Tinción Ziehl-Neelsen y Medio Löwenstein-Jensen

Técnica de tinción de ziehl-neelsen DIAPOSITIVA 5
¿Qué es la tinción de Ziehl-Neelsen?
La tinción de Ziehl-Neelsen en una técnica de coloración para identificar microorganismos
alcohol-ácido resistentes (AAR). El nombre de este procedimiento de microbiología hace referencia
a sus autores: el bacteriólogo Franz Ziehl y el patólogo Friedrich Neelsen.
Esta técnica es un tipo de coloración diferencial, lo que implica el uso de distintos colorantes con la
finalidad de crear contraste entre las estructuras que se desean observar, diferenciar y
posteriormente identificar. La tinción de Ziehl-Neelsen sirve para identificar ciertos tipos de
microorganismos.
Algunos de estos microorganismos son micobacterias (por ejemplo, Mycobacterium tuberculosis),
nocardias (por ejemplo, Nocardia sp.) y algunos parásitos unicelulares (por ejemplo,
Cryptosporidium parvum). Muchas de las bacterias pueden clasificarse a través de una técnica
común llamada tinción de Gram.
No obstante, algunos grupos bacterianos requieren otros métodos para poder identificarlos.
Técnicas como la tinción de Ziehl-Neelsen requieren combinaciones de colorantes con calor para
fijar el primero a la pared celular.
Luego viene un proceso de decoloración que permite obtener dos resultados:
resistencia o sensibilidad a la decoloración por ácidos y alcoholes.
Fundamento
El fundamento de esta técnica de tinción se basa en las propiedades de la pared celular de estos
microorganismos. La pared está formada por un tipo de ácidos grasos llamados ácidos micólicos;
estos se caracterizan por presentar cadenas muy largas.
Cuando los ácidos grasos presentan estructuras muy largas, estos pueden retener los colorantes
con mayor facilidad. Algunos géneros de bacterias son muy difíciles de teñir mediante tinción de
Gram, debido al alto contenido de ácidos micólicos de la pared celular.
En la tinción de Ziehl-Neelsen se utiliza el compuesto fenólico carbol fucsina, un colorante básico.
Este tiene la capacidad de interactuar con los ácidos grasos de la pared celular, la cual es de
textura cerosa a temperatura ambiente.
La tinción con carbol fucsina es mejorada en presencia de calor, debido a que
la cera se derrite y las moléculas de colorante se mueven con mayor rapidez
hacia el interior de la pared celular.
El ácido que se usa posteriormente sirve para decolorar las células que no fueron teñidas porque
su pared no era lo suficientemente afín al colorante; por lo tanto, la fuerza del decolorante ácido es
capaz de eliminar el colorante ácido. Las células que resisten esta decoloración se llaman ácidoresistentes.
Colorante secundario
Después de la decoloración de la muestra, esta se contrasta con otro colorante llamado colorante
secundario. Generalmente se utiliza el azul de metileno o el verde de malaquita.
El colorante secundario tiñe el material de fondo y, en consecuencia, crea contraste a las
estructuras que fueron teñidas en el primer paso. Solo las células decoloradas absorben el
segundo colorante (contra-tinción) y toman su color, mientras que las células ácido-resistentes
conservan el color rojo.
Este procedimiento se usa frecuentemente para la identificación de Mycobacterium
tuberculosis y Mycobacterium leprae, las cuales son llamadas bacilos ácido-alcohol resistentes.
Reactivos
Colorante primario
Se usa carbol fucsina al 0,3 % (filtrado). Este colorante se prepara a partir de una mezcla de
alcoholes: fenol en etanol (90 %) o metanol (95 %), y en esta mezcla se disuelven 3 gramos de
fucsina básica.
Solución decolorante
En este paso se pueden emplear soluciones de ácido alcohol al 3 % o ácido sulfúrico al 25 %.
Colorante secundario (contra-colorante)
El colorante más empleado para realizar el contraste en las muestras suele ser el azul de metileno
al 0,3 %. Sin embargo, también se pueden emplear otros, como el verde malaquita al 0,5 %.
Procedimiento de tinción ácido-rápida
Preparar un frotis bacteriano
Esta preparación se hace en un portaobjetos limpio y seco, siguiendo las precauciones de esterilidad.
Secado del frotis
Dejar que el frotis se seque a temperatura ambiente.
Calentar la muestra
La muestra se debe calentar aplicando fuego al portaobjeto por debajo. Se puede hacer una fijación con
alcohol cuando el frotis no se ha preparado con esputo (tratado con hipoclorito de sodio para blanquearlo) y si
no se va a teñir inmediatamente.
M. tuberculosis se elimina con lejía y durante el proceso de tinción. La termofijación del esputo no tratado no
matará a M. tuberculosis, mientras que la fijación con alcohol es bactericida.
Cubrir la mancha
La mancha se cubre con la solución de carbol fucsina (colorante básico primario).
Calentar la mancha
Esto se hace durante 5 minutos. Debe notar un desprendimiento de vapor (aproximadamente a 60 °C). Es
importante no sobrecalentar y evitar quemar la muestra.
Con relación al calentamiento de la mancha, se debe tener mucho cuidado al calentar la carbol fucsina,
especialmente si la tinción se lleva a cabo sobre una bandeja u otro recipiente en el que se hayan recogido
productos químicos altamente inflamables de la tinción previa.
Solo se debe aplicar una pequeña llama debajo de los portaobjetos usando un hisopo encendido previamente
humedecido con unas gotas de alcohol ácido, metanol o etanol al 70 %. Evitar usar un hisopo grande
empapado en etanol porque esto es un riesgo de incendio.
Lavar la mancha
Este lavado debe hacerse con agua limpia. Si el agua del grifo no está limpia, lavar el frotis con agua filtrada o
destilada, preferiblemente.
Cubrir el frotis con alcohol ácido
Este alcohol ácido debe estar al 3 %. La cobertura se lleva a cabo durante 5 minutos o hasta que el frotis esté
lo suficientemente decolorado, es decir, de color rosa pálido.
Puede servirte: Priones
Hay que tomar en cuenta que el alcohol ácido es inflamable; por lo tanto, debe usarse con mucho cuidado. Se
debe evitar estar cerca de fuentes de ignición.
Lavar la mancha
El lavado debe ser con agua limpia, destilada.
Cubrir el frotis con colorante
Puede ser colorante verde de malaquita (0,5 %) o azul de metileno (0,3 %) durante 1 o 2 minutos, utilizando el
tiempo más prolongado si el frotis es delgado.
Lavar la mancha
Nuevamente debe utilizarse agua limpia (destilada).
Drenar
Se debe limpiar la parte posterior del portaobjeto y colocar la mancha en un estante de drenaje, para que esta
se seque al aire (no usar papel absorbente para el secado).
Examinar el frotis en el microscopio
Debe usarse el objetivo de 100X y el aceite de inmersión. Escanear el frotis sistemáticamente y anotar las
observaciones pertinentes.
Interpretar los resultados
Teóricamente, los microorganismos que se tiñan de un color rojizo se consideran ácido alcohol resistente
positivos (AAR+).
Al contrario, si los microorganismos se tiñen de azul o verde, dependiendo del colorante utilizado como
contra-colorante, se consideran ácido alcohol resistente negativos (AAR-).
Referencias
Cita este artículo
¿Qué es el medio Löwenstein-Jensen? DIAPOSITIVA 6
El medio Löwenstein-Jensen es un medio sólido selectivo para el aislamiento y desarrollo de
bacterias del género Mycobacterium, como Mycobacterium tuberculosis (bacilo de Koch), M. avium,
entre otras, a excepción de M. leprae, que no es cultivable.
Las bacterias del género Mycobacterium no crecen en medios de cultivo convencionales, por tanto,
fue necesario diseñar un medio especial para su aislamiento. El medio original fue creado por
Löwenstein y luego modificado por Jensen.
La modificación consistió en la eliminación del colorante rojo congo, sustituyéndolo por mayor
concentración de verde malaquita. Además, alteró las concentraciones de citrato de magnesio y
fosfato monopotásico.
El medio Löwenstein-Jensen actualmente contiene almidón de patata, asparragina, citrato
magnésico, fosfato monopotásico, sulfato magnésico, verde malaquita, ácido nalidíxico,
cicloheximida, lincomicina, huevos batidos, glicerina y agua.
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Las micobacterias se aíslan normalmente de sitios que no son estériles, como esputos, orina,
abscesos, entre otros. Esto quiere decir que la mayoría de las muestras contendrán microbiota
habitual del área, más el patógeno.
Es por ello que el medio Löwenstein-Jensen contiene una serie de inhibidores en su composición
representados por el verde malaquita, antibióticos y antifúngicos.
Además, las muestras que provienen de sitios no estériles deben ser descontaminadas y
neutralizadas antes de sembrarse en el medio Löwenstein-Jensen.
Fundamento del medio LöwensteinJensen
La presencia de huevo y glicerina en el medio Löwenstein-Jensen estimula el crecimiento de las
micobacterias debido a que proporcionan los ácidos grasos y las proteínas necesarias para el
desarrollo de estos microorganismos.
Este medio contiene verde malaquita, un inhibidor de la microbiota acompañante. Pero además
contiene ácido nalidíxico (35 µg/mL), que inhibe la microbiota gramnegativa, cicloheximida (400
µg/mL), que inhibe los hongos y levaduras saprófitos, y lincomicina (2µ/mL), que inhibe la
microbiota grampositiva.
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Algunas casas comerciales prefieren añadir la siguiente combinación de antibióticos: polimixina B
200.000 unidades/L, anfotericina B 10 mg/L, carbenicilina 50 mg/L y trimetoprima 10 mg/L.
Este medio no contiene agar, por tanto, la solidificación del medio ocurre por la coagulación de la
albúmina presente en el huevo durante la esterilización.
Preparación del medio LöwensteinJensen
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Pesar 37,3 g del medio deshidratado en 600 ml de agua destilada a la que
previamente se le ha adicionado 12 ml de glicerol.
Calentar la mezcla, agitando frecuentemente hasta su disolución total.
Autoclavar el medio a 121 °C por 15 minutos.
Preparar una suspensión homogénea de 1.000 ml de huevos frescos en
condiciones asépticas. Adicionar la suspensión de huevo a los 600 ml de medio
preparado a una temperatura de 50-60 °C, evitando las burbujas de aire.
Las soluciones de antibióticos también se le agregan después de la
esterilización en el autoclave.
Verter el medio en tubos de ensayo estériles con tapón de rosca. Calentar los
tubos a 85 °C por 45 minutos en posición inclinada.
Puede servirte: Petunias
El color del medio preparado es verde aguamarina y puede presentar puntos blanquecinos por la
presencia de lípidos del huevo.
El pH del medio debe quedar en 7,2 ± 0,2.
Guardar los tubos en nevera y protegidos de la luz directa hasta su uso. Atemperar antes de
sembrar.
Existe una modificación del medio, denominada “modificación de Gruft del Löwenstein Jensen”.
Contiene los mismos compuestos que el medio clásico, pero se le agrega RNA-5 mg/100 mL, y
como inhibidores contiene verde malaquita 0,025 g/100 mL, penicilina 50 U/mL y ácido nalidíxico
35 ug/mL.
Usos del medio Löwenstein-Jensen
El medio Löwenstein-Jensen se usa para el aislamiento de micobacterias, a partir de diversos tipos
de muestras. Se recomienda realizar una tinción de Ziehl-Neelsen a toda muestra en la que se
sospeche la presencia de micobacterias.
Algunas muestras provienen de sitios estériles, pero otras no. Las muestras no estériles deben ser
descontaminadas según sea el caso:
Esputo
Las muestras de esputos se deben descontaminar de la siguiente manera:

