Rendimiento supra-biológico de enzimas inmovilizadas por interacciones no covalentes

Artículo https://doi.org/10.1038/s41467-024-46719-5
Rendimiento supra-biológico de enzimas
inmovilizadas habilitadas por
interacciones no covalentes similares a las
chaperonasespecíficas.
Recibido: 7 de septiembre de
2023
HéctorSánchez-Morán1, JoelL.Kaar1& DanielK.Schwartz1
Aceptado: 1 de marzo de
2024
Diseñar materiales sintéticos complejos para la inmovilización enzimática
podría desbloquear la utilidad de la biocatálisis en entornos extremos.
Inspirados por la biología, investigamos el uso de escobas aleatorias de
copolímeros como soportes dinámicos de inmovilización que permiten el
rendimiento catalítico supra-biológico de enzimas inmobilizadas. Esto se
demuestra inmovilizando Bacillus subtilis Lipase. Un cepillo empapado con
fragmentos aromáticos, que pueden interactuar con la lipasa mediante
múltiples interacciones no covalentes. La incorporación de grupos
aromáticos conduce a un aumento de 50°C en la temperatura óptima de la
lipasa, así como a un aumento de 50 veces en la actividad enzimática. Los
estudios FRET de molécula única revelan que estos sacos apoyan a las
chaperones biomiméticas al promover el plegamiento de la enzima y
estabilizar el estado plegado y catalíticamente activo de la enzima. Este
efecto disminuye cuando los residuos aromáticos mutan, lo que sugiere la
imimportancia de las interacciones de apilamiento π y catión π para la
estabilización. Nuestros resultados subrayan cómo las interacciones de
apoyo enzimático poco exploradas pueden permitir oportunidades
inexploradas para el uso de enzimas en biotransformaciones industriales.
Comprobar actualizaciones
La inmovilización de soportes sólidos de la fenzyme tiene el
potencial de proporcionar mayor estabilidad, actividad y facilidad
de usabilidad1–4, para aplicaciones en fabricación química y
farmacéutica5–10, biodetección11–13 y biorremediación14,15.
Los materiales típicos de inmovilización consisten en materiales
basados en carbohidratos altamente porosos, soportes
inorgánicos o compuestos de sitios, incluyendo agarosa16–18,
nanoflores inorgánicas19,20 o estructuras metal-orgánicas3,21–
23. Sin embargo, las enzimas suelen inactivarse al inmovilizar
tales materiales debido a la desnaturalización como resultado de
interacciones entre el fenofeno y material y/o bloqueo del sitio
activo de la enzima, lo que a su vez conduce a una reducción del
rendimiento catalítico global24–26. Avances recientes sugieren el
potencial
de
materiales
complejos
y
heterogéneos—
suchaslipidbicapas27,28 brochas orcopo-lymerbrushes25,29–
32—mientras el peto apoya la inmovilización forenzyme. Estos
materiales sintéticos son excepcionalmente dinámicos y
químicamente ajustables, comprendiendo nuevas partes
químicas que interactúan de forma no covalente mediante
autoensamblaje transitorio con la mitad en la superficie
enzimática. Es importante destacar que el cepillo de polímeros
puede ver la introducción de interacciones biomiméticas no
covalentes, como el enlace H, el autoensamblaje hidrofóbico, el
apilado π y las interacciones π-catión. Este último
Las interacciones relacionadas con el aromático se encuentran en
ensamblajes macromoleculares biológicos, incluyendo ADN de
doble cadena33, proteínas de organismos extremofílicos34–36 y
los medios de separación intracelular en fase líquido-líquido37–39.
Se cree que tales interacciones también contribuyen a la
estabilización de otros mal-mal, dada su insensibilidad a las
variaciones de temperatura40, y pueden interceder puentes fuertes
como salados41,42. La incorporación de grupos aromáticos en los
soportes de inmovilización puede favorecer el apilamiento
estabilizador38, 43 y π-catión34,35,42,44–46 interacciones con
residuos enzimáticos expuestos a la superficie catiónica aromatica,
respectivamente.
La introducción de interacciones estabilizadoras inspiradas
biológicamente en materiales poliméricos dinámicos y químicamente
heterogéneos puede permitir mecanismos complejos de
estabilización para ensamblajes enzima-polímero solubles o enzimas
inmovilizadas. Por ejemplo, se han explorado interacciones
sintéticas entre approa y chestomimic, biológicamente relevantes,
utilizando
conjuntos
de
heteropolímeros47.
Además,
la
encapsulación polimérica—las fenoenzimas han resultado en su
estabilización a altas temperaturas y interfaces co-solventes48–51.
Aunque el complejo mecanismo de interacción enzima-polímero
puede desafiar la separación usando métodos convencionales de
caracterización, una amplia gama de métodos biofísicos y
bioquímicos,
1Departamento de Ingeniería Química y Biológica, Universidad de Colorado Boulder, CampusApartado 596 Boulder,
CO80309, EE. UU.correo electrónico: [email protected]; [email protected]
y se han empleado enfoques computacionales. Además, la
microscopía de transferencia de energía de la molécula única
Försterresonance (SM-FRET) ha proporcionado conocimientos
mecanicistas únicos para la enzima simmo-bilizada sobre
soportes poliméricos, demostrando específicamente que los
soportes dinámicos con un equilibrio adecuado de las
interacciones entre la fenzyma y el polímero pueden mejorar el
rendimiento de las enzimas inmovilizadas al estabilizar el estado
plegado y/o facilitar el replegue. Este último efecto es análogo a
un mecanismo "similar al de la acompañante", en el que la
conformación activa y, por tanto, la función de la enzima se
rescata de un estado natural. Cabe destacar que este fenómeno
se ha reportado en varias moléculas y macromoléculas
naturales27,28,52,53 y sintéticas25,54 como bicapas lipídicas o
escobas poliméricas injertadas en superficie. Estos hallazgos
sugieren que otras variaciones en la estructura polimérica
pueden ofrecer nuevas oportunidades para mejorar el
rendimiento de las enzimas inmovilizadas.
Ya demostramos anteriormente que la inmovilización de
Bacillussubtilis
La lipasa A (LipA) en el cepillo polimérico de sulfobetaína
zwitteriónica (SBMA) sostiene la desestabilización no en tableta
de LipA25,29. A diferencia de muchas otras enzimas lipasina,
LipA carece de una tapa anfifílica que cubre el sitio activo y, por
tanto, su hendidura de unión está expuesta al disolvente55,56.
Encontramos que el rendimiento mejorado de LipA se debió a las
interacciones hidrofílicas estabilizadoras entre la superficie de
LipA, que en general es altamente hidrofila en comparación con
otras lipas, y SBMA26,57. Además, demostramos que más lipasas
hidrofóbicas se estabilizaron mejor con cepillos mixtos de
polímero menos hidrofilos que contenían SBMA y metacrilato de
polietileno glicol. Aquí investigamos la hipótesis de que los
pinchas poliméricas SBMA con diversas cantidades de monómero
aromático de etileno glicolfeniléter acry-late (EGPMA) pueden
aumentar drásticamente la actividad y estabilidad de LipA
inmovilizado —rico en residuos aromáticos— a temperaturas
suprabiológicas.
A diferencia de los esfuerzos anteriores por estabilizar
enzimas con cepillos copolímeros de Ran-dom, la presencia del
componente aromático EGPMA podría potencialmente permitir
interacciones de apilamiento y/o catión. Para aislar aún más la
relevancia de las interacciones aromáticas, se estudió el impacto
de la mutación de residuos aromáticos en la bilización de
LipAonitssta-bilización mediante la incorporación de EGPMA.
Además, SM-FRET se empleó para estudiar la dinámica
conformacional de LipAand btain, inmovilizados, percepciones
mecanicistas sobre la dinámica de despliegue y repliegue
complejo dentro de la capa de pincel. Finalmente, la generalidad
de este enfoque se demostró al incorporar una enzima adicional
no relacionada, la carbonicanhidrasa. En conjunto, las
observaciones combinadas de Mac-Roscopi y a escala molecular
subrayan la importancia de interacciones adecuadamente
ajustadas entre las partes aromáticas en el soporte de
inmovilización y los residuos superficiales enzimáticos para
preservir y rescatar el estado plegado y activo de las enzimas
inmovilizadas.
