UNIVERSIDAD CATÓLICA DE VALPARAÍSO INSTITUTO DE QUIMICA SECCIÓN DE BIOQUÍMICA.

UNIVERSIDAD CATÓLICA DE VALPARAÍSO.
INSTITUTO DE QUIMICA
SECCIÓN DE BIOQUÍMICA.
TAREA BIOQUÍMICA EXPERIMENTAL II
1.
a.
b.
c.
d.
R:
2.
a.
b.
R:
3.
a.
b.
R:
BQA 445
Un extracto crudo contiene 20 mg/ml de una proteína. 10 lt de este extracto en un
volumen de reacción de 0,5 ml catalizan la formación de 30 nmoles de producto en un
minuto bajo condiciones óptimas de ensayo (pH, , [S]sat, etc.).
Exprese la velocidad de conversión en nmoles/min en el ensayo y la velocidad de
reacción en nmoles/(ml min), nmoles/(lt min), moles/(lt min) y en M/min en el
ensayo.
Cuál sería la velocidad si los mismos 10 lt del extracto se ensayan en un volumen total
de 10,0 ml ?
¿Cuál es la [E] en el ensayo y en el extracto? (UI/ml)?
¿Cuál es la actividad específica de la preparación?
a.
60x10-6 M
b.
3x 10-6 M
c.
60x10-3 UI/ml
d.
0,15 UI/mg
Una preparación enzimática tiene una actividad específica de 42 U/mg de proteína y
contiene 12 mg/ml de proteína.
Calcule la velocidad inicial de la reacción en 1,0 ml de mezcla que contiene :
20 lt de la preparación
5 lt de la preparación
¿Debe ser diluida la preparación antes del ensayo?
504 UI/ml
10,08 UI
2,51 UI
15 lt de una preparación enzimática catalizan la producción de 0,58 moles de
producto en un minuto en condiciones óptimas de ensayo.
¿Cuánto producto se formará en un minuto con 150 lt de la preparación?
¿Cúanto tiempo tomará a 150 lt de la preparación producir 0,52 moles de producto
bajo las mismas condiciones de ensayo?
a.
0,58 moles/min
5,8 moles/min
b.
5,4 seg
1
4.
a.
b.
c.
R:
5.
R:
6.
R:
7.
R:
8.
2
Un gramo de una enzima pura (PM 92.000) cataliza una reacción a una velocidad de
0,50 moles/min bajo condiciones óptimas. Calcule :
La actividad específica (U/mg) de la enzima.
El número de recambio.
La duración de un ciclo catalítico?
a.
500 UI/mg
b.
4,6 x 104 min-1
c.
2,17 x 10-5 min
Un gramo de músculo fresco contiene 40 unidades de una enzima con un número de
recambio de 6 x 104 min -1. Estime la concentración intracelular de la enzima.
Suponga que 1,0 gr de músculo fresco contiene aproximadamente 0,8 ml de agua
intracelular.
8,33 x 10-7 M
Calcular la actividad catalítica de una enzima en UI y en katal, como también la
actividad específica.
El ensayo enzimático se realizó en las siguientes condiciones :
La medida de actividad se realizó a 339 nm, la pendiente de la curva absorbancia versus
tiempo fue 0,063 min-1 en un volumen de ensayo de 3,0 ml. El volumen de la muestra
enzimática fue de 2 x 10 - 4 lt. La muestra contiene 10 grs de enzima por litro.

=
0,63 lt/mmol x mm
l
=
10 mm
-1
2500 nkat l
150 UI l-1
250 nkat/gr ptna
15 UI/gr ptna
A 40 mgr de un tejido homogenizado en 1,0 ml de medio, se le agregan 10 lt de
deoxicolato. A un volumen de 2 lt de este homogenizado, se mide la actividad láctico
deshidrogenasa monitoreando la oxidación del NADH a 340 nm en presencia de
piruvato. El volumen de ensayo es de 0,9 ml y la variación de la absorbancia por min es
de
0,02 min -1. El  para el NADH es 6,3 lt/ mmol x cm.
Calcular la actividad catalítica en UI en el ensayo y la actividad específica del extracto.