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

Determinar la cantidad de muestra de esputo en ml y agregar a la muestra la
misma cantidad de NaOH al 4% e incubar a 37 °C.
Agitar la mezcla frecuentemente durante 30 minutos. Posteriormente,
centrifugar a 3000 RPM por 30 minutos.
Descartar el sobrenadante sobre una solución de desinfectante fenólico.
Usar el sedimento para sembrar, pero antes se debe neutralizar el pH.
Para neutralizar el sedimento se utiliza H2SO4 al 5% en presencia del indicador
rojo de fenol hasta llevar a un pH neutro que origina un color salmón.
Lavado gástrico, lavado bronquial y aspirado
bronquial

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
Centrifugar la muestra a 3000 RPM por 30 minutos. Se descarta el
sobrenadante y se usa el sedimento.
Para descontaminar el sedimento se adicionan 3 ml de NaOH al 4% y se agita
frecuentemente a 37 °C por un lapso de media hora.
Centrifugar nuevamente, se descarta el sobrenadante y se usa el sedimento.
Este último se debe neutralizar como fue explicado en la muestra de esputo.
Puede servirte: Rizosfera: composición, partes, importancia
Orina
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
Dejar sedimentar la muestra en la nevera durante 24 horas. Separar el
sobrenadante. El sedimento restante debe centrifugarse por 30 minutos a 3000
RMP.
Descartar nuevamente el sobrenadante y reconstituir el sedimento con 3 ml de
solución fisiológica estéril.
Adicionar 3 ml de NaOH al 4% y proceder a la descontaminación y neutralización
tal como se ha descrito antes.
Líquido ascítico, líquido pleural, líquido
cefalorraquídeo

En este tipo de muestra se centrifuga y se descarta el sobrenadante. Realizar
un Gram al sedimento u observar directamente en el microscopio. Si no se
observan bacterias no es necesario el paso de la descontaminación y tampoco el
de neutralización.

En este caso la muestra se puede sembrar de forma directa usando el
sedimento. En caso de existir bacterias, proceder a descontaminar y neutralizar
como se ha descrito anteriormente.
Biopsias

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
A este tipo de muestra se le debe adicionar 5 ml de agua destilada para
posteriormente centrifugar a 1500 RPM por 10 minutos.
Descartar el sobrenadante y volver a centrifugar el sedimento a 3500 RPM por
30 minutos.
Utilizar el sedimento para sembrar el medio de cultivo.
Hisopado laríngeo


El hisopo debe introducirse en un tubo estéril que contenga partes iguales de
agua destilada y NaOH al 4%. El hisopo se debe presionar sobre las paredes del
tubo para que la muestra sea diluida en el líquido.
Centrifugar y usar el sedimento. Neutralizar el sedimento como ya ha sido
descrito.
Sembrado


