Guía de Prácticas y Seminarios de Fundamentos de Toxicología UCM

GUÍA DE PRÁCTICAS Y
SEMINARIOS DE
FUNDAMENTOS DE
TOXICOLOGÍA
EDITADO POR:
Profa. Eva Ramos Alonso
Profa. Paula Moyano-Cires Ivanoff
AUTORES:
Profa. Eva Ramos Alonso
Prof. Javier del Pino Sans
Prof. Alejandro Romero Martínez
Profa. María Jesús Díaz Plaza
Profa. María Teresa Frejo Moya
Profa. Paula Moyano-Cires Ivanoff
ISBN: 978-84-09-32028-8
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ÍNDICE:
1. NORMAS DE SEGURIDAD Y BUENAS
PRÁCTICAS EN EL LABORATORIO ...................... - 4 2.
LABORATORIO DE TOXICOLOGÍA ................ - 8 -
2.1.
Determinación de Amoniaco en Muestras de Agua por el Método de
Nessler. ................................................................................................................... - 9 2.2.
Determinación De Arsénico por el método de Gutzeit. .................... - 13 -
2.3.
Determinación De Sal En Alimentos Y En Agua De Bebida ............ - 17 -
2.4.
Identificación de venenos volátiles (Cianuros)................................... - 21 -
2.5.
Determinación Cualitativa De Plomo En Muestras De Agua .......... - 26 -
2.6.
Determinación de Nitratos y Nitritos .................................................. - 29 -
3.
SEMINARIOS DE TOXICOLOGÍA ................. - 37 -
3.1.
Evaluación del riesgo medioambiental ................................................ - 38 -
3.2.
Ensayos de toxicidad. Modelos y cálculos de índices de toxicidad. - 53 -
3.3.
Fuentes de Información en Toxicología. Bases de Datos. ................. - 70 -
3.4.
Toma de muestras. Normas para la recogida, preparación y remisión
de muestras para la investigación químico-toxicológica. ............................. - 74 -
Dedicado a la profesora María Jesús Díaz, por sus enseñanzas y los buenos
momentos que pasamos juntos en el laboratorio.
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1. NORMAS DE SEGURIDAD Y
BUENAS PRÁCTICAS EN EL
LABORATORIO
Esta guía se ha diseñado para orientar a los alumnos en las Prácticas de
Laboratorio, ofreciendo información básica de manejo y protocolos para llevar
a cabo las técnicas de una manera segura, rápida y eficaz.
Se debe tener en cuenta que trabajar en un laboratorio conlleva riesgos con
consecuencias muy diversas en función de la práctica que se esté realizando.
Por lo que se han considerado principalmente los riesgos derivados de las
practicas contenidas en este manual.
Los principios de las Buenas Prácticas de Laboratorio (BPL) son utilizados para
realizar ensayos destinados a obtener los datos sobre las propiedades y
peligrosidad para las personas, los animales y el medio ambiente de cualquier
sustancia química.
En esta primera parte se explican las características del trabajo de laboratorio,
con el fin de evitar riesgos derivados del uso y manejo de los reactivos. Por lo
tanto, lo principal es que el alumno debe mantener una atención especial
durante el proceso de modo que permanentemente aplique las precauciones
específicas para cada práctica.
Normas básicas:
1. Es obligatorio el uso de la bata, manteniéndola en todo momento
abrochada. Es recomendable el uso de gafas de seguridad cuando se
manipulen productos químicos.
2. No se puede ingerir alimentos o fumar en el laboratorio.
3. Recogerse el pelo y evitar pulseras o colgantes que puedan engancharse.
4. Avisar de posibles alergias.
5. Lavarse las manos al finalizar las prácticas antes de abandonar el
laboratorio, incluso si se ha usado guantes.
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6. El alumno debe respetar el material y es el responsable de su
mantenimiento hasta el final de las prácticas. De modo que al final debe
quedar todo perfectamente limpio y recogido tal y como lo encontró.
Normas de trabajo:
1. No pipetear NUNCA con la boca.
2. No trabajar separado de la mesa o poyata.
3. Eliminar adecuadamente los residuos producidos en los bidones
habilitados al efecto, no eliminando nunca restos por el desagüe, aunque
sean pequeñas cantidades.
4. El uso de aparatos será supervisado siempre por el/los profesor/es
encargados de la práctica.
Recordatorio de los pictogramas de etiquetado de
productos químicos:
Es importante conocerlos para prevenir lesiones y enfermedades en el
laboratorio.
La regulación establecida por la Unión Europea en 2009 sobre clasificación,
etiquetado y envasado (CLP) introduce pictogramas con forma de rombo que
indican la naturaleza del peligro o peligros asociados a la utilización de
sustancias o mezclas peligrosas.
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En las etiquetas, los pictogramas van acompañados de palabras de advertencia
(atención, peligro), indicaciones de peligro (frases H) y consejos de prudencia
(frases P), así como de información sobre el producto y el proveedor.
I.
Los productos químicos con este pictograma significan:
• Gas bajo presión, puede explotar cuando se calienta.
• Gas refrigerado, puede originar quemaduras o lesiones
criogénicas.
• Gases disueltos.
II. Este pictograma se refiere a sustancias explosivas,
autorreactivas y peróxidos orgánicos que pueden causar una
explosión cuando se calientan.
III.
Hay que tener en cuenta lo que significan estos dos pictogramas de
aspecto similar:
1.- Este advierte acerca de gases, aerosoles, líquidos y sólidos
inflamables como:
• Sustancias y mezclas de calentamiento espontáneo.
• Líquidos y sólidos pirofóricos que pueden incendiarse en
contacto con el aire.
• Sustancias y mezclas que emiten gases inflamables en contacto
con el agua.
• Sustancias autorreactivas o peróxidos orgánicos que pueden
provocar un incendio si se calientan.
2.- Si encuentras este pictograma en la etiqueta significa que estás en
presencia de gases, sólidos o líquidos oxidativos que pueden causar
o intensificar un incendio o explosión.
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IV.
Una sustancia o mezcla que lleve este pictograma puede tener uno o
varios de los siguientes efectos:
•
•
•
•
Es cancerígena.
Afecta a la fertilidad y al neonato.
Causa mutaciones.
Es un sensibilizante respiratorio, puede provocar alergias,
asma o dificultad respiratoria si es inhalado.
• Resulta tóxica en determinados órganos.
• Peligro por aspiración, que puede ser mortal o muy nocivo si se
ingiere o penetra a través de alguna vía.
V.
Producto químico extremadamente tóxico en contacto con la
piel, si se inhala o ingiere, y que puede resultar mortal.
VI.
Siempre que utilices un producto químico con este
pictograma no olvides que es corrosivo y que puede
provocar quemaduras graves en la piel y daño ocular.
También es corrosivo para los metales.
VII.
Este pictograma puede referirse a uno o más de los siguientes
peligros:
Toxicidad aguda.
Causa una sensibilización cutánea, irritación de piel y ojos.
Irritante para la respiración.
Es narcótico, provoca somnolencia o mareos.
Peligroso para la capa de ozono.
•
•
•
•
•
VIII.
Este pictograma advierte de que la sustancia es tóxica o
nociva para los organismos acuáticos.
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2. LABORATORIO DE TOXICOLOGÍA
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2.1. Determinación de Amoniaco en
Muestras de Agua por el Método de Nessler.
FUNDAMENTO
El reactivo Nessler, en presencia de iones amoniaco, se descompone
formando yoduro de dimercuriamonio que permite la determinación
colorimétrica de los iones amonios. El reactivo de Nessler produce una
coloración gradual de amarillo a pardo, a medida que aumenta la concentración
de amoníaco.
REACTIVOS
1) Preparación del reactivo de Nessler:
- Solución A: disolver 160 g de NaOH en 500 ml de H20.
- Solución B: Disolver 70 g de IK en 100 ml de agua y añadir 100 g de I2Hg y
llevar hasta 500 ml.
El reactivo Nessler se obtiene mezclando a partes iguales la solución A+B.
2) Solución de Tartrato de Sodio y Potasio:
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Disolver 50 g de Tartrato doble de Sodio y Potasio tetrahidratado en 100 ml de
agua, esta solución impide la precipitación de Ca y Mg con el reactivo de
Nessler.
3) Solución Patrón de Cloruro de Amonio:
Pesar 3,819 g de Cloruro de amonio en 1 L de agua destilada; contiene 1290 ppm
de NH4+ (1300 ppm).
PROCEDIMIENTO
Preparación de la Recta de Calibrado.
A partir de una solución patrón de Amonio de 130 ppm, vamos a preparar
las siguientes soluciones; 50, 13, 4 y 1 ppm y las vamos a llevar a un volumen
de 5 ml con agua destilada. A continuación, se añaden 0,1 ml de tartrato sódicopotásico y 0,1 ml de reactivo de Nessler en cada tubo de ensayo.
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Preparamos 3 muestras en tubos de ensayo;
o Muestra 1: Recoger 1 ml de agua de grifo.
o Muestra 2: 1 ml de agua de pecera.
o Muestra 3: 1 ml de agua destilada.
Vamos a tratar las muestras con 0,1 ml de tartrato sódico-potásico y 0,1 ml
de reactivo de Nessler y a determinar los niveles de amonio.
Determinación cualitativa: Si se produce una coloración amarilla indica que
el contenido en amoníaco es < 5 ppm, el color pardo rojizo indica un contenido
en amoniaco >10 ppm.
Determinación cuantitativa:
Se toman 100 ml de muestra, se alcaliniza la muestra con NaOH 6N y se
elimina la turbidez con SO4Zn 10%.
Tratamos las muestras con tartrato sódico-potásico y reactivo de Nessler.
Esperamos 10 minutos y se observa el color amarillo.
Se lee la absorbancia a una longitud de onda de 425 nm.
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PROBLEMAS Y CUESTIONES
1. A partir de una solución patrón de Amonio de 130 ppm, realizar las
siguientes diluciones: 50, 13, 4 y 1 ppm, llevar a un volumen final de 5 ml
con agua destilada.
2. ¿Las muestras medidas cualitativamente tienen una concentración < 5
ppm o >10 ppm?
3. ¿Que cantidad de amoniaco en mg/l contiene cada una de las tres
muestras que hemos medido?
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2.2.
Determinación De Arsénico por el
método de Gutzeit.
FUNDAMENTO
La identificación la llevamos a cabo a través del Método de Gutzeit. La
reacción de Gutzeit evidencia la presencia de Arsénico en la muestra que
vayamos a analizar, está basada en que el hidrógeno arseniado, desprendido en
la reducción de la muestra con hidrógeno naciente, al reaccionar con un papel
reactivo de nitrato de plata, lo reduce a plata metálica formando un halo negro.
SO4Cu
H2SO4 + Zn
H2Û + SH2Û
4H2 + AsO4H3 à 4H2O + H3As (Arsenamína)
AsH3 + 6NO3Ag + 3H2O à 6Ag + AsO3H3 + 6NO3H
MATERIAL Y REACTIVOS
o Matraz de Gutzeit
o H2SO4
o Sulfato de cobre al 10%
o Zinc metal en forma de perlas
o Nitrato de plata 1N
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PROCEDIMIENTO
o Se introducen 5 g de la muestra problema en el matraz.
o Añadimos 1 ml de agua destilada para homogeneizar la muestra.
o Posteriormente introducimos dos perlas de zinc que actúa como
reductor.
o Y finalmente dos gotitas de sulfato de cobre que actúa como
catalizador acelerando la reacción.
o En el extremo superior del matraz se coloca un papel de filtro al que
se le adiciona una gota de nitrato de plata.
o A continuación, se adiciona H2SO4 al matraz hasta llegar a una
concentración aproximada del 10 %.
o Dejar el matraz Gutzeit durante 10 minutos en oscuridad.
o Si en la muestra hay arsénico aparecerá en el papel de filtro una
mancha de color negro brillante es que hay presencia de arsénico
debido a que el nitrato de plata se reduce a plata metálica.
o En el caso contrario, se mantendrá el papel intacto.
