QB2a2016_MEC1.pdf

“lest our necessary and highly successful
preoccupation with cell fragments and fractions
obscure the fact that the cell is not just an inert
playground for a few almighty masterminding
molecules, but is a system,
a hierarchically ordered system,
of mutually interdependent species of molecules,
molecular groupings, and supramolecular entities;
and that life, through cell life,
depends on the order of their interactions”
Paul A. Weiss
1898—1989
1960
“lest our necessary and highly successful
preoccupation with cell fragments and fractions
obscure the fact that the cell is not just an inert
playground for a few almighty masterminding
molecules, but is a system,
hierarchically
system,
PODEMOS aIR
TODAVIA ordered
UN POCO
“MAS ALLA”..?
of mutually interdependent species of molecules,
molecular groupings, and supramolecular entities;
and that life, through cell life,
depends on the order of their interactions”
Paul A. Weiss
1898—1989
1960
MATRIZ
EXTRACELULAR
la interacción de las células
con el exterior celular regula una gran
diversidad de funciones celulares
BIOLOGIA DEL DESARROLLO
?
1 única célula
huevo fertilizado
“cigota”
organismo
multicelular
• distintos tipos celulares
• distintos órganos/funciones
• Diferenciación celular
BIOLOGIA CELULAR
! Cómo se mantiene la identidad de tejidos y órganos durante toda la
vida de un organismo multicelular?
! COMO SE MANTIENEN LAS FUNCIONES TEJIDO-ESPECIFICAS?
! De que manera una célula (o grupo de células) pierde esta identidad
y se vuelve patogénica/tumorigénica?
BIOLOGIA TUMORAL
Necesario definir:
“UNIDAD DE FUNCION” o “UNIDAD FUNCIONAL”
Organismo unicelular
Organismo = 1 célula = unidad de función
Organismo multicelular
Funciones tejido-específicas (funciones que adopta y mantiene cada tejido/órgano)
Unidad de función > 1 célula
Células aisladas pierden función tejido-específica " existen y funcionan dentro de un contexto
(“microentorno”)
" interaccionan con este microentorno en forma
dinámica y recíproca
CÉLULAS
microscópicas, móviles, blandas, aplastables,
llenas de medio acuoso
tiene la capacidad de combinarse dando lugar a
variedad de organismos resistentes y complejos
Cómo?
a través de INTERACCIONES
INTERACCIONES DE CADA CELULA CON SU “MICROENTORNO”
A QUE LLAMAMOS “MICROENTORNO” ?
INTERACCIÓN
CÉLULA-CÉLULA
MATIAS BLAUSTEIN 2007
FACTORES
SOLUBLES
INTERACCIÓN
CÉLULA-MEC
“In the complex and crowded environment of a cell,
WHERE you are is as important as WHAT you are… “
(Simon Frantz, Editor Nature)
Qué Saben sobre la Matriz
Extracelular ?
Dónde la encontramos?
Quién la produce?
Qué funciones cumple?