Resultados y debate
Síntesis y caracterización de los pinceles SBMA/EGPMA
Nuestro objetivo era investigar si podíamos aprovechar el rango de
interacciones no covalentes basándonos en las características
estructurales de LipA para aumentar aún más su estabilización en
comparación con enfoques anteriores. Curiosamente, LipA tiene un
número inusualmente alto de residuos aromáticos expuestos a
disolventes, lo que representa el 7% de su superficie. Las manchas
aromáticas encontradas en LipA son menos hidrofóbicas que
parches formadas por residuos alifáticos, que representan en más
hidrofóbicas clipas57. Además, el hidrofilício de alta superficie Lip
también se debe a la presencia de numerosos residuos cargados e
hidrofílicos (lisina, argi-nueve, aspartato, glutamato). Basándonos
en estas observaciones, wehypoEl tamaño de que LipA puede estabilizarse aún más introduciendo
monómeros con grupos aromáticos en los cepillos SBMA, que pueden
interactuar específicamente con residuos aromáticos (apilados de π) y
catiónicos (π-catión). Estos grupos aromáticos también podrían
promover potencialmente otras interacciones con LipA, como
interacciones hidrofóbicas con las partes alifáticas expuestas a
disolventes que rodean el sitio activo de LipA, potencialmente
mejorando su estabilidad general y rendimiento catalítico
mediante estos otros mecanismos58.
Para probar nuestra hipótesis, preparamos soportes de
copolímero aleatorios injertados en superficie compuestos por
SBMA y 0–10% molar de EGPMA aromático (Fig.1a) mediante
polimerización radical por transferencia de átomos desde la
superficie de silicanosferas con un diámetro hidrodinámico de
411 nm. Además de SBMA y EGPMA, los cepillos incluían
gliquidiilmetacrilato molar (GMA), que contiene un grupo
epóxido que puede reaccionar covalentemente con numerosos
sitios en la superficie de las fenenzimas, incluyendo el Nterminal, lisinas, cisteínas, tirosinas e histidinas. Basado en el
análisis de pKa y exposición a disolventes, el sitio más probable
en el labio A que puede reaccionar con GMA incluye la mina Nterminal y sus tidinas, incluyendo el C-terminal 6 su stag (Tabla
1 de Supplemen-tary). La alta probabilidad de reactividad en
numerosos sitios permitió que LipAtobe inmovilizado
covalentemente a pesar de las propiedades de resistencia
proteica de los cepillos ricos en SBMA59. Asumiendo la misma
reactividad de estos monómeros de metacrilato que hemos
caracterizado en trabajos previos54, estimamos que el volumen
molecular de GMA en la capa de brocha era aproximadamente el
2,5% de la capa de cepillo para todos los soportes del pincel, lo
que sugiere que el número de ataduras entre LipA y la capa del
cepillo era relativamente independiente de la composición del
pincel. La incorporación de EGPMA se confirmó mediante la
espectroscopía infrarroja de la transformada de Fourier con
reflectancia difusa, que reveló un aumento sistemático del modo
de estiramiento aromático C-H al aumentar el contenido de
EGPMA (Fig.1b). La caracterización de las partículas modificadas
por polímero mediante dispersión dinámica de luz sugirió que el
polímero solvatado cor-ona tenía un grosor de 73–143 nm
(Fig.1c). Por último, verificamos la humedad de todos los
arbustos que no desarrollan obleas de sílice plana y
encontramos ángulos de contacto estático similares de ~11°
para todas las superficies (Fig.1 suplementaria), consistentes
con su estado altamente hidratado60.
Los soportes mixtos SBMA/EGPMA confieren una actividad
y estabilidad suprabiológicas del Labio A. Por ejemplo, la
actividad del labio inmovilizado como función de
temperatura y contenido de EGPMA en la capa del pincel, el
Labio A fue covalente en el 0–10% de soportes EGPMA, lo
que resultó en cargas de 0,16–0,38 millones de soporte de
la enzima de la cima de la fen-A (Tabla Suplementaria 2). La
estabilidad del labio A libre e inmovilizado se evaluó
midiendo la tasa inicial de hidrolisis que sufre esa velocidad
de alefina butirata como función de temperatura entre 20 y
90 °C. Observamos que la inmovilización del labio A resultó
tanto en la activación como en la estabilización de las
temperaturas tele-vatadas de labio A para todas las
composiciones de brochas poliméricas. Curiosamente, la
actividad del labio A inmovilizado a temperaturas elevadas
dependió fuertemente de la fracción de EGPMA en la capa de
cepillo. Esto puede verse en la Fig.2a, que muestra los
perfiles de actividad dependientes de la temperatura de LipA
libre e inmovilizado. Además, el efecto estabilizador sobre
LipA aumentó con contenido de EGPMA hasta el 5% y luego
disminuyó para los puertos sup: con un 10% de EGPMA.
Específicamente, la inmovilización de LipA en el 5% de
soporte EGPMA resultó en una mejora catalítica dramática
de hasta 50 veces en comparación con la actividad óptima
medida de LipA libre (Vopt), junto con un aumento de la
temperatura de actividad óptima (Topt) de 40°C a 90°C (Fig.2
suplementaria). Además, mientras que el LipA libre mostró
una pérdida de actividad catalítica por encima de 40°C, el
soporte de LipA inmovilizó un 5% de EGPMA mostró una
actividad creciente en todo el rango de temperatura medido.
Cabe destacar que los 10% de los soportes EGPMA fueron
menos estabilizadores que los soportes SBMA puros (sin
EGPMA). Esta tendencia no monótona sugirió un mecanismo
de estabilización matizado asociado a una fracción óptima
de EGPMA. Para facilitar la visualización, el rendimiento
diferencial (es decir, la rotación) de la función de
temperatura de LipA immobi-lizada de la Fig.2a se
representó como un mapa de calor (Fig.2b). Esto puso de
manifiesto el aumento monotono dependiente de la
temperatura de la rotación de LipA cuando se inmoviliza en
soportes EGPMA del 5%, en contraste con la actividad
significativamente menor en los soportes EGPMA del 0%, 1%
y 2%, y la pérdida de actividad por encima del 70°Con10%
soporta. Para ilustrar aún más la relación no monótona
Transmitancia (unidades
de arbitraje)
(a) (b) (d)
3100
1%
2%
5%
10%
3000
Número de onda (cm-1)
c)200
Capa
Grosor
(nm)
polimérica
150
SiO2
100
50
0
1
2
5
10
%EGPMA
Fig.1|Visión general de la inmovilización de los cepillos de copolímero
SBMA/EGPMA mezclados al azar. Esquemático de las superficies del cepillo
con estructuras químicas de los espectros de derivas SBMA, EGPMA y GMA.
Brochas poliméricas de 0− 10% EGPMA cultivan partículas opálicas no
silicanas. Las líneas discontinuas representan picos característicos para los
modos de estiramiento aromáticos C-H. El grosor de la capa polimérica
hidratada se asegura por dispersión dinámica de luz. Composición de la
previsión, el radio del núcleo SiO2
entre la actividad de LipA y la composición del pincel, se muestra
la rotación del contenido de la enzima de la carne 40°Función de
la Casa/EGPMA en la Fig.2c. Cabe destacar que la Fig.
Suplementaria 2 también muestra los datos de los ensayos de
actividad dependiente de la temperatura para el LipA soluble e
inmovilizado en una escala de actividad lineal.
Para comprender mejor los fenómenos subyacentes asociados
con la mejora catalítica del LipA inmovilizado, analizamos los
parámetros cinéticos de la función de temperatura del LipA
inmovilizado. Este análisis reveló que las diferencias catalíticas entre
las composiciones de soporte a altas temperaturas se atribuirían a
diferencias en kcat y no Km (Tabla suplementaria S3). Sin embargo, los
aumentos en kcat no fueron suficientes para explicar todo el
cataliticismo de LipA. Esto sugirió una interacción entre un aumento
de la tinta con la temperatura y otros efectos sinérgicos, como un
aumento de la preservación activa del sitio. El análisis de Km sugirió
que las diferencias en la unión al sustrato, en función del contenido de
EGPMA a temperatura constante, eran insignificantes. Además, aunque
los valores de Km eran más altos en temperaturas elevadas para todos
los cepillos, lo que indica una unión más débil al sustrato, esto puede
atribuirse a la reducción de la absorción del sustrato respecto a la capa
de matorrales, determinada midiendo la partición del sustrato (Fig.S3
suplementaria). Estos hallazgos juntos sugirieron que la aparente
catálisis mejorada puede, de hecho, explicarse por la mala
estabilización del LipA por las superficies del arbusto.
