REDVET. Revista electrónica de Veterinaria. ISSN 1695-7504 Rev. electrón. vet.

REDVET. Revista electrónica de Veterinaria. ISSN 1695-7504
2007 Volumen VIII Número 8
REDVET Rev. electrón. vet. http://www.veterinaria.org/revistas/redvet
Vol. VIII, Nº 8, Agosto/2007– http://www.veterinaria.org/revistas/redvet/n080807.html
Anticuerpos
monoclonales
que
reconocen
epítopes
conformacionales de
la fimbria F41 de la Escherichia coli
enterotoxigénicas (Monoclonal antibodies that recognize different
conformational epítopes in enterotoxigenic Escherichia coli F41
fimbriae)
Campal Espinosa, Ana Cristina: Centro de Ingeniería Genética y Biotecnología
de Camagüey. Apdo 387. C.P. 70100. Camagüey, Cuba. | Junco Barranco,
Jesús Arturo: Centro de Ingeniería Genética y Biotecnología de Camagüey. Apdo
387. C.P. 70100. Camagüey, Cuba. | Casas Suárez Sonia: Centro de
Ingeniería Genética y Biotecnología de Camagüey. Apdo 387. C.P. 70100.
Camagüey, Cuba. |
Arteaga Moré, Niurka Onexis: Centro de Ingeniería
Genética y Biotecnología de Camagüey. Apdo 387. C.P. 70100. Camagüey, Cuba .|
Castro Santana, María Dolores: Centro de Ingeniería Genética y Biotecnología
de Camagüey. Apdo 387. C.P. 70100. Camagüey, Cuba. | Fuentes Aguilar,
Franklin: Centro de Ingeniería Genética y Biotecnología de Camagüey. Apdo 387.
C.P. 70100. Camagüey, Cuba. | León Barreras, Licette: Centro de Ingeniería
Genética y Biotecnología de Camagüey. Apdo 387. C.P. 70100. Camagüey, Cuba |
Barreto Argilagos Guillermo: Facultad de Ciencias Agropecuarias. Universidad
de Camagüey, Circunvalación Norte, CP. 70100, Camagüey, Cuba | Pardo,
Guillermo: Facultad de Ciencias Agropecuarias. Universidad de Camagüey,
Circunvalación Norte, CP. 70100, Camagüey, Cuba.
La correspondencia deberá dirigirse a:
Lic. Ana Cristina Campal Espinosa.
Centro de Ingeniería Genética y Biotecnología.
Apdo 387. CP. 70100. Camagüey. Cuba.
e-mail: [email protected]
REDVET: 2007, Vol. VIII Nº 8
Recibido: 29 Mayo 2007 / Referencia: 080715_REDVET / Aceptado: 21 Julio 2007 / Publicado: 01 Agosto 2007
Este trabajo Resulta de la Tesis para obtener el grado de Maestro En Educación en Ciencias Naturales con terminal
en Biología presentada José Luis Carlos Bedolla Cedeño en el Instituto Michoacano De Ciencias De La
Educación “José María Morelos”. Secretaria De Educación. Gobierno Del Estado De Michoacán México,
siendo su Asesor de Tesis Mc. Georgina Canedo Mendarozqueta. Está disponible en
http://www.veterinaria.org/revistas/redvet/n080807.html concretamente en
http://www.veterinaria.org/revistas/redvet/n080807/080715.pdf
REDVET® Revista Electrónica de Veterinaria está editada por Veterinaria Organización®.
