Práctica 1 Producción de anticuerpos policlonales Inmunización

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Práctica 1
Producción de anticuerpos policlonales
Inmunización experimental de ratones
Semestre B-2010
Introducción
Los anticuerpos o inmunoglobulinas son un grupo de glicoproteínas heterogéneas presentes en el
plasma y en los tejidos que poseen una especificidad de enlace para un antígeno particular. El
método usual para producir anticuerpos policlonales experimentalmente consiste en la inoculación
de animales con preparaciones purificadas o parcialmente purificadas de antígeno (inmunógeno).
La administración de un inmunógeno in vivo estimula diferentes células del sistema inmune, dando
origen a una población mixta de anticuerpos derivados de un número variado de clones de
linfocitos B (policlonal). El suero de un animal inmunizado contiene estos anticuerpos y es referido
como antisuero policlonal.
Los anticuerpos policlonales son particularmente valiosos como reactivos biológicos para el estudio
de proteínas, células y tejidos cuando se utilizan en técnicas muy diversas, tales como: ELISA,
inmunofluorescencia e inmunotransferencia.
Los métodos de inmunización experimental son muy variados y dependen del uso que se le quiera
dar al anticuerpo producido. En general, al establecer un protocolo de inmunización experimental
se debe tomar en consideración un conjunto de factores que afectan el tipo y la magnitud de la
respuesta humoral del animal inmunizado. Estos factores son los siguientes: la especie del animal
utilizado, la constitución genética del animal, el tipo, la dosis y la ruta de administración del
inmunógeno, el número de inmunizaciones (refuerzos) y el uso de adyuvantes.
La selección del animal para la producción de anticuerpos policlonales depende de la cantidad de
antisuero deseada, la experiencia previa con el inmunógeno y la distancia evolutiva entre la
especie de donde se aisló el inmunógeno y la especie del animal inmunizado. En el laboratorio se
inmuniza frecuentemente conejos puesto que son fáciles de mantener, responden bien frente a un
amplio rango de antígenos y es posible obtener hasta 25 ml de suero de cada desangrado sin
efectos dañinos para el animal. Sin embargo, la inmunización experimental puede realizarse
también en otras especies, tales como: ratones, ratas, cobayos, gallinas, cabras y ovejas. La
constitución genética del animal influye sobre el tipo y grado de respuesta inmune del animal
inmunizado. Los genes que codifican el complejo mayor de histocompatibilidad (MHC), los
receptores de antígeno de los linfocitos T y B y otros genes involucrados en los mecanismos
inmunoregulatorios juegan un papel fundamental en la respuesta inmune. Por tal razón se suele
inmunizar de dos a tres conejos y de 4 a 6 ratones con el mismo antígeno.
La producción de anticuerpos policlonales depende en gran medida de la calidad, cantidad y
pureza del inmunógeno así como la especificidad y sensibilidad del ensayo donde se desee utilizar
el anticuerpo.
Las proteínas son las moléculas más inmunogénicas, mientras que los carbohidratos, los lípidos y
ácidos nucleicos son poco inmunogénicos. En general, mientras más purificado y menos
heterogéneo sea un antígeno, mayor será la probabilidad de obtener el anticuerpo deseado con
alta especificidad. El principal problema con las preparaciones de antígenos heterogéneas es la
falta de especificidad deseada en el antisuero resultante, ya que algunas moléculas contaminantes
de la preparación son frecuentemente más antigénicas que el inmunógeno de interés y el antisuero
resultante podría tener mayor especificidad hacia las moléculas contaminantes que hacia la
proteína de interés.
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La mayoría de los antígenos de interés son las sustancias solubles, los cuales tienen una
inmunogenicidad variable dependiendo del tamaño de la molécula y de la composición química.
Las moléculas más inmunogénicas tienen una masa molecular cerca de 100.000 Da mientras que
las sustancias con pesos inferiores a 5000 Da son poco inmunogénicas. Estas sustancias de bajo
peso pueden hacerse inmunogénicas si se les conjuga químicamente a una proteína (haptenoportador).
