REACTIVOS INCLUIDOS EN EL KIT
Kit de Recuento LeukoSure
PN 175621 (200 determinaciones)
Reactivo de Lisis LeukoSure, 1 x 20 mL
Reactivo de Tinción LeukoSure, 2 x 70 mL
Fluoroesferas LeukoSure, 1 x 20 mL
Excitación a 488 nm.
Emisión a 560-630 nm.
Emisión a 525-700 nm.
Excitación a 488 nm.
PRECAUCIONES
1. El Reactivo de Tinción LeukoSure contiene yoduro de
propidio, el cual es un agente mutagénico,
probablemente carcinógeno y debe manipularse con
precaución. Es preciso utilizar guantes impermeables
siempre que se manipule este reactivo.
2. El Reactivo de Lisis LeukoSure contiene cianuro
potásico. En contacto con un ácido puede emitir un
gas tóxico. Evite el contacto con los ácidos.
3. Los Reactivos de Tinción y Lisis LeukoSure contienen
azida sódica. Bajo condiciones ácidas ésta produce
ácido hidrazóico, un compuesto extremadamente
tóxico. Los compuestos de azida deben irrigarse con
agua corriente mientras son desechados. Estas
precauciones se recomiendan para evitar los
depósitos en las tuberías metálicas en las que pueden
desarrollarse condiciones explosivas. En caso de
contacto con la piel o los ojos, lavar inmediata y
abundantemente con agua.
4. Las Fluoroesferas LeukoSure contienen formaldehído
al 1%. Evite el contacto con la piel y los ojos pues el
formaldehído puede causar efectos irreversibles en
estos tejidos. No inspire los vapores. Utilice elementos
de seguridad apropiados, como guantes y protección
ocular.
5. Debe eliminarse todo el aluminio del selado térmico de
la parte superior del recipiente de Fluoroesferas
LeukoSure. El aluminio residual reacciona con el
formaldehído y puede causar un cambio en el aspecto
de las fluoroesferas.
6. Una vez abierto, el recipiente de las Fluoroesferas
LeukoSure debe conservarse firmemente tapado y
en posición vertical para impedir la evaporación o el
escape; de lo contrario, podrían obtenerse
resultados erróneos.
7. Las Fluoroesferas LeukoSure se sedimentan tras
prolongados periodos. Verifique que éstas se
encuentran completamente resuspendidas antes
de su uso. Evite agitar excesivamente a fin de
minimizar la formación de burbujas de aire. Incluir en
la pipeta burbujas de aire podría dar lugar a
resultados erróneos.
8. Utilice una pipeta calibrada de desplazamiento
positivo o de repetición para dispensar los
componentes de la muestra leucorreducida y las
Fluoroesferas LeukoSure; de lo contrario, podrían
obtenerse resultados erróneos.
9. Para garantizar un preciso y exacto pipeteo la muestra
leucorreducida y de las Fluoroesferas LeukoSure, siga
las técnicas de pipeteo recomendadas por el
fabricante; no hacerlo podría ocasionar resultados
erróneos.
1 de 6
10. Cada lote de Fluoroesferas LeukoSure posee una
concentración específica. Verifique el uso de la
concentración indicada correcta al determinar los
resultados del recuento absoluto.
11. Asegure un recuento mínimo de 10,000 Fluoroesferas
LeukoSure; de lo contrario, podrían obtenerse
resultados erróneos.
12. Los especímenes, las muestras y todo el material que
entre en contacto con ellos debe considerarse capaz
de transmitir infecciones y en consecuencia debe
manipularse y desecharse tomando las debidas
precauciones.
13. Nunca pipetee con la boca; evite el contacto con la
piel y las mucosas.
14. Las muestras teñidas y lisadas deben ser analizadas
con el citómetro de flujo en las 2 horas siguientes a la
adición de las Fluoroesferas LeukoSure.
15. No utilice los reactivos después de la fecha de
caducidad impresa en las etiquetas de los viales.
16. Minimice la exposición de los reactivos a la luz
durante su conservación o incubación.
17. Evite la contaminación microbiana de los reactivos
pues podrían obtenerse resultados erróneos.
18. Al manipular estos reactivos siga las Buenas Prácticas
de Laboratorio recomendadas.
19. Posibilidad de efectos irreversibles.
20. Posibilidad de sensibilización en contacto con la piel.
21. Úsense indumentaria y guantes adecuados y
protección para los ojos/la cara.
22. En caso de contacto con los ojos, lávense inmediata y
abundantemente con agua y acúdase a un médico.