NEGATIVO
POSITIVO
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PROBLEMAS Y CUESTIONES
1. Sabiendo que la IDA de los compuestos arsenicales inorgánicos es de
0,0002 mg/kg de peso corporal, y que el contenido de As en las algas H.
Fusiformis (hijiki) se encuentra en un rango de 115-145 mg/kg. En el
supuesto de que una persona de unos 70 kg ingiera 3 gramos de este tipo
de algas en un restaurante. ¿Cuál sería el porcentaje de la IDA que está
ingiriendo? En el caso de que se presente sobredosificación, detallar los
síntomas clínicos que presentaría.
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2. Un hombre de unos 70 kg de peso consume 185 g/día de pescado y
marisco (niveles de As inorgánico se encuentran en niveles de 4,390 µg/g
peso fresco) y 226 g/día de verduras y hortalizas (niveles de As
inorgánico se encuentran en niveles de 0,0006 µg/g peso fresco). Sabiendo
que la IDA es de 0,002 mg/kg/día (2 µg/kg/día) y la BMDL01 entre 0,38 µg/kg/día, calcular si la cantidad ingerida de As supera la IDA y la
BMDL01.
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2.3.
Determinación De Sal En Alimentos Y
En Agua De Bebida
El objetivo de esta práctica es determinar la concentración de sal en muestras
de diferentes alimentos (pan, galletas, sopas) y en una muestra de agua del grifo
mediante volumetría de precipitación, siguiendo el Método de Mohr.
FUNDAMENTO
Los cloruros precipitan con AgNO3 formando un precipitado blanco de AgCl,
según la siguiente reacción:
NaCl + AgNO3→ NaNO3 + AgCl↓
El punto final de la valoración se observa añadiendo una pequeña cantidad de
K2CrO4 (color amarillo) que formará un precipitado de Ag2CrO4 (pardonaranja), una vez terminada la reacción entre el cloruro y la plata, según la
reacción:
2Ag+ + CrO4 = → Ag2CrO4↓
REACTIVOS
- Nitrato de Plata (AgNO3): 0,1 M. PM = 169,87 gr/mol
- Dicromato potásico (K2CrO4) al 10 %
- Disolución de NaCl patrón: Pesar 1,0 gr/1 L (1000 ppm)
Estandarización de la disolución de AgNO3
Poner en un matraz, 10 ml de la disolución de NaCl (0,1 gr/l) añadir 40 ml de
agua destilada y 0,5 ml de la disolución de K2CrO4. Añadir el AgNO3 con una
bureta hasta viraje del indicador de amarillo (turbio) a pardo-anaranjado
(turbio).
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2.3.1. Determinación de Sal en una Muestra
de Alimento y en Muestras de Agua del Grifo.
(Método de Mohr)
PROCEDIMIENTO
1. Pesar 1 g de las muestras solidas y disolver en 10 ml de agua destilada, agitar
durante 5 minutos.
2. Tomar 100 ml de agua del grifo y seguir el mismo procedimiento.
3. Las muestras sólidas se filtrarán con papel de filtro a otro matraz.
4. Añadir a este matraz, que contiene el sobrenadante, 4-5 gotas del indicador
(K2CrO4).
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5. Valorar esta solución añadiendo despacio con una bureta, gotas de AgNO3,
hasta el viraje del indicador amarillo (turbio) a pardo-anaranjado.
6. Apuntar en el cuaderno los ml de AgNO3, gastados para las muestras sólidas
(pan, galletas etc.) y agua.
CÁLCULOS
N= nº de equivalentes/Volumen
nº de equivalentes = g/PM
PM NaCl = 58,4 g/mol
Después de realizar los cálculos para la muestra solida y el agua, valora los
resultados y comenta tus conclusiones.
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PROBLEMAS Y CUESTIONES
1. ¿Cómo prepararías la solución de Nitrato de plata 0,1 N y PM= 169,87
gr/mol?
2. Si una persona consume 100 g de pan y el contenido en sal de ese pan es
de 17g/kg de harina. ¿Cuánto consume de sal y cuánto consume de
sodio? ¿Los niveles son superiores o inferiores al recomendado por la
OMS (5 g/persona/día)? En caso de superar los niveles recomendados
por la OMS, ¿cuáles serían los posibles efectos tóxicos?
3. Sabiendo que el nivel de sal en la mayoría de los panes es de 16 g de
NaCl/Kg de harina (1,6 % o 16000 ppm), y en el agua de bebida son de
0,5 %. Calcular en porcentaje (%) y en ppm (µg/ml o mg/L) los niveles de
sal encontrados en las muestras analizadas.
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2.4.
Identificación de venenos volátiles
(Cianuros)
Niveles en plantas de 200 ppm son tóxicos .
Agua de bebida máximo permitido 2 ppm.
2.4.1. Determinación de cianuros: Método de
Grignard
FUNDAMENTO
Esta reacción está basada en la formación de isopurpurina por fijación del ácido
cianhídrico sobre el ácido pícrico en presencia de un álcali. Esta reacción es
característica del cianuro. Las muestras deben conservarse en frío para evitar la
acción enzimática y bacteriana sin agregado de conservantes ya que es una
reacción muy sensible.
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MATERIAL Y REACTIVOS
Papel picrosodado.- En un matraz se ponen 0,5 g de ácido pícrico y 5 g de
bicarbonato sódico, los cuales se diluyen hasta 100 ml de agua.
En esta solución sumergimos tiras de papel de filtro dejándolo después durante
10 minutos en oscuridad.
Procedemos a secarlas en una estufa a 37 ºC y las colocaremos en el matraz con
la muestra tratada.
PROCEDIMIENTO
1. Se toman dos matraces. En un matraz ponemos la muestra problema
(homogeneizado de plantas cianogéneticas, yuca, almendra amarga,
laurel, mandioca etc.), y en otra muestra control.
2. Añadimos 50 ml de agua unas gotas de cloroformo y unas gotas de ácido
sulfúrico.
3. Se suspende la tira de papel picrosodado en el matraz sin que toque el
líquido y tapamos el matraz.
Si hay cianuros en la muestra observaremos una coloración rojo anaranjada en
la tira de papel picrosodado; si no existen cianuros, no se observa ningún
cambio de color en la tira. La intensidad del color variará en función de los
niveles de cianuros de la muestra. Comparar con el control.
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2.4.2. Determinación de cianuros: Método de
azul de prusia
FUNDAMENTO
Su determinación se puede hacer en alimentos, fluidos biológicos y tejidos. Se
basa en la formación de ferrocianuros que después es tratado con una sal férrica,
es una reacción muy específica para el cianuro.
REACTIVOS
- Soluciones de CNK (10 mg/ml)
- Sulfato ferroso 2%
- Cloruro Férrico al 30%
- HCl 0,1 N
PROCEDIMIENTO
Recta de calibrado:
A partir de la solución stock de 10 mg/ml hacer las siguientes diluciones: 8, 3,
1 y 0,1 mg/ml y llevar a un volumen de 5 ml con agua destilada.
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Añadir a todos los tubos 1 ml de sulfato ferroso, agitar y dejar reposar 4
minutos.
Añadir unas gotas HCl, 2-5 gotas de Cl3Fe, mezclar.
Aparece un color azul de Prusia. Determinar el límite de detección del método.
Preparación de muestras de alimentos:
1. Colocar 10 gr de muestra (mandioca..) en un matraz de destilación
2. Añadir 50 ml agua.
3. Añadir 10 ml de ácido tartárico al 10% y destilar.
4. Recoger el destilado sobre 5 ml de NaOH 10%, medir el volumen
destilado.
5. Coger 1ml de la muestra y añadir 1 ml de Sulfato ferroso.
6. Añadir unas gotas de HCl y unas gotas de CL3Fe.
7. Comparar el color con la recta de calibrado.
8. Para la determinación cuantitativa leer a l= 680 nm
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PROBLEMAS Y CUESTIONES
1. Sabiendo que la Dosis de Referencia Aguda (DRA) para los glucósidos
cianogénicos es de 0,009 mg/kg pc (expresada como equivalente de CN-)
y que la Ingesta diaria máxima tolerable provisional (IDMTP) es de 0,02
mg/kg pc, expresada como CN-, y teniendo en cuenta que los máximos
niveles de HCN permitidos en la yuca dulce son de 50 mg/kg, y en la
harina de yuca de 10 mg/kg.
Calcular:
• La cantidad de CN- ingerida por una persona de 60 Kg de peso que come
100 g de yuca dulce y 50 g de harina de yuca.
• Si los niveles ingeridos de CN- superan los de la DRA y IDMTP, describe
los síntomas clínicos de la intoxicación.
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2.5.
Determinación Cualitativa De Plomo
En Muestras De Agua
Primero se tiene que destruir la materia orgánica, cuando trabajamos con
muestras sólidas, con una mezcla sulfonítrica, el plomo se deposita como
residuo insoluble de sulfato de plomo. Ese residuo se disuelve en un ácido y
formamos una solución de una sal de plomo para hacer las determinaciones.
FUNDAMENTO
1)
Reacción del yoduro de plomo. Las sales de plomo reaccionan con IK y
producen un precipitado amarillo de I2Pb, poco soluble en agua fría y soluble
en agua caliente.
2)
Reacción del cromato de plomo. Las sales de plomo reaccionan con
CrO3K2 y producen un precipitado amarillo de cromato de plomo, soluble en
NaOH.
3)
Con Ditizona: A las sales de Pb, se añaden CNK y gotas de ditizonas
(0,05% en Cl4C). La ditizona, de color verde, reacciona con el catión Pb2+
formando un quelato rojo en soluciones neutras o alcalinas. Para evitar la
interferencia de otros cationes como Ag+, Cu2+, Hg2+, Cd2+ y Zn2+ se adiciona
previamente cianuro de potasio, resultando entonces una reacción específica y
sensible para el plomo.
(CH3-COO)2Pb + 2IK à I2Pb¤
CH3-COO)2Pb + CrO3K2 à CrO3Pb¤
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REACTIVOS
- Solución de yoduro potásico (IK), 2 gr/50 ml de agua
- Solución de acetato de plomo 5 mg/ml
- Solución de dicromato potásico 0,5 gr/10 ml de agua
PROCEDIMIENTO
Realizamos una Recta patrón de 3, 2, 0,5 y 0,1 mg/ml tanto de Yoduro de
potásico, como de dicromato potásico. Preparamos las muestras problema de
agua del grifo con 1ml de cada reactivo.
Yoduro de potásico
Dicromato potásico
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PROBLEMAS Y CUESTIONES
1. A partir de la solución stock de acetato de plomo 5 mg/ml, realizar las
siguientes diluciones: 3; 2; 0,5 y 0,1 mg/ml, llevar a un volumen final de
5 ml con agua destilada.
2. Calcular el límite de detección de los dos métodos, y decir cuál es más
sensible.
3. Sabiendo con los niveles máximos permitidos de plomo en agua de
bebida son de (10-25 µg/L), coger una muestra problema de agua y ver si
hay niveles tóxicos comparándolos con los colores de la recta de calibrado.
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2.6.
