GENETICA BACTERIANA

GENETICA BACTERIANA
1
Mutaciones
Transferencia de material genético
de un microorganismo a otro
Procesos que producen cambios en la
información genética de un microorganismo.
Estos pueden tener como consecuencia un
cambio en su fenotipo (cambios
morfológicos, estructurales o funcionales)
y adaptación a distintos ambientes.
Recombinación genética
Estos procesos permiten el análisis de la
estructura génica de un organismo y de su
funcionalidad y tienen importancia y uso
para la construcción de nuevos organismos
con aplicaciones prácticas.
2
Mutaciones
Transferencia de material genético
de un organismo a otro
Procesos que producen cambios en la
información genética de un organismo
y pueden tener como consecuencia un
cambio en su fenotipo y adaptación a
distintos ambientes.
Recombinación genética
Estos procesos permiten el análisis de la
estructura génica de un organismo y de su
funcionalidad y tienen importancia y uso
para la construcción de nuevos organismos
con aplicaciones prácticas.
3
Mutación: cambio heredable en la secuencia de bases del genoma
de un organismo.
Mutante: la cepa que lleva ese tipo de cambio (proviene de una cepa
silvestre).
Genotipo: dado por la secuencia de nucleótidos en el ADN
Gen, mutación y cepa mutante: minúscula e itálica (ej.:hisC).
Fenotipo: dado por las propiedades observables o detectables del
organismo (ej.:His-).
4
Bacteria sensible a antibiótico
Se hace crecer en un medio con antibiótico
Se aíslan colonias que poseen una resistencia a la
droga (heredable).
¿Las mutaciones se indujeron a causa del antibiótico?
5
En general la mutación es un evento espontáneo que ocurre al azar y no está
relacionado con una adaptación al medio ambiente.
Luria y Delbruck (1943): investigaron el origen de la mutación que le confiere a E. coli
resistencia al fago T1
B
A
o
1
2
3
20
20 erlenmeyers(1ml/erlenmeyer)
conteniendo 103 células /ml
10 ml conteniendo
103 células/ml
Se crecen hasta alcanzar 109 células/ml
Cada uno se plaquea en una placa con fago T1
0,2 ml / placa
Se plaquean 20 placas que contienen el fago,
0,2 ml de cultivo / placa.
6
A
B
Todas las
replicas en
medio selectivo
son iguales
Mutación adaptativa ?
7
Tasa de mutación para un determinado fenotipo: La probabilidad de que una célula mute a un
determinado fenotipo cada vez que la misma se divide.
a=
m
d
m
=
N2 – N1
a= tasa de mutación
m= número de mutaciones surgidas en el cultivo
en el tiempo t
d= número de divisiones ocurridas en ese tiempo t
N= número de células
Aproximación con experimento en placa
Placas con igual número de bacterias
sembradas
Cada bacteria da lugar a una colonia
t1
m2-m1
A = _________
t2
Eventos de mutación ≠ número de mutantes
Si se hace en cultivo líquido hay que hacer
correcciones en base a cálculos estadísticos
Se agrega fago
N
y se incuba
Contar número de mutantes (y en réplicas que no fueron sometidas al fago contar el número de células totales)
Se aplica esta aproximación
M/N
Pendiente= a
tiempo
La tasa de mutación se saca experimentalmente
y depende del tamaño del gen, secuencia del gen,
secuencia de aa y estructura tridimensional del
producto del gen que se está mutando y si el fenotipo
depende de un solo gen o de varios.
Tasa de mutación espontánea para cada gen: 10-6-10-8
Se debe trabajar con cultivos densos en fermentador
8
Puntuales: sustitución de pares de bases (transiciones o transversiones)
microinserciones
microdeleciones
Mutaciones
Elementos de inserción
Mutaciones debidas a cambio de muchos pares de bases (genes enteros): inserciones
deleciones
inversiones
Translocaciones
duplicaciones
Recombinación
9
Consecuencias de las mutaciones puntuales
En zona codificante:
UAC
Codón de tirosina
Sustitución de pares de bases: El
cambio fenotípico depende de donde
exactamente ocurre la mutación en el
gen, que cambio de nucleótido tuvo
lugar y que producto codifica dicho
gen.