23. En caso de accidente o malestar, acúdase
inmediatamente al médico (si es posible, muéstresele
la etiqueta).
24. Úsese únicamente en lugares bien ventilados.
PREPARACIÓN DE LOS REACTIVOS
Los reactivos del Kit de Recuento LeukoSure no precisan
preparación pudiendo ser utilizados directamente de sus
recipientes. Agite durante 10 a 12 segundos las
Fluoroesferas LeukoSure. Permita que las burbujas se
disipen antes de pipetear los reactivos. Elimine todo el
aluminio del sellado térmico de la parte superior del
recipiente de las Fluoroesferas LeukoSure.
CONDICIONES DE ALMACENAMIENTO
Y ESTABILIDAD
Conservados a 2-8°C, los reactivos del Kit de Recuento
LeukoSure son estables hasta la fecha de caducidad
impresa en la etiqueta del vial.
Una vez abiertos los recipientes, los Reactivos de Tinción
y Lisis LeukoSure son estables durante 60 días.
Tras abrir el recipiente, las Fluoroesferas LeukoSure son
estables durante 30 días.
Nota: Una vez abierto el recipiente, las Fluoroesferas
LeukoSure deben conservarse en posición vertical con
objeto de impedir posibles escapes.
Nota: En caso que se requieran fluoroesferas LeukoSure
adicionales, pueden pedirse con el nombre LeukoSure
Fluorospheres, PN 6607124.
Los reactivos del Kit de Recuento LeukoSure deben
alcanzar la temperatura ambiente (20-25°C) antes de
su uso.
No congelar.
Minimizar la exposición a la luz.
SIGNOS DE DETERIORO
Todo cambio en el aspecto físico de estos reactivos o
cualquier variación importante en los valores obtenidos en
las muestras de control puede indicar deterioro; en ese
caso, estos reactivos no deben ser utilizados.
El aspecto normal del Reactivo de Tinción LeukoSure es
un líquido rosa o rojizo transparente.
El aspecto normal del Reactivo de Lisis LeukoSure es un
líquido marrón claro transparente. La incapacidad de este
reactivo para lisar los eritrocitos puede indicar deterioro.
El aspecto normal de las Fluoroesferas LeukoSure es un
líquido turbio incoloro. Durante el análisis, la aparición de
poblaciones fluorescentes secundarias que representen
más de 20% de la población total puede indicar deterioro.
exterior de la punta de la pipeta evitando la abertura.
Agite suavemente.
8. Las muestras deben ser analizadas en las
2 horas siguientes a la adición de las
Fluoroesferas LeukoSure.
OBTENCIÓN Y PREPARACIÓN
DEL ESPÉCIMEN
ANÁLISIS POR CITOMETRÍA DE FLUJO
Las muestras de eritrocitos recogidas en CPD (Citrato
Fosfato Dextrosa), CPDA (Citrato Fosfato Dextrosa
Adenina) o CPD2 (CPDA más Adsol) deben
conservarse refrigeradas (2-8°C) hasta ser analizadas.
Las muestras de plaquetas recogidas en ACD
(Ácido Citrato Dextrosa) deben conservarse a temperatura
ambiente (20-25°C) hasta ser analizadas. Las muestras
deben teñirse durante las 48 horas siguientes a
la leucorreducción.
Las muestras teñidas deben conservarse a 2-8°C.
Las muestras teñidas antes de 24 horas de la
leucorreducción pueden ser analizadas en el transcurso
de las siguientes 24 horas. Las muestras teñidas 24 a
48 horas después de la leucorreducción deben ser
analizadas antes de 2 horas.
Las muestras teñidas deben alcanzar la temperatura
ambiente antes del análisis.
Una vez añadidas las Fluoroesferas LeukoSure, las
muestras son estables durante 2 horas.
MATERIAL SUMINISTRADO
Kit de Recuento LeukoSure,
PN 175621-200 determinaciones
MATERIAL NECESARIO NO INCLUIDO
Pipeta de repetición (100 µL) y puntas, o
Pipeta de desplazamiento positivo (100 µL) y puntas
Cronómetro
Tubos de ensayo de 12 x 75 mm
Agitador vórtex
Citómetro de flujo (serie COULTER EPICS® XL-MCL,
XL, Cytomics FC o equivalente)
Fluoroesferas Flow-Set, PN 6607007
Fluoroesferas Flow-Check, PN 6605359
Líquido envolvente IsoFlow, PN 8547008
Agente de limpieza COULTER CLENZ®, PN 8546929
Kit de Control de Plaquetas Leuko-Trol,
PN 175651, o
Kit de Control de ERI Leuko-Trol, PN 175658
Nota: En caso de precisar una cantidad adicional de
Fluoroesferas LeukoSure, solicitar Fluoroesferas
LeukoSure, PN 6607124.
