INVE MEM 2005 129815

Desarrollo de embriones somáticos de alcornoque
en biorreactores de inmersión temporal
Jesús Jiménez, Inmaculada Hernández, Dolores López-Vela, Mariano Toribio y Jesús Alegre
Instituto Madrileño de Investigación y Desarrollo Rural, Agrario y Alimentario (IMIDRA)
Finca “El Encín”. Apartado 127, 28800 Alcalá de Henares (Madrid).
e-mail: [email protected]
imidra
INTRODUCCIÓN
El sistema de inmersión temporal (SIT) se basa en el empleo de medio líquido y el establecimiento de ciclos de aporte y retirada del
medio. Esto permite aprovechar las ventajas del medio líquido (favorece la absorción de nutrientes, el crecimiento del material vegetal
y la dilución de los metabolitos excretados), al tiempo que reduce sus inconvenientes (suprime el contacto continuo de los explantos con
el medio de cultivo, evitando los problemas de asfixia y vitrificación). Por otra parte el SIT facilita el control y el estudio de la nutrición
en el cultivo in vitro y puede contribuir al desarrollo óptimo de los explantos. En este trabajo presentamos la puesta a punto de un SIT
aplicado a la obtención de embriones somáticos de alcornoque.
PREPARACIÓN DEL INÓCULO
MATERIALES Y MÉTODOS
- MATERIAL VEGETAL:
Zonas de necrosis
--
Células somáticas desprendidas de
zonas de necrosis de embriones
somáticos en proliferación.
- EQUIPO Y DISPOSITIVO SIT:
El equipo utilizado consta de dos recipientes conectados
entre sí con tubos de silicona que se acoplan a una bomba
de presión. El sistema es gobernado por un programador,
que abre y cierra una serie de electroválvulas para permitir
el paso del medio en uno u otro sentido.
1. Se seleccionaron masas
de embriones somáticos
de Q.s. en proliferación.
2. Se cultivaron en 500 ml.
de medio SH en agitador
orbital (110 r.p.m.) en
cámara de cultivo a 25 ºC,
durante 7 días.
3. y 4. Se procede al filtrado
del líquido con discos de
papel estéril (0,2 ). Las
células de necrosis
desprendidas se
retuvieron en el disco y
éste fue introducido en los
recipientes.
1
2
3
4
Inoculo inicial
BOMBA AIRE PRESIÓN
PROGRAMADOR
2 Inmersiones/día
RESULTADOS
4 Inmersiones/día
1 Inmersión/día
GRÁFICO 2: COMPARACIÓN TRATAMIENTOS TIS-ESTA
CONSUMOS ACUMULADOS NO3-
GRÁFICO 1: COMPARACIÓN TRATAMIENTOS TIS-ESTA
CONSUMOS ACUMULADOS NH4+
6 Inmersiones/día
ELECTROVALVULA
70,00
20,00
CONDUCCIÓN DE AIRE
60,00
RECIPIENTES
15,00
Esquema del SIT
50,00
TIS
10,00
ESTA
mg/l
Vista del Sistema
de Inmersión Temporal (SIT)
mg/l
CONDUCCIÓN DE ELECTRICIDAD
ESTACIONARIO
0,00
30
45
- TRATAMIENTOS UTILIZADOS:
60
75
90
105
pH
8
7,5
7
6,5
6
5,5
5
4,5
4
- PARÁMETROS ESTUDIADOS:
NH4+
Espectrofotómetro - colorimetría
NO3-
Ionómetro – Electrodos selectivos
H2PO4-
Espectrofotómetro - colorimetría
Ntotal
Suma NH4+, NO3-
pH
pH - metro
CE
Conductivímetro
Pesadas
Peso Fresco final de los embriones
60
75
90
105
120
G R ÁFIC O 4: PESO FR ESC O FIN AL D E LO S EM B R IO N ES
PO R T R AT AM IEN T O S T IS-EST A
TIS
12
10
ESTA
8
gr
6
4,09
TIS
E S TA
4
30
45
60
75
90
105
o El gráfico 1, señala diferencias entre los tratamientos SIT y
ESTA,
siendo
éstas
más
acusadas en los últimos periodos
de cultivo (a partir de 90 días).
El consumo de amonio fue más elevado en el tratamiento SIT,
lo que pudiera estar en relación
con el hecho de que se formaran
embriones más desarrollados, al
contrario que en el ESTA que
fueron en estado globular.
o Las diferencias en el consumo de
NO3- (gráfico 2) fueron más
marcadas en la comparación de
las frecuencias de SIT que en el
de los tratamientos SIT-ESTA.
El mayor consumo fue en el del
tratamiento de 6 inmersiones.
Pesadas
Se valoró el aspecto
Y tipos de estructuras (morfología)
45
10,16
MUESTREOS
Medio de cultivo líquido MS (Murashige & Skoog, 1962) con macronutrientes
SH (Schenk & Hildebrant, 1972)
30
Días de cultivo
GRÁFICO 3: COMPARACIÓN TRATAMIENTOS TIS-ESTA pH
15
INMERSIÓN PERMANENTE EN
AGITADOR ORBITAL A (110 r.p.m.)
15
120
Días de cultivo
SISTEMA ESTACIONARIO
(ESTA)
SISTEMA DE INMERSIÓN
TEMPORAL (SIT)
Desarrollo de los embriones
30,00
10,00
15
Evaporación
TIS
20,00
5,00
0,00
1 Y 6 INMERSIONES /DÍA
40,00
Proyecto RTA 03-050
120
2
0
En la gráfica 3, se observa una tendencia a elevarse en todos
los tratamientos, pero es mucho más lineal y regular en el
caso del SIT que en el ESTA que produce el necrosamiento
de los embriones, coincidiendo además con una mayor
captación de NO3- en las etapas finales del cultivo.
En la comparación de los pesos frescos obtenidos (gráfica 4)
podemos observar diferencias entre los tratamientos SITESTA, siendo mucho mayores en el ESTA. Esto fue
posiblemente debido a que la preparación del inóculo inicial
del SIT no fue lo suficientemente homogénea.