UNIVERSIDAD TÉCNICA DE AMBATO FACULTAD DE CIENCIA E INGENIERÍA EN ALIMENTOS Y BIOTECNOLOGÍA CARRERA DE BIOTECNOLOGÍA Determinación del efecto antioxidante y antimicrobiano de extractos de diferentes tipos de ortiga (Urtica dioica, Urtica urens, Urtica leptophylla, Urera baccifera) frente a cepas de Staphylococcus aureus, Escherichia coli, Listeria monocytogenes y Bacillus cereus. Informe Final de Integración Curricular, Modalidad Proyecto de Investigación, previo a la obtención de título de Ingeniero Biotecnólogo, otorgado por la Universidad Técnica de Ambato, a través de la Facultad de Ciencia e Ingeniería en Alimentos y Biotecnología. Autor: Kevin Daniel Mariño Manzano Tutor: Msc. María Daniela Garcés Moncayo Ambato – Ecuador Marzo - 2023 APROBACIÓN DEL TUTOR Msc. María Daniela Garcés Moncayo CERTIFICA: Que el presente Informe Final de Integración Curricular ha sido prolijamente revisado. Por lo tanto, autorizo la presentación de este Informe Final de Integración Curricular bajo la modalidad de Proyecto de Investigación, el mismo que responde a las normas establecidas en el Reglamento de Titulación y Grados de la Facultad de Ciencia e Ingeniería en Alimentos y Biotecnología. Ambato, 14 de febrero del 2023 Firmado electrónicamente por: MARIA DANIELA GARCES MONCAYO ……………………………………………. Msc. María Daniela Garcés Moncayo C.I. 180357158-5 TUTORA ii DECLARACIÓN DE AUTENTICIDAD Yo, Kevin Daniel Mariño Manzano, manifiesto que los resultados obtenidos en el presente Informe Final de Integración Curricular, modalidad Proyecto de Investigación, previo a la obtención del título de Ingeniero Biotecnólogo, son absolutamente originales, auténticos y personales, a excepción de las citas bibliográficas. ……………………………………………. Kevin Daniel Mariño Manzano C.I. 180469725-6 AUTOR iii APROBACIÓN DE LOS MIEMBROS DEL TRIBUNAL DE GRADO Los suscritos Profesores Calificadores, aprueban el presente Informe Final de Integración Curricular, modalidad Proyecto de Investigación, el mismo que ha sido elaborado de conformidad con las disposiciones emitidas por la Facultad de Ciencia e Ingeniería en Alimentos y Biotecnología de la Universidad Técnica de Ambato. Por constancia firman: Firmado electrónicamente por: ESTEBAN MAURICIO FUENTES PEREZ …………………………………………… Presidente de Tribunal Firmado electrónicamente por: WILLIAM RICARDO CALERO CACERES …………………………………………… PhD. William Ricardo Calero Cáceres CI. 1714344885-9 Firmado electrónicamente por: LILIANA PAULINA LALALEO CORDOVA …………………………………………… PhD. Liliana Paulina Lalaleo Córdova CI. 180360185-3 Ambato, 03 de marzo de 2023 iv DERECHOS DE AUTOR Autorizo a la Universidad Técnica de Ambato, para que haga del presente Informe Final de Integración Curricular o parte de él un documento disponible para su lectura, consulta y procesos de investigación, según las normas de la Institución. Cedo los Derechos en línea patrimoniales de mi Informe Final de Integración Curricular, con fines de difusión pública, además apruebo la reproducción de este, dentro de las regulaciones de la Universidad, siempre y cuando esta reproducción no suponga una ganancia económica y se realice respetando mis derechos de autor. …………………………………………. Kevin Daniel Mariño Manzano C.I. 180469725-6 AUTOR v DEDICATORIA A mis padres Víctor y Dora, por su apoyo incondicional en mi camino universitario, por ofrecerme sus consejos de vida y darme la oportunidad de estudiar. A mis hermanas Karen y Victoria por acompañarme en todo momento y por ser quienes me han impulsado a perseguir mis metas. A mis abuelitos, Guido y Carmen quienes me han ayudado en todo momento para que este anhelo se haga realidad. A mis tías, Katy y Ximena por sus consejos y apoyo incondicional . A toda mi familia que ha estado siempre al pendiente de este largo caminar fomentando en mí, el deseo de superación y de triunfo en la vida. Lo que ha contribuido a la consecución de este logro. vi AGRADECIMIENTOS A Dios, por haberme dado la vida y fuerzas para alcanzar una meta más en mi vida. A mis padres, por guiarme durante todo mi vida A mis abuelitos por apoyarme y motivarme a seguir adelante A mi tutora Msc María Daniela Garcés por apoyarme y guiarme en la realización de este proyecto de investigación Al PhD. Irvin Tubón por compartirme sus conocimientos y ayudarme en la realización de este trabajo de titulación A mis amigos con los que compartí agradables momentos durante toda la carrera A mis amadas mascotas, Jack, Beto y Charly que en su momento me brindaron alegrías y sonrisas. A mis docentes de la FCIAB, por haberme formado profesionalmente con sus conocimientos y enseñanzas compartidas en toda la carrera. vii ÍNDICE GENERAL DE CONTENIDOS APROBACIÓN DEL TUTOR ..................................................................................... ii DECLARACIÓN DE AUTENTICIDAD ................................................................... iii APROBACIÓN DEL TRIBUNAL DE GRADO ....................................................... iv DEDICATORIA ......................................................................................................... vi AGRADECIMIENTOS ............................................................................................. vii ÍNDICE GENERAL DE CONTENIDOS ................................................................. viii RESUMEN ................................................................................................................ xiii ABSTRACT .............................................................................................................. xiv CAPITULO I................................................................................................................ 1 MARCO TEÓRICO ..................................................................................................... 1 1.1. ANTECEDENTES INVESTIGATIVOS ...................................................... 1 1.1.1. Flora del Ecuador ................................................................................... 1 1.1.2. Plantas medicinales ................................................................................ 1 1.1.3. Especies vegetales (ortigas) ........................................................................ 2 1.1.3. 1.2. Actividad antimicrobiana ....................................................................... 6 Objetivos........................................................................................................ 8 1.2.1. Objetivo general.......................................................................................... 8 1.2.2. Objetivos específicos .................................................................................. 8 1.3. Hipótesis ........................................................................................................ 9 1.3.1. Hipótesis nula ......................................................................................... 9 1.3.2. Hipótesis alternativa ............................................................................... 9 1.4. Variables ........................................................................................................ 9 1.4.1. Variable independiente........................................................................... 9 1.4.2. Variable dependiente .............................................................................. 9 viii CAPÍTULO II ............................................................................................................ 10 METODOLOGÍA ...................................................................................................... 10 2.1. Materiales ........................................................................................................ 10 2.1.1. Material vegetal .................................................................................... 10 2.1.2. Material biológico ................................................................................ 10 2.1.3. Reactivos de laboratorio ....................................................................... 