TP _raton_FC_2015.pdf

Neurobiología del Aprendizaje y la Memoria - 2015
Departamento de Fisiología, Biología Molecular y Neurociencias, FCEN, UBA
TRABAJO PRÁCTICO N°3
CONDICIONAMIENTO DE MIEDO AL CONTEXTO EN RATONES:
RECONSOLIDACIÓN Y EXTINCIÓN
INTRODUCCIÓN
Consolidación: A principios del siglo XX, Müller y Pilzecker realizaron experimentos de
interferencia en humanos sin patologías cerebrales, de los que concluyeron que luego de un
aprendizaje existe un proceso interno que fija las asociaciones que se han formado, y que
denominaron consolidación (Lechner et al., 1999). Para ese entonces, Ribot (1882) ya había
advertido que los pacientes con amnesia orgánica global (que implica daño en el
hipocampo y el sistema límbico en general) tenían más afectada la memoria de los eventos
recientes que la de los más remotos. Esta idea fue abandonada por más de 50 años hasta que
Hebb replanteó el estudio y a su vez se retomó la experimentación en animales no humanos
(revisado en Maldonado, 2008). La presencia de amnesia al introducir un factor de
interferencia dentro de un intervalo de tiempo previo o posterior al entrenamiento, pero no
cuando se lo presentaba fuera de ese intervalo, se consideró como evidencia de la existencia
de un proceso discreto de estabilización de la memoria. Este fenómeno se comprobó en
especies muy diversas tanto en invertebrados como en vertebrados. Entre los factores de
interferencia utilizados se puede mencionar: otros aprendizajes, lesiones, trauma,
inactivación neuronal, lesiones cerebrales, electrochoques convulsivos, hipotermia,
inhibidores generales de la transcripción o de factores de transcripción (FTs) específicos, y
la inhibición de la traducción o de ciertas vías moleculares específicas (revisado en
Alberini, 2009).
Con el tiempo la concepción original de consolidación fue mutando y hoy en día se
distingue el proceso inicial que permite la estabilización de la memoria en una primera
instancia, de otros procesos celulares y circuitales que siguen ocurriendo a medida que pasa
el tiempo (y sin intervenciones comportamentales). Es decir, una memoria no dependería
siempre del mismo lugar del cerebro sino que existirían diferentes localizaciones según la
edad de la memoria. Se definió entonces como consolidación sináptica o celular al proceso
inicial en el que ocurren cambios a nivel de expresión génica y de síntesis proteica
necesarios para llevar adelante los cambios fisiológicos y morfológicos de largo término.
La consolidación sistémica implica la reorganización de la información a nivel de circuitos
en áreas cerebrales de procesamiento y almacenaje de la información (Dudai, 1996, 2002;
Medina et al., 2008).
Reconsolidación: La idea de que una vez que se forman las memorias son indestructibles
fue inicialmente descartada por algunos autores en cuyos trabajos se veía que, luego de
reactivadas, las memorias podrían ser bloqueadas (Misanin, 1968). A estos trabajos
pioneros se les dio poca importancia pues la comunidad científica consideró que las
maneras de lograr el bloqueo resultaban muy inespecíficas (e.g. electrochoques
convulsivos). Sin embargo, en el año 2000 se publicaron dos trabajos que evidenciaban el
mismo fenómeno. Esta vez, los experimentos y los agentes interferentes resultaron más
controlados y específicos (Sara 2000, Nader, 2000). El proceso por el cual una memoria
reactivada debe ser reestabilizada para perdurar se denominó reconsolidación, por sus
similitudes con la consolidación. Dicho proceso, sólo se evidencia ante la presencia de un
Neurobiología del Aprendizaje y la Memoria - 2015
Departamento de Fisiología, Biología Molecular y Neurociencias, FCEN, UBA
agente interferente. Con el paso del tiempo, fueron encontrándose diferencias entre ambas
fases de la memoria, no sólo en las vías celulares implicadas, sino también en las dinámicas
de activación e incluso en las áreas cerebrales necesarias.