CAC
Codón de
Histidina
Proteína defectuosa
Mut de contrasentido
UAG
codón de
terminación
Proteína incompleta
Mut sin sentido
UAU
codón de
tirosina
Proteína normal
Mut silenciosa
Mutaciones por desfase: Por inserción
o deleción (que no sea múltiplo de 3)
se origina un desfase en el marco de
lectura. La traducción resulta alterada.
En zona no codificante:
En zona promotora: inactivación o conversión de un promotor inducible en promotor constitutivo.
10
Por errores en la replicación: los errores ocurren
Ocurrir
naturalmente
con alta frecuencia pero
existen mecanismos de
corrección muy eficientes
Por alteración espontánea de ciertos nucleótidos
que lleva a un apareamiento equivocado
Tautomerismo, pérdida de amino.
Mutaciones
Mutágenos químicos y físicos
Provocadas
Para aislar una mutante:
Mutágenos biológicos: mutagénesis por transposón
Mutagénesis dirigida: Tecnología de ADN
recombinante.
Hay que tratar de aumentar la tasa de mutación
Hay que buscar un método eficiente de selección
11
Tautomerismo
T- - - A
T- - - G
TA
CG
forma
enol
5% de las citosinas están metiladas
C - - -G
MeC - - -G
Tanto C como MeC pueden perder el NH2
C
MeC
U
T- - -A
MeCG
TA
Hot Spots
12
Por errores en la replicación: ocurre con alta frecuencia
Ocurrir
naturalmente
Existen mecanismos de
corrección
Por alteración espontánea de ciertos nucleótidos
que lleva a un apareamiento equivocado
Tautomerismo, Hot Spots.
Mutaciones
Mutágenos químicos y físicos
Provocadas
Para aislar una mutante:
Mutágenos biológicos: mutagénesis por transposón
Mutagénesis dirigida: Tecnología de ADN
recombinante.
Hay que tratar de aumentar la tasa de mutación
Hay que buscar un método eficiente de selección
13
Hipoxantina (APAREA CON CITOCINA)
Uracilo (APAREA CON ADENINA)
(la transforma en comp.
que se aparea con A)
y deleciones
Daño por especies reactivas de oxígeno: radicales libres, agua oxigenada
mutaciones puntuales por errores en apareamiento
(Formación de 8-oxo-G aparea con A en lugar de C
Análogo de base
T
T(forma enol) (aparea con G)
BU
BU (forma enol)
BU - - - G
Más frecuentemente
AT
GC
14
Por errores en la replicación: ocurre con alta frecuencia
Ocurrir
naturalmente
Existen mecanismos de
corrección
Por alteración espontánea de ciertos nucleótidos
que lleva a un apareamiento equivocado
Tautomerismo, Hot Spots.
Mutaciones
Mutágenos químicos y físicos
Provocadas
Para aislar una mutante:
Mutágenos biológicos: mutagénesis por transposón
Mutagénesis dirigida: Tecnología de ADN
recombinante.
Hay que tratar de aumentar la tasa de mutación
Hay que buscar un método eficiente de selección
15
Sistemas de reparación
Mecanismos de reparación específicos para determinado tipo de mutación
Daño por Deaminación: Actúan DNA glicosilasas específicas reconocen (hipoxantina, xantina y uracilo).
Rompen entre el azúcar y la base alterada. Luego actúan las AP endonucleasas que
cortan en el esqueleto azúcar-fosfato y finalmente actúa la ADN polimerasa I rellenando.
Desaminación de citocinas metiladas
C
MeC
U
Uracil-glicosilasa
T- - -A
MeCG
TA (sobre las T en mismatch con G en el contexto
No se saca con una glicosilasa
de determinada secuencia actúa otro sistema
de reparación llamado VSP (very short patch)
Hot spot
Daño por alquilación: glicosilasas específicas, AP endonucleasas y la ADN pol I
Daño por especies reactivas de oxígeno: Formación de 8-oxo G. Aparea con A en lugar de C
Paricipan los genes mutM, mut T y mutY.
mut M codifica para una glicosilasa específica para 8-oxo G.
mutY codifica para una glicosilasa específica para A.
mutT inhibe la formación de 8-oxo G.