Se autoriza la difusión y reenvío siempre que enlace con Veterinaria.org® http://www.veterinaria.org y con REDVET®
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Resumen
Las Escherichia coli enterotoxigénicas (ECET) producen diarreas en terneros neonatos debido a
su capacidad para unirse a las células del epitelio intestinal a través de las fimbrias y la
secreción de enterotoxinas. En terneros, las cepas de ECET K99+ y F41+ son aisladas con
mayor frecuencia, mientras que en los cerdos los aislamientos de ECET F41+ son menos
frecuentes, existiendo pocos estudios al respecto. Es por ello, que el objetivo planteado en
1
Anticuerpos monoclonales que reconocen epítopes conformacionales de la fimbria F41 de la Escherichia coli
enterotoxigénicas
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2007 Volumen VIII Número 6
este trabajo fue obtener anticuerpos monoclonales, para ser empleados como herramientas
diagnósticas, para la detección de la fimbria. Para ello los ratones fueron inmunizados con la
fimbria purificada y en combinación con células F41+ muertas con 0,5% de formalina. La
especificidad de los anticuerpos fue determinada por ELISA con antígenos relacionados. El
análisis de los epítopes se realizó por ensayo de competencia y Western Blot. Como resultado
se obtuvieron 4 AcMs dirigidos hacia tres epítopes conformacionales diferentes en la fimbria
F41, uno de los cuales está también presente en la fimbria K99. El AcM CBC – F41.3 fue útil
para detectar a la fimbria F41 en muestras de fermentaciones en un ELISA de captura.
Palabras claves: Escherichia coli enterotoxigénicas, fimbrias, F41, anticuerpos monoclonales,
colibacilosis.
Abstract
Production of diarrhea in neonatal calves by enterotoxigenic Escherichia coli (ETEC) depends
on the bacterial ability to bind to the intestinal epithelial cells in host through fimbriae and
the secretion of enterotoxins. In calves,
ECET strains K99 + and F41 + are the most
important causes of colibacillosis. By the contrary the isolation of ECET strains F41 + from
piglets with diarrhea, are less frequent. The objectives this work were generation and
characterization of monoclonal antibodies (Mabs), to be used as diagnostic tools for the
fimbriae detection. To this aim, mice were immunized with purified fimbriae in combination
with F41 + cells killed with 0,5% of formalin. The specificity of the antibodies was determined
by ELISA with related antigens. Epítope analysis was carried out by competitive ELISA and
Western Blot.
Finally were obtained 4 Mabs recognizing three different conformational
epítopes in the F41 fimbriae, one of them was present also in the K99 fimbria. The Mabs CBC
– F41.3 was useful to detect F41 fimbriae in samples from fermentations by a capture ELISA.
Key words: enterotoxigenic Escherichia coli, fimbriae, F41, monoclonal antibodies,
colibacillosis.
Introducción:
La diarrea neonatal en terneros y cerdos causa importantes daños económicos en las
producciones pecuarias en todo el mundo (Barragry, 1997, da Costa et al., 2006), su principal
agente causal son las cepas de Escherichia coli enterotoxigénicas (ECET) (Runnels et al.,
1986). La patogénesis involucra la unión de las fimbrias a glicoproteínas y glicolípidos que
actúan como receptores en la mucosa y en las células epiteliales del intestino delgado del
hospedero así como, la inducción de diarreas a través de las enterotoxinas (Francis et al.,
1998).
Las cepas porcinas de ECET expresan varios tipos de fimbrias: K88 (F4), K99 (F5), F41, 987p
(F6) y F18. La fimbria F41 se expresa frecuentemente en cepas que también expresan a la F5
de los serotipos O9 y O101 (Smyth et al., 1994). La misma tiene una estructura filamentosa
de 29.5kDa, con un diámetro de 3,2 nm (de Graaf y Roorda, 1982). En cerdos, las cepas de
ECET F41+ son poco frecuentes, pero en lugares donde la masa está vacunada con
formulaciones que no contienen a la fimbria, su incidencia puede ser mayor.
Entre los genes codificantes para las proteínas accesorias encargadas de la biosíntesis de las
fimbrias de F41, F4 y la CS31A existe una alta homología (Anderson y Moseley, 1988, Korth et
al., 1992). Sin embargo, a nivel aminoacídico la homología entre la F41, y las fimbrias F4, F5,
tipo I, CFA-I y PapA es limitada e incluye los residuos hidrofóbicos y a la penúltima tirosina
del carboxilo terminal (de Graaf y Mooi, 1986).
