Extractos de Ortiga: Efecto Antioxidante y Antimicrobiano

UNIVERSIDAD TÉCNICA DE AMBATO
FACULTAD DE CIENCIA E INGENIERÍA EN
ALIMENTOS Y BIOTECNOLOGÍA
CARRERA DE BIOTECNOLOGÍA
Determinación del efecto antioxidante y antimicrobiano de extractos de diferentes
tipos de ortiga (Urtica dioica, Urtica urens, Urtica leptophylla, Urera baccifera)
frente a cepas de Staphylococcus aureus, Escherichia coli, Listeria monocytogenes y
Bacillus cereus.
Informe Final de Integración Curricular, Modalidad Proyecto de Investigación, previo
a la obtención de título de Ingeniero Biotecnólogo, otorgado por la Universidad
Técnica de Ambato, a través de la Facultad de Ciencia e Ingeniería en Alimentos y
Biotecnología.
Autor: Kevin Daniel Mariño Manzano
Tutor: Msc. María Daniela Garcés Moncayo
Ambato – Ecuador
Marzo - 2023
APROBACIÓN DEL TUTOR
Msc. María Daniela Garcés Moncayo
CERTIFICA:
Que el presente Informe Final de Integración Curricular ha sido prolijamente revisado.
Por lo tanto, autorizo la presentación de este Informe Final de Integración Curricular
bajo la modalidad de Proyecto de Investigación, el mismo que responde a las normas
establecidas en el Reglamento de Titulación y Grados de la Facultad de Ciencia e
Ingeniería en Alimentos y Biotecnología.
Ambato, 14 de febrero del 2023
Firmado electrónicamente por:
MARIA DANIELA
GARCES MONCAYO
…………………………………………….
Msc. María Daniela Garcés Moncayo
C.I. 180357158-5
TUTORA
ii
DECLARACIÓN DE AUTENTICIDAD
Yo, Kevin Daniel Mariño Manzano, manifiesto que los resultados obtenidos en el
presente Informe Final de Integración Curricular, modalidad Proyecto de
Investigación, previo a la obtención del título de Ingeniero Biotecnólogo, son
absolutamente originales, auténticos y personales, a excepción de las citas
bibliográficas.
…………………………………………….
Kevin Daniel Mariño Manzano
C.I. 180469725-6
AUTOR
iii
APROBACIÓN DE LOS MIEMBROS DEL TRIBUNAL DE GRADO
Los suscritos Profesores Calificadores, aprueban el presente Informe Final de
Integración Curricular, modalidad Proyecto de Investigación, el mismo que ha sido
elaborado de conformidad con las disposiciones emitidas por la Facultad de Ciencia e
Ingeniería en Alimentos y Biotecnología de la Universidad Técnica de Ambato.
Por constancia firman:
Firmado electrónicamente por:
ESTEBAN MAURICIO
FUENTES PEREZ
……………………………………………
Presidente de Tribunal
Firmado electrónicamente por:
WILLIAM RICARDO
CALERO CACERES
……………………………………………
PhD. William Ricardo Calero Cáceres
CI. 1714344885-9
Firmado electrónicamente por:
LILIANA PAULINA
LALALEO CORDOVA
……………………………………………
PhD. Liliana Paulina Lalaleo Córdova
CI. 180360185-3
Ambato, 03 de marzo de 2023
iv
DERECHOS DE AUTOR
Autorizo a la Universidad Técnica de Ambato, para que haga del presente Informe
Final de Integración Curricular o parte de él un documento disponible para su lectura,
consulta y procesos de investigación, según las normas de la Institución.
Cedo los Derechos en línea patrimoniales de mi Informe Final de Integración
Curricular, con fines de difusión pública, además apruebo la reproducción de este,
dentro de las regulaciones de la Universidad, siempre y cuando esta reproducción no
suponga una ganancia económica y se realice respetando mis derechos de autor.
………………………………………….
Kevin Daniel Mariño Manzano
C.I. 180469725-6
AUTOR
v
DEDICATORIA
A mis padres Víctor y Dora, por su apoyo incondicional en mi camino universitario,
por ofrecerme sus consejos de vida y darme la oportunidad de estudiar.
A mis hermanas Karen y Victoria por acompañarme en todo momento y por ser
quienes me han impulsado a perseguir mis metas.
A mis abuelitos, Guido y Carmen quienes me han ayudado en todo momento para
que este anhelo se haga realidad.
A mis tías, Katy y Ximena por sus consejos y apoyo incondicional
.
A toda mi familia que ha estado siempre al pendiente de este largo caminar
fomentando en mí, el deseo de superación y de triunfo en la vida. Lo que ha
contribuido a la consecución de este logro.
vi
AGRADECIMIENTOS
A Dios, por haberme dado la vida y fuerzas para alcanzar una meta más en mi vida.
A mis padres, por guiarme durante todo mi vida
A mis abuelitos por apoyarme y motivarme a seguir adelante
A mi tutora Msc María Daniela Garcés por apoyarme y guiarme en la realización
de este proyecto de investigación
Al PhD. Irvin Tubón por compartirme sus conocimientos y ayudarme en la
realización de este trabajo de titulación
A mis amigos con los que compartí agradables momentos durante toda la carrera
A mis amadas mascotas, Jack, Beto y Charly que en su momento me brindaron
alegrías y sonrisas.
A mis docentes de la FCIAB, por haberme formado profesionalmente con sus
conocimientos y enseñanzas compartidas en toda la carrera.
vii
ÍNDICE GENERAL DE CONTENIDOS
APROBACIÓN DEL TUTOR ..................................................................................... ii
DECLARACIÓN DE AUTENTICIDAD ................................................................... iii
APROBACIÓN DEL TRIBUNAL DE GRADO ....................................................... iv
DEDICATORIA ......................................................................................................... vi
AGRADECIMIENTOS ............................................................................................. vii
ÍNDICE GENERAL DE CONTENIDOS ................................................................. viii
RESUMEN ................................................................................................................ xiii
ABSTRACT .............................................................................................................. xiv
CAPITULO I................................................................................................................ 1
MARCO TEÓRICO ..................................................................................................... 1
1.1.
ANTECEDENTES INVESTIGATIVOS ...................................................... 1
1.1.1.
Flora del Ecuador ................................................................................... 1
1.1.2.
Plantas medicinales ................................................................................ 1
1.1.3. Especies vegetales (ortigas) ........................................................................ 2
1.1.3.
1.2.
Actividad antimicrobiana ....................................................................... 6
Objetivos........................................................................................................ 8
1.2.1. Objetivo general.......................................................................................... 8
1.2.2. Objetivos específicos .................................................................................. 8
1.3.
Hipótesis ........................................................................................................ 9
1.3.1.
Hipótesis nula ......................................................................................... 9
1.3.2.
Hipótesis alternativa ............................................................................... 9
1.4.
Variables ........................................................................................................ 9
1.4.1.
Variable independiente........................................................................... 9
1.4.2.
Variable dependiente .............................................................................. 9
viii
CAPÍTULO II ............................................................................................................ 10
METODOLOGÍA ...................................................................................................... 10
2.1.
Materiales ........................................................................................................ 10
2.1.1.
Material vegetal .................................................................................... 10
2.1.2.
Material biológico ................................................................................ 10
2.1.3.
Reactivos de laboratorio ....................................................................... 10
2.1.4.
Equipos de laboratorio ......................................................................... 11
2.1.5.
Instrumentos de laboratorio.................................................................. 11
2.1.6.
Insumos ................................................................................................ 12
2.2.
Métodos ....................................................................................................... 12
2.2.1.
Tipo de investigación ........................................................................... 12
2.2.2.
Población y muestra ............................................................................. 13
2.2.3.
Obtención de los extractos ................................................................... 13
2.2.4.
Concentración Mínima Inhibitoria (CMI) y Concentración Mínima
Bactericida (CMB) .............................................................................................. 15
2.2.5.
Actividad antioxidante ......................................................................... 18
2.2.6.
Cuantificación de fenoles totales ......................................................... 19
CAPÍTULO III ........................................................................................................... 20
RESULTADOS Y DISCUSIÓN................................................................................ 20
3.1. Análisis y discusión de resultados ................................................................... 20
3.1.1. Rendimiento de los extractos .................................................................... 20
3.1.2. Actividad antioxidante .............................................................................. 21
3.1.3. Compuestos fenólicos totales.................................................................... 26
CAPITULO IV ........................................................................................................... 32
CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES ......................................................... 32
BIBLIOGRAFÍA........................................................................................................ 34
ix
INDICE DE TABLAS
Tabla 1. Características morfológicas de los diferentes tipos de ortiga ...................... 2
Tabla 2. Concentración Mínime Inhibitoria de extractos de ortiga frente a distintos
microorganismos. ......................................................................................................... 6
Tabla 3 Rendimiento de los extractos de los diferentes tipos de ortiga .................... 20
Tabla 4 Porcentaje de inhibición de los radicales de DPPH de los extractos de
diferentes especies de ortiga....................................................................................... 22
Tabla 5 Capacidad antioxidante en equivalentes Trolox de las matrices vegetales 23
Tabla 6 Concentración de extractos necesaria para inhibir el 50% de radicales
DPPH.......................................................................................................................... 26
Tabla 7 Contenido de fenoles totales de los extractos provenientes de cada especie
vegetal. ....................................................................................................................... 28
Tabla 8
Concentración mínima inhibitoria de los diferentes extractos frente a
cuatro cepas bacterianas. ............................................................................................ 29
Tabla 9
Concentración mínima bactericida de los diferentes extractos frente a
cuatro cepas bacterianas. ............................................................................................ 30
x
INDICE DE FIGURAS
Figura 1
Clasificación taxonómica de las distintas especies de ortiga. .................. 5
Figura 2
Distribución geográfica de las distintas especies de ortiga analizadas....4
Figura 3
Representación gráfica de la ´primera fase de la preparación de la placa
de microtitulación....................................................................................................... 16
Figura 4 Representación gráfica de la segunda y tercera fase de la preparación de la
placa con distintas diluciones. .................................................................................... 16
Figura 5
Representación de la metodología aplicada en la evaluación de la
actividad antimicrobiana. ........................................................................................... 18
Figura 6 Porcentajes de Inhibición de DPPH a distintas concentraciones de los
extractos vegetales ..................................................................................................... 24
Figura 7
Curva de calibración para Trolox ............................................................ 55
Figura 8
Curva de calibración de ácido gálico....................................................... 56
Figura 9 y 10 Macerado de los extractos y extracción Soxhlet .............................. 59
Figura 11 Extractos etanólicos .............................................................................. 599
Figura 12 y 13 Extracto etanólico y metanólico de U. urens ................................... 59
Figura 15 y 16 Soluciones stock para actividad antioxidante y antimicrobiana ...... 60
Figura 17 Primera dilución de los extractos etanólicos ........................................... 61
Figura 18 Primera dilución de los extractos metanólicos ....................................... 61
Figura 19 Segunda y tercera dilución de los extractos metanólicos. ........................ 62
Figura 20 Actividad antioxidante de los extractos etanólicos.................................. 62
Figura 21 Actividad antioxidante de los extractos metanólicos .............................. 63
Figura 22 Cuantificación del contenido fenólico ...................................................... 63
xi
ÍNDICE DE ANEXOS
ANEXO A. Certificado de la identificación taxonómica de las especies vegetales. . 43
ANEXO B. Autorización de recolección de especímenes de especies de la diversidad
biológica. .................................................................................................................... 44