También en daño al ADN por especies reactivas de oxígeno
actúa el sistema de reparación por escisión (mecanismo general)
Daño por Radiación UV (formación de dímeros de timina). Fotoreactivación: ocurre en presencia de
la luz. Actúa una Fotoliasa que separa las bases unidas
También hay N-glicosilasas específicas para dímeros de timina
16
Mecanismos de reparación general
Actividad correctora de la ADN polimerasa III durante la replicación (MutD)
Reparación de mismatch dependiente de metilo:
Reconocen cambios en la estructura del ADN debido a un apareo indebido
(pequeñas distorsiones en la hélice). Participan los genes mutS, mut L y
mut H.
El gen dam (metila Adenina dentro de determinada
secuencia después de la replicación, la nueva hebra esta temporalmente
no metilada). Entonces cuando el daño y la formación de mismatch ocurre
durante la replicación puede ser corregido correctamente.
Genes mut: genes mutadores
17
Mecanismos que reconocen distorsiones grandes en la hélice principalmente daños por UV
y cruzamiento entre cadenas
Reparación por escisión
Reparación recombinatoria
Reparación por mecanismo de SOS (mutagénico)
Reparación por escisión
Reparación recombinatoria
Intervienes los productos de los genes uvrA, uvrB, uvrC, uvrD y
DNA polimerasa. Son inducibles por daño al ADN
18
Reparación por mecanismo de SOS (mutagénico)
Por acción de mutágenos
o por stress ambiental
Daño al ADN
grande
Se induce el sistema de SOS
(normalmente reprimido por LexA)
RecA se une al ADN dañado y sufre un cambio
conformacioal que induce una actividad autoproteolítica en LexA
se induce el regulon SOS
constituído por genes que participan en la reparación
del ADN.
Cuando el daño es muy grande ocurre la Reparación mutagénica. Se dejan de reprimir los genes
umuD y umuC (se requieren niveles mayores de RecA). La presencia de los productos de estos genes
permite que la ADN polimerasa replique sobre el ADN dañado (bypass replicativo) pero metiendo
errores.
19
Por errores en la replicación: ocurre con alta frecuencia
Existen mecanismos de
corrección
Ocurrir
naturalmente
Por alteración espontánea de ciertos nucleótidos
que lleva a un apareamiento equivocado
Tautomerismo, Hot Spots.
Mutaciones
Mutágenos químicos y físicos
Provocadas
Mutágenos biológicos: mutagénesis
por transposón
Para aislar una mutante:
Genes
mutadores
Mutagénesis dirigida: Tecnología de ADN
recombinante.
Hay que tratar de aumentar la tasa de mutación
Hay que buscar un método eficiente de selección
20
Mutación de Genes mutadores
(Ej: mutación en la función Correctora)
Stress, alta dosis de radiación UV o de sustancias
reactivas de oxígeno o ayuno exhaustivo
Hipermutación por inducción del sistema SOS
Elevada tasa de mutación general
21
Mutación adaptativa ?
Mecanismos
Tasa de mutación general regulada por el ambiente
Stress (ambiente adverso)
Amplificación adaptativa
Hipermutación por inducción del sistema SOS
El ambiente provoca la hipermutación y el aumento de probabilidad de adaptarse a ese ambiente adverso
Incrementada tasa de mutación en sitios específicos regulada por el ambiente
En células que no están creciendo se produce una amplificación de los genes que limitan el crecimiento
Al haber más, es más probable que muten.
22
Reversiones
Una revertante es una cepa en la que se restauró el fenotipo silvestre que se había perdido.
Secuencia que al traducir da el mismo fenotipo
Revertante de un mismo sitio
Se vuelve a la secuencia original: revertante verdadera
Mutación en el mismo gen: corrigen el marco
de lectura.
Mutación en otro gen que restaura el fenotipo
silvestre produciendo la misma proteína.
