Semana 9
� Definición y origen
La PCR (Reacción en Cadena de la Polimerasa) es una técnica de
amplificación in vitro de fragmentos específicos de ADN.
Fue desarrollada por Kary Mullis en 1986.
Utiliza la capacidad de la ADN polimerasa para sintetizar una cadena
complementaria de ADN.
El termociclador realiza PCR convencional o PCR en tiempo real, según el
modelo.
� Componentes necesarios para la PCR
dNTPs: mezcla de los cuatro nucleótidos (dATP, dCTP, dTTP, dGTP); son
los bloques para formar el nuevo ADN.
Cebadores (primers): pequeños fragmentos de ADN que marcan el inicio y
fin del segmento a amplificar.
o El primer se pone en el ADN para que la Taq polimerasa pueda llegar
al gen.
ADN polimerasa (Taq polimerasa):
o Enzima termoestable aislada de la bacteria Thermus aquaticus, que
vive a altas temperaturas.
o Importante porque resiste las temperaturas de desnaturalización.
ADN molde: contiene la secuencia de ADN que se quiere amplificar. Puede
contener ADN nuclear y mitocondrial.
Buffer: mantiene las condiciones óptimas de pH e iones para la enzima.
Iones Mg²⁺ : cofactores esenciales para la actividad de la Taq polimerasa.
� Etapas del ciclo de PCR
Cada ciclo tiene tres fases principales:
1. Desnaturalización (~94–95 °C)
a. Se separan las hebras del ADN molde.
b. Inicia el proceso: el termociclador calienta para abrir las hebras de
ADN.
2. Alineamiento o hibridación (~50–65 °C)
a. Los cebadores se hibridan con sus secuencias complementarias del
ADN molde.
b. El cebador se pega para ver el gen y permitir la acción de la Taq.
3. Elongación (~72 °C)
a. La Taq polimerasa extiende los cebadores sintetizando la nueva hebra
de ADN.
4. Extensión final
a. Una última elongación para completar la síntesis de fragmentos
incompletos.
→ Este ciclo se repite unas 25 a 40 veces, produciendo millones de copias del
fragmento deseado.
⚡ Detección del producto de PCR
En la PCR convencional, se analiza mediante electroforesis en gel, para
visualizar el tamaño del fragmento amplificado.
En la PCR en tiempo real, la amplificación se detecta mediante señales de
fluorescencia. No se usa gel.
Gen que se puede identificar: Citocromo B (ejemplo del gen a encontrar).
✅ Ventajas de la PCR
Sensibilidad: requiere cantidades mínimas de ADN.
Especificidad: amplifica solo el fragmento deseado.
Eficiencia: genera una gran cantidad de producto en pocos ciclos.
Fidelidad: depende de la enzima. La Taq comete algunos errores, pero
existen otras polimerasas más fieles.
� Aplicaciones de la PCR
Diagnóstico de enfermedades infecciosas (virus, bacterias).
Diagnóstico prenatal de enfermedades genéticas.
Diagnóstico y detección temprana de cáncer.
Clonaje y secuenciación de ADN.
Análisis forense: identificación de personas a partir de sangre, pelo, semen.
Pruebas de paternidad.
Microbiología ambiental.
Microrize detecta varios genes como, por ejemplo, genes asociados al
autismo.
En Perú, la genética tuvo gran relevancia luego del accidente de Mesa
Redonda, aplicándose en análisis forense.
🛠️ Preparación de la PCR (ejecución de laboratorio)
� Materiales
Micropipetas: 10–100 µL.
Puntas estériles: 10–100 µL y 100–1000 µL.
Microcentrífuga (16,000 rpm).
Termociclador (convencional o en tiempo real).
Agua estéril (1.5 mL).
Cabina UV: todo el proceso debe realizarse dentro para evitar contaminación.
Plataforma DNA Learning Center.
4 muestras de ADN.
Kit con mix de PCR (Taq polimerasa, dNTPs, primers, Mg²⁺ , buffer, agua).
Kit de primers (Forward y Reverse).
� Mezcla maestra (Master Mix)
En un tubo PCR se colocan 25 µL de la solución de reacción final:
o 4 µL de ADN se pasan al tubo Master Mix.
Componente
Agua estéril
Buffer (10X)
MgCl₂
Primer R
Primer F
dNTPs
Taq
polimerasa
ADN molde
Total
Volumen
(µL)
12
2.5
1
1
1
1
Conservació
n
—
10X
25 mM
10 µM
10 µM
10 mM
—
1X
1 mM
0.4 µM
0.4 µM
0.4 mM
0.5
5 U/µL
1 U/25 µL
1
25 µL
—
—
—
—
Conc.
final
Luego se centrifuga brevemente para mezclar todos los componentes.
⌛ Condiciones del termociclador (30 ciclos)
Etapa
Desnaturalización
inicial
Hibridación (annealing)
Elongación
Número de ciclos
Conservación final
Temperatur
a
Tiempo
94 °C
1 min
52 °C
72 °C
—
4 °C
1 min
30 seg
30 ciclos
—
❄️ Conservación post-PCR
Si se usará pronto: almacenar a 4 °C.
Si no se usará de inmediato: conservar a –20 °C.
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