Determinación de Nitratos y Nitritos
2.6.1. ANÁLISIS CUALITATIVO DE
NITRATOS EN HOJAS DE ESPINACAS
REACTIVOS
• Difenilamina:
- Pesar 0,25 g/ 10 ml de agua y añadir 40 ml de H2SO4 cc
• Acido sulfúrico al 80%.
- Coger y poner en un frasco 20 ml de agua y añadir 80 ml de H2SO4 cc.
• Mezclar a partes iguales 50 ml de Difenilamina + 50 ml de H2SO4 cc. (80%)
FUNDAMENTO
La comprobación del material sospechoso se realiza dejando caer una gota de
reactivo sobre la hoja del vegetal (lechuga, espinacas etc). Un cambio de color
de verde a azul es una reacción positiva que indica un contenido de nitrato
superior al 2%.
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2.6.2. DETERMINACION DE NITRATOS.
REACTIVOS
• Sulfato de hierro (II) 1,4 g /10 ml de agua destilada
• Ácido sulfúrico del 96 %.
• Nitrato de sodio para el ensayo
PROCEDIMIENTO
1. Colocar 1 ml de agua problema en un tubo de ensayo y añadir con mucho
cuidado 1 ml de ácido sulfúrico cc, enfriar el tubo.
2. Una vez se haya enfriado, resbalando por las paredes, se añade 1 ml de
sulfato de hierro (II) recién preparado, hay que procurar que no se mezclen
las disoluciones, si hay nitratos, en la zona de unión de los dos líquidos
aparece un anillo pardo oscuro o pardo rojizo, a veces tarda un poco en
formarse. Esta reacción la dan también los nitritos, por lo tanto, únicamente
será una prueba segura de que hay nitratos, si no hay nitritos.
3. Si hay nitritos puede efectuarse la prueba de la Brucina pero hay que tener
cuidado pues es una sustancia muy tóxica.
4. Añadir 3 cm3 de ácido sulfúrico poco a poco a 1 ml de agua, colocada en un
tubo de ensayo, enfriar en el chorro del grifo
5. Añadir unos cristalitos de Brucina, en presencia de nitratos aparece una
coloración roja que vira a amarillo.
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ANÁLISIS CUANTITATIVO DE
NITRITOS EN ALIMENTOS Y AGUA
DE BEBIDA
Según el Código Alimentario Español, los productos cárnicos pueden tener un
contenido en nitrito sódico no superior a 150 ppm. El empleo de nitrito/ nitrato
en la elaboración de derivados cárnicos es esencial para conseguir su color
típico y para garantizar la ausencia de Clostridium botulinum.
FUNDAMENTO
La medida de nitritos se realiza mediante su transformación en un compuesto
AZO de color rosa. Tras la extracción de los nitritos presentes en la muestra con
agua alcalina caliente, la transformación ocurrirá en dos pasos:
1) En medio ácido se produce la reacción entre una amina primaria, la
sulfanilamida, con los nitritos presentes en de la muestra. El resultado final de
esta reacción es la formación de una sal de diazonio.
2) A la sal de diazonio resultante se le acopla una amina aromática, N-(1, naftil)etilendiamina, para dar lugar al compuesto AZO de color rosa.
3) Por último se lee la absorbancia en un espectrofotómetro UV/Visible a una
longitud de onda de 540 nm y se cuantifica la respuesta. Para ello se elabora
una recta patrón partiendo de una solución que contiene 0,25 por mil de nitrito
sódico.
- 31 -
REACTIVOS
• Agua alcalina caliente: alcalinizar 1 L de agua destilada a pH = 8-9, con
NaOH 0,1 N (1% de NaOH es suficiente). Calentar hasta ebullición antes
de su empleo.
• Reactivos Carrez: Ferrocianuro al 15 % y Acetato de zinc al 30 %
• Sulfanilamida al 1 %: disolver 1 gr de sulfanilamida en 100 ml de una
solución de HCl 1,5 N. Guardar en frasco topacio.
• N-(1-Naftil) etilendiamina al 0,1%: 0,1gr /100 ml de H2O.
• Ácido Clorhídrico 1,5 N: PM = 36,47; Riqueza= 35 % y D= 1,18 Kg/L
CONSTRUCCIÓN DE LA RECTA
PATRÓN DE NITRITO SÓDICO
Solución patrón de nitrito sódico: 0,25 mg/ml.
A partir de esta solución preparar las siguientes concentraciones y llevar a un
volumen de 10 mL con agua destilada: 10, 5, 2,5 y 1,25 µg/mL.
Si estas soluciones son muy concentradas hacer una posterior dilución (1:9) para
llegar a las siguientes concentraciones: 1; 0,5; 0,25 y 0,125 µg/mL. Una vez
hechas las diluciones añadir a cada tubo:
-
1 mL de la solución de sulfanilamida, agitar los tubos.
1 mL de N-(1 naftil)-etilendiamina agitar. Dejar los tubos en reposo 5 min
hasta la aparición de un color rosado, Leer a 540 nm en un expectrofotómetro
(UV/Visible) frente a un blanco.
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PREPARACIÓN DE LAS MUESTRAS
SÓLIDAS
Partimos de 2 g de muestra problema y la disolvemos en 25 mL de agua, pH =
8-9 caliente en un matraz.
-
Calentamos el matraz a ebullición, y dejamos enfriar.
En el matraz echamos 1 ml de ferrocianuro potásico al 15% y 1 ml de
acetato de Zn al 30% (se utilizan como agentes clarificantes).
-
Filtramos el contenido del matraz con papel de filtro.
Del filtrado cogemos 1 ml y añadimos 1 ml de sulfanilamida y 1 ml de N(1-naftiletilendiamina), agitamos y leemos a l = 540 nm.
DETERMINACIÓN DE NITRITOS EN
EL AGUA DE GRIFO
Se coge 1 o 2 ml del agua de grifo y se le añade 1 ml de sulfanilamida y 1 ml de
N-(1-naftil-etilendiamina) y leemos a l = 540 nm.
CÁLCULOS:
NaNO2 (ppm) = (C x V)/M
C = concentración de nitrito sódico en la recta de calibrado.
M = gr de muestra tomada.
V = ml del sobrenadante.
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PROBLEMAS Y CUESTIONES
1) Explicar cómo se hacen las diferentes diluciones a partir de la solución
estándar de nitrito sódico de (0,25 mg/ml) para obtener 10, 5, 2,5 y 1,25 µg/ml,
llevar a un volumen final de 10 ml con agua destilada. Construir la recta de
calibrado. Calcular los niveles de Nitritos en las muestras analizadas. Indicar si
los niveles de nitritos encontrados en el agua de bebida y en el embutido están
dentro de los niveles permitidos.
2) Si el contenido máximo de Nitratos en las hojas de lechuga es de 4000 ppm.
y el IDA para los Nitratos es de IDA= 3,65 mg/Kg. ¿Cuánta cantidad de lechuga
se podría comer al día, una persona que pese 70 Kilos y consumiera otros
alimentos que constituyan una fuente de Nitratos?
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3) En el agua de bebida encontramos niveles de 1 ppm de Nitritos y su IDA =
0,07 mg/ml. Calcular el MOS sabiendo que una persona de 70 Kg consumo
todos los días 2 L de agua. Valores de MOS inferiores a 100 han sido
interpretados por las Agencias Reguladoras como una situación de alerta.
4) Sabiendo que un niño de 7 a 12 años con un peso medio de 35 Kg y sabiendo
que la IDA para los Nitratos es de 3,65 mg/kg/día, y que ingiere 2,61 gr de
acelgas/persona día.
(Contenido medio de Nitratos 1390 mg/ Kg).
- Calcular los mg de NO3/persona/día que ingiere un niño entre 7-12 años
- Calcular el % de la IDA que ingiere
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5) Sabiendo que el contenido medio de Nitratos en potitos de vegetales es de 50
mg/Kg, y los potitos son de 250 gr y el peso de un niño de 4 meses es de 6,5 Kg
y la IDA = 3,65 mg/Kg.
Calcular:
- Cantidad de nitratos en un potito de 250 g
- % de la IDA para un potito de 250 g
- 36 -
3. SEMINARIOS DE TOXICOLOGÍA
- 37 -
3.1.
Evaluación del riesgo medioambiental
INTRODUCCIÓN
Medioambiente: lo conforman todos los elementos naturales y artificiales que
están interrelacionados forma natural manteniendo un equilibrio ecológico. La
actividad general del hombre puede desencadenar la ruptura paulatina de tal
equilibrio lo que conduce a un deterioro del medio ambiente, y por tanto a una
degradación en las condiciones de vida de los seres vivos.
Ecotoxicología: es la científica que estudia el efecto de las sustancias y
compuestos químicos tóxicos sobre los ecosistemas.
Contaminación: Alterar nocivamente la pureza o las condiciones normales de
una cosa o un medio por agentes químicos o físicos. Un contaminante puede ser
no solo una sustancia que no está de forma natural en el medio, sino también
sustancias naturales que no se encuentran en las proporciones normales,
produciendo efectos de toxicidad.
Los contaminantes se pueden clasificar de 3 formas:
Ø Contaminantes según su fuente de procedencia.
1. Agricultura y ganadería
2. Generadores de electricidad
3. Transporte
4. Minería
5. Metalurgia
6. Industria química y electrónica
7. Tratamiento de residuos
Ø Contaminantes según el medio receptor.
1. Contaminantes atmosféricos
2. Contaminantes urbanos
3. Contaminantes en interiores
4. Contaminantes del agua
5. Contaminantes marinos
6. Contaminantes del suelo
Ø Contaminantes según los impactos ambientales que ocasionan.
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1. Contaminantes de efecto invernadero
2. Contaminantes de acidificación
3. Contaminantes que producen destrucción del ozono
estratosférico
4. Contaminantes que originan eutrofización
5. Contaminantes que producen toxicidad
6. Contaminantes que inducen la formación de smog
7. Contaminantes que producen ecotoxicidad
DISPERSIÓN DE LOS CONTAMINANTES ATMOSFÉRICOS
Una vez emitidos los contaminantes pueden ser transformados o degradados a
otros compuestos menos tóxicos por la acción de las reacciones químicas y
bioquímicas que tienen lugar en el medioambiente, pero estas reacciones
pueden llegar a saturarse, superándose las capacidades de dichas reacciones
para transformar los contaminantes acumulándose por encima de las
concentraciones seguras y dando lugar a los fenómenos de toxicidad. Para
evitarlo es importante que se produzca la dispersión de los contaminantes por
medio de los distintos factores meteorológicos (Figura 1).
Figura 1. Esquema de dispersión de contaminantes por factores meteorológicos.
- 39 -
Inversión térmica
A nivel atmosférico el principal factor que influye en la dispersión de los
contaminantes es el viento que presenta dos movimientos, uno es el horizontal
y otro en vertical que depende del gradiente térmico (es decir cuando se
asciende un metro en altura, la temperatura disminuye un grado). Al ascender
en altura y disminuir la temperatura el aire se condensa, pesa más y baja al
suelo. El suelo es calentado por la acción solar y por convección calienta el aire
próximo al mismo, lo cual produce una expansión del mismo y al disminuir su
densidad pesa menos y asciende, produciéndose una recirculación de aire
mediada por la acción solar. Los contaminantes son emitidos en la parte baja de
la atmosfera próximos al suelo y a continuación por la recirculación del aire
estos contaminantes ascienden a capas superiores y son dispersados por la
acción de los vientos en horizontal.