Ej. : mutación en genes de tRNA. Supresora informacional
Revertantes
También pueden
ocurrir naturalmente
o ser provocadas
Revertantes de segundo sitio o
mutaciones supresoras
Supresoras por sobrexpresión
Supresoras por interacción
Mutación que produce una vía metabólica
alternativa que permite el mismo fenotipo. Supresora
por bypass
23
Supresora informacional
También supresora informacional de desfase
24
Por errores en la replicación: ocurre con alta frecuencia
Ocurrir
naturalmente
Existen mecanismos de
corrección
Por alteración espontánea de ciertos nucleótidos
que lleva a un apareamiento equivocado
Tautomerismo, Hot Spots.
Mutaciones
Mutágenos químicos y físicos
Provocadas
Para aislar una mutante:
Mutágenos biológicos: mutagénesis por transposón
Mutagénesis dirigida: Tecnología de ADN
recombinante.
Hay que tratar de aumentar la tasa de mutación
Hay que buscar un método eficiente de selección
25
Aislamiento de mutantes
Detección en placa
Detección por replica en placa y rastreo (screening)
Ej.: pérdida de pigmentación
Ej.: mutante auxótrofa
mutante sensible a antibiótico
s/Ab
c/Ab
Selección
Selección positiva: La mutación proporciona una ventaja para el crecimiento
bajo ciertas condiciones ambientales.
Ej.: resistencia a un antibiótico.
s/Ab
c/Ab
Selección negativa: La mutación causa una desventaja: Ej.: mutantes auxótrofas,
mutantes sensibles a un antibiótico.
Enriquecimiento (penicilina, incorporación de precursor metabólico
radioactivo)
Mutantes leaky
Mutantes condicionales
26
Mutagénesis y carcinogénesis: Test de Ames
Uso de cepas bacterianas mutantes para identificar sustancias potencialmente
carcinogénicas.
Se usa mutantes auxotróficas, puntuales (S. typhimurium, auxótrofa para histidina;,
E. coli, auxótrofa para triptofano).
La mutante auxótrofa no puede crecer en un medio carente del nutriente para el cual
es auxotrófica, si revierte entonces crece.
Una sustancia con capacidad mutagénica incrementa la frecuencia de reversión en la
mutante puntual.
Control
Disco de papel
Placa con bacterias
auxotróficas para
histidina
Medio con concentración muy baja de histidina
Disco de papel
Con sustancia a ensayar
activada
27
Mutaciones
Transferencia de material genético
de un organismo a otro
Procesos que producen cambios en la
información genética de un organismo
y pueden tener como consecuencia un
cambio en su fenotipo y adaptación a
distintos ambientes.
Recombinación genética
Estos procesos permiten el análisis de la
estructura génica de un organismo y tienen
importancia y uso para la construcción de
nuevos organismos con aplicaciones
prácticas.
28
Existen 3 formas de transferencia de ADN a una bacteria
TRANSFORMACION
TRANSDUCCION
CONJUGACION
29
Mutaciones
Transferencia de material genético
de un organismo a otro
Procesos que producen cambios en la
información genética de un organismo
y pueden tener como consecuencia un
cambio en su fenotipo y adaptación a
distintos ambientes.
Recombinación genética
Estos procesos permiten el análisis de la
estructura génica de un organismo y tienen
importancia y uso para la construcción de
nuevos organismos con aplicaciones
prácticas.
30
Recombinación: proceso por el que, en parte o por completo, las
moléculas de ADN de dos fuentes distintas se intercambian o juntan
en una unidad. La información genética se ve redistribuida
RECOMBINACION GENERAL
U HOMOLOGA
RECOMBINACION ESPECIFICA
O NO HOMÓLOGA
-Transposición (Rec. sitio específica ilegitima)
-Recombinación sitio específica legítima
Entre fragmentos iguales o muy similares
RecA
Resolvasas
Integrasas
Transposasas
Invertasas y más..