ANEXO C. Análisis estadístico para el rendimiento de los extractos. ..................... 46
ANEXO D. Análisis estadístico de actividad antioxidante ....................................... 46
ANEXO E. Análisis estadístico de los compuestos fenólicos totales. ...................... 49
ANEXO F. Análisis estadístico de la actividad antimicrobiana................................ 49
ANEXO G. Absorbancia de los extractos en la inhibición de DPPH. ...................... 52
ANEXO H. Curvas de calibración ............................................................................ 55
ANEXO I. Concentración Mínima Inhibitoria .......................................................... 56
ANEXO J. Fotografías .............................................................................................. 59
xii
RESUMEN
Las plantas medicinales se han convertido en una esperanza para el desarrollo de
medicinas alternativas, por tal razón, la OMS promueve el estudio de medicamentos a
base de fuentes vegetales, ya que con frecuencia generan escasos efectos secundarios,
mínima toxicidad y combaten la resistencia antimicrobiana. La familia Urticaceae
posee un alto índice de moléculas bioactivas. La presente investigación se enfoca en
evaluar la actividad biológica de los extractos hidroalcólicos (EtOH) y metanólicos
(MtOH) provenientes de cuatro especies de ortiga. Inicialmente se realizó la
extracción, que arrojó rendimientos variables, destacando como mejor resultado el
MtOH de U. dioica correspondiente a 2,487 porciento. La capacidad antioxidante se
determinó mediante la técnica DPPH, todos los extractos presentan actividad
antioxidante considerable, sin embargo, el MtOH de U. baccifera inhibió un
equivalente a 435,80 micromoles de Trolox por litro. La cuantificación de fenoles
totales se midió mediante el ensayo Folin-Ciocalteu, con el cual se demostró que los
EtOHs superan a los MtOHs. La extracción hidroalcohólica de U. dioica mostró una
mayor cantidad de compuestos fenólicos (87,840 miligramos de ácido gálico por
gramo). La actividad antimicrobiana se estimó mediante el método de microdilución
en placas de 96 pocillos basado en resazurina, con lo cual se determinó la CMI y CMB.
Los extractos que inhibieron a una menor concentración fueron: el MtOH de U.
baccifera y U. urens a E. coli y B.cereus, EtOH de U. urens y U. dioica a S. aureus y
L. monocytogenes, respectivamente. En conclusión, los extractos vegetales analizados
poseen actividad biológica considerable.
Palabras clave: Extractos vegetales, actividad antioxidante, actividad antimicrobiana,
fenoles totales, moléculas bioactivas, bacterias.
xiii
ABSTRACT
Medicinal plants have become a hope for the development of alternative medicines,
for this reason, the WHO promotes the study of medicines based on plant sources,
since they frequently generate few side effects, minimal toxicity and combat
antimicrobial resistance. The Urticaceae family has a high index of bioactive
molecules. This research focuses on evaluating the biological activity of
hydroalcoholic (EtOH) and methanolic (MtOH) extracts from four nettle species.
Initially, the extraction was carried out, which yielded variable yields, highlighting the
MtOH of U. dioica corresponding to 2.487 percent as the best result. The antioxidant
capacity was determined using the DPPH technique, all the extracts present
considerable antioxidant activity, however, the MtOH of U. baccifera inhibited an
equivalent to 435.80 micromoles of Trolox per liter. The quantification of total phenols
was measured by the Folin Ciocalteu assay, which demonstrated that EtOHs exceed
MtOHs. The hydroalcoholic extraction of U. dioica showed a higher amount of
phenolic compounds (87,840 milligrams of gallic acid per gram). The antimicrobial
activity was estimated by the microdilution method in 96-well plates based on
resazurin, with which the MIC and MBC were determined. The extracts that inhibited
at a lower concentration were: MtOH from U. baccifera and U. urens to E. coli and
B.cereus, EtOH from U. urens and U. dioica to S. aureus and L. monocytogenes,
respectively. In conclusion, the analyzed plant extracts have considerable biological
activity.
Keywords: Plant extracts, antioxidant activity, antimicrobial activity, total phenols,
bioactive molecules, bacteria.
xiv
CAPITULO I
MARCO TEÓRICO
1.1. ANTECEDENTES INVESTIGATIVOS
1.1.1. Flora del Ecuador
Dieciocho países megadiversos albergan el 70% de todas las especies del mundo
(Scarano et al., 2021), entre ellos Ecuador, que con sólo el 0,06% de la superficie
terrestre mundial es considerado el país más biodiverso por unidad de superficie del
mundo (Mestanza et al., 2020). Incomparablemente, aloja alrededor del 10% de todas
las especies vegetales del planeta (Velasteguí, 2018), específicamente se han descrito
científicamente un total de 25560 especies, de las cuales el 5348 (20,92%) son endémicas
(Vargas, 2002). Aproximadamente, 10 000 crecen en la región Andina, 8200 en la
Amazonía, 6300 en la región Litoral y 850 en Galápagos (Velasteguí, 2018).
1.1.2. Plantas medicinales
Las plantas son fábricas químicas vivientes que biosintetizan una gran variedad de
metabolitos secundarios, que constituyen la base de diversos medicamentos comerciales
y remedios herbales (Li et al., 2020). De hecho, los alcaloides, los terpenoides y los
fenilpropanoides son metabolitos de gran valor para la industria farmacéutica (Sanchita &
Sharma, 2018). Dichos componentes químicos son aprovechados principalmente en la
fabricación de fármacos y alimentos, dado a que poseen actividad biológica; pero
también, son muy valiosos en las industrias de perfumería, agroquímica y cosmética
(Rasool, 2012). Por tal razón. se define como planta medicinal a toda especie vegetal que
posee propiedades terapéuticas o ejercen un efecto farmacológico beneficioso sobre el
organismo humano o animal (Namdeo, 2018).
Las plantas medicinales se han convertido en una esperanza para el desarrollo de
medicinas alternativas (Getachew et al., 2022), por esta razón, la Organización Mundial
de la Salud (OMS), propone un estudio exhaustivo de medicamentos a base de plantas,
ya que con frecuencia generan escasos efectos secundarios, son menos tóxicos (OMS,
2016) y combaten la resistencia a los antibióticos. (Shin et al., 2018). Además se estima
1
que, de 300000 plantas existentes, únicamente el 15% han sido analizadas con el fin de
determinar su potencial farmacológico (Palhares et al., 2015). En Ecuador, se han
identificado propiedades medicinales en más 3118 especies de plantas. (Caballero-Serrano
et al., 2019)
De acuerdo con la OMS, entre el 65% y el 80% de las personas que habitan en países en
vías de desarrollo usan plantas medicinales como remedio (OMS, 2019). Además, en todo
el mundo se están llevando a cabo estudios que demuestran la eficacia y la importancia
de las plantas medicinales (Palhares et al., 2015) esto se ve reflejado en el mercado global
de medicamentos derivados de plantas, cuyo tamaño en el 2020, alcanzó los 185 860
millones de dólares y se estima que escale hasta los 430 050 millones de dólares en 2028
(Fortune Business Insights, 2022).
1.1.3. Especies vegetales (ortigas)
1.1.3.1. Descripción botánica
Tabla 1. Características morfológicas de los diferentes tipos de ortiga.
Características
Especies vegetales
U. dioica
U. urens
U. leptophylla
U. baccifera
Nombres
 Ortiga mayor
 Ortiga menor
 Ortiga de monte
 Ortiga brava
populares
 Ortiga verde
 Ortiga blanca
 Ortiga macho
Tamaño
50 cm a 1,5 m.
15 a 50 cm.
40 cm a 1,5 m
1,5 m a 2,5 m
Hojas
 Lanceoladas a  Opuestas,
 Opuestas,
 Ovadas
ovadas, de 5 a
simples de 4 a 6
decusadas de 5 a
oblongas,
15 cm de largo.
cm de largo.
12 cm de largo.
200 a 40 cm de
 Borde aserrado
 Borde aserrado
 Borde crenado
de
largo.
 Pecíolos de 1 a  Pecíolos de 0,5  Pecíolos de 1 a 3,5  Borde aserrado
3 cm de largo.
a 2 cm de largo.
cm de largo.
a dentado.
 Pecíolos de 2 a
20 cm.
2
 Color
Flores
verde  Color
amarillento.
verde,  Color verde claro  Color
blanco
o
 Inflorescencias
amarillento
en panículas.
 Inflorescencias
o amarillento.
púrpura
rojizo.
 Inflorescencias en  Inflorescencias
espiga.
en panículas.
en panículas.
Tallos
Fruto
 Cuadrangulares  Acanalados
 Acanalados
 Gruesos
 Erguidos
 Erguidos
 Erguidos
 Erguidos
 Delgados
 Ramificados
 Delgados
 Lisos
Aquenio ovado
Aquenio liso
Aquenio liso ovado
Aquenio aplanado
ovado
Imagen
Nota: La presenta tabla compara las principales características fisiológicas de las especies
mencionadas.
Adaptado de: Gutiérrez et al., (2020); Romoleroux et al., (2016); Pomboza et al.,
(2016); Guamán, (2015), Weigend et al., (2013); Thomé, (2011).
Los géneros Urtica y Urera, pertenecen a una misma familia (Urticaceae), por lo cual
comparten algunas particularidades, como su coloración (verde), la presencia de flores
unisexuales (Gutiérrez et al., 2020; Romoleroux et al., 2016; Weigend et al., 2013) y
pelos urticantes que las envuelve por completo, aunque en el caso de las Urticas estas se
presentan como delgadas vellocidades translúcidas (Romoleroux et al., 2016) y en las
Ureras como espinas (Gutiérrez et al., 2020). Sin embargo, existen características
morfológicas en las que difieren totalmente, como las que se detallan en la tabla 1.
3
1.1.3.2. Hábitat
Figura 1
Distribución geográfica de las distintas especies de ortiga analizadas.
Nota: La figura muestra las provincias en las que se desarrollan las especies de ortiga
estudiadas. Fuente: Elaboración Propia .Adaptado de: ARCSA, (2015); Romoleroux et
al., (2016) ; Pomboza et al., (2016).
Las especies del género Urtica que habitan en el país, se desarrollan principalmente en la
región Andina, en terrenos húmedos ricos en nitrógeno, con un pH variable entre 6.3 y
7.2 y a una altura de 1500 a 4000 msnm. (Pomboza et al., 2016; Romoleroux et al.,
2016). Mientras que, el género Urera prolifera en zonas húmedas a una elevación de 5002.800 msnm (MAE, 2015). U. leptophylla y U. baccifera son plantas nativas del Ecuador
(MAE, 2015; Romoleroux et al., 2016), a diferencia de U. dioca y U. urens, que son
especies introducidas, originarias de Europa y Asia (Morales et al., 2016). La distribución
geográfica de estas plantas en el Ecuador se puede apreciar en la figura 2.
4
1.1.3.2. Clasificación taxonómica
Figura 2
Clasificación taxonómica de las distintas especies de ortiga.
Nota: La figura representa la clasificación taxonómica de U. dioica, U. urens, U.
leptophylla y U. baccifera. Adaptado de: Romoleroux et al., (2016)
1.1.3.4. Composición química
Las ortigas poseen diferentes compuestos biológicamente activos (Kregiel et al., 2018),
destaca la presencia de flavonoides, ácido fórmico, ácidos grasos, proteínas, vitaminas
A,B, C, D, E, F, K y P, carotenoides, terpenoides, esteroles, compuestos polifenólicos,
aminoácidos esenciales, clorofila, taninos, isolectinas, carbohidratos, polisacáridos y
minerales principalmente calcio, hierro, magnesio, fósforo, potasio y sodio. (Begić et al.,
2020; Kregiel et al., 2018; Mzid et al., 2017). De igual manera, disponen de
neuromoduladores, como la acetilcolina, histamina, serotonina y colina (Begić et al.,
2020).
5
1.1.3.5. Usos
Estas plantas han sido utilizadas durante años en la medicina tradicional, con el fin de
tratar patologías relacionadas con el estrés oxidativo e inflamación, como enfermedades
cardiovasculares, neurodegenerativas, diabetes, aterosclerosis, artritis, reumatismo,
eccema, hemorragias, hiperplasia prostática benigna y cáncer (Bourgeois et al., 2016;
Carvalho et al., 2017). Adicionalmente, las hojas son empleadas como antiinflamatorio,
antirreumático, diurético, para tratar hemorroides, pérdida del cabello, infecciones
urinarias, enfermedades de la piel y trastornos gástricos (Gutiérrez et al., 2020).
Asimismo, se emplean en la industria cosmética como un completo antienvejecimiento
(Bourgeois et al., 2016).
1.1.3. Actividad antimicrobiana
Los antimicrobianos son agentes con la capacidad de destruir microorganismo o inhibir
su multiplicación y desarrollo (Girón, 2018). Investigaciones preliminares revelan que
los extractos etanólicos, exánicos, metanólicos y acuosos provenientes de distintas
especies de ortiga resultan eficaces al momento de combatir diferentes cepas microbianas
(Kregiel et al., 2018).
Tabla 2. Concentración Mínima Inhibitoria de extractos de ortiga frente a distintos
microorganismos.
Concentración
Microorganismo
Mínima Inhibitoria
Escherichia coli
36,21 mg/ml
Pseudomonas aeruginosa
72,43 mg/ml
Staphylococcus aureus SARM
66,66 mg/ml
Bacillus cereus
16,66 mg/ml
Acinetobacter calcoaceticus
16,66 mg/ml
6
Bacillus subtilis
36,21 mg/ml
Vibrio parahaemolyticus
4,16 mg/ml
Saccharomyces cerevisiae
2,08 mg/ml
Nota: La presente tabla muestra la concentración mínima extractos de ortiga necesarios
para inhibir el crecimiento bacteriano. Adaptado de: Jyoti et al., (2016); Kregiel et al.,
(2018); Mzid et al., (2017); Velasco et al., (2021)
1.1.4. Actividad antioxidante
Los radicales libres del oxígeno son moléculas inestables y altamente reactivas, que se
originan como consecuencia del metabolismo aeróbico fisiológico normal (Carvajal,
2019). Estos radicales interactúan directamente con moléculas del sistema biológico,
afectando potencialmente el ADN, las proteínas y los lípidos (Rodrigues et al., 2019).
Además, su acumulación promueve el desarrollo de afecciones metabólicas,
cardiovasculares, neurodegenerativas y otras crónicas (Rodrigues et al., 2019).
Favorablemente, se puede neutralizar estos radicales mediante metabolitos secundarios
denominados antioxidantes, tales como los polifenoles, los ácidos fenólicos y los
flavonoides provenientes de especies vegetales (Rets’epile et al., 2020). En diversas
investigaciones, se ha confirmado el valor biológico de las ortigas, destacando su
significativa actividad antioxidantes, gracias a su alto contenido de fenoles, polifenoles y
taninos (Begić et al., 2020; Mzid et al., 2017).
7
1.2. Objetivos
1.2.1. Objetivo general
Determinar el efecto antioxidante y antimicrobiano de los extractos de cuatro diferentes
tipos de ortiga (Urtica dioica, Urtica urens, Urtica leptophylla, Urera baccifera) frente
a cepas de Staphylococcus aureus, Escherichia coli, Listeria monocytogenes y Bacillus
cereus.
1.2.2. Objetivos específicos