PROCEDIMIENTO DE LISADO Y TINCIÓN
1. Rotule un tubo de ensayo de 12 x 75 mm para cada
espécimen o células de control Leuko-Trol a analizar.
2. Dispense 100 µL de la muestra en cada tubo. Antes
de la dispensación, seque cuidadosamente la parte
exterior de la punta de la pipeta evitando la abertura.
3. Agregue al primer tubo 100 µL de Reactivo de
Lisis LeukoSure; agite seguidamente durante 5 a
10 segundos.
4. Agregue 500 µL de Reactivo de Tinción LeukoSure al
tubo; agite inmediatamente.
5. Incube a temperatura ambiente (20-25°C), en la
oscuridad, durante 15 minutos.
6. Repita los pasos 2 a 5 para cada tubo de muestra.
7. Inmediatamente antes del análisis agregue 100 µL de
Fluoroesferas LeukoSure a cada uno de los tubos de
muestra (use la pipeta previamente empleada). Antes
de la dispensación, seque cuidadosamente la parte
Nota: Para obtener óptimos resultados debe pasarse
entre las muestras un tubo con líquido
envolvente IsoFlow.
Ajuste del Instrumento
1. Verifique que el citómetro de flujo se encuentra
debidamente alineado y estandarizado en cuanto a
dispersión de la luz e intensidad de la fluorescencia.
Consulte las instrucciones en los manuales del
producto o la sección de ayuda en línea.
2. Elabore un protocolo para las Fluoroesferas Flow-Set
que histogramas monoparamétricos para la dispersión
de la luz (uno para FS lineal y otro para SS lineal) y
para cada uno de los tres parámetros de fluorescencia
(LOG FL1, LOG FL2 y LOG FL3).
3. Elabore una región lineal dentro de cada histograma.
4. Utilice la región del histograma de FS como región de
selección (“gate”) para los histogramas de SS y de
fluorescencia.
5. Ajuste la compensación de color a 0% para todos los
parámetros de fluorescencia.
6. Ajuste el discriminador de FL3 a 3.
7. Ajuste una condición de parada (“STOP”) en 10,000
eventos en alguno de los histogramas de
fluorescencia.
8. Mientras analiza la muestra de Flow-Set, ajuste los
valores de los PMT para situar los picos de dispersión
y fluorescencia dentro de los siguientes límites:
Regiones diana para el Flow-Set
Parámetro
Intervalo
FS
50 - 73
SS
506 - 544
LOG FL1
0.48 - 0.66
LOG FL2
51 - 63
LOG FL3
5.4 - 6.6
Protocolo para el Análisis de las Muestras:
Elabore los siguientes histogramas:
9. Histograma 1, correspondiente a SS frente a FS
(véase la Figura 1).
10. Histograma 2, correspondiente a FL3 frente a cociente
(RATIO) (FL3 / FL2) (véase la Figura 2).
11. Histograma 3, correspondiente a LOG FL1 frente
a Contaje.
Fundamento de los histogramas:
El Histograma 1 se emplea para la confirmación visual de
la adquisición por dispersión de la luz. El Histograma 2
utiliza la mayor fluorescencia de los leucocitos en FL2 y
FL3 para discriminar adicionalmente entre los leucocitos
nucleados y las plaquetas, eritrocitos o detritus. Los
eventos que se sitúan en la diagonal de este histograma
representan detritus inespecíficos y son eliminados del
análisis. El Histograma 3 corresponde a la región de las
Fluoroesferas LeukoSure utilizadas para calcular el
recuento absoluto de leucocitos.
Creación de Regiones:
12. Genere una región CAL lineal (A) que abarque el pico
de Fluoroesferas LeukoSure en el Histograma 3.
Importante: Confirme que la región CAL abarca
totalmente y exclusivamente la población de
Fluoroesferas LeukoSure individuales y que ha
utilizado la correcta concentración indicada x 10.
13. Genere una región amorfa (B) en el Histograma 2
para incluya la población leucocitaria teñida con PI.
14. El Histograma 1 no precisa una región de análisis.
2 de 6
15. Utilice un criterio negativo de selección [-A, o NO
(CAL)] en los Histogramas 1 y 2 para eliminar las
Fluoroesferas LeukoSure de los histogramas.