31
RECOMBINACION GENERAL U HOMOLOGA
Intercambio de
cadenas homólogas
Modelo de
Holliday o de
invasion de
doble cadena
Isomerización
A
Dos cortes en cs
En el mismo lugar
Entrecruzamiento de
Extremos libres
Apareamiento con
Secuencia complementaria
Y formación de heteroduplex
Resolución
Secuencias homólogas (95-100%, 100pb mínimo)
Sinapsis
Heteroduplex
Endonucleasas, ligasas, polimerasas
Estructura de Holliday
RecA
Migracion de ramificacion
Parches
Empalmes
(recombinación verdadera)
32
Las dos cadenas de
una de las moléculas
de ADN se cortan y los
extremos 5´se degradan
Uno de los extremos 3´
invade la otra molécula
de ADN y encuentra su
secuencia complementaria
La ADN polimerasa
Desplaza y rellena
Ligación
Modelo de reparación de ruptura de
doble cadena
33
Enzimas que participan en la recombinación homóloga:
RecBCD: nucleasa se une a extremos de doble cadena. Reconoce una secuencia determinada que determina
donde se va a formar un extremo 3´ que va a constituír la hebra invasora. Helicasa
RecA: Se une al extremo 3´de la cadena invasora, lo fuerza a adoptar la conformación de una hélice y permite que se meta
en la doble hélice de la cadena complementaria formando una hélice triple en la cual tiene lugar el apareamiento de
la hebra invasora con su complementaria.
RuvA, RuvB: involucradas en la migración de la ramificación.
RuvC: resuelve la estructura de Holliday
34
35
Consecuencias de la recombinación homóloga
Mutación ó complementación
Para que aparezca un nuevo fenotipo a
raíz de la recombinación homóloga, las
dos cadenas que se intercambian deben
tener alguna diferencia
Integración al cromosoma
La recombinación entre dos regiones de una
misma molécula de ADN que presentan
similitud puede ser la causa de:
Deleciones
Inversiones
empalme
36
Existen 3 formas de transferencia de ADN a una bacteria
TRANSFORMACION
TRANSDUCCION
CONJUGACION
37
PLASMIDOS
Elementos genéticos, doble cadena, generalmente circulares,
que se replican en forma independiente del cromosoma del
hospedador
No llevan genes que codifiquen para funciones esenciales. Están relacionados con la capacidad
evolutiva o adaptativa de las bacterias
Se conocen miles de tipos diferentes
Se encuentran en la mayoría de las bacterias
Tamaño entre 1000- 106 pb
Plásmido típico: circular, bicatenario, 0,2-0,4% del ADN cromosómico
38
Forma superenrollada. Con rotura en una cadena da círculo abierto. Con rotura en las dos
cadenas da forma lineal.
Los plásmidos se replican a partir de un origen de replicación.
En forma similar al
cromosoma.
Replicación theta
En círculo rodante
39
Los genes necesarios para la replicación pertenecen en su mayoría al hospedador pero
el plásmido lleva información:
‹ Para algunas de las enzimas necesarias para la iniciación de la replicación (esto determinará si
es de amplio o estrecho rango de huésped y que tipo de replicación sigue).
‹ Para el control temporal de la iniciación de la replicación determinando el número de copias
por célula. Plásmidos de alto y bajo número de copias.
‹ Para la regulación de la partición de los plásmidos entre las células hijas en la división celular
‹ Puede determinar su capacidad de compartir la célula con otros tipos de plásmidos:
incompatibilidad.
40
Número de copias:
Es característico del plásmido
Bajo número de copias (1-3)
Alto número de copias (10-100)
RepA, RNA
Curación:
Los plásmidos se pueden eliminar de la célula hospedadora por distintos tratamientos:
colorantes de acridina, detergentes, elevada temperatura, electroporación. Ocurre una dilución
del plásmido en la división celular.
Partición:
La segregación de los plásmidos en las dos células hijas, para plásmidos de bajo
número de copias está regulada.
Incompatibilidad:
Plásmidos distintos pero estrechamente relacionados no pueden permanecer juntos en forma
estable en una misma célula. Los plásmidos que no pueden coexistir forman parte del mismo
grupos de incompatibilidad. Los plásmidos que pertenecen al mismo grupo de incompatibilidad comparten el mecanismo de regulación de número de copias o el mecanismo de partición.
Hay numerosos grupos de incompatibilidad
41
Incompatibilidad
Diferente grupo de
incompatibilidad
Mismo grupo de
incompatibilidad
42
Hay distintos tipos de plásmidos en cuanto a genes extra que contienen y que le confieren al
hospedador un cierto fenotipo o una cierta capacidad.