10 2.1.4. Equipos de laboratorio ......................................................................... 11 2.1.5. Instrumentos de laboratorio.................................................................. 11 2.1.6. Insumos ................................................................................................ 12 2.2. Métodos ....................................................................................................... 12 2.2.1. Tipo de investigación ........................................................................... 12 2.2.2. Población y muestra ............................................................................. 13 2.2.3. Obtención de los extractos ................................................................... 13 2.2.4. Concentración Mínima Inhibitoria (CMI) y Concentración Mínima Bactericida (CMB) .............................................................................................. 15 2.2.5. Actividad antioxidante ......................................................................... 18 2.2.6. Cuantificación de fenoles totales ......................................................... 19 CAPÍTULO III ........................................................................................................... 20 RESULTADOS Y DISCUSIÓN................................................................................ 20 3.1. Análisis y discusión de resultados ................................................................... 20 3.1.1. Rendimiento de los extractos .................................................................... 20 3.1.2. Actividad antioxidante .............................................................................. 21 3.1.3. Compuestos fenólicos totales.................................................................... 26 CAPITULO IV ........................................................................................................... 32 CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES ......................................................... 32 BIBLIOGRAFÍA........................................................................................................ 34 ix INDICE DE TABLAS Tabla 1. Características morfológicas de los diferentes tipos de ortiga ...................... 2 Tabla 2. Concentración Mínime Inhibitoria de extractos de ortiga frente a distintos microorganismos. ......................................................................................................... 6 Tabla 3 Rendimiento de los extractos de los diferentes tipos de ortiga .................... 20 Tabla 4 Porcentaje de inhibición de los radicales de DPPH de los extractos de diferentes especies de ortiga....................................................................................... 22 Tabla 5 Capacidad antioxidante en equivalentes Trolox de las matrices vegetales 23 Tabla 6 Concentración de extractos necesaria para inhibir el 50% de radicales DPPH.......................................................................................................................... 26 Tabla 7 Contenido de fenoles totales de los extractos provenientes de cada especie vegetal. ....................................................................................................................... 28 Tabla 8 Concentración mínima inhibitoria de los diferentes extractos frente a cuatro cepas bacterianas. ............................................................................................ 29 Tabla 9 Concentración mínima bactericida de los diferentes extractos frente a cuatro cepas bacterianas. ............................................................................................ 30 x INDICE DE FIGURAS Figura 1 Clasificación taxonómica de las distintas especies de ortiga. .................. 5 Figura 2 Distribución geográfica de las distintas especies de ortiga analizadas....4 Figura 3 Representación gráfica de la ´primera fase de la preparación de la placa de microtitulación....................................................................................................... 16 Figura 4 Representación gráfica de la segunda y tercera fase de la preparación de la placa con distintas diluciones. .................................................................................... 16 Figura 5 Representación de la metodología aplicada en la evaluación de la actividad antimicrobiana. ........................................................................................... 18 Figura 6 Porcentajes de Inhibición de DPPH a distintas concentraciones de los extractos vegetales ..................................................................................................... 24 Figura 7 Curva de calibración para Trolox ............................................................ 55 Figura 8 Curva de calibración de ácido gálico....................................................... 56 Figura 9 y 10 Macerado de los extractos y extracción Soxhlet .............................. 59 Figura 11 Extractos etanólicos .............................................................................. 599 Figura 12 y 13 Extracto etanólico y metanólico de U. urens ................................... 59 Figura 15 y 16 Soluciones stock para actividad antioxidante y antimicrobiana ...... 60 Figura 17 Primera dilución de los extractos etanólicos ........................................... 61 Figura 18 Primera dilución de los extractos metanólicos ....................................... 61 Figura 19 Segunda y tercera dilución de los extractos metanólicos. ........................ 62 Figura 20 Actividad antioxidante de los extractos etanólicos.................................. 62 Figura 21 Actividad antioxidante de los extractos metanólicos .............................. 63 Figura 22 Cuantificación del contenido fenólico ...................................................... 63 xi ÍNDICE DE ANEXOS ANEXO A. Certificado de la identificación taxonómica de las especies vegetales. . 43 ANEXO B. Autorización de recolección de especímenes de especies de la diversidad biológica. .................................................................................................................... 44 ANEXO C. Análisis estadístico para el rendimiento de los extractos. ..................... 46 ANEXO D. Análisis estadístico de actividad antioxidante ....................................... 46 ANEXO E. Análisis estadístico de los compuestos fenólicos totales. ...................... 49 ANEXO F. Análisis estadístico de la actividad antimicrobiana................................ 49 ANEXO G. Absorbancia de los extractos en la inhibición de DPPH. ...................... 52 ANEXO H. Curvas de calibración ............................................................................ 55 ANEXO I. Concentración Mínima Inhibitoria .......................................................... 56 ANEXO J. Fotografías .............................................................................................. 