1,44 UI ml-1
0,036 UI/mg
Se cuantifica fructosa 1,6-bisfosfato (FBF) (PM : 340 Dalton) en hígado de rata
mediante el ensayo enzimático con aldolasa / triosafosfato isomerasa / glicerofosfato
deshidrogenasa. Dos moles de NADH se transforman por mol de FBF. Para preparar el
extracto, se homogeniza 1,0 gr de tejido fresco en 7,25 ml de HClO4. Con un valor de 75
% (p/p) para el contenido fluido del hígado, el volumen del extracto es 7,25 + 0,75 =
8,00 ml. Para neutralizar y remover el perclorato, 0,2 ml de una solución de K2CO3 se
R:
9.
a.
b.
10.
a.
b.
c.
11.
a.
b.
añaden a 6,0 ml del extracto. El volumen de la solución libre de perclorato es 6,2 ml. El
factor de dilución para el extracto es 6,2/6,0 = 1,033, y para el tejido es 8 x 6,2/6,0 =
8,267.
El cambio de absorbancia medido a 339 nm 0,120 ( = 0,631 l/mmol x mm); el
volumen del ensayo es 3 x 10 –3 l, el volumen de la muestra es 1,5 x 10-3 l, y el paso de
luz, 10 mm.
Calcule la concentración del metabolito en el extracto libre de perclorato (mmol/l, mg/l)
y el contenido de FBF en el tejido (mmol/kg).
0,0196 mmol l-1
6,67 mg l-1
0,157 mmol Kg-1
Se ensaya la enzima alcohol deshidrogenasa siguiendo la formación de NADH
espectrofotométricamente en una celda de 1 cm. La mezcla del ensayo (volumen total
2,0 ml) contiene exceso de etanol, tampón y 0,1 ml de la preparación enzimática
convenientemente diluida (20 l en 1,0 ml). La preparación enzimática original
contiene 120 g ptna/ml. La absorbancia a 340 nm aumenta a una velocidad de 0,060
min-1.
¿Cuál es la concentración de la lactato deshidrogenasa en la preparación enzimática
(UI/ml)?
¿Cuál es la actividad específica de la enzima en la preparación (UI/mg ptna)?
 NADH = 63 (mM cm) -1
Un extracto libre de células de E. coli contiene 24 mg de proteína por ml. 20 l de este
extracto catalizan la incorporación de glucosa-14C desde glucosa-14C-1-fosfato a
glicógeno a una velocidad de 1,6 nm min-1 en un volumen de ensayo de 0,1 ml.
Calcule :
La velocidad de conversión en unidades internacionales (UI).
La velocidad de reacción en moles l –1 min -1.
La actividad específica del extracto en kat mg-1.
En un ensayo para determinar la actividad de una enzima se preincuba 4,9 ml del
sustrato saturante a el pH y temperatura adecuados y se inicia la reacción agregando 0,1
ml del extracto enzimático diluido (1/20). Después extrae alícuotas de 1,0 ml del medio
de ensayo a los tiempos 2, 4, 6 y 8 min. que agrega a 2,0 ml de carbonato de sodio 2,0 M
para detener la reacción. La absorbancia medida a 400 nm. se indica en la tabla. El
coeficiente de extinción del producto a esa longitud de onda es 10.000 M -1 cm -1.
Calcule la velocidad de la reacción (U/ml) en la cuveta y la concentración de la enzima
(U/ml) en el extracto.
Indique qué controles debió realizar para chequear posibles artefactos, como también
reacción no enzimática.
t (min)
2
4
6
8
3
A (400 nm)
12.
0,09
0,20
0,31
0,39
Se estudió la actividad de la enzima ureasa, que cataliza la reacción
CO(NH2)2
+
H2O 
CO2 +
2NH3
en función de la concentración de urea, con los siguientes resultados :
[urea]
velocidad
mmol/l mmol/(l x mgE)
30
3,37
60
5,53
100
7,42
150
8,94
250
10,70
400
12,04
Calcule los parámetros cinéticos ocupando el método de Hanes y Woolf ([S]/v versus
[S]). Indique la Vmax en mmol/(min x mgE), UI/mgE y en catal/Kg E.
13.
Demuestre, mediante las ecuaciones correspondientes, que la presencia de un inhibidor
reversible presente en la preparación enzimática da lugar a una curva descendente al
estudiar el efecto de la concentración de enzima en la velocidad de la reacción
enzimática.
14.