43
Existen 3 formas de transferencia de ADN a una bacteria
TRANSFORMACION
TRANSDUCCION
CONJUGACION
44
Transformación
Lisis bacteriana
Extrucción de ADN por T4SS
Proceso por el cual el ADN libre
se incorpora en una célula
receptora y lleva a cabo un cambio
genético heredable.
Porque?
Nutrición
Adaptación
reparación
No todas las bacterias son transformables naturalmente.
Ejemplos de bacterias transformables naturalmente: Bacillus, Streptococcus, Haemophilus, Neisseria, Azotobacter,
Pseudomonas
Célula competente: célula capaz de tomar
una molécula de ADN y ser
transformada.
La competencia natural depende de la especie, de la fase de crecimiento, del pH, etc.
Algunas especies presentan el 100% de las células en una cultivo competentes al final
de la fase exponencial (10-15´) (Streptococcus pneumoniae) y otras un 1-20 % de
células competentes y solo en fase Estacionaria (Bacillus subtilis)
En el proceso de transformación natural intervienen proteínas de membrana que
asocian ADN, autolisinas de pared celular, nucleasas.
45
Desarrollo de la competencia
Observado para Streptococcus pneumoniae, Bacillus subtilis (G+)
A medida que la célula crece, secreta al medio un péptido. Existen proteínas sensoras en la membrana celular
que sensan la concentración del péptido. Cuando el péptido llega a determinada concentración, esto es sensado
por las proteínas sensoras (mecanismo de quorum sensing) que transmiten la señal a una proteína reguladora
(sistema de regulación de dos componentes) que a su vez activa la transcripción de varios genes entre los que
se encuentran aquellos que codifican para la maquinaria necesaria para la captación del ADN exógeno, su
entrada y recombinación (proteínas unidoras del ADN cd, endonucleasas, exonucleasas, autolisinas de la pared,
canales de membrana, proteínas protectoras contra la degradación de la cadena simple que entra, proteínas
necesarias para la recombinación.
Transformación natural es poco eficiente con plásmidos
La captación de ADN es inespecífica
salvo para Neisseria y Haemophilus en
los que se reconoce una secuencia de
11 pb.
46
Gram (+)
47
Se puede inducir el estado de competencia: mecanismo de transformación distinto al que
ocurre en células naturalmente competentes.
Ej.: Tratamiento con Cl2Ca y shock térmico (E. coli).
Electroporación (distintas bacterias)
En el caso de competencia inducida se puede transformar con
plásmidos
Replicable
Complementación
Transformación con plásmidos
Complementación
no replicable (suicida)
recombinación
mutación
48
Se debe tener un método de
selección
Eficiencia de
= número de colonias
Transformación
μg ADN
49
Existen 3 formas de transferencia de ADN a una bacteria
TRANSFORMACION
TRANSDUCCION
CONJUGACION
50
Transducción
Infección lítica y lisogénica
51
Generalizada
Transducción
Especializada
52
Formación de fago transductor para transducción generalizada
Fagos transductores:
Fago P1 y P22
Fago
transductor
53
Transducción generalizada
Selección en
Determinado
medio
Recombinación
Homóloga
(RecA)
54
Transducción especializada
Formación de fago transductor con fago atemperado
Fago lambda
Célula
lisogénica
Recombinación sitio
específica legítima
55
Transducción especializada
56
Existen 3 formas de transferencia de ADN a una bacteria
TRANSFORMACION
TRANSDUCCION
CONJUGACION
57
Conjugación
58
Plásmidos conjugativos (F en E. coli)
4 etapas:
1) formación del par receptor-donor
G (-)
2)Preparación para la transferencia
del ADN.
3)Transferencia del ADN.
4) Formación de una réplica funcional
en el aceptor.
Transconjugante
Conjugación en G(+): producción por parte de células
aceptoras de feromonas que inducen en la superficie de las
células donadoras la acumulación de sustancias de agregación que
median la unión entre los dos tipos celulares (Enterococcus)
59
(60 genes, 100kb)
Plásmido autotransferible o conjugativo (F):
llevan genes que permiten el contacto efectivo
y lleva la información necesaria para la
transferencia
Plásmido movilizable o transferible:
lleva la información necesaria para la
Transferencia (indispensable: origen de
transferencia, oriT)
Plásmido no transferible: no tiene los
genes necesarios para el efectivo
contacto ni para la transferencia del
ADN.