59 xii RESUMEN Las plantas medicinales se han convertido en una esperanza para el desarrollo de medicinas alternativas, por tal razón, la OMS promueve el estudio de medicamentos a base de fuentes vegetales, ya que con frecuencia generan escasos efectos secundarios, mínima toxicidad y combaten la resistencia antimicrobiana. La familia Urticaceae posee un alto índice de moléculas bioactivas. La presente investigación se enfoca en evaluar la actividad biológica de los extractos hidroalcólicos (EtOH) y metanólicos (MtOH) provenientes de cuatro especies de ortiga. Inicialmente se realizó la extracción, que arrojó rendimientos variables, destacando como mejor resultado el MtOH de U. dioica correspondiente a 2,487 porciento. La capacidad antioxidante se determinó mediante la técnica DPPH, todos los extractos presentan actividad antioxidante considerable, sin embargo, el MtOH de U. baccifera inhibió un equivalente a 435,80 micromoles de Trolox por litro. La cuantificación de fenoles totales se midió mediante el ensayo Folin-Ciocalteu, con el cual se demostró que los EtOHs superan a los MtOHs. La extracción hidroalcohólica de U. dioica mostró una mayor cantidad de compuestos fenólicos (87,840 miligramos de ácido gálico por gramo). La actividad antimicrobiana se estimó mediante el método de microdilución en placas de 96 pocillos basado en resazurina, con lo cual se determinó la CMI y CMB. Los extractos que inhibieron a una menor concentración fueron: el MtOH de U. baccifera y U. urens a E. coli y B.cereus, EtOH de U. urens y U. dioica a S. aureus y L. monocytogenes, respectivamente. En conclusión, los extractos vegetales analizados poseen actividad biológica considerable. Palabras clave: Extractos vegetales, actividad antioxidante, actividad antimicrobiana, fenoles totales, moléculas bioactivas, bacterias. xiii ABSTRACT Medicinal plants have become a hope for the development of alternative medicines, for this reason, the WHO promotes the study of medicines based on plant sources, since they frequently generate few side effects, minimal toxicity and combat antimicrobial resistance. The Urticaceae family has a high index of bioactive molecules. This research focuses on evaluating the biological activity of hydroalcoholic (EtOH) and methanolic (MtOH) extracts from four nettle species. Initially, the extraction was carried out, which yielded variable yields, highlighting the MtOH of U. dioica corresponding to 2.487 percent as the best result. The antioxidant capacity was determined using the DPPH technique, all the extracts present considerable antioxidant activity, however, the MtOH of U. baccifera inhibited an equivalent to 435.80 micromoles of Trolox per liter. The quantification of total phenols was measured by the Folin Ciocalteu assay, which demonstrated that EtOHs exceed MtOHs. The hydroalcoholic extraction of U. dioica showed a higher amount of phenolic compounds (87,840 milligrams of gallic acid per gram). The antimicrobial activity was estimated by the microdilution method in 96-well plates based on resazurin, with which the MIC and MBC were determined. The extracts that inhibited at a lower concentration were: MtOH from U. baccifera and U. urens to E. coli and B.cereus, EtOH from U. urens and U. dioica to S. aureus and L. monocytogenes, respectively. In conclusion, the analyzed plant extracts have considerable biological activity. Keywords: Plant extracts, antioxidant activity, antimicrobial activity, total phenols, bioactive molecules, bacteria. xiv CAPITULO I MARCO TEÓRICO 1.1. ANTECEDENTES INVESTIGATIVOS 1.1.1. Flora del Ecuador Dieciocho países megadiversos albergan el 70% de todas las especies del mundo (Scarano et al., 2021), entre ellos Ecuador, que con sólo el 0,06% de la superficie terrestre mundial es considerado el país más biodiverso por unidad de superficie del mundo (Mestanza et al., 2020). Incomparablemente, aloja alrededor del 10% de todas las especies vegetales del planeta (Velasteguí, 2018), específicamente se han descrito científicamente un total de 25560 especies, de las cuales el 5348 (20,92%) son endémicas (Vargas, 2002). Aproximadamente, 10 000 crecen en la región Andina, 8200 en la Amazonía, 6300 en la región Litoral y 850 en Galápagos (Velasteguí, 2018). 1.1.2. Plantas medicinales Las plantas son fábricas químicas vivientes que biosintetizan una gran variedad de metabolitos secundarios, que constituyen la base de diversos medicamentos comerciales y remedios herbales (Li et al., 2020). De hecho, los alcaloides, los terpenoides y los fenilpropanoides son metabolitos de gran valor para la industria farmacéutica (Sanchita & Sharma, 2018). Dichos componentes químicos son aprovechados principalmente en la fabricación de fármacos y alimentos, dado a que poseen actividad biológica; pero también, son muy valiosos en las industrias de perfumería, agroquímica y cosmética (Rasool, 2012). Por tal razón. se define como planta medicinal a toda especie vegetal que posee propiedades terapéuticas o ejercen un efecto farmacológico beneficioso sobre el organismo humano o animal (Namdeo, 2018). Las plantas medicinales se han convertido en una esperanza para el desarrollo de medicinas alternativas (Getachew et al., 2022), por esta razón, la Organización Mundial de la Salud (OMS), propone un estudio exhaustivo de medicamentos a base de plantas, ya que con frecuencia generan escasos efectos secundarios, son menos tóxicos (OMS, 2016) y combaten la resistencia a los antibióticos. (Shin et al., 2018). Además se estima 1 que, de 300000 plantas existentes, únicamente el 15% han sido analizadas con el fin de determinar su potencial farmacológico (Palhares et al., 2015). En Ecuador, se han identificado propiedades medicinales en más 3118 especies de plantas. (Caballero-Serrano et al., 2019) De acuerdo con la OMS, entre el 65% y el 80% de las personas que habitan en países en vías de desarrollo usan plantas medicinales como remedio (OMS, 2019). Además, en todo el mundo se están llevando a cabo estudios que demuestran la eficacia y la importancia de las plantas medicinales (Palhares et al., 2015) esto se ve reflejado en el mercado global de medicamentos derivados de plantas, cuyo tamaño en el 2020, alcanzó los 185 860 millones de dólares y se estima que escale hasta los 430 050 millones de dólares en 2028 (Fortune Business Insights, 2022). 1.1.3. Especies vegetales (ortigas) 1.1.3.1. Descripción botánica Tabla 1. Características morfológicas de los diferentes tipos de ortiga. Características Especies vegetales U. dioica U. urens U. leptophylla U. baccifera Nombres Ortiga mayor Ortiga menor Ortiga de monte Ortiga brava populares Ortiga verde Ortiga blanca Ortiga macho Tamaño 50 cm a 1,5 m. 15 a 50 cm. 40 cm a 1,5 m 1,5 m a 2,5 m Hojas Lanceoladas a Opuestas, Opuestas, Ovadas ovadas, de 5 a simples de 4 a 6 decusadas de 5 a oblongas, 15 cm de largo. cm de largo. 12 cm de largo. 200 a 40 cm de Borde aserrado Borde aserrado Borde crenado de largo. Pecíolos de 1 a Pecíolos de 0,5 Pecíolos de 1 a 3,5 Borde aserrado 3 cm de largo. a 2 cm de largo. cm de largo. a dentado. Pecíolos de 2 a 20 cm. 2 Color Flores verde Color amarillento. verde, Color verde claro Color blanco o Inflorescencias amarillento en panículas. Inflorescencias o amarillento. púrpura rojizo. Inflorescencias en Inflorescencias espiga. en panículas. en panículas. Tallos Fruto Cuadrangulares Acanalados Acanalados Gruesos Erguidos Erguidos Erguidos Erguidos Delgados Ramificados Delgados Lisos Aquenio ovado Aquenio liso Aquenio liso ovado Aquenio aplanado ovado Imagen Nota: La presenta tabla compara las principales características fisiológicas de las especies mencionadas. Adaptado de: Gutiérrez et al., (2020); Romoleroux et al., (2016); Pomboza et al., (2016); Guamán, (2015), Weigend et al., (2013); Thomé, (2011). Los géneros Urtica y Urera, pertenecen a una misma familia (Urticaceae), por lo cual comparten algunas particularidades, como su coloración (verde), la presencia de flores unisexuales (Gutiérrez et al., 2020; Romoleroux et al., 2016; Weigend et al., 2013) y pelos urticantes que las envuelve por completo, aunque en el caso de las Urticas estas se presentan como delgadas vellocidades translúcidas (Romoleroux et al., 2016) y en las Ureras como espinas (Gutiérrez et al., 2020). Sin embargo, existen características morfológicas en las que difieren totalmente, como las que se detallan en la tabla 1. 3 1.1.3.2. Hábitat Figura 1 Distribución geográfica de las distintas especies de ortiga analizadas. Nota: La figura muestra las provincias en las que se desarrollan las especies de ortiga estudiadas. Fuente: Elaboración Propia .Adaptado de: ARCSA, (2015); Romoleroux et al., (2016) ; Pomboza et al., (2016). Las especies del género Urtica que habitan en el país, se desarrollan principalmente en la región Andina, en terrenos húmedos ricos en nitrógeno, con un pH variable entre 6.3 y 7.2 y a una altura de 1500 a 4000 msnm. (Pomboza et al., 2016; Romoleroux et al., 2016). Mientras que, el género Urera prolifera en zonas húmedas a una elevación de 5002.800 msnm (MAE, 2015). U. leptophylla y U. baccifera son plantas nativas del Ecuador (MAE, 2015; Romoleroux et al., 2016), a diferencia de U. dioca y U. urens, que son especies introducidas, originarias de Europa y Asia (Morales et al., 2016). La distribución geográfica de estas plantas en el Ecuador se puede apreciar en la figura 2. 