16. Utilice una compuerta negativa [-B, o NO (B)] para
contar únicamente las fluoroesferas del
Histograma 3. Establezca una orden de parada en
10,000 eventos en este histograma.
Ajuste del instrumento:
17. Antes de analizar las muestras o controles, ajuste el
discriminador de FL3 a 50.
18. Transfiera los valores de alto voltaje y las ganancias
obtenidas tras completar el protocolo Flow-Set al
Protocolo de Análisis de la Muestra.
19. Fije el tiempo de detención en 300 segundos.
20. Las muestras pueden analizarse a velocidad de flujo
ALTA (HIGH).
21. Guarde el Protocolo de Análisis de la Muestra.
Figura 1: El Histograma 1 muestra SS frente a FS y es
utilizado para confirmar visualmente la adquisición.
Los histogramas representan la adquisición del
Leuko-Trol Plaquetas Nivel H en un EPICS XL/XL-MCL
con el Software System II™ Versión 3.0 (a) y un FC
500 con el Software RXP (b).
a
b
b
a
Linealidad en el rango dinámico para ERI con LEU
marcados en EPICS XL/XL-MCL
400
Recuentos absolutos recuperados
(LEU/uL)
Los resultados óptimos se obtienen mediante un pipeteo
preciso y exacto tanto de la muestra como de las
Fluoroesferas LeukoSure. Para confirmar si la técnica
utilizada para dispensar la muestra y las Fluoroesferas
LeukoSure es precisa, efectúe el siguiente procedimiento
de verificación:
28. Coloque un tubo de ensayo y un recipiente de pesada
en una balanza analítica.
29. Tare la balanza hasta que la lectura sea cero.
30. Siga las instrucciones del fabricante para pipetear
100 µL de las Fluoroesferas LeukoSure en el tubo
de ensayo.
31. Para eliminar el exceso de reactivo, limpie
cuidadosamente el área externa de la punta de la
pipeta evitando su abertura.
32. Registre el peso del tubo de ensayo, el recipiente de
pesada y la muestra dispensada de Fluoroesferas
LeukoSure.
33. Repita los pasos 2 a 4 hasta haber pesado como
mínimo 10 de las muestras dispensadas de
Fluoroesferas LeukoSure.
34. Calcule la media, la desviación típica (SD) y el
coeficiente de variación porcentual (CV%) de
los pesos.
35. El CV% debe ser ≤2.0%.
Figura 3: Linealidad en el Rango dinámico de ERI en
un citómetro de flujo EPICS XL/XL-MCL (a) y Cytomics
FC 500 (b).
Estos histogramas pueden ser utilizados como una
ayuda en la solución de problemas. Los histogramas
opcionales son dos monoparamétricos de FL2 y FL3 y
uno de tiempo frente a Fluoroesferas LeukoSure.
22. Elabore el Histograma 4 de FL2 frente a Contaje con
una región lineal en el pico de fluorescencia. Utilice
una selección negativa [-A, o NO (CAL)].
23. Elabore el Histograma 5 de FL3 frente a Contaje con
una región lineal en el pico de fluorescencia. Utilice
una selección negativa [-A, o NO (CAL)].
24. Elabore el Histograma 6 de Tiempo frente a LOG FL
con una región rectangular en el pico de fluorescencia
de las Fluoroesferas LeukoSure. Utilice una selección
negativa [-B, o NO (B)].
Protocolo para el IsoFlow:
Para crear un protocolo con el fin de lavar con IsoFlow
entre muestras:
25. Guarde el protocolo de Análisis de la Muestra como
IsoFlowBlank.
26. Reduzca el tiempo de parada a 60 segundos.
27. Guarde el Protocolo IsoFlow Blank.
200
150
100
50
50
100
150
200
250
300
350
400
450
Recuentos absolutos esperados
(LEU/uL)
b
Linealidad en el rango dinámico para ERI con LEU
marcados en Cytomics FC 500
400
350
y = 0,9399x - 0,6371
R2 = 0,9999
300
250
200
150
100
50
0
0
50
100 150 200 250 300 350
Recuentos absolutos esperados
(LEU/uL)
400
450
Figura 4: Linealidad y Sensibilidad en el Límite Bajo
para ERI en un citómetro de flujo EPICS XL/XL-MCL
(a) y Cytomics FC 500 (b).
a
Sensibilidad en el límite inferior para ERI con
LEU marcados en EPICS XL/XL-MCL
25
CARACTERÍSTICAS DEL RENDIMIENTO
Linealidad
Se realizaron mediciones repetidas de muestras de
eritrocitos y plaquetas mezcladas con 10 dilciones
seriadas de leucocitos, para obtener un rango dinámico
(0 a 400 células/µL) y un límite infeior en el margen de
sensibilidad (0 a 20 células/µL). Las muestras fueron
preparadas conforme al prospecto incluido en el Kit de
Recuento LeukoSure y analizadas con citómetros de flujo
EPICS XL/XL-MCL y Cytomics FC 500. Los valores se
expresan en términos de recuento absoluto (células/µL).