La mayoría de los antígenos requieren la adición de sustancias adyuvantes a fin de mejorar su
inmunogenicidad. Un adyuvante es una sustancia que al inocularse junto con el antígeno mejora de
manera no específica la respuesta inmune frente a ese antígeno. Ellos prolongan la persistencia
del antígeno, aumentan las señales coestimulatorias y estimulan la proliferación de linfocitos de
manera inespecífica. Entre los adyuvantes más utilizados se encuentran las sales de aluminio,
carbón, aceites minerales, y componentes de la pared bacteriana. El adyuvante de Freud
incompleto es muy utilizado y está constituido por una mezcla de aceite mineral y detergente
mientras que la incorporación de Mycobacterium tuberculosis a la mezcla de aceite produce el
adyuvante completo de Freud.
La magnitud de la respuesta inmune depende también de la dosis del inmunógeno administrada.
Dosis muy bajas o muy altas de inmunógeno no estimulan respuesta inmune o inducen un estado
de ausencia de respuesta inmune (anérgia). En líneas generales, los conejos se inmunizan con
dosis entre 10 y 1000 μg, mientras que los ratones son inmunizados con dosis entre 1 y 100 μg.
Después de la primera inoculación (inmunización primaria) del antígeno, hay un período de latencia
donde no se detectan anticuerpos en el suero del animal, seguido por la producción de niveles de
anticuerpos de tipo IgM detectables en el suero después de 7 días. Los anticuerpos de tipo IgG se
producen de 3 a 4 días más tarde. Posteriormente se desvanece la respuesta inmune
relativamente rápido. Sin embargo, si después de un período de tiempo re-inoculamos el mismo
antígeno (inmunización de refuerzo) al animal inmunizado, esto conduce a la producción de una
respuesta inmune secundaria, la cual tiene un período de latencia más corto y produce mayores
niveles de anticuerpos. La respuesta secundaria posee altos niveles de anticuerpos del tipo IgG e
IgA. La respuesta de IgM será similar a la obtenida en la inmunización primaria, mientras que los
anticuerpos IgG específicos serán detectables entre el 3 y 4 día después del refuerzo, alcanzando
un pico después de los 10 a 14 días y serán producidos durante mayor tiempo que en la respuesta
inmune primaria. La generación de una respuesta inmune secundaria eficiente requiere que los
refuerzos sean administrados después que la respuesta inmune primaria haya decaído (mínimo 2
semanas), de lo contrario se producirá un estado de anérgia. Los refuerzos resultan en un aumento
de la afinidad y la avidez de los anticuerpos producidos por el antígeno. Durante la producción de
antisueros, es común administrar de 2 a 3 inyecciones de refuerzos.
El objetivo de la práctica es la obtención de sueros policlonales mediante inmunización
experimental las cuales incluyen el manejo de técnicas de inmovilización del animal, inoculación
por varias rutas parenterales y desangrado que garanticen el menor dolor e incomodidad en el
animal y a la vez asegure la administración exitosa de la sustancia inmunogénica.
Objetivos del trabajo práctico
• Obtención de anticuerpos policlonales específicos anti Trypanosoma cruzi, mediante
inmunización experimental de ratones NMRI o Balb/c.
• Familiarizar al estudiante con las técnicas de inmovilización de animal; preparación del
inmunógeno con o sin adyuvante; inoculación de inmunógenos a través de diferentes rutas;
preparación de sueros y extracción de muestras de sangre de animales de laboratorio.
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Protocolo de Inmunización
Esquema de inmunización para la producción de anticuerpos policlonales
Para la obtención de antisueros de ratón, específicos contra Trypanosoma cruzi, hemos diseñado
un protocolo o esquema de inmunización que consiste en la inoculación de una preparación
purificada de una proteína recombinante (Pgr24) del parásito T. cruzi, por tres vías parenterales
diferentes, en cuatro oportunidades, durante el curso de un semestre. Cada grupo experimental
conformado por 5 ratones, para un total de 15 individuos.
