Desactivación de la fluorescencia intrínseca de proteínas: Cambios

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Curso de Fluorescencia 2008-PEDECIBA
Práctica 2
Desactivación de la fluorescencia intrínseca de proteínas:
Cambios conformacionales por pH
Introducción
La disminución de la fluorescencia se puede producir por varias razones, algunas
triviales y otras por interacción entre moléculas desactivadoras (quenchers) y el
fluoróforo. Este último tipo de interacción nos puede dar una valiosa información sobre
la accesibilidad de triptofanos a diferentes quenchers, y es una herramienta
metodológica que permite visualizar cambios conformacionales, unión de ligandos, o
asociación de proteínas en solución.
La desactivación de la fluorescencia se analiza mediante la relación de Stern-Volmer:
I0 / I = 1 + Ksv[Q]
Donde Ksv es la constante de Stern-Volmer, y está relacionada con la accesibilidad del
fluoróforo al quencher (mayor accesibilidad, mayor Ksv), y cuando el quenching es
colisional (= dinámico) es igual al producto de la constante cinética de reacción entre el
estado excitado y el quencher (kq) y el tiempo de vida media del fluoróforo (τ0).
Ksv = kq.τ0
La constante de velocidad kq depende de los coeficientes de difusión del fluoróforo y del
quencher mediante la ecuación de Einstein-Smoluchowski, por lo que se puede utilizar
Ksv para determinar coeficientes de difusión.
Aún si el gráfico de Stern-Volmer es lineal, hay que distinguir si se trata de un
quenching colisional o a un quenching estático. Ambos tipos de quenching dan una
relación lineal de Stern-Volmer, pero el quenching estático no depende de la difusión.
El quenching estático se debe a la formación de un complejo entre el fluoróforo en su
estado basal y el quencher, que cuando absorbe luz no emite fotones.
Hay varias maneras de diferenciar entre quenching colisional y quenching estático.
Generalmente las Ksv obtenidas de quenching estático son mayores que las del
colisional. Entonces, comparando la Ksv obtenida con un valor estimado de Ksv usando
una kq controlada por difusión se puede tener una idea primaria del tipo de quenching.
Otra manera consiste en estudiar el quenching en función de la temperatura. La difusión
aumenta con la temperatura, mientras que la asociación generalmente disminuye. Por lo
tanto, si Ksv/F0 aumenta proporcionalmente con T/ , se trata de quenching colisional,
si disminuye, es estático.
Una forma adicional es explorando el espectro de absorbancia. Los complejos
fluoróforo-quencher pueden formar especies que absorben de manera diferente que las
dos especies por separado.
La mejor forma de diferenciar es comparando Stern-Volmer obtenidos de datos de
fluorímetros con otros obtenidos por el análisis de las vidas medias de fluorescencia. Un
quencher estático no afecta la vida media de fluorescencia, como lo hace uno dinámico.
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Sin embargo, el gráfico de Stern-Volmer no es siempre lineal. Si se observa una
curvatura negativa, (I0/I es menos que lo esperado a [Q] grandes), esto se puede deber a
que la molécula tiene más de un fluoróforo, o la molécula puede estar en más de una
conformación, que resulta en diferentes grados de accesibilidad de los diferentes
fluoróforos al quencher. Se puede estimar la fracción de fluoróforos accesibles a bajas
[Q] mediante una manipulación sencilla de la ecuación de Stern-Volmer, y
eventualmente determinar las Ksv correspondientes a cada fluoróforo (a altas [Q]).
Si se observan desviaciones positivas, se puede tratar de varias causas. Una causa trivial
podría ser que a las concentraciones que se ensaya el quencher provoca
desnaturalización o cambios conformacionales en la proteína (se puede ensayar la
actividad enzimática de la proteína, o algún método estructural para descartar esta
hipótesis). Otra razón puede ser debido a un quenching combinado dinámico y estático
(estudiar como estático, y ver ecuaciones para discriminar en Lakowicz). La tercera
razón podría ser debido a la esfera de acción de quenching.
Consejos prácticos:
Evitar la desactivación trivial: cuando se observa caída en la fluorescencia pero se debe
al bloqueo del haz incidente por una sustancia que absorbe fuertemente (Abs. λ ex <
0.05). Controlar la absorbancia de la muestra con la mayor concentración de quencher.
Si se usan quenchers cargados, se debe controlar que la concentración de iones se
mantenga constante en todo el ensayo, balanceando con KCl. Cuando se usa ioduro, se
debe agregar ditionito para evitar la formación de triioduro, que absorbe mucho a las
longitudes de onda de trabajo.
Materiales
KI 2.2 M (preparar fresco y agregar una punta de espátula de ditionito)
KCl 2.2 M
Mañana
1- Trp 5 µM en fosfato 50 mM pH 7.4
2- BSA 2 µM en fosfato 50 mM pH 7.4
3- BSA 2 µM en glicina 50 mM pH 2.8
Tarde
1- Trp 5 µM en glicina 50 mM pH 2.8
2- OVA 2 µM en fosfato 50 mM pH 7.4
3- OVA 2 µM en glicina 50 mM pH 2.8
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Procedimiento
Repartirse en 3 subgrupos y elegir soluciones 1, 2 o 3 de fluoróforo.
Preparar los tubos por duplicado.
Preparar
Tubo Fluoróforo
(µL)
Ioduro
(µL)
KCl
(µL)
1
1000
0
100
2
1000
5
95
3
1000
10
90
4
1000
20
80
5
1000
30
70
6
1000
50
50
7
1000
75
25
8
1000
100
0
IF
(URF)
IF
(URF)
I0
prom.
I0/IF
I0/IF
En el espectrofluorímetro:
1234-
Calibrar el fotomultiplicador utilizando tubo 1: usar ex = 285 y em = 345 nm.
Hacer espectro de emisión; ex =.......
Hacer espectro de excitación; em =.......
(Sólo para proteínas) usando ex = 295 nm, recalibrar la sensibilidad y hacer otro
espectro de emisión.
5- Hacer espectro emisión del buffer; ex = 295 nm
6- Registrar IF para todos los tubos, ex =......, em =...... . Se usará ex = 295 nm para
proteínas.
7- Hacer espectro emisión del tubo 8.
Análisis
1- Graficar espectros (pasos 2, 3, 4, 5 y 7). Comparar espectros emisión, Calcular
los diferenciales (ex = 285 vs. ex = 295; y con vs. sin quencher; pH 7.4 vs. 2.8),
identificar picos de emisión.
2- Graficar Stern-Volmer. Determinar Ksv.
3- Calcular accesibilidad de fluoróforos a baja [Q].
4- Discutir los resultados. ¿Cómo afecta el pH a la estructura proteica?
Bibliografía
Principles of fluorescence spectroscopy, 3rd Ed., JR Lakowicz, Springer.
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