El medio Löwenstein-Jensen se inocula agregando 0,5 ml de la
muestra sobre la superficie del medio. Rotar el tubo para distribuir la muestra en
todo el medio. No usar asa de platino.
Se puede sembrar un segundo tubo que contenga medio Stonebrink con la
finalidad de aislar Mycobacterium bovis y otras especies que no crecen en el
medio Löwenstein-Jensen.
Incubación
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
Los tubos inoculados se incuban en aerobiosis a 37 °C, con la tapa un poco
floja e inclinados a 5° aproximadamente y protegidos de la luz.
Se puede enriquecer el ambiente con dióxido de carbono al 5-10%. Revisar
los cultivos dos veces por semana hasta la aparición de colonias.
Cuando la muestra haya sido absorbida se ajustan las tapas. El tiempo
máximo de incubación es de 8 semanas, si al cabo de este tiempo no hay
crecimiento se reporta como negativo.
Puede servirte: Maltosa: estructura, función, alimentos, metabolismo
Control de calidad
Como control de calidad se pueden usar las siguientes cepas:
Mycobacterium tuberculosis ATCC 27294, Mycobacterium kansasii ATCC 12478, Mycobacterium
avium ATCC 19291, Mycobacterium bovis ATCC 19219, Mycobacterium fortuitum ATCC
6841, Escherichia coli ATCC 25922, Streptococcus pyogenes ATCC 19615, Cryptococcus
neoformans ATCC 32045.
Para las tres primeras especies mencionadas se espera un excelente desarrollo, para M.
fortuitum el crecimiento debe ser bueno, mientras que para M. bovis se espera un crecimiento
escaso o nulo. En tanto que las especies diferentes al género Mycobacterium deben ser inhibidas
en su totalidad.
Limitaciones del medio LöwensteinJensen
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El medio preparado debe protegerse de la luz, la exposición prolongada a la luz
hace que el medio vire de verde a azul, en este caso ya no se puede utilizar el
medio. Esto se debe a que el verde malaquita es fotosensible.
El medio, como contiene huevo, puede ser fácilmente contaminado si no se
manipula asépticamente. Puede ser disuelto si se contamina con bacterias
proteolíticas.
El cultivo y manipulación de bacterias del género Mycobacterium requiere
de un personal calificado, que sea consciente de las medidas de bioseguridad
que debe cumplir para evitar ser contaminado o contaminar a otros.
No se debe usar HCl en el paso de la neutralización debido a la formación de
cloruro de sodio, que puede ser tóxico para el bacilo de Koch.
Las muestras deben mantenerse refrigeradas y protegidas de la luz mientras
no sean procesadas.
Cultivo en medios líquidos (como el sistema BACTEC MGIT
960) DIAPOSITIVA 7
stema automático de detección
micobacteriana BD BACTEC™ MGIT™
Contacto
1. Descripción general
2. Instrucciones de uso electrónicas y otros recursos
Descripción general
BD BACTEC™ MGIT™ es una solución completamente automática para el cultivo líquido y
las pruebas de sensibilidad a micobacterias.
Características y beneficios
Sistema BD BACTEC™ MGIT™ 960
El sistema BD BACTEC™ MGIT™ 960, indicado para detectar el crecimiento
micobacteriano y realizar pruebas de sensibilidad de alto volumen, ha sido diseñado para
satisfacer las necesidades de los laboratorios de volumen medio y alto.
Sistema BD BACTEC™ MGIT™ 320
El sistema BD BACTEC™ MGIT™ 320 ha sido diseñado para ayudar a los laboratorios de
menor capacidad a detectar TB de manera rápida y precisa.
Incubación integrada
La incubación integrada elimina, de forma segura y eficiente, la necesidad de manejar o
transferir los tubos una vez cargados en el sistema, reduciendo la manipulación y aumentando
la seguridad del operador.
Control de datos
El sistema opcional de gestión de datos BD EpiCenter™ realiza análisis estadísticos y se
adapta a las distintas preferencias del usuario. Permite hacer un seguimiento sencillo de las
muestras y proporciona un sistema de informes flexible y dinámico, que cubre las
necesidades de gestión de datos más exigentes.
Simplicidad y rendimiento
El sistema se ha diseñado pensando en la simplicidad, para maximizar la productividad con
una mínima formación e interacción del personal.
Flexibilidad
BD BACTEC™ MGIT™ dispone de pruebas micobacterianas de crecimiento y sensibilidad a
fármacos en el mismo instrumento.
Colocación de los tubos
El sistema dirige automáticamente la colocación de los tubos e indica los resultados positivos
con una señal visual y acústica a medida que se producen.
Tecnología no radiométrica
El sistema utiliza tubos indicadores de crecimiento micobacteriano y sensores patentados BD
BACTEC™ MGIT™, que usan de manera eficiente tecnología fluorométrica avanzada para
facilitar la detección no invasiva del consumo de O 2 de forma precisa.
Control de calidad
El sistema ejecuta continuamente un control de calidad automático para asegurar un
funcionamiento preciso y fiable, y proporciona resultados positivo/negativo y unidades
numéricas de crecimiento.
Fácil manejo
El sistema permite escanear los tubos de plástico y cargar fácilmente las muestras, trabajando
de forma autónoma.
Monitorización continua
El sistema identifica los resultados positivos a medida que se producen, acelera los resultados
para mejorar la asistencia al paciente, reduce las estancias hospitalarias y optimiza el uso de
los equipos y del personal.
Pruebas de sensibilidad a fármacos (DST,
Drug Susceptibility Testing) DIAPOSITIVA 8
Identificación de la tuberculosis
farmacorresistente: Comentario
COMENTARIO05/12/17 Matthew E. Levison, MD, Former Professor, School of Public Health, Drexel University;
Adjunct Professor of Medicine, Drexel University College of Medicine
La tuberculosis (TB) farmacorresistente es una amenaza continua que dificulta de forma significativa los
esfuerzos de erradicación de la TB. En muchos países, el número en aumento de infecciones por TB
multirresistente (Multiple Drug-Resistent Tuberculosis, MDR) ha conducido a la necesidad de contar con una
prueba precisa y rápida, con resultados en el mismo día, para determinar la sensibilidad a los fármacos (Drug
Susceptibility Testing, DST) para los medicamentos antituberculosos de primera y segunda línea. Esta prueba
podría permitir tomar una decisión terapéutica inmediata. La TB MDR se define como la resistencia a los 2
medicamentos para la TB de primera línea más eficaces: isoniazida (INH) y rifampina (RIF). La TB
superresistente (Extensively Drug-Resistant, XDR) es un tipo de TB MDR que es resistente a la INH y a la
RIF, además de a cualquier fluoroquinolona (FQ) y, al menos, a uno de los tres fármacos de segunda línea
inyectables: amikacina (AMK), kanamicina (KAN) o capreomicina (CAP). En 2016, hubo 600 000 casos nuevos
con resistencia a la rifampina (Resistence to Rifampin, RR) en todo el mundo, de los cuales 490 000
presentaban TB MDR. Casi la mitad (47 %) de estos casos tuvieron lugar en India, China y en la Federación
Rusa.
La resistencia a un fármaco en M. tuberculosis se debe exclusivamente a las mutaciones en los genes
específicos y se ha asociado con >20 mutaciones en >11 genes y regiones promotoras. La multirresistencia es
la consecuencia de la acumulación de varias de estas mutaciones. Sin embargo, no se conocen todas las
mutaciones que presentan resistencia.
Más del 95 % de las cepas de M. tuberculosis resistentes a la RIF tienen mutaciones en la región determinante
de resistencia a la RIF (RIF Resistance-Determining Region, RRDR) del gen rpoB, y se han desarrollado varias
pruebas genéticas moleculares para detectar mutaciones en la RRDR.
La prueba para detectar la sensibilidad a los fármacos es esencial para lo siguiente:



Contar con orientación para realizar la selección de los fármacos.
Determinar si una respuesta clínica deficiente se debe al desarrollo de resistencia.
Evaluar la resistencia a un fármaco.
Tradicionalmente, los métodos fenotípicos basados en el cultivo son el patrón de oro para la DST. Pero estos
métodos tienen la desventaja principal de requerir un intervalo extremadamente largo antes de que estén
disponibles los resultados. Debido al lento desarrollo de la M. tuberculosis, los resultados demoran desde seis
hasta ocho semanas con un medio sólido y desde cuatro hasta cinco semanas con un medio líquido. Las DST
basadas en el cultivo también implican un riesgo biológico significativo que necesita altos niveles de prácticas
de bioseguridad y personal capacitado.
Para superar estas desventajas, se han desarrollado DST genéticas rápidas que acortan el tiempo de
respuesta desde meses hasta varias horas. El diagnóstico rápido de resistencia a un fármaco con métodos
moleculares es primordial para iniciar de inmediato una terapia antibiótica eficaz, y, así, mejorar los resultados
del tratamiento y reducir la transmisión de la TB MDR. Además de ser rápida, la DST genética también debe
ser precisa y, para ser útil en países de bajos recursos donde reside la mayoría de los pacientes con TB MDR,
deber ser simple de usar y rentable.
En la actualidad, la determinación genética de la resistencia a la RIF está disponible con normalidad en los
países desarrollados, y está cada vez teniendo mayor disponibilidad en el mundo en vías de desarrollo.
GeneXpert MTB/RIF (Cepheid), que cuenta con el aval de la OMS, es un sistema cerrado automatizado que
usa técnicas rápidas de PCR para detectar secuencias de ADN en muestras de esputo que son específicas
para M. tuberculosis, como también ciertas mutaciones que presentan resistencia a la RIF. La resistencia a la
RIF se usa como un marcador indirecto para la TB MDR, debido a que el 95 % de las cepas resistentes a la
RIF también son resistentes a la INH. La prueba tiene bastante mejor precisión que la microscopía de frotis
acidorresistente del esputo; la prueba se completa en un plazo de 2 horas con un riesgo biológico mínimo, y
puede ser realizada por trabajadores con menos experiencia y que requieren una capacitación técnica mínima.
GeneXpert MTB/RIF es un sistema altamente preciso entre las diversas regiones geográficas y ha contribuido
al aumento global en la detección de la TB RR. La prueba puede detectar >97 % de pacientes con resistencia a
la RIF identificada por cultivo (1) y tiene una especificidad cercana al 99 %.
Sin embargo, la rápida detección de la resistencia a fármacos de segunda línea ha quedado resagada. Se
necesita con urgencia poder identificar rápidamente la resistencia a las FQ y a los fármacos inyectables de
segunda línea AMK, KAN y CAP para detectar la TB XDT. Con la plataforma GeneXpert, se ha diseñado un
ensayo experimental para la detección rápida de los genes relacionados con la resitencia a la INH, a las FQ
(moxifloxacina y ofloxacina) y a los aminoglucósidos (amikacina y kanamicina).
En un estudio reciente que apareció en la publicación New England Journal of Medicine, se evaluó la precisión
del diagnóstico de este ensayo experimental en pacientes de China y Corea del Sur (2). Cuando se utilizó el
secuenciamiento de ADN como el estándar de referencia, el ensayo experimental alcanzó el objetivo de
sensibilidad del 95 % de la OMS para la INH, las FQ y la AMK, pero no alcanzó el objetivo de sensibilidad para
la KAN por, aproximdamente, 2 puntos porcentuales. Sin embargo, con un estándar basado en el cultivo, la
sensibilidad del ensayo genético experimental para detectar la resistencia fue menor: 83,3 % para la INH;
88,4 % y 87,6 % para la ofloxacina y moxifloxacina; y 71,4 % y 70,7 % para la kanamicina y amikacina. Aun
así, la especificidad osciló desde 94,3 hasta 99,6 % en comparación con el objetivo de la OMS de 98 %.
Limitaciones e inquietudes
Este estudio no evaluó la resistencia a la CAP, aunque se informó que la mutación de RRS detectada a partir
del ensayo representó la “mayor parte” de la resistencia. Este estudio tampoco evaluó la resistencia a otros
fármacos de primera línea, como ser estreptomicina, etambutol y pirazinamida (PZA), que pueden ser útiles en
la TB MDR. Otra limitación de este estudio fue la representación geográfica limitada de los participantes y las
cepas de M. tuberculosis. Se espera que estudios futuros documenten su utilidad en todo el mundo.
Se sabe que la concordancia entre los resultados de la DST genética y de la DTS basada en el cultivo no
siempre es cercana al 100 %. Las pruebas genéticas detectan solo las mutaciones que se pretenden detectar,
y algunas cepas resistentes tienen mutaciones conocidas que no están incluidas en el ensayo, o bien tienen
mutaciones desconocidas. Por ende, sería prudente usar la DST basada en el cultivo para confirmar la
sensibilidad identificada por la DST genética. En el futuro, la incorporación de mutaciones adicionales
asociadas a la resistencia puede mejorar la sensibilidad de este ensayo experimental. Se espera que con
mayor acceso a un análisis molecular rápido y mejorado, en especial en las comunidades con bajos recursos,
se identificará una mayor proporción de pacientes con TB MDR y se la tratará de inmediato con regímenes
polifarmacológicos eficaces.
Estos métodos son fundamentales,
especialmente en contextos donde
no se dispone de tecnologías
moleculares más rápidas, aunque
suelen ser más lentos
Reacción en cadena de la polimerasa (PCR)
DIAPOSITIVA 10
La reacción en cadena de la polimerasa (PCR por sus siglas del
inglés polymerase chain reaction) es un método ampliamente utilizado para hacer
rápidamente de millones a miles de millones de copias (completas o parciales) de
una muestra específica de ADN, lo que permite a los científicos tomar una muestra
muy pequeña de ADN y amplificarla (o una parte de ella).) a una cantidad lo
suficientemente grande como para estudiar en detalle. PCR fue inventado en 1983
por el bioquímico estadounidense Kary Mullis en Cetus Corporation; Mullis y el
bioquímico Michael Smith, que habían desarrollado otras formas esenciales de
manipular el ADN, recibieron conjuntamente el Premio Nobel de Química en 1993.
La PCR es fundamental para muchos de los procedimientos utilizados en las
pruebas e investigaciones genéticas, incluido el análisis de muestras antiguas de
ADN y la identificación de agentes infecciosos. Usando PCR, las copias de
cantidades muy pequeñas de secuencias de ADN se amplifican exponencialmente
en una serie de ciclos de cambios de temperatura. La PCR es ahora una técnica
común y, a menudo, indispensable que se utiliza en la investigación de laboratorio
médico para una amplia variedad de aplicaciones, incluida la investigación
biomédica y la ciencia forense criminal.
La mayoría de los métodos de PCR se basan en ciclos térmicos. El ciclo térmico
expone a los reactivos a ciclos repetidos de calentamiento y enfriamiento para
permitir diferentes reacciones dependientes de la temperatura, específicamente, la
fusión del ADN y la replicación del ADN impulsada por enzimas. La PCR emplea dos
reactivos principales: cebadores (que son fragmentos cortos de ADN de cadena
sencilla conocidos como oligonucleótidos que son una secuencia complementaria a
la región de ADN objetivo) y una ADN polimerasa. En el primer paso de la PCR, las
dos hebras de la doble hélice del ADN se separan físicamente a alta temperatura en
un proceso llamado desnaturalización del ácido nucleico. En el segundo paso, se
baja la temperatura y los cebadores se unen a las secuencias complementarias de
ADN. Luego, las dos cadenas de ADN se convierten en plantillas para que la ADN
polimerasa ensamble enzimáticamente una nueva cadena de ADN a partir de
nucleótidos libres, los componentes básicos del ADN.
Casi todas las aplicaciones de PCR emplean una polimerasa de ADN estable al
calor, como la polimerasa Taq, una enzima aislada originalmente de la bacteria
termófila Thermus aquaticus. Si la polimerasa usada fuera sensible al calor, se
desnaturalizaría bajo las altas temperaturas del paso de desnaturalización. Antes del
uso de la polimerasa Taq, la polimerasa de ADN tenía que agregarse manualmente
en cada ciclo, lo que era un proceso tedioso y costoso.
Las aplicaciones de la técnica incluyen la clonación de ADN para la secuenciación,
la clonación y manipulación de genes, la mutagénesis de genes; construcción de
filogenias basadas en ADN o análisis funcional de genes; diagnóstico y seguimiento
de trastornos genéticos; amplificación de ADN antiguo; análisis de huellas dactilares
genéticas para perfiles de ADN (por ejemplo, en ciencia forense y pruebas de
paternidad); y detección de patógenos en pruebas de ácido nucleico para el
diagnóstico de enfermedades infecciosas.
Principios
La PCR amplifica una región específica de una cadena de ADN (el objetivo de
ADN). La mayoría de los métodos de PCR amplifican fragmentos de ADN de entre
0,1 y 10 kilopares de bases (kpb) de longitud, aunque algunas técnicas permiten la
amplificación de fragmentos de hasta 40 kpb. La cantidad de producto amplificado
está determinada por los sustratos disponibles en la reacción, que se vuelve
limitante a medida que avanza la reacción.
Una configuración básica de PCR requiere varios componentes y reactivos, que
incluyen:

una plantilla de ADN que contiene la región objetivo de ADN para amplificar

una ADN polimerasa; una enzima que polimeriza nuevas hebras de ADN; La
polimerasa Taq resistente al calor es especialmente común, ya que es más probable que
permanezca intacta durante el proceso de desnaturalización del ADN a alta temperatura.