El primer grupo de ensayo (A), constituido por 5 ratones serán inoculados por primera vez con una
dosis de 100 μg de la proteína recombinante Pgr24 de T. cruzi previamente purificada, en
presencia de adyuvante completo de Freud, vía intraperitoneal. Después de 15 días de la primera
inmunización se realiza la primera inmunización de refuerzo por vía intradérmica utilizando la mitad
de la dosis del antígeno (50 μg) inoculada en la primera inmunización junto con adyuvante
incompleto de Freud. Se continúa el segundo refuerzo por vía subcutánea, después de un intervalo
de 15 días, inoculando la misma dosis de antígeno utilizada en el primer refuerzo, luego de un
intervalo de 15 días, un tercer refuerzo del antígeno recombinante en solución salina. El segundo
grupo experimental (B) serán inoculados sólo con adyuvante de Freud, siguiendo el mismo
protocolo, intervalos y vía de inoculación similar a lo descrito para el grupo A. El tercer grupo
experimental (5 ratones restantes), al que llamaremos control (C), será sometido al mismo
esquema de inmunización y refuerzo cada 15 días, pero se inoculará sólo con solución salina.
Antes de la primera inmunización, después de la primera inmunización y de los refuerzos se extrae
una pequeña muestra de sangre a fin de valorar el desarrollo de la respuesta inmune en los sueros.
Una vez que aparece una respuesta de anticuerpos óptima (determinada por algún método
serológico, por ejemplo inmunofluorescencia o E.L.I.S.A.) el animal se desangra por punción
cardíaca a cielo abierto o bien se puede continuar las inmunizaciones de refuerzos y realizar
sangramientos secuenciales a fin de obtener los antisueros.
Procedimiento a seguir en el protocolo de inmunización
Día 1 (07-10-2010) Primera inmunización
Objetivos:
• Inocule cada ratón del grupo A, en la cavidad peritoneal, un volumen total de 0,2 ml de
emulsión que contiene 100 μg de la proteína recombinante (Pgr24) purificada de T. cruzi
(concentración inicial 1 mg/ml) en presencia de adyuvante completo de Freud (ACF).
• Inocule cada ratón del grupo B, un volumen de 0,2 ml de emulsión que contiene adyuvante
completo de Freud (ACF) en solución salina.
• Inocule cada ratón del grupo C, un volumen de 0,2 ml de solución salina.
Identificación de los ratones a ser inmunizados
1. Identifique los ratones que serán inmunizados colocando una marca, con una gasa embebida
en una solución de ácido pícrico (en la frente, una de las patas, lomo o abdomen del animal
utilizando). Otra manera de realizar el marcaje es realizando pequeños cortes, previa asepsia,
en la oreja y cola del animal.
2. Pese los ratones.
3. Lleve en su cuaderno el registro de los datos de identificación del animal: sexo, peso, marca
con ácido pícrico, edad del animal, fecha de nacimiento, fechas de inmunizaciones, señas
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particulares del ratón (marca de corte), tipo de inmunógeno, dosis del inmunógeno, vías de
inoculación y desangrado total.
Grupo
A
B
C
marcas
OD: oreja derecha cortada
OI: oreja izquierda cortada
DOC: dos orejas cortadas
CC: cola cortada
OD/CC: oreja derecha y cola cortadas
OD: oreja derecha cortada
OI: oreja izquierda cortada
DOC: dos orejas cortadas
CC: cola cortada
OD/CC: oreja derecha y cola cortadas
OD: oreja derecha cortada
OI: oreja izquierda cortada
DOC: dos orejas cortadas
CC: cola cortada
OD/CC: oreja derecha y cola cortadas
Edad/Peso (g)
Tratamiento
Inmunógeno + Adyuvante
Adyuvante
Solución salina
Muestra de sangre
Extraiga una muestra de sangre del seno orbital antes de la primera inmunización. Separe el
suero, colóquelo en un vial de congelación, rotule el vial y almacene a -20° C.