Extinción: La memoria de extinción implica la disminución de la respuesta condicionada
ante la reiterada o prolongada presentación del estímulo condicionado en ausencia del
incondicionado. Depende de síntesis proteica, al igual que la consolidación y
reconsolidación de la memoria original. Actualmente las hipótesis que intentan explicarla
se basan en resultados que apoyan el debilitamiento temporal del circuito que codifica la
memoria original, o el reforzamiento de circuitos inhibitorios que hacen contacto con el
circuito que codifica la memoria original. En cualquier caso, dichos cambios son
temporarios pues comportamentalmente se observa que la memoria original está intacta
(por ejemplo, por la recuperación espontánea; revisado en Myers y Davis, 2007).
Condicionamiento de miedo al contexto: Un ejemplo de condicionamiento clásico muy
utilizado actualmente es el de condicionamiento de miedo al contexto (del inglés,
contextual fear conditioning), en el que el sujeto experimental, típicamente un ratón o una
rata, es colocado en una caja con determinadas características contextuales (CS,
conditioned stimulus); luego de un tiempo de habituación, se presenta un choque eléctrico
suave en las patas (US, unconditioned stimulus). Ante dicha situación, los animales suelen
responder inicialmente con una locomoción mayor, o con un comportamiento de
congelamiento (unconditioned response). Si el animal vuelve a ser colocado en su caja de
alojamiento, y un tiempo después se lo vuelve a colocar en la misma caja de entrenamiento,
el mismo muestra un conjunto de comportamientos de miedo, entre ellos el de freezing
(conditioned response), y así, evidencia la memoria de la asociación CS-US (Blanchard and
Blanchard, 1969). La existencia de un condicionamiento de miedo puede también ser
evaluada ante la presentación del CS utilizando otros parámetros además del freezing, por
ejemplo un incremento en la presión sanguínea, cambios en la respiración, respuestas de
sobresalto ante otros estímulos, evitación del lugar en donde ocurrió el evento aversivo,
entre otros (LeDoux, 2000).
OBJETIVOS
El objetivo general de este trabajo es que los alumnos se familiaricen con los animales y
experimentos comportamentales de uso común y en condiciones controladas de laboratorio,
y también con los conceptos teóricos y experimentales sobre las fases reconsolidación y
extinción de la memoria. El objetivo particular será estudiar el efecto interferente sobre la
memoria original de una tarea novedosa luego de la reactivación de una memoria.
Asimismo se trabajará con protocolos que dan lugar a la reconsolidación de la memoria o a
la extinción.
Neurobiología del Aprendizaje y la Memoria - 2015
Departamento de Fisiología, Biología Molecular y Neurociencias, FCEN, UBA
MATERIALES Y MÉTODOS
Animales
Se utilizarán ratones Mus musculus de la cepa BALBc, machos, de 7 a 9 semanas de
edad y de un peso aproximado entre 30 a 40 gramos, provistos por el bioterio de la Facultad
de Ciencias Exactas y Naturales, Universidad de Buenos Aires. En nuestro laboratorio, los
ratones permanecerán en un cuarto de alojamiento con condiciones de luz y temperatura
controladas (ciclo de luz de 13 h, luces encendidas a las 9.00 am; 21-23°C). Serán alojados
en cajas para tal fin, de a grupos de 4 individuos como máximo. En su interior, dichas cajas
contienen viruta, y se los proveerá de agua y comida ad libitum. En los momentos de
experimento, los ratones serán llevados a la sala contigua, denominada “experimental”, que
se encuentra en condiciones similares a las de la sala de alojamiento.
Dispositivo de entrenamiento y evaluación para el paradigma de condicionamiento de
miedo al contexto.
La arena experimental consiste en una caja de acrílico transparente que se encuentra
a su vez dentro de otra caja de mayor tamaño con una ventana transparente en la puerta
lateral, por donde se colocan los animales, de a uno, para realizar la tarea. El piso de la caja
acrílica consiste en una grilla de barras de acero. Esta grilla está conectada a un dispositivo
eléctrico de comando que permite establecer los parámetros básicos característicos de los
estímulos utilizados, tales como intensidad del choque eléctrico, duración, etc.
