Quilomicrones en carnívoros marinos.

Trabajo Práctico
Química Biológica
INTEGRANTES
 Bernstein, Mariana.
 Dury, Lucia.
 Fernández Blanco, Victoria.
 Paz, Estefanía.
Utilizamos de base el trabajo realizado por: Margaret Cooper, Sara Inverson y
Horacio Heras:
La dinámica del acido graso del quilomicrón sanguíneo en un carnívoro
marino: sus implicaciones en el metabolismo lipídico y estimaciones
cuantitativas de la dieta del predador.
Este trabajo analizó los ácidos grasos, tanto los presentes en quilomicrones como
en el tejido adiposo, estos pueden proveer estimaciones precisas para inferir la presa
dominante del predador.
Un aspecto importante que tuvieron en cuenta fue que debido a la absorción
intestinal del ácido graso y su incorporación en quilomicrones, la relación entre la
composición del ácido graso proveniente de la dieta y aquel del tejido adiposo se puede
ver afectada. Por este motivo uno de los objetivos principales fue investigar el
metabolismo de cada uno de los ácidos grasos en las primeras etapas de asimilación,
caracterizando la composición de los ácidos grasos de los quilomicrones a través del
período completo de digestión y comparándolos con los de la presa.
Hasta hace poco el estudio de los ácidos grasos había sido utilizado solo para
inferir datos cualitativos sobre la presa dominante en mamíferos marinos y aves. Estos
investigadores utilizaron además datos cuantitativos, pero esto requirió un cuidadoso
estudio del metabolismo del ácido graso en el predador, como explicamos anteriormente.
Aunque el triacilgricérido del quilomicrón no es exactamente similar al de la dieta es
el que mejor la refleja, ya que estos son de origen exógeno, mientras que la composición
de los fosfolípidos y ésteres de colesterol es de origen endógeno (producidos por el
organismo). Por este motivo son los únicos utilizados en el análisis.
El segundo objetivo de los autores fue estimar cuantitativamente la composición de
la dieta usando el modelo QFASA (Quantitative Fatty Acid Signature Analysis). Este
modelo provee información a largo plazo de la dieta del animal estudiado.
Los materiales y métodos que utilizaron en el estudio fueron: seis focas (entre
2 y 3 años) de la población del Scotian Shelf del este de Canadá (Halichoerus grypus).
Las focas estuvieron en ayuno por 24 hs antes de comenzar el experimento. La primera
muestra se tomo antes de alimentarlas, de la parte posterior de la aleta utilizando
Vacuteiner con anticoagulante. Cada animal fue alimentado de un mismo lote de Arenque
Atlántico (Clupea harengus): a tres de ellas se las alimento con 2.3 kg y a las demás con
4.6 kg. A la vez 10 arenques del mismo lote fueron elegidos al azar y se los guardó para
un futuro análisis. Las focas fueron capturadas a las 0, 1, 3, 6, 9, 12 y 24 hs después de
haber sido alimentadas y se les tomó una muestra de sangre.
Se utilizo una densidad de 1.006 gr/ml para aislar las lipoproteínas con un diámetro
mayor a 100nm. Así se logró aislar la mayoría de los quilomicrones (de 35 a 250nm) y
minimizar la contaminación de VLDL (de 30 a 110nm).
Las muestras fueron centrifugadas y examinadas visualmente, identificando la
presencia y cantidad de quilomicrones evidenciada en una capa blanca y opalescente en
la superficie. Siendo clasificadas como limpias o teniendo poca, moderada, alta o muy alta
concentración de quilomicrones.
Para calcular el grado en que la composición del ácido graso del quilomicrón se
asemeja a aquella de la ingerida en la dieta, se utilizó el promedio Kulback-Leibler (KL),
que es la distancia entre el quilomicrón y los ácidos grasos del arenque. A menor
distancia de KL mayor similitud entre ambos.
Los resultados que obtuvieron fueron:
Uno de los inconvenientes que se les presentaron fue que estuvieron incapacitados
de obtener suficientes lípidos para un análisis confiable. Esto fue debido a la presencia de
bajos niveles de lípidos en el muestreo de las 0 y 24 hs; y en mayor parte a los reducidos
volúmenes de sangre obtenidos a medida que el proceso de muestreo avanzaba.
El análisis visual indico que los quilomicrones aparecieron en sangre una hora
después de que las focas fueran alimentadas, luego entre las 3 y 6 horas se evidenció un
pico en la densidad observada, para después declinar suavemente hasta que la capa no
fuera más evidente. Sin embargo las focas alimentadas con 4.6 kg de arenque, mostraron
el pico más tempranamente y a la vez persistió más tiempo que en aquellas alimentadas
con 2.3kg.
Las menores distancias de KL calculadas se observaron a las tres horas después
de la alimentación, indicando que el ácido graso del quilomicrón y aquel de la comida eran
más similares en este momento. Además la tendencia general de las focas alimentadas
con 4.6kg es tener distancias de KL menores que las alimentadas con 2.3kg. De todos
modos los dos grupos exhiben el mismo patrón de KL en el tiempo.
