IRAC 2013 CLASIFICACIÓN, MICROMANIPULACIÓN Y CONGELADO DE

IRAC
2013
Espec
CLASIFICACIÓN, MICROMANIPULACIÓN Y CONGELADO DE
EMBRIONES BOVINOS
Fecha: 8/11/2013
Nombre y Apellido: Barceló Hernán
Objetivo:
1. Transferir lo estudiado a lo largo del curso en la resolución de las actividades
presentadas.
Criterios de evaluación:
1. Manejo conceptual, nivel de profundización y capacidad para establecer
relaciones.
2. Capacidad crítica y posibilidad de realizar análisis personales.
3. Integración y transferencia de lo estudiado a situaciones concretas.
1. Observe las fotografías de embriones y en base al Sistema de Evaluación de
embriones de la Sociedad Internacional de Embriones (IETS) haga una
clasificación de los embriones según:
a. el estadio de desarrollo
b. la Calidad (grado 1,2,3,4).
c. Explique para cada fotografía la/s característica/s que tuvo en cuenta
para calificar los embrión.
1)
2)
3)
4)
5)
6)
7)
1) 5 – 1: Es un blastocisto temprano, el embrión muestra muy buena
integridad celular en sus blastómeras. Una parte de estas se notan mas
compactas; en otra región se observa una separación entre las mismas
lugar donde se formara el blastocele. La zona pelúcida tiene una rotura
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2)
3)
4)
5)
6)
7)
en la parte superior lo cual impide que este embrión pueda ser
importado.
7 – 2: El embrión se nota esférico, con una zona pelúcida delgada lo cual
denota que hubo una expansión y posterior colapso del embrión .Denota
alteraciones en parte de sus blastómeras. Células sueltas degeneradas
en la parte superior que desprenden detritus hacia la derecha de la
imagen las cuales no llegan a constituir el 50 % de la masa celular.
Sobre la izquierda se nota el blastocele más claro que se diferencia del
macizo celular.
4 – 1: Son dos mórulas de excelente calidad. Zona pelúcida intacta. Muy
buena compactación y homogeneidad celular en forma y color.
4 – 3: Forma esférica con buena zona pelúcida. El macizo celular es
pequeño. Células desprendidas y degeneradas sobre la parte superior.
Dentro del macizo hay células que se muestran claras formando
vesículas.
4 – 2: Es una mórula que clasificaría como calidad 2. Buen tamaño y
grosor de la zona pelúcida. Si bien hay células desprendidas y
degeneradas arriba y un par de vesículas el macizo celular muestra
buena compactación y uniformidad en el tamaño y color de las células.
4 – 3: Es una mórula, adecuada zona pelúcida. Hay muchas células
sueltas y degeneradas y sobre todo detritus celulares. Noto el macizo
demasiado pequeño y raro, con aspecto granulado.
1: Infertilizado. Se observa material pun tillado oscuro, rodeado por una
membrana vitelina lisa, lo que demuestra que no hubo división celular.
2. Realice una comparación entre el método de congelado y la vitrificación de
embriones teniendo en cuenta: medios de congelado, toxicidad, curva de
congelado, método de descongelado y practicidad (costos, entrenamiento,
etc.).
Aspecto / Método
Medios
Toxicidad
Congelado
En la practica los medios utilizados
para la congelación de embriones son
crioprotectores
intracelulares
puntualmente
el
glicerol
y
el
etilenglicol;
fundamentalmente
el
ultimo.
Por
las
concentraciones
de
crioprotectores que se utilizan en este
método los daños tóxicos sobre los
embriones son mucho menores en
relación a la vitrificación. Son mas
comunes los daños mecánicos sobre
las células por efecto de la
cristalización.
Vitrificación
La vitrificación involucran el uso de
mezclas de crioprotectores como
glicerol y etilenglicol, glicerol y
propanediol
o
etilenglicol
y
propanediol con sacarosa, tetralosa o
galactosa.