4 1.1.3.2. Clasificación taxonómica Figura 2 Clasificación taxonómica de las distintas especies de ortiga. Nota: La figura representa la clasificación taxonómica de U. dioica, U. urens, U. leptophylla y U. baccifera. Adaptado de: Romoleroux et al., (2016) 1.1.3.4. Composición química Las ortigas poseen diferentes compuestos biológicamente activos (Kregiel et al., 2018), destaca la presencia de flavonoides, ácido fórmico, ácidos grasos, proteínas, vitaminas A,B, C, D, E, F, K y P, carotenoides, terpenoides, esteroles, compuestos polifenólicos, aminoácidos esenciales, clorofila, taninos, isolectinas, carbohidratos, polisacáridos y minerales principalmente calcio, hierro, magnesio, fósforo, potasio y sodio. (Begić et al., 2020; Kregiel et al., 2018; Mzid et al., 2017). De igual manera, disponen de neuromoduladores, como la acetilcolina, histamina, serotonina y colina (Begić et al., 2020). 5 1.1.3.5. Usos Estas plantas han sido utilizadas durante años en la medicina tradicional, con el fin de tratar patologías relacionadas con el estrés oxidativo e inflamación, como enfermedades cardiovasculares, neurodegenerativas, diabetes, aterosclerosis, artritis, reumatismo, eccema, hemorragias, hiperplasia prostática benigna y cáncer (Bourgeois et al., 2016; Carvalho et al., 2017). Adicionalmente, las hojas son empleadas como antiinflamatorio, antirreumático, diurético, para tratar hemorroides, pérdida del cabello, infecciones urinarias, enfermedades de la piel y trastornos gástricos (Gutiérrez et al., 2020). Asimismo, se emplean en la industria cosmética como un completo antienvejecimiento (Bourgeois et al., 2016). 1.1.3. Actividad antimicrobiana Los antimicrobianos son agentes con la capacidad de destruir microorganismo o inhibir su multiplicación y desarrollo (Girón, 2018). Investigaciones preliminares revelan que los extractos etanólicos, exánicos, metanólicos y acuosos provenientes de distintas especies de ortiga resultan eficaces al momento de combatir diferentes cepas microbianas (Kregiel et al., 2018). Tabla 2. Concentración Mínima Inhibitoria de extractos de ortiga frente a distintos microorganismos. Concentración Microorganismo Mínima Inhibitoria Escherichia coli 36,21 mg/ml Pseudomonas aeruginosa 72,43 mg/ml Staphylococcus aureus SARM 66,66 mg/ml Bacillus cereus 16,66 mg/ml Acinetobacter calcoaceticus 16,66 mg/ml 6 Bacillus subtilis 36,21 mg/ml Vibrio parahaemolyticus 4,16 mg/ml Saccharomyces cerevisiae 2,08 mg/ml Nota: La presente tabla muestra la concentración mínima extractos de ortiga necesarios para inhibir el crecimiento bacteriano. Adaptado de: Jyoti et al., (2016); Kregiel et al., (2018); Mzid et al., (2017); Velasco et al., (2021) 1.1.4. Actividad antioxidante Los radicales libres del oxígeno son moléculas inestables y altamente reactivas, que se originan como consecuencia del metabolismo aeróbico fisiológico normal (Carvajal, 2019). Estos radicales interactúan directamente con moléculas del sistema biológico, afectando potencialmente el ADN, las proteínas y los lípidos (Rodrigues et al., 2019). Además, su acumulación promueve el desarrollo de afecciones metabólicas, cardiovasculares, neurodegenerativas y otras crónicas (Rodrigues et al., 2019). Favorablemente, se puede neutralizar estos radicales mediante metabolitos secundarios denominados antioxidantes, tales como los polifenoles, los ácidos fenólicos y los flavonoides provenientes de especies vegetales (Rets’epile et al., 2020). En diversas investigaciones, se ha confirmado el valor biológico de las ortigas, destacando su significativa actividad antioxidantes, gracias a su alto contenido de fenoles, polifenoles y taninos (Begić et al., 2020; Mzid et al., 2017). 7 1.2. Objetivos 1.2.1. Objetivo general Determinar el efecto antioxidante y antimicrobiano de los extractos de cuatro diferentes tipos de ortiga (Urtica dioica, Urtica urens, Urtica leptophylla, Urera baccifera) frente a cepas de Staphylococcus aureus, Escherichia coli, Listeria monocytogenes y Bacillus cereus. 1.2.2. Objetivos específicos Obtener extractos de cuatro especies de ortiga (U. leptophylla, U. baccifera) dioica, U. mediante extracción Soxhlet urens, U. y extracción hidroalcohólica. Evaluar la actividad antioxidante de los extractos obtenidos de cuatro especies de ortiga (U. dioica, U. urens, U. leptophylla, U. baccifera), por medio de la técnica de 2,2-difenil-1-picrilhidrazilo (DPPH). Establecer la Concentración Mínima Inhibitoria (CMI) y Concentración Mínima Bactericida (CMB) de los extractos obtenidos de cuatro especies de ortiga (U. dioica, U. urens, U. leptophylla, U. baccifera) mediante el método de dilución en caldo. 8 1.3. Hipótesis 1.3.1. Hipótesis nula Los diferentes métodos de extracción (extracción hidroalcohólica y extracción Soxhlet) influyen en las actividades biológicas (antimicrobiana y antioxidante) de los extractos obtenidos de las cuatro especies de ortiga. 1.3.2. Hipótesis alternativa Los diferentes métodos de extracción (extracción hidroalcohólica y extracción Soxhlet) no influyen en las actividades biológicas (antimicrobiana y antioxidante) de los extractos obtenidos de las cuatro especies de ortiga. 1.4.Variables 1.4.1. Variable independiente Métodos de extracción (extracción hidroalcohólica y extracción Soxhlet). Especies de ortiga (U. dioica, U. urens, U. leptophylla, U. baccifera). 1.4.2. Variable dependiente Actividad antioxidante Actividad antimicrobiana Fenoles totales 9 CAPÍTULO II METODOLOGÍA 2.1.Materiales 2.1.1. Material vegetal • Urtica dioica • Urtica urens • Urtica leptophylla • Urera baccifera 2.1.2. Material biológico Cepas bacterianas de: • Staphylococcus aureus ATCC 12600 • Escherichia coli ATCC 11775 • Listeria monocytogenes ATCC 19115 • Bacillus cereus ATCC 10876 2.1.3. Reactivos de laboratorio Medio PCA (Plate Count Agar) Agua de peptona Resazurina Trolox (ácido 6-hidroxi-2,5,7,8-tetrametilcromano-2-carboxílico) Folin-Ciocalteu Carbonato de sodio (Na2CO3) DPPH (2,2-difenil-1-picrilhidracilo) 10 Etanol al 96%. Metanol 99% Solución salina Gentamicina Agua destilada 2.1.4. Equipos de laboratorio Cámara de flujo laminar Incubadora Refrigeradora Autoclave Espectofotómetro Extractor Soxhlet Balanza analítica Vórtex Rotavapor Plancha de calentamiento Plancha de agitación 2.1.5. Instrumentos de laboratorio Pipeta volumétrica (1 mL) Embudos de vidrio Balones de aforo (10,50, 100 mL) Piseta Cajas Petri Lámparas de alcohol Tubos de ensayo con tapa rosca Frascos herméticos de vidrio oscuro Frascos ámbar con tapa (250 mL) 11 Tubos Eppendorf Agitadores magnéticos Vasos de precipitación (50, 100 mL) Micropipeta (100 – 1000 µL) Micropipeta (20 – 200 µL) Puntas estériles Película adhesiva Asa de Drigalsky Asa bacteriológica Caja de microtitulación de 96 pocillos Gradilla Papel filtro Espátula Pinzas Matraz Erlenmeyer (100, 250 mL) 2.1.6. Insumos • Mandil • Guantes • Cepillo de lavar equipos • Papel aluminio • Fósforos • Lápiz graso • Marcadores 2.2. Métodos 2.2.1. Tipo de investigación 12 La presente investigación es de carácter cuantitativo, puesto que pretende analizar datos cuantitativos relacionados con diversas variables, dado que se busca identificar la capacidad inhibitoria y antioxidante de cuatro especies distintas de ortiga, de diferentes zonas del país. 2.2.2. Población y muestra La población considerada para esta investigación son las cuatro especies de ortiga obtenidas en las parroquias Macas y Cotaló. 