Se han generado varios anticuerpos monoclonales (AcM) murinos hacia las fimbrias F41
(Raybould et al., 1987, Thorns y Roeder, 1988, Van Zijderveld et al., 1989) que han sido
Caracterización toxicológica de las macroalgas marinas Hypnea spp y Sargasun spp para la futura
utilización en la alimentación y la salud animal como humana
http://www.veterinaria.org/revistas/redvet/n070707/070705.pdf
2
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empleados en estudios inmunológicos, en ensayos para la detección y cuantificación del
antígeno en muestras de heces fecales y cultivo, así como en la inmunización pasiva de
animales susceptibles (Duchet – Suchaux et al., 1992). Mediante ellos se ha determinado la
existencia en la subunidad mayor de la fímbria de 5 epitopes inmunodominantes (Van
Zijderveld, et al., 1989). En el presente trabajo se caracterizan tres AcM murinos que
reconocen tres epítopes diferentes en la fimbria F41 nativa. Además se demostró la utilidad de
uno de ellos para la inmunodetección de cepas F41 + en diferentes muestras biológicas.
Materiales y Métodos.
Cepas Bacterianas, anticuerpos y antígenos.
Las cepas de ECET: H945/77 (O157:K88ac,LT+,Sta-), G 205 (O8:K87:K88ac), G7 (O8:K87:
K88ab), pr (190-56 O32: K87: K88ad) , B44 (O9: K30K99,F41:H-), MO6 (O101: K30: F41),
987p-2 (O9:K103, 987p), fueron donadas por el Dr. Jorge Blanco, del Laboratorio de
Referencia de la E.coli, Lugo, España y por el Centro Nacional de Sanidad Agropecuaria
(CENSA, Cuba).
Los anticuerpos policlonales (AcP) contra las proteínas fimbriadas nativas y electroeluidas y
HB101 se obtuvieron en conejos, absorbidos, purificados y se caracterizaron según describen
Campal et. al., 2007, (en imprenta).
Los cultivos celulares crecidos en medio Minca, durante 4h a 37 °C, con agitación a 250 r.p.m,
se colectaron mediante centrifugación a 4000 r.p.m. por 30 minutos. Luego se resuspendieron
en tampón fosfato salino (PBS) hasta alcanzar una absorbancia de 60DO. La extracción y
clarificación de las fimbrias se realizó por el método de de Graff y Roorda (1982). Las fimbrias
se purificaron por cromatografía de exclusión molecular en Sephacryl S-1000 (Pharmacia,
E.U.A).. A las fracciones purificadas se les determinó la concentración de proteínas totales
(Lowry et al, 1951). La pureza se estimó por SDS – PAGE al 12,5% (Laemli, 1970), la
intensidad de las bandas se leyó en un fotodensitómetro (Atom, España). La inmunodetección
de las proteínas fimbriales se realizó por ELISA utilizando anticuerpos policlonales.
Inmunización de los ratones:
Se ensayaron dos esquemas de inmunización diferentes (Cuadro.1). En ambos se inmunizaron
ratones hembras Balb/c (CENPALAB, La Habana, Cuba) de 19 – 20g de peso, de 6-7 semanas
de edad, con la fimbria F41 purificada. En el esquema 2 se añadieron al inmunógeno 5 x 108
UFC. mL-1 células muertas por tratamiento con 0,5% formalina. Las que antes de ser
utilizadas se lavaron mediante centrifugación 20 min a 10 000 rpm y se resuspendieron en PBS
(Runnels et al., 1987). Las inmunizaciones primarias se realizaron por vía subcutánea. Las
inmunizaciones finales se efectuaron tres días antes de la fusión. Los títulos de los ratones se
midieron por ELISA (Campal et al., 2003) diez días después de cada inmunización.
Cuadro 1. Esquemas para la inmunización de los ratones con la fimbria F41.
Inmunización
Inmunización secundaria
Inmunización
primaria
final.
No.
Adyu- Dosis Adyu- Dosis Vía Frecuencia # de
Adyu- Dosis Vía
Esvante
(µg)
vante
(µg)
veces vante (µg)
quema
/ tipo
de Ag
1/ F41
ACF
10
AIF
10
s.c quincenal
3
no
10
i.p
2/F41
+
células
AIF
50 +
células
AIF
ídem
i.p
30 días
2
no
ídem
i.v
i.p – intraperitoneal; i.v – intravenosa; s.c – subcutánea.