Trabajos anteriores sugirieron que los soportes complejos son
heterogéneos
puede
prolongar
la
vida
operativa
de
las
enzimas
inmovilizadas25,27,29,61. Para estudiar la capacidad de los
soportes que contienen EGPMA para preservar la actividad
0
1
2
5
10
%EGPMA
la partícula se restaba del radio de la partícula injertada por polímero. Las barras de
error representan el error estándar de la media para tres réplicas técnicas (n=3),
teniendo en cuenta la propagación del error relacionada con la resta de la
silicappartícula del núcleo. d Ilustración de los soportes de pincel resultantes tras la
conjugación de LipA con GMA en la capa de pincel.
enzimática, medimos la actividad catalítica dependiente del tiempo
de la LipA immobilizada por incubación a 40°C (Fig.2d). En un día, la
disminución de la actividad relativa fue similar para todas las
composiciones de soporte, aunque el 5% de EGPMA de soporte
promovió una LipA inicial mucho mayor. Sin embargo, la actividad de
LipA inmovilizado se mantuvo durante más tiempo por ciertas
composiciones de soporte, concretamente un EGPMA del 5%. Para
Visualizando la actividad acumulada a lo largo del tiempo,
estimamos el rendimiento de la reacción de la formación del
producto integrando los datos de la Fig.2d, que representa el área
bajo las curvas de retención de actividad. Este análisis reveló que el
soporte EGPMA del 5% proporcionó al menos el doble del
rendimiento específico del producto (Fig.2e), lo que resalta la
relevancia práctica de la afinación de la EGPMA para la
inmovilización que permite la determinación del labio A a altas
temperaturas.
Eliminar las interacciones aromáticas reduce la estabilidad
térmica. En base a los resultados de estabilidad descritos
anteriormente, buscamos aclarar de forma estratégica los
efectos de la interacción aromática en la estabilización de
LipA. Si dichas interacciones contribuyeron a la
estabilización de LipA, el efecto estabilizador de la EGPMA
debería reducirse si se eliminaran los residuos aromáticos
en la enzima. Esta hipótesis se desperdició diseñando tres
variantes LipA diferentes en las que las cantidades relativas
de residuos aromáticos expuestos a la superficie y
enterrados se mutaron a alanina (expuesta) o
metionina/valina (enterrada). Los utantes fueron redefinidos
con LipAΔ SA-50%, con residuos aromáticos superficiales
accesibles mediante disolventes mutados para reducir el área
superficial aromática en un 50%, LipAΔ SA-100%, eliminando
todos los residuos aromáticos superficiales, y LipAΔ
enterrado al 100%, con todos los residuos aromáticos
enterrados eliminados (Tabla Suplementaria4, Fig.4
Suplementaria). Estos mutantes nos permitieron determinar
si la eliminación de residuos aromáticos expuestos a
disolventes accesibles en el estado plegado (LipAΔ SA-50% y
LipAΔ SA-100%) resultaba en una reducción de la
estabilización del apilamiento y las interacciones π-catións
con EGPMA. Además, la eliminación de residuos aromáticos
enterrados accesibles en el estado no plegado
(LipAΔ enterrado-100%) nos permitió comprobar si la
reducción de las interacciones aromáticas con EGPMA en el
estado no plegado—que hipotéticamente podría mejorar el
plegamiento cerebral—también podría conducir a una
disminución general inactividad y/o estabilidad.
Los utants estaban inmovilizados en una partícula que contenía
EGPMA
soportes, con cargas en el rango 0,14–2,28 mgofenzima mepergof
104
103
0
1
2
5
102
%EGPMA
Freeenz
ima
Actividad(s
-1)
a)
10
101
0
0
1
2
5
Rotación
normaliza
da
%EGPMA
b)
10
2030
4050
6070
8090
optimal5%EGPMAsupportforLipAWT(Fig.3).
Además, los
tres
mutantes inmovilizados tenían estabilidad térmica reducida en
relación con el LipAWT inmovilizado, perdiendo actividad por
encima de 70°C, aunque algunos mutantes solubles eran más
activos y/o estables que el LipAWT soluble. Estos hallazgos
sugirieron que los residuos aromáticos en LipAWT desempeñaron
un papel importante en la promoción de interacciones
estabilizadoras con soportes que contienen EGPMA, apoyando la
hipótesis que el apilado π y el catión π están implicados en la
estabilización del LipAWT inmovilizado. Otros mecanismos
potenciales también pueden ser pertinentes, incluyendo la
formación de nichos hidrofóbicos dentro de la capa de brocha que
puedan promover interacciones hidrofóbicas62,63. También es
plausible que cambios en el contenido aromático puedan modificar
la rigidez de la cadena polimérica64, lo que podría alterar el
autoensamblaje de la capa de cepillo alrededor de los estados
plegados y no plegados de la enzima. Además, para determinar si
la mutación en la unión de sustrato impactada por LipA, medimos
el Km para la forma soluble de cada una de las variantes y
demostramos que los valores de Km para LipAWT, Lip AΔ SA-50% y
LipAδ enterrado-100% eran similares, mientras que el Km para
LipAδ sa-100% era mayor que los demás. (Tabla Suplementaria5).
Esto último no fue sorprendente en el año 161A, una de las
mutaciones en LipAΔ SA100% está cerca del sitio activo y podría afectar la unión al sustrato. Aun
con esta diferencia, las diferenciasKmare no son suficientes para
explicar el
c)
T(ºC)
800
diferencias en la actividad que se observaron. Cabe destacar que
los datos dependientes de la temperatura en la Fig. 3 también se
muestran representados en una escala de actividad lineal en la Fig.
suplementaria 5.
Actividad(s
-1)
600
400
Estados conformacionales de la enzima inmovilizada
determinados mediante FRET de una sola molécula
200
La microscopía SM-FRET se utilizó para investigar la base
mecánica que sustenta la influencia de la química del cepillo en
la estabilidad labial inmovilizada. En contraste con los conjuntos
tradicionales y las métricas de promedia temporal de la
estabilidad
proteica,
SM-FRET
proporciona
información
cuantitativa sobre la dinámica del estado conformacional del
mesón inmovilizado
molécula por molécula. El experimento SM-FRET en este trabajo
%EGPMA
0
e) 10x107
8
Molproduct
Molenzima
)
d) 600
Actividad(s
-1)
Freee
nzima
400
200
t(d)
4
Ren
dimi
ento
)
0012345678
6
2
0012510
%EGPMA
Fig. 2| Mejoras dramáticas en LipAperformance en pinceles mixtos
SBMA/EGPMA. una actividad dependiente de la temperatura de LipA
inmovilizado y libre sobre soportes SBMA/EGPMA. Las barras de error
representan el error estándar de la media de tres réplicas técnicas para la
medición (n=3).bMapa de calor correspondiente a los datos de actividad
dependientes de la temperatura del panel a escalado al intervalo entrelamás
baja de la mayor rotación de la enzima inmovilizada.cGiro de LipA a
40°Cobtained desde datos en la caja discontinuada del panel.dPerfil de
retención enzimática de actividad del labio inmovilizado durante la
incubación a 40°C.Las barras de error representan el error estándar de la
media de tres réplicas técnicas medida de foreach(n=3).eRendimiento total
teórico de la formación del producto correspondiente a la integración de
combinó localización altamente multiplexada de molécula única con
FRET, para medir cambios conformacionales de moléculas
enzimáticas individuales con resolución a escala nm65,66.
Para los experimentos de FRET SM, se utilizó una variante de LipA
previamente informada con cisteína expuesta a disolventes y el
aminoácido no canónico azidofenilalanina25. Esto permitió el uso de
química ortogonal para etiquetar LipAsite-específicamente con FRETemparejado AlexaFluor555 y Atto647N (LipA-FRET, Fig.4a), lo cual fue
confirmado por SDS-PAGE (SuplementaryFig.6). Los fluoróforos se
posicionaron de tal manera que quedaban separados del sitio activo y
en proximidad (~2,4nm) en el estado plegado de LipA relativo al radio
de Förster de R0=4,59nm (métodos suplementarios), resultando en
fretos altos.
curvas deFig. 2d. Las barras de error estimadas mediante propagación de
error integrado están incluidas, pero son demasiado pequeñas para ser
observadas.
se midieron el apoyo (Tabla Suplementaria6) y sus actividades
catalíticas. Los mapas de calor de actividad revelaron que los
mutantes LipA con contenido aromático reducido (expuestos y
enterrados) estaban estabilizados en soportes poliméricos con
menor composición aromática que el LipA tipo salvaje (LipAWT), y
que incluso la inmovilización optimizada de estos mutantes era
menos estabilizadora. Específicamente, los tres mutantes se
estabilizaron potencialmente en los soportes con menos EGPMA
(1% o 2%) que el
Donante y aceptor también estaban muy separados en la
secuencia primaria, lo que resultaba en grandes separaciones en
el estado no desplegado. Esta separación se estimó modelando el
estado desplegado de bobina aleatoria de LipAvia, una
simulación de caminata aleatoria auto-evitativa, lo que arrojó una
distancia media entre fluoróforos de aproximadamente 9,8 nm
(Fig.7 suplementaria). Así, se esperaba una gran disminución en
el FRET durante el despliegue de LipA a FRET. Esto se confirmó al
someter a la naturaleza de LipA-FRET a la mitad de la
temperatura, que resultó en una disminución sistemática de la
eficiencia del FRET como función de la concentración
desnaturalizante, sugiriendo la alteración de la estructura
terciaria de LipA (Fig.8 suplementaria).