Dicha recirculación del aire se rompe al producirse el fenómeno de inversión
térmica. Dicho fenómeno consiste en la colocación de una masa de aire de
menor temperatura próxima al suelo que la capa de aire superior que presenta
mayor temperatura (Figura 2). La presencia de una capa de inversión impide
que se produzca la recirculación del aire dado que el aire más frio no va a
ascender y los contaminantes atrapados en esta capa quedaran atrapados y se
concentraran. La inversión térmica depende de la hora del día y de la estación
del año dado que es producida por la nula o poca radicación solar. También
influye la localización geográfica dado que las zonas de valles con menor
irradiación solar son más propensas a este fenómeno.
Figura 2. Esquema de inversión térmica.
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CONTAMNINATES ATMOSFÉRICOS
- Inorgánicos:
Ø Co, So, No, halógenos, metales e iones metálicos u otros.
- Orgánicos:
Ø hidrocarburos, oxidantes fotoquímicos
- Partículas
EXPRESIÓN DE LAS CONCENTRACIONES DE LOS CONTAMINANTES
• Porcentaje en volumen (nº volúmenes del componente especifico en 100
volúmenes de aire)
• ppm (mL/m3): 1ppm corresponde a un volumen de contaminante por un
millón de volúmenes de aire.
• Los mg/m3 proporcionan la masa de contaminante contenida en 1 m3 de
aire.
CONTAMINANTES DERIVADOS DEL CARBONO
El carbono presenta un ciclo natural en la atmosfera (Figura 3). Existen dos
gases en la atmosfera procedentes de diferentes fuentes naturales que son el
monóxido de carbono (CO) y el dióxido de carbono (CO2). Además, por la
actividad del antropogénica existe adicional de óxidos de carbono al ciclo del
carbono aunque dicho aporte es muy inferior al aportado por las fuentes
naturales, pero presenta efectos dañinos sobre los el medioambiente por alterar
las proporciones normales en la atmosfera. El CO presenta diversas fuentes
naturales, siendo la primera fuente la degradación del metano atmosférico y la
segunda los océanos. Las fuentes antropogénicas de deben fundamentalmente
a la combustión incompleta de compuestos carbonados o a la disociación del
CO2 entre otras causas.
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Figura 3. Ciclo del Carbono.
El CO es un gas toxico para los animales y el hombre, no produciendo efectos
perjudiciales a las plantas o sobre los materiales. El CO es un gas que tiene una
afinidad por la hemoglobina 200 veces superior al O2, lo cual conduce al
desplazamiento del mismo y que se forme un compuesto que es la
carboxihemoglobina, reduciendo el transporte de oxígeno a los tejidos.
Dependiendo del porcentaje de carboxihemoglobina se producen diferentes
alteraciones fisiológicas hasta llegar a la muerte.
Con respecto al CO2, s e ha relacionado con la generación del conocido como
efecto invernadero (Figura 4). Existen diferentes gases de efecto invernadero
entre los que se encuentra el CO2, pero el que se está incrementado su
concentración en la atmosfera de manera constante desde la revolución
industrial es el CO2. Los gases de efecto invernadero absorben parte de la
radiación solar llegando a la superficie terrestre fundamentalmente la que se
encuentra en la gama del visible. Cuando se enfría la superficie por la noche
esta emite radiación infrarroja que es absorbida por gases de efecto invernadero
como el CO2 incrementado la temperatura de la tierra. El efecto invernadero es
necesario porque si no la temperatura media de la tierra sería bastante inferior,
pero un exceso está produciendo unas alteraciones en los climas, las cosechas,
deshielo en los polos, desplazamiento de vectores de enfermedades y aparición
de las mismas en otras localizaciones etc.
- 42 -
Figura 4. Esquema del efecto invernadero.
Por este motivo, para dar una respuesta global a este y diferentes problemas de
contaminación ambiental surgieron las Cumbre de la Tierra, siendo la primera
en Estocolmo (1972), y de forma particular se formó la Convención Marco sobre
Cambio Climático en 1994 y se desarrollaron sucesivas convenciones para
intentar evitar dichos problemas, llegando a acuerdos como los obtenidos en el
protocolo de Kioto y otros posteriores para reducir las emisiones de CO2 a nivel
mundial y así poder evitar los efectos dañinos sobre el medio ambiente.
CONTAMINANTES DERIVADOS DEL NITROGENO
El nitrógeno presenta su ciclo natural en el medio ambiente (Figura 5), siendo
las fuentes naturales de nitrógeno las que más contribuyen al ciclo, sin embargo
las fuentes antropogénica suponen un gran peligro por los componentes tóxicos
que se generan y por la concentración de contaminantes emitidos en espacios
reducidos como suelen ser las ciudades. A nivel atmosférico existen
fundamentalmente 3 óxidos de nitrógeno, que son el óxido nitroso (N2O), el
óxido nítrico (NO), y el dióxido de nitrógeno (NO2). La principal fuente
antropogénica de óxidos de nitrógeno son los procesos de combustión,
produciéndose siempre en menor cantidad el NO2 que el resto de óxidos de
nitrógeno (menos del 10%).
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Figura 5. Esquema ciclo del nitrógeno.
Los óxidos de nitrógeno también presentan un ciclo natural en la atmosfera
mediado por la acción de los rayos solares (Figura 6). Desde el punto de vista
toxicológico solo tienen importancia el NO y el NO2, siendo este último 4 veces
más toxico que el óxido nítrico. Además, hay que tener en cuenta en la
peligrosidad de esto dos óxidos que su aporte antropogénico es importante y
que participan en las reacciones fotoquímicas en la atmosfera. En este sentido,
la presencia de otros contaminantes en la atmosfera como agentes oxidantes,
hidrocarburos, metales…u otros, puede desencadenar que el ciclo atmosférico
del nitrógeno se desequilibre incrementándose la formación de NO2, o inducir
la formación de otros compuestos oxidantes tóxicos por la reacción de NO2 con
los hidrocarburos dando lugar a los nitratos de peroxiacilo (NPN).
Los efectos tóxicos descritos para el NO y el NO2 tanto en animales como en el
hombre se producen fundamentalmente sobre el aparato respiratorio,
pudiendo ocasionar la muerte en la mayoría de las especies por encima de 100
ppm. También se ha descrito que presentan efectos tóxicos sobre las plantas
dañando las hojas y reduciendo la fotosíntesis.
- 44 -
Además, se ha descrito que el NO y el NO2 originan daños sobre los materiales
como en las fibras textiles, los tintes o en el cableado formado por aleaciones de
cuproníquel.
Figura 6. Esquema del ciclo fotolítico de los óxidos de nitrógeno.
CONTAMINANTES DERIVADOS DEL AZUFRE
El azufre también presenta un ciclo natural en el medioambiente (Figura 7). A
nivel atmosférico existen fundamentalmente dos óxidos de azufre, que son el
dióxido de azufre (SO2) y el trióxido de azufre (SO3). La principal fuente de
óxidos de azufre es natural a través de la descomposición de la materia
orgánica dando sulfuro de hidrogeno (H2S) que es oxidado hasta S02. Los
aportes antropogénicos se generan principalmente a través de la combustión de
compuestos azufrados. Siempre se forma SO2 en gran proporción y en menor
proporción SO3 (1-10%), lo cual es importante debido a la mayor peligrosidad
del SO3 que además en presencia de humedad se transforma en ácido sulfúrico.
Sin embargo, debido a la presencia de otros contaminantes como metales
pesados pueden incrementar la conversión por oxidación del SO2 a SO3,
incrementándose la peligrosidad de la mezcla sobre los seres vivos expuestos.
- 45 -
Figura 7. Esquema del ciclo del azufre.
Uno de los principales problemas que se ha asociado a las emisiones
antropogénicas de óxidos de azufre en los países industrializado es la
generación de la lluvia acida mediada por el ácido sulfúrico formado a partir
del SO3, produciendo un daño sobre la vegetación tras perdidos prologados de
exposición a la misma, acidificación del suelo, de las aguas etc. Se ha descrito
que los óxidos de azufre presentan una mayor toxicidad sobre las platas que
sobre los animales u el hombre, dañando sus hojas y el aparato fotosintético. En
los animales y el hombre se han descrito fundamentalmente alteraciones
respiratorias, también neurológicas por exposición a estos compuestos, pero
debido a la dificultad que presentan las moléculas de estos óxidos para penetrar
profundamente a nivel pulmonar por su tamaño su absorción es baja no
produciendo mayores efectos de toxicidad. La peligrosidad se incrementan
cuando la respiración se realiza por la boca en lugar de por la nariz dado que
permite que las partículas penetren mejor a nivel pulmonar, siendo
especialmente vulnerables la población con problemas respiratorios.
- 46 -
También se ha descrito que los óxidos de azufre producen alteraciones sobre los
materiales. En este sentido, se ha descrito que modifican el secado y tiempo de
endurecimiento de algunas pinturas influyendo en su durabilidad, aumentan
la velocidad de corrosión de la mayoría de los metales y, especialmente el
hierro, acero y cinc. Además, las concentraciones elevadas de H2SO4 son capaces
de atacar una amplia gama de materiales para la construcción (mármol, caliza,
cuero, papel).
PROBLEMAS DE CONTAMINACIÓN AMBIENTAL
Se han producido una serie de catástrofes medioambientales que se podrían
haber evitado si se hubieran establecido medidas de control y de seguimiento,
así como una evaluación impacto ambiental de las actividades industriales
antes de que se hubieran puesto en marcha. Algunos ejemplos a nivel global
son:
- Desastre de Bhopal: se originó el 3 de diciembre de 1984 en la India al
producirse una fuga de 42 toneladas de isocianato de metilo. No existía medidas
de seguridad y control para gestionar las posibles consecuencias de la liberación
de los productos o residuos producidos sobre los trabajadores y la población.
- Enfermedad de Itai-Itai: se produjo en Japón, como consecuencia de la
contaminación de las aguas de un rio por una industria minera principalmente
con cadmio que ocasiono la contaminación de los cultivos de arroz dando lugar
a la intoxicación de la población por consumo de dicho arroz. No existían
medidas de control y protocolos de gestión de los residuos generados por la
empresa minera.
- Accidente de Seveso: Se originó el 9 de julio de 1976 en la región de Lombardia
(Italia) en el municipio de Seveso, al producirse la fuga de una nube tóxica que
contenía entre otras sustancias tóxicas la dioxina TCDD en la planta Icmesa de
grupo Roche. Dicho accidente se produjo por la falta de medidas de seguridad
que controlaran los procesos de producción, ni planes de vigilancia y control de
escapes así como de planes de contingencia para la protección de los empleados
y la población.
- 47 -
EVALUACIÓN DE IMPACTO AMBIENTAL
Hay dos sistemas de gestión ambiental, la Evaluación del Impacto Ambiental
(EIA), que es un procedimiento a priori, que intenta evitar que se ponga en
marcha una actividad que pueda producir efectos perjudiciales sobre el
medioambiente evaluando los posibles efecto que puede desencadenar y el otro
sistema son las Ecoauditorias, que son una a posteriori, que evalúa una vez en
funcionamiento una actividad si esta se ajusta a la regulación y normativa
exigida en materia medioambiental y propone planes de mejora de gestión
medioambiental evitando que pueda generar algún daño sobre el
medioambiente.
La Evaluación del Impacto Ambiental (EIA) es un procedimiento jurídicoadministrativo de recogida de información, análisis y predicción destinado a
anticipar, corregir y prevenir los posibles efectos directos e indirectos que la
ejecución de una determinada obra o proyecto causa sobre el medio ambiente.
Permitiendo a la Administración adoptar las medidas adecuadas a su
protección.