Obtener extractos de cuatro especies de ortiga (U.
leptophylla, U. baccifera)
dioica, U.
mediante extracción Soxhlet
urens, U.
y extracción
hidroalcohólica.

Evaluar la actividad antioxidante de los extractos obtenidos de cuatro especies de
ortiga (U. dioica, U. urens, U. leptophylla, U. baccifera), por medio de la técnica
de 2,2-difenil-1-picrilhidrazilo (DPPH).

Establecer la Concentración Mínima Inhibitoria (CMI) y Concentración Mínima
Bactericida (CMB) de los extractos obtenidos de cuatro especies de ortiga (U.
dioica, U. urens, U. leptophylla, U. baccifera) mediante el método de dilución en
caldo.
8
1.3.
Hipótesis
1.3.1. Hipótesis nula
Los diferentes métodos de extracción (extracción hidroalcohólica y extracción
Soxhlet) influyen en las actividades biológicas (antimicrobiana y antioxidante) de
los extractos obtenidos de las cuatro especies de ortiga.
1.3.2. Hipótesis alternativa
Los diferentes métodos de extracción (extracción hidroalcohólica y extracción
Soxhlet) no influyen en las actividades biológicas (antimicrobiana y antioxidante)
de los extractos obtenidos de las cuatro especies de ortiga.
1.4.Variables
1.4.1. Variable independiente

Métodos de extracción (extracción hidroalcohólica y extracción Soxhlet).

Especies de ortiga (U. dioica, U. urens, U. leptophylla, U. baccifera).
1.4.2. Variable dependiente

Actividad antioxidante

Actividad antimicrobiana

Fenoles totales
9
CAPÍTULO II
METODOLOGÍA
2.1.Materiales
2.1.1. Material vegetal
•
Urtica dioica
•
Urtica urens
•
Urtica leptophylla
•
Urera baccifera
2.1.2. Material biológico
Cepas bacterianas de:
•
Staphylococcus aureus ATCC 12600
•
Escherichia coli ATCC 11775
•
Listeria monocytogenes ATCC 19115
•
Bacillus cereus ATCC 10876
2.1.3. Reactivos de laboratorio
 Medio PCA (Plate Count Agar)
 Agua de peptona
 Resazurina
 Trolox (ácido 6-hidroxi-2,5,7,8-tetrametilcromano-2-carboxílico)
 Folin-Ciocalteu
 Carbonato de sodio (Na2CO3)
 DPPH (2,2-difenil-1-picrilhidracilo)
10
 Etanol al 96%.
 Metanol 99%
 Solución salina
 Gentamicina
 Agua destilada
2.1.4. Equipos de laboratorio

Cámara de flujo laminar

Incubadora

Refrigeradora

Autoclave

Espectofotómetro

Extractor Soxhlet

Balanza analítica

Vórtex

Rotavapor

Plancha de calentamiento

Plancha de agitación
2.1.5. Instrumentos de laboratorio

Pipeta volumétrica (1 mL)

Embudos de vidrio

Balones de aforo (10,50, 100 mL)

Piseta

Cajas Petri

Lámparas de alcohol

Tubos de ensayo con tapa rosca

Frascos herméticos de vidrio oscuro

Frascos ámbar con tapa (250 mL)
11

Tubos Eppendorf

Agitadores magnéticos

Vasos de precipitación (50, 100 mL)

Micropipeta (100 – 1000 µL)

Micropipeta (20 – 200 µL)