El FRET A-Lip se inmovilizó en cepillos compuestos por 0%, 5% y
10% EGPMA sobre obleas de sílice de imagen, y los experimentos SMFRET se realizaron a 20°C, 45°C, proporcionando información sobre los
mecanismos de estabilización en condiciones de inestabilidad térmica
y desnaturalización térmica, respectivamente. A cada temperatura, un
gran número de trayectelas (1300–3200; Tabla Suplementaria 7) se
recopiló para poder medir estadísticamente de forma rigurosa tanto
de cantidades promediadas en el tiempo (por ejemplo, fracciones
plegadas promedias) como de parámetros dinámicos (por ejemplo,
desplegamiento aparente y tasas de plegado). Mapas de calor,
histograma
donante-aceptante, regenerados de
todas las
observaciones, de la composición del pincel,
LipAW
T
104
LipAΔSA50%
105
103
LipAΔSA100%
0
1
2
5
103
104
102
102
102
101
103
0
0
0
1
2
5
0
0
0
1
2
5
1
2
5
10
10
2030405060708090
T(ºC)
10
Actividad
normaliz
ada
0
101
101
%EGPMA
Actividad(s1)
Freeenzima
103
%EGPMA
LipAΔenterrado-100%
104
10
30405060708090
T(ºC)
30405060708090
30405060708090
T(ºC)
T(ºC)
Fig.3|Impacto de las mutaciones de la superficie expuso y enterrado residuos
aromáticos en la actividad de LipA en pinceles mixtos SBMA/EGPMA. La
actividad como función de la concentración de EGPMA se expresa como
gráfico y el correspondiente mapa de calor para los diversos mutantes así
como para el tipo salvaje LipA. En cada mapa de calor, la escala de la tabla
de colores, se basó en la menor actividad de la actividad más alta del tipo
salvaje y mutante
se utilizaron para identificar poblaciones de estados plegados y
desplegados
para
realización
experimental
de
labios
inmovilizados (Fig.4b). En estos histogramas 2D, la población
con bajos aceptores e altas intensidades de donante
correspondía al aparente estado no desplegado, mientras que la
población con altas intensidades de aceptante y baja donante
correspondía al aparente estado plegado. Antes de cada
composición de pincel, las laciones de popu se definieron usando
una línea umbral de intensidad mínima integrada mostrada en la
Fig.4b. La fracción plegada promedio en el tiempo (φ F) de cada
composición de brocha se calculó como el número de
observaciones en estado antiguo dividido por el número total de
observaciones.
El análisis sobre la fracción de la antigüedad reveló
inesperadamente que el soporte del 5% EGPMA era la única capaz de
mantener la formación de LipAcon plegado bajo condiciones de
desnaturalización térmica. Específicamente, bajo condiciones no
desnaturalizantes a 20°C, el labio A inmovilizado mostró la fracción
plegada más alta en el soporte EGPMA del 0% (es decir, el
homopolímero SBMA) con φF=0,89±0,04, mientras que φFof LipAon
5% y 10% EGPMA fueron menores (0,72±0,01 y 0,66± 0,04,
respectivamente). Cabe destacar que a 45°C, el soporte EGPMA del 5%
mantuvo el mismo nivel de plegamiento que a 20°C (φF=0,73±0,02),
mientras que los soportes LipA-FRET inmovilizados en el 0% y 10%
EGPMA mostraron una estabilidad reducida (φF=0,56 ± 0,04 y
0,60±0,02, respectivamente).
Estos datos sugirieron que las tres composiciones de soporte
ofrecieron una estabilidad conformacional significativa bajo
condiciones de desnaturalización térmica. Cabe destacar que
45°Ciss por encima del LipA67 soluble del Tm, y nuestras
mediciones de actividad encontraron que el LipA A superior al LipA
libre era ~40°C; por lo tanto, el LipA soluble se desplegó en gran
enzimas. Los rectángulos cruzados corresponden a condiciones donde la
enzima de tipo salvaje y inmovilizada no tenía actividad asegurable. Nota: el
gráfico y el mapa de calor de LipAWT están duplicados de la Fig.2a. Las barras
de error para todos los gráficos representan el error estándar de la media de
tres réplicas técnicas para cada medición (n=3).
medida a 45°C. Así, los valores distintos de cero de φFat45°C para
LipA inmovilizado en las tres posiciones de apoyo pueden atribuirse
a interacciones favorables entre cepillos y enzimas y son
consistentes con la mantenición de actividad por LipAshown
inmovilizado en la Fig.2a. Como LipA está por encima de su Tmat
nativo 45°C, no fue sorprendente que φFwaA se acelere lentamente
en el 0% y 10% EGPMA soportara relativamente a temperaturas
bajas. Sin embargo, el soporte EGPMA del 5% pudo mantener la
misma fracción plegada en ambas ordenaciones bajas de las
perturas, lo que ilustra la naturaleza especial de esta composición
de soporte en la estabilización del labio A. Esto a su vez puede
explicar la alta actividad y estabilidad del labio A inmovilizado en
este soporte, como se ha discutido anteriormente. De hecho, se
observó una correlación cualitativa entre la fracción plegada
determinada por el FRET y la actividad enzimática en una peratura
elevada (Fig. suplementaria 9).
Curiosamente, la inspección visual de los mapas de calor de
FRET reveló
que la población estatal no desplegada de LipA-FRET inmovilizada
en el soporte EGPMA del 5% era más compacta (es decir, menos
difusa) que la
desplegado en el 0% y 10% de los soportes EGPMA. Este sug indicó
que el soporte EGPMA desplegado en el 5% de soporte EGPMA
estaba más conformacionalmente restringido en comparación con
las otras superficies. Esta diferencia también pudo observarse en la
distribución de las intensidades de donantes para el estado no
desplegado en cada superficie, mostrando que el soporte EGPMA
del 5% realmente promueve un estado más tenso y desplegado (Fig.
10 suplementaria).
Escobillas ajustadas composicionalmente reducen el
desplegamiento y aceleran la cinética de plegamientoPara
comprender mejor los mecanismos que promueven un φF
más alto para LipA inmovilizado con un 5% de EGPMA
soporta, en condiciones de desnaturalización térmica, se
extrajo información dinámica de las trayectorias SM-FRET
(Fig.11 suplementaria). Específicamente, determinamos las
probabilidades de tran-sición entre los estados plegados y no
plegados para el FRET LipA-FRET inmovilizado, y las usamos
para calcular la constante efectiva de la tasa cinética, así que
el plegamiento divertido y el plegado (k-fold y kfold) para la
condición experimental (Fig.5a) usando un modelo de cadena
de Markov de tres estados. A 20°C, la aparente disminución
en φF con el aumento del contenido EGPMA correlacionó con
una disminución sistémica en la tasa de replegue. Cabe
destacar que, a 20°C, el kfold fue mayor para el cepillo EGPMA
al 0% (6,54±2,10s− 1) y disminuyó sistemáticamente con el
aumento del contenido de EGPMA al 5% (3,92±2,34s− 1) y al
10% (1,53±0,22s− 1). Simultáneamente, el kunfold fue similar
en cepillos EGPMA del 0% (0,156±0,047s− 1) y 5%
(0,120±0,061s− 1), y más alto en el cepillo EGPMA del 10%
(0,310±0,041s− 1).
Un análisis análogo a 45°C reveló efectos sinérgicos
matizados que promovió un mayor φ F para inmovilizar el labio AFRET al 5% de EGPMA al inhibir tanto el despliegue como
promover el replegue. En primer lugar, el cepillo EGPMA del 5%
promueve un doble de km más alto (2,40±0,55s− 1) que el
0%(2,13±0,29s− 1) y el 10% (1,11±0,17s− 1) los soportes EGPMA.
Simultáneamente, el cepillo EGPMA del 5% inhibió el despliegue
cinético por lo que el LipA-FRET movilizado, como se evidencia
en un pliegue de cones más bajo (0,298±0,063s− 1) en
comparación con los cepillos EGPMA del 0% (0,922±0,127s− 1) y
el 10% (0,430±0,061 s− 1). Es importante destacar que la
interacción entre el replegamiento más rápido "similar a un
acompañante" y el desplegamiento más lento en cepillos EGPMA
al 5% correlacionó con el aparente aumento de φ F, que resultó en
un rendimiento catalítico mejorado. Para una primera
aproximación, el comportamiento de LipA en el soporte EGPMA
del 5% puede explicarse por un estado plegado estabilizado y un
estado desplegado desestabilizado.