La Evaluación de Impacto Ambiental valorará los efectos directos e indirectos
de cada propuesta de actuación sobre la población humana, la fauna, la flora, la
gea, el suelo, el aire, el agua, el clima, el paisaje y la estructura y función de los
ecosistemas previsiblemente afectados.
La EIA se rige por el Real Decreto-ley 9/2018, de 5 de diciembre que modifica
el RD Ley 21/2013, de 9 de diciembre, según el cual deberán someterse a
Evaluación de Impacto Ambiental cualquier actuación, pública o privada,
consistente en la realización de las obras, instalaciones, planes y programas o
cualquier actuación comprendida en el Anexo I de dicho decreto por el
procedimiento ordinario.
Si la actuación está comprendida en el Anexo II, se deberá someterse a EIA por
procedimiento simplificado aportando el informe de impacto ambiental. En el
anexo II están recogida todas las actividades que revierte menor peligrosidad y
en el anexo I las más peligrosas. Las actividades pueden ser las mismas, y en
esos casos la diferencia estriba en el volumen (cuanto más volumen de
producción, mayor peligrosidad).
En el RD Ley 21/2013, de 9 de diciembre se establece a diferencia de
disposiciones anteriores que las actividades recogidas en el anexo II debían de
pasar obligatoriamente una EIA por el procedimiento simplificado y además
- 48 -
que si el volumen de producción para una misma industria erradicada en
distintas comunidades autónomas que no para del volumen indicado en el
anexo II debía de pasar EIA por el procedimiento ordinario si a suma de todos
los volúmenes producidos en las diferentes comunidad autónomas superaba lo
especificado en el anexo I.
El órgano administrativo competente
Cuando se trate de proyectos cuya repercusión no sobrepase el ámbito
territorial de una Comunidad Autónoma, el órgano ambiental competente será
el que determine la Comunidad Autónoma.
Cuando un proyecto pueda tenga repercusiones sobre el medio ambiente de
más de una Comunidad Autónoma, deberá ser autorizado o aprobado por la
Administración General del Estado, siendo en este caso el Ministerio de Medio
Ambiente el órgano ambiental competente.
Informe
El informe que se realiza tiene que ser muy pormenorizado. Debe incluir:
a) Descripción general del proyecto y exigencias previsibles en el tiempo, en
relación con la utilización del suelo y de otros recursos naturales. Estimación de
los tipos y cantidad de residuos vertidos y emisiones de materia o energía
resultantes.
b) Una exposición de las principales alternativas estudiadas y una justificación
de las principales razones de la solución adoptada, teniendo en cuenta los
efectos ambientales.
c) Evaluación de los efectos previsibles directos o indirectos del proyecto sobre
la población, la fauna, la flora, el suelo, el aire, el agua, los factores climáticos,
el paisaje y los bienes materiales, incluido el patrimonio histórico-artístico y el
arqueológico.
d) Medidas previstas para reducir, eliminar o compensar los efectos
ambientales significativos.
e) Programa de vigilancia ambiental.
f) Resumen del estudio y conclusiones en términos fácilmente comprensibles.
Informe, en su caso, de las dificultades informativas o técnicas encontradas en
la elaboración del proyecto.
Declaración de Impacto ambiental
Es el pronunciamiento del órgano ambiental que determinará, a los solos efectos
ambientales, la conveniencia o no de realizar el proyecto y en su caso, fijará las
- 49 -
condiciones en que debe realizarse, en orden a la protección del medio ambiente
y de los recursos naturales, teniendo en cuenta a este fin las previsiones
contenidas en los planes ambientales vigentes.
La Declaración de Impacto Ambiental incluirá las consideraciones apropiadas
para realizar el seguimiento ambiental de la ejecución, desarrollo o
funcionamiento y, en su caso, clausura de la actuación evaluada, de
conformidad con el programa de vigilancia, prescripciones de control o criterios
de seguimiento establecidos.
PROBLEMAS Y CUESTIONES
1. Indique cuál es la normativa actual por la que se rige la Evaluación del
Impacto Ambiental.
2. Según esta normativa, ¿se puede establecer una planta para la elaboración
productos lácteos que se prevé que reciba más de 200 toneladas de leche/día
sin necesidad de realizar una evaluación de impacto ambiental?. Razone la
respuesta.
- 50 -
3. Se sabe que los trabajadores de una industria esta expuestos diariamente a
anilina en niveles de 8,6 mg/m3, a n-butilmercaptano en niveles de 4,5 mg/m3,
y a ácido fórmico en niveles de 6 mg/m3 durante toda la jornada laboral (8
horas). Indique si los trabajadores están expuestos a niveles superiores a los
permitidos en el ambiente laboral, sabiendo que el máximo para estos niveles
son de 2 ppm para la anilina, 0,5 ppm para el n-butilmercaptano y 5 ppm para
el ácido fórmico.
Pm anilina: 93,13
Pm n-butilmercaptano: 90,19
Pm ácido fórmico: 46,03
4. Para el ejemplo anterior, indicar en aquellos compuestos que superen los
valores permitidos, que posibles efectos tóxicos se pueden producir sobre los
trabajadores expuestos.
- 51 -
5. Citar cinco cumbres sobre el cambio climático y el medio ambiente.
6. Citar cinco crisis ambientales mundiales y el lugar en el que se produjeron.
- 52 -
3.2.
Ensayos de toxicidad. Modelos y
cálculos de índices de toxicidad.
INTRODUCCIÓN
En la mayoría de los tóxicos, la magnitud de la respuesta biológica está
relacionada con la dosis, por lo tanto se puede definir matemáticamente la
relación entre dosis y respuesta.
Igualmente, no todos los animales responden igual ante la misma
exposición. Para tener presente este hecho la relación dosis-respuesta debe
contener una medida de variabilidad que refleje las medidas inherentes en las
respuestas esperadas entre los animales, como por ejemplo, las desviaciones
típicas, el error standard, etc.
La relación dosis-respuesta que se aplica más comúnmente es la DL50 que
se define como la dosis de sustancia capaz de matar al 50% de los individuos
que la han recibido.
ENSAYOS DE TOXICIDAD
Los ensayos de toxicidad son estudios cualitativos y cuantitativos de los
efectos nocivos que pueden ser ocasionados por cualquier agente químico o
físico sobre la estructura y la función de los diferentes sistemas en el organismo.
Estos estudios resultan de gran importancia para evaluar la seguridad de
diferentes compuestos y prevenir posibles alteraciones que se puedan generar
en el organismo.
Generalmente, el primer ensayo de toxicidad realizado en un nuevo
producto es la toxicidad aguda, que se pueden definir como los estudios
experimentales que permiten determinar los efectos nocivos que pueden darse
en un corto periodo de tiempo tras la administración de una única dosis de una
sustancia, o de varias dosis administradas en 24 horas.
- 53 -
Los objetivos de las pruebas de toxicidad aguda son:
1) proporcionar una estimación de la toxicidad intrínseca de la sustancia,
expresada como una dosis letal media (DL50) para su posterior
clasificación
(2) proporcionar información sobre los órganos diana y otras
manifestaciones clínicas de toxicidad,
(3) identificar las diferencias entre las especies y las especies susceptibles,
(4) establecer la reversibilidad de la respuesta tóxica, y
(5) proporcionar información que ayude al diseño y a la selección de la
dosis para estudios a largo plazo (subcrónicos, crónicos) (Casarett and
Doull Toxicology 2008)
En Toxicología, el término más representativo de la toxicidad aguda de
una sustancia es la dosis letal 50 (DL50) definido como la dosis de una sustancia
que origina la muerte al 50% de los animales que la han recibido. Los valores de
la DL50 son usados como un indicador general de la toxicidad aguda de una
sustancia y se expresan generalmente en miligramos (mg) de sustancia tóxica
por kilogramo (kg), y lo más común es que el dato sea acompañado del animal
en el que se probó (ratas, conejos, etc.).
La determinación exacta de la muerte del 50 % de los animales empleados
originaria una pérdida de animales de experimentación enorme por lo que
actualmente se emplean diversos métodos para su determinación
MÉTODO DE REED-MUENCH
Es uno de los métodos más sencillos. Puede realizarse por procedimientos
gráficos o aritméticos. Se emplean valores acumulativos y los cálculos se
realizan teniendo solo en cuente los valores próximos al 50% de
letalidad/mortalidad, calculando la distancia proporcional de los porcentajes
de letalidad y el logaritmo del incremento de las dos dosis adyacentes al 50%
de letalidad.
- 54 -
Tomamos como ejemplo una dosis inicial de 50 mg/kg p.c., siendo las
dosis consecutivas, por tanto de 100, 200 y 400 mg/kg p.c.
Dosis Valores reales Valores acumulativos Total (M+V)
mg/kg M
acumulativos
V
M
V
p.c.
50
0
10
0
(9+10)=19
(0+19)=19
100
2
8
(0+2)=2
(1+8)=9
(2+9)=11
200
9
1
(2+9)=11
(0+1)=1
(11+1)=12
400
10
0
(11+10)=21
0
(21+0)=21
% letalidad de
los valores
acumulativos
0
18,18
91,66
100
A continuación aplicamos la siguiente fórmula para el cálculo de la DL50:
Log DL50 = log dosis inferior + (B x log A)
Siendo A = dosis superior/dosis inferior
B=
50 - % dosis inferior
% dosis superior - % dosis inferior
En primer lugar buscamos el valor de B que es la distancia proporcional
de porcentajes continuos al 50%. Estos porcentajes, en este caso serán 18,18 y
91,66 que corresponden a las dosis de 100 y 200 mg/kg p.c.
(𝟓𝟎$𝟏𝟖,𝟏𝟖)
𝟑𝟏,𝟖𝟐
B = 𝟗𝟏,𝟔𝟔$𝟏𝟖,𝟏𝟖 = 𝟕𝟑,𝟒𝟖 = 𝟎, 𝟒𝟑𝟑𝟎
A continuación buscamos el logaritmo del incremento de dosis contiguas
al 50% de letalidad que en la fórmula corresponde con el logaritmo de A (log
A). Estas dosis corresponden en nuestro ejemplo a 100 (dosis baja) y 200 mg/kg
p.c. (dosis alta).
𝑫𝒐𝒔𝒊𝒔 𝒎𝒂𝒚𝒐𝒓
𝟐𝟎𝟎
= 𝟏𝟎𝟎 = 𝟐 = A
𝑫𝒐𝒔𝒊𝒔 𝒎𝒆𝒏𝒐𝒓
log 2 = 0,3010 = log A
En realidad lo que estamos buscando es el logaritmo del factor de
progresión que es el número que nos relaciona las dosis.
- 55 -
A continuación multiplicamos los dos valores obtenidos y sumamos el
logaritmo de la dosis menor adyacente al 50% de letalidad.
log 100 = 2,0000
+ 0,4330 x 0,3010 = 0,1303
2,1303
(log dosis inferior)
+ (B x log A)
Log DL50
Por lo tanto Log DL50 = 2,1303
Como el valor que nos interesa es la dosis letal 50, no su logaritmo, en
último lugar buscamos el antilogaritmo del número resultante y nos dará la
DL50.
Antlog 2,1303 = 134,9895 mg/kg = DL50
Mediante este método no podemos calcular el error estándar ni ningún
otro parámetro de variabilidad.
La variante gráfica de este método nos permite calcular de una manera
rápida la DL50 aproximada de un compuesto. Se representan en abscisas las
dosis y en ordenadas por una parte la supervivencia acumulativa y por otra
parte la mortandad acumulativa. Son dos curvas que se cortan en un punto que
es la DL50.