Matriz Extracelular
!  componente NO celular de todos los tejidos y órganos
!  red organizada a la cual las células se adhieren
!  células la fabrican, organizan y degradan
!  influye sobre funciones celulares
!  componentes secretados por células y ensamblados localmente !  existe en todos los mamíferos desde estadio embrionario de 2 células
!  componente del microambiente de todos los tipos celulares
varía la composición y las relaciones espaciales entre células y MEC
! compuesta por GLICOPROTEINAS, “GAGs” glicosaminoglicanos (cadenas de
polisacáridos) y PROTEOGLICANOS (GAGs + núcleo proteico)
MEC (componente no celular)
"  provee andamiaje fisico para organización de los componentes celulares
"  inicia señales bioquímicas y biomecánicas requeridas para la morfogénesis,
diferenciación y homeostasis tisular. Estrategias para la “construcción” de organismos multicelulares
Dos tipos de organización de células para formar tejidos animales
(extremos estructurales)
CONECTIVO
Huesos
Tendones
Tej adiposo
Poco contacto célula-célula
Mucho contacto célula-MEC
Células dispersas dentro de MEC abundante
Rica en polimeros fibrosos (colágeno)
La MEC es la que soporta
la tensión del tejido
EPITELIAL
Recubre cavidades y superficies
Interior de tracto gastrointestinal Epidermis,
Ductos de glándulas (salivales y mamarias)
Mucho contacto célula-célula
Poco contacto célula-MEC
Células se apoyan sobre MEC escasa en forma de alfombra =
“lamina o membrana basal”
barrera entre células epiteliales y tejido subyacente
Rica en laminina
Citoesqueleto mucha participación en soportar la tensión del tejido
Distintos tipos de tejidos y
distintos tipo de MEC Figure 19-40 Molecular Biology of the Cell (© Garland Science 2008)
Figure 19-39 (part 2 of 3) Molecular Biology of the Cell (© Garland Science 2008)
Algunas cels no epitelilales tambien estan en
contacto con membrana basal Figure 19-39 (part 1 of 3) Molecular Biology of the Cell (© Garland Science 2008)
Membrana basal funciona como filtro
en el glomérulo renal previene pasaje
de macromoléculas de sangre a orina
Figure 19-39 (part 3 of 3) Molecular Biology of the Cell (© Garland Science 2008)
Componentes de MEC
COMPONENTES de MB SECRETADOS POR CELULAS
A AMBOS LADOS DE LA MB
GLICOPROTEINAS
Figure 19-41 Molecular Biology of the Cell (© Garland Science 2008)
PROTEOGLICANOS
GAGs (polisacáridos) + proteína
2014 December ; 15(12): 786–801 Importancia de la MEC ejemplificada por consecuencias de KO de
distintos componentes
Patologías causadas por mutaciones en genes de prot. de interacción célula-MEC
LAMININA:
Componente mayoritario de la MB
HETEROTRIMERO
3 cadenas polipeptídicas unidas por puentes S-S
HETEROTRIMERO
3 cadenas polipeptídicas diferentes unidas por puentes S-S
Familia de las lamininas: 11 genes en humanos, (5 para cadena alfa, 3 para beta, 3 para gamma)
Heterotrímeros de laminina identificados hasta la fecha
Distintas isoformas de cada cadena = heterotrímeros con propiedades levemente distintas γ-1 componente de casi todos los heterotrimeros e indispensable (KO letal embrionario)
Familia del Colágeno
28 miembros en mamíferos
Proteína + abundante
30% de la masa proteica
COLAGENO IV: OTRO COMPONENTE DE LA MEMBRANA BASAL
6 cadenas diferentes Se enrollan de a 3 cadenas formando superhélice (soga) denom “protómero”
Protómeros se asocian entre sí a traves de diferentes uniones
3 tipos de
“protomeros”
Uniones Nterm-Nterm (7S)
Uniones Cterm-Cterm (NC1)
Uniones S-S entre protomeros
Superenrollado y curvado Cómo se organiza todo esto?
integrina
Conectores entre
laminina y colageno
Figure 19-43 Molecular Biology of the Cell (© Garland Science 2008)
Las células se conectan con otras células o con la MEC
A TRAVES DE
MOLÉCULAS DE ADHESIÓN (receptores)
EN SUPERFICIE CELULAR
Adhesiones célula-célula
FAMILIA DE CADHERINAS
Adhesiones célula-MEC
FAMILIA DE INTEGRINAS
proteínas de transmembrana que integran
“el afuera” con “el adentro” celular…
Integran uniendo MEC con CITOESQUELETO
Interacción
INTEGRINA -CITOESQUELETO
(dominios de unión a integrinas)
Cola N-term larga- extracelular
Cola C-term corta - intracelular
Citosol
Figure 19-3 Molecular Biology of the Cell (© Garland Science 2008)
Integrina contacta con
filamentos de actina a
traves de proteina
conectora “talina”
Integrinas en mamíferos
" 18 subunidades α
" 8 subunidades β
" 24 combinaciones α-β detectadas a nivel proteico
" 12 heterodimeros contienen subunidad β1
" 5 heterodimeros contienen subunidad αV
" Habilidad de unirse a gran variedad de ligandos- no sólo a
moléculas de MEC
" Un mismo ligando puede unirse a múltiples integrinas
Estructura de Integrinas
El tipo de subunidad alfa que participa en el dímero de
integrina determina el dominio de unión a ligando
" Qué tipo de dominio de unión
a ligando tiene la integrina?