La medición matemática de la linealidad se muestra en las
pendientes de las líneas de regresión obtenidas de los
gráficos de los recuentos absolutos de leucocitos. Ello se
refuerza por las desviaciones potenciales mínimas en el
ensayo según se evidencia por las intersecciones con el
eje Y, en los análisis. Los recuentos absolutos esperados
demuestran una elevada correlación con los recuentos
absolutos recuperados. Las Figuras 3 a 6 demuestran el
rango dinámico (3, 5) y el límite de sensibilidad (4, 6) para
las muestras de eritrocitos y plaquetas mezcladas con
leucocitos, en los citómetros de flujo XL/XL-MCL (a) y
FC 500 (b).
250
0
Recuentos absolutos recuperados
(LEU/uL)
Histogramas Opcionales:
y = 0.9122x - 0.1729
R2 = 0.9999
300
0
DETERMINACIÓN DEL RECUENTO
ABSOLUTO
Para determinar el recuento absoluto en el citómetro de
flujo EPICS XL/ XL-MCL o Serie FC, introduzca el valor de
10 veces la concentración indicada de las Fluoroesferas
LeukoSure (por ejemplo, si la concentración indicada
es 1004, usted introducirá 10040) al nombrar la región
CAL según se indica en el paso 12 del apartado
ANÁLISIS POR CITOMETRÍA DE FLUJO. Al contabilizar
un mínimo de 10,000 fluoroesferas, el recuento absoluto
de la muestra se calcula utilizando la siguiente fórmula:
Recuento absoluto (células/10 µL) = (Número Total de
Células Contabilizadas dividido por el Número Total de
Fluoroesferas Contabilizadas) multiplicado por 10 veces la
concentración indicada de las Fluoroesferas LeukoSure.
El valor obtenido corresponde a LEU/10 µL. Para
convertir el valor a LEU/µL divida por 10 el valor obtenido.
350
Recuentos absolutos recuperados
(LEU/uL)
a
PROCEDIMIENTO DE VERIFICACIÓN DE
LA TÉCNICA DE PIPETEO
y = 0.9444x - 0.1531
R2 = 0.9955
20
15
10
5
0
0
5
10
15
20
25
30
Recuentos absolutos esperados
(LEU/uL)
b
Sensibilidad en el límite inferior para ERI con
LEU marcados en Cytomics FC 500
25
Recuentos absolutos recuperados
(LEU/uL)
Figura 2: El Histograma 2 corresponde a FL3 frente a
cociente (FL3/FL2) que ofrece una mayor
discriminación entre los leucocitos nucleados y las
plaquetas, los eritrocitos o los detritus. Los eventos
que se sitúan sobre la diagonal de este histograma
representan detritus inespecíficos y son eliminados
del análisis. Los histogramas representan la
adquisición de Leuko-Trol Plaquetas Nivel H en un
EPICS XL/XL-MCL con el Software System II Versión
3.0 (a) y un FC 500 con el Software RXP (b).
y = 0.8799x + 0.2326
R2 = 0.9990
20
15
10
5
0
0
5
10
15
20
Recuentos absolutos esperados
(LEU/uL)
3 de 6
25
30
350
y = 1.005x + 0.0829
R2 = 0.9999
300
250
200
150
50
0
50
100
150
200
250 300
350
400
450
Recuentos absolutos esperados
(LEU/uL)
10
0
Exactitud del método con muestras de
ERI en EPICS XL/XL-MCL
(n = 70 ; dos sitios)
50
Recuentos absolutos recuperados
(LEU/uL)
350
y = 0.9827x + 0.9753
R2 = 0.9998
250
200
150
100
50
y = 1.0217x + 0.0795
R2 = 0.9936
40
30
20
10
0
0
100
150
200
250
300
350
400
0
450
Recuentos absolutos esperados
(LEU/uL)
10
20
30
40
Recuentos absolutos esperados
(LEU/uL)
50
b
Exactitud del método con muestras de
plaquetas en EPICS XL/XL-MCL
(n = 50; dos sitios)
Figura 6: Linealidad y Sensibilidad en el límite bajo
para Plaquetas en un citómetro de flujo EPICS
XL/XL-MCL (a) y Cytomics FC 500 (b).