dos cebadores de ADN que son complementarios a los extremos 3' (tres cebadores) de cada
una de las cadenas con sentido y antisentido del objetivo de ADN (la ADN polimerasa solo
puede unirse y alargarse de una región de ADN de doble cadena; sin cebadores, no hay un
sitio de iniciación de doble cadena en el que la polimerasa pueda unirse); Los cebadores
específicos que son complementarios a la región objetivo del ADN se seleccionan de
antemano y, a menudo, se fabrican a medida en un laboratorio o se compran a proveedores
bioquímicos comerciales.

trifosfatos de desoxinucleósidos, o dNTP (a veces llamados "trifosfatos de
desoxinucleótidos"; nucleótidos que contienen grupos trifosfato), los componentes básicos a
partir de los cuales la ADN polimerasa sintetiza una nueva hebra de ADN

una solución tampón que proporciona un entorno químico adecuado para una actividad y
estabilidad óptimas de la ADN polimerasa

cationes bivalentes, típicamente iones de magnesio (Mg) o manganeso (Mn); Mg es el más
común, pero Mn se puede usar para la mutagénesis de ADN mediada por PCR, ya que una
concentración más alta de Mn aumenta la tasa de error durante la síntesis de ADN;
y cationes monovalentes, típicamente iones de potasio (K)
La reacción suele llevarse a cabo en un volumen de 10 a 200 μl en pequeños tubos
de reacción (volúmenes de 0,2 a 0,5 ml) en un termociclador. El termociclador
calienta y enfría los tubos de reacción para alcanzar las temperaturas requeridas en
cada paso de la reacción (ver más abajo). Muchos termocicladores modernos
utilizan el efecto Peltier, que permite calentar y enfriar el bloque que contiene los
tubos de PCR simplemente invirtiendo la corriente eléctrica. Los tubos de reacción
de paredes delgadas permiten una conductividad térmica favorable para permitir un
rápido equilibrio térmico. La mayoría de los termocicladores tienen tapas calentadas
para evitar la condensación en la parte superior del tubo de reacción. Los
termocicladores más antiguos que carecen de una tapa calentada requieren una
capa de aceite encima de la mezcla de reacción o una bola de cera dentro del tubo.
Procedimiento
Por lo general, la PCR consiste en una serie de 20 a 40 cambios de temperatura
repetidos, llamados ciclos térmicos, y cada ciclo consta comúnmente de dos o tres
pasos de temperatura discretos (consulte la figura a continuación). El ciclo suele
estar precedido por un solo paso de temperatura a una temperatura muy alta (>90
°C (194 °F)) y seguido por una retención al final para la extensión del producto final
o almacenamiento breve. Las temperaturas utilizadas y el tiempo que se aplican en
cada ciclo dependen de una variedad de parámetros, incluida la enzima utilizada
para la síntesis de ADN, la concentración de iones bivalentes y dNTP en la reacción,
y la temperatura de fusión (T m) de la cebadores Los pasos individuales comunes a
la mayoría de los métodos de PCR son los siguientes:

Inicialización: este paso solo se requiere para las ADN polimerasas que requieren activación
por calor mediante PCR de inicio en caliente. Consiste en calentar la cámara de reacción a
una temperatura de 94 a 96 °C (201 a 205 °F), o 98 °C (208 °F) si se utilizan polimerasas
extremadamente termoestables, que luego se mantiene durante 1 a 10 minutos.

Desnaturalización: este paso es el primer evento de ciclo regular y consiste en calentar la
cámara de reacción a 94–98 °C (201–208 °F) durante 20–30 segundos. Esto provoca la
fusión o desnaturalización del ADN de la plantilla de ADN de doble cadena al romper los
enlaces de hidrógeno entre las bases complementarias, lo que produce dos moléculas de
ADN de cadena sencilla.

Hibridación: en el siguiente paso, la temperatura de reacción se reduce a 50–65 °C (122–
149 °F) durante 20–40 segundos, lo que permite la hibridación de los cebadores con cada
una de las plantillas de ADN monocatenario. Normalmente se incluyen dos cebadores
diferentes en la mezcla de reacción: uno para cada uno de los dos complementos
monocatenarios que contienen la región objetivo. Los cebadores son secuencias
monocatenarias en sí mismas, pero son mucho más cortas que la longitud de la región
objetivo y complementan solo secuencias muy cortas en el extremo 3' de cada cadena.
Es fundamental determinar una temperatura adecuada para el paso de recocido
porque la eficiencia y la especificidad se ven fuertemente afectadas por la
temperatura de recocido. Esta temperatura debe ser lo suficientemente baja para
permitir la hibridación del cebador con la hebra, pero lo suficientemente alta para
que la hibridación sea específica, es decir, el cebador debe unirse sólo a una parte
perfectamente complementaria de la hebra y a ningún otro lugar. Si la temperatura
es demasiado baja, la imprimación puede adherirse de manera imperfecta. Si es
demasiado alto, es posible que la imprimación no se adhiera en absoluto. Una
temperatura típica de recocido está entre 3 y 5 °C por debajo de la T mde las
imprimaciones utilizadas. Los enlaces de hidrógeno estables entre bases
complementarias se forman solo cuando la secuencia del cebador coincide muy de
cerca con la secuencia de la plantilla. Durante este paso, la polimerasa se une al
híbrido cebador-plantilla y comienza la formación de ADN.

Extensión/alargamiento: La temperatura en este paso depende de la ADN polimerasa
utilizada; la temperatura de actividad óptima para la ADN polimerasa termoestable de la
polimerasa Taq es de aproximadamente 75 a 80 °C (167 a 176 °F),aunque comúnmente se
usa una temperatura de 72 ° C (162 ° F) con esta enzima. En este paso, la ADN polimerasa
sintetiza una nueva hebra de ADN complementaria a la hebra de la plantilla de ADN
mediante la adición de dNTP libres de la mezcla de reacción que es complementaria a la
plantilla en la dirección 5' a 3', condensando el grupo 5'-fosfato. de los dNTP con el grupo 3'hidroxi al final de la cadena de ADN naciente (alargada). El tiempo preciso requerido para la
elongación depende tanto de la ADN polimerasa utilizada como de la longitud de la región
diana del ADN a amplificar. Como regla general, a su temperatura óptima, la mayoría de las
ADN polimerasas polimerizan mil bases por minuto. En condiciones óptimas (es decir, si no
hay limitaciones debidas a sustratos o reactivos limitantes), en cada paso de
extensión/alargamiento, se duplica el número de secuencias diana de ADN.
Los procesos de desnaturalización, recocido y elongación constituyen un solo ciclo.
Se requieren múltiples ciclos para amplificar el objetivo de ADN a millones de
copias. La fórmula utilizada para calcular el número de copias de ADN formadas
después de un número determinado de ciclos es 2, donde n es el número de ciclos.
Por lo tanto, un conjunto de reacciones de 30 ciclos da como resultado 2, o
1.073.741.824, copias de la región diana del ADN de doble cadena original.

Elongación final: este único paso es opcional, pero se realiza a una temperatura de 70 a 74
°C (158 a 165 °F) (el rango de temperatura requerido para una actividad óptima de la
mayoría de las polimerasas utilizadas en PCR) durante 5 a 15 minutos después de la último
ciclo de PCR para asegurarse de que cualquier resto de ADN monocatenario esté
completamente elongado.