Prepare la emulsión del antígeno junto con el adyuvante
Cada ratón del grupo A recibirá, en cavidad abdominal, 200 μl de la mezcla de inmunógeno y
adyuvante completo de Freud (proporción 1:1 v/v), que contiene un total de 100 μg de Pgr24
recombinante purificado de T. cruzi.
1. Prepare 1 ml de emulsión de inmunógeno y adyuvante completo de Freud para inocular los
5 ratones de la caja A, de tal manera que 0.2 ml de emulsión contenga 100 μg del antígeno.
El antígeno recombinante de T. cruzi se encuentra en una concentración de 1 μg/μl.
Concentración inicial de la preparación de inmunógeno
Dosis del antígeno a inocular a cada ratón
Volumen final de la emulsión a preparar para inocular 5 ratones (Ag
+ACF)
Concentración final del inmunógeno en la emulsión
1 μg/μl
100 μg / 200 μl
1000 μl
?
2. Prepare 1 ml de emulsión con adyuvante completo de Freud y solución salina para inocular
los ratones del grupo B
El procedimiento para preparar la emulsión es el siguiente: coloque 0.5ml de la solución de
antígeno en una jeringa y en otra jeringa 0.5 ml adyuvante Completo y/o incompleto de Freud
(ACF). Remueva las agujas. Elimine las burbujas de aire en ambas jeringas y conecte ambas
jeringas mediante una aguja con doble conector.
Justo antes de la inmunización, emulsifique la preparación de antígeno con el ACF (1 ml)
haciendo pasar repetidas veces de un lado a otro de las jeringas la mezcla, ver Figura 1. Cuando
la mezcla se torne homogénea y blanca, desconecte la aguja conector, colóquele una aguja de
21-G y pruebe si la emulsión es estable. Para ello vierta una gota de la emulsión en 50 ml de
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agua fría en un vaso de precipitación. Una buena emulsión de agua y aceite debe mantenerse
como una gota aislada sobre la superficie del agua sin dispersarse. Si la gota se dispersa,
continúe emulsificando la mezcla. Durante este proceso se puede generar calor. Enfríe las
jeringas en una cama de hielo y mantenga la temperatura cercana a 4° C.
Figura 1: Jeringas conectoras
Inoculación del antígeno por vía intraperitoneal
1. Inocule los ratones del grupo A, en el área abdominal, dentro de cavidad peritoneal con 200 μl
de emulsión del antígeno y el ACF. El ratón recibirá un total de 100 μg del antígeno.
2. Inocule cada ratón del grupo B, por vía intraperitoneal, con 200 μl de emulsión preparada con
adyuvante completo de Freud y solución salina estéril
3. Inocule cada ratón del grupo C, por vía intraperitoneal, con 200 μl de solución salina estéril.
Día 15 (21-10-2010) Segunda inmunización (Primer refuerzo)
Objetivos:
• Inocule cada ratón del grupo A, por vía intradérmica, un volumen total de 100 μl de emulsión
que contiene 50 μg de la proteína recombinante (Pgr24) purificada de T. cruzi (concentración
inicial 1 mg/ml) en presencia de adyuvante incompleto de Freud (AIF), en una proporción 1:1
v/v.
• Inocule cada ratón del grupo B, por vía intradérmica, un volumen de 200 μl de emulsión que
contiene adyuvante incompleto de Freud (ACF) en solución salina.
• Inocule cada ratón del grupo C, por vía intradérmica, un volumen de 200 μl de solución salina.
Muestra de sangre
Extraiga una muestra de sangre del seno orbital de los ratones antes de la segunda
inmunización. Separe el suero, colóquelo en un vial de congelación, rotule el vial y almacene el
suero a -20°C.