- 56 -
MÉTODO DE MILLER Y TAINTER
Este método es hoy en día uno de los más utilizados a la hora de estudiar
cualquier relación dosis-respuesta, y en Toxicología la relación dosis-respuesta
más utilizada o estudiada es la relación dosis-porcentaje de mortandad,
determinando así la DL50. Las razones por las que se ha planteado este método
gráfico-matemático, son las siguientes:
Como hemos visto al principio de realizar estudios de determinación de
la DL50 (por ejemplo, el método de Reed-Muench), se venían representando en
una gráfica utilizando papel milimetrado, donde en ordenadas se representaba
el % de letalidad y en abcisas la dosis, y así obtenían una curva análoga a la de
la curva de Gauss; esta curva tiene forma sigmoidea asimétrica.
Curva dosis-respuesta sin ninguna transformación
Tomada de Toxicología de los alimentos, 2000. P. Valle y B.L. Florentino
Esto es debido a que el aumento de mortalidad no viene dado en la misma
proporción que el aumento de la dosis. Así un aumento de la mortalidad en un
10% para pasar por ejemplo del 30% al 40%, se produce solamente cuando los
estímulos, en este caso la dosis del tóxico, aumentan en una proporción
constante y no en una cantidad igual.
- 57 -
Esta representación puede mejorarse, obteniendo una curva simétrica,
tipo sigmoide, empleando en abcisas logaritmos de dosis en vez de dosis.
C
B
B
A
A
Tomada de Fundamental Toxicology J.H. Duffus y H.G.J. Worth. 2006
Traven (1927) estableció este tipo de curvas de “porcentajes de
mortalidad” o “porcentajes de respuesta”. Se observa en la figura que con una
dosis inferior a A no muere ningún animal. La dosis A representa la Dosis Letal
Mínima (DL01). La dosis B, a la que mueren el 50% de los animales, es la DL50 y
como se ve es la que puede determinarse con mayor precisión ya que una
pequeña desviación de la dosis determina una mayor variación en el porcentaje
de animales muertos. Por ellos la DL50 es el parámetro más empleado para
caracterizar la toxicidad de una sustancia. La dosis C representa aquella en que
el 100% de los animales han muerto, es la DL100.
El número de animales utilizados para determinar una curva de este tipo
es bastante elevado. Se consideran necesarios lotes mínimos de 10 animales por
dosis. El trazado de la curva para ser fiable requiere de 6 a 7 puntos por lo que
se necesitarían entre 80-100 animales y esto encarecía considerablemente la
investigación.
Con el objeto de simplificar el estudio de la DL50, Bliss por una parte y
Miller y Tainter por otra, estudiaron la posibilidad de transformar estas curvas
en rectas mediante una aproximación matemática. El trazado de una línea recta
requiere menos puntos, 3 ó 4, con lo que se reduciría el número de animales
utilizados en el estudio y la determinación de la DL50 sería más exacta. Un
simple método estadístico permite determinar la línea recta más apropiada
correspondiente a los puntos obtenidos. Esta modificación se conoce con el
nombre de “Transformación probit”.
- 58 -
La Transformación probit está basada en la hipótesis de que la
sensibilidad o respuesta de los sujetos de la población expuesta frente a la Dosis
(efecto) estudiada, sigue una distribución normal o curva de Gauss. La
experiencia ha demostrado que las gráficas de frecuencias teóricas, en las cuales
cada valor numérico (variable) se traza en función del número de veces
(frecuencia) con la cual ocurre en una población dada, sigue en general una
forma simétrica en forma de campana, llamada campana de Gauss.
Curva de frecuencia dosis-respuesta (variación intraespecie) (adaptada de
Willians y Burton, 1985)
Tomada de Toxicología de los alimentos, 2000. P. Valle y B.L. Florentino
Porcentaje de respuesta
%
0,1
2,3
15,9
50
84,1
97,7
99,9
Distribuciones
equivalentes normales
(DEN)
-3
-2
-1
0
1
2
3
- 59 -
Unidades probit
2
3
4
5
6
7
8
Los Probit son unidades de probabilidad. Se define el probit como la
unidad de respuesta obtenida por la adición de 5 unidades a cada uno de los
valores de la desviación equivalente normal, obtenida esta a su vez del
porcentaje de respuesta obtenido, de tal forma que a un 50% de respuesta se le
asigna un Probit 5. La relación entre el porcentaje de respuesta, desviación
equivalente normal y Probit aparece donde el probit 5 es el punto medio es el
punto medio de la curva normal de Gauss. Se necesita por lo tanto un papel
llamado papel probit o papel logarítmico-probabilístico.
Tomado de “Probit analysis. A statistical treatment of the sigmoid response curve. D. J.
Finney, 1952”
- 60 -
PORCENTAJES
2
5
10
20
30
40
50
60
70
80
90
95
99
8
7
5
5000
4
4000
3
3000
2
2000
1
1000
900
9
7
700
600
6
5
500
4
400
3
300
2
200
1
100
90
9
7
70
60
6
5
50
4
40
3
30
2
20
1
10
3.0
3.5
4.0
4.5
5.0
PROBITS
- 61 -
5.5
6.0
6.5
7.0
DOSIS
9000
8000
7000
6000
9
Las ventajas de esta medio son varias:
• Para determinar la DL50 utilizando el método de Miller y Tainter el
número de animales utilizados en el estudio es mucho menor, ya que solo
con 3 puntos podemos determinar una recta.
• Podemos calcular fácilmente la pendiente de la recta. Cuanto mayor es la
dispersión de los resultados en función del logaritmo de la dosis, menor
es la pendiente (a mayor pendiente mayor toxicidad). Esta pendiente
puede considerarse en principio como una característica de la intensidad
de la toxicidad para una sustancia.
• La utilización de los Probit simplifica extraordinariamente el cálculo, al
convertir la curva dosis/respuesta en una recta que relaciona el logaritmo
de la dosis con los Probit
• Por este método podemos calcular utilizando la gráfica, el error standard,
una medida de variabilidad entre los animales que tenemos que tener en
cuenta.
Para trazar la recta que nos indicará la DL50, tomamos el papel probit y
representamos en el eje de abscisas, las dosis y en el eje de ordenadas los
porcentajes de mortalidad. Trazamos la línea que mejor se adapte a los datos y
la DL50 se determina mediante la dosis que corresponde con el probit 5 (50%).
Tomado de Casarett and Doull’s Toxicology. 2008
- 62 -
Con este método podemos calcular el error estándar de la media que es la
desviación estándar de la población dividida por la raíz cuadrada del tamaño
de la muestra. Esta medida cuantifica las oscilaciones de la media muestral
(media obtenida en los datos) alrededor de la media poblacional (verdadero
valor de la media).
P4
P5
P6
En nuestro caso la media poblacional correspondería al valor del P5 y para
calcular el valor de la desviación estándar tendríamos que determinar dos tipos
de desviaciones, una a la derecha y otra a la izquierda que corresponderían con
los valores obtenidos de P6 (84%) y P4 (16%). Restando el menor (Probit 6) del
mayor (Probit 4) obtenemos un valor numérico correspondiente a dos
desviaciones típicas (2s) y el error standard sería:
Tomado de Wikipedia
2s
E.S. =
2N =
P4 - P6
2N
N = Número de animales empleados entre las dosis correspondientes al Probit
3,5 y al Probit 6,5
Vamos a realizar el ejercicio que hemos resuelto por el método de ReedMuench utilizando el método de Miller y Tainter.
Dosis Valores reales % mortandad
mg/kg
(valores reales)
M
V
p.c.
50
0
10
0
100
2
8
20
200
9
1
90
400
10
0
100
- 63 -
El cálculo del error standard sería en este caso:
190 - 88
40 = 16,13
E.S. =
Por lo tanto la DL50 sería igual a 130 ± 16,13 mg/kg
MÉTODO DE KARBER
Es un método aritmético y en él se emplea el intervalo medio del número
de muertes en cada grupo de animales y la diferencia entre dosis para el mismo
intervalo. La DL50 se obtiene al restar de la dosis capaz de originar la muerte en
todos los animales empleados un cociente que estará formado por la suma de
productos de diferencias partida por el número de animales de cada grupo.
LOTES
Dosis (mg/kg p.c.)
Nº animales
Nº de muertos
A (Diferencia entre dosis)
B (Diferencia media entre
muertos)
Producto A x B
Suma del producto A x B
1
50
10
0
2
100
10
2
3
200
10
9
4
400
10
10
50
100
200
1
5,5
9,5
50
550
2500
1900
- 64 -
CÁLCULO
Dosis capaz de originar la muerte de un 100% de los animales = 400 mg/kg p.c.
𝑺𝒖𝒎𝒂 𝒑𝒓𝒐𝒅𝒖𝒄𝒕𝒐𝑨 𝒙𝑩
DL50 = 400 - 𝑵º 𝒂𝒏𝒊𝒎𝒂𝒍𝒆𝒔 𝒑𝒐𝒓 𝒍𝒐𝒕𝒆 = 400 -
𝟐𝟓𝟎𝟎
= 150 mg/kg p.c.
𝟏𝟎
MÉTODO DE DOSIS FIJA
El método de dosis fija se lleva a cabo en ratas en dos fases:
En la primera se realiza un estudio preliminar, investigando de manera
secuencial los efectos de varias dosis administradas por vía oral a ratas de un
solo sexo (machos o hembras). El estudio preliminar proporciona información
acerca de la relación entre dosis y toxicidad, así como una estimación de la dosis
letal mínima (DL01). No suelen utilizarse más de 1 animal por dosis en esta
primera fase.
- 65 -
En el estudio principal, se administra a ratas la sustancia por vía oral a
grupos de 5 animales del mismo sexo, en las dosis pre-establecidos (5, 50, 500 o
2000 mg/kg p.c.). La dosis utilizada en primer lugar será aquella determinada
mediante el estudio preliminar capaz de producir “toxicidad manifiesta”, pero
sin aparecer letalidad alguna.
Una vez administrada la sustancia se realizan observaciones sobre sus
posibles efectos tóxicos. En caso de que la dosis inicial elegida produzca una
toxicidad manifiesta, pero no la muerte, no será preciso realizar otras pruebas
o ensayos.
En caso de que el nivel de dosis elegido no produzca toxicidad manifiesta,
se deberá volver a administrar la sustancia al nivel de dosis inmediatamente
superior. Si los animales mueren, o si es preciso sacrificarlos debido a una fuerte
reacción tóxica en los mismos, se deberá volver a administrar la sustancia al
nivel de dosis inmediatamente inferior.
Este procedimiento permite la identificación de la “dosis discriminante”,
que es la mayor de las dosis pre-establecidas que se puede administrar sin que
- 66 -
origine la muerte de los animales (incluyendo el sacrificio de los animales por
manifestaciones tóxicas visibles).
DOSIS
RESULTADOS
5 mg/kg p.c.
Supervivencia de menos
del 100%
Supervivencia del 100%
pero toxicidad manifiesta
Supervivencia del 100% sin
toxicidad manifiesta
50 mg/kg
500 mg/kg
2000 mg/kg
INTERPRETACIÓN
Compuestos que son
MUY TÓXICOS
Compuestos que son
TÓXICOS
Véanse los resultados
con 50 mg/kg
Compuestos que
pueden ser TÓXICOS o
Supervivencia de menos
MUY TÓXICOS. Véanse
del 100%
los resultados para 5
mg/kg
Supervivencia del 100%
Compuestos que son
pero toxicidad manifiesta
NOCIVOS
Supervivencia del 100% sin Véanse los resultados
toxicidad manifiesta
para 500 mg/kg
Compuestos que
pueden ser TÓXICOS o
Supervivencia de menos
NOCIVOS. Véanse los
del 100%
resultados para 50
mg/kg
Compuestos que se
Supervivencia del 100%
considera que no tienen
pero toxicidad manifiesta
toxicidad manifiesta
aguda significativa
Supervivencia del 100% sin Veanse los resultados
toxicidad manifiesta
para 2000 mg/kg
Supervivencia de menos
Veanse los resultados
del 100%
para 500 mg/kg
Supervivencia del 100%,
Compuestos que no
con o sin toxicidad
tienen una toxicidad
manifiesta
aguda significativa
- 67 -
PROBLEMAS Y CUESTIONES
- Calcular la dosis letal 50 por el método de Reed y Muench y por el método de
Miller y Tainter con los siguientes datos:
Dosis mg/kg p.c.