2.2.3. Obtención de los extractos 2.2.3.1. Obtención de la muestra La especie Urtica baccifera fue recolectada en una propiedad privada ubicada en la parroquia San Isidro, perteneciente al cantón Morona, provincia de Morona Santiago. Las especies Urtica urens, Urtica dioica y Urtica leptophylla fueron recolectadas en una propiedad privada ubicada en la parroquia Cotaló, cantón Pelileo, provincia de Tungurahua. Las especies fueron herborizadas y entregadas al herbario “Misael Acosta Solís” de la Universidad Técnica de Ambato, para confirmar que las especies corresponden a las descritas anteriormente. (ANEXO A). Adicionalmente, se solicitó la autorización de investigación científica al Ministerio del Ambiente y Agua, para poder proceder con la recolección de las especies vegetales. (ANEXO B) 2.2.3.2. Preparación de la muestra Se seleccionaron las plantas que no presentan daños en sus hojas o tallos. Se cortaron ramas completas (tallo, hojas y flores) cuyo tamaño varío entre los 25 y 50 cm. Las especies recolectadas se desinfectaron con una solución de hipoclorito de sodio (5%) y agua destilada, se enjuagaron con agua y se secaron en un lugar oscuro a una temperatura aproximada de 25 a 30 °C. Finalmente, el material vegetal seco fue triturado en una licuadora hasta obtener un polvo fino, que se lo almacenó en fundas plásticas. 13 2.2.3.3. Extracción hidroalcohólica Se tomaron 50 g del polvo y se lo mezcló con 200 mL de etanol al 96% en un frasco resistente al calor; se dejará reposar en la incubadora a 37 °C por 72 h. Después, se filtró el extracto obtenido con papel filtro. Posteriormente, se evaporó el etanol en el rotavapor a una temperatura de 68°C y 240 revoluciones. Según lo ejecutado por Salih, (2014), el extracto obtenido se secó por completo en una incubadora a 40 °C por 6 h, Este proceso se lo realizó por duplicado y se repitió con todas las especies de ortiga. 2.2.3.4. Extracción Soxhlet Con papel filtro se formaron cartuchos de 5,5 x 7,5 cm, en el cual se depositará 25 g de material vegetal pulverizado. Luego, se montó el equipo de extracción Soxhlet, en el interior del tubo extractor se colocaron dos cartuchos y en el balón se vertió 300 mL de metanol al 99% junto con 3 perlas de ebullición. Posteriormente, se calentó la plancha a una temperatura de 110 °C y se inició el flujo de agua del condensador. Este proceso se mantuvo durante 18 h hasta que se redujo visiblemente la coloración del solvente más el extracto. Finalmente, se evaporó el metanol en el rotavapor a una temperatura de 68°C y 240 revoluciones. El proceso se lo realizó por duplicado con las cuatro especies de ortiga. 2.2.3.5. Almacenamiento Los extractos obtenidos se recolectaron en frascos herméticos de vidrio oscuro y se los almacenó en un congelador a una temperatura de -20°C. 14 2.2.4. Concentración Mínima Inhibitoria (CMI) y Concentración Mínima Bactericida (CMB) 2.2.4.1. Diluciones de los extractos Las diluciones se realizaron en tubos Eppendorf correctamente esterilizados. Se utilizó agua de peptona como diluyente, la mezcla se homogeneizó en un vórtex a una velocidad de 30 rpm por 5 minutos. Las concentraciones iniciales fueron de 100 μg/mL, 80 μg/mL, 60 μg/mL, 40 μg/mL, 20 μg/mL, 10 μg/mL. Posteriormente, se realizó una segunda y tercera secuencia de diluciones, dependiendo de los resultados obtenidos para medir la CMI. 2.2.4.2. Activación de las cepas En lo que respecta a las cepas bacterianas, se realizó la activación de las mismas siguiendo las instrucciones de la casa comercial. Luego se realizó la siembra en el medio de cultivo PCA (Plate Count Agar), siguiendo la técnica de estriación por el método escocés, con ayuda de un asa bacteriológica. Posteriormente, las cajas Petri correctamente rotuladas se incubarán a 37ºC por 24 horas, en forma invertida. 2.2.4.3. Concentración Mínima Inhibitoria (CMI) 2.2.4.3.1. Preparación del inóculo. Se realizó la estandarización hasta 0,5 de la escala de MacFarland (1,5 x 10 8 UFC/ml), siguiendo la metodología planteada por Alcaide et al., (2017). 15 2.2.4.3.2. Preparación de las placas de microdilución Para el desarrollo de este apartado de utilizó una placa de microtitulación de 96 pocillos (8x12). Se depositaron 100 μL de las diluciones previamente preparadas junto con 100 μL del inóculo estandarizado, como control positivo se utilizó gentamicina y como control negativo agua de peptona, esto se lo puede apreciar en la figura 3. Seguidamente, las placas se cubrieron con su tapa correspondiente y se incubaron a 37°C por 24 horas. Este procedimiento se lo realizó por triplicado con todos los extractos y bacterias Posteriormente, se colocó en cada pocillo 20 μL de una solución de resazurina al 0.02% y se incubó por 2 horas. Trascurrido este tiempo se observó el cambio de coloración en cada pocillo, lo que indica la presencia o ausencia de crecimiento bacteriano (Ortega, 2018). Por último, dependiendo de los resultados de la prueba colorimétrica de resazurina se realizaron diluciones a menor escala entre distintos rangos de concentración y se repitió el proceso descrito anteriormente (Figura 4). Esto se lo realizó en dos ocasiones y en la última cuya escala fue menor, se identificó el pocillo que no presentó crecimiento bacteriano, el cual fue considerado para la CMI. Figura 3 Representación gráfica de la ´primera fase de la preparación de la placa de microtitulación Fuente: Elaboración Propia 16 Figura 4 Representación gráfica de la segunda y tercera fase de la preparación de la placa con distintas diluciones. Fuente: Elaboración Propia 2.2.4.4. Concentración Mínima Bactericida (CMB) En este apartado, primero se prepararon cajas Petri con medio PCA, correctamente rotuladas. Luego, se homogeneizó con la micropipeta el contenido de los pocillos que no presenten turbidez. Se tomó el inoculo homogeneizado de cada pocillo y se realizó una siembra por con un asa bacteriológica sobre las placas preparas. Consecutivamente, se incubó a 37°C y se leyó a las 24, 48 y 72 horas. Finalmente, identificó en las placas la ausencia de colonias bacterianas. (García et al., 2008, Robalino, 2019). 17 Figura 5 Representación de la metodología aplicada en la evaluación de la actividad antimicrobiana. Fuente: Elaboración Propia 2.2.5. Actividad antioxidante La evaluación de la actividad antioxidante de los diversos extractos se llevó a cabo utilizando 1,1-difenil-2-picrilhidrazilo (DPPH). Brevemente, se preparó una solución stock de cada extracto a una concentración 3000 µg/mL, para lo cual se mezclaron 30 mg de extracto con 10 mL de una solución metanol-agua en una proporción 50:50 (v/v). Se realizaron diluciones adicionales en serie, de 2000, 1500, 1000, 500 y 250 µg/mL, a partir de la solución madre. Se preparó una solución de DPPH al 150 µM, utilizando como diluyente una solución metanol-agua en una proporción 80:20 (v/v). Se utilizó una placa de microtitulación de 96 pocillos, en los cuales se mezclaron 20 µL de las diluciones con 180 µL de solución de DPPH. La mezcla de reacción se agitó y luego se mantuvo en un cuarto oscuro a temperatura ambiente durante 40 min (Mzid et al., 2017; Pazmiño, 2008). Adicionalmente, para la curva de calibración se utilizó como estándar una solución madre de Trolox de concentración 500 μM para lo cual, se prepararon diluciones en metanolagua (50:50), hasta alcanzar concentraciones de 50, 100 200, 300, 400 y 500 μM. El control se lo consiguió al mezclar 180 µL de DPPH con 20 µL de metanol-agua (50:50). 18 El blanco se conformó por 180 µL del diluyente de DPPH con 20 µL del diluyente del Trolox o extractos. La densidad óptica se midió a 517 nm utilizando un espectrofotómetro (Telenchana, 2019; Rets’epile et al., 2020). Se usó la siguiente ecuación para calcular el porcentaje de actividad eliminadora de radicales DPPH de los extractos. 𝑨 −𝑨 % 𝑰𝒏𝒉𝒊𝒃𝒊𝒄𝒊ó𝒏 𝑫𝑷𝑷𝑯 = [𝟏 − ( 𝑨𝒎−𝑨 𝒃)]*100 𝒄 𝒃 Donde, Am: Absorbancia de la muestra Ab: Absorbancia del blanco Ac: Absorbancia del control Cada experimento se llevó a cabo por triplicado y se usó los promedios de los tres valores para calcular los valores de IC50. 