Puntas estériles

Película adhesiva

Asa de Drigalsky

Asa bacteriológica

Caja de microtitulación de 96 pocillos

Gradilla

Papel filtro

Espátula

Pinzas

Matraz Erlenmeyer (100, 250 mL)
2.1.6.
Insumos
•
Mandil
•
Guantes
•
Cepillo de lavar equipos
•
Papel aluminio
•
Fósforos
•
Lápiz graso
•
Marcadores
2.2. Métodos
2.2.1. Tipo de investigación
12
La presente investigación es de carácter cuantitativo, puesto que pretende analizar datos
cuantitativos relacionados con diversas variables, dado que se busca identificar la
capacidad inhibitoria y antioxidante de cuatro especies distintas de ortiga, de diferentes
zonas del país.
2.2.2. Población y muestra
La población considerada para esta investigación son las cuatro especies de ortiga
obtenidas en las parroquias Macas y Cotaló.
2.2.3.
Obtención de los extractos
2.2.3.1. Obtención de la muestra
La especie Urtica baccifera fue recolectada en una propiedad privada ubicada en la
parroquia San Isidro, perteneciente al cantón Morona, provincia de Morona Santiago. Las
especies Urtica urens, Urtica dioica y Urtica leptophylla fueron recolectadas en una
propiedad privada ubicada en la parroquia Cotaló, cantón Pelileo, provincia de
Tungurahua. Las especies fueron herborizadas y entregadas al herbario “Misael Acosta
Solís” de la Universidad Técnica de Ambato, para confirmar que las especies
corresponden a las descritas anteriormente. (ANEXO A). Adicionalmente, se solicitó la
autorización de investigación científica al Ministerio del Ambiente y Agua, para poder
proceder con la recolección de las especies vegetales. (ANEXO B)
2.2.3.2. Preparación de la muestra
Se seleccionaron las plantas que no presentan daños en sus hojas o tallos. Se cortaron
ramas completas (tallo, hojas y flores) cuyo tamaño varío entre los 25 y 50 cm. Las
especies recolectadas se desinfectaron con una solución de hipoclorito de sodio (5%) y
agua destilada, se enjuagaron con agua y se secaron en un lugar oscuro a una temperatura
aproximada de 25 a 30 °C. Finalmente, el material vegetal seco fue triturado en una
licuadora hasta obtener un polvo fino, que se lo almacenó en fundas plásticas.
13
2.2.3.3. Extracción hidroalcohólica
Se tomaron 50 g del polvo y se lo mezcló con 200 mL de etanol al 96% en un frasco
resistente al calor; se dejará reposar en la incubadora a 37 °C por 72 h. Después, se filtró
el extracto obtenido con papel filtro. Posteriormente, se evaporó el etanol en el rotavapor
a una temperatura de 68°C y 240 revoluciones. Según lo ejecutado por Salih, (2014), el
extracto obtenido se secó por completo en una incubadora a 40 °C por 6 h, Este proceso
se lo realizó por duplicado y se repitió con todas las especies de ortiga.
2.2.3.4.
Extracción Soxhlet
Con papel filtro se formaron cartuchos de 5,5 x 7,5 cm, en el cual se depositará 25 g de
material vegetal pulverizado. Luego, se montó el equipo de extracción Soxhlet, en el
interior del tubo extractor se colocaron dos cartuchos y en el balón se vertió 300 mL de
metanol al 99% junto con 3 perlas de ebullición. Posteriormente, se calentó la plancha a
una temperatura de 110 °C y se inició el flujo de agua del condensador. Este proceso se
mantuvo durante 18 h hasta que se redujo visiblemente la coloración del solvente más el
extracto. Finalmente, se evaporó el metanol en el rotavapor a una temperatura de 68°C y
240 revoluciones. El proceso se lo realizó por duplicado con las cuatro especies de ortiga.
2.2.3.5.
Almacenamiento
Los extractos obtenidos se recolectaron en frascos herméticos de vidrio oscuro y se los
almacenó en un congelador a una temperatura de -20°C.
14
2.2.4. Concentración Mínima Inhibitoria (CMI) y Concentración Mínima
Bactericida (CMB)
2.2.4.1. Diluciones de los extractos
Las diluciones se realizaron en tubos Eppendorf correctamente esterilizados. Se utilizó
agua de peptona como diluyente, la mezcla se homogeneizó en un vórtex a una velocidad
de 30 rpm por 5 minutos. Las concentraciones iniciales fueron de 100 μg/mL, 80 μg/mL,
60 μg/mL, 40 μg/mL, 20 μg/mL, 10 μg/mL. Posteriormente, se realizó una segunda y
tercera secuencia de diluciones, dependiendo de los resultados obtenidos para medir la
CMI.
2.2.4.2. Activación de las cepas
En lo que respecta a las cepas bacterianas, se realizó la activación de las mismas siguiendo
las instrucciones de la casa comercial. Luego se realizó la siembra en el medio de cultivo
PCA (Plate Count Agar), siguiendo la técnica de estriación por el método escocés, con
ayuda de un asa bacteriológica. Posteriormente, las cajas Petri correctamente rotuladas se
incubarán a 37ºC por 24 horas, en forma invertida.
2.2.4.3.
Concentración Mínima Inhibitoria (CMI)
2.2.4.3.1. Preparación del inóculo.
Se realizó la estandarización hasta 0,5 de la escala de MacFarland (1,5 x 10 8 UFC/ml),
siguiendo la metodología planteada por Alcaide et al., (2017).
15
2.2.4.3.2. Preparación de las placas de microdilución
Para el desarrollo de este apartado de utilizó una placa de microtitulación de 96 pocillos
(8x12). Se depositaron 100 μL de las diluciones previamente preparadas junto con 100
μL del inóculo estandarizado, como control positivo se utilizó gentamicina y como
control negativo agua de peptona, esto se lo puede apreciar en la figura 3. Seguidamente,
las placas se cubrieron con su tapa correspondiente y se incubaron a 37°C por 24 horas.
Este procedimiento se lo realizó por triplicado con todos los extractos y bacterias
Posteriormente, se colocó en cada pocillo 20 μL de una solución de resazurina al 0.02%
y se incubó por 2 horas. Trascurrido este tiempo se observó el cambio de coloración en
cada pocillo, lo que indica la presencia o ausencia de crecimiento bacteriano (Ortega,
2018). Por último, dependiendo de los resultados de la prueba colorimétrica de resazurina
se realizaron diluciones a menor escala entre distintos rangos de concentración y se repitió
el proceso descrito anteriormente (Figura 4). Esto se lo realizó en dos ocasiones y en la
última cuya escala fue menor, se identificó el pocillo que no presentó crecimiento
bacteriano, el cual fue considerado para la CMI.
Figura 3 Representación gráfica de la ´primera fase de la preparación de la placa
de microtitulación
Fuente: Elaboración Propia
16
Figura 4 Representación gráfica de la segunda y tercera fase de la preparación de la
placa con distintas diluciones.
Fuente: Elaboración Propia
2.2.4.4. Concentración Mínima Bactericida (CMB)
En este apartado, primero se prepararon cajas Petri con medio PCA, correctamente
rotuladas. Luego, se homogeneizó con la micropipeta el contenido de los pocillos que no
presenten turbidez. Se tomó el inoculo homogeneizado de cada pocillo y se realizó una
siembra por con un asa bacteriológica sobre las placas preparas. Consecutivamente, se
incubó a 37°C y se leyó a las 24, 48 y 72 horas. Finalmente, identificó en las placas la
ausencia de colonias bacterianas. (García et al., 2008, Robalino, 2019).
17
Figura 5 Representación de la metodología aplicada en la evaluación de la actividad
antimicrobiana.
Fuente: Elaboración Propia
2.2.5. Actividad antioxidante
La evaluación de la actividad antioxidante de los diversos extractos se llevó a cabo
utilizando 1,1-difenil-2-picrilhidrazilo (DPPH). Brevemente, se preparó una solución
stock de cada extracto a una concentración 3000 µg/mL, para lo cual se mezclaron 30 mg
de extracto con 10 mL de una solución metanol-agua en una proporción 50:50 (v/v). Se
realizaron diluciones adicionales en serie, de 2000, 1500, 1000, 500 y 250 µg/mL, a partir
de la solución madre. Se preparó una solución de DPPH al 150 µM, utilizando como
diluyente una solución metanol-agua en una proporción 80:20 (v/v). Se utilizó una placa
de microtitulación de 96 pocillos, en los cuales se mezclaron 20 µL de las diluciones con
180 µL de solución de DPPH. La mezcla de reacción se agitó y luego se mantuvo en un
cuarto oscuro a temperatura ambiente durante 40 min (Mzid et al., 2017; Pazmiño, 2008).
Adicionalmente, para la curva de calibración se utilizó como estándar una solución madre
de Trolox de concentración 500 μM para lo cual, se prepararon diluciones en metanolagua (50:50), hasta alcanzar concentraciones de 50, 100 200, 300, 400 y 500 μM. El
control se lo consiguió al mezclar 180 µL de DPPH con 20 µL de metanol-agua (50:50).
18
El blanco se conformó por 180 µL del diluyente de DPPH con 20 µL del diluyente del
Trolox o extractos. La densidad óptica se midió a 517 nm utilizando un espectrofotómetro
(Telenchana, 2019; Rets’epile et al., 2020). Se usó la siguiente ecuación para calcular el
porcentaje de actividad eliminadora de radicales DPPH de los extractos.
𝑨 −𝑨
% 𝑰𝒏𝒉𝒊𝒃𝒊𝒄𝒊ó𝒏 𝑫𝑷𝑷𝑯 = [𝟏 − ( 𝑨𝒎−𝑨 𝒃)]*100
𝒄
𝒃
Donde,
Am: Absorbancia de la muestra
Ab: Absorbancia del blanco
Ac: Absorbancia del control
Cada experimento se llevó a cabo por triplicado y se usó los promedios de los tres valores
para calcular los valores de IC50.
2.2.6. Cuantificación de fenoles totales
El contenido fenólico se evaluó por medio de método de Folin y Ciocalteu. Para ello, en
una placa de microtitulación de 96 pocillos se mezclaron 10 μL de muestra con 130 μL
de agua destilada y10 μL del reactivo Folin-Ciocalteu (2 N). Trascurridos 6 minutos se
añadieron 100 µL de carbonato de sodio al 7% (p/v). Posteriormente, en un lugar oscuro
y a temperatura ambiente se incubaron las placas durante 90 minutos. Finalmente se midió
la absorbancia a 750 nm. La curva de calibración se la realizó con diluciones de 10 a 100
mg/L de ácido gálico (GAE). El procedimiento se lo realizó por triplicado con cada una
de las muestras y los resultados se expresaron como equivalentes de miligramos de ácido
gálico por gramo de peso seco de la muestra (mg GAE/g DW).
19
CAPÍTULO III
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
3.1. Análisis y discusión de resultados
3.1.1. Rendimiento de los extractos
Los extractos de las cuatro especies de ortiga (U. dioica, U. urens, U. leptophylla y U
baccifera) se obtuvieron por medio de una extracción con disolventes (etanol y metanol).
La extracción hidroalcohólica presentó un mayor rendimiento para U. leptophylla, el cual
fue de 1,403%, mientras que, la extracción Soxhlet cuyo disolvente fue metanol, alcanzó
un rendimiento máximo de 2,487% para U. dioica. En la tabla 3, se aprecia el rendimiento
de cada especie vegetal. De acuerdo con Hernández et al., (2020), la bioactividad y el
rendimiento de los compuestos bioactivos de una extracción depende de diversos factores,
tales como, la polaridad del disolvente, la temperatura, el tiempo de extracción, la
composición química del compuesto extraíble y la relación sólido-líquido. Según,
Bañuelos et al., (2018), los extractos vegetales contienen monoterpenos, diterpenos,
triterpenos, tetraterpenos, sesquiterpenos,y politerpenos, además una gran cantidad de
radicales funcionales como cetonas, carburos, aldehídos, alcoholes, éteres, ésteres,
peróxidos y fenoles que confieren la capacidad biológica a las plantas.
Tabla 3 Rendimiento de los extractos de los diferentes tipos de ortiga
Especies
Rendimiento de los extractos (%p/v)
Etanólico-Macerado
Metanólico-Soxhlet
U. dioica
1,318c ± 0,11
2,487a ± 0,08
U. urens
0,974d ± 0,04