Prepare el antígeno junto con el adyuvante
• Prepare 0.5 ml de emulsión de inmunógeno y adyuvante incompleto de Freud para inocular los
5 ratones del grupo A, de tal manera que 100 μl de emulsión contenga 50 μg del antígeno.
Este volumen es suficiente para inocular 5 ratones por vía intradérmica El antígeno
recombinante de T. cruzi se encuentra en una concentración de 1 μg/μl. Dependiendo de la
concentración de antígeno, determine la dilución de éste, a fin de tener la dosis de antígeno
deseada en el volumen que se inoculará cada animal.
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1 μg/μl
Concentración inicial de la preparación de inmunógeno
Dosis del antígeno a inocular a cada ratón
Volumen final de la emulsión a preparar para inocular 5 ratones (Ag +AIF)
Concentración final del inmunógeno en la emulsión
50 μg / 100 μl
500 μl
?
• Prepare 0,5 ml de emulsión de adyuvante incompleto de Freud y solución salina para inocular
los 5 ratones del grupo B
Inoculación del antígeno por vía intradérmica
1. Inocule cada ratón del grupo A, en a región dorsal, por vía intradérmica, en aproximadamente
10 sitios (0.01 ml por sitio), con 100 μl de emulsión que contiene 50 μg del antígeno y AIF.
2. Inocule cada ratón del grupo B, por vía intradérmica, con 100 μl de emulsión preparada con
adyuvante incompleto de Freud y solución salina estéril
3. Inocule cada ratón del grupo C, por vía intradérmica, con 100 μl de solución salina estéril
Día 22 (04-11-2010): Tercera inmunización (Segundo refuerzo)
Objetivos:
1. Inocule cada ratón del grupo A, por vía subcutánea, un volumen total de 100 μl de disolución
que contiene 50 μg de la proteína recombinante (Pgr24) purificada de T. cruzi (concentración
inicial 1 mg/ml)
2. Inocule cada ratón del grupo B y C, por vía subcutánea, un volumen de 100 μl de solución
salina.
Extraiga una muestra de sangre de los ratones y prepare el suero
Extraiga una muestra de sangre del seno orbital antes de la tercera inmunización. Separe el suero,
colóquelo en un vial de congelación, rotule el vial y almacene el suero a -20°C.
Prepare el antígeno
• Prepare un volumen de 500 μl de antígeno purificado en solución salina estéril para inocular 5
ratones por vía subcutánea. A cada ratón se le administrará un volumen de 100 μl que
contiene 50 μg la proteína recombinante (Pgr24) purificada de T. cruzi (concentración inicial 1
mg/ml).
Concentración inicial de la preparación de inmunógeno
Dosis del antígeno a inocular a cada ratón
Volumen final de disolución del antígeno a preparar para 5 ratones
Concentración final del inmunógeno en la disolución
1 μg/μl
50 μg / 100 μl
500 μl
?
Inoculación del antígeno por vía subcutánea
1. Inocule los ratones del grupo A, por vía subcutánea, en cinco sitios diferentes, .con un
volumen de 100 μl de solución salina que contiene 50 μg del antígeno.
2. Inocule los ratones del grupo B, y C por vía subcutánea, en cinco sitios diferentes, .con un
volumen de 100 μl de solución salina estéril.
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Día 37 (18-11-2010) Cuarta inmunización (Tercer refuerzo)
Objetivo:
1. Inocule cada ratón del grupo A, por vía subcutánea, un volumen total de 100 μl de disolución
salina que contiene 50 μg de la proteína recombinante (Pgr24) purificada de T. cruzi
(concentración inicial 1 mg/ml)
2. Inocule cada ratón de los grupos B y C, por vía subcutánea, un volumen de 100 μl de solución
salina.
Extraiga una muestra de sangre de los ratones y prepare el suero
Extraiga una muestra de sangre del seno orbital antes de la tercera inmunización. Separe el
suero, colóquelo en un vial de congelación, rotule el vial y almacene el suero a -20°C.