2.2.6. Cuantificación de fenoles totales El contenido fenólico se evaluó por medio de método de Folin y Ciocalteu. Para ello, en una placa de microtitulación de 96 pocillos se mezclaron 10 μL de muestra con 130 μL de agua destilada y10 μL del reactivo Folin-Ciocalteu (2 N). Trascurridos 6 minutos se añadieron 100 µL de carbonato de sodio al 7% (p/v). Posteriormente, en un lugar oscuro y a temperatura ambiente se incubaron las placas durante 90 minutos. Finalmente se midió la absorbancia a 750 nm. La curva de calibración se la realizó con diluciones de 10 a 100 mg/L de ácido gálico (GAE). El procedimiento se lo realizó por triplicado con cada una de las muestras y los resultados se expresaron como equivalentes de miligramos de ácido gálico por gramo de peso seco de la muestra (mg GAE/g DW). 19 CAPÍTULO III RESULTADOS Y DISCUSIÓN 3.1. Análisis y discusión de resultados 3.1.1. Rendimiento de los extractos Los extractos de las cuatro especies de ortiga (U. dioica, U. urens, U. leptophylla y U baccifera) se obtuvieron por medio de una extracción con disolventes (etanol y metanol). La extracción hidroalcohólica presentó un mayor rendimiento para U. leptophylla, el cual fue de 1,403%, mientras que, la extracción Soxhlet cuyo disolvente fue metanol, alcanzó un rendimiento máximo de 2,487% para U. dioica. En la tabla 3, se aprecia el rendimiento de cada especie vegetal. De acuerdo con Hernández et al., (2020), la bioactividad y el rendimiento de los compuestos bioactivos de una extracción depende de diversos factores, tales como, la polaridad del disolvente, la temperatura, el tiempo de extracción, la composición química del compuesto extraíble y la relación sólido-líquido. Según, Bañuelos et al., (2018), los extractos vegetales contienen monoterpenos, diterpenos, triterpenos, tetraterpenos, sesquiterpenos,y politerpenos, además una gran cantidad de radicales funcionales como cetonas, carburos, aldehídos, alcoholes, éteres, ésteres, peróxidos y fenoles que confieren la capacidad biológica a las plantas. Tabla 3 Rendimiento de los extractos de los diferentes tipos de ortiga Especies Rendimiento de los extractos (%p/v) Etanólico-Macerado Metanólico-Soxhlet U. dioica 1,318c ± 0,11 2,487a ± 0,08 U. urens 0,974d ± 0,04 2,150b ± 0,1 U. leptophylla 1,403c ± 0,09 2,340a,b ± 0,08 U. baccifera 0,608e ± 0,02 1,336c ± 0,09 Nota: Los valores presentados en la tabla representan la media de los rendimientos obtenidos por duplicado con su respectiva desviación estándar. Las letras representan la 20 diferencia significativa entre el rendimiento de los diferentes extractos (P ≤ 0.05).Los análisis estadísticos se llevaron a cabo con Minitab. Mediante el análisis de varianza ANOVA y la prueba de rangos múltiples Tukey, se identificó que los factores de estudio presentan un efecto estadísticamente significativo sobre el rendimiento, a un de nivel de confianza del 95% (p < 0,05). El análisis estadístico ejecutado se lo puede apreciar en el ANEXO C. El rendimiento derivado de la extracción hidroalcohólica muestra valores estrechamente bajos, la alta concentración de etanol (96%) puede ser la responsable de este hecho, dado que, en una previa investigación ejecutada en Túnez, al utilizar etanol al 70% obtuvieron un rendimiento de 4.768 % (Mzid et al., 2017). Por otra parte, la extracción con metanol al 99% muestra un rendimiento superior a su contraparte. Stanojević et al., (2016), en su respectiva investigación obtuvo un rendimiento del 18,25% y especifica que concentraciones de metanol superiores al 50 % v/v generan una disminución significativa en el rendimiento. Asimismo, la variación existente entre los rendimientos de los extractos se atribuye a las polaridades de los diferentes compuestos presentes en las distintas especies (Ahmed et al., 2022). Por otra parte, el tamaño de las partículas de la matriz vegetal también puede influir en la eficiencia de la extracción, mientras menor sea el tamaño de las partículas los solventes penetrarán de mejor manera, facilitando la difusión de los solutos (Zhang et al., 2018). 3.1.2. Actividad antioxidante La actividad antioxidante se evaluó por medio del método de captación de radicales libres DPPH. Los resultados basados en el porcentaje de inhibición de radicales DPPH de los extractos de las distintas especies vegetales se evaluó a concentraciones variables de 250 µg/mL hasta 3000 μg/mL. En la tabla 4, se presentan los valores correspondientes a esta actividad bióloga. 21 Tabla 3 Porcentaje de inhibición de los radicales de DPPH de los extractos de diferentes especies de ortiga Extracto Porcentaje de Inhibición por especie (%) Concentración (μg/mL) U. dioica U. urens U. baccifera 6,78wx Etanólico 250 22,77rst ± 1,77 5,91wx ± 0,36 Macerado 500 33,41klm ± 0,63 24,03pqrst ± 0,59 10,40uvw ± 0,68 13,48uv ± 1,07 1000 46,81hi 27,82opq ± 1,07 1500 49,80fgh ± 1,30 35,93kl ± 1,84 26,95opq ± 1,19 35,86kl 2000 54,37ef ± 1,54 43,03ij ± 2,07 33,02lmn ± 0,72 49,88fgh ± 0,96 3000 62,49d ± 2,49 53,03efg ± 0,85 47,99h ± 0,90 57,13e ± 1,66 Metanólico 250 3,70x ± 1,27 26,02opqr ± 1,04 3,08x ± 0,46 35,43jk ± 1,31 Soxhlet 500 6,62wx ± 1,70 35,18klm ± 2,80 9,78vw ± 1,44 46,89gh ± 0,71 1000 15,17u ± 0,74 42,80 ij ± 1,97 15,24u ± 1,41 65,92c ± 1,29 1500 25,79opqr ± 1,16 55,66e ± 0,93 20,25pqrst ± 3,24 71,10b ± 1,79 2000 30,72mno ± 0,74 62,66d ± 1,97 23,09 ± 2,24 73,09ab ± 1,29 3000 41,65j 67,28cd ± 2,01 35,80kl ± 2,34 76,83a ± 0,93 ± 1,78 13,48uv U. leptophylla ± 1,30 ± 1,52 28,37nop ± 0,83 ± 1,29 21,12st ± 1,48 Porcentaje de inhibición de los radicales de DPPH de los extractos de diferentes especies de ortiga. Nota. El ensayo se realizó por triplicado. Las letras representan la diferencia significativa entre los porcentajes de inhibición de DPPH (P ≤ 0.05). A través del análisis de varianza ANOVA y la prueba de rangos múltiples Tukey, se identificó que los factores estudiados exhiben un efecto estadísticamente significativo sobre los porcentajes de eliminación de DPPH, a un nivel de confianza del 95% (p< 0,05). El análisis estadístico se lo puede evidenciar en el ANEXO D. 22 ± 0,49 Tabla 4 Capacidad antioxidante en equivalentes Trolox de las matrices vegetales Extracto Matriz vegetal % de µmol Equivalente Inhibición Trolox/L U. dioica 62,49 ± 2,49c U. urens 53,03 ± 0,85e U. leptophylla 33,02 ± 0,72f U. baccifera 57,13 ± 1,66d U. dioica 41,65 ± 1,29g Metanólico- U. urens 67,28 ± 2,01b Soxhlet U. leptophylla 35,80 ± 2,34h U. baccifera 76,83 ± 0,93a Etanólico 356,02 ± 297,43 ± 8,57c 263,08 ± 323,02 ± 0,95f 1,91e 5,72d 225,90 ± 382,50 ± 3,72g 204,19 ± 435,80 ± 0,93h 1,86b 2,79a Nota. Los valores del porcentaje de inhibición de DPPH son resultado del promedio de 3 repeticiones. Mientras que, el resultado de expresado en µmol Equivalente Trolox/L se obtuvo por medio de la media de 2 repeticiones, se presenta su respectiva desviación estándar. Las letras representan la diferencia significativa entre los porcentajes de inhibición de DPPH (P ≤ 0.05). Mediante el análisis de varianza ANOVA y la prueba de rangos múltiples Tukey, se demostró que los factores analizada exteriorizan un efecto estadísticamente significativo sobre los porcentajes de eliminación de DPPH y los µmol de equivalente Trolox a un nivel de confianza del 95% (p< 0,05). El análisis estadístico se lo puede evidenciar en el ANEXO E. 23 Figura 6 Porcentajes de Inhibición de DPPH a distintas concentraciones de los extractos vegetales Porcentaje de inhibición DPPH 90 80 Inhibición DPPH (%) 70 60 50 40 30 20 10 0 ET.Ud ET.Uu ET.Ul ET.Ub MT.Ud MT.Uu MT.Ul MT.Ub Extractos 250 µg/mL 500 µg/mL 1000 µg/mL 1500 µg/mL 2000 µg/mL 3000 µg/mL Nota: ET.Ud: Extracto etanólico de U. dioica; ET.Uu: Extracto etanólico de U. urens; ET.Ul: Extracto etanólico de U. leptophylla. ET.Ub: Extracto etanólico de U. baccifera. MT.Uu: Extracto metanólico de U. dioica; MT.Uu: Extracto metanólico de U. urens; MT.Ul: Extracto metanólico de U. leptophylla. MT.Ub: Extracto metanólico de U. baccifera. La técnica DPPH se basa en la capacidad que poseen los compuestos antioxidantes de las muestras para neutralizar los radicales libres