" Qué tipo de dominio de unión
a integrina tiene el ligando
extracelular ?
Integrina-C3bprot
desistemade
complemento
Integrina-Fibronec=na
(proteinadeMEC)
Integrina-moléculasde
adhesioncelular
(CAMs)
Integrina-TGFbeta
(factordecrecim)
Animales Heterocigotas son completamente normales
Embriones Homocigotas se desarrollan hasta estadio de
blastocisto, se implantan normalmente pero mueren
inmediatamente despues de la implantación
12/24 heterodimeros de integrinas contienen subunidad β1
LAS INTEGRINAS SUFREN CAMBIOS CONFORMACIONALES
QUE AFECTAN INTERACCIONES A AMBOS LADOS DE LA MEMBRANA
“activación-inactivación”
regulación de la afinidad de integrinas por sus ligandos
extracelulares
ACTIVACION DE INTEGRINAS
CONFORMACION “CERRADA”
CONFORMACION “ABIERTA
Laregulacióndelaac=vidaddelasintegrinasesescencialparael
normalfuncionamientodecélulas,tejidosyórganos.
Ejemplo:Ac=vacióninapropiadadeintegrinasenplaquetas
sanguíneascausapatologíascomotrombosis
colas citoplasmaticas
interaccionan fuertemente
Figure 19-48b Molecular Biology of the Cell (© Garland Science 2008)
“OUTSIDE-IN ACTIVATION” (de afuera hacia adentro)
unión de ligando extracelular activa integrina cambiando su conformación
intracelular y exponiendo sitio de union a talina que estaba tapado por interacción
entre subunidades
α y β
CONFORMACION “CERRADA”
colas citoplasmaticas
interaccionan fuertemente
Figure 19-48b Molecular Biology of the Cell (© Garland Science 2008)
CONFORMACION “ABIERTA
“inside-out” activation (de adentro hacia fuera):
"  Vías de señalización modifican conformación de TALINA promueven unión a β integrina ➣ cambio conformacional se “propaga” a
dominio extracelular de integrina ➣ promueven unión a ligando (aumenta
afinidad por proteína de MEC)-
"  Vías de señalización modifican conformación de dominio citoplasmático de integrinas
Conformación autoinhibitoria
Figure 19-49 Molecular Biology of the Cell (© Garland Science 2008)
Talina
Actor clave en la activación de integrinas (en la formación de la adhesión celula-MEC)
α
" Unión de talina desarma
interacción entre subunidades
α y β, separa las colas y esto
lleva a la activación
" talina se une a dom
citoplasmáticos de la mayoría
de las β integrinas
β
adhesión MEC-INTEGRINA-CITOESQUELETO de actina
(dominios de unión a integrinas)
Cola N-term larga- extracelular
Cola C-term corta - intracelular
Citosol
Integrina contacta con
filamentos de actina a traves
de “talina”
Figure 19-3 Molecular Biology of the Cell (© Garland Science 2008)
núcleo
actina
integrinas Intracelularmente se induce el ensamblado de
complejos multiproteicos
(citoesqueleto y moléculas de señalización)
Complejo de adhesión o “Adhesoma”
todos los tipos de complejos de adhesión, no solo mediados por integrinas
MEC
“adhesoma”
! Heterodímero de integrina
! Composicion, densidad y rigidez de
MEC
! Tipo celular
qué proteinas conforman adhesoma
qué cascadas de señalización se
activan cuál será el “destino” celular
Ensamblado de complejo de adhesión
organiza/regula ensamblado de
citoesqueleto
160 componentes identificados en Adhesomas
Relacionados entre sí a través de 690 interacciones confirmadas
Efecto de diferentes “tipos” de MECs sobre el
“spreading” celular y la formación de
adhesiones focales.