Las fluctuaciones en el estado plegado y desplegado fueron
realmente medidas
siguiendo las fluctuaciones cuadráticas medias de raíz (RMSF) en
inter-
a)
Ravg
Donante:
Alexa Fluor555
Aceptor:
Atto647N
Active
site
45ºC
0%EGPMA
20ºC
5%EGPMA
Intensidad de donante
(unidades de arb.)
b)
= 2,4nm
respeto0%EGPMA. La fluctuación en el estado desplegado varió
de forma no monótona con la concentración de EGPMA, con
RMSF reducido para el estado no plegado del pincel EGPMA al 5%.
Esta tendencia recordaba a las observaciones mencionadas
anteriormente de la Fig.3 bandaFig. Suplementaria. 10
consistentes con la presencia de un estado desplegado
localizado. El cepillo EGPMA del 5% aparentemente promueve un
estado único no desplegado que es menos dinámico y más
conformacionalmente restringido; Esto se desarrolló en el estado
se desplegó a una tasa efectiva más rápida en comparación con
otras posiciones de comunicación que promovían estados no
desplegados menos restringidos.
El análisis de las constantes y fluctuaciones de la tasa de
transición revela un papel crucial de la aromaticidad de EGPMA en el
comportamiento del LipA antiguo y desplegado. Específicamente,
planteamos la hipótesis de que pueden ocurrir interacciones entre el
apilamiento de monómeros y residuos y los cationes entre los grupos
EGPMAfenil y las numerosas tirosinas, fenilala-nueve y triptófanos
(apilamiento π) expuestos a disolventes de LipA; o lisinas y argininas
(π-catión), influyendo en la dinámica y estabilización de LipA
catalíticamente. Por ejemplo, el estado plegado de LipA puede
promoverse al reducir eficazmente la energía libre del estado plegado
mediante interacciones aromáticas estabilizadoras, disminuyendo el
Kunfold. Por el contrario, cuando se despliegan, las fenilalaninas o
tirosinas previamente enterradas podrían formar nuevas interacciones
de apilamiento con EGPMA, así como interacciones de π-catión con los
cuaternarioamonios de SBMA. Dado que la escala temporal de las
fluctuaciones de la cadena lateral del polímero es de órdenes de
magnitud más rápidas que el despliegue de la enzima68,69, el cepillo
pudo sondear los residuos recién expuestos y autoensamblarse
alrededor de aromáticos previamente enterrados. Especulamos que
tales interacciones pueden facilitar el replegueo al atrapar eficazmente
la enzima en un estado parcialmente desplegado a lo largo del
proceso de despliegue, resultando en el estado localizado y
dinámicamente restringido observado para un 5% de soportes EGPMA.
Esto, a su vez, puede reducir la probabilidad de que LipA acceda a un
estado no desplegado lento o cinéticamente atrapado. Así, al inhibir el
proceso de despliegue, el soporte EGPMA optimizado del 5% puede
ayudar a reconducir LipA de vuelta a su conformación plegada y
catalíticamente activa, que era coherente con el kfold acelerado en
relación con otras composiciones poliméricas.
10%EGPMA
Estabilización de la hidrhídrica de carbonice sobre
cepillos que contienen EGPMA
Intensidad aceptor (arb.units)
Fig.4 | Esquema de LipA-FRET y FRETheatmaps de LipA-FRET inmovilizados.
Esquema etiquetado como Labio A-FRET, con distancia media entre fluoróforos
(Ravg).
mapas de calor de bFRET correspondientes a cada composición de soporte
polimérico(filas) y a cada temperatura(columnas). Las líneas blancas
discontinuas indican el umbral utilizado para distinguir observaciones plegadas
de no plegadas. Los números anotados representan el valor asociado de
fracción media plegada, φF, para cada condición. Los números entre paréntesis
representan la desviación estándar de la fracción antigua para cinco ensayos
(n=5) de determinación de línea discontinua usando diferentes puntos de inicio
antes de no supervisado
Para determinar si los cepillos que contienen EGPMA pueden
usarse para estabilizar una enzima diferente de LipA en
estructura y función, seleccionamos un mutante termoestable de
la anhidrosa-carbónica humana II (hCAII)70. La hidrasa
carbonicicana tiene un uso potencial en aplicaciones de captura
de carbono, ya que puede secuestrar dióxido de carbono vía
hidratación en ácido carbono71,72. Inmovilizamos la hCAII sobre
un bru que contiene EGPMA con cargas en el rango de 0,81–8,60
mg de soporte de la fenenzima (Tabla suplementaria 8), y
analizamos la enzima actividad
Método de minimización.
para liberar e inmovilizar la ciza me funciona la temperatura (Fig.6 y
Fig.12 suplementaria), utilizando lacetato de 4-metila beliférico
como sustrato fluorogénico. Aunque la enzima libre era más activa
que la inmovilizada a baja temperatura, nuestros resultados
sugirieron que todos los puertos de apoyo aumentaron la
termoestabilidad de hCAII, lo que sugiere un equilibrio entre
actividad y estabilidad de hCAII. Además, la estabilización térmica
aumentó sistemáticamente con contenido de EGPMA, siendo un
soporte de EGPMA del 10% notablemente más estabilizador que
otras composiciones, logrando una actividad óptima 9 veces
superior a la de la enzima libre (Fig. 12 de Supple-mentary). Es
importante que todos apoyen contener EGPMAsurla enzima libre pasada en rendimiento catalítico a temperaturas
elevadas,
mientras que solo el soporte que no contenía el EGPMA falló en salirDistancia del fluoróforo durante los intervalos en que la proteína residía sin estado u realizan inactividad de hCAI libre. Estas observaciones
otro (Fig.5b). El análisis de los valores RMSF de cada estado reveló tendencias demuestran la elevancia de los soportes de EGPMA para
dinámicas matizadas con el contenido de EGPMA, que eran cualitativamente promover la estabilización y el aumento de la actividad de la
similares tanto a 20°C como a 45°C. Específicamente, el RMSF del estado plegado hCAI.
de LipA inmovilizado disminuyó sistemáticamente con el aumento del contenido de
Al examinar las características estructurales de hCAII,
EGPMA, lo que sugiere que el aumento de las interacciones proteína-polímero encontramos que contiene muchos residuos que pueden interactuar
aromático puede restringir el movimiento de las proteínas. Esto era consistente con favorablemente con las partes aromáticas de EGPMA (Fig.
el que se presentó, cuun observador se plegó en el 5% y 10% EGPMA roza con
suplementaria 13). Por ejemplo, hCAII contiene 23 resina expuesta a
disolventes y 7 residuos de arginina, todos los cuales pueden
participar en interacciones π-catión. Además, en contraste con LipA,
que tiene
10
20ºC
1
a)10
5
Enzima
libre
0
1
K(S1)
0.1
Actividad(s
-1)
104
2
5
103
10
45ºC
%EGPMA
a)
10
102
1
Actividad
normaliz
ada
b)
%EGPMA
0
304050
6070
8090
T(ºC)
Fig.6|Estabilización de hCAII en cepillos mixtos SBMA/EGPMA. Actividad
dependiente de la temperatura de hCAI inmovilizado y congelado en soportes
SBMA/EGPMA. Las barras de error representan el error estándar del mismo de
tres réplicas técnicas que preceden la medición (n=3). b Mapa de calor
correspondiente a los datos de actividad dependientes de la temperatura del
panel a escalado hasta el intervalo entre la baja posición de mayor rotación de
enzima inmovilizada.
0.1
b)
2.0
1.5
20ºC
RMSF(nm)
1.0
0.5
0
2.0
1.5
1.0
0
5
10
45ºC
%EGPMA
0.5
0
Fig.5|Análisis dinámico de LipA-FRET inmovilizado en cepillos SBMA/EGPMA.
Constantes efectivas de la tasa de transición para el plegamiento y el
despliegue para cada condición estudiada. Las barras de error representan el
más expuesto a disolventes que los aromáticos enterrados, hCAII
contenía 11 residuos aromáticos expuestos a disolventes y 16
enterrados que podrían estar implicados en el apilamiento con
las partes EGPMA. Basándonos en los hallazgos de la actividad de
hCAII y sus características estructurales, podemos concluir que la
inmovilización de hCAII en eGPMA apoya una gran mejora en la
estabilidad y actividad térmica de hCAII, probablemente debido a
múltiples interacciones de apilamiento de cationes y células de Π
entre hCAII y la capa de cepillos. En general, estos resultados
generalizan nuestras observaciones que sugieren que la EGPMA
es una enzima notablemente estabilizadora para enzimas ricas
en residuos aromáticos y catiónicos.