Retención final: el paso final enfría la cámara de reacción a 4–15 °C (39–59 °F) durante un
tiempo indefinido y puede emplearse para el almacenamiento a corto plazo de los productos
de la PCR.
Para verificar si la PCR generó con éxito la región objetivo de ADN anticipada (a
veces también denominada amplímero o amplicón), se puede emplear la
electroforesis en gel de agarosa para la separación por tamaños de los productos de
la PCR. El tamaño de los productos de la PCR se determina por comparación con
una escalera de ADN, un marcador de peso molecular que contiene fragmentos de
ADN de tamaños conocidos, que corre en el gel junto con los productos de la PCR.
Etapas
Al igual que con otras reacciones químicas, la velocidad de reacción y la eficiencia
de la PCR se ven afectadas por factores limitantes. Por lo tanto, todo el proceso de
PCR se puede dividir en tres etapas según el progreso de la reacción:

Amplificación exponencial: en cada ciclo, la cantidad de producto se duplica (suponiendo
una eficiencia de reacción del 100 %). Después de 30 ciclos, una sola copia de ADN puede
incrementarse hasta 1.000.000.000 (mil millones) de copias. En cierto sentido, entonces, la
replicación de una hebra discreta de ADN está siendo manipulada en un tubo bajo
condiciones controladas. La reacción es muy sensible: solo deben estar presentes
cantidades diminutas de ADN.

Nivelación fuera de etapa: la reacción se ralentiza a medida que la ADN polimerasa pierde
actividad y el consumo de reactivos, como dNTP y cebadores, hace que se vuelvan más
limitados.

Meseta: No se acumula más producto debido al agotamiento de los reactivos y la enzima.
Mejoramiento
En la práctica, la PCR puede fallar por varias razones, como la sensibilidad o la
contaminación. La contaminación con ADN extraño puede dar lugar a productos
falsos y se aborda con protocolos y procedimientos de laboratorio que separan las
mezclas previas a la PCR de los posibles contaminantes del ADN. Por ejemplo, si se
analiza el ADN de la escena de un crimen, una sola molécula de ADN del personal
de laboratorio podría amplificarse y desviar la investigación. Por lo tanto, las áreas
de configuración de PCR están separadas del análisis o la purificación de otros
productos de PCR, se utiliza material de plástico desechable y la superficie de
trabajo entre las configuraciones de reacción debe limpiarse a fondo.
La especificidad se puede ajustar mediante condiciones experimentales para que
no se generen productos espurios. Las técnicas de diseño de cebadores son
importantes para mejorar el rendimiento del producto de PCR y evitar la formación
de productos inespecíficos. El uso de componentes de tampón alternativos o
enzimas de polimerasa puede ayudar con la amplificación de regiones de ADN
largas o problemáticas. Por ejemplo, se dice que la polimerasa Q5 es
aproximadamente 280 veces menos propensa a errores que la polimerasa Taq.
Tanto los parámetros de ejecución (por ejemplo, la temperatura y la duración de los
ciclos) como la adición de reactivos, como la formamida, pueden aumentar la
especificidad y el rendimiento de la PCR. Se pueden realizar simulaciones
informáticas de los resultados teóricos de la PCR (PCR electrónica) para ayudar en
el diseño del cebador.
Aplicaciones
Aislamiento selectivo de ADN
La PCR permite el aislamiento de fragmentos de ADN a partir de ADN genómico
mediante la amplificación selectiva de una región específica de ADN. Este uso de
PCR aumenta muchas formas, como la generación de sondas de hibridación para la
hibridación del sur o del norte y la clonación de ADN, que requieren mayores
cantidades de ADN, que representan una región de ADN específica. La PCR
proporciona a estas técnicas grandes cantidades de ADN puro, lo que permite el
análisis de muestras de ADN incluso a partir de cantidades muy pequeñas de
material de partida.
Otras aplicaciones de la PCR incluyen la secuenciación de ADN para determinar
secuencias amplificadas por PCR desconocidas en las que se puede usar uno de
los cebadores de amplificación en la secuenciación de Sanger, el aislamiento de una
secuencia de ADN para acelerar las tecnologías de ADN recombinante que
involucran la inserción de una secuencia de ADN en un plásmido, fago, o cósmido
(dependiendo del tamaño) o el material genético de otro organismo. Las colonias
bacterianas (como E. coli) pueden examinarse rápidamente mediante PCR para
detectar construcciones de vector de ADN correctas. La PCR también se puede usar
para la toma de huellas genéticas; una técnica forense utilizada para identificar a
una persona u organismo mediante la comparación de ADN experimental a través
de diferentes métodos basados en PCR.
Algunos métodos de huellas dactilares de PCR tienen un alto poder discriminativo y
pueden usarse para identificar relaciones genéticas entre individuos, como padrehijo o entre hermanos, y se usan en pruebas de paternidad (Fig. 4). Esta técnica
también se puede usar para determinar las relaciones evolutivas entre organismos
cuando se usan ciertos relojes moleculares (es decir, los genes 16S rRNA y recA de
microorganismos).
Amplificación y cuantificación de ADN
Debido a que la PCR amplifica las regiones de ADN a las que se dirige, la PCR se
puede usar para analizar cantidades extremadamente pequeñas de muestra. Esto
suele ser fundamental para el análisis forense, cuando solo se dispone de una
pequeña cantidad de ADN como prueba. La PCR también se puede usar en el
análisis de ADN antiguo que tiene decenas de miles de años. Estas técnicas
basadas en PCR se han utilizado con éxito en animales, como un mamut de
cuarenta mil años, y también en ADN humano, en aplicaciones que van desde el
análisis de momias egipcias hasta la identificación de un zar ruso y el cuerpo de El
rey inglés Ricardo III.
Los métodos de PCR cuantitativa o PCR en tiempo real (qPCR, que no debe
confundirse con RT-PCR) permiten estimar la cantidad de una secuencia dada
presente en una muestra, una técnica que a menudo se aplica para determinar
cuantitativamente los niveles de expresión génica. La PCR cuantitativa es una
herramienta establecida para la cuantificación de ADN que mide la acumulación de
producto de ADN después de cada ronda de amplificación por PCR.
qPCR permite la cuantificación y detección de una secuencia de ADN específica en
tiempo real ya que mide la concentración mientras se lleva a cabo el proceso de
síntesis. Existen dos métodos para la detección y cuantificación simultáneas. El
primer método consiste en utilizar colorantes fluorescentes que se retienen de forma
inespecífica entre las dobles hebras. El segundo método implica sondas que
codifican secuencias específicas y están marcadas con fluorescencia. La detección
de ADN utilizando estos métodos solo se puede ver después de que tenga lugar la
hibridación de las sondas con su ADN complementario (ADNc). Una combinación
técnica interesante es la PCR en tiempo real y la transcripción inversa. Esta
sofisticada técnica, denominada RT-qPCR, permite la cuantificación de una pequeña
cantidad de ARN. A través de esta técnica combinada, el ARNm se convierte en
ADNc, que se cuantifica aún más usando qPCR. Esta técnica reduce la posibilidad
de error en el punto final de la PCR,aumentar las posibilidades de detección de
genes asociados con enfermedades genéticas como el cáncer. Los laboratorios
utilizan RT-qPCR con el fin de medir con sensibilidad la regulación génica. Los
fundamentos matemáticos para la cuantificación confiable de PCR y RT-qPCR
facilitan la implementación de procedimientos de ajuste precisos de datos
experimentales en aplicaciones de investigación, médicas, diagnósticas y de
enfermedades infecciosas.
Aplicaciones médicas y de diagnóstico
A los futuros padres se les puede hacer una prueba para determinar si son
portadores genéticos, o se les puede hacer una prueba a sus hijos para determinar
si realmente están afectados por una enfermedad. Las muestras de ADN para las
pruebas prenatales se pueden obtener mediante amniocentesis, muestreo de
vellosidades coriónicas o incluso mediante el análisis de células fetales raras que
circulan en el torrente sanguíneo de la madre. El análisis de PCR también es
esencial para el diagnóstico genético previo a la implantación, en el que se analizan
las células individuales de un embrión en desarrollo para detectar mutaciones.

