problema 2 - Universidad de Puerto Rico Humacao

DILUCIONES
Si se sospecha que una muestra tiene una gran cantidad de microorganismos por mL o
gm, la muestra se diluye. Al diluir lamuestra antes de hacer la prueba, se evita que las
placas tengan exceso de colonias, permitiendo obtener diluciones con un número de
colonias entre 25 y 250 CFU/ml o gm. El plan de dilución que más frecuentemente se
utiliza envuelve diluir la muestra por un factor de 10. La muestra se diluye con una
solución salina estéril, 0.85% NaCl of 0.1% peptona. Usualmente en este laboratorio se
utilizan botellas de dilución con un volumen de 90 ó 99 ml.
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1. La muestra ya sea sólida o líquida se considera que tiene un factor de dilución de
100 ó 1 (no-diluída).
2. Si el diluyente tiene 90 ml de solución estéril, para hacer una dilución 1/10,
transfiera 10 ml ó 10 gm al blanco. Esta es la dilución 10-1.
3. Continue haciendo las diluciones necesarias.
Para diluciones utilizando un volumen de 99 ml de diluyente, puede añadir 11 ml
para hacer solución de 10-1 ó 1 ml para hacer dilución 10-2.
El mismo procedimiento aplica al poner la muestra en placa. Si se toma 1 ml de muestra
del la dilución 10-3 y se añade agar, tienes la misma dilución en la placa que tienes en el
tubo. Si transfieres 0.1 ml de la muestra de la botella de dilución y le viertes agar, has
procedido a hacer una próxima dilución (0.1 ml de la dilución 10-3 en la placa se
convierte en la dilución 10-4).
REPORTE DE RESULTADOS
Cuando se contabilizan las placas, es importante seguir las siguientes reglas. Debes
incluir:




Dos cifras significativas
Factor de dilución
CFU / ml ó CFU / gm
Contaje estándar de placa (SPC) ó contaje estimado estándar de placa (ESPC)
SOLO SE REPORTA UN CONTAJE POR MUESTRA, NO POR DILUCION.
Cuando se calculan los resultador de placas en duplicado se reporta la media
geométrica (promedio). En la práctica, se utiliza el promedio para reducir
estadísticamente las muestras que se salen del centro así como para encontrar el
contaje de placa promedio cuando se trabaja con un gran número de placas.
PLACAS NORMALES: CONTAJE ESTANDAR DE PLACAS (SPC)
Primero, anote la dilución de la placa que está contando. Luego cuente las colonias que
aparecen en la placa. Anote los resultados de las placas que tengan entre 25 a 250
colonias. Incluya las colonias pequeñas cuanto reporte sus resultados. Para reportar los
resultados, promedie los contajes de placas en duplicado. Ajuste para 2 cifras
significativas. Incluya el factor de dilución y reporte como “CFU/gm ó CFU/ml” SPC.
Muestra
Placa
100
10-1
10-2
Leche
pausterizada
A
TNTC
243
22
B
TNTC
236
18
Contaje
reportado
2.4 x 103
CFU/ml
SPC
2
En el ejemplo anterior, no puedes utilizar los resultados de la dilución 10-2 porque el
número de colonias en una de las placas está fuera del rango 25-250. Sin embargo sería
acceptable reportarlos como estimado (2.0 x 104 CFU/ml ESPC).
PLACAS CON MUCHAS COLONIAS: CONTAJE ESTIMADO DE PLACA
ESTANDAR
Puedes estimar el contaje de varias formas. Si utilizas un contador de colonias, el sistema
de rejillas divide la placa en 56 áreas iguales. Escoge un area representativa de la placa y
haz un estimado contando por lo menos 6 cuadrados. Saca el promedio de los cuadrados
y multiplica por el factor de dilución. De nuevo, promedia los resultados de las placas
duplicadas y ajusta a dos cifras significativas. Incluye el factor de dilución y reporta los
resultados como “CFU/g ó CFU/ml”ESPC.
Muestra
Placa
100
10-1
10-2
Ensalada
de papas
A
TNTC
TNTC
TNTC
B
TNTC
TNTC
TNTC
Estimado Contaje reportado
De 10-2
4.4 x 104 CFU/ml
412
ESPC
478
PLACAS CON POCA DENSIDAD: CONTAJE ESTIMADO DE PLACA
ESTANDAR
Para placas con contajes bajos, existen dos opciones al reportar los resultados. El
primero es contar las colonias y reportarlas como ESPC. La otra situación es cuando no
hay colonias en una placa. En este caso el contaje se reporta como “<”que la dilución
más baja.
CONTAJES BAJOS
Muestra
Ensalada
de papas
Placa
A
100
12
10-1
0
0
B
6
0
0
Placa
A
100
0
10-1
0
0
B
0
0
0
10-2
Contaje reportado
9.0 x 100 CFU/ml
ESPC
10-2
Contaje reportado
<1.0 X 102 CFU/ml
ESPC
NO-CRECIMIENTO
Muestra
Ensalada
de pasta
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OTROS CASOS
Crecimiento esparcido: Cuando ambas placas tienen crecimiento esparcido, reporte
comjo SPR.
Accidente de laboratorio: En el caso de accidentes de laboratorio reporte como tal: LA.
Universidad de Puerto Rico
Recinto Universitario de Humacao
Departamento de Biología
Dra. Esther Z. Vega
Problemas de práctica de diluciones
1. 1 ml de cultivo de bacterias se diluye con 9 ml de peptona. 1/10 de ml de está
dilución se diluye en 9.9 ml de peptona. De ésta dilución 1/10 de ml se pone en
una placa con 25 ml de medio. Luego de 24 horas de incubación se contaron 219
colonias. ¿Cuántas células había en el cultivo original? Muestra todo tu trabajo.
¿Tendrá efecto la cantidad de medio de la placa?
2. Cinco gramos de yogurt se mezclan con 45 ml de agua de peptona. Se hacen dos
diluciones sucesivas de 1/100. 1/10 de ml se pone en placa de la última dilución.
Esto se hace en duplicado. Luego de incubar se obtienen los siguientes
resultados: 75 CFU y 73 CFU. Calcula el número de CFU/gm de yogurt.
3. a. La muestra consiste de 10 ml de una dilución de 10-1 de jugo de repollo. La
asignación es hacer contaje total de placa aeróbica, tal que cada placa es inoculada
con 0.1 ml. Se hacen en placa las siguientes diluciones: 10-2, 10-3, 10-4 y 10-5.
Haz un diagrama del procedimiento indicando las cantidades de diluyentes e
inóculo a utilizar.
b. Si se obtienen 120 colonias en la placa inoculada con 0.1 ml de la dilución 10-2,
¿cuál sera el CFU/ml en el jugo de repollo sin diluir?
4. Se esperaría el mismo # de CFU en 10 ml de la dilución 10-2 de hamberguer que
en _______ gm de la muestra sin diluir.
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5. Un gramo de yogurt se añade a 99 ml de agua de dilución. Se hacen cuatro
diluciones de 1/10 y se pone en duplicado en placa 1/10 de ml en PCA. Luego de
inucuban y se obtiene los siguientes resultados:
Dilución hecha de yogurt
Dilución inicial
Primera dilución 1/10
Segunda dilución 1/10
Tercera dilución 1/10
Cuarta dilución 1/10
CFU/ml
TNTC, TNTC
TNTC, TNTC
442, 432
52, 48
7, 3
Utilizando estos datos, calcula el número de CFU/gm de yogurt.
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