Bajo condición estándar, 10 moles de sustrato disueltos en 95 ml de tampón se llevan a
30oC, después se agrega 5 ml de tampón que contienen la enzima. Después de mezclar,
se continúa la incubación a la temperatura indicada. El Km es 5 x 10-3 M. Se obtienen los
siguientes datos :
t (min) S (moles)
10
9,0
20
8,1
30
7,3
¿Cuál es la cantidad de enzima presente en la mezcla de reacción en unidades
recomendadas por la Comisión de enzimas?
¿Cuál es la concentración de enzima presente en la solución añadida?
Se encontró que llevando la reacción a 10oC la velocidad disminuye a la mitad. Calcule
la energía de activación de la reacción.
a.
b.
c.
15.
Se encuentra que una enzima en condiciones dadas presenta un Km de 6 x 10 -3 M. En
estudios siguientes, 0,5 mol del sustrato se disuelven en tampón, se añade la enzima y
se lleva el volumen a 25 ml. Prediga el orden de la reacción.
16.
En el problema descrito anteriormente se encuentra que 0.2 mol del S se convierten a P
después de 10 min. de incubación.
4
a.
b.
c.
¿Cuánto espera que se convierta después de 20 min?.
¿Cuánto S queda después de 5 min. de incubación?.
¿Cuál sería la k obs si la cantidad de enzima se aumenta al doble ?
17.
Los siguientes datos fueron determinados en una reacción enzimática del tipo S  P
v (nmoles/lt x min)
[S M
-6
6,25 x 10
15,00
-5
7,50 x 10
56,25
1,00 x 10-4
60,00
-3
1,00 x 10
74,90
-2
1,00 x 10
75,00
a.
b.
c.
d.
Determine Km y Vmáx.
¿Cuál será la velocidad de reacción a S = 2,5 x 10-5 y
5,0 x 10-5 M.
-5
¿Cuál será la velocidad si la [S] = 5 x 10 M y la [E] es el doble de la original.
Determine la constante cinética de 1er orden para esta reacción.
18.
En presencia de una enzima que tiene un Km de 1.0 mM, a una concentración de sustrato
de 1 M, se produce la conversión de un 20% del sustrato en producto en 15 minutos.
¿Qué % de conversión se observaría en 30 minutos?
19.
La constante de equilibrio para la reacción S  P es 5. Suponga que tiene una mezcla de
sustrato y producto a una concentración de 2x10 -4 M y 3x10-4 M respectivamente.
KmS =
3 x 10 –5 M,
V máxd =
2 moles/(lt min),
i
V máx =
4 moles/(lt min).
¿En qué dirección ocurre la reacción cuando se agrega la enzima?
¿A cuál velocidad inicial tendería la reacción hacia el equilibrio? Suponga que no hay
inhibición por el “producto” de la reacción catalizada.
Si
a.
b.
20.
En una reacción enzimática realizada a pH 7.0 y a 38oC, se mide
espectrofotométricamente
la desaparición del sustrato en función del tiempo.
Tiempo (min) A (340 mm)
1
0,347
2
0,339
5
0,327
9
0,302
16,5
0,275
23
0,254
27
0,239
30
0,229
5
Determine:
a.
b.
c.
21.
El orden de la reacción.
La constante de velocidad.
La concentración inicial del sustrato, si el coeficiente de extinción es
6,02 x 10-3 (M cm)–1 y l = 1 cm
De acuerdo a los siguientes datos calcule Vmáx y Km. Comente los resultados:
[S] M v (moles/l x min)
8,33 x 10-6
13,8
-5
1,00 x 10
16,0
-5
1,25 x 10
19,0
-5
1,67 x 10
23,6
-5
2,00 x 10
26,7
2,50 x 10-5
30,8
-5
3,33 x 10
36,3
-5
4,00 x 10
40,0
-5
5,00 x 10
44,4
-5
6,00 x 10
48,0
-5
8,00 x 10
53,4
-4
1,00 x 10
57,1
2,00 x 10-4
66,7
[S] M
t (min)
-8
1,00 x 10
0
-9
9,80 x 10
10
-9
9,60 x 10
20
-9
9,42 x 10
30
-9
9,23 x 10
40
8,87 x 10-9
60
22.