Generación y purificación de los anticuerpos monoclonales.
3
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Los esplenocitos de los ratones con mejores títulos se fusionaron con las células de mieloma
murino X63/Ag8/653 (CRL- 1580, ATCC, USA) en una proporción (5:1), el resto de los
procedimientos de generación de los AcM y su purificación se realizaron como describieron
Campal et. al., (2003). Para el análisis de los resultados de la fusión se utilizó el programa
estadístico SPSS 11.7. Los datos de eficiencia de fusión y positividad se analizaron
estadísticamente mediante una prueba de comparación de proporciones. Las absorbancias de
los hibridomas positivos se analizaron mediante una prueba T para muestras independientes.
Caracterización de los anticuerpos.
El isotipo de los AcMs se determinó por inmunodifusión radial (Ouchterlony, 1978), utilizando
las condiciones y los antisueros anti-inmunoglobulinas (Ig) de ratón descritos por Campal et
al., 2003.
Para el ensayo de Western- Blot, se aplicaron en un gel de SDS-PAGE al 15%, 30 µg de
extractos de la fimbria F41 y se separaron electroforéticamente (Laemli U.K, 1970).
Posteriormente se transfirieron a un soporte de nitrocelulosa (Schleider & Shuell Co.,Keene,
N.H) usando un equipo de transferencia semiseco (Sigma, USA) a 500 mA. Se siguió el método
descrito por Towbin et al. (1979). La nitrocelulosa se incubó con el sobrenadante de los
hibridomas sin diluir. Como control positivo se utilizó un AcP anti – F41 obtenido en conejo y
como control negativo un AcP anti – F4 en conejo diluidos 1/50. Luego, se adicionaron los AcP
anti-Ig de ratón en conejo a las muestras y anti-Ig de conejo en carnero para los controles. La
reacción se reveló con proteína A-oro coloidal hasta que apareció la banda coloreada.
Ensayos inmunoenzimáticos en placa (ELISA).
En general, para el recubrimiento de las placas de microtitulación (Nunc, Maxisorp, Denmarck)
se utilizó el tampón carbonato / bicarbonato de sodio 0,05 mmoL, pH 9.6 y las placas se
incubaron 3h a 37°C. Los lavados se realizaron con PBS – 0,05% de Tween 20. Para el bloqueo
y la dilución de las muestras se utilizó una solución de PBS / 0,5% de leche descremada
(Oxoid, UK). En todos los casos el conjugado se incubó durante 1h a 37°C. El sustrato consistió
de 4,62 mmol.L-1 de ortofenilendiamina (OPD), 5,56 mmol.L-1, H2O2, Na2HPO4 0.05 mol.L-1 y
ácido cítrico 0.02 mol, pH5). Las placas se leyeron a 492 nm en el lector de placas Multiskan
Titertek MC 340nm – 492nm.
Los ELISA indirectos para la titulación de los sueros de los ratones, el tamizaje de los
sobrenadantes y la determinación de la reactividad cruzada de los AcMs frente a antígenos
fimbriados relacionados se realizaron con las condiciones descritas por Campal et al., 2003
para los AcM anti – F4. Los sueros murinos se colocaron en diluciones seriadas base 2,
mientras que los sobrenadantes de los hibridomas no fueron diluidos.
ELISA
con
dos
anticuerpos
para
la
inmunodetección
de
la
fimbria
F41.
El recubrimiento se realizó con 5µg . mL-1 del AcP de carnero anti – F41, purificado, y se
incubó 3h a 37°C. Luego del bloqueo, durante 1h a 37°C, se realizaron diluciones seriadas
base 2 de las fimbrias y se incubaron 3h a 37°C. Como conjugado se empleó un anticuerpo
policlonal anti-F41 obtenido en conejo marcado con peroxidasa (HRP). Después de 10 min con
el sustrato cromogénico se leyeron las placas a 492nm. Después de cada paso se realizaron 5
lavados.