2,150b ± 0,1
U. leptophylla
1,403c ± 0,09
2,340a,b ± 0,08
U. baccifera
0,608e ± 0,02
1,336c ± 0,09
Nota: Los valores presentados en la tabla representan la media de los rendimientos
obtenidos por duplicado con su respectiva desviación estándar. Las letras representan la
20
diferencia significativa entre el rendimiento de los diferentes extractos (P ≤ 0.05).Los
análisis estadísticos se llevaron a cabo con Minitab.
Mediante el análisis de varianza ANOVA y la prueba de rangos múltiples Tukey, se
identificó que los factores de estudio presentan un efecto estadísticamente significativo
sobre el rendimiento, a un de nivel de confianza del 95% (p < 0,05). El análisis estadístico
ejecutado se lo puede apreciar en el ANEXO C. El rendimiento derivado de la extracción
hidroalcohólica muestra valores estrechamente bajos, la alta concentración de etanol
(96%) puede ser la responsable de este hecho, dado que, en una previa investigación
ejecutada en Túnez, al utilizar etanol al 70% obtuvieron un rendimiento de 4.768 %
(Mzid et al., 2017). Por otra parte, la extracción con metanol al 99% muestra un
rendimiento superior a su contraparte. Stanojević et al., (2016), en su respectiva
investigación obtuvo un rendimiento del 18,25% y especifica que concentraciones de
metanol superiores al 50 % v/v generan una disminución significativa en el rendimiento.
Asimismo, la variación existente entre los rendimientos de los extractos se atribuye a las
polaridades de los diferentes compuestos presentes en las distintas especies (Ahmed et
al., 2022). Por otra parte, el tamaño de las partículas de la matriz vegetal también puede
influir en la eficiencia de la extracción, mientras menor sea el tamaño de las partículas
los solventes penetrarán de mejor manera, facilitando la difusión de los solutos (Zhang
et al., 2018).
3.1.2. Actividad antioxidante
La actividad antioxidante se evaluó por medio del método de captación de radicales libres
DPPH. Los resultados basados en el porcentaje de inhibición de radicales DPPH de los
extractos de las distintas especies vegetales se evaluó a concentraciones variables de 250
µg/mL hasta 3000 μg/mL. En la tabla 4, se presentan los valores correspondientes a esta
actividad bióloga.
21
Tabla 3 Porcentaje de inhibición de los radicales de DPPH de los extractos de
diferentes especies de ortiga
Extracto
Porcentaje de Inhibición por especie (%)
Concentración
(μg/mL)
U. dioica
U. urens
U. baccifera
6,78wx
Etanólico
250
22,77rst
± 1,77
5,91wx
± 0,36
Macerado
500
33,41klm ± 0,63 24,03pqrst ± 0,59 10,40uvw ± 0,68
13,48uv
± 1,07
1000
46,81hi
27,82opq ± 1,07
1500
49,80fgh ± 1,30
35,93kl
± 1,84 26,95opq ± 1,19
35,86kl
2000
54,37ef
± 1,54
43,03ij
± 2,07 33,02lmn ± 0,72
49,88fgh ± 0,96
3000
62,49d
± 2,49 53,03efg ± 0,85
47,99h
± 0,90
57,13e
± 1,66
Metanólico
250
3,70x
± 1,27 26,02opqr ± 1,04
3,08x
± 0,46
35,43jk
± 1,31
Soxhlet
500
6,62wx
± 1,70 35,18klm ± 2,80
9,78vw
± 1,44
46,89gh
± 0,71
1000
15,17u
± 0,74
42,80 ij
± 1,97
15,24u
± 1,41
65,92c
± 1,29
1500
25,79opqr ± 1,16
55,66e
± 0,93 20,25pqrst ± 3,24
71,10b
± 1,79
2000
30,72mno ± 0,74
62,66d
± 1,97
23,09
± 2,24
73,09ab
± 1,29
3000
41,65j
67,28cd
± 2,01
35,80kl
± 2,34
76,83a
± 0,93
± 1,78
13,48uv
U. leptophylla
± 1,30
± 1,52 28,37nop ± 0,83
± 1,29
21,12st
± 1,48
Porcentaje de inhibición de los radicales de DPPH de los extractos de diferentes
especies de ortiga.
Nota. El ensayo se realizó por triplicado. Las letras representan la diferencia significativa
entre los porcentajes de inhibición de DPPH (P ≤ 0.05).
A través del análisis de varianza ANOVA y la prueba de rangos múltiples Tukey, se
identificó que los factores estudiados exhiben un efecto estadísticamente significativo
sobre los porcentajes de eliminación de DPPH, a un nivel de confianza del 95% (p< 0,05).
El análisis estadístico se lo puede evidenciar en el ANEXO D.
22
± 0,49
Tabla 4 Capacidad antioxidante en equivalentes Trolox de las matrices vegetales
Extracto
Matriz vegetal
% de
µmol Equivalente
Inhibición
Trolox/L
U. dioica
62,49 ± 2,49c
U. urens
53,03 ± 0,85e
U. leptophylla
33,02 ± 0,72f
U. baccifera
57,13 ± 1,66d
U. dioica
41,65 ± 1,29g
Metanólico-
U. urens
67,28 ± 2,01b
Soxhlet
U. leptophylla
35,80 ± 2,34h
U. baccifera
76,83 ± 0,93a
Etanólico
356,02 ±
297,43 ±
8,57c
263,08 ±
323,02 ±
0,95f
1,91e
5,72d
225,90 ±
382,50 ±
3,72g
204,19 ±
435,80 ±
0,93h
1,86b
2,79a
Nota. Los valores del porcentaje de inhibición de DPPH son resultado del promedio de 3
repeticiones. Mientras que, el resultado de expresado en µmol Equivalente Trolox/L se
obtuvo por medio de la media de 2 repeticiones, se presenta su respectiva desviación
estándar. Las letras representan la diferencia significativa entre los porcentajes de
inhibición de DPPH (P ≤ 0.05).
Mediante el análisis de varianza ANOVA y la prueba de rangos múltiples Tukey, se
demostró que los factores analizada exteriorizan un efecto estadísticamente significativo
sobre los porcentajes de eliminación de DPPH y los µmol de equivalente Trolox a un
nivel de confianza del 95% (p< 0,05). El análisis estadístico se lo puede evidenciar en el
ANEXO E.
23
Figura 6 Porcentajes de Inhibición de DPPH a distintas concentraciones de los
extractos vegetales
Porcentaje de inhibición DPPH
90
80
Inhibición DPPH (%)
70
60
50
40
30
20
10
0
ET.Ud
ET.Uu
ET.Ul
ET.Ub
MT.Ud
MT.Uu
MT.Ul
MT.Ub
Extractos
250 µg/mL
500 µg/mL
1000 µg/mL
1500 µg/mL
2000 µg/mL
3000 µg/mL
Nota: ET.Ud: Extracto etanólico de U. dioica; ET.Uu: Extracto etanólico de U. urens;
ET.Ul: Extracto etanólico de U. leptophylla. ET.Ub: Extracto etanólico de U. baccifera.
MT.Uu: Extracto metanólico de U. dioica; MT.Uu: Extracto metanólico de U. urens;
MT.Ul: Extracto metanólico de U. leptophylla. MT.Ub: Extracto metanólico de U.
baccifera.
La técnica DPPH se basa en la capacidad que poseen los compuestos antioxidantes de las
muestras para neutralizar los radicales libres DPPH, por medio de la transferencia de
electrones, convirtiéndolos en compuestos estables (Bouabid et al., 2020). Todos los
extractos analizados presentaron capacidad antioxidante, lo que demuestra la capacidad
que poseen los compuestos fitoquímicos para donar un átomo de hidrógeno y neutralizar
los radicales (Cidade et al., 2020). Sin embargo, el porcentaje varió considerablemente
dependiendo de la especie vegetal y el medio de extracción. En la figura 6 se puede
evidenciar el porcentaje de inhibición es directamente proporcional con la concentración
de los extractos. Los extractos hidroalcohólicos arrojaron a U. dioica como la mejor
24
especie para inhibir radicales libres, con un porcentaje máximo de 62,49 ± 2,49 % a la
concentración del extracto más alta (3000 mg/mL), seguidamente se encuentran U.
baccifera, que presenta un alto índice de similitud con la anterior, alcanzando una
diferencia inferior al 6%. Luego se encuentra U. urens con un porcentaje de 53,03±0,85%
y por último U. leptophylla, no consiguió superar el 50% de inhibición. En el caso de los
extractos metanólicos obtenidos mediante extracción Soxhlet, U. baccifera demostró ser
la especie con un más alto nivel antioxidante logrando un 76,83 ± 0,93%. U. leptophylla
presentó valores con rangos bajos en los dos métodos de extracción (Tabla 4). El
comportamiento de los diferentes extractos es muy similar al alcanzado en informes
anteriores, Rets’epile et al., (2020), en su investigación llevada a cabo con diferentes
solventes, identificó que el extracto metanólico de U. urens alcanza un porcentaje de
inhibición de 73.84±6.82%. En contraste, Mzid et al., (2017), al utilizar un extracto
etanólico de U. urens obtuvo un porcentaje depurador de 93,56 %, sin embargo, el patrón
de referencia fue el ácido ascórbico. En el mismo contexto, Semalty et al., (2010), evaluó
esta actividad biológica con raíces de U. dioica, con un extracto etanólico y metanólico,
arrojando un porcentaje inhibitorio de 45,03± 0,0005% y 46,71 ± 0,0011%,
respectivamente. De igual modo, en un análisis llevado a cabo en Brasil, Gindri et al.,
(2014) probaron que U. baccifera consigue inhibir un 12.30 ± 2.09% a una concentración
de 250 mg/mL. Estos resultados se asemejan considerablemente con los obtenido en la
presente investigación. En la tabla 5, se puede evidenciar el resultado del porcentaje de
inhibición a mayor concentración de extracto, reflejado en equivalentes Trolox, el cual se
utilizó como patrón de referencia en la construcción de la curva de calibración. De igual
manera, en la tabla 6, se evidencia la concentración necesaria para neutralizar el 50% de
los radicales libres, determinando que el extracto metanólico de U. dioica y U.
leptophylla, junto con el extracto etanólico de esta última, inhiben el 50% de los radicales
libre de DPPH con concentraciones superiores a los 3000 ug/mL.
25
Tabla 5 Concentración de extractos necesaria para inhibir el 50% de radicales
DPPH.
Extractos
IC50 (ug/mL)
Etanólico-Macerado
Metanólico-Soxhlet
U. dioica
1334,39 ± 1,39
>3000
U. urens
2665,75 ± 0,83
1165,56 ± 3,39
U. leptophylla
>3000
>3000
U. baccifera
2407,24± 1,49
468,16 ± 1,27
De acuerdo con Köksal et al., (2016), la capacidad antiradicales se debe principalmente
a la cantidad de compuestos fenólicos distribuidos en las plantas, que detienen las
reacciones de oxidación en cadena y actúan como quelantes de metales, agentes
reductores, mensajeros químicos, reguladores fisiológicos e inhibidores del ciclo celular.
De igual manera, Ahmed et al., (2022) afirman que el solvente utilizado en la extracción
es el factor más influyente al momento de extraer compuestos bioactivos en una técnica
de extracción sólido-líquido, esto debido a la influencia que ejercen las polaridades de los
solventes, lo que explicaría la variabilidad existente en los resultados. Asimismo, en
diversas investigaciones, el metanol ha demostrado una buena eficiencia en una
extracción sólido-líquido, dado que este diluyente no degrada los compuestos fenólicos,
debido a que no promueve la formación de peróxido de hidrógeno (Borges et al., 2020).
Adicionalmente, los resultados también estarían influenciados por la procedencia, época
de recolección, tratamiento y calidad de las especies vegetales, puesto que son factores
determinantes en el rendimiento y concentración de compuestos fenólicos (Cuti &
Prado, 2019).
3.1.3. Compuestos fenólicos totales
La cantidad de compuestos fenólicos presentes en las ortigas está influenciada por el
estado vegetativo, la época de cosecha, el genotipo, la variedad, el suelo, el clima, el
almacenamiento, e incluso depende significativamente de las partes de la planta, las hojas
son la sección más rica en estos compuestos bioactivos (Kregiel et al., 2018). Garofulić
et al., (2021) & Zeković et al., (2017), mencionan que en las hojas de ortiga los
principales compuestos fenólicos son la rutina, ácido sinápico, cafeico, clorogénico, p26
ácido cumárico, naringenina y naringina, sin embargo, Garofulić et al., (2021) informan
que los ácidos cinámicos y flavonoles abundan en las zonas aéreas de las ortigas.
La cuantificación de compuesto fenólicos se llevó a cabo utilizando el método
colorimétrico de Folin-Ciocalteu. La determinación de estos compuestos se ejecutó en