Dibuje estimativamente las rectas obtenidas en el gráfico del método lineal directo
cuando la concentración de sustrato es mucho menor que el Km y cuando ésta es mucho
mayor.
¿Qué información puede usted obtener de estas rectas y qué puede concluir de las
concentraciones de sustrato usadas?
23.
Use la ecuación de Debye-Hückel para estimar i en disoluciones acuosas de CaCl2 a
25oC, a concentraciones 0,001; 0,01 y 0,1M.
24.
a.
b.
Usando la ecuación de Debye-Hückel estime :
i para una disolución acuosa de CuSO4 0,01M a 25oC .
i para una disolución acuosa de CuSO4 0,001M, MgCl2 0,01M y Al(NO3)3 0,01M a
25 oC. (Suponga que no hay asociación iónica).
25.
Obtenga una expresión que le permita calcular el pKaap para los compuestos ácidos
indicados, suponga una I = 0,02 M.
HA
HAHA+
EH2+2
a.
b.
c.
d.
6
e.
EH2+
Calcule además el  pKa para cada caso suponiendo I = 0,005; 0,010; 0,015 y 0,02 M.
26.
Calcule el pH de un tampón fosfato, donde la concentración de ambas especies (H2PO4 y HPO4=) es igual.
27.
a.
b.
c.
Calcule la fuerza iónica de un tampón acetato de sodio 0,01M pH 5,0 si lo prepara :
A partir de una solución de ácido acético agregando NaOH.
A partir de una solución de acetato de sodio a la que agrega HCl.
Igual que en b., en presencia de NaCl 0,1M.
28.
Calcule el pH de una solución de tampón fosfato 0,005M que contiene un 30% de
H2PO4- y un 70% de HPO4-2 en presencia de NaCl 0,01M.
29.
Si Ud. mezcla 40 ml de una solución de NaH2PO4 0,05M (NaCl 0,1M) y 60 ml de otra
de Na2HPO4 0,05M. La temperatura es 25 oC.
Indique o calcule :
la concentración de la solución tampón
su fuerza iónica
el pKa aparente del tampón
el pH de la solución.
30.
¿Cuál es el pH de una solución de KCl 0.05M que contiene K2HPO4 0.01M y KH2PO4
0.01M?
pKA1
2,13
20 oC
pKA2
7,22
pKA3
12,38
¿Cuál es la fuerza iónica de la solución?
31.
¿Cuál tampón posee mayor fuerza iónica :
tampón TRIS 0,05 M pH 7,5 o tampón fosfato 0,05 M pH 7,5?
¿Cómo puede igualarse la fuerza iónica?
Usted debe realizar un ensayo enzimático a pH 7,5; I 150 mM y 25ºC. Para ello prepara
tampón fosfato 50 mM. Indique cómo procedería en la preparación del tampón si :
Ocupa una mezcla de soluciones de la forma iónica ácida (50 mM) y de la básica (50
mM) correspondientes.
Titula la forma ácida con NaOH.
32.
a.
b.
2
- log f i =
ácido fosfórico
pKa1
pKa2
15oC
2,107
7,230
20oC
2,148
7,198
A zi I
1+
I
25oC
2,196
7,185
7
pKa3
A
12,38
18ºC
0,503
25º C
0,511
35ºC
0,520
33.
Explique en detalle como puede determinar si la disminución observada en la actividad
sobre y bajo el pH óptimo de una enzima se debe a efectos del pH en la estabilidad o en
la ionización de grupos prototrópicos esenciales del sitio activo de la enzima.
34.
a.
b.
c.
d.
Explique cómo, experimentalmente, Ud. puede distinguir :
Efecto del pH en la estabilidad de una enzima.
Efecto del pH en grupos esenciales ionizables de la enzima libre.
Efecto del pH en grupos ionizables en el complejo ES.
Efecto el pH en grupos ionizables del sustrato.
35.
¿Cómo es posible que el pH óptimo de la pepsina sea 2,0 mientras que el de la fosfatasa
alcalina sea 10,0?
36.
Usando la función de Michaelis apropiada calcule el porcentaje relativo de la especie
isoeléctrica, H3N+-CH2-C00-, presente a valores de pH entre 2,0 a 12,0.
Asuma pKa1 = 3,12 y pKa2 = 8,07.
37.
Una reacción enzimática puede describirse por la ecuación
k1
k3
k2
EA
EA 
E ' A  P 

k 1
38.
a.
b.