ELISA competitivo para el análisis de epítopes.
El AcM CBC – F41.1 se adicionó a las placas de poliestireno, previamente recubiertas con la
fimbria F41, en concentraciones decrecientes desde 5µg . mL-1 hasta 156,2 ng . mL-1 y se
incubaron durante 2h a 37 °C. Después de los lavados, se añadieron 100 µL del AcM CBC –
F41.3 – HRP, en la dilución de trabajo establecida. Los pasos posteriores se realizaron de igual
forma que el ELISA anterior. El porciento de inhibición se calculó por la fórmula siguiente: B%
= (Bo - Bi / Bt - Bi) x 100,
I% = 100 - B%, donde; Bo – absorbancia determinada en cada
punto, unión del CBC-987p.1; Bi - unión inespecífica, absorbancia donde la concentración de
antígeno (Ag) es 0, y Bt - unión total del AcM marcado, absorbancia donde la concentración
de CBC – F41.1 es 0.
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Determinación de la constante de afinidad de los anticuerpos monoclonales.
La constante de afinidad (Ka) de los anticuerpos se estimó por el método de Beatty y cols
(1987), basado en la Ley de Acción de Masas. Para ello las placas de microtitulación (Nunc,
Maxisorp, Dinamarca) se recubrieron con 100 µL por pozo de F41 en concentraciones de 10,
7.5, 5, 2.5, 1.25 µg . mL-1, diluidos en tampón de recubrimiento. Luego de bloqueadas, las
placas se incubaron durante 3h a 37°C con concentraciones del AcM desde 3 µg . mL-1 hasta
5,86 ng . mL-1. Posteriormente, se añadió el AcP anti-ratón en conejo - HRP diluido en
solución de bloqueo. La reacción se detectó por adición del sustrato cromogénico. La cantidad
de AcM adherido al Ag en la placa [AgAc] se midió a partir de los valores de absorbancia
(Abs) leídos a 492nm.
Al realizar diluciones seriadas del AcM se obtiene para cada
concentración de recubrimiento una recta de absorbancia (Abs) contra la concentración de
AcM adicionado al pocillo. La expresión (Abs max) representa al valor máximo de Abs e indica
mayor reactividad entre el Ag y el AcM para cada una de las concentraciones de Ag utilizadas
en el recubrimiento y es un reflejo del número relativo de epítopes que el AcM reconoce en el
antígeno. Para cada caso se calcula, por la ecuación de la recta, la concentración del AcM para
el 50% de la unión con el Ag. Para ello, se toman los valores de Abs medidos para cada
concentración de recubrimiento, y se calcula el porciento de unión respecto a la unión máxima
(Abs max), que es el 100% de la unión del AcM con el Ag. Para el cálculo de la constante de
afinidad se seleccionan las dos valores más cercanos de la concentración de AcM calculada al
50% de la unión: [ Ac150%] y [ Ac250%] y se sustituyen en la ecuación Ka = ½ ( 2 [ Ac150%]
- [ Ac250%]). Debe asumirse que los títulos de unión del Ag en el monómero de Ac son
idénticos y no existe cooperatividad entre ellos.
Elisa para cuantificar al antígeno F41.
Las placas (Nunc, Polisorb, Dinamarca) se recubrieron con 5µg . mL-1 del CBC-F41.3 purificado,
e incubaron durante 3 horas a 50°C, en tampón de recubrimiento. Después de los lavados, se
añadió a los pocillos, por triplicado, la fimbria F41 purificada diluida en solución de bloqueo en
concentraciones desde 600 ng . mL-1 hasta 16,26 ng . mL-1 . Para la cuantificación, a las
muestras se le realizan al menos tres diluciones. Las placas se incubaron 2h a 37°C. Después
de los lavados, se añadieron a los pocillos 100µL del mismo AcM - HRP. Finalmente se añadió
la solución del sustrato y la placa se leyó a 492nm. La concentración de las muestras se
calculó por la ecuación y = m (ln x) + a, donde y es la Abs leída a 492nm para cada punto y
x la concentración del Ag.
RESULTADOS.