60
PLASMIDOS
Conjugación
Cl2Ca
Transformación
inducida
Electroporación
Autotransferibles (conjugativos y transferibles)
PLASMIDOS
Transferibles (necesito la presencia de otro conjugativo)
Conjugacón biparental y
triparental
Donación
61
Conjugación triparental
62
Naturales
PLASMIDOS
Obtenidos por tecnología de ADN recombinante
Replicativos
Amplio o estrecho
rango de huesped
PLASMIDOS
Suicidas
Transformación o
Conjugación con plásmidos
Replicable
Complementación o introducción de gen nuevo
Complementación
no replicable (suicida)
recombinación
mutación
Tecnología de ADN recombinante
63
Medio de contraselección apropiado para seleccionar células
aceptoras (con la nueva información) y no las dadoras
Conjugación
Complementación
A-
A
+
A
Vector Amp r
Cm r
Replicativo
Vector de expresión
Aceptora
Cepa dadora con funciones
de conjugación
Mutación
E. coli (no crece en sacarosa)
Rhizobium
Plásmido suicida, debe
ocurrir recombinacion
homologa
A
+
A-
Gm
Crece en medio
Vector suicida Ampr
mínimo con sacarosa en cepa dadora
Cepa dadora con funciones
de conjugación
Un evento de recombinación
Ampr
2 eventos de recombinación
Amps
64
Medio de contraselección apropiado para seleccionar células
aceptoras (con la nueva información) y no las dadoras
Conjugación
Complementación
A-
A
+
A
Vector Amp r
Cm r
Replicativo
Vector de expresión
Aceptora
Medio c/Amp y c/ Cm
Crece aceptora con plásmido
Cepa dadora con funciones
de conjugación
Mutación
E. coli (no crece en sacarosa)
Rhizobium
Plásmido suicida, debe
ocurrir recombinacion
homologa
A
+
A-
Gm
Crece en medio
Vector suicida Ampr
mínimo con sacarosa en cepa dadora
Cepa dadora con funciones
de conjugación
Un evento de recombinación
Ampr
2 eventos de recombinación
Amps
65
Medio de contraselección apropiado para seleccionar células
aceptoras (con la nueva información) y no las dadoras
Conjugación
Complementación
A-
A
+
A
Vector Amp r
Cm r
Replicativo
Vector de expresión
Aceptora
Medio c/Amp y c/ Cm
Crece aceptora con plásmido
Cepa dadora con funciones
de conjugación
Mutación
E. coli (no crece en sacarosa)
Rhizobium
Plásmido suicida, debe
ocurrir recombinacion
homologa
A
+
A-
Gm
Crece en medio
Vector suicida Ampr
mínimo con sacarosa en cepa dadora
Cepa dadora con funciones
de conjugación
Un evento de recombinación
Ampr
Medio selectivo c/ Gm
(medio mínimo c/Sac y Gm)
2 eventos de recombinación
Gmr Amps
66
Integración
deleción
Un evento de recombinación
Gmr Ampr
Gmr Amps
67
Movilización del cromosoma
El plásmido F se puede integrar al cromosoma (episoma) y es capaz de transferir una
porción del cromosoma a una célula aceptora: Conducción y sexducción
F+: plásmido F no integrado (donadora)
F-: no tiene plásmido F (receptora)
Hfr: células que tienen el plásmido F integrado al cromosoma (conductora)
F´: Ocasionalmente el plásmido F integrado se puede escindir del cromosoma y existe la posibilidad de que se incorporen
al mismo genes cromosómicos adyacentes (donador si no perdió ninguno de los genes necesarios para el proceso)
(Sexducción)
68
La integración del plásmido F al
cromosoma es a través de las
Secuencias de Inserción, IS,
que se encuentran tanto en el
plásmido como en determinados
lugares del cromosoma.