39.
a.
8
EP
2
donde k2 es el paso limitante de la hidrólisis del sustrato 1, mientras que k3 es el paso
limitante en la hidrólisis del sustrato 2. EA contiene dos grupos prototrópicos esenciales
de pKa igual a 5 y 8, E'A contiene sólo un grupo de pKa igual a 5. Calcule el perfil
Vmaxap versus pH para ambos sustratos. ¿Qué puede decir acerca del pH óptimo de los
dos sustratos?
La velocidad inicial de una reacción catalizada se determina a varios pH bajo
condiciones donde [S]o >> Km. Se encuentra que el pH óptimo de la reacción es 6,5
con la actividad dependiente de valores de pKa iguales a 6,0 y 7,0.
¿Cuál es el valor relativo de Vmaxap (pH = 6,5) en relación a Vmax ?
¿Cuál es el valor corregido de pK1 y pK2?
pKE1 y pKE2 tienen un valor de 4,0 y 8,0 respectivamente, pKEA1 es 4,0. El Kmap es igual
a Km a todos los valores de pH bajo 6,0, pero aumenta sobre pH 6,0 con dependencia de
un pKaap igual a 8,0.
Dibuje la curva velocidad inicial versus pH  de acuerdo a los cálculos correspondientes
cuando
[A]o << Km
b.
c.
[A]o = Km
[A]o >> Km
Grafique todos los resultados en el mismo gráfico.
¿Qué conclusiones puede usted obtener de los datos?
40.
El sitio activo de una enzima contiene un sólo grupo ionizable, cuyo pKa es 6.0. Para
unirse al sustrato debe estar en la forma iónica negativa. El sustrato está en una forma
positiva en todo el rango de pH estudiado.
Incubación a pH altos (pH > 8.0) no afecta la actividad a pH = 7.0.
¿Cómo sería el gráfico Vmaxap/Kmap versus pH? (justifique).
41.
El sustrato de una enzima es A, base de un ácido débil de pKa = 4.5. El sitio activo de la
enzima contiene un residuo de histidina (pKa= 6.5) que debe estar protonado para que
haya actividad.
¿Cuál es el pH óptimo de la reacción?
Justifique su respuesta.
42.
Una enzima que posee un sólo grupo disociable presenta una Vmáx independiente del pH
(a pH alcalinos) igual a 400 nmoles/(lt min). A pH más ácido ésta es dependiente. A pH
6.0 la Vmáx observada es 240 nmoles/(lt min). Calcule el pka del complejo E-S.
43.
El sitio activo de una enzima posee dos grupos disociables, cuyos pKa son 4 y 6. El
sustrato no presenta carga en el intervalo de pH trabajado. Preincubación de la enzima a
los diferentes pH no afecta la actividad a pH 4.0.
Dibuje el gráfico Vo versus pH, si [S] << Km.
¿Cuál sería el pH óptimo de la reacción.
Discutir los pKA obtenidos experimentalmente.
Es posible obtener al pH óptimo el 100% de la actividad potencial de la enzima?.
¿Cuáles son los valores de los pKa de ES?
a.
b.
c.
d.
e.
44.
En un estudio de la acción de la -quimiotripsina sobre el ester etílico del
acetil-L-triptófano se encontró que la velocidad máxima de hidrólisis (Vmáx) que se
obtenía al saturar a la enzima con el sustrato, variaba con el pH de la forma que sigue:
pH
Velocidad
pH
Velocidad
Unidades arbitrarias
Unidades arbitrarias
5,4
10
7,2
260
5,6
19
7,4
280
5,8
32
7,8
300
6,4
99
8,0
320
6,5
112
8,4
331
6,6
141
9,0
327
6,8
192
De esta información qué conclusiones se pueden extraer? Fundamente su respuesta.
9
45.
La proteína quinasa de Neurospora crassa presenta una energía de activación de
10.700 cal/mol. ¿Cuánto más rápido procede la reacción a 37oC comparada con 15oC?.
46.
En la siguiente reacción:
fumarato + H2O  malato
Compare la Keq a 25 C con la Keq a 37oC (To corporal)
o
Go = -880 cal/mol a 25oC.
Ho = +3.560 cal/mol (puede ser considerada constante en el rango, 25oC  40oC).