base a una curva estándar de ácido gálico (GAE), que se diseñó en concentraciones
variables de 10 a 100 GAE.mg/L. En la tabla 7 se muestra los resultados calculados en
base a la ecuación A750 nm = 0,0027 [GAE] + 0,113 (R2 = 0,9989). En diversos estudios se
ha probado que el etanol y metanol al ser solventes polares presentan una excelente
afinidad por los compuestos bioactivos (Stanojević et al., 2016). Sin embargo, los
valores obtenidos muestran que los extractos etanólicos superan ampliamente a los
extractos metanólicos, en relación al índice de compuestos fenólicos en relación (Tabla
7). De acuerdo con, (Flórez et al., 2022) esta variación puede ser debido al método de
extracción Soxhlet, dado que, la alta temperatura de trabajo puede generar la destrucción
de productos químicos termolábiles y la evaporación del solvente, produciendo impurezas
indeseables en el extracto. Kowalska et al., (2021) avalan esta teoría, puesto que, en su
respectiva investigación trabajaron a temperaturas de ≤ 35 °C y 105 °C, logrando mejores
resultados a menor temperatura, los autores afirman que el tratamiento térmico moderado
puede haber determinado la escisión de los enlaces glucosídicos de los azúcares fenólicos
y la producción de aglicones fenólicos, que reaccionan con mayor facilidad al reactivo de
Folin-Ciocalteu. En la presente investigación se identificó que el extracto etanólico de U.
dioica presenta un mayor contenido polifenólico (87,840 ± 2,835 mg GAE/g), en
contraste, en un análisis preliminar Kowalska et al., (2021) al usar con alcohol anihidro
a 50°C alcanzaron valores de 31,9 mg GAE/L, lo que refuerza la teoría de que la
temperatura de extracción influye en directamente en la cantidad de compuestos
bioactivos. Como se mencionó en el apartado anterior, los compuestos fenólicos son los
principales responsables de la capacidad antioxidante, y eso se puede comprobar al
comparar los resultados de la tabla 4 y 5 con la tabla 6, lo que demuestra su íntima
relación.
En comparación con estudios previos, en Irán se obtuvieron valores bajos con esta especie
(24.1 mg GAE/g) (Kukrić et al., 2012a), sin embargo, en Bosnia reportan 208.37 mg
GAE/g (Pourmorad et al., 2006), los dos estudios se realizaron con extractos etanólicos.
Por otro lado, en Turquía, la extracción Soxhlet con metanol presentó una cantidad de
27
compuestos fenólicos de 332,19 ± 2,79 mg GAE/g (Özkan et al., 2011), lo que supera
ampliamente a los obtenidos en este estudio. Estos resultados se acoplan a lo planteado
por Kregiel et al., (2018), quienes indican que el clima y el lugar de procedencia de las
muestras influye en el rendimiento de compuestos activos. Al respecto, el contenido
fenólico de U. baccifera se asemeja al de Moncayo et al., (2021) que fue de 61.55 ± 1.54
mg GAE/mL. Con respecto a U. leptophylla no se encontraron estudios que hayan
evaluado su capacidad antioxidante y compuesto fenólicos.
Tabla 6 Contenido de fenoles totales de los extractos provenientes de cada especie
vegetal.
Extracto
Fenoles totales
Matriz vegetal
Absorbancia (750 nm)
U. dioica
0,350 ± 0,008
87,840
±
2,835a
Etanólico-
U. urens
0,306 ± 0,004
70,160
±
1,728c
macerado
U. leptophylla
0,324 ± 0,002
41,111
±
0,740e
U. baccifera
0,338 ± 0,003
83,333
±
1,111b
U. dioica
0,187 ± 0,002
27,435
±
0,804f
Metanólico-
U. urens
0,303 ± 0,004
70,494
±
1,464c
Soxhlet
U. leptophylla
0,166 ± 0,003
19,654
±
1,101g
U. baccifera
0,254 ± 0,002
52,136
±
0,756d
(mg GAE/g)
Nota. Los valores de absorbancia son resultado del promedio de 3 repeticiones. Mientras
que, el resultado de fenoles totales (mg GAE/g) se consiguió por medio de la media de 3
repeticiones. Las letras representan la diferencia significativa entre los porcentajes de
inhibición de DPPH (P ≤ 0.05).
Mediante el análisis de varianza ANOVA y la prueba de rangos múltiples Tukey, se
demostró que los factores analizados manifiestan un efecto estadísticamente significativo
sobre la cantidad de fenoles totales, a un nivel de confianza del 95% (p< 0,05). El análisis
estadístico se lo puede evidenciar en el ANEXO F.
28
3.1.3. Actividad antimicrobiana
3.1.3.1. Concentración Mínima Inhibitoria y Concentración Mínima Bactericida
Las especies de la familia Urticaceae presentan un alto índice de actividad antimicrobiana
frente a bacterias Gram-positivas y Gram-negativas, comparable con agentes
antimicrobianos como el nitrato de miconazol, la amoxicilina, la ofloxacina y la
netilmicina (Kregiel et al., 2018). Su capacidad antimicrobiana se debe principalmente a
que son ricas en terpenoides, carotenoides, flavonoides, esteroles y poseen un elevado
número de polifenoles (Đurović et al., 2017).
La evaluación de actividad antimicrobiana se llevó a cabo mediante el método de
microdilución en placas de 96 pocillos basado en resarzurina. Se presenció efectos
inhibidores significativos por parte de los extractos etanólicos y metanólicos de las
distintas especies de ortiga, frente a la S. aureus ATCC 12600, E. coli ATCC 11775, L.
monocytogenes ATCC 19115, B. cereus ATCC 10876. El análisis se ejecutó en 3 fases,
partiendo de concentraciones de extracto de 10 µg/mL a 100 µg/mL, hasta en posteriores
diluciones alcanzar la CMI.
Tabla 7 Concentración mínima inhibitoria de los diferentes extractos frente a cuatro
cepas bacterianas.
CMI (μg/mL)
Extractos
Matriz vegetal
E. coli
Etanólico
Metanólico
Soxhlet
S. aureus
L. monocytogenes
B.cereus
U. dioica
52,00 ±
0,87c 31,50 ± 0,87ab 13,77 ±
0,46d
17,00 ± 0,87d
U. urens
33,00 ±
0,87d
41,50 ±
0,87a
26,00 ± 0,00c
U. leptophylla 53,50 ± 0,00bc 28,50 ± 0,87bc 23,00 ±
0,87c
31,50 ± 0,87a
13,00 ± 0,87e
U. baccifera
27,00 ±
0,87e
13,03 ± 0,40e
21,50 ±
0,87c
16,00 ± 0,35e
U. dioica
52,00 ±
0,87c
48,50 ± 0,87a
13,03 ±
0,40d
16,20 ± 0,35e
U. urens
54,00 ±
0,00b
11,00 ± 0,00e
13,77 ±
0,46d
13,27 ± 0,40e
U. leptophylla 66,00 ±
0,00a
26,00 ± 0,00cd 28,00 ±
0,87b
16,50 ± 0,87e
16,00 ±
0,35f
16,70 ± 0,52d
0,87b
28,50 ± 0,87b
U. baccifera
26,50 ±
Nota. Los valores de la CMI son resultado de la media de 3 repeticiones. Las letras
representan la diferencia significativa entre la CMI evaluada para cada cepa microbiana.
(P ≤ 0.05).
29
Mediante el análisis de varianza ANOVA y la prueba de rangos múltiples Tukey, se
demostró que los factores analizados manifiestan un efecto estadísticamente significativo
la CMI de cada cepa bacteriana, a un nivel de confianza del 95% (p< 0,05). El análisis
estadístico de cada bacteria se lo puede evidenciar en el ANEXO F.
Tabla 8 Concentración mínima bactericida de los diferentes extractos frente a cuatro
cepas bacterianas.
Extractos
Etanólico
Metanólico
Material
CMB (μg/mL)
vegetal
E. coli
S. aureus
L. monocytogenes
B.cereus
U. dioica
≥52,00
≥31,50
≥14,30
≥16
U. urens
≥34,50
≥14,50
≥41,50
≥27
U. leptophylla
≥53,50
≥28,50
≥23,00
≥32
U. baccifera
≥28,50
≥13,50
≥22,50
≥16
U. dioica
≥52,00
≥48,50
≥13,50
≥17
U. urens
≥54,00
≥ 12,50
≥14,30
≥13
U. leptophylla
≥67,50
≥26,00
≥28,00
≥16
U. baccifera
≥17,50
≥17,3
≥27,50
≥27
Los valores establecidos en la tabla 8, muestran que existe diferencia significativa entre
los extractos vegetales con cada uno de los patógenos. Asimismo, se identifica que el
extracto etanólico (EtOH) y metanólico (MtOH) de U. leptophylla necesita una
concentración más elevada para inhibir el desarrollo de E. coli (66,0 ±0,00 µg/mL) y B.
cereus (31,50 ± 0,87 µg/mL), respectivamente. En el mismo contexto el extracto
metanólico de U. dioica, relaciona 48,50±0,87 µg/mL para S. aureus y el extracto
etanólico de U. urens, 41,50±0,87 µg/mL, frente a L. monocytogenes. De igual manera,
U. baccifera demostró ser excepcional para inhibir a E. coli, dado que, requirió de las
menores concentraciones tanto para el extracto metanólico como etanólico (16,00 ± 0,35;
27,00 ± 0,87 µg/mL). En el caso de S. aureus, el EtOH de U. urens y U. baccifera junto
con el MtOH de U. urens, inhibieron a una menor concentración (13,00±0,87;
13,03±0,40; 11,00±0,00 µg/mL). L. monocytogenes fue contrarrestada a una
concentración de 13,77±0,46 µg/mL de EtOH de U. dioica y por último EtOH de U.
baccifera junto con MtOH de U.dioica U.urens y U. leptophylla inhabilitaron a B.cereus
(16,00±0,35;16,20±0,35;13,27±0,40; 16,50±0,87 µg/mL). La CMB presentó resultados
30
muy similares a los de la CMI, con ligeras diferencias en la concentración de los extractos
(Tabla 9). La diferencia de la sensibilidad de las bacterias Gram-positivas (S.aureus, L.
monocytogenes, B. cereus) y Gram-negativas (E.coli) puede atribuirse a la diferencia
existente entre sus morfologías constitucionales, las bacterias gram-negativas presentan
una membrana fosfolipídica externa que contiene los componentes lipopolisacáridos
estructurales, esto permite que la pared celular sea menos permeable a compuestos
antimicrobianos; por lo tanto, las bacterias Gram-positivas al poseer únicamente una capa
externa de peptidoglicano no presentan impermeabilidad, siendo más susceptibles a
dichos compuestos (Mzid et al., 2017;Kaushik et al., 2015). De igual manera, Martín,
(2018), menciona que, un mecanismo de inhibición de los extractos se basa en los
componentes polifenólicos, los cuales se adhieren al ADN de las bacterias, impidiendo la
síntesis de proteínas y generación de compuesto, lo que provoca una ruptura de la
membrana y posteriormente la muerte celular.
Los valores de la CMI de EtOH de U. dioica frente a S. aureus (31,50±0,87 µg/mL) tienen
gran similitud con los obtenidos por Belabbas, (2020), que fueron de 0,039 mg/mL frente
a la cepa S. aureus ATCC 29213. Sin embargo, existe una alta variación con respecto a
la CMI alcanzada por el mismo autor frente a L. monocytogenes ATCC 7644 (2.5 mg/mL)
y B. cereus ATCC 10876 (0.156 mg/mL) y E. coli ATCC 10536 (1,25 mg/mL). Esta
tergiversación puede ser resultado de las cepas bacterianas utilizadas, dado que Kukrić
et al., (2012), realizó un experimento con los mismos parámetros (EtOH de U. dioica)
frente a E. coli del tracto urinario y E. coli de los alimentos, obteniendo resultados
diferentes, 72.43 y 36, 21 µg/mL, respectivamente. Dichos valores se asemejan más a los
obtenido en esta investigación. En un experimento ejecutado en la India, determinaron
que el MtOH de U. dioica logra una CMI para E. coli a 125 µg/mL y 250 µg/mL para S.
aureus (Rolta et al., 2020). El estudio de Mzid et al., (2017) reportó que los EtOH de U.
urens exhiben actividad altamente bactericida frente a S. aureus, B. subtilis y E. coli a
una concentración de 150 µg/mL. Según, la actividad antimicrobiana de EtOH de U.
urens está influenciada por los componentes de tipo terpenos y flavonoides, puesto que
en el análisis fitoquímico evidenciaron la presencia de triterpenos y flavonoides (Salem
et al., 2021). Como se puede evidenciar, existe gran incertidumbre conforme a los
resultados planteados por distintos autores, Kregiel et al., (2018) reafirma lo propuesto
por Cuti & Prado, (2019) y sugiere que las variaciones pueden estar asociadas con la
hábitat de la planta, su ubicación y condiciones climáticas, también puede influir las
técnicas aplicadas para la extracción y métodos de evaluación.
31
CAPITULO IV
CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES
4.1. Conclusiones