Abs 492 nm
Los dos esquemas utilizados para la inmunización de los ratones dieron lugar a títulos de
anticuerpos en suero de hasta 1/ 16000. En las diluciones inferiores se observan valores de
absorbancia más altos en los sueros de animales inmunizados con el esquema dos, sugestivo
de respuestas de anticuerpos
más intensas (Fig, 1).
1,600
1,400
1,200
Esquema1
1,000
0,800
Esquema 2
0,600
No inmunizado
0,400
0,200
Fig. 1 Títulos medio de
0,000
anticuerpos en suero de los
ratones inmunizados con los
dos esquemas de inmunización.
Valores medios de 2 animales.
0
5000
10000
15000
20000
Recíproco diluciones suero
5
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Para la obtención de los AcM necesarios para el diseño de los sistemas de diagnóstico se
realizaron 2 experimentos de fusión que dieron lugar a 4 líneas estables de hibridomas
(Tabla.2).
Tabla.2 Resultados generales de los experimentos de fusión.
No.
fusión
antíge
no
1
2
± ES
F41
F41
Esquema
de
inmunizaci
ón
1
2
%
Eficiencia/
%
positividad
50 / 26,4
62 / 70
(2,9/
3,54)**
Promedio
AcM
Absorban
cia
obtenido
Isoti
po
máxima*
0,964a
1,092b
CBC –
F41.1
IgM
CBC –
F41.2
IgM
CBC –
F41.3
IgG1
CBC –
F41.4
IgG1
0,0158
* Comprende el resultado del tamizaje primario de los 20 híbridos con los mayores niveles de absorbancia
medidos a 492nm por ELISA.
** p< 0,05
La fusión realizada con los linfocitos de ratones inmunizados con la fimbria F41
según el esquema 1 tuvo una eficiencia del 50%, muy baja, al igual que el porciento
de híbridos positivos (26%), los que se caracterizaron además por su inestabilidad
en la secreción de inmunoglobulinas. Como resultado, se clonaron cuatro híbridos,
quedando como líneas estables los hibridomas CBC- F41.1 y CBC - F41.2 secretores
de anticuerpos de isotipo IgM.
En la fusión realizada con los esplenocitos de los animales inmunizados siguiendo el
esquema 2, aunque la eficiencia continuó siendo baja, un alto número de los híbridos
obtenidos reaccionaron positivamente frente a la fimbria F41 (70%). Al comparar,
para cada fusión, el valor promedio de las veinte mayores lecturas de absorbancia,
de igual número híbridos medidos mediante ELISA recubriendo con el antígeno, pudo
comprobarse que existían diferencias estadísticamente significativas entre ellos,
siendo superior el promedio de las absorbancias correspondientes a los híbridos de la
fusión 2. Estos hibridomas mantenían una secreción estable de anticuerpos (datos no
mostrados), como resultado, se establecieron las líneas celulares CBC-F41.3 y CBCF41-4 productoras de anticuerpos específicos hacia las fimbrias F41 de isotipo IgG1.
Todos los anticuerpos monoclonales obtenidos, fueron específicos hacia el antígeno
F41, excepto el CBC-F41.1 que reconoce un epítope común a las fimbrias F5 y F41
el que también está presente en una preparación purificada de la fimbria F5 de
origen recombinante (Fig.2). Los ensayos de competencia demostraron que el
epítope reconocido por el CBC – F41. 3 en la fimbria F41 es diferente al reconocido
6
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por los anticuerpos CBC-F41.1 y CBC –F41.2 (Fig. 3). Por lo que puede establecerse
que los AcMs CBC – F41.1, CBC- F41.2 y CBC – F41.3 reconocen al menos a tres
epítopes diferentes en la fimbria F41, de naturaleza conformacional, ya que se
pierden cuando la F41 es sometida a tratamiento con agentes reductores y
detergentes, como se evidenció en el ensayo de Western Blot. (Fig.4).
