90 Micropropagación: desinfección de los explantes PDF

MICROPROPAGACIÓN
DESINFECCIÓN DE LOS EXPLANTES
Como se muestra en la Guía 80: Micropropagación en el laboratorio educacional, uno de los pasos
más críticos en las técnicas de cultivo in vitro es la desinfección de los explantes, que comienza con
un buen lavado con agua y jabón o detergente. Una vez que el explante está bien limpio, se procede
a la desinfección con agentes químicos.
Los más económicos y fáciles de usar son el alcohol 70º y el hipoclorito de sodio, vendido
comercialmente como agua sanitaria en Brasil, lavandina en Argentina, y agua jano en Chile y otros
países latinoamericanos.
Una inmersión de 1 a 2 minutos en alcohol 70º permite eliminar burbujas de aire y disolver la capa
epicuticular de los explantes, pero no garantiza la esterilización del explante. Esa es la función del
agua sanitaria.
En muchos países la concentración del principio activo (NaClO) del agua sanitaria es del 5%, y los
protocolos correspondientes recomiendan utilizar diluciones de 10 a 20 % (v/v). En Brasil, donde la
legislación determina que la concentración del principio activo (NaClO) del agua sanitaria sea del 1,5
a 2%, la dilución equivalente para la desinfección del explante se encuentra entre el 25 y 50%.
Nosotros preferimos fijar en 50% la concentración de la solución desinfectante del agua sanitaria y
modificar el tiempo de inmersión en función del tipo de explante. Como medida adicional, la solución
desinfectante se prepara en un frasco estéril. Vale la pena destacar que una desinfección externa
bien realizada no elimina las contaminaciones internas, que pueden aparecer días más tarde del
sembrado del explante.
Una vez desinfectado el explante, se retira el hipoclorito mediante tres lavados sucesivos con agua
destilada estéril. La duración de los lavados es de 1, 3 y 5 minutos, pudiendo en el último lavado
permanecer por más tiempo. Para el lavado existen dos técnicas, cuya elección depende del tamaño
y del número de explantes a esterilizar. La primera consiste en retirar el material y transferirlo a los
recipientes con agua destilada estéril, un procedimiento práctico si el número de explantes es
pequeño (Figura 1).
La segunda es abrir ligeramente el frasco para descartar el líquido, desechando el contenido en una
pileta o en un balde de descarte (Figura 2). Antes y después de este procedimiento, se recomienda
limpiar cuidadosamente la tapa y el exterior del frasco de alcohol. Esta última es nuestra preferida.
Si fuera necesario cortar el material o eliminar las partes quemadas por el hipoclorito de sodio, prever
la esterilización de los instrumentos y de una caja de Petri conteniendo una hoja de papel toalla
donde se realizará la disección.
Guía 90
María Antonia Malajovich / Guías de actividades
Biotecnología: enseñanza y divulgación
http://www.bteduc.bio.b
MICROPROPAGACIÓN / DESINFECCIÓN DE LOS EXPLANTES
Figura 1. Técnica para desinfectar los explantes.
A. Material
Pinza
Recipiente con solución
desinfectante
Tres recipientes o placas de Petri
con agua destilada estéril
Explantes
B. Procedimiento
o
Primer lavado
(1 minuto)
o
Segundo lavado
(3 minutos)
o
Tercer lavado
(5 minutos)
Explantes limpios
Guía 90
María Antonia Malajovich / Guías de actividades
Biotecnología: enseñanza y divulgación
http://www.bteduc.bio.b
MICROPROPAGACIÓN / DESINFECCIÓN DE LOS EXPLANTES
Figura 2. Otra técnica para desinfectar los explantes.
A - Material
Frasco estéril 3 frascos con agua destilada estéril
para la solución
desinfectante
Recipiente
de descarte
Explantes
Observación:
Durante el procedimiento, limpiar
cuidadosamente los bordes de la tapa y
el exterior de los frascos con alcohol
antes de transferir los líquidos. Esta
medida
reduce
notablemente
el
número de contaminaciones
B – Procedimiento
O
Esterilizar los explantes en la solución de agua sanitaria, descartar el líquido y agregar agua
destilada estéril para el primer lavado.
Guía 90
María Antonia Malajovich / Guías de actividades
Biotecnología: enseñanza y divulgación
http://www.bteduc.bio.b
MICROPROPAGACIÓN / DESINFECCIÓN DE LOS EXPLANTES
O
Primer lavado (1 minuto)
Una vez descartado el líquido,
agregar agua destilada estéril
para el segundo lavado
O
Segundo lavado (3 minutos)
Una vez descartado el líquido,
agregar agua destilada estéril
para el tercer lavado
O
Tercero lavado (5 minutos)
Una vez descartado el líquido,
invertir el frasco para que los
explantes queden en la tapa
O
Los explantes están listos para el sembrado.
Guía 90
María Antonia Malajovich / Guías de actividades
Biotecnología: enseñanza y divulgación
http://www.bteduc.bio.b
MICROPROPAGACIÓN / DESINFECCIÓN DE LOS EXPLANTES
NUESTRO COMENTARIO
La preparación de numerosos frascos de agua destilada estéril consume mucho tiempo, de modo que
probamos reemplazarla en los lavados por una solución de Clor-in 10 (Dicloro isocianurato de sodio
o NaDCC), un producto que se vende en los comercios locales para desinfectar utensilios y
legumbres, en la concentración y tiempo indicados por el fabricante.
El Clor-in puede prepararse en el momento y no precisa enjuague. El mayor inconveniente es que el
material queda un poco pegajoso y eso puede dificultar la transferencia de los explantes con la pinza
a los tubos de ensayo.
En función de nuestra experiencia, vale la pena destacar que los ensayos de reinfección de explantes
sólo con Clor-in 10, sin utilizar agua sanitaria, sólo dan resultados aceptables cuando el medio de
cultivo no contiene sacarosa.
Para reducir las contaminaciones bacterianas y fúngicas, algunos autores recomiendan agregar
NaDCC o Nipagin (metilparabeno) al medio de cultivo ya esterilizado. Sin embargo, no encontramos
información clara sobre las concentraciones utilizadas y preferimos probar el uso de dichos productos
en el lavado de los explantes.
Guía 90
María Antonia Malajovich / Guías de actividades
Biotecnología: enseñanza y divulgación
http://www.bteduc.bio.b