Se identificó que los extractos metanólicos obtenidos mediante el método Soxhlet
generan rendimientos superiores a los extractos hidroalcohólicos. U. dioica y U.
leptophylla exhibieron los mejores rendimientos en la extracción metanólica, con
valores de 2,487 ± 0,08 y2,340 ± 0,08, respectivamente. En este contexto, las
especies vegetales junto con los solventes influyen significativamente en el
rendimiento de los extractos.

Todos los extractos analizados presentaron índices aceptables de actividad
antioxidante. Se evidenció que la concentración de los extractos y las especies
vegetales influyen directamente al porcentaje de inhibición de DPPH. A medida
que la concentración aumentó, también lo hizo el porcentaje de inhibición. El
extracto metanólico de U. baccifera presentó resultados superiores en relación a
sus contrapartes, alcanzando un porcentaje de inhibición de 76,83 ± 0,93 %,
equivalente a 435,80 ± 2,79 µmol ET/L. Por otra parte, en lo concerniente a los
extractos etanólico, U. dioica demostró un alto poder antioxidante (62,49 ± 2,49%
y 356,02 ± 8,57 µmol ET/L).

Los extractos presentan índices considerables de compuestos fenólicos, que varían
dependiendo de la matriz vegetal, el método de extracción, el tipo de solvente y
la temperatura. Basado en estos parámetros, se evidenció que los extractos
etanólicos superan ampliamente a los metanólicos. Los fenoles totales se ven
influenciados significativamente por los métodos de extracción y la matriz
vegetal. La extracción hidroalcohólica de U. dioica y U. baccifera mostraron una
mayor cantidad de compuestos fenólicos (87,840 ± 2,835 mg GAE/g y
83,333±1,111 mg GAE/g).

Los extractos etanólicos y metanólicos de las cuatro especies de ortiga presentaron
actividad inhibitoria frente a bacterias patógenas. En el caso de E. coli, U.
32
baccifera demostró ser una buena opción para inhibir a E. coli, puesto que,
necesitó concentraciones menores tanto para el extracto metanólico como
etanólico (16,00 ± 0,35; 27,00± 0,87 µg/mL). En el caso de S. aureus, el extracto
etanólico de U. urens, inhibió a una menor concentración (13,00±0,87 µg/mL). L.
monocytogenes fue neutralizada a una concentración de 13,77±0,46 µg/mL de
extracto metanólico de U. dioica y finalmente el extracto metanólico de U.urens
inhabilitó a B.cereus con 13,27±0,40 µg/mL. Los métodos de extracción y las
especies vegetales afectan considerablemente la CMI de cada bacteria.
4.2. Recomendaciones

Examinar métodos de extracción convencionales y no convencionales que
permitan mejorar el rendimiento de los extractos, así como también la cantidad y
calidad de compuestos bioactivos extraíbles.

Utilizar solventes como el agua, acetona, glicerina, hexano a distintas
concentraciones, con el fin de evaluar su rendimiento y capacidades biológicas de
los extractos vegetales.

Analizar otras actividades biológicas como la actividad antiinflamatoria
fotoprotectora, antifúngica, hipoglucemiante, antineurodegenerativas, entre otras.

Realizar un análisis cromatográfico que permita identificar todos los metabolitos
secundarios presentes en cada una de las especies de ortiga.

