Guía de Laboratorio 2: Morfología Bacteriana

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Universidad Andrés Bello
Facultad de Ciencias de la Vida
Departamento de Ciencias Biológicas
Laboratorio de Microbiología
Guía N°2:
Morfología bacteriana: observación macroscópica y
microscópica
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TRABAJO PRÁCTICO N°2
Objetivos:
•
Conocer las tinciones más frecuentemente utilizadas en microbiología (Gram, Ziehl
Neelsen, tinción de esporas y tinción de cápsula), sus fundamentos y su utilidad.
•
Realizar la observación microscópica de los frotis teñidos. Distinguir morfología
(cocáceas y bacilos), afinidad tintorial (Gram positivos y negativos) y agrupación
(cadenas, racimos, diplococos).
MARCO TEÓRICO
MORFOLOGÍA MACROSCÓPICA DE LAS COLONIAS
Una etapa importante y básica en el estudio de las características de una bacteria, es la
observación de su morfología. Como consecuencia del pequeño tamaño que presentan, no es
posible distinguirlas a simple vista; sin embargo, podemos estudiar poblaciones bacterianas,
llamadas colonias (observación macroscópica). Cada colonia está formada por millones de
células bacterianas. Para obtener estas colonias es necesario proporcionar a las bacterias los
requerimientos necesarios de materia orgánica, iones inorgánicos y factores de crecimiento,
entre otros, mediante un medio de cultivo.
El examen macroscópico permite un acercamiento en la identificación de los géneros
bacterianos, que poseen características propias de desarrollo de sus colonias, según su forma,
elevación, margen y color.
La orientación sobre las pruebas bioquímicas para la identificación definitiva depende en
gran parte del aspecto macroscópico de las colonias.
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MORFOLOGÍA MICROSCÓPICA
La observación microscópica de una colonia extendida sobre un portaobjetos permite
distinguir la forma microscópica de las bacterias.
•
Microscopía directa al fresco:
Esta técnica no utiliza tinciones sino que consiste en observar entre portaobjeto y cubreobjeto
una gota de muestra clínica o una gota de cultivo líquido. Su principal utilidad es la observación
de la motilidad bacteriana.
•
Microscopía con tinciones:
La observación microscópica de bacterias utiliza variadas técnicas tintoriales que se basan
en ciertas características estructurales de los agentes, de las cuales la más importante es la
tinción de Gram. La siguiente tabla menciona algunas tinciones utilizadas en el laboratorio para
el diagnóstico de infecciones bacterianas.
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Tabla Nº1. Tinciones de uso en el diagnóstico de agentes bacterianos:
Alcohol
1. Tinción de Gram:
La técnica de mayor importancia en el área de la microbiología, es la tinción de Gram,
pues divide a las bacterias en dos grandes grupos: Gram positivas y Gram negativas. Además,
permite diferenciar forma (cocos, bacilos) y la agrupación bacteriana (pares, cadenas, racimos).
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La tinción de Gram consiste en teñir un frotis de bacterias con cristal violeta y luego
tratarlas con una solución mordiente (fijadora) de Iodo y Ioduro, denominada Lugol. Todas las
bacterias se tiñen en estas condiciones. Sin embargo, sólo algunas son capaces de retener el
colorante al tratarlas con un agente decolorante como etanol o una solución decolorante de
etanol-acetona. Las bacterias que retienen el colorante son Gram positivas; las que se
decoloran son las Gram negativas y para observarlas deberán teñirse con un colorante de
contraste (safranina). Por lo tanto, las bacterias Gram positivas se verán de color azul o
violeta y las bacterias Gram negativas de color rojo o rosado.
La diferencia en la reacción frente a la tinción de Gram se debe a que la composición
química de las estructuras externas de las bacterias es distinta. Las bacterias Gram positivas
tienen una capa gruesa de peptidoglicán o mureína, mientras que las Gram negativas tienen
menor cantidad de peptidoglicán y tienen una membrana externa (además de la membrana
citoplasmática). La explicación más aceptada es que, luego de la acción de la solución
decolorante, las bacterias Gram positivas son capaces de retener el colorante gracias al
peptidoglicán. En cambio, las Gram negativas, pierden parte de los lípidos de su membrana
externa por acción del decolorante (un solvente orgánico, como por ejemplo, alcohol), lo que
sumado a la menor cantidad de peptidoglicán, hace que se decoloren. Es importante
destacar que la etapa crítica en la tinción es la decoloración, por lo que se debe tener especial
cuidado en realizarla en forma adecuada.
La tinción de Gram:
1.- Revela la afinidad tintorial de las bacterias: - Gram positivas - Gram negativas
2.- Permite conocer la forma bacteriana: - Cocáceas – Bacilos - Cocobacilos – Vibrios Espirilos – Espiroquetas
3.- Permite conocer la disposición o agrupación bacteriana:
Cocáceas en diplococos (pares)
Cocáceas en estreptococos (cadena)
Cocáceas en tétrada
Cocáceas en sarcina (octágena)
Cocáceas en estafilococos (racimo)
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Gram negativas
Gram positivas
Fig 1. Esquema de diferentes formas bacterianas
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Fig 2. División de las células que origina distintas agrupaciones bacterianas a) División
en un plano, b) División en dos planos, c) División en 3 planos y d) División al azar.