La formación del estado amorfo de la
solución y lograr la vitrificación se
deben utilizar concentraciones de
crioprotectores mucho mas altas lo
cual hace peligroso que aparezcan
daños de origen toxico. Existen
varias esterategias para reducir ese
riesgo: usar crioprotectores menos
tóxicos, reducir las concentraciones
utilizadas,
ocupar
volúmenes
mínimos de solución y reducir el
tiempo de exposición.
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Curva
enfriamiento
Descongelado
Practicidad
de El
congelado
tradicional
utiliza
criprotectores
permeables
que
reemplazan el agua intracelular
combinado con un enfriamiento
gradual y controlado (0.3 a 1° C/min)
lo que evita la formación de cristales
que dañen las células
El descongelado de
embriones
congelados
dependerá
del
crioprotector utilizado para congelarlo.
El glicerol no admite la transferencia
directa. Debemos descongelar el
embrión en un baño maría, retirar el
crioprotector a temperatura ambiente y
transferirla. Para sacar el crioprotector
se puede colocarlo en una solución
concentrada de un crioprotector no
permeable (sacarosa) o bien pasarlo
por soluciones con concentraciones
decrecientes de glicerol. Esto permite
extraer el glicerol de las células a una
velocidad controlada evitando el
ingreso rápido de agua y el estallido
celular. Los embriones congelados en
etilenglicol admiten la transferencia
directa
por
lo
cual
podemos
descongelar la pajuela en agua a 30°C
y transferirla directamente.
Sin dudas el congelado el etilenglicol a
sido adoptado mundialmente por su
practicidad
al
momento
del
descongelado
que
permite
el
descongelado y la transferencia directa
del embrión en una receptora
Es requisito una velocidad de
enfriamiento extremadamente alta
para lograr el estado amorfo de las
soluciones de vitrificación. Se pueden
lograr velocidades de enfriamiento de
2500°C/min
sumergiendo
los
embriones contenidos en pequeños
volúmenes de crioprotectores. Esto
también
permite
reducir
las
concentraciones
de
los
crioprotectores.
Existen
varios
sistemas
de
vitrificación en búsqueda de utilizar
volúmenes mínimos de soluciones el
mas comúnmente utilizado es el OPS
(open-pulled Straw) en el cual los
embriones se vitrifican en pajuelas de
0,25
ml
estiradas.
El
descongelamiento se realiza se
realiza a través de la exposición de
las gotas de OPS en gotas de 0,25 M
de sacarosa lo que permitirá el
descongelado gradual y la entrada
controlada de agua a las células.
Luego se pasa al medio de
mantenimiento, se envasa y se
transfiere.
Si bien aun no se ha encontrado una
técnica de vitrificación que se adapte
a poder transferir directamente los
embriones descongelados a una
receptora sigue siendo “la opción”
para
criopreservar
embriones
producidos in vitro, que no responden
bien al congelado convencional. Esto
hace
que
este
procedimiento
potencie los beneficios propios de la
fertilización
y
producción
de
embriones in vitro. Personalmente de
acuerdo a lo que he visto en la
practica de vitrificación, en la medida
que se encuentre una manera de
transferir
embriones
vitrificados
directamente,
la
congelación
tradicional se vera paulatinamente
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desplazada por esta técnica.
3. Enumere al menos 3 factores importantes para la obtención de preñeces a
partir de la transferencia de embriones micro manipulados (hemi-embriones)
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Por tratarse de un proceso muy delicado y metódico es esencial que
quien se ocupe de efectuar la técnica sea un técnico con formación y
experiencia adecuadas.
La calidad original del embrión original que ha dado origen a los hemiembriones es esencial. Deberán ser calidad 1.
La calidad de cada hemi-embrión obtenido es esencial. Diferencias de
tamaño y cultivo de los embriones en el laboratorio después de la
sección facilitando la unión de las blastómeras.
Estadio de desarrollo del embrión original. Son mejores los resultados si
se cortan mórulas.