Valores reales
Muertos
Vivos
40
0
10
80
2
8
160
7
3
320
10
0
- 68 -
- 69 -
3.3.
Fuentes de Información en Toxicología.
Bases de Datos.
Con el surgimiento de Internet se ha facilitado el acceso gratuito a la
información para toda la población. Sin embargo, no toda la información
presente en la red es veraz y objetiva por lo que hay que es necesario saber
discernir qué información lo es de la que no lo es. Para ello es necesario recurrir
a páginas oficiales de organismos internacionales que publican en sus webs
información contrastada y revisada por pares. En este sentido, los estudiantes
de toxicología y toxicólogos deben de poder distinguir entre los diferentes tipos
de fuentes de información toxicológica, su localización, interpretación y manejo
dentro de las áreas toxicológicas (reguladora, ocupacional, industrial, clínica,
experimental, ambiental, etc).
Para facilitar el aprendizaje y acceso a la información toxicológica varios
Profesores del Área de Toxicología de la Universidad de Sevilla y del Instituto
Nacional de Toxicología de Sevilla (Repetto G, Moreno IM, del Peso A, Repetto
M, Cameán AM)
desarrollaron una herramienta web denominada
“BUSCATOX” en el cual se agrupan las principales webs relacionadas con la
toxicología en sus diferentes ámbitos permitiendo una búsqueda ágil y sencilla
de la información toxicológica en diversas páginas que ofrecen dicha
información veraz de forma gratuita.
En dicha web existe un menú con diferentes subapartados en los que podemos
encontrar la información toxicológica en los diferentes ámbitos. Así
encontramos un apartado de Datos toxicológicos donde se localizan webs que
proporcionan información toxicológica general, como por ejemplo Inchem que
publican monografías de los compuestos tóxicos estudiados o como la web
Pubchem que es una base de datos gestionada por la Biblioteca Nacional de
Medicina norteamericana que proporciona información sobre estructuras
químicas, identificadores, propiedades químicas y físicas, actividades
biológicas, patentes, salud, seguridad, datos de toxicidad entre otros.
Otro apartado es el de publicaciones donde se encuentra el principal buscador
a nivel mundial que es PubMed que es una base de datos gestionada por la
Biblioteca Nacional de Medicina norteamericana que publica los trabajos
científicos publicados en las revistas científicas. Dicha información es una
información muy específica que necesita de uso de palabras clave para localizar
- 70 -
exactamente aquello que se está buscando y el uso de comandos de inclusión o
exclusión.
También podemos encontrar un apartado de Seguridad química y Ocupacional.
Aquí podemos encontrar las Fichas Internacionales de Seguridad Química
(FISQ) que recogen información esencial de seguridad y salud de sustancias
químicas contrastada por un grupo de trabajo a nivel internacional. También
podemos encontrar la web del Instituto Nacional de Seguridad y Salud en el
trabajo que publica los Valores Límites de Exposición (VLAs) de exposición
laboral por debajo de los cuales los trabajadores están protegidos durante la
jornada laboral aunque se produzca una exposición durante todos los años de
trabajo. Además hay otras web internacionales que también publican sus
valores limites entro otras.
Otro subapartado es Genotoxicidad y Carcinogenicidad donde se presenta el
enlace a Webs que presentan informacion especifica en este ámbito como la de
la Agencia Internacional Para la Evaluación del Cáncer (IARC) que publica
monografías de los estudios realizados sobre distintas sustancias y clasifica las
sustancias según los estudios realizados en carcinógenos para el hombre o su
probabilidad de que así lo sean.
Tenemos otros subapartados como Medicamentos donde se ubican las
principales webs relacionadas con la información Fármacos como por ejemplo
la Agencia Española del Medicamento y Productos Sanitarios (AEMPS),
Agencia Europea del Medicamento (EMA) o la Agencia Americana de
alimentos y medicamentos (FDA). También contamos con otros subapartados
como Alimentos, done se agrupan las principales páginas que recogen
información relacionada con la seguridad de los alimentos como el Codex
Alimentarius, el Comité Mixto FAO/OMS de Expertos en Aditivos
Alimentarios (JECFA), la Agencia Española de Seguridad Alimentaria y
Nitración (AECOSAN), la Agencia europea de Seguridad Alimentaria (EFSA)
entre otras presentando los limites máximo de residuos (LMRs).
Además tenemos un subapartado de evaluación del riesgo donde podemos
encontrar Webs que proporcionan información para poder realizar esta como
puede ser la Agencia norteamericana de sustancias Toxicas y Registro de
Enfermedades (ATSDR) que publica los niveles mínimos de riesgo (MRLs).
- 71 -
PROBLEMAS Y CUESTIONES
1) Para los ensayos de genotoxicidad de un producto a base de plantas existe
un documento guía de ensayos no clínicos. ¿Cuál es el test in vitro indicado
en el primer paso para su evaluación?
2) Consultando el documento guía para evaluar la toxicidad tras dosis
repetidas, contestar a las siguientes preguntas;
a) ¿Qué tejidos deben examinarse para el estudio anatomo-patológico?
b) ¿en cuántos de los animales utilizados deben realizarse estos estudios?
3) ¿Cómo están clasificadas las siguientes sustancias por IARC y cuáles son
sus principales órganos diana para aquellos clasificados como 1?
SUSTANCIA
CLASIFICACIÓN
IARC
ARSÉNICO
ACRILAMIDA
METILEUGENOL
CAFEÍNA
- 72 -
ÓRGANO/S
DIANA
4) ¿Dónde se puede encontrar información sobre el valor LMR del plaguicida
Clorpirifos en productos agrícolas de la Unión Europea? Que niveles son
más restrictivos, ¿en mandarinas o manzanas? y del más restrictivo, ¿cuál
ha sido su evolución?
5) ¿Dónde podemos encontrar las directrices sobre las opciones para la
gestión de riesgos en relación a los resultados de la evaluación de riesgos?
6) Que cantidad de hormonas puede contener la carne destinada a consumo
humano en la UE? ¿Qué Directiva lo refleja?
- 73 -
3.4. Toma de muestras. Normas para la
recogida, preparación y remisión de muestras
para la investigación químico-toxicológica.
Cuando se produce un efecto tóxico es necesario conocer con exactitud el
agente causal del mismo. Para ello se deben de tomar muestras allá donde más
probable se pueda encontrar dicho agente para poder aislarlo de la matriz en la
que se encuentre, identificarlo y por último si es posible cuantificarlo para así
poder determinar el grado del efecto tóxico que podemos esperar.
En función de donde se encuentre actuando el tóxico tendremos que tomar
un tipo de muestra u otra así en un animal o persona intoxicada o fallecida
tendremos que tomar diversas muestras bilógicas.
Si nos encontramos ante un vertido en un río tendremos que tomar muestras
de agua. Si nos encontramos con una emisión de contaminantes por parte de
una industria tendremos que tomar muestras de gases atmosféricos y así según
donde se encuentre el tóxico. Por lo tanto según el tipo de muestra, tendrá un
tratamiento, preparación, acondicionamiento y remisión al laboratorio.
LA VALIDEZ DE LOS RESULTADOS
La validez de los resultados depende de:
Ø Perfección del muestreo
La muestra debe ser representativa del conjunto del que es tomada,
cuando el muestreo no se realiza adecuadamente no podemos extrapolar
los resultados obtenidos en los análisis practicados sobre dicha muestra.
Ø Condiciones de la remisión de muestras
Si la muestra no se procesa adecuadamente para evitar que pueda ser
contaminada o que pueda se degrada, los resultados obtenidos sobre la
misma no serán representativos de la situación original.
- 74 -
Ø Condiciones de almacenaje
El almacenamiento es fundamental porque hay que evitar que las
condiciones del mismo no puedan desencadenar en una degradación de
la muestra o del toxico que la contiene y al final no podamos detectarlo o
se haga en una concentración no representativa de la que se encuentra en
el conjunto del que es tomada la muestra.
PRECAUCIONES DURANTE LA RECOGIDA Y ENVÍO DE
MUESTRAS AL LABORATORIO
Ø Protección del personal que recoge la muestra.
o Prevenir el contacto directo con la muestra (guantes, mascarilla,
bata u otro tipo de ropa protectora).
o Prohibir el consumo de comidas y bebidas, así como de tabaco.
o Extremar las condiciones de asepsia y siempre que sea posible
utilizar material desechable.
o Recomendar la vacunación al personal que está en contacto directo
con las muestras.
Ø Protección de la Muestra
o Contaminación por material biológico humano.
o Contaminación química
o Contaminación microbiológica
ORIENTACIÓN HACIA EL ANÁLISIS TOXICOLÓGICO
El iniciar un análisis toxicológico sobre una muestra sin ningún tipo de
información es bastante complicado. En el caso de que no se dispusiera de
ningún tipo de información se debería de realizar una marcha analítica para ir
descartando compuestos por propiedades fisicoquímicas y familias de
compuestos, lo cual sería un proceso caro y tedioso. Para evitarlo se necesita
proporcionar la mayor información posible para poder orientar dentro de
cuáles son los tóxicos más probables que estemos buscando y planificar lo
análisis necesarios sobre las muestras para poder aislarlo, identificarlos y
cuantificarlos si es que están presentes.
- 75 -
En los casos de las intoxicaciones es necesario aporta diversos datos como
son:
Ø Historia clínica y examen físico del paciente.
Ø Información acerca de:
- Agente sospechoso
- Dosis sospechosa
- Tiempo entre la ingesta y la toma de muestras
- Ubicación del paciente/cadáver
En otros casos será necesario mandar la información necesaria para poder
llegar a poder acotar los posibles tóxicos. Por ejemplo, si tenemos un vertido en
un rio será necesario indicar donde se ha tomado las muestras y las industrias
próximas con las actividades que realizan, además de indicar otros factores
como olores si es que se perciben de forma específica, aspecto de las aguas
documentado con fotografías, etc.
PRINCIPALES MUESTRAS BIOLÓGICAS
La elección de la muestra para el análisis toxicológico hace dependiendo
de la sospecha que se tiene, de las propiedades químicas y tipo del producto
que se sospecha, de la vía de intoxicación y de los métodos analísticos entre
otros factores.
Las principales muestras biológicas que podemos tomar son:
• Contenido gástrico:
Se toma muestras de contenido gástrico cuando sospechamos o sabemos que
la intoxicación se ha producido por vía oral y ha pasado poco tiempo desde la
ingestión del toxico. La muestra se puede tomar en un vómito espontáneo o
inducido tras haberle administrado algún fármaco emético. También se puede
hacer sobre el suero empleado para el lavado gástrico. El que no detectemos el
toxico en el contenido gástrico no significa que no se encuentre, sino que puede
haber haberse absorbido por completo antes de que obtuviéramos las muestra.
o Aspectos positivos: el tóxico esta en alta concentración y es de extracción
fácil.
o Aspectos negativos: la muestra no es representativa del grado de
intoxicación.