Abs 492nm
2,500
2,000
1,500
1,000
0,500
0,000
987 P
K99rec
K99
F41
K88ab
K88ad
K88ac
Antígenos 10 µ g. mL− 1
C-
CBC -F41.1
CBC - F41.2
CBC-F41.3
CBC-F41.4
C+
Fig. 2 Reactividad de los anticuerpos monoclonales dirigidos hacia la fimbria F41 frente
a antígenos relacionados. La sigla K99rec denomina a la K99 de origen recombinante.
120,0
CBC-F41.1/competencia
% de unión
100,0
CBC-F41.1
80,0
60,0
CBC-F41.2/competencia
40,0
CBC-F41.2/competencia
20,0
CBC-F41.2
0,0
CBC-F41.3 -HRP
0
2000
4000
6000
AcM ng . mL-1
Fig. 3 Los anticuerpos CBC- F41.1, CBC-F41.2 y CBC-F41.3 – HRP reconocen epítopes
diferentes en la fimbria F41.
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Figura 4. Ensayo de Western Blot con la fimbria F41. 1.
Anticuerpo policlonal anti –F41 obtenido en conejo; 2
CBC – F41.2; 3. CBC – F41.3.
La constante de afinidad estimada para los
anticuerpos CBC- F41.2 y el CBC – F41.3 fue de 1,
83 x 10 9 M y 1,77 x 10 7 M respectivamente. Para
los restantes AcMs esta no se estimó y en general,
el anticuerpo CBC-F41.4 no se caracterizó.
El isotipo del anticuerpo, así como la especificidad y la afinidad del CBC – F41.3,
hicieron de él un reactivo adecuado para el desarrollo de un ELISA para la
cuantificación del antígeno. En el mismo, dada la estructura polimérica de la fimbria,
fue posible utilizarlo como anticuerpo de recubrimiento y conjugado. El rango optimo
de detección del antígeno fue desde 600 ng . mL-1 hasta 16, 26 ng. mL-1 en muestras
purificadas, extractos y células (Fig. 5).
1,200
y = 0,2572Ln(x) - 0,6178
R2 = 0,9895
Abs 492 nm
1,000
0,800
0,600
CBC - F41.3
0,400
0,200
0,000
0
200
400
600
800
F41 ng. mL-1
Figura. 5. Rango de detección de la fimbria F41 en el ELISA de cuantificación con el CBC
– F41.3 . Cada punto corresponde a la media de tres valores.
DISCUSIÓN.
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El principal criterio tomado en cuenta para el diseño del primer esquema
de
inmunización fue la inmunogenicidad de las fimbrias, dada su estructura polimérica y
alto peso molecular. Por ello, este se realizó administrando bajas dosis de la F41 por
vía subcutánea. Sin embargo, aunque se obtuvieron altos títulos de anticuerpos en
suero, el número de híbridos positivos en la fusión fue bajo y la mayoría de ellos
dejaron de secretar durante el proceso de cultivo y caracterización. Ello es un indicio
de que la mayoría de hibridomas secretaban anticuerpos de isotipo IgM, como fue
comprobado para las dos primeras líneas establecidas: CBC – F41.1 y el CBC – F41.2.
El carácter mayoritario secreción de IgM puede ser el resultado de una respuesta
inmune primaria que involucra a los linfocitos B, y da lugar a la producción de
inmunoglobulinas por las células plasmáticas, sin requerir para ello de la estimulación
y cooperación de las células T, o sea es un antígeno independiente de las células T. Lo
mismo ya había sido sugerido previamente por Campal et al., 2003 para la fimbria
F4, tomando como antecedentes los estudios realizados por Ponniah et al., en 1992
Estos investigadores demostraron que la fimbria tipo 1 de la Escherichia coli es capaz
de activar las diferentes etapas de la respuesta inmune en la células B humanas en
reposo: la proliferación, activación, maduración y la secreción policlonal de IgM, sin
requerir de la cooperación de las células T, siendo crítica en esta respuesta el
reconocimiento de los residuos de manosa por parte de la subunidad FimH que es la
adhesina y actúa como una lectina.