Recuentos absolutos LeukoSure
(LEU/uL)
Sensibilidad en el límite inferior para plaquetas con
LEU marcados en EPICS XL/XL-MCL
30
25
y = 0.9624x + 0.2491
R2 = 0.9977
15
50
Precisión
Intralaboratorio
40
30
20
10
0
10
20
30
40
50
60
Recuentos absolutos LeucoCount
(LEU/uL)
10
5
0
5
10
15
20
25
Recuentos absolutos esperados
(LEU/uL)
30
Figura 8: Exactitud del Kit de Recuento LeukoSure
(Cytomics FC 500) frente al Equipo LeucoCount
(BD FACS) para los productos eritrocitarios (a)
y plaquetarios (b).
a
b
Exactitud del método con muestras de ERI
en Cytomics FC 500
(n = 100; trés sitios)
Sensibilidad en el límite inferior para plaquetas LEU
marcados en Cytomics FC 500
Recuentos absolutos LeukoSure
(LEU/uL)
30
25
20
y = 1.0074x + 0.2336
R2 = 0.9981
15
10
5
50
y = 0.9769x + 0.0358
R2 = 0.9941
40
30
20
10
0
0
0
5
10
15
20
25
Recuentos absolutos esperados
(LEU/uL)
30
40
0
10
20
30
40
Recuentos absolutos LeucoCount
(LEU/uL)
4 de 6
50
60
Tabla 1: Precisión Inter e Intralaboratorio
y = 0.9532x - 0.2231
R2 = 0.9961
0
0
30
Se realizaron en la misma fecha estudios con tres
diferentes citómetros de flujo – EPICS XL/XL-MCL,
Cytomics FC 500 y BD FACSCailbur. Se prepararon
cuatro especímenes comprendidos en el rango dinámico
(0 a 400 LEU/µL) para las muestras de ERI y plaquetas.
Los especímenes fueron divididos en tres alicuotas; una
de cada nivel fue utilizada para preparar las muestras
(n = 10) para cada citómetro de flujo. Los valores se
expresan como recuentos absolutos (LEU/µL).
La Tabla 1 contiene los resultados del Estudio de
Precisión inter e intralaboratorio, según el tipo de muestra,
nivel e instrumento. Los valores obtenidos exhibieron
escasa variación entre uno y otro instrumento y dentro del
tipo de muestra y nivel según se evidenció por las medias
y las desviaciones típicas de las mediciones repetidas.
Esta información demuestra la precisión y la
reproducibilidad del Kit de Recuento LeukoSure.
60
a
20
20
Recuentos absolutos LeucoCount
(LEU/uL)
Nivel de
Muestra
50
10
Precisión inter e intralaboratorio
400
0
0
PRECISIÓN
450
Recuentos absolutos recuperados
(LEU/uL)
20
a
Linealidad en el rango dinámico para plaquetas con
LEU marcados en Cytomics FC 500
Recuentos absolutos recuperados
(LEU/uL)
30
Figura 7: Exactitud del Kit de Recuento LeukoSure
(EPICS XL/XL-MCL) frente al Kit LeucoCount
(BD FACS) para los productos eritrocitarios (a) y
plaquetarios (b).
b
300
y = 0.9872x - 0.07
R2 = 0.9954
40
100
0
Recuentos absolutos recuperado
(LEU/uL)
50
50
ERI / Bajo
n: 10
Media: 1.1
(LEU/µL)
SD: 0.34
ERI / Bajo-Medio
n: 10
Media: 4.5
(LEU/µL)
SD: 1.01
ERI / Medio
n: 10
Media: 48.2
(LEU/µL)
SD: 3.16
ERI / Alto
n: 10
Media: 437.2
(LEU/µL)
SD: 11.85
Precisión
Interlaboratorio
Combinada
400
60
BD
FACSCalibur
Recuentos absolutos recuperados
(LEU/uL)
450
Exactitud del método con muestras de
plaquetas en Cytomics FC 500
(n = 78; trés sitíos)
Cytomics
FC 500
Linealidad de rango dinámico para plaquetas con
LEU marcados en EPICS XL/XL-MCL
El grado de exactitud del recuento absoluto de
leucocitos obtenido en las muestras de ERI y plaquetas
leucorreducidas fue evaluado comparando el Kit de Recuento
LeukoSure con el kit LeucoCount (Becton Dickinson
Immunocytometry Systems, San Jose, CA) en Beckman
COULTER, Inc. y en dos sitios externos de evaluación.