DPPH, por medio de la transferencia de electrones, convirtiéndolos en compuestos estables (Bouabid et al., 2020). Todos los extractos analizados presentaron capacidad antioxidante, lo que demuestra la capacidad que poseen los compuestos fitoquímicos para donar un átomo de hidrógeno y neutralizar los radicales (Cidade et al., 2020). Sin embargo, el porcentaje varió considerablemente dependiendo de la especie vegetal y el medio de extracción. En la figura 6 se puede evidenciar el porcentaje de inhibición es directamente proporcional con la concentración de los extractos. Los extractos hidroalcohólicos arrojaron a U. dioica como la mejor 24 especie para inhibir radicales libres, con un porcentaje máximo de 62,49 ± 2,49 % a la concentración del extracto más alta (3000 mg/mL), seguidamente se encuentran U. baccifera, que presenta un alto índice de similitud con la anterior, alcanzando una diferencia inferior al 6%. Luego se encuentra U. urens con un porcentaje de 53,03±0,85% y por último U. leptophylla, no consiguió superar el 50% de inhibición. En el caso de los extractos metanólicos obtenidos mediante extracción Soxhlet, U. baccifera demostró ser la especie con un más alto nivel antioxidante logrando un 76,83 ± 0,93%. U. leptophylla presentó valores con rangos bajos en los dos métodos de extracción (Tabla 4). El comportamiento de los diferentes extractos es muy similar al alcanzado en informes anteriores, Rets’epile et al., (2020), en su investigación llevada a cabo con diferentes solventes, identificó que el extracto metanólico de U. urens alcanza un porcentaje de inhibición de 73.84±6.82%. En contraste, Mzid et al., (2017), al utilizar un extracto etanólico de U. urens obtuvo un porcentaje depurador de 93,56 %, sin embargo, el patrón de referencia fue el ácido ascórbico. En el mismo contexto, Semalty et al., (2010), evaluó esta actividad biológica con raíces de U. dioica, con un extracto etanólico y metanólico, arrojando un porcentaje inhibitorio de 45,03± 0,0005% y 46,71 ± 0,0011%, respectivamente. De igual modo, en un análisis llevado a cabo en Brasil, Gindri et al., (2014) probaron que U. baccifera consigue inhibir un 12.30 ± 2.09% a una concentración de 250 mg/mL. Estos resultados se asemejan considerablemente con los obtenido en la presente investigación. En la tabla 5, se puede evidenciar el resultado del porcentaje de inhibición a mayor concentración de extracto, reflejado en equivalentes Trolox, el cual se utilizó como patrón de referencia en la construcción de la curva de calibración. De igual manera, en la tabla 6, se evidencia la concentración necesaria para neutralizar el 50% de los radicales libres, determinando que el extracto metanólico de U. dioica y U. leptophylla, junto con el extracto etanólico de esta última, inhiben el 50% de los radicales libre de DPPH con concentraciones superiores a los 3000 ug/mL. 25 Tabla 5 Concentración de extractos necesaria para inhibir el 50% de radicales DPPH. Extractos IC50 (ug/mL) Etanólico-Macerado Metanólico-Soxhlet U. dioica 1334,39 ± 1,39 >3000 U. urens 2665,75 ± 0,83 1165,56 ± 3,39 U. leptophylla >3000 >3000 U. baccifera 2407,24± 1,49 468,16 ± 1,27 De acuerdo con Köksal et al., (2016), la capacidad antiradicales se debe principalmente a la cantidad de compuestos fenólicos distribuidos en las plantas, que detienen las reacciones de oxidación en cadena y actúan como quelantes de metales, agentes reductores, mensajeros químicos, reguladores fisiológicos e inhibidores del ciclo celular. De igual manera, Ahmed et al., (2022) afirman que el solvente utilizado en la extracción es el factor más influyente al momento de extraer compuestos bioactivos en una técnica de extracción sólido-líquido, esto debido a la influencia que ejercen las polaridades de los solventes, lo que explicaría la variabilidad existente en los resultados. Asimismo, en diversas investigaciones, el metanol ha demostrado una buena eficiencia en una extracción sólido-líquido, dado que este diluyente no degrada los compuestos fenólicos, debido a que no promueve la formación de peróxido de hidrógeno (Borges et al., 2020). Adicionalmente, los resultados también estarían influenciados por la procedencia, época de recolección, tratamiento y calidad de las especies vegetales, puesto que son factores determinantes en el rendimiento y concentración de compuestos fenólicos (Cuti & Prado, 2019). 3.1.3. Compuestos fenólicos totales La cantidad de compuestos fenólicos presentes en las ortigas está influenciada por el estado vegetativo, la época de cosecha, el genotipo, la variedad, el suelo, el clima, el almacenamiento, e incluso depende significativamente de las partes de la planta, las hojas son la sección más rica en estos compuestos bioactivos (Kregiel et al., 2018). Garofulić et al., (2021) & Zeković et al., (2017), mencionan que en las hojas de ortiga los principales compuestos fenólicos son la rutina, ácido sinápico, cafeico, clorogénico, p26 ácido cumárico, naringenina y naringina, sin embargo, Garofulić et al., (2021) informan que los ácidos cinámicos y flavonoles abundan en las zonas aéreas de las ortigas. La cuantificación de compuesto fenólicos se llevó a cabo utilizando el método colorimétrico de Folin-Ciocalteu. La determinación de estos compuestos se ejecutó en base a una curva estándar de ácido gálico (GAE), que se diseñó en concentraciones variables de 10 a 100 GAE.mg/L. En la tabla 7 se muestra los resultados calculados en base a la ecuación A750 nm = 0,0027 [GAE] + 0,113 (R2 = 0,9989). En diversos estudios se ha probado que el etanol y metanol al ser solventes polares presentan una excelente afinidad por los compuestos bioactivos (Stanojević et al., 2016). Sin embargo, los valores obtenidos muestran que los extractos etanólicos superan ampliamente a los extractos metanólicos, en relación al índice de compuestos fenólicos en relación (Tabla 7). De acuerdo con, (Flórez et al., 2022) esta variación puede ser debido al método de extracción Soxhlet, dado que, la alta temperatura de trabajo puede generar la destrucción de productos químicos termolábiles y la evaporación del solvente, produciendo impurezas indeseables en el extracto. Kowalska et al., (2021) avalan esta teoría, puesto que, en su respectiva investigación trabajaron a temperaturas de ≤ 35 °C y 105 °C, logrando mejores resultados a menor temperatura, los autores afirman que el tratamiento térmico moderado puede haber determinado la escisión de los enlaces glucosídicos de los azúcares fenólicos y la producción de aglicones fenólicos, que reaccionan con mayor facilidad al reactivo de Folin-Ciocalteu. En la presente investigación se identificó que el extracto etanólico de U. dioica presenta un mayor contenido polifenólico (87,840 ± 2,835 mg GAE/g), en contraste, en un análisis preliminar Kowalska et al., (2021) al usar con alcohol anihidro a 50°C alcanzaron valores de 31,9 mg GAE/L, lo que refuerza la teoría de que la temperatura de extracción influye en directamente en la cantidad de compuestos bioactivos. Como se mencionó en el apartado anterior, los compuestos fenólicos son los principales responsables de la capacidad antioxidante, y eso se puede comprobar al comparar los resultados de la tabla 4 y 5 con la tabla 6, lo que demuestra su íntima relación. En comparación con estudios previos, en Irán se obtuvieron valores bajos con esta especie (24.1 mg GAE/g) (Kukrić et al., 2012a), sin embargo, en Bosnia reportan 208.37 mg GAE/g (Pourmorad et al., 2006), los dos estudios se realizaron con extractos etanólicos. Por otro lado, en Turquía, la extracción Soxhlet con metanol presentó una cantidad de 27 compuestos fenólicos de 332,19 ± 2,79 mg GAE/g (Özkan et al., 2011), lo que supera ampliamente a los obtenidos en este estudio. Estos resultados se acoplan a lo planteado por Kregiel et al., (2018), quienes indican que el clima y el lugar de procedencia de las muestras influye en el rendimiento de compuestos activos. Al respecto, el contenido fenólico de U. baccifera se asemeja al de Moncayo et