células que expresan VINCULINA-GFP
fibronectina
α5β1integrina
vitronectina
αVβ3
endogenamente no cuentan con
integrina que una vitronectina
pero fueron transfectadas con αV β3
Células sanguineas (linea celular) , plaqueadas sobre proteína de MEC (vitronectina),
en presencia de un agente activador de la adhesion (PMA)-
Se cuantifica células adheridas y se visualiza fibras de actina x IF
Ensayo de polimerización de actina in vitro a partir de adhesomas purificados de células
transfectadas con GFP-β3
adheridos a esferas magnéticas recubiertas con
anticuerpo anti integrina β3
+ actina-TRITC
15 minutos c/ actina-TRITC + 5 minutos actina-FITC
Integración de cascadas
de señalizacion
activadas dentro de una
célula por distintas
interacciones
exterior
Una misma molécula/vía de señalización puede ser activada por:
- unión de GF a su receptor
- unión ECM-integrinas
- unión célula-célula
En muchos casos, activación conjunta es necesaria para respuesta
celular apropiada
más complejo aún…
“cross-talk”(regulación cruzada) entre distintos complejos ligando-receptor
Unión de factor de crecimiento (GF) a su receptor influye sobre
función de integrinas
1- alterarando la
expresión de
subunidades de
integrinas o de otros
componentes del
adhesoma
2
1
2- favoreciendo la
habilidad de integrinas
de unirse a moléculas
de MEC •  activación inside-out
•  MPT de integrinas
más complejo aún…
“cross-talk”(regulación cruzada) entre distintos complejos ligando-receptor
Unión de factor de crecimiento (GF) a su receptor influye sobre
función de integrinas
1- alterarando la
expresión de
subunidades de
integrinas o de otros
componentes del
adhesoma
2
1
2- favoreciendo la
habilidad de integrinas
de unirse a moléculas
de MEC •  activación inside-out
•  MPT de integrinas
Sólo en células epiteliales puede haber otro tipo de adhesiones célula-MEC
“hemidesmosomas” Un tipo particular de integrina (heterodímero α6 β4) se une a laminina de MB e intracelularmente se une a filamentos intermedios (queratina)
CEL-MEC
UNIONES de ANCLAJE"
Figure 19-46 Molecular Biology of the Cell (© Garland Science 2008)
Hemidesmosoma
señalización disparada por unión GF-GFR
Modifica integrinas (MPTs) - desensamblado de complejo de adhesión (hemidesmosoma)
Factor de crecimiento (EGF) promueve fosforilación de residuos serina (S)
en cola citoplasmática de integrina ß4 (via acción de quinasa/s)
Se desestabiliza interacción con plectina y se desensambla hemidesmosoma
Quinasa/s
Hemidesmosoma
estable
EGF
Procesos dinámicos, cicatrización de heridas en epidermis,
requieren desestabilización de adhesiones celulares. Y la situación inversa también ocurre….
Unión de MEC a integrinas (y reclutamiento de adhesoma) influye
sobre señalización disparada por Receptor de GF
GF
GFR
Adhesomainfluye
sobrevíasde
señalización
disparadaspor
ac=vacióndeGFR
Adhesomaproduce
MPTssobreGFRque
llevanaac=vaciónde
GFRaúnenausencia
deligandoydisparan
señalizaciónríoabajo
GFR
Y la situación inversa también ocurre….
Unión de MEC a integrinas (y reclutamiento de adhesoma) influye
sobre señalización disparada por Receptor de GF
GF
GFR
Adhesomainfluye
sobrevíasde
señalización
disparadaspor
ac=vacióndeGFR
Adhesomaproduce
MPTssobreGFRque
llevanaac=vaciónde
GFRaúnenausencia
deligandoydisparan
señalizaciónríoabajo
GFR
Integración de cascadas
de señalizacion activadas
dentro de una célula por
distintas interacciones
exterior
integrinas & GFRs son más que receptores individuales que
unen a sus respectivos ligandos.
Funcionan como un “sistema sensor”que le permite a las
células detectar dónde están y definir cómo responder Otro ejemplo de regulación cruzada entre sistemas ligando-receptor
“célula normal”
mitógeno-dependiente
anclaje-dependiente
inhibición por contacto
vs.
