cadena respiratoria y fosforilación oxidativa

CÁTEDRA: BIOQUÍMICA
Carreras: Farmacia
Profesorado en Química
Licenciatura en Química
Licenciatura en Alimentos
CADENA RESPIRATORIA Y FOSFORILACIÓN OXIDATIVA
1) Indique si las afirmaciones hechas a continuación son verdaderas o falsas.
a) La respiración puede ocurrir sólo en presencia de O 2.
b) El dispositivo molecular para la respiración se encuentra sólo en las células
eucariotas.
c) Las proteínas transportadoras de electrones que tienen FAD como grupo
prostético se denominan citocromos.
d) La relación P:O es igual a 2,5 para el FADH2 en la mitocondria.
e) El amital bloquea la formación del ATP de la oxidación del isocitrato, pero
no de la del succinato.
f) En presencia de un desacoplante la energía obtenida del transporte de
electrones se disipa como calor.
2) La inyección de dinitrofenol a una rata produce un aumento inmediato en su
temperatura corporal. ¿Puede explicar por qué?
3) Un laboratorio farmacéutico le envió a usted muestras de dos nuevos
compuestos metabólicos para caracterizarlos como posibles antibióticos.
Utilizando una preparación aislada de mitocondrias de hígado e incubada con
piruvato, O2, ADP, y Pi, usted observa que la adición del compuesto "A"
bloquea tanto el transporte de electrones como la fosforilación oxidativa.
Cuando agrega el compuesto "B" además del "A", observa con sorpresa que
se restablece el transporte de electrones pero no la fosforilación oxidativa. a)
¿Cómo clasificaría estos compuestos teniendo en cuenta su modo de acción
en el transporte de electrones y la fosforilación oxidativa? b) Nombre un par de
sustancias conocidas que podrían dar el mismo resultado.
4) Se prepararon mitocondrias y se determinó el consumo de O 2 en 0,2 ml de
la preparación en estado 4, en estado 3 y desacoplado, en presencia y en
ausencia de una sustancia M (ver tabla). Indique qué tipo de inhibidor es M y
justifique su respuesta.
CONDICIÓN
ESTADO 4
ESTADO 4
ESTADO 3
ESTADO 3
DESACOPLADO
DESACOPLADO
SUSTANCIA M
(nM)
0
0,5
0
0,5
0
0,5
CONSUMO DE 02 (moles
de át O/min)
11
4
80
30
85
33
5) Cuatro transportadores: a, b, c y d, cuyas formas reducidas y oxidadas
pueden ser distinguidas espectrofotométricamente, se requieren para la
1
respiración en un sistema de transporte de electrones bacteriano. En presencia
de sustrato y oxígeno, tres inhibidores diferentes bloquean la respiración,
obteniéndose los patrones de los estados de oxidación que aparecen en la
Tabla. ¿Cuál es el orden de los transportadores en la cadena desde los
sustratos hasta el oxígeno?
Tabla: Efecto de los inhibidores sobre los niveles de oxidación de los
transportadores en una vía hipotética de transporte de electrones (+ y - indican
las formas totalmente oxidadas y reducidas, respectivamente).
INHIBIDOR
1
2
3
a
+
+
b
+
-
c
-
d
+
+
+
6) a) Se determinó (en presencia de distintas concentraciones de una
sustancia "A" y "B") la velocidad de consumo de oxígeno en mitocondrias
intactas en las siguientes condiciones: estado "3", estado "4" y en presencia de
un desacoplante. El sustrato empleado fue malato-glutamato. Los resultados
se grafican abajo. Indique si las sustancias "A" y “B” son inhibidores de la
síntesis de ATP, de la cadena respiratoria o desacoplantes. Justifique
brevemente.
60
60
50
50
DESACO PLADO
DESACO PLADO
40
ESTADO 3
30
20
ESTADO 4
Q O2
Q O2
40
ESTADO 3
30
20
10
ESTADO 4
10
0
0
0
10 20 30 40 50 60 70 80
[A ]
0
10 20 30 40 50 60 70 80
[B ]
b) Se estudió el efecto de distintas concentraciones de una sustancia "C" y "D"
(inhibidores del transporte de electrones) sobre el consumo de oxígeno en
partículas submitocondriales utilizando como sustrato: NADH, succinato y
ascorbato + tetra metil p fenilen diamina (TMPD). Precise lo mejor posible el
lugar de acción de la sustancia "C" y "D" en la cadena respiratoria. Justifique
brevemente.
2
60
60
50
50
NADH
S U C C IN A T O
40
40
20
Q O2
Q O2
S U C C IN A T O
NADH
30
30
20
10
10
ASC + TM PD
ASC + TM PD
0
0
0
10 20 30 40 50 60 70 80
[C ]
0
10 20 30 40 50 60 70 80
[D ]
7) Una suspensión de mitocondrias consume 24 µmol O2/min en presencia de
malato y glutamato. Al agregar 2,8 mmoles de ADP y Pi en exceso el consumo
se acelera a 211 µmol O2/min durante 3 min para luego retornar a la velocidad
inicial. Explique a qué se debe la aceleración transitoria del consumo de
oxígeno y calcule el control respiratorio e índice P/O. Explique cómo afectaría
un inhibidor de la transferencia de energía la velocidad de consumo de oxígeno
y el índice P/O.