DESARROLLO DEL TRABAJO PRÁCTICO
Sesión de manipulación (del inglés, handling)
Por dos días consecutivos, previo al entrenamiento, los ratones serán sometidos a
una sesión diaria de 2-3 min en la que los experimentadores los manipulan de una manera
similar al entrenamiento, pero sin este último. El objetivo de esta sesión es que los ratones
se habitúen al experimentador -para que el mismo no constituya en sí un estímulo novedoso
y estresante el día del entrenamiento- y a la manipulación por parte del mismo.
Sesión de entrenamiento (5 min de duración)
Se entrenarán los ratones colocándolos en la arena experimental de a uno por vez.
Luego de 2 min, cada ratón recibirá 3 ensayos de choque eléctrico, siendo el intervalo entre
ensayos 60 seg. Cada choque tendrá una intensidad de 0.8 mA, y una duración de 1 seg.
Luego del último ensayo cada ratón permanecerá en la arena por 60 seg más.
Entre cada ratón, la rejilla, piso y, de ser necesario, los bordes de la arena serán
fregados con un papel embebido en alcohol 96º, para cerciorarse de que no haya señales
olfativas presentes (orina o materia fecal).
Sesión de reexposición
Se dividirá a los animales entrenados en cinco grupos experimentales.
1) “5 min”: son animales reexpuestos 5 min al contexto de entrenamiento 7 días post
entrenamiento. Esos 5 min son suficientes para logar la reactivación y
Neurobiología del Aprendizaje y la Memoria - 2015
Departamento de Fisiología, Biología Molecular y Neurociencias, FCEN, UBA
reconsolidación de la memoria de condicionamiento de miedo al contexto (de la
Fuente et al 2011).
2) “NR”: son animales entrenados pero no reexpuestos al contexto de entrenamiento.
3) “5min + NOR”: son animales reexpuestos 5 min al contexto de entrenamiento 7
días post entrenamiento. Luego de esta reexposición, cada animal experimenta una
sesión de entrenamiento al paradigma de objeto novedoso (NOR, por sus siglas en
inglés: novel object recognition) por 15 min.
Nota: El NOR es una tarea en la cual en la sesión de entrenamiento el ratón debe conocer dos objetos
similares. En una sesión de evaluación, se le presenta un objeto conocido y uno nuevo. Si el ratón
recuerda la experiencia anterior, explorará en mayor medida al objeto novedoso. Este paradigma se
discutirá en más detalle en el Trabajo Práctico N°4. En este trabajo, el entrenamiento de NOR se
utilizará como interferencia para la reconsolidación de la memoria de condicionamiento de miedo al
contexto.
4) “30 min”: son animales reexpuestos 30 min al contexto de entrenamiento 7 días
post entrenamiento. Esos 30 min son suficientes para logar memoria de extinción en
animales condicionados en un paradigma de condicionamiento de miedo al contexto
(de la Fuente et al 2011).
5) Ratones No Reexpuestos + entrenamiento de NOR: son animales a los que 7 días
post entrenamiento se los entrena en la tarea de NOR SIN reexposición previa al
contexto de entrenamiento de condicionamiento de miedo al contexto
Sesión de evaluación
La retención de la memoria de largo término será evaluada a 48 h luego de la
reexposición. Durante la sesión de evaluación, los ratones serán reintroducidos en la arena
experimental de a uno por vez, por 5 min. Tanto el entrenamiento, la reexposición y la
evaluación de la memoria, serán filmados para ser analizados posteriormente.