Los soportes de brocha polimérica que comprenden
copolímeros aleatorios zwitteriónico/aromáticos (SBMA/EGPMA)
mejoraron significativamente el rendimiento catalítico y la
estabilidad térmica de LipA inmovilizada, una enzima con alto
contenido aromático. Específicamente, un soporte EGPMA
ajustado de forma óptima del 5% promovió un aumento de 50°C
en la superficie y un aumento de 50 veces en Vopt comparado
con la enzima libre. Los mutantes labiales con contenido
aromático reducido, expuestos o enterrados se estabilizaron
hasta mayor medida, lo que sugiere que la estabilización puede
implicar interacciones de apilamiento y/o cationes que involucran
a los grupos aromáticos en el cepillo. El análisis SM-FRET mostró
que los cepillos EGPMA del 5% preservaron de forma más eficaz
el estado plegado del labio inmovilizado frente a la naturaleza
termial en comparación con otros soportes SBMA/EGPMA. La
estabilización del estado plegado fue consistente con la
reducción de la cinética de desplegamiento para los escobillos
LipA del 5% EGPMA inmovilizados. Mejoró la cinética del
plegamiento transitorio
error estándar de las constantes de tasa, derivado de la raíz cuadrada de la
cota inferior de Cramèr–Rao tal como la describe Kienleetal.80.b.
Fluctuaciones de los estados plegados y no plegados medidas por las
fluctuaciones cuadráticas medias de la raíz (RMSF) de las trayectorias
individuales en intervalos en los que la proteína permanece en el plegado o
en los estados no plegados, respectivamente. Se estimaron barras de error
como el error estándar de las medias en las fuertes niteraciones(n=10) del
muestreo de remuestreo de las mediciones RMSF de la condición
correspondiente.
unfoldedenzymeaswellasSM-FRETfluctuaciónanalysissugerido
que inmovilizó los pinchos LipA al 5% EGPMA exhibieron un estado
no plegado altamente tenso que se replegó fácilmente en
comparación con una bobina aleatoria típica, lo que puede explicar
la cinética mejorada del plegado. Estos hallazgos ilustran el
potencial de materiales complejos para aportar propiedades
suprabiológicas a las enzimas, al tiempo que abren oportunidades
para explorar nuevos polímeros heterogéneos. Trabajos futuros
explorarán una estabilización enzimática más profunda en
soportes cada vez más complejos, incluyendo mezclas
multicomponentes que también contienen donantes/aceptores
cargados, hidrofóbicos, que enlazan H, o dipolos fuertes. En última
instancia, estos nuevos materiales ofrecerán oportunidades sin
precedentes para permitir el uso de
enzimas en ambientes hostiles y, por tanto, catalizan
biotransformaciones
sintéticas
extremadamente
difíciles
e
interesantes. Al promover la bilización de las fenenzimas en entornos
así, nuestros hallazgos pueden tener un impacto significativo en la
optimización de bioprocesos y la ingeniería de reacción de
biosistemas.
Métodos
Materiales
Bromuro de cobre(II), ascórbicido, N, N, N′ , N′ , N′ , N′ ′
pentametildietamina-lenetriamina
(PMDETA),
metacrilato
glicididino
(GMA),
glicofenofenometacrilato
(EGPMA),
tetraetilortosilicato, hidróxido de munición (30% en agua), tolueno,
bicina y tris (2-carbox-yetil) fosfina (TCEP) fueron comprados a
MilliporeSigma (St. Louis, MO). [2-metacriloiloxi)etil]dimetil-(3sulfopropilo)-hidróxido de amonio(SBMA) fue comprado a
TCIChemicals (Portland, OR). Metanol (MeOH) fue adquirido a
FisherScientific. La dimetilformamida (DMF) fue comprada a
MacronFineChemicals (Center Valley, PA). El (p-clorometil)fenil
triclorosilano (CMPS) fue comprado a Gelest (Morrisville, PA).
Todos los productos químicos se usaron sin necesidad de
purificación adicional.
Wafers de silica fundidos de dos pulgadas para una sola
molécula de imagen comprados de MarkOptics (SantaAna, CA).
Se adquirieron wafers de silicona de dos pulgadas con
recubrimiento de óxido nativo para elipsometría a WaferPro
(Lafayette, CO).
InvitrogenAlexaFluor555Click-iTstrained
dibenzylciclooctyne
(AF555-sDIBO) fue comprado a ThermoFisher (Waltham, WA). ATTOTECAta 647N-maleimida fue comprada a MilliporeSigma (St. Louis,
MO).
Preparación, funcionalización y caracterización
superficialesLas nanoesferas de oxido de silicio se
sintetizaron siguiendo el método de Stöber26,75 mL de
tetraetil ortosilicato se disolvieron 1,536 Lofa1:1 mezcla de
metanol/etanol. Posteriormente, se añadieron 389 mL de
hidróxido de amonio (30% en agua) durante 5 minutos de
agitación vigorosa y se mantuvieron a temperatura ambiente
durante 4 horas desde la última gota. Las partículas se
separaron mediante centrifugación a 12.000×g durante 5
minutos y se lavaron con agua(x2), etanol y meta, antes de
almacenarlas en un desecador hasta su uso posterior.
Posteriormente, las nanosferas se funcionaron con CMPS
mediante deposición líquida en un hidroustolueno, usando
CMPS en 0,1% v/v durante 45 minutos. Tras completar la
deposición, se introdujeron obleas con toluene(x2),
isopropanol(x2) y agua, y almacenaron un desecador de vacío
hasta su uso posterior.
Las polimerizaciones iniciadas en superficie de cepillos mixtos
SBMA/EGPMA fueron sintetizadas por los activadores, regenerados por
el método de polimerización radical de transferencia de electrones
(ARGETATRP)25,73–75. En resumen, se añadieron 2,5 partículas
funcionalizadas por CMPS a 20 mL de una mezcla 7:3(v/v)MeOH/DMF
con proporciones SBMA/EGPMA inapropiadas, 5% glicidiilmetacrilato
(42,1μ L), 11,2 mg de ácido ascórbico L y un pequeño alambre de
cobre. Se fabricó por separado una solución de stock con ligadura de
cobre y ATR, que contenía 0,0426 gos de bromuro de cobre(II), 398 μ
L de PMDETA, 210 mL de metanolandia 90 mL de DMF. Todas las
soluciones se reingeneraron en frascos de Schlenk mediante ciclos
repetidos de congelación-bomba-descongelación (4 veces). La solución
que contenía monómeros tenía mezclas de SBMA y EGPMA en
proporciones 100:0, 99:1, 98:2, 95:5 y 90:10. La solución que
contenía cobre y ligando (10 mL) se transfirió al matraz que contenía
la mezcla de anoesfera y monómero bajo un volumen final
nitrogentado de 30 mL, que se permitió actuar durante 3 hamos de
presión positiva de nitrógeno de 5 psi. La concentración final de cobre
fue de 15 ppm, y la proporción molar de todos los otros compuestos
químicos se resumen en la Tabla Suplementaria 9. Las nanoesferas
recubiertas con cepillo polimérico fueron clasificadas para la SEPA
mediante centrifugación, lavadas secuencialmente con metanol, DMF,
agua y metanol, y almacenaron un desecador hasta su uso posterior.
Las partículas resultantes fueron caracterizadas mediante FTIR usando
un instrumento ThermoFisher Scientific Nicolet6700FT-IR con un
portamuestrasDERIVAS. Mediciones de dispersión dinámica de luz
(AntonPaarLitesizer500)
se realizaron tras la resuspensión en un tampón de 50 msodio
fosfato filtrado a 0,1 μ m, a pH 7,5, y sonicación por sonda para
dispersión de partículas.
Para la microscopía de molécula única, las obleas de óxido
de silicio se limpiaron en solución de piraña (peróxido de
hidrógeno 30%V/v + 70% ácido sulfúrico) durante 1 hora, se
enjuagaron con agua ultrapura, se secaron con nitrógeno y se
expusieron a UV-ozono durante 1 hora. Tras la deposición de
CMPS, se realizaron polimerizaciones de forma similar a la
descrita para las partículas, pero en una cámara con una
atmósfera de N2 inerte. La mojabilidad de las superficies se
midió mediante ángulo de contacto y goniometría mediante el
método de la gota sesil, con un goniómetro personalizado.