Ejecutar pruebas antimicrobianas con cepas resistentes a antibióticos, con el fin
de determinar una posible alternativa a partir de fuentes vegetales para combatir
la resistencia microbiana.
33
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42
ANEXOS
ANEXO A. Certificado de la identificación taxonómica de las especies vegetales.
43
ANEXO B. Autorización de recolección de especímenes de especies de la diversidad
biológica.
44
45
ANEXO C. Análisis estadístico para el rendimiento de los extractos.
Tabla C1. Análisis de varianza ANOVA para el rendimiento de los extractos.
Fuente
Ortigas
Extractos
Ortigas*Extractos
Error
Total
GL SC Ajust. MC Ajust. Valor F Valor p
3
1
3
8
15
2,16260
4,08343
0,12133
0,05541
6,42278
0,72087
4,08343
0,04044
0,00693
104,07
589,51
5,84
0,000
0,000
0,021
Tabla C2. Prueba de rangos multipes Tukey para los rendimientos de los
extractos.
Ortigas*Extractos
U.dioca -Metanólico
U.leptophylla - Metanólico
N
2
2
Media
2,4870 A
2,3395 A
U.urens -Metanólico
U.leptophylla -Etanólico
U.baccifera -Metanólico
U.dioca -Etanólico
U.urens -Etanólico
U.baccifera -Etanólico
2
2
2
2
2
2
2,1505
1,4025
1,3665
1,3180
0,9740
0,6075
Las medias que no comparten una letra son significativamente diferentes.
ANEXO D. Análisis estadístico de actividad antioxidante
46
Agrupación
B
B
C
C
C
D
E
Tabla D1. Análisis de varianza ANOVA para la actividad antioxidante
Fuente
Ortigas
Extractos
Concentraciones
Concentraciones*Extractos
Concentraciones*Ortigas
Extractos*Ortigas
Concentraciones*Extractos*Ortigas
Error
Total
GL
3
1
5
5
15
3
15
96
143
SC Ajust. MC Ajust.
13917,8
4639,26
596,3
596,32
27101,2
5420,24
135,3
27,07
722,0
48,14
16338,6
5446,20
649,2
43,28
207,1
2,16
59667,6
Valor F
2150,59
276,43
2512,62
12,55
22,31
2524,65
20,06
Tabla D2. Prueba de rangos múltiples Tukey para actividad antioxidante
Concentraciones*Extractos*Ortigas
3000 Metanólico U. baccifera
2000 Metanólico U. baccifera
1500 Metanólico U. baccifera
1000 Metanólico U. baccifera
3000 Metanólico U. urens
2000 Metanólico U. urens
3000 Etanólico U.dioica
3000 Etanólico U. baccifera
1500 Metanólico U. urens
2000 Etanólico U.dioica
3000 Etanólico U. urens
2000 Etanólico U. baccifera
1500 Etanólico U.dioica
500 Metanólico U. baccifera
3000 Etanólico U. leptophylla
1000 Etanólico U.dioica
2000 Etanólico U. urens
1000 Metanólico U. urens
3000 Metanólico U.dioica
250 Metanólico U. baccifera
1500 Etanólico U. urens
1500 Etanólico U. baccifera
3000 Metanólico U. leptophylla
500 Metanólico U. urens
N Media
Agrupación
3 78,2910 A
3 74,6728 A B
3 72,7483 B
3 67,7444
C
3 67,2825
CD
3 62,6636
D
3 62,4901
D
3 57,1316
E
3 55,6582
E
3 54,3735
EF
3 53,0339
EFG
3 49,8818
FGH
3 49,8030
FGH
3 49,3457
GH
3 47,9905
H
3 46,8085
HI
3 43,0260
IJ
3 42,8022
IJ
3 41,6474
J
3 38,2602
JK
3 35,9338
KL
3 35,8550
KL
3 35,7968
KL
3 35,1809
KLM
47
Valor p
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
500 Etanólico U.dioica
2000 Etanólico U. leptophylla
2000 Metanólico U.dioica
1000 Etanólico U. urens
1000 Etanólico U. baccifera
1500 Etanólico U. leptophylla
250 Metanólico U. urens
1500 Metanólico U.dioica
500 Etanólico U. urens
2000 Metanólico U. leptophylla
250 Etanólico U.dioica
1000 Etanólico U. leptophylla
1500 Metanólico U. leptophylla
1000 Metanólico U. leptophylla
1000 Metanólico U.dioica
500 Etanólico U. baccifera
250 Etanólico U. urens
500 Etanólico U. leptophylla
500 Metanólico U. leptophylla
250 Etanólico U. leptophylla
500 Metanólico U.dioica
250 Etanólico U. baccifera
250 Metanólico U.dioica
250 Metanólico U. leptophylla
3 33,4121
3 33,0181
3 30,7159
3 28,3688
3 27,8172
3 26,9504
3 26,0200
3 25,7891
3 24,0347
3 23,0947
3 22,7738
3 21,1190
3 20,2463
3 15,2425
3 15,1655
3 13,4752
3 13,4752
3 10,4019
3 9,7768
3 6,7770
3 6,6205
3 5,9102
3 3,6952
3 3,0793
KLM
LMN
MNO
NOP
OQ
OQ R
OQ R S
Q R S
Q R S T
Q R S T
R S T
S T
T
Tabla D3. Análisis de varianza ANOVA para el equivalente Trolox.
Fuente
Extracto
Especies
Extracto*Especies
Error
Total
GL SC Ajust. MC Ajust. Valor F Valor p
1
19,6
19,6
1,15
0,316
3
47622,1
15874,0 929,24
0,000
3
40334,8
13444,9 787,05
0,000
8
136,7
17,1
15
88113,2
Tabla D4. Prueba de rangos múltiples para el equivalente Trolox
Extracto*Especies
Metanólico U. baccifera
Metanólico U. urens
Etanólico U. dioica
N Media
Agrupación
2 435,797 A
2 382,501
B
2 356,023
C
48
U
U
U V
U V
U V W
V W
W X
W X
W X
X
X
Etanólico U. baccifera
Etanólico U. urens
Etanólico U. leptophylla
Metanólico U. dioica
Metanólico U. leptophylla
2
2
2
2
2
323,021
297,427
263,077
225,905
204,192
D
E
F
G
H
Las medias que no comparten una letra son significativamente diferentes.
ANEXO E. Análisis estadístico de los compuestos fenólicos totales.
Tabla E1. Análisis de varianza ANOVA de los compuestos fenólicos
Fuente
Extractos
Especies
Extractos*Especies
Error
Total
GL SC Ajust. MC Ajust. Valor F Valor p
1
3
3
16
23
4764,7
6004,6
2858,6
34,8
13662,7
4764,68
2001,53
952,87
2,17
2192,88
921,18
438,54
0,000
0,000
0,000
Tabla E2. Prueba de rangos múltiples Tukey para compuestos fenólicos
Extractos*Especies
N
Etanólico U. dioica
3
Etanólico U. baccifera
3
Metanólico U. urens
3
Etanólico U. urens
3
Metanólico U. baccifera
3
Etanólico U. leptophylla
3
Metanólico U. dioica
3
Metanólico U. leptophylla 3
Media
Agrupación
87,8365 A
83,3333
B
70,4938
C
70,1577
C
52,1358
D
41,1111
E
27,4346
F
19,6543
G
Las medias que no comparten una letra son significativamente diferentes.
ANEXO F. Análisis estadístico de la actividad antimicrobiana.
49
ANEXO F1. ANOVA para E. coli
Fuente
Extractos
Especies
Extractos*Especies
Error
Total
GL SC Ajust. MC Ajust. Valor F Valor p
1
186,48
186,48 497,29
0,000
3 4937,80
1645,93 4389,16
0,000
3
897,55
299,18 797,82
0,000
16
6,00
0,37
23 6027,84
ANEXO F2. Prueba de rangos múltiples Tukey para E. coli
Extractos*Especies
Metanólico U.leptophylla
N
3
Media
Agrupación
66,0 A
Metanólico U. urens
Etanólico U.leptophylla
3
3
54,0
53,5
B
B C
Etanólico U.dioica
Metanólico U.dioica
Etanólico U. urens
Etanólico U. baccifera
3
3
3
3
52,0
52,0
33,0
27,0
C
C
Metanólico U. baccifera
3
15,8
D
E
F
Las medias que no comparten una letra son significativamente diferentes.
ANEXO F3. ANOVA para S. aureus
Fuente
Extractos
Especies
Extractos*Especies
Error
Total
GL SC Ajust. MC Ajust. Valor F Valor p
1
33,84
33,84
2,14
0,163
3
3667,39
1222,46
77,15
0,000
3
161,86
53,95
3,40
0,043
16
253,53
15,85
23
4116,64
ANEXO F4. Prueba de rangos múltiples Tukey para S. aureus
Extractos*Especies
Metanólico U.dioica
Etanólico U.dioica
Etanólico U.leptophylla
N
3
3
3
Media
48,5000 A
38,1667 A
28,5000
Metanólico U.leptophylla
3
26,0000
Metanólico U. baccifera
3
16,7000
50
Agrupación
B
B
C
C
D
D
E
Etanólico U. baccifera
3
13,0333
E
Etanólico U. urens
Metanólico U. urens
3
3
13,0000
11,0000
E
E
Las medias que no comparten una letra son significativamente diferentes.
ANEXO F5. ANOVA para L monocytogenes
Fuente
Extractos
Especies
Extractos*Especies
Error
Total
GL SC Ajust. MC Ajust. Valor F Valor p
1
111,37
111,370 205,29
0,000
3
722,07
240,692 443,67
0,000
3 1133,46
377,820 696,44
0,000
16
8,68
0,543
23 1975,59
ANEXO F6. Prueba de rangos múltiples Tukey para L. monocytogenes
Extractos*Especies
N
Media
Agrupación
Etanólico U. urens
Metanólico U.leptophylla
Metanólico U. baccifera
3
3
3
41,5000 A
28,5000
27,0000
B
B
Etanólico U.leptophylla
3
23,0000
C
Etanólico U. baccifera
3
21,5000
C
Metanólico U. urens
Etanólico U.dioica
Metanólico U.dioica
3
3
3
13,7667
13,7667
13,2667
D
D
D
Las medias que no comparten una letra son significativamente diferentes.
ANEXO F7. ANOVA para B. cereus
Fuente
Extractos
Especies
Extractos*Especies
GL SC Ajust. MC Ajust. Valor F Valor p
1
96,40
96,400 226,60
0,000
3
187,29
62,430 146,75
0,000
3
719,64
239,880 563,87
0,000
51
Error
Total
16
23
6,81
1010,14
0,425
ANEXO F8. Prueba de rangos múltiples Tukey para B. cereus.
Extractos*Especies
Etanólico U.leptophylla
Metanólico U. baccifera
Etanólico U. urens
Etanólico U.dioica
Metanólico U.leptophylla
Metanólico U.dioica
Etanólico U. baccifera
Metanólico U. urens
N
3
3
3
3
3
3
3
3
Media
Agrupación
31,5000 A
28,5000
B
26,0000
C
17,0000
D
16,5000
D
16,2000
D
16,0000
D
13,2667
E
Las medias que no comparten una letra son significativamente diferentes.
ANEXO G. Absorbancia de los extractos en la inhibición de DPPH.
ANEXO G1. Absorbancia del extracto etanólico de U. dioica
Concentración
3000
2000
1500
1000
500
250
Blanco
Control
Absorbancia 515 nm (U. dioica)
1
2
3
0,203
0,194
0,215
0,232
0,238
0,245
0,252
0,263
0,258
0,263
0,273
0,275
0,328
0,324
0,329
0,373
0,379
0,364
0,042
0,047
0,047
0,471
0,441
0,493
52
Promedio
Desviación
0,204
0,238
0,258
0,270
0,327
0,372
0,045
0,468
0,011
0,007
0,006
0,006
0,003
0,008
0,003
0,026
ANEXO G2. Absorbancia del extracto etanólico de U. urens
Concentración
3000
2000
1500
1000
500
250
Blanco
Control
Absorbancia 515 nm (U. urens)
1
2
3
0,243
0,241
0,248
0,279
0,296
0,284
0,31
0,325
0,314
0,352
0,345
0,348
0,364
0,369
0,367
0,414
0,415
0,405
0,042
0,047
0,038
0,471
0,471
0,441
Promedio
Desviación
0,244
0,286
0,316
0,348
0,367
0,411
0,042
0,461
0,004
0,009
0,008
0,004
0,003
0,006
0,005
0,017
ANEXO G3. Absorbancia del extracto etanólico de U. leptophylla
Concentración
3000
2000
1500
1000
500
250
Blanco
Control
Absorbancia 515 nm (U. leptophylla)
1
2
3
0,268
0,261
0,267
0,326
0,332
0,328
0,355
0,349
0,359
0,377
0,374
0,386
0,426
0,426
0,421
0,447
0,432
0,440
0,042
0,047
0,047
0,471
0,441
0,493
Promedio
Desviación
0,265
0,329
0,354
0,379
0,424
0,440
0,045
0,468
0,004
0,003
0,005
0,006
0,003
0,008
0,003
0,026
Promedio
Desviación
0,227
0,257
0,317
0,351
0,411
0,443
0,045
0,007
0,004
0,002
0,005
0,005
0,002
0,003
ANEXO G4. Absorbancia del extracto etanólico de U. baccifera
Concentración
3000
2000
1500
1000
500
250
Blanco
Absorbancia 515 nm (U. baccifera)
1
2
3
0,226
0,234
0,22
0,253
0,261
0,258
0,319
0,316
0,315
0,351
0,355
0,346
0,416
0,407
0,411
0,443
0,445
0,442
0,042
0,047
0,047
53
Control
0,471
0,441
0,493
0,468
0,026
Promedio
Desviación
0,298
0,345
0,367
0,413
0,450
0,462
0,045
0,478
0,006
0,003
0,005
0,003
0,003
0,003
0,003
0,013
Promedio
Desviación
0,187
0,207
0,237
0,293
0,326
0,366
0,042
0,461
0,009
0,009
0,004
0,009
0,012
0,005
0,005
0,017
ANEXO G5. Absorbancia del extracto metanólico de U. dioica
Concentración
3000
2000
1500
1000
500
250
Blanco
Control
Absorbancia 515 nm (U. dioica)
1
2
3
0,303
0,292
0,299
0,344
0,349
0,343
0,362
0,366
0,372
0,409
0,414
0,415
0,453
0,449
0,447
0,465
0,46
0,462
0,042
0,047
0,047
0,471
0,471
0,493
ANEXO G6. Absorbancia del extracto metanólico de U. urens
Concentración
3000
2000
1500
1000
500
250
Blanco
Control
Absorbancia 515 nm (U. urens)
1
2
3
0,183
0,181
0,197
0,199
0,216
0,206
0,233
0,238
0,241
0,284
0,301
0,294
0,324
0,339
0,315
0,370
0,361
0,366
0,042
0,047
0,038
0,471
0,471
0,441
ANEXO G7. Absorbancia del extracto metanólico de U. leptophylla
Concentración
3000
2000
1500
1000
500
250
Absorbancia 515 nm (U. leptophylla)
1
2
3
0,335
0,318
0,317
0,389
0,376
0,37
0,375
0,395
0,402
0,407
0,411
0,419
0,443
0,431
0,434
0,463
0,465
0,467
54
Promedio
Desviación
0,323
0,378
0,391
0,412
0,436
0,465
0,010
0,010
0,014
0,006
0,006
0,002
Blanco
Control
0,042
0,471
0,047
0,471
0,038
0,441
0,042
0,461
0,005
0,017
ANEXO G8. Absorbancia del extracto metanólico de U. baccifera
Concentración
3000
2000
1500
1000
500
250
Blanco
Control
Absorbancia 515 nm (U. baccifera)
1
2
3
0,135
0,143
0,14
0,154
0,15
0,161
0,157
0,161
0,172
0,191
0,18
0,184
0,264
0,262
0,268
0,308
0,319
0,311
0,042
0,047
0,038
0,471
0,471
0,441
Promedio
Desviación
0,139
0,155
0,163
0,185
0,265
0,313
0,042
0,461
0,004
0,006
0,008
0,006
0,003
0,006
0,005
0,017
ANEXO H. Curvas de calibración
% Inhibición DPPH
Figura 7
Curva de calibración para Trolox
100
90
80
70
60
50
40
30
20
10
0
y = 0,1755x + 1,3083
R² = 0,9958
0
100
200
300
400
Concentración de Trolox (µm/mL)
55
500
600
Figura 8
Curva de calibración de ácido gálico.
ANEXO I. Concentración Mínima Inhibitoria
ANEXO I1. Primera fase de diluciones de los extractos hidroalcohólicos.
Bacteria
Extracto
U. dioica
U. urens
E. coli
U.
leptophylla
U.
baccifera
S. aureus
U. dioica
U. urens
Réplicas
1
2
3
1
2
3
1
2
3
1
2
3
1
2
3
1
10
/
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
20
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
56
CMI (µg/mL)
40
60
+
+
+
+
+
+
-
80
-
100
-
2
+
3
+
+
1
+
+
U.
2
+
+
leptophylla
3
+
+
1
+
U.
2
+
baccifera
3
+
1
+
2
+
U. dioica
3
+
+
+
1
+
+
+
2
+
+
+
U. urens
L.
3
+
+
monocytogenes
1
+
+
U.
2
+
+
leptophylla
3
+
+
1
+
+
U.
2
+
+
baccifera
3
+
1
+
+
2
+
+
+
U. dioica
3
+
+
1
+
+
2
+
+
U. urens
3
+
+
B. cereus
1
+
+
U.
2
+
+
leptophylla
3
+
+
+
1
+
U.
2
+
baccifera
3
+
Nota: Los signos positivos (+) muestran aquellos pocillos en los cuales hubo crecimiento
-
microbiano y los signos negativos (-) aquellos en los que no hubo crecimiento.
ANEXO I2. Primera fase de diluciones de los extractos metanólicos, método
Soxhlet.
Bacteria
E. coli
Extracto
U. dioica
U. urens
Réplicas
1
2
3
1
2
10
+
+
+
+
+
20
+
+
+
+
+
57
CMI (µg/mL)
40
60
+
+
+
78+/+
-
80
-
100
-
3
+
+
+
1
+
+
+
+
U.
2
+
+
+
+
leptophylla
3
+
+
+
+
1
+
+
U.
2
+
+
baccifera
3
+
1
+
+
+
2
+
+
+
U. dioica
3
+
1
+
2
+
U. urens
3
+
+
S. aureus
1
+
+
U.
2
+
+
leptophylla
3
+
+
1
+
U.
2
+
baccifera
3
+
1
+
2
+
U. dioica
3
+
+
1
+
2
+
U. urens
L.
3
+
monocytogenes
1
+
+
U.
2
+
+
leptophylla
3
+
+
1
+
+
U.
2
+
+
+
baccifera
3
+
+
1
+
+
2
+
U. dioica
3
+
+
1
+
2
U. urens
3
+
B. cereus
1
+
+
U.
2
+
leptophylla
3
+
1
+
+
U.
2
+
+
+
baccifera
3
+
+
Nota: Los signos positivos (+) muestran aquellos pocillos en los cuales hubo crecimiento
microbiano y los signos negativos (-) aquellos en los que no hubo crecimiento.
58
-
ANEXO J. Fotografías
Figura 9 Macerado de los extractos
Figura 10 Extracción Soxhlet
Figura 11 Extractos etanólicos
Figura 12
Figura 13 Extracto metanólico de U. uren
Extracto etanólico U. urens
Figura 14 Extracto metanólico de U.
leptophylla
59
Figura 15 Soluciones stock para actividad
Figura 16 Diluciones para actividad
antioxidantes antimicrobiana
60
Figura 17 Primera dilución de los extractos etanólicos
A: E. coli; B:B.cereus; C: S. aureus; D: L. monocytogenes
Figura 18 Primera dilución de los extractos metanólicos
A: E.coli: B: L. monocytogenes; C:S.aureus; C:B.cereus
61
Figura 19 Segunda y tercera dilución de los extractos metanólicos.
A: Segunda dilución de E. coli y S. aureus; B: Segunda dilución de L. monocitogenes y
B.cereus; C: Tercera dilución de E. coli y S. aureus; D: : Tercera dilución de L.
monocitogenes y B.cereus.
Figura 20 Actividad antioxidante de los extractos etanólicos
62
Figura 21 Actividad antioxidante de los extractos metanólicos
Figura 22 Cuantificación del contenido fenólico
63
Figura 23. Concentración Mínima Bactericida de los extractos etanólicos y
metanólicos
Extractos etanólicos
Extractos metanólicos
En las dos figuras la primera final presenta la CMB de los extractos de U. dioica, las
siguientes filas hacen referencia a U. urens, U. leptophylla y U. baccifera,
respectivamente.
64