La PCR también se puede utilizar como parte de una prueba sensible para la tipificación de
tejidos, vital para el trasplante de órganos. A partir de 2008, incluso existe una propuesta
para reemplazar las pruebas tradicionales basadas en anticuerpos para el tipo de sangre
con pruebas basadas en PCR.

Muchas formas de cáncer implican alteraciones en los oncogenes. Mediante el uso de
pruebas basadas en PCR para estudiar estas mutaciones, los regímenes de terapia a veces
se pueden personalizar individualmente para un paciente. La PCR permite el diagnóstico
precoz de enfermedades malignas como la leucemia y los linfomas, que actualmente es la
más desarrollada en la investigación del cáncer y ya se utiliza de forma rutinaria. Los
ensayos de PCR se pueden realizar directamente en muestras de ADN genómico para
detectar células malignas específicas de translocación con una sensibilidad que es al menos
10 000 veces mayor que la de otros métodos.La PCR es muy útil en el campo médico ya
que permite el aislamiento y amplificación de supresores de tumores. La PCR cuantitativa,
por ejemplo, se puede utilizar para cuantificar y analizar células individuales, así como para
reconocer confirmaciones y combinaciones de ADN, ARNm y proteínas.
Aplicaciones de enfermedades infecciosas
La PCR permite un diagnóstico rápido y altamente específico de enfermedades
infecciosas, incluidas las causadas por bacterias o virus. La PCR también permite la
identificación de microorganismos no cultivables o de crecimiento lento, como
micobacterias, bacterias anaerobias o virus a partir de ensayos de cultivo de tejidos
y modelos animales. La base para las aplicaciones de diagnóstico de PCR en
microbiología es la detección de agentes infecciosos y la discriminación de cepas no
patógenas de patógenas en virtud de genes específicos.
La PCR ha revolucionado la caracterización y detección de organismos de
enfermedades infecciosas de las siguientes maneras:

El virus de la inmunodeficiencia humana (o VIH), es un objetivo difícil de encontrar y
erradicar. Las primeras pruebas de infección se basaron en la presencia de anticuerpos
contra el virus que circulan en el torrente sanguíneo. Sin embargo, los anticuerpos no
aparecen hasta muchas semanas después de la infección, los anticuerpos maternos
enmascaran la infección de un recién nacido y los agentes terapéuticos para combatir la
infección no afectan a los anticuerpos. Se han desarrollado pruebas de PCR que pueden
detectar tan solo un genoma viral entre el ADN de más de 50 000 células huésped. Las
infecciones se pueden detectar antes, la sangre donada se puede analizar directamente
para detectar el virus, los recién nacidos se pueden analizar inmediatamente para detectar
infecciones y los efectos de los tratamientos antivirales se pueden cuantificar.

Algunos organismos de la enfermedad, como el de la tuberculosis, son difíciles de obtener
de los pacientes y su cultivo en el laboratorio es lento. Las pruebas basadas en PCR han
permitido la detección de pequeñas cantidades de organismos patógenos (tanto vivos como
muertos), en muestras convenientes. El análisis genético detallado también se puede utilizar
para detectar la resistencia a los antibióticos, lo que permite una terapia inmediata y eficaz.
Los efectos de la terapia también pueden evaluarse inmediatamente.

La propagación de un organismo patógeno a través de poblaciones de animales domésticos
o salvajes puede controlarse mediante pruebas PCR. En muchos casos, se puede detectar y
monitorear la aparición de nuevos subtipos virulentos. Los subtipos de un organismo que
fueron responsables de epidemias anteriores también pueden determinarse mediante
análisis de PCR.

El ADN viral puede detectarse mediante PCR. Los cebadores utilizados deben ser
específicos para las secuencias objetivo en el ADN de un virus, y la PCR se puede utilizar
para análisis de diagnóstico o secuenciación de ADN del genoma viral. La alta sensibilidad
de la PCR permite la detección del virus poco después de la infección e incluso antes del
inicio de la enfermedad. Tal detección temprana puede dar a los médicos un tiempo de
anticipación significativo en el tratamiento. La cantidad de virus ("carga viral") en un paciente
también se puede cuantificar mediante técnicas de cuantificación de ADN basadas en PCR
(ver más abajo). Se usa una variante de PCR (RT-PCR) para detectar el ARN viral en lugar
del ADN: en esta prueba, la enzima transcriptasa inversa se usa para generar una secuencia
de ADN que coincide con el ARN viral; este ADN se amplifica luego según el método
habitual de PCR. La RT-PCR se usa ampliamente para detectar el genoma viral del SARSCoV-2.

Enfermedades como la tos ferina (o tos ferina) son causadas por la bacteria Bordetella
pertussis. Esta bacteria se caracteriza por una infección respiratoria aguda grave que afecta
a varios animales y humanos y ha provocado la muerte de muchos niños pequeños. La
toxina de la tos ferina es una exotoxina proteica que se une a los receptores celulares
mediante dos dímeros y reacciona con diferentes tipos de células, como los linfocitos T, que
desempeñan un papel en la inmunidad celular. La PCR es una herramienta de prueba
importante que puede detectar secuencias dentro del gen de la toxina de la tos ferina.
Debido a que la PCR tiene una alta sensibilidad para la toxina y un tiempo de respuesta
rápido, es muy eficiente para diagnosticar la tos ferina en comparación con el cultivo.
GEN XPER TBC DIAPOSITIVA 11 VER PDF
GEN XPER ULTRA DIAPOSITIVA 12 VER PDF
GINO TYPE Y OTROS LINEAS DE PRUBA DIAPOSITIVA 13 VER PDF
Técnicas modernas de secuenciación del ADN: del Sanger
al NGS DIAPOSITIVA 14
01 OCT. 2024
Desde el desarrollo de la secuenciación Sanger en 1977 hasta la aparición de la secuenciación de
nueva generación (NGS), las técnicas de secuenciación del ADN han avanzado de manera
espectacular. Hoy en día, gracias a tecnologías como Illumina y PacBio, es posible secuenciar genomas
completos a una fracción del costo y tiempo que requería la secuenciación Sanger, lo que ha abierto la
puerta a aplicaciones como la medicina personalizada y la biología molecular avanzada. La
secuenciación de ADN se diferencia de otros procesos moleculares como la replicación del ADN, en que
se
enfoca
en
la
determinación
del
orden
de
los
nucleótidos.
Puntos clave




La secuenciación Sanger fue el estándar durante varias décadas, pero ha sido reemplazada en
gran medida por la NGS.
NGS permite secuenciar genomas completos a una fracción del costo y tiempo que Sanger.
Existen varias técnicas de NGS, como Illumina y PacBio, cada una con sus propias ventajas.
La NGS ha impulsado grandes avances en medicina personalizada y biotecnología.
Evolución de las técnicas de secuenciación
La secuenciación del ADN ha recorrido un largo camino desde los años 70, cuando Frederick Sanger
desarrolló la primera técnica exitosa de secuenciación, conocida como secuenciación Sanger. Esta
metodología fue clave para proyectos como el Proyecto Genoma Humano, que mapeó el genoma
completo en 2003. Sin embargo, las limitaciones de Sanger en términos de velocidad y costo llevaron a
la creación de técnicas más avanzadas conocidas como secuenciación de nueva generación (NGS),
que permiten secuenciar millones de fragmentos de ADN en paralelo.
Con la llegada de la NGS, tecnologías como Illumina y PacBio han dominado el campo, permitiendo una
secuenciación más rápida y económica, haciendo posible secuenciar el genoma humano por unos cientos
de
dólares
en
lugar
de
los
miles
de
millones
que
costaba
inicialmente.
COMPRAR PRODUCTOS PARA BIOLOGÍA MOLECULAR
Comparación entre Sanger y NGS



Sanger vs NGS: La principal diferencia entre la secuenciación Sanger y la NGS radica en la cantidad
de fragmentos de ADN que pueden ser secuenciados al mismo tiempo. Mientras que la secuenciación
Sanger procesa un solo fragmento de ADN a la vez, las tecnologías de NGS pueden secuenciar millones
de fragmentos en paralelo, lo que reduce considerablemente el tiempo necesario para obtener resultados.
Ventajas de Sanger:
Ideal para secuenciar genes individuales o fragmentos cortos de ADN.
Alta precisión en secuencias cortas.
Ventajas de NGS:
Mayor velocidad y eficiencia.