8) Usted realizó una serie de experimentos con partículas submitocondriales en
donde midió síntesis de ATP, consumo de oxígeno y diferencia de pH. El
medio de reacción contenía, además de las partículas, ADP, Pi y NAD, una
serie de agregados, los cuales se indican al final del enunciado. Los resultados
fueron elaborados por un compañero suyo, quién para comprobar sus
conocimientos sobre el tema se los entregó en forma desordenada. ¿Es usted
capaz de ordenarlos? Hágalo.
SINTESIS DE ATP (µmol/h.mg proteína):
30; 0; 0; 30; 20; 0; 10; 0; 0; 0; 0; 20; 30; 0; 0.
CONSUMO DE O2 (µmol/h.mg proteína):
0; 5; 5; 0; 5; 12; 2; 5; 5; 12; 0; 0; 2; 5; 0.
DIFERENCIA DE pH:
0; 0; 1,5; 1; 1; 0; 0; 1; 1,5; 0; 0; 1; 0; 1; 1.
AGREGADOS:
A) Isocitrato
B) Isocitrato + isocitrato deshidrogenasa
C) B + -cetoglutarato deshidrogenasa + CoA
D) B + rotenona
E) C + succinil CoA sintetasa + GDP + rotenona
F) D + 2,4-dinitrofenol
G) E + oligomicina
H) E + 2,4-dinitrofenol
I) NADH
J) NADH + amital
K) J + succinato
L) K + malonato
3
M) L + ascorbato-TMPD
N) M + oligomicina
O) N + 2,4-dinitrofenol
9) El gráfico muestra el trazado obtenido en un oxígrafo al incubar partículas
submitocondriales a 30°C, en un medio a pH: 7,5. Caracterice cada uno de los
compuestos agregados (A, B, C, etc.). Justifique brevemente el efecto de cada
compuesto sobre la velocidad de consumo de O2.
A
B
C
D
B
[O 2 ] (m M )
E
F
E
G
H
I
T iem po (m in)
10) Se agregaron 0,1 ml de una suspensión conteniendo partículas
submitocondriales (con una concentración de proteína de 5 mg/ml) a 2,9 ml de
una solución amortiguadora (pH 7,2) en una cubeta termostatizada de un
oxígrafo. Las medidas de consumo de oxígeno obtenidas ante el agregado de
diferentes compuestos se muestra en el gráfico adjunto. En base a estos
datos: a) Calcule la velocidad de consumo de O 2 en cada caso, expresándola
en µmol/min.mg de proteína. b) Calcule el índice P/O. c) Caracterice lo mejor
posible a los compuestos X, Y, Z y A. d) ¿Qué velocidad de consumo de O 2
esperaría medir si a los 3,9 minutos (flecha en línea de puntos) se agregara
nuevamente ADP y Pi (iguales cantidades que anteriormente)? ¿Durante
cuánto tiempo? e) ¿Puede decir en qué estado estaban las partículas a tiempo
cero?
4
5 µ l A D P (6 5 m M )
+ 3 µ l P i (7 5 m M )
2 µl X
0 .2 0
2 µl Y
0 .1 8
2 µl Z
[O 2 ] (m M )
0 .1 6
2 µl A
0 .1 4
0 .1 2
0 .1 0
0 .0
0 .5
1 .0
1 .5
2 .0
2 .5
3 .0
3 .5
4 .0
T ie m p o (m in )
RESPUESTAS
1) a) F b) F c) F d) F e) V f) V
2) Porque se disipa el gradiente de protones como calor.
3) A: inhibidor de la F1-ATPasa (oligomicina); B: desacoplante (dinitrofenol)
4) inhibidor de la cadena de transporte de electrones
5) c b a d
6) a) A: inhibidor de ATPasa; B: inhibidor de cadena de transporte de
electrones
b) C: inhibidor sitio 1; D: inhibidor sitio 2
7) Aumenta el consumo de O2 al agregar ADP y Pi (pasa de estado 4 a 3)
C.R.= 7,42
P:O= 2,5
8) A) 0 0 0 B) 30 5 1 C) 30 5 1 D) 0 0 0 E) 20 5 1 F) 0 0 0 G) 0 2 1,5 H) 0 12 0
I) 30 5 1 J) 0 0 0 K) 20 5 1 L) 0 0 0 M) 10 5 1 N) 0 2 1,5 O) 0 12 0
9) A: NADH. B: ADP. C: rotenona. D: succinato. E: oligomicina. F: DNF. G:
antimicina. H: ascorbato+TMPD. I: CN,CO, F-, N310) a) 0,024; 0,3; 0,024; 0,51; 0; 0,54
b) 1,5
c) X-succinato, Y-desacoplante, Z-antimicina, A-ascorbato+TMPD
d) no se vería efecto. Prácticamente no hay oxígeno.
e) estado 1.
5
Modelo quimiosmótico
Relación entre potenciales de óxido-reducción y energía libre en la cadena
respiratoria mitocondrial.
6
Sitios de acción de inhibidores en la cadena respiratoria mitocondrial.
Desacoplante 2,4 dinitrofenol. Tiene un protón disociable y es muy hidrofóbico.
La carga negativa está deslocalizada en toda la molécula permitiendo su
solubilidad en la membrana. El DNP toma protones del espacio
intermembrana, atraviesa la membrana interna mitocondrial y disipa el
gradiente de protones.
7
Lanzadera del glicerofosfato
Lanzadera del malato-aspartato
8
Grupos prostéticos de citocromos. El Fe-protoporfirina IX se encuentra en
citocromos b, hemoglobina y mioglobina. Los hemos A y C se encuentran en
citocromos del mismo nombre. Obsérvese el sistema de dobles enlaces
conjugados que permiten detectar a las proteínas que los poseen por su
absorción en el visible.
9