Prepare el antígeno
Prepare el antígeno de la misma manera que se preparó en la tercera inmunización
Inoculación del antígeno por vía subcutánea - Ver anexo
Inocule los tres grupos de ratones, por vía subcutánea y con la misma dosis que lo hizo en la
tercera inmunización
Día 52 (02-12-2010) Obtención de antisuero policlonal
Desangrado de los ratones
Sangrado total de los ratones por punción cardiaca a cielo abierto para obtener sueros inmunes y
determinar los niveles de anticuerpos específicos producidos después de la cuarta inmunización.
ANEXOS
Preparación de antisueros
1. Después de extraer muestras de sangre deje la sangre a temperatura ambiente 1/2 a 1 hora hasta
la formación del coágulo. Separe cuidadosamente el coágulo de la pared del tubo con un aplicador
de madera. Si se requiere mejor retracción del coágulo, mantenga la sangre refrigerada a 4ªC
durante 2 a 4 horas.
2. Decante el suero en un tubo y centrifugue a 1000g durante 15 minutos a 4ªC (2500 r.p.m.).
3. Cuidadosamente separe el suero por decantación o con pipeta Pasteur. El suero obtenido debe
estar libre de células.
4. Alicuote el suero en viales de 0.2 ml y almacene a -20ªC.
Seguimiento de la inmunización y aplicación de refuerzos
1. Dos semanas después de la primera inmunización tome una muestra de sangre. Separe el suero y
almacénelo a –20° C. Determine el título de anticuerpos específicos contra el antígeno inoculado
presentes en el antisuero. Esta muestra tiene la finalidad de permitir determinar el desarrollo de la
respuesta de anticuerpos en el antisuero de los ratones durante el curso de la inmunización.
2. Administre el primer refuerzo a los 15 días después de la primera inmunización. Tome muestra de
sangre del ratón, previo a la inmunización y separe el suero.
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3. Administre el segundo refuerzo con 15 días de intervalo. Tome muestra de sangre del ratón previo
a la inmunización y separe el suero.
4. Dos semanas después de la cuarta inmunización, desangre el ratón mediante punción cardiaca,
separe el suero y prepare alícuotas de 0.2 ml en viales de congelación y almacene a –20° C.
Caracterización y evaluación de los antisueros obtenidos
Una vez obtenido el antisuero de los ratones inmunizados es necesario detectar la presencia de
anticuerpos, cantidad, pureza, tíctuo y especificidad utilizando una técnica de inmunoensayo
confiable.
El título de un antisuero se puede estimar utilizando alguna de las técnicas de inmunoensayo taes
como ELISAy su especificidad a través de pruebas de reacciones cruzadas o por cromatografía de
afinidad utilizando el antígeno purificado.
Para algunas técnicas de inmunoensayos es suficiente utilizar los antisueros crudos, mientras que en
otras técnicas, es conveniente purificar alguno de los isotipos de anticuerpos con una especificidad
particular.
En los siguientes trabajos prácticos ustedes caracterizarán los antisueros obtenidos durante el
proceso de inmunización de este curso, utilizando la técnica de E.L.I.S.A. y la determinarán de la
cantidad de proteínas mediante el método de Lowry.
Materiales equipos y reactivos para las inmunizaciones de los ratones
– Ratones de 6 semanas de edad
– Aguja de jeringa con conectador doble
– Antígeno purificado (proteína de 1 a 2 mg/ml
– Algodón
en PBS)
– Gasa
– Adyuvante completo e incompleto de Freud
– Marcador
– Solución salina al 0,9% estéril
– Viales
– Alcohol al 70%
– Guantes
– Jeringas de vidrio de 1 c.c.
– Lentes
– Agujas 20, 21 y 25.
– Acido pícrico
Materiales, equipo y reactivos necesarios para el desangrado de los ratones
– Ratones inmunizados
– Aplicadores de madera
– Algodón
– Tubos de ensayo
– Tubos de ensayo
– Tubos de centrifuga
– Alcohol al 70%
– Pipetas Pasteur
– Tubo de centrífuga estéril, 44 x 142 mm
– Centrifuga refrigerada
– Jeringa estéril de 3 ml con aguja de 21”.