Análisis de datos
La forma operativa de medir memoria en la sesión de evaluación será la
visualización de un comportamiento estereotipado de miedo denominado congelamiento o
freezing, que se da cuando un animal permanece inmóvil, excepto por los movimientos
asociados a la actividad cardíaca y respiratoria. La medición se realizará observando los
videos, utilizando una metodología de medición instantánea cada 5 seg (60 mediciones
totales). En cada medición se evaluará si el ratón muestra un comportamiento de freezing
de aproximadamente 1 seg. Si se observa este comportamiento, en la planilla
correspondiente se anotará el valor “0”, y si se observa movimiento del animal, se anotará
“1”. Al final, se contará la cantidad de “ceros” para cada ratón, y se calculará un porcentaje
de freezing (n° “ceros”*100/60). Para la comparación entre grupos se realizará una media
de los porcentajes de freezing de los ratones de un mismo grupo, con su correspondiente
error estándar, y se compararán los distintos grupos según corresponda. Se discutirán los
test estadísticos más adecuados según los grupos a comparar.
Neurobiología del Aprendizaje y la Memoria - 2015
Departamento de Fisiología, Biología Molecular y Neurociencias, FCEN, UBA
Observación: El día de la explicación del práctico se entregará a los alumnos
una planilla en la que figurará el protocolo experimental (con el número de ratones
por grupo). Cada grupo de alumnos hará el experimento completo para un número de
animales a definir, pertenecientes a cada grupo experimental. Analizará los datos y los
volcará en una planilla conjunta. Luego esta planilla podrá ser visible para todos los
alumnos, y es la que utilizarán para el análisis de los datos y la confección del informe.
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
Se analizarán los videos correspondientes a las sesiones de entrenamiento y
evaluación de cada animal, calculando los porcentajes de freezing (media y error estándar)
de cada grupo en ambas sesiones. Como se mencionó anteriormente, la memoria se
evaluará considerando la respuesta de los animales el día de la evaluación. Se discutirán los
resultados en base al marco teórico y al diseño experimental utilizado.
Para la memoria de extinción, además de la extinción propiamente dicha (evaluada a
largo término), también puede evaluarse el comportamiento de los animales dentro del
ensayo de extinción (sesión de reexposición). Se obtiene así un estudio de lo que se
denomina “extinción intra-sesión”, en la que se espera ver la disminución de la respuesta
condicionada con el paso del tiempo (en los 30 min). Puede analizarse el comportamiento
de freezing en los primeros 5 min y en los últimos 5 min.
Alberini CM (2009) Transcription factors in long-term memory and synaptic plasticity. Physiol Rev 89:121145.
Blanchard RJ, Blanchard DC (1969) Passive and active reactions to fear-eliciting stimuli. J Comp Physiol
Psychol 68:129-135.
de la Fuente V, Freudenthal R, Romano A. Reconsolidation or extinction: transcription factor switch in the
determination of memory course after retrieval. J Neurosci. 2011 Abril 13; 31(15):5562-73.
Dudai Y (1996) Consolidation: fragility on the road to the engram. Neuron 17:367-370.
Dudai Y (2002) Molecular bases of long-term memories: a question of persistence. Curr Opin Neurobiol
12:211-216.
Lechner HA, Squire LR, Byrne JH (1999) 100 years of consolidation--remembering Muller and Pilzecker.
Learn Mem 6:77-87.
LeDoux JE (2000) Emotion circuits in the brain. Annu Rev Neurosci 23:155-184.
Maldonado H (2008) La memoria animal. Buenos Aires: Eudeba.
Medina JH, Bekinschtein P, Cammarota M, Izquierdo I (2008) Do memories consolidate to persist or do they
persist to consolidate? Behav Brain Res 192:61-69.
Misanin JR, Miller RR, Lewis DJ (1968) Retrograde amnesia produced by electroconvulsive shock after
reactivation of a consolidated memory trace. Science 160:554-555.
Myers KM, Davis M (2007) Mechanisms of fear extinction. Mol Psychiatry 12:120-150.
Nader K, Schafe GE, Le Doux JE (2000b) Fear memories require protein synthesis in the amygdala for
reconsolidation after retrieval. Nature 406:722-726.
Sara SJ (2000) Retrieval and reconsolidation: toward a neurobiology of remembering. Learn Mem 7:73-84.