Además, en un trabajo independiente se realizó una comprobación de la eficacia
del modelo QFASA. Se estudiaron dos grupos de focas: a uno se lo alimentó con el
arenque experimental y además con 4 especies seleccionadas de la base de datos del
Scotian Shelf con un contenido similar de ácidos grasos. Y al otro subgrupo se le dio una
dieta mas variada, con el arenque experimental y las 28 especies que componían la
totalidad de la base de datos provista por el Scotian Shelf más otro lote de arenque
distinto del experimental.
El uso del modelo QFASA en ambos grupos funcionó bien, estimando la dieta tanto
en los que fueron alimentados selectamente como en aquellos con alimentación más
variada. De hecho el modelo utilizado arrojó datos más precisos cuando se lo aplicó al
segundo grupo, incluso identificando al arenque experimental como la presa principal, por
sobre las otras 28 especies consumidas.
No obstante, algunas presas fueron identificadas erróneamente debido a la
similitud de sus ácidos grasos con los del arenque, y a la aparición de “ruido” introducido
en las marcas de los quilomicrones debido al aumento de la relación Fosfolípidos:
Triacilglicéridos con el correr del tiempo.
Aunque el modelo QFASA proveyó estimaciones acertadas sobre la dieta, el
tiempo desde la comida y el tamaño de la misma influenciaron la precisión de los
resultados.
Mantenimiento de la temperatura corporal en
Halichoerus grypus y su relación con la dieta.
Objetivo 1: Identificar si el ácido graso 22:1(n-11) participa en la generación de
calor en la grasa parda a través de la β-oxidación.
Objetivo 2: Si por condiciones ambientales no se consumen estos ácidos grasos,
¿podrán igualmente mantener la temperatura corporal?
Metodología
PARTE 1
Extracción de lípidos del arenque: se homogeniza el tejido de interés en una
mezcla de solución de Folch (cloroformo/metanol 2:1 v/v) y agua.
Se separarán 2 fases: en la fase superior (metanol/agua) se mantendrán las
moléculas más polares, tales como proteínas y glúcidos, quedando en la fase inferior
(cloroformo) los lípidos.
Separamos la fase que nos compete y realizamos una cromatografía de adsorción
para separar los lípidos que nos interesan.
 Cromatografía de adsorción en columna: en una columna de vidrio
colocamos gel de sílice (una forma de ácido silícico) y en la parte superior de dicha
columna volcamos la mezcla de lípidos/cloroformo extraída anteriormente. Los lípidos
polares se fijan fuertemente al ácido silícico polar, mientras que los lípidos neutros pasan
directamente a través de la columna y emergen en el primer lavado con cloroformo. A
continuación se eluyen los lípidos polares, en orden de polaridad creciente, lavando la
columna progresivamente con disolventes de mayor polaridad.
Utilizamos para los siguientes análisis las primeras fracciones que emergen de la
columna y que tendrán los lípidos neutros y poco polares, donde encontraremos los
ácidos grasos libres.
 Cromatografía de gas líquido: este método separa los componentes volátiles
de una mezcla según sus tendencias relativas a disolverse en el material inerte
empaquetado en la columna cromatográfica y a volatilizarse, desplazándose a través de
la columna, arrastrados por una corriente de un gas inerte. El orden de elución depende
de la naturaleza del absorbente sólido de la columna y del punto de ebullición de los
componentes de la mezcla lipídica. El tiempo que tarda un compuesto en emerger de una
columna de cromatografía es llamado tiempo de retención.
Podemos identificar la identidad del acido graso 22:1 si se utiliza el tiempo de
retención relativo:
t.r.r. compuesto X =
.
t.r. compuesto X
t.r. compuesto de referencia de identidad conocida
Para esto, debemos agregarle a la mezcla un compuesto de referencia con un
tiempo de retención conocido.
El resultado lo comparamos con los valores de t.r.r. tabulados, pudiendo extraer así
el ácido graso 22:1.
 Marcado radioactivo del ácido graso: utilizamos C14 para marcar nuestra
muestra del ácido graso 22:1, luego de esto se lo introduce en los arenques que
posteriormente serán utilizados como alimento.
A las 12hs y 24hs extraeremos una muestra de tejido pardo de cada foca para
analizarla.
 Análisis de la muestra de tejido: para visualizar los lípidos marcados se
pueden usar 3 metodologías:
 Exposición a una película radiográfica.
 Contador de Geiger-Muller.
 Espectrofotometría de centelleo o contador de centelleo líquido.
PARTE 2
Una vez revelados los resultados, y si es comprobada nuestra hipótesis de que la
producción de calor por la grasa parda es debido a la ingesta del ácido graso en cuestión,
llevaremos a cabo un segundo estudio donde analizaremos si las focas podrán mantener
su temperatura corporal en ausencia de estos lípidos. Para esto realizaremos:
 Alimentación: Alimentaremos a un grupo de focas con el Arenque rico en el
ácido graso 22:1. Y a otro grupo lo alimentaremos con una dieta carente de dicho ácido
graso.
 Medición de la temperatura: mediremos durante 15 días, 3 veces por día, la
temperatura corporal a ambos grupos de focas, para luego comparar los datos.
Conclusiones
Si en el segundo grupo la temperatura descendiera significativamente
comprobaríamos nuestra segunda hipótesis.
Si no pasara esto, deberíamos realizar otro análisis para buscar el o los ácidos
grasos que reemplazarían la función del 22:1.