LipAmutantsdesignandexpression
Se diseñaron mutantes con diferentes grados de eliminación de
residuos aromáticos (LipAΔ SA-50%, LipAΔ SA-100% y LipAΔ
enterrado-100%) utilizando Rosetta (Tabla Suplementaria4). Los
residuos aromáticos accesibles en superficie fueron reemplazados
por mutaciones laninícolas (Fig. 14 suplementaria), y se utilizó la
puntuación de energía de Rosetta para verificar que la
introducción de cada mutación no introdujo una alteración mayor
del estado plegado. Para la sustitución de residuos aromáticos
enterrados, se permitió a Rosetta seleccionar la mutación más
favorable energéticamente. El Y130 enterrado no mutó desde que
su eliminación resultó en una disminución drástica de la
puntuación energética de Rosetta, lo que sugiere que era un
residuo críticamente estabilizador, y que la sustitución sin
aromático podría compensar su eliminación. Tras el diseño de
mutantes guiados por Rosetta, se permitió realmente relajarse a
las estructuras usando el protocolo de relajación de Rosetta. Una
vez seleccionadas las mutaciones, los genes de estos mutantes se
introdujeron en vectores de expresión superiores ET21-b(+)
mediante la optimización de vía codones de Genscript. Los genes
de todos los mutantes se muestran en la Tabla Suplementaria 10.
Expresión enzimática, purificación y marcado
El constructo FRET de BacillussubtilisLipasa A se expresó
recombinantemente con una versión modificada de un protocolo
de autoinducción previamente descrito51. El plásmido SPET21b(+)codificandoLipA con un hexahistidinetagónico terminal-C-y
pDule2pCNFRS codificando en ARN sintetase para incorporación
del aminoácido antinatural p-azidofenialanina (pAzF) en un
codón
oclusivo
ámbar
fueron
co-transformados
en
E.ColiBL21(DE3). LipA contenía dos mutaciones en las
posiciones4 y 175 para la incorporación de PAzFandcisteína,
específicamente, para etiquetar LipA específicamente en el sitio
con fluoróforos emparejados por FRET mediante reacciones por
clic. Las colonias se seleccionaron a partir de una placa LBagar
que contenía 100μ g/mLofampicillina y 50μ g/mL de la
espectrinomicina. Tras un crecimiento nocturno hasta
saturación en un medio estándar no inductor, las células fueron
reducidas a trifugas, se eliminó el sobrenadante, las células se
suspendieron en agua ultrapura ilizada y se transfirieron a 2L
frascos de cultivo que contenían medio de crecimiento mínimo
de autoinducción con antibióticos76. Además, se añadió Larabinosa con filtro estéril a una concentración final de
Se llevó a cabo una incubación de 3,33 mM. para 27 hits a 37°C, con
rotación a 250 rpm y matrazs protegidos de luz y papel de aluminio.
Tras la expresión, se extrayeron células mediante centrifugación a
5000×gat4°C durante 30 minutos y, posteriormente, se congelaron
rápidamente o purificación.
La purificación mediante cromatografía de afinidad se realizó
con una columna Ni-NTA (Bio-RadLaboratories). Brevemente, las
células estuvieron suspendidas en el tampón A, que contenía 50
mMsodio fosfato, pH7.500 mMnaCl, 10 mMimidazol y 6M guanidina
hidrocloruro, y vísonicación lisada. El satélite celular y las muestras
posteriores que contenían LipAw fueron protegidos de la luz en todos
los casos. Tras la centrifugación para mover los restos celulares, el
satélite celular fue cargado en la columna Ni-NTA y eluído con el buffer
B, que consiste en el buffer A y 300 mM de imidazol. Todas las líneas,
columnas y fracciones recuperadas y el sistema FPLC se protegieron
con papel de aluminio para evitar la degradación inducida por la luz
del grupo arilazida. Las fracciones que contenían LipA se identificaron
usando un nano-dropspectrofotómetro en lugar de usar la lámpara de
280nm del sistema de cromatografía. Posteriormente, LipA fue
intercambiado por buffer.
en 50 mMmfosfato sódico a pH 7 con 6M guanidina hidrocloruro
en cartucho de desal, Bio-ScaleMiniBio-Gel, 50 mLP-6 (Bio-Rad, EE.
UU.). La pureza final y la concentración se evaluaron mediante
SDS-PAGE y espectrofotometría, utilizando un coeficiente de
extinción de 22.900 M− 1 cm− 1.
El etiquetado se realizó con una versión modificada de los
métodos previamente descritos25,77. 400μ Lof35μ MLipAwere
incubado con
0,1μ L 2-mercaptoetanolida 0,3 mMDIBO-AF555 y dejado rotar hasta
12 hat temperatura ambiente. Tras el marcaje AF555, LipA-AF555
fue dessalado 4 veces en fosfato de sodio 50 mM a pH 7 con un
buffer de hidroclorhidrato de 6 Mguanida usando columnas de spin
Zeba de 7 kDa (ThermoFisher) para mover la presencia de 2mercapcapano a etanol, lo que podría interferir con el siguiente
paso.
Tras el intercambio de buffer, TCEP y Atto 647N-maleimida
—en ese orden— se añadieron a concentraciones finales de 1,4
mMan 0,3 mM, respectivamente. Tras una rotación de 6 horas a
temperatura ambiente, el labio A-FRET se desaló 5 veces con 7 k.
Almacenamiento de la columna de espino de zar movió el exceso
de fluoróforo libre. La eliminación del fluoróforo libre se evaluó
mediante nanogota UV-estabilización de 553/280 y 648/280
relaciones de señal. Posteriormente, se evaluó la eficiencia de
etiquetado de LipA-FRET midiendo las absorciones en 280, 553 y
648 nm, utilizando coeficientes de extinción de
1,55×105M− 1cm− 11,5× 105M− 1cm− 1 para AF555 y Atto647N,
respectivamente, aplicando factores de corrección para regiones
solapadas (Fig. suplementaria 15). Las eficiencias de etiquetado se
estimaron en un 48,1% para AF555 y un 67,2% para ATTO647N.
La expresión de LipA y mutantes de tipo salvaje se realizó en E.
ColiBL21(DE3). Los vectores pET21-b(+) que codifican cada gen fueron
transformados y se seleccionaron colonias individuales usando un
antibiótico de 100 μ g/mLofampicillino. La expresión de cada gen se
indujo 1 mM de isopropil β -D-1-tiogalactopiranósido y se permitió
expresarse a 26°C durante 24 horas con rotación a 200 rpm. La
extracción y purificación se realizaron idénticas a las de LipA-FRET.
Thermostable CAII fue amablemente proporcionado por Ryan
Mehl (Universidad Estatal de Oregón) codificado en un vector
pET28b+ y expresado en Escherichia coliBL21(DE3) como se
describió anteriormente70,78.
Ensayos de inmovilización enzimática y de actividad
Para permitir la inmovilización, las enzimas purificadas (tipo
LipAwild, mutante o CAII) fueron intercambiadas en tampón de
movilización de animación con la presencia de 10 mbicina, pH 8,7,
100 mM NaCl. Se incubó una solución de enzima de chena (1,8 mL)
con las nanoesferas recubiertas con cepillo polimérico (200 mg)
utilizando un agitador orbital giratorio. Todas las enzimas fueron
reincubadas para obtener 12 hóbitos 4°C. Tras la inmovilización, la
carga enzimática de las partículas se determinó usando un balance
de masa basado en la actividad relativa de una enzima de Chen que
permanecía en la superacción natural de la herela. La actividad
relativa se calculaba normalizando la actividad de la enzima en la
supernadante de la actividad de la enzima en ausencia de partículas.
Para asegurarnos de que todas las enzimas inmovilizadas estuvieran
unidas a los artículos por unión covalente, eliminamos cualquier
enzima no covalente o enzima de la cepilla polimérica mediante un
lavado extensivo de las partículas con un tampón fresco que
consistía en 50 mm fosfato sódico a pH 7 hasta que la actividad
enzimática del sobrenadante fue egregulable.
Se realizaron experimentos de retención relativa de actividad
utilizando
baño de calentamiento seco para incubar partículas que
contienen ofenzymas a 40°C durante 7 días, y un lector de placas
Tecan InfinitePro200 para mediciones de fluorescencia, usando
longitudes de onda de excitación y emisión de 530 y 593,
respectivamente. Antes de cada momento de este experimento, la
actividad enzimática se adquirió resuspendiendo enzima y pipeta,
sacando una cantidad constante en un pozo que contenía un
tampón fresco (50mM bufan de fosfato de sodio pH7) con resoor
de finbutirato (concentración final de 50μ M). En todos los casos,
se restó el consumo de sustrato no específico de la tasa
observada.