Recombinación homóloga
69
70
Existen diferentes secuencias de inserción y para cada tipo existen distintos sitios
en el cromosoma donde se pueden integrar, o sea se pueden tener diferentes cepas Hfr.
-
Como se detecta si hubo o
no transferencia de ADN
cromosómico y
recombinación
71
Mediante el uso de una variedad de cepas Hfr se pudo determinar en E. coli la disposición y orientación
de un gran número de genes cromosómicos
Conjugación de:
Hfr a+ b+ c+ d+ e+ Strs
X
F- a- b- c- d- e- Strr
Producto de conjugación
(Se corta la conjugacion a distintos tiempos
por agitación)
Plaqueo en medio con estreptomicina
y todos los aa menos:
a
b
c
d
e
También se puede utilizar
la transducción generalizada
Para mapear el genoma de E. coli
72
73
Mutaciones
Transferencia de material genético
de un organismo a otro
Procesos que producen cambios en la
información genética de un organismo
y pueden tener como consecuencia un
cambio en su fenotipo y adaptación a
distintos ambientes.
Recombinación genética
Estos procesos permiten el análisis de la
estructura génica de un organismo y tienen
importancia y uso para la construcción de
nuevos organismos con aplicaciones
prácticas.
74
RECOMBINACION NO HOMÓLOGA
Recombinación sitio específica legítima
Transposición (sitio específica ilegítima)
75
Integración de fago (integrasas)
Recombinación sitio específico
legítima
Transposición replicativa (resolvasa)
Inversión (invertasas)
Integrasas
Invertasas
76
Recombinación sitio específico ilegítima
Transposición
El ADN de bacterias, virus y células eucariotas contienen elementos que se pueden
mover de un lugar a otro del mismo
El movimiento se llama transposición.
Secuencias de inserción
Transposones compuestos
Transposones no compuestos
Fago Mu
77
IR
Secuencias de inserción
Transposones compuestos
Tn5, Tn9, Tn10
IR
Transposasa
E.coli contiene distintos IS,
algunos estan repetidos.
se los encuentra tanto en cromosoma
como en los plásmidos
Transposones no compuestos
Tn3
78
8-38 pb
Reconocimiento del
blanco:
Transposasa
Target: 3-12 pb
No es específica respecto de la
secuencia del huésped. Es característico
el número de bases duplicadas para
cada transposón.
Algunos transposones saltan
preferentemente a regiones con
determinado enrollamiento o grado
de metilación.
Conservativo (Tn5 y IS)
Mecanismo de transposición
compuesto
Replicativo (Tn3, Fago Mu) (hay un intermediario)
No compuesto
79
Transposición replicativa
Transposición conservativa
Transposición
(Transposasas)
Recombinación sitio
Específica ilegítima
Recombinación
sitio específica
legítima
(Resolvasas)
IS y transposones compuestos
Tn3 y fago Mu
80
Consecuencias de la transposición
Mutagénesis: Se utilizan transposones para mutagenizar. La resistencia a antibióticos
para la cual codifican es útil para seleccionar las mutantes. Se utilizan como portadores
del transposón, plásmidos suicidas. Se utilizan transposones modificados: miniTn5 (no
codifica para la transposasa).
Inducción de la expresión: por secuencias promotoras que contiene y que quedan
rio arriba de algún gen.
Rearreglos: por inserción de transposones compuestos
(deleciones e inversiones, nuevos transposones)
81
Mutagenesis generalizada por transposición
Rhizobium
E. Coli (no crece en sacarosa)
+
Crece en
AB sacarosa
Vector (suicida en rhizobium) AmpR
con Tn5 (Kmr)
Medio selectivo c/ Km
(AB Sac Km)
Plásmido suicida, debe
ocurrir transposición
La transposasa del transposón es inactiva y va otra copia intacta en el plásmido fuera del transposón
82
Rearreglos
Deleción
Creación de un nuevo transposón
Inversión
Out-side end transposition
(transposición externa)
In-side end transposition
(transposición interna)
83
Thomas D. Brock and Michael T. Madigan. Biología de los
Microorganismos
Prescot, Harley and Klein. Microbiology
Snyder and Champness. Molecular genetics of bacteria
84