Así, en el segundo esquema, se incluyó a las células completas muertas con
formalina con el objetivo de lograr una presentación más efectiva del antígeno a los
órganos linfoides y la activación policlonal del sistema inmune que involucrara a los
linfocitos T. Como resultado en la fusión 2 se incrementó significativamente la
eficiencia, así como la cantidad e inmunoreactividad de los híbridos positivos hacia la
fimbria F41, esto último es indicador de una secreción más estable de
inmunoglobulinas, así como de la existencia de hibridomas altamente secretores o de
la producción de anticuerpos de una mayor avidez por el antígeno.
La constante de afinidad estimada para el AcM CBC-F41.2 fue alta, superior a la del
CBC – F41.3 que puede valorarse de media. Aunque no fue posible estimar la
constante de afinidad de los otros dos anticuerpos es nuestro criterio que en el valor
de las constantes influyó la valencia de los anticuerpos y el número de inmunizaciones
realizadas a los animales, que fue superior en el esquema 1.
Los AcM CBC – F41.1, CBC- F41.2 y CBC – F41.3 reconocen a tres epítopes diferentes
en la fimbria F41, uno de ellos está presente además en la fimbria K99, ello está en
correspondencia con los estudios de van Zijderveld et al. (1989), quienes demostraron
la existencia de al menos 5 epítopes inmunodominantes específicos para la F41
distribuidos por toda su estructura. Los resultados obtenidos indican la presencia de
un sexto epítope, situado en una región conservada en las fimbrias F5 y F41. Aunque
no existen reportes al respecto y la homología a nivel de secuencia nucleotídica y
aminoacídica entre ambas fimbrias es limitada, la existencia de tal epítope puede
deducirse de resultados obtenidos en estudios anteriores: 1) la vacunación con la
fimbria F5 purificada protege a cerdos neonatos (Runnels, et al., 1987) y terneros (
Acres, et al., 1979) del reto con cepas de ECET productoras de ambos antígenos F5 y
F41, 2) AcM contra la fimbria F5 pueden proteger a los terneros del reto con cepas de
ECET que solo expresan a la F41(Sherman et al., 1983), 3) La obtención de un AcM
anti –K99, de isotipo IgM que reconoce un epítope en la fimbria F41 purificada con
una afinidad comparable a la que presenta frente al antígeno F5 purificado (Junco, et
al., 2003), 4). No se debe descartar que el epítope común pertenezca a una de las
subunidades menores que componen la estructura de la fimbria F41, por ser éstas
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muy conservadas entre las fimbrias como resultado de un posible origen evolutivo
común y de generalidades existentes entre los mecanismos de biosíntesis y
ensamblaje de las fimbrias expresadas por las Escherichia coli, tal y como ocurre
entre las subunidades menores de la fimbria F41 y F4 (Anderson y Moseley, 1988).
Para la demostración de esta hipótesis se requieren ensayos de inmunoprecipitación u
otros estudios moleculares más detallados.
Todos los epítopes reconocidos por los anticuerpos monoclonales son
conformacionales, presentes solo cuando, la fimbria mantiene su estructura nativa,
coincidiendo con los resultados de van Zijderveld et al., 1989, quienes obtuvieron 23
AcM hacia la fimbria F41, ninguno de los cuales era capaz de reaccionar con la misma
en experimentos de Western Blot.
En 1987, Raybould et al desarrollaron un ELISA capaz de detectar hasta 5ng. mL-1 del
antígeno F41 purificado empleando un AcM y anticuerpo policlonal anti –F41 obtenido
en conejo. Aunque el ELISA desarrollado en este trabajo, tiene un rango de detección
menor, este fue útil para el control de muestras procedentes de cultivo y sirve de
punto de partida para el establecimiento de las condiciones ensayo que permitan la
óptima detección de la F41 en muestras de hisopados rectales de cerdos y terneros.
Por tanto, los AcM obtenidos son útiles, no solo para profundizar en el conocimiento
de la estructura de la fimbria F41, sino también para el desarrollo de ensayos de
detección y cuantificación del antígeno que serán de gran utilidad en la práctica
veterinaria, lo que permitirá profundizar en el impacto real que tienen las diarreas
causadas por las ECET F41+ en cerdos y terneros neonatos.
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