Todos los perfiles de actividad dependientes de la temperatura
fueron medidosHoribaScientificFluoroMax-4spectrofluorometerwithan
incorporó el controlador de temperatura Peltier. La concentración
de la reacción de Chassaysay, libre e inmovilizada, que se mezcló
continuamente, se normalizó en base a la carga enzimática en las
microesferas. Las reacciones se realizaron en fosfato sódico de 50
mM, usando 50 μ de Mresorufinbutirate como sustrato
fluorogénico, y la velocidad de liberación del producto fluorescente
se rastreó en pasos de 0,1 s durante 30 s tras la adición de
sustrato. Se utilizó una calibración de unidades de fluorescencia
frente a concentración de refinas de resoror libre para convertir la
pendiente en unidades de concentración de producto (Fig. 16
suplementaria), utilizando longitudes de onda de excitación y
emisión de 570 y 593 nm, respectivamente, utilizando anchos de
corte de 1 nm tanto para excitación como para emisión. Además,
se midió la hidrólisis del sustrato de fondo, se restó de las
mediciones de actividad a cada temperatura y se verificó que la
señal fluorescente era estable a lo largo de los 20–90°C y el gesto
murió (Fig. 17 suplementaria). Para medir perfiles de actividad
dependientes de la temperatura, el tampón se precalentó a la
temperatura objetivo en un baño de agua externo. También
estimamos la posible partición de resorufinbutirato en soportes
(Fig.3 suplementaria) incubando soportes sin enzima GMA o con
50μ M de resorufin durante 20 minutos a temperatura ambiente
para permitir la sorrfinfina y la sorción en todos los soportes y la
diferencia segura—una función del contenido de EGPMA. Tras la
incubación, dividimos cada muestra en dos partes iguales. Una
parte se lavó tres veces con 50 mMsodio fosfato de bófete de acero
pH7 y a 20°C. La otra parte se lavó tres veces con el mismo
bufferato de 70°C. Tras estos pasos, medimos la cantidad principal
de resoro en partículas que se habían utilizado para ambas
temperaturas, mediante la medición por fluorescencia de partículas
suspendidas en un tampón continuamente agitado en el
espectrofluorómetro.
Para los ensayos de la CAII, usamos lacetato de 4metilumbelélico a concentración final de 100μ substrato de mas.
De forma similar al resorufin butirato, utilizamos una curva de
calibración
de
fluorescencia
para
el
producto
4metilumbeliferona (Fig. suplementaria 18), y medimos hidrólisis
dependiente de la temperatura y fluorescencia dependiente de
la temperatura del sustrato y producto, respectivamente
(Supplemen- tary Fig. 19).
Imagen de molécula única
Antes de la imagen, todos los buffers se fotoblanquearon
durante la noche usando un láser UV cercano de 100 mW. El
filtro de imagen funcionalizado por polímero se transfirió a una
celda de flujo construida a medida con una ventana para la
imagen, que inicialmente se llenó con un amortiguador de
inmovilización. Por separado, el LipA-FRET, que inicialmente se
almacenó en un buffer de fosfato de sodio de 50 mM con 6
Mguanida clorhidrato, se diluyó en un tampón de inmovilización
(10 mM bicina, pH8,7, 100 mMN Cl) hasta una concentración
final de 5×10− 12 M. Además, se añadió a la misma solución en
un exceso de 1000 con respecto al LipA-FRET, y todos se
introdujeron en la celda de flujo. Después de la incubación para
permitir que ocurra la immobilización, la célula de flujo se lavó
con 30 mL de tampón (10 mM fosfato de sodio, pH 7) y se dejó
equilibrarse durante 30 minutos. Las muestras fueron imágenes
de un prisma personalizado Reflexión Interna Total Fluorescente
(TIRF) aparato usando un microscopio NikonEclipseTE-2000
microscopio con un objetivo de inmersión en agua de 60 ×. Las
moléculas del donador AF555 fueron excitadas por láser de 532
nmláseres (Cobolt, Samba) y un láser de 50 mW 640 nmláser
(Crystalaser). El láser se dirigió hacia la parte trasera del soporte
de sílice fundido a través de un prismofo de silicahemicilíndrico
fusionado de 12,7 mm de radio (EgorovScientific) usando aceite
de silicar fusionado con índice de fracción. La emisión tanto de
fluoróforos AF555 como de Atto647Nacceptor de LipA-FRET se
separó en canales de imagen espectralmente distintos usando un
espejo dicroico(T610LPXR, Chroma) de 610 nmm. La señal
donante se limpió aún más con un filtro pasa-banda de 585/29
nm (Semrock), y la señal receptora se limpió con un filtro pasabanda de 685/40 nm (Semrock). Los canales de imagen donantes
y aceptores se alinearon usando un divisor de haz Optosplit III
(Cairn Research) y capturaron a una cámara EMCCD de Andori
Xon 3888 se mantuvo a − 95°C. Se obtuvo la adquisición de
imágenes alternando
Excitación con 200 ms de tiempo de adquisición. Se recopilaron
trece películas para la condición (composición de temperatura
y/o pincel) en diferentes regiones de la superficie. Tras el
postprocesamiento usando software personalizado MATLAB
como se describió en trabajos anteriores, se incluyeron
29,79,1350–3150 trayectorias en el análisis para todas las
condiciones (Tabla Suplementaria7). Se excluyeron de análisis
posteriores
las trayectorias
con señales
fluorescentes
anormalmente altas o sobrelapadas (agregados LipA-FRET) o
objetos no dualmente marcados. Todas las trayectorias de 4 o
más fotogramas fueron analizadas durante 1 minuto hasta que el
donante, aceptó o aceptó fluoróforos fotoblanqueados. Se
generaron mapas de calor FRET utilizando todos los puntos de
datos de cada trayectoria, los parámetros de transición cinética
se estimaron en una cadena oculta de Markov con tres estados
como se describió anteriormente25,80. El análisis de
fluctuaciones se realizó estimando la distancia interfluorófora, la
distancia basada en la donación y la intensidad aceptante. Cada
cálculo de la raíz cuadrada de la media de la fluctuación (RMSF)
se realizó para todos los puntos de datos que correspondían al
estado de plegamiento (plegado o no fol). Si una molécula
proteica realizaba múltiples transiciones entre estados plegados
y no plegados, todos los intervalos habitables en cada estado se
consideraban eventos de fluctuación separados para el cálculo de
RMSF.
Resumen del reportaje
Más información sobre el diseño de la investigación está
disponible
en
el
Reportaje
de
Portafolio
de
NatureResumenenlazenlazesteartículo.
Disponibilidad de datos
TheekPerimentssportDistributor-AlliphoneText.SorcidatewithBabber.
Disponibilidad de código
El código utilizado para analizar los datos que apoyan la
conclusión de su estudio está disponible a petición. El código de
parche Hi-usado para el análisis aromático expuesto a la
superficie
se
puede
encontrar
en
Github:
https://github.com/KaarLab/hi-patch.
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Agradecimientos
Este trabajo fue apoyado por el NSF award 2103647 a J.K.L y D.K.S., así
como por una beca de investigación para posgrado del NIH Grant
RainingT 32GM-065103 a H.S-M. Los autores agradecen a Ryan Mehl
por proporcionar el plásmido para hCAII.
Contribuciones de autor
H.S.-M., J.L.K. y D.K. S diseñaron el trabajo. H.S.-M. preparó a todo el
SAM, por favor, llevó a cabo todos los experimentos y realizó análisis
de datos. Todos los autores contribuyeron a la interpretación de
datos y a la preparación de artículos. J.L.K. y D.K.S. obtuvieron la
financiación para este estudio.
Intereses en competencia
Los autores declaran el(los) siguiente(s) interés(s) financiero(s) en
competencia: Aunque aquí no hay conflicto directo de intereses,
H.S-M, J.L. KandD.K.S. son inventores en una solicitud de patente
para el uso de superficies de escobilla de polímero mixtos para
estabilizar enzimas inmovilizadas.
Información adicional
Información suplementariaLa versión en línea contiene
supplementarymaterialavailableathttps://doi.org/10.1038
/s41467-024-46719-5.
La correspondencia y solicitudes de materiales deben dirigirse a Joel. L.
Kaaror Daniel K. Schwartz.
Información de revisión por paresNatureCommunications agradece a
la(s) revisora(s) no residente por su contribución a la revisión por pares
de este trabajo. Un archivo de revisión por pares está disponible.
La información sobre reimpresiones y permisos está disponible
athttp://www.nature.com/reprints
Nota del editorSpringer Nature se mantiene neutral respecto a las
reivindicaciones jurídicas en mapas publicados y afiliaciones institucionales.
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