Utilidad clínica de la tinción de Gram:
Este examen permite al clínico sospechar el agente causal de la infección, que muchas
veces sirve de base para el inicio de la terapia antibiótica.
La sensibilidad analítica (el número mínimo de bacterias que la técnica puede detectar)
es de 100.000 bacterias /ml de muestra.
La sensibilidad clínica (la probabilidad de que un paciente que tenga una infección
arroje un resultado positivo en un test) varía según tipo de muestra:
•
Líquido cefalorraquídeo (meningitis): 75 %
•
Líquido pleural (empiema pleural): 50-80%
•
Líquido peritoneal (peritonitis): 25-50%
•
Líquido articular (artritis séptica): 50%
La tinción de Gram se debe solicitar en toda muestra clínica y es de gran importancia en
las infecciones mixtas por bacterias aeróbicas y anaeróbicas, pues si bien los anaerobios no
crecen en los medios habituales, sí se observan en la tinción de Gram.
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2. Tinción de Cápsula:
Utiliza tinta china para evidenciar la presencia de la cápsula microbiana, pues tiñe de color
negro todo el frotis, salvo la cápsula (queda un espacio blanco, sin teñir). El resto del
microorganismo se tiñe de color rojo con el colorante de contraste (safranina). Se observa con
objetivo de inmersión (100x).
Ej. Tinción de cápsula (Enterobacter sp. y Streptococcus pneumoniae).
3. Tinción de esporas:
Utiliza el colorante verde de malaquita que tiñe esta forma de resistencia de algunas
bacterias. El resto de la bacteria se tiñe de color rojo con el colorante de contraste (safranina).
Se observa con objetivo de inmersión (100x).
Las esporas pueden ser terminales o subterminales o pueden encontrarse libres de la
célula bacteriana. Ej.Clostridium sp., Bacillus sp.
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4. Tinción de Ziehl Neelsen:
Es de gran importancia en microbiología, ya que permite evidenciar la presencia de
bacilos ácido-alcohol resistentes como Mycobacterium tuberculosis. Dicho patógeno es el agente
causal de la tuberculosis, enfermedad infecciosa muy importante en nuestro país.
La tinción también se utiliza para el estudio de Cryptosporidium en muestras de deposiciones.
Fundamento:
La fucsina, que es un colorante básico, forma un complejo con los ácidos micólicos de la
pared de las micobacterias. Este complejo es resistente a la decoloración con alcohol-ácido
(alcohol clorhídrico) permaneciendo de color fucsia las bacterias ácido alcohol resistentes
(AAR+), a diferencia de las otras bacterias (AAR-) que se decoloran. El azul de metileno se usa
como tinción de contraste.
Técnica:
1.- Se cubre el frotis con fucsina concentrada de Ziehl Neelsen.
2.- Se calienta el frotis hasta que emita vapores (2 a 3 minutos).
3.- Se decolora escurriendo alcohol-ácido.
4.- Se tiñe con azul de metileno, el colorante de contraste,
por 30 segundos.
5.- Dejar secar y leer con objetivo de inmersión (100x).
Utilidad clínica:
Permite identificar micobacterias presentes en una muestra.
En Chile, la presencia de bacilos ácido-alcohol resistentes en muestras diferentes es
altamente sugerente de tuberculosis.
La cantidad mínima de bacilos que es capaz de detectar (sensibilidad analítica) varía
entre 5.000 a 10.000 bacilos / ml de muestra.
La sensibilidad clínica varía según tipo de muestra:
•
Líquido cefalorraquídeo: 20-40%
•
Líquido pleural: 50%
•
Líquido peritoneal: 25%
•
Líquido articular: 20%
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•
Orina: No es diagnóstica de tuberculosis por la alta incidencia de micobacterias no
tuberculosas en esta muestra.
La tinción de Ziehl Neelsen se debe solicitar en toda muestra clínica cuando se sospecha
tuberculosis, ya que es un examen rápido, sencillo y de bajo costo que además de confirmar un
diagnóstico, permite conocer los casos infecciosos.
USO CORRECTO DEL MICROSCOPIO DE LUZ (ACEITE DE INMERSIÓN):
Para observar las bacterias con tinción de Gram, tinción de Ziehl Neelsen, tinción de
cápsula y tinción de esporas es necesario utilizar el objetivo de inmersión (100x). Para ello una
vez realizado el extendido y la tinción se debe:
1. Colocar la preparación sobre la platina del microscopio.
2. Verificar que el condensador esté arriba y el diafragma abierto, ya que el objetivo de inmersión
requiere mucha más luz que los objetivos secos.
3. Enfocar primero con el objetivo 40x (seco), eligiendo la zona de interés.
4. Colocar el revólver a mitad de camino, entre el objetivo 40x y el de inmersión (100x, el de la
línea negra) EVITANDO CUALQUIER CONTACTO DE LOS OBJETIVOS SECOS CON EL
ACEITE DE INMERSIÓN.