Los productos eritrocitarios y plaquetarios leucoreducidos
fueron preparados conforme a las instrucciones de cada
fabricante y analizados en el EPICS XL/XL-MCL y
Cytomics FC 500 utilizando el Kit de Recuento LeukoSure
y en un citómetro de flujo BD FACS usando el kit
LeucoCount. Ver en las Figuras 7 y 8 los gráficos
correspondientes a estos datos.
EPICS
XL/XL-MCL
a
b
EXACTITUD DEL MÉTODO
Recuentos absolutos LeukoSure
(LEU/uL)
Figura 5: Linealidad en el Rango dinámico de
Plaquetas en un citómetro de flujo EPICS XL/XL-MCL
(a) Cytomics FC 500 (b).
10
0.9
10
1.2
30
1.1
0.30
0.56
0.42
10
4.7
10
4.4
30
4.6
0.78
0.67
0.81
10
42.9
10
41.0
30
44.0
1.35
1.91
3.79
10
432.8
10
425.1
30
431.7
9.4
6.7
10.54
Plaquetas / Bajo
n: 10
10
Media: 0.4
0.4
(LEU/µL)
SD: 0.20
0.27
Plaquetas / Bajo-Medio
n: 10
10
Media: 3.6
4.2
(LEU/µL)
SD: 0.51
0.78
Plaquetas / Medio
n: 10
10
Media: 38.2
37.8
(LEU/µL)
SD: 1.73
1.71
Plaquetas / Alto
n: 10
10
Media: 383.6 386.7
(LEU/µL)
SD: 5.30
7.74
10
0.3
Combinada
Precisión
Interlaboratorio
BD
FACSCalibur
Cytomics
FC 500
EPICS
XL/XL-MCL
Nivel de
Muestra
Precisión
Intralaboratorio
30
0.4
0.18
10
4.3
30
4.0
0.78
0.74
10
39.6
30
38.5
2.3
1.0
10
377.1
30
382.5
6.46
7.53
La estabilidad de la muestra fue evaluada comparando
las muestras teñidas y adquiridas en el transcurso de la
hora siguiente a la leucorreducción con las muestras
teñidas y adquiridas 24 o 48 horas después de la
leucorreducción y analizadas antes de 2 horas.
La estabilidad de la muestra teñida fue establecida
mediante la comparación de las muestras teñidas y
adquiridas en el transcurso de la hora siguiente a la
leucorreducción con las muestras teñidas a las
24 horas y analizadas después de otras 24 horas
de conservación.
Antes de la tinción, los productos eritrocitarios deben
ser refrigerados (2-8°C) y los concentrados
plaquetarios permanecer a temperatura ambiente
(20-25°C).
Según puede observarse en la Tabla 2, las muestras de
ERI y plaquetas pueden teñirse hasta 48 horas después
de la leucorreducción.
Las muestras teñidas antes de 24 horas pueden ser
refrigeradas y analizadas hasta 24 horas después. La
estabilidad de las muestras teñidas a las 24 horas figura
en la Tabla 3.
Tabla 2: Estabilidad de las Muestras Teñidas en las
48 Horas Posteriores a la Leucoreducción
ERI
Plaquetas
Tipo de
Muestra
ERI
Plaquetas
0.22
Estabilidad
Tipo de
Muestra
Tabla 3: Estabilidad de las Muestras Teñidas Antes de
24 horas y Adquiridas Después de 24 Horas
n
Tiempo 0
(LEU/µL)
Diferencia
Media en
24 Horas
(LEU/µL)
Diferencia
Media en
48 Horas
(LEU/µL)
3
0.9
+0.1
-0.1
3
4.7
-0.3
+0.2
3
46.7
+6.6
-2.0
3
436
+27.5
-27.2
3
0.3
0
+0.1
3
3.3
+1.1
+0.7
3
38.1
+1.8
-1.8
3
372.5
+22.7
11.7
n
Tiempo 0
(LEU/µL)
Diferencia Media
24 Horas Después de
la Tinción
(LEU/µL)
3
0.9
+0.3
3
4.7
+0.3
3
46.7
+2.6
+21.9
3
436
3
0.3
+0.1
3
3.3
+0.54
3
28.1
+0.2
3
372.5
+0.3
COMPARACIÓN DE LOS CITÓMETROS
DE FLUJO
El rendimiento del Kit de Recuento LeukoSure fue evaluado
en los citómetros de flujo EPICS XL/XL-MCL, FC 500 y BD
FACS. Los resultados del análisis de regresión en 30
muestras de ERI y plaquetas aparecen en la Tabla 4.