al., (2021) que fue de 61.55 ± 1.54 mg GAE/mL. Con respecto a U. leptophylla no se encontraron estudios que hayan evaluado su capacidad antioxidante y compuesto fenólicos. Tabla 6 Contenido de fenoles totales de los extractos provenientes de cada especie vegetal. Extracto Fenoles totales Matriz vegetal Absorbancia (750 nm) U. dioica 0,350 ± 0,008 87,840 ± 2,835a Etanólico- U. urens 0,306 ± 0,004 70,160 ± 1,728c macerado U. leptophylla 0,324 ± 0,002 41,111 ± 0,740e U. baccifera 0,338 ± 0,003 83,333 ± 1,111b U. dioica 0,187 ± 0,002 27,435 ± 0,804f Metanólico- U. urens 0,303 ± 0,004 70,494 ± 1,464c Soxhlet U. leptophylla 0,166 ± 0,003 19,654 ± 1,101g U. baccifera 0,254 ± 0,002 52,136 ± 0,756d (mg GAE/g) Nota. Los valores de absorbancia son resultado del promedio de 3 repeticiones. Mientras que, el resultado de fenoles totales (mg GAE/g) se consiguió por medio de la media de 3 repeticiones. Las letras representan la diferencia significativa entre los porcentajes de inhibición de DPPH (P ≤ 0.05). Mediante el análisis de varianza ANOVA y la prueba de rangos múltiples Tukey, se demostró que los factores analizados manifiestan un efecto estadísticamente significativo sobre la cantidad de fenoles totales, a un nivel de confianza del 95% (p< 0,05). El análisis estadístico se lo puede evidenciar en el ANEXO F. 28 3.1.3. Actividad antimicrobiana 3.1.3.1. Concentración Mínima Inhibitoria y Concentración Mínima Bactericida Las especies de la familia Urticaceae presentan un alto índice de actividad antimicrobiana frente a bacterias Gram-positivas y Gram-negativas, comparable con agentes antimicrobianos como el nitrato de miconazol, la amoxicilina, la ofloxacina y la netilmicina (Kregiel et al., 2018). Su capacidad antimicrobiana se debe principalmente a que son ricas en terpenoides, carotenoides, flavonoides, esteroles y poseen un elevado número de polifenoles (Đurović et al., 2017). La evaluación de actividad antimicrobiana se llevó a cabo mediante el método de microdilución en placas de 96 pocillos basado en resarzurina. Se presenció efectos inhibidores significativos por parte de los extractos etanólicos y metanólicos de las distintas especies de ortiga, frente a la S. aureus ATCC 12600, E. coli ATCC 11775, L. monocytogenes ATCC 19115, B. cereus ATCC 10876. El análisis se ejecutó en 3 fases, partiendo de concentraciones de extracto de 10 µg/mL a 100 µg/mL, hasta en posteriores diluciones alcanzar la CMI. Tabla 7 Concentración mínima inhibitoria de los diferentes extractos frente a cuatro cepas bacterianas. CMI (μg/mL) Extractos Matriz vegetal E. coli Etanólico Metanólico Soxhlet S. aureus L. monocytogenes B.cereus U. dioica 52,00 ± 0,87c 31,50 ± 0,87ab 13,77 ± 0,46d 17,00 ± 0,87d U. urens 33,00 ± 0,87d 41,50 ± 0,87a 26,00 ± 0,00c U. leptophylla 53,50 ± 0,00bc 28,50 ± 0,87bc 23,00 ± 0,87c 31,50 ± 0,87a 13,00 ± 0,87e U. baccifera 27,00 ± 0,87e 13,03 ± 0,40e 21,50 ± 0,87c 16,00 ± 0,35e U. dioica 52,00 ± 0,87c 48,50 ± 0,87a 13,03 ± 0,40d 16,20 ± 0,35e U. urens 54,00 ± 0,00b 11,00 ± 0,00e 13,77 ± 0,46d 13,27 ± 0,40e U. leptophylla 66,00 ± 0,00a 26,00 ± 0,00cd 28,00 ± 0,87b 16,50 ± 0,87e 16,00 ± 0,35f 16,70 ± 0,52d 0,87b 28,50 ± 0,87b U. baccifera 26,50 ± Nota. Los valores de la CMI son resultado de la media de 3 repeticiones. Las letras representan la diferencia significativa entre la CMI evaluada para cada cepa microbiana. (P ≤ 0.05). 29 Mediante el análisis de varianza ANOVA y la prueba de rangos múltiples Tukey, se demostró que los factores analizados manifiestan un efecto estadísticamente significativo la CMI de cada cepa bacteriana, a un nivel de confianza del 95% (p< 0,05). El análisis estadístico de cada bacteria se lo puede evidenciar en el ANEXO F. Tabla 8 Concentración mínima bactericida de los diferentes extractos frente a cuatro cepas bacterianas. Extractos Etanólico Metanólico Material CMB (μg/mL) vegetal E. coli S. aureus L. monocytogenes B.cereus U. dioica ≥52,00 ≥31,50 ≥14,30 ≥16 U. urens ≥34,50 ≥14,50 ≥41,50 ≥27 U. leptophylla ≥53,50 ≥28,50 ≥23,00 ≥32 U. baccifera ≥28,50 ≥13,50 ≥22,50 ≥16 U. dioica ≥52,00 ≥48,50 ≥13,50 ≥17 U. urens ≥54,00 ≥ 12,50 ≥14,30 ≥13 U. leptophylla ≥67,50 ≥26,00 ≥28,00 ≥16 U. baccifera ≥17,50 ≥17,3 ≥27,50 ≥27 Los valores establecidos en la tabla 8, muestran que existe diferencia significativa entre los extractos vegetales con cada uno de los patógenos. Asimismo, se identifica que el extracto etanólico (EtOH) y metanólico (MtOH) de U. leptophylla necesita una concentración más elevada para inhibir el desarrollo de E. coli (66,0 ±0,00 µg/mL) y B. cereus (31,50 ± 0,87 µg/mL), respectivamente. En el mismo contexto el extracto metanólico de U. dioica, relaciona 48,50±0,87 µg/mL para S. aureus y el extracto etanólico de U. urens, 41,50±0,87 µg/mL, frente a L. monocytogenes. De igual manera, U. baccifera demostró ser excepcional para inhibir a E. coli, dado que, requirió de las menores concentraciones tanto para el extracto metanólico como etanólico (16,00 ± 0,35; 27,00 ± 0,87 µg/mL). En el caso de S. aureus, el EtOH de U. urens y U. baccifera junto con el MtOH de U. urens, inhibieron a una menor concentración (13,00±0,87; 13,03±0,40; 11,00±0,00 µg/mL). L. monocytogenes fue contrarrestada a una concentración de 13,77±0,46 µg/mL de EtOH de U. dioica y por último EtOH de U. baccifera junto con MtOH de U.dioica U.urens y U. leptophylla inhabilitaron a B.cereus (16,00±0,35;16,20±0,35;13,27±0,40; 16,50±0,87 µg/mL). La CMB presentó resultados 30 muy similares a los de la CMI, con ligeras diferencias en la concentración de los extractos (Tabla 9). La diferencia de la sensibilidad de las bacterias Gram-positivas (S.aureus, L. monocytogenes, B. cereus) y Gram-negativas (E.coli) puede atribuirse a la diferencia existente entre sus morfologías constitucionales, las bacterias gram-negativas presentan una membrana fosfolipídica externa que contiene los componentes lipopolisacáridos estructurales, esto permite que la pared celular sea menos permeable a compuestos antimicrobianos; por lo tanto, las bacterias Gram-positivas al poseer únicamente una capa externa de peptidoglicano no presentan impermeabilidad, siendo más susceptibles a dichos compuestos (Mzid et al., 2017;Kaushik et al., 2015). De igual manera, Martín, (2018), menciona que, un mecanismo de inhibición de los extractos se basa en los componentes polifenólicos, los cuales se adhieren al ADN de las bacterias, impidiendo la síntesis de proteínas y generación de compuesto, lo que provoca una ruptura de la membrana y posteriormente la muerte celular. Los valores de la CMI de EtOH de U. dioica frente a S. aureus (31,50±0,87 µg/mL) tienen gran similitud con los obtenidos por Belabbas, (2020), que fueron de 0,039 mg/mL frente a la cepa S. aureus ATCC 29213. Sin embargo, existe una alta variación con respecto a la CMI alcanzada por el mismo autor frente a L. monocytogenes ATCC 7644 (2.5 mg/mL) y B. cereus ATCC 10876 (0.156 mg/mL) y E. coli ATCC 10536 (1,25 mg/mL). Esta tergiversación puede ser resultado de las cepas bacterianas utilizadas, dado que Kukrić et al., (2012), realizó un experimento con los mismos parámetros (EtOH de U. dioica) frente a E. coli del tracto urinario y E. coli de los alimentos, obteniendo resultados diferentes, 72.43 y 36, 21 µg/mL, respectivamente. Dichos valores se asemejan más a los obtenido en esta investigación. En un experimento ejecutado en la India, determinaron que el MtOH de U. dioica logra una CMI para E. coli a 125 µg/mL y 250 µg/mL para S. aureus (Rolta et al., 2020). El estudio de Mzid et al., (2017) reportó que los EtOH de U. urens exhiben actividad altamente bactericida frente a S. aureus, B. subtilis y E. coli a una concentración de 150 µg/mL. Según, la actividad antimicrobiana de EtOH de U. urens está influenciada por los componentes de tipo terpenos y flavonoides, puesto que en el análisis fitoquímico evidenciaron la presencia de triterpenos y flavonoides (Salem et al., 2021). Como se puede evidenciar, existe gran incertidumbre conforme a los resultados planteados por