5. Colocar una gota de aceite de inmersión sobre la preparación.
6. Cuidadosamente colocar el objetivo 100x en contacto con el aceite, el objetivo deberá estar
prácticamente tocando el portaobjetos y el aceite deberá ocupar este pequeño espacio.
7. Observar con los oculares y ajustar el foco utilizando sólo el micrométrico.
8. Una vez terminada la observación microscópica, LIMPIAR CUIDADOSAMENTE EL
OBJETIVO, RETIRANDO EL ACEITE CON UN PAPEL TISSUE.
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ACTIVIDADES
Primera sesión
1. Siembra en distintos agares:
Siembre las placas con las bacterias que le entregará el profesor. Debe sembrar con
la técnica de aislamiento en cuadrantes en los siguientes medios de cultivo: Agar
Corriente, Agar Sangre, Agar Manitol, Agar MacConkey
2. Preparación frotis:
a. Colocar con el asa una gota de agua en el centro de la lámina (aprox. 0,5 cm de
diámetro).
b. Flamear el asa para su esterilización.
c. Enfriar el asa en un sector del agar donde no exista crecimiento bacteriano.
d. Tomar una colonia con el asa desde la placa.
e. Mezclar la muestra con la gota de agua.
f. Fijar el frotis exponiéndolo a la llama del mechero hasta que se seque, recuerde
que no debe tener la muestra sobre la llama del mechero por mucho tiempo.
3. Tinción de Gram
a. Verificar, con el dorso de la mano, que el vidrio no esté demasiado caliente.
b. Cubrir el frotis completamente con cristal violeta y dejar en reposo por 1 min.
c. Dejar escurrir el cristal violeta y agregar sobre la muestra una solución de lugol.
d. Dejar con lugol por 1 min.
e. Lavar el lugol y agregar alcohol-acetona por 15-20 seg. (es importante no
sobrepasar este tiempo ya que la decoloración excesiva puede alterar los
resultados de la tinción). Lavar con agua dejando escurrir suavemente, hasta
eliminar el exceso.
f. Cubrir con colorante de contraste, Safranina al 1%, por 1 min.
g. Lavar con agua, dejar escurrir y secar suavemente con papel absorbente.
h. Observar en el microscopio óptico con inmersión.
Utilizar el microscopio, anotar y fotografiar lo que observe.
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Segunda sesión
1. Observación macroscópica:
De las siembras realizadas en la sesión práctica anterior, realizar análisis macroscópico
2. Tinción de Cápsula:
a. Limpie una lámina portaobjeto con alcohol y seque cuidadosamente con papel
absorbente.
b. En una esquina de la lámina portaobjeto coloque una gota de tinta china del tamaño
de una arveja.
c. Esterilice el asa y tome una colonia grande del cultivo de la bacteria Klebsiella spp.
d. Mezcle la tinta china con la bacteria, La tinta china impide ver si la solución
tiene o no suficiente bacteria, por lo mismo es necesario mezclar con suficiente
cultivo.
e. No ensucie su cultivo bacteriano con tinta china, asegúrese de esterilizar el asa
previamente y de enfriarla.
f.
Realice un frotis extendiendo la suspensión de manera que quede una capa
delgada. Esto se realiza tomando otro portaobjeto y, esparciendo la mezcla a lo
largo del portaobjeto que contiene la mezcla tinta china-bacteria. Ver Figura.
g. Fije suavemente en el mechero o seque al aire.
3. Tinción de esporas
a.
Limpie una lámina portaobjeto con alcohol y seque cuidadosamente con papel
absorbente.
b. Ponga una gota de agua del tamaño de una arveja en el portaobjetos.
c. Tome una muestra de Bacillus spp. con el asa, mezcle con la gota de agua y fije en
el mechero hasta que se seque completamente (sin hervir).
d. No olvide esterilizar el asa después de usarla. No la deje contaminada sobre el
mesón.
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e. Corte papel absorbente en forma rectangular, de manera que cubra el frotis con
bacteria.
f.
Ponga 4 capas de papel sobre el frotis y, a continuación, agregue solución colorante
verde de malaquita. Debe fijarse que el colorante tiene que atravesar las 4 capas de
papel y ponerse en contacto con el frotis bacteriano.
g. Esta tinción se realiza en caliente: para ello con unas pinzas de madera debe
colocar la muestra encima de la llama del mechero hasta observar emisión de vapor
durante 5 min. No sobrecaliente para evitar que se queme su muestra o se rompa el
portaobjeto, mueva la muestra por sobre la llama del mechero para evitar que se
quiebre el portaobjetos y se queme la muestra.
h. Una vez que se detenga la emisión de vapor desde la muestra, hay que reponer el
colorante nuevamente. Debe repetir 2 veces este proceso.
i.
Lave con agua de tal manera que escurra suavemente todo el colorante verde de
malaquita.
j.
Posteriormente cubra con Safranina por 2 minutos
k. Documentar sus resultados y completar el informe del laboratorio
Tinción de cápsula
Tinción de esporas