- 76 -
• Orina:
Se toman muestras de orina cuando el toxico se elimina si metabolizarse
principalmente por esta vía y es difícil de identificarse en otros tejidos. Los
tóxicos se concentran en la orina por lo que si las concentraciones presentes en
otros tejidos son muy bajas y las técnicas analísticas son poso sensibles esta sería
la muestra de elección. Al tomarse la muestra se recomienda no añadir
conservantes, o usar fluoruro sódico o azida sódica si se van a tardar en analizar.
o Aspectos positivos: Es una muestra no invasiva, la extracción fácil y
exenta de proteínas por lo que las interferencias son mínimas.
o Aspectos negativos: muchos tóxicos se eliminan como metabolitos
que son comunes y no podemos diferenciar el tóxico o si la intoxicación
cursa de forma aguda y no da tiempo a detectar el mismo.
• Sangre:
o Es representativa del grado de intoxicación por lo que es la muestra
predilecta.
o Los tóxicos orgánicos básicos alcanzan concentraciones bajas dado que el
pH de la sangre es ligeramente básico.
o Se utiliza para el screening de tóxicos ácidos y neutros y para el estudio
de gases y sustancias volátiles
o Se recoge en un lugar donde la sangre fluya libremente (para evitar la
contaminación hística), y se vita recogerla de cavidades abiertas ya que se
puede haber contaminado (teniendo un efecto de concentración o
dilución, según los casos).
o Los tóxicos se pueden encontrar en la sangre unidos a los eritrocitos,
disueltos en la sangre o unidos a proteínas plasmáticas: por esa razón hay
que elegir entre analizar sangre total o plasma. El plasma tiene menos
interferencias que la sangre total. Se evita la formación de emulsiones con
los disolventes orgánicos como sucede en sangre total.
o Se suelen añadir anticoagulantes excepto para la determinación del plomo
por espectrometría de absorción atómica, y conservantes cloruro sódico
(para evitar que interfieran en el análisis y den falsos positivos).
o Las muestras de sangre post-mortem se deben agitar vigorosamente e
incluso someter a ultrasonidos para fluidificarlas.
- 77 -
• Pelo:
o Se usa en casos de intoxicación por drogas o metales pesados.
o Resisten a la degradación y es factible someterlo a análisis.
o La recolección de pelo es simple, no invasiva y replicable en caso de una
eventual confirmación.
o La muestra no puede ser alterada físicamente, ni puede ser manipulada
las concentraciones de drogas (por ingesta de algún agente neutralizante,
como podría ocurrir en el caso de sangre) o metales encontradas en la
muestra.
o Para las drogas, el pelo provee una ventana más amplia de detección que
muestras como orina y sangre (del orden de varias semanas a meses) en
las cuales las drogas permanecen durante un corto periodo.
• Humor vítreo:
o Es de accesibilidad fácil y con un volumen suficiente para poder realizar
el análisis.
o El aislamiento de los tóxicos es fácil ya que contiene pocas proteínas y
enzimas.
o Es resistente a la contaminación bacteriana y tarda en degradarse.
• Hígado:
o Muchos tóxicos son degradados a nivel hepático siendo posible
encontrarlo en este tejido fácilmente.
o Tarda mucho más tiempo que otros tejidos en degradarse por lo que es
una muestra de lección post-mortem
o Hay que tener cuidado en su extracción por que puede ser contaminado
con la bilis.
• Otros tejidos:
o Cerebro: intoxicaciones con disolventes y alcohol.
o Riñón: intoxicaciones por metales
o Bilis: sobredosis de opiáceos
o Pelo: tóxicos minerales
- 78 -
NORMAS PARA LA TRAMITACIÓN, PREPARACIÓN Y
ENVIO DE MUESTRAS
Hay que tener en cuenta a la hora de realizar el procesado de las muestras
y su envío si son tomadas para un proceso judicial en cuyo caso deben de seguir
lo indicado en la Orden JUS/1291/2010, de 13 de mayo, por la que se aprueban
las normas para la preparación y remisión de muestras objeto de análisis por el
Instituto Nacional de Toxicología y Ciencias Forenses (INTCF).
El INTCF es un órgano técnico adscrito al ministerio de Justicia con tres
Departamentos del Instituto (Madrid, Sevilla y Barcelona), cuya misión, entre
otras, es la realizar todos los análisis pertinentes en materia de toxicología así
como la de realizar los informes y asesorar en dicha materia a la administración
de justicia.
Para poder enviar las muestras al INTCF se debe de rellenar los
formularios correspondientes en función del tipo de muestra y análisis a
realizar que se encuentran como anexos de la Orden JUS/1291/2010, de 13 de
mayo. Antes de enviar las muestras se le debe de comunicar al laboratorio el
envío y se debe de enviar los datos de las muestras así como los datos necesarios
para realizar la investigación.
En los procesos judiciales es necesario que se mantenga la cadena de
custodia en todo momento. La cadena de custodia supone saber que ha pasado
con la muestra en todo momento y quien la ha manipulado, de tal manera que
no existe ninguna duda sobre los resultados obtenidos en las muestras y que no
ha podido ser manipulados. Cuando se rompe la cadena de custodia las
muestras y resultados obtenidos quedan invalidados.
Para mantener la cadena de custodia cada muestra debe llevar la siguiente
información:
o La toma de muestras se ha practicado en el día…
o Las muestras han sido envasadas y etiquetadas por…
o Tipo y/o número de precinto….
o Fecha de remisión de muestras al laboratorio….
o Condiciones de almacenaje hasta su envío….
o Transporte efectuado por….
o Firmado por….
- 79 -
Embalaje
• Interior
o Primario: envase de plástico, de rosca, cerrando de forma. Si la muestra
es corrosiva o puede quedar adsorbida en las paredes del plástico, no se
toma en este material, sino que se toma en vidrio. Cada muestra debe
enviarse precintada, cerrada, con número de referencia, con fecha y hora
de recogida, nombre o identificación y firma de la persona que recoge la
muestra, especificando lo que contienen y el paciente al que pertenecen.
o Secundario: saco de plástico con cierre hermético. Debe llevar material
absorbente por si se produce un derrame.
• Exterior
o Se emplea una nevera. Siempre asumimos que necesitan refrigeración.
Algo muy importante es solo poner muestra de 1 individuo por nevera,
para que no se mezclen las muestras. Deben llevar etiquetas que lo
identifiquen
o Se produce la refrigeración (alrededor del embalaje secundario). El
embalaje puede ser hermético con refrigeración con frigolines o con
salida de CO2 y refrigeración por hielo seco.
o En el exterior se deben de pegar las etiquetas que deben identificar el tipo
de sustancia que contiene el envío y las características de manejo siendo
de materiales perdurables, legibles y visibles.
Recepción de muestras en el laboratorio
Una vez que se reciben las muestras en el laboratorio se debe de mantener la
cadena de custodia para ello se deben de seguir los siguientes pasos:
1. Recibir las muestras y rellenar la hoja de custodia anotando:
- Nombre de la persona que entrega la muestra
- Nombre de la persona que recibe la muestra
- Fecha y hora de entrega
- Empresa que realiza el transporte (si procede)
- 80 -
2. Comprobar el número de referencia de cada muestra y compararlo con el
formulario enviado
-Anotar discrepancias, si existen
3. Comprobar que todas las muestras estén bien empaquetadas y que los
precintos estén íntegros
-Anotar discrepancias, si existen
4. Al abrir los recipientes, bolsas, etc. que contienen las muestras comprobar
que la identificación y descripción son correctas
5. Fotografiar las muestras y anotar su estado de conservación
Almacenamiento de las muestras
Si las muestras no pueden ser procesadas en el momento de entrega, que
es lo más habitual, es necesario realizar un almacenamiento adecuado de las
mismas para evitar que estas se puedan descomponer.
Los principales factores que pueden producir descomposición química y
biológica son:
o Luz: Muchos compuestos químicos son fotolábiles, es decir, la luz los
degrada. Esta asunción hay que asumirla siempre, tratando de que las
muestras no estén expuestas a la luz. Por lo tanto, hay que utilizar frascos no
transparentes de color topacio o envueltos con papel de aluminio
fundamentalmente en muestras de fluidos bilógicos transparentes como la
orina. Los alcaloides del cornezuelo de centeno y las fenotiacinas son
fotolábiles.
o Hidrolisis: Los tóxicos tipos éster como los anestésicos locales son
hidrolizados a temperatura ambiente e incluso a temperaturas bajas por la
acción de esterasas de sangre y tejidos. El pH alcalino favorece la hidrólisis.
Para evitarlos se añaden inhibidores de esterasas como fluoruro sódico o
acidificar las muestras hasta pH 4.
o Temperatura: 4ºC para la conservación y -20ºC para el almacenamiento. Solo
se descongela una vez, ya que si no se degrada la muestra. Se dividirá en
diferentes fracciones.
o Oxidación: La oxidación se puede prevenir reduciendo al mínimo la cantidad
de oxígeno en los recipientes llenándolos al máximo y cerrándolos
herméticamente. Se pueden adicionar antioxidantes (aunque esto puede
reducir los metabolitos oxidados de algunos tóxicos a sus productos
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originales). También influye la temperatura y el pH, así tenemos que lo
compuestos fenólicos se oxidan a 4ºC y los que contienen azufre son oxidados
en medio alcalino. Los iones metálicos actúan como catalizadores. Su efecto
puede disminuirse adicionando una proteína a la que se unan y dejen de
actuar (p. ej. seroalbúmina bovina).
o Descomposición biológica: se descomponen componentes de la muestra
dando lugar a la formación de otras sustancias nuevas (como el alcohol). Para
evitarla y obtener un resultado más fiable, se divide la muestra en dos: una
parte sin nada, y la otra con conservantes.
Otro factor que puede alterar la composición de la muestra es la
contaminación. Consiste en el paso a la muestra de compuestos formados
durante la putrefacción o de los componentes de los envases.
o Ejemplo de putrefacción: Aparece fenetilamina y se puede confundir con la
metanfetamina. También se produce tiramina y triptófano.
o Ejemplo de contaminación por componentes de los envases: Plastificante
tipo ftalatos de los envases o los tapones.
INTERPRETACIÓN DE LOS RESULTADOS
Una vez realizado los análisis sobre las muestras, podemos llegar a
identifica y cuantifica el toxico presente en la muestra. Sin embargo, en muchos
de los casos no es posible la detección del toxico en la muestra por diversas
causas como pueden ser:
1. Defectos del método analítico
2. Descomposición del toxico durante el almacenamiento
3. Que el toxico se haya eliminado antes de producirse los efectos y
recogerse la muestra
En el caso de que podamos identificar y cuantificar el toxico presente, puede
ocurrir que los datos obtenidos no sean exactos debido a:
1. Insuficiente soporte estadístico
2. Diferencias intra- e interindividuales
3. Interacciones entre tóxicos
4. Diferencias de sensibilidad y exactitud de las técnicas analíticas
empleadas
5. Diferencias entre los valores de concentraciones toxicas en las distintas
muestras
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PROBLEMAS Y CUESTIONES
1. Se debe de elaborar un caso de práctico de una intoxicación en la que el
alumno indique la historia clínica y toda aquella información necesaria para
determinar que posible toxico la ha originado, indicar que muestras se han
tomado justificadamente, como se han empaquetado y enviado y almacenado.
Indicar como se ha mantenido la cadena de custodia paso a paso, y rellenar el
formulario específico para enviar al INTCF.
(Descargar los PDF de los formularios del INTCF, apartado de documentación)
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