“célula transformada”
mitógeno-independiente
anclaje-independiente
pérdida de inhibición por contacto
Las células NO transformadas
(salvo células no-adherentes - sanguíneas)
requieren adhesión a MEC
para progresión del ciclo celular
Adhesión
célula-MEC???
Figure 17-14 Molecular Biology of the Cell (© Garland Science 2008)
Laac%vacióndelcomplejo
CDK/cycDfosforilaeinac%va
parcialmentelaproteínaRB
permi%endolasíntesis,
mediadaporelFTE2F,de
ciclinaE.
ElcomplejoCDK/cycEinac%va
porcompletolaproteínaRB.
G1-Cdk = CDK4-6/cycD
G1/S-Cdk = CDK2/cycE
S-Cdk = CDK2-1/cycA
•  Aumenta ciclina D
•  Aumenta factor
que degrada a
p27 (inhibidor de
cdks)
Unión MEC-integrina activa distintas moléculas de señalización
Factor de crecim
(mitógeno)
MEC
integrina
adhesoma
Src
Abl
FAK
Rho GTPasas
PKC
eventos independientes?
ILK
eventos coordinados?
Pi3K/Akt
MEK/ERK
… otras
Receptor de
factor de crecim.
en el contexto de la proliferación celular…
La activación de alguna/s vias señalización disparadas por unión
integrina-MEC dependen de actividad de EGFR (receptor de EGF) ??
MEC
integrina
Receptor de
factor de crecim.
!  Células en suspensión (S) vs. Células adheridas a dif MEC (FN, LM, CL)
!  TODAS EN AUSENCIA DE SUERO (SIN FACTORES DE CRECIM)
Adhesión aumenta fosforilacion de EGFR
aún en ausencia de ligando (EGF)
Fosforilación de EGFR en ausencia de ligando
Adhesion aumenta fosforilación de
EGFR aún en ausencia de dominio
extracelular
Fosforilación de EGFR en ausencia dom extracelular
SINLIGANDO!!!!!!!
AG
PD
Aumento en fosforilación de
ERK disparada por adhesión (integrina-MEC) depende de actividad de
Receptor de EGF (EGFR)
Adhesión aumenta fosforilación de ERK
! 
Células en suspensión = S
! 
Células adheridas a MEC (FN)
! 
TODAS EN AUSENCIA DE SUERO (SIN FACT DE CRECIM)
Vía de ERK (y de Akt) necesarias para progresión del ciclo celular…
Es suficiente la activación de estas vias por integrinas para que las
células proliferen?
Marcación de células en fase S con BrdU y anticuerpo fluorescente
anti-BrdU
NO es suficiente la activación por MEC-integrinas
Vías de ERK y Akt necesarias para progresión del ciclo celular
NO es suficiente la activación de estas vias por integrinas para que las
células proliferen
El ciclo celular progresa
gracias a combinación de
señales disparadas por
a
c
a) integrinas-MEC;
b) Activacion de EGFR por
integrinas (aún en
ausencia de ligando)
c) GFs-receptores de GF
b
SIN
LIGANDO
Con factor de
crecimiento
(ligando)
EGFR
Células adheridas
(unión
Integrina-MEC)
SIN
LIGANDO
Con factor de
crecimiento
(ligando)
EGFR
AMBOS SUBSETS DE FOSFORILACIONES SON NECESARIOS
PARA LA PROGRESION DEL CICLO CELULAR
unión
IntegrinaMEC
Fosforilaciones inducidas por formación de adhesoma
(integrina-MEC) son diferentes a las inducidas por unión de
EGF a EGFR,
ambas necesarias para la progresión del ciclo celular
Integración de cascadas
de señalizacion
activadas dentro de una
célula por distintas
interacciones
exterior
Una misma molécula/vía de señalización puede ser activada por:
- unión de GF a su receptor
- unión ECM-integrinas
- unión célula-célula
En muchos casos, activación conjunta es necesaria para respuesta
celular apropiada