47.
a.
b.
49.
Para la siguiente reacción:
Lactasa + H2O  glucosa + galactosa.
o
La Vmáx a 21 y 37 C fué 140 y 200 nmoles/(lt min). Calcule:
Ea
Q
entre 25 y 35oC.
La -glucuronidasa óptimamente activa a pH 3,4 es inhibida por el ácido múcico. Se
obtuvieron los datos siguientes en un experimento realizado para determinar el efecto de
la variación de la concentración del sustrato sobre la velocidad de reacción, en ausencia
y presencia de mucato 0.0001 M. El sustrato empleado fue fenoltalein-glucurónido y la
velocidad de la reacción se expresa en gr de fenoltaleína liberada en 60 minutos a
37oC. Determinar el tipo de inhibidor y la constante de disociación del
enzima-inhibidor.
[S] mM
50.
51.
10
Velocidad
velocidad
sin inhibidor mucato 10-4 M
1
32,0
3,0
2
43,6
6,3
3
50,4
9,0
4
53,0
11,8
5
56,5
14,5
10
62,1
24,4
La tripsina se desnaturaliza de modo reversible por efecto del calor. A 44 oC la
constante de equilibrio para la transformación de la tripsina nativa en desnaturalizada es
1.00 y a 50oC es 7.20. Calcular la variación en el contenido calórico.
La desnaturalización térmica de la hemocianina de langosta ha sido estudiada por
Fleisher utilizando la siguiente técnica:
Las soluciones de hemocianina fueron colocadas en tubos de vidrio cerrados, calentados
en varios intervalos de tiempo a cuatro temperaturas diferentes y enfriadas
inmediatamente por inmersión en agua-hielo.
Bajos estas condiciones, la proteína desnaturalizada precipitó como un sólido amorfo
blanco que fue separado de la proteína soluble remanente mediante centrifugación.
Siguiendo el aumento de la refracción específica se determinó la concentración de la
proteína soluble remanente en la solución.
Los siguientes datos se obtuvieron a pH 7.4.
Temperatura ºC tiempo
desnaturalización
min
65,6
0
2
4
6
8
10
Temperatura ºC tiempo
desnaturalización
min
71,5
0
1
2
3
4
5
aumento
refracción
específica
0,0141
0,0136
0,0120
0,0107
0,0096
0,0091
Temperatura ºC tiempo
desnaturalización
min
aumento
refracción
específica
0,0151
0,0080
0,0049
0,0034
0,0023
0,0011
Temperatura ºC tiempo
desnaturalización
min
69,6
73,6
0
1
2
3
4
5
0
0,5
1,0
1,5
aumento
refracción
específica
0,0151
0,0116
0,0097
0,0075
0,0061
0,0041
aumento
refracción
específica
0,0148
0,0060
0,0027
0,0010
Determíne el orden de la reacción para la desnaturalización y la velocidad de reacción
específica (constante de velocidad) para cada temperatura. Calcular la energía de activación
aparente para el proceso de desnaturalización.
52.
En el examen del curso Ud. debe estimar la constante de inactivación (ki) de una
reacción catalizada por la ß-glucosidasa de la levadura K. fragilis, en solución acuosa y a
una fuerza iónica de 0,1 M. De acuerdo a la bibliografía la enzima presenta, un pH
óptimo alrededor de 6,9 y una "temperatura óptima" de 45oC. Dispone de sales de
fosfato, como también de sales de MES y NaCl para preparar el tampón, y de paranitrofenil-ß-D-glucopiranósido como sustrato.
Indique
El pH y el intervalo de temperatura al cual trabajaría realizaría el ensayo y las
condiciones para estimar la inactivación.
Preparación del tampón.
11
-
Condiciones experimentales que deben cumplirse para realizar el estudio solicitado.
Plan de trabajo completo para la obtención de la constante de inactivación.
Antecedentes.
A z 2i I
- log f i =
1+ I
ácido fosfórico
pKa1
pKa2
pKa3
p-nitrofenol
pKa
MES
pKa
delta pKa / oC
estructura sal
12
15 oC
2,107
7,230
20 oC
2,148
7,198
12,38
25 oC
2,196
7,185
7,149
6,15
-0,011
/–—\
O
N+H CH2 CH2 SO3 - (Na+ Cl-)
\ /