Tabla 4: Comparación del Kit de Recuento LeukoSure
en Citómetros de Flujo EPICS XL/XL-MCL o Cytomics
FC 500 frente a BD FACS.
Instrumento
y Tipo de
Muestra
n
Pendiente
Intercepción
Correlación
ERI
30
0.9837
-0.1295
0.9934
Plaquetas
30
1.0310
0.1687
0.9920
ERI
30
0.9964
0.0285
0.9856
Plaquetas
30
1.0474
-0.0573
0.9915
EPICS
XL/XL-MCL
Cytomics
FC 500
ESPECIFICIDAD
Especificidad del Reactivo
El yoduro de propidio forma complejos con el ADN y el
ARN de cadena doble. En presencia de la ARNasa,
utilizada para eliminar el ARN de cadena doble, el yoduro
de propidio se une estoiquiométricamente al ADN de
cadena doble de modo que células nucleadas presentes
en la muestra emiten fluorescencia proporcionalmente a
su contenido de ADN.7, 8
Control de Calidad
Para obtener óptimos resultados, verifique que las pipetas
se encuentran calibradas conforme a la periodicidad
recomendada por el fabricante.
Para obtener óptimos resultados, verifique que el
citómetro de flujo se encuentra debidamente alineado y
estandarizado en cuanto a dispersión de la luz y
fluorescencia. Refiérase a los manuales de los productos
para conocer las respectivas instrucciones.
Controle la lisis eritrocitaria en las muestras de ERI
mediante la inspección visual de la muestra tras el
procesamiento y la evaluación de los histogramas de
dispersión de la luz. Las muestras no lisadas tienen un
aspecto turbio en el tubo de ensayo. Las muestras
parcialmente lisadas presentarán conyajes anormalmente
elevados o patrones aberrantes de dispersión de luz en
las poblaciones leucocitarias.
Procese y analice diariamente las adecuadas Células
de Control de Leuko-Trol utilizando el Protocolo para el
Análisis de la Muestra. Los valores de los recuentos
absolutos obtenidos deben encontrarse dentro de los
límites esperados informados en la Página del
Ensayo adjunta.
5 de 6
LIMITACIONES
1. Para obtener resultados óptimos debe pasarse entre
las muestras un tubo con líquido envolvente IsoFlow.
2. Los reactivos deben ser utilizados antes de la fecha
de caducidad impresa en la etiqueta de la unidad.
3. Si las muestras de ERI tienen aspecto turbio, se ha
producido una lisis insuficiente.
4. Los eritrocitos nucleados (NGR) pueden sufrir lisis
incompleta y estar incluidos en la población
leucocitaria de dispersión de la luz.
5. Las muestras preparadas deben ser analizadas en el
transcurso de las 2 horas siguientes a la adición de las
Fluoroesferas LeukoSure.
6. Para conocer otras limitaciones de los instrumentos,
consulte los correspondientes manuales del producto
o la sección de ayuda en línea.
7. Para conocer otras limitaciones de las Células de
Control Leuko-Trol, consulte el prospecto específico
adjunto en cada paquete.
BIBLIOGRAFÍA
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Moroff G, Pisciotto PT, Sayers M and Silberstein LE.
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Reduction of Whole Blood and Blood Components
Intended for Transfusion.
www.fda.gov/cber/gdlns/preleuk.pdf.
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white cells in Clinical Benefits of Leukodepleted Blood
Products, Sweeney J and Heaton A, eds. RG Landes
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study evaluating three methods for counting residual
WBCs in WBC-reduced blood components: Nageotte
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Transfusion 40:513-520.
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five platforms for enumeration of residual leucocytes in
leukoreduced blood components. Brit J Haem
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7. Crissman HA and Steinkamp JA. 1973. Rapid,
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volume in single cells from large mammalian cell
populations. J Cell Biology 59:766-771.
8. Shapiro HM: 1995. Practical Flow Cytometry. Extrinsic
Parameters. Third Edition, New York: Wiley-Liss,
p. 251-262.
DISPONIBILIDAD DEL PRODUCTO
Kit de Recuento LeukoSure
PN 175621-200 pruebas
Fluoroesferas LeukoSure
PN 6607124-100 pruebas
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al 1-800-526-7694. Fuera de los Estados Unidos,
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