Capacidad para secuenciar genomas completos de manera más económica.
Útil para aplicaciones como la medicina personalizada y estudios de microbiomas.
Una de las técnicas más utilizadas en NGS es la reacción en cadena de la polimerasa (PCR), que juega
un papel clave en la preparación de las muestras. Para realizar la PCR y otras técnicas de amplificación
de ADN, los termocicladores son una herramienta indispensable en los laboratorios de biología
molecular.
Aplicaciones actuales de NGS
El impacto de la NGS se extiende más allá de la secuenciación de genomas completos. Algunas de las
principales aplicaciones incluyen:
1. Medicina personalizada: La secuenciación de los genomas de los pacientes permite tratamientos
personalizados basados en su perfil genético.
2. Investigación en enfermedades genéticas: NGS permite identificar variantes genéticas asociadas con
enfermedades hereditarias de manera más rápida y precisa.
3. Microbiomas: La secuenciación de comunidades microbianas ha revolucionado el estudio de la flora
bacteriana en diferentes ambientes, incluidos el intestino humano y el medio ambiente. Los estudios
basados en evaluación de la biodiversidad a través del ADN son cada vez más comunes gracias a la
precisión y velocidad de la NGS.
4. Agricultura y biotecnología: La secuenciación de cultivos y animales permite el desarrollo de nuevas
variedades resistentes a enfermedades.
5. Conservación: La secuenciación de ADN se utiliza para estudiar la genética de especies en peligro,
facilitando
su
conservación.
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Preguntas
Frecuentes
¿Cuál es la diferencia entre la secuenciación Sanger y la
secuenciación de nueva generación (NGS)?
La secuenciación Sanger procesa un solo fragmento de ADN a la vez, mientras que las técnicas de
NGS permiten secuenciar millones de fragmentos en paralelo. Esto hace que la NGS sea mucho
más rápida y económica para secuenciar genomas completos.
¿Qué aplicaciones tiene la secuenciación de nueva
generación (NGS)?
La NGS se utiliza en medicina personalizada, estudios de enfermedades genéticas, análisis de
microbiomas, agricultura y biotecnología, así como en la conservación de especies en peligro.
También es fundamental para estudios de biodiversidad.
¿Qué ventajas ofrece la secuenciación Sanger?
La secuenciación Sanger es ideal para secuenciar genes individuales o fragmentos cortos de ADN.
Aunque es más lenta que la NGS, ofrece una alta precisión en secuencias cortas y sigue siendo
utilizada en estudios específicos.
¿Cómo ha revolucionado la secuenciación NGS la medicina
personalizada?
La NGS permite secuenciar el genoma de los pacientes de manera rápida y precisa, identificando
variantes genéticas específicas que permiten tratamientos adaptados a cada individuo, mejorando
la precisión y eficacia de la medicina personalizada.
¿Qué tecnologías dominan actualmente la secuenciación de
nueva generación (NGS)?
Las principales tecnologías de NGS incluyen Illumina y PacBio, cada una con sus propias ventajas.
Illumina es conocida por su alta precisión y bajo costo, mientras que PacBio es valorada por su
capacidad para secuenciar moléculas de ADN más largas.
Conclusión
Las técnicas de secuenciación del ADN han evolucionado significativamente desde la creación de
la secuenciación Sanger hasta los métodos actuales de NGS. Mientras que la secuenciación Sanger
sigue siendo relevante para ciertos tipos de estudios, la NGS ha demostrado ser una herramienta
indispensable en aplicaciones que van desde la medicina personalizada hasta la investigación genética
a gran escala. Con el continuo desarrollo de nuevas tecnologías, es probable que veamos aún más
avances en este campo en los próximos años.
Ventajas generales de los métodos moleculares
Resultados rápidos (horas vs días/semanas con cultivos).
Alta sensibilidad y especificidad.
Detección simultánea de M. tuberculosis y mutaciones de resistencia.
⚠️ Limitaciones
Costos elevados y necesidad de equipos específicos (excepto Xpert en algunos casos).
No siempre disponibles en entornos con recursos limitados.
No reemplazan al cultivo cuando se necesita realizar pruebas de sensibilidad fenotípica o
estudios epidemiológicos.
Recombinase Polymerase Amplification (RPA)
‹Isothermal Nucleic Acid Amplification
DIAPOSITIVA 15

Loop-Mediated Isothermal Amplification (LAMP)

RCA and MDA-WGA

Recombinase Polymerase Amplification (RPA)
Recombinase polymerase amplification (RPA) is a sensitive, low-temperature, isothermal DNA amplification technique
that does not require thermal cycling. RPA is initiated by two primers and carried out by a mixture of recombinase
enzymes, a single-stranded binding protein, and a strand-displacing DNA polymerase. RPA is a versatile technique with
applications spanning from pathogen diagnostics to next-generation sequencing. It is performed at a constant
temperature of 39–42°C, making it highly suitable for detecting various pathogens in field conditions. RPA can also be
used to detect RNA targets by incorporating reverse transcriptase into the reaction. The reverse transcriptase
synthesizes a cDNA template from RNA before the recombinase complex binds the primers to initiate the RPA reaction.
Amplified DNA can be detected using various detection methods such as end-point detection, real-time analysis, lateral
flow assays, and CRISPR-Cas systems.
The RPA reaction starts when a recombinase complex made of UvsX and UvsY proteins binds to the primers in the
presence of ATP. This complex seeks a homologous sequence on DNA and promotes strand opening and invasion by
the primer. The single-strand DNA binding protein (Gene 32 Protein) stabilizes the resulting D-loop structure, allowing
the DNA polymerase to extend the primer while displacing the DNA strand.
Recombinase polymerase amplification kit
The Invitrogen Lyo-ready RPA Kit includes all required components in a glycerol-free format for isothermal recombinase
polymerase amplification (RPA), enabling high reaction sensitivity, specificity, and tolerance to inhibitors. The Lyo-ready
RPA Kit contains separate reagents that provide maximum flexibility to optimize the RPA reaction and work with various
types of pathogens (RNA/DNA), including S. aureus, P. aeruginosa, influenza, measles, and other pathogens.
Components for (RT-)RPA reactions are also available in a stand-alone format.
Product highlights:

Sensitive—Achieves sensitivity as low as one copy of target samples

Specific—Detects and amplifies a single target in a mixture of RNA/DNA

Fast—Amplifies targets in as little as 20 minutes

Robust—Amplifies even from inhibitor-containing RNA/DNA samples

Flexible—Provides the ability to optimize the RPA or RT-RPA reaction
Ventajas generales de los métodos isotérmicos:
Funcionan sin termocicladores.
Fáciles de implementar en campo o laboratorios periféricos.
Alta velocidad y capacidad de detección visual o por dispositivos simples.
Ideales para diagnóstico descentralizado o en zonas rurales.
⚠️ Desafíos y limitaciones:
Algunos tienen menor validación clínica comparado con PCR o GeneXpert.
Posibilidad de falsos positivos si no se manejan adecuadamente.
Disponibilidad comercial y estandarización aún limitada en algunos casos.