– Viales
– Aguja estéril
– Tubo de hematocrito
– Algodón y gasa.
Bibliografía
Current Protocols in Immunology 1992. Editado por John Coligan, Ada Kruisbeek, David Margulies,
Ethan Shevach y Warren Strober. Publicado por Greene Publishing Associates and Wiley Interscience.
Volumen 1. Capitulo 1.6.
Antibody production. Essential Techniques (1997). PJ Delves. Editorial John Wiley and Sons.
Técnicas de inoculación y sangrías de animales: http://www.scribd.com/doc/3288391/TECNICAS-DEINOCULACION-Y-SANGRIA-DE-ANIMALES
Técnicas de obtención e inoculación de muestras. Consejo Superior de investigaciones científicas.
Comité ético de experimentación animal del Centro Nacional de Biotecnología. España.
http://www.cnb.csic.es/~animalario/CEEA.html
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Protocolo de inmunización Semestre B-2010
Producción de anticuerpos de ratón policlonales anti-Pgr24 mediante la inoculación de la proteína
recombinante Pgr24de T. cruzi (Ag). Concentración del Ag: 1 mg/ml, por tres vías parenterales
diferentes (intraperitoneal, intradérmica y subcutánea).
GRUPOS EXPERIMENTALES
Grupo A: 5 ratones inoculados con emulsión de la proteína recombinante Pgr24 de T. cruzi y
adyuvante de Freud (esquema de inmunización).
Grupo B: 5 ratones inoculados con emulsión de Adyuvante de Freud y solución salina.
Grupo C: 5 ratones inoculados con solución salina.
PRIMERA INMUNIZACIÓN
07-10-2010
grupos
muestra
de
sangre
(Suero
normal)
A
A-SN
B
B-SN
C
C-SN
grupos
Grupo A
Dosis del antígeno
100 μg
Prepare 1000 μl emulsión
para inocular los ratones A:
____ μl l Ag (mg/ml)
500 μl Adyuvante completo
de Freud (ACF).
SEGUNDA INMUNIZACIÓN
21-10-2010
Vía
A-S1
i.p.
Inocule cavidad abdominal de
cada ratón con 200 μl de
emulsión que contiene 100μg del
antígeno
Grupo A
Dosis del antígeno
50 μg
B-S1
C-S1
TERCERA y CUARTA INMUNIZACIÓN
04-11-2010 / 18-11-2010
muestra
de
sangre
(Sueros
2° y
3ºInm.)
muestra de
sangre
(Sueros1°
Inm.)
Vía
Grupo A
Dosis del antígeno
50 μg
Prepare 0.5 ml emulsión para
inocular los ratones A:
____ μl l Ag mg/ml)
250 μl Adyuvante Incompleto
de Freud (AIF).
Vía
i.d
Inocule la dermis de cada ratón con
100 μl de emulsión que contiene 50
μg del antígeno
DESANGRADO TOTAL
02-12-2010
Obtención de antisueros de ratones
inmunizados por punción cardíaca
después de 4° Inmunización
Vía
A-S2
A
B-S2
C-S2
Prepare 0.5 ml de disolución
para inocular los ratones A:
____ μl l Ag (mg/ml)
250 μl solución salina estéril
B
s.c.
A-S3
C
A-S4
B-S3
Inocule por vía subcutánea, con
100 μl de disolución que contiene
50 μg del antígeno.
B-S4
C-S4
C-S3
Inoculación intraperitoneal (i.p.); intradérmica (i.d.); subcutánea (s.c.); punción cardíaca (p.c.)
Extraiga una muestra de sangre de los ratones (0.05 -0.2ml.) del seno orbital.
Realice el sangrado total (1ml) del ratón por punción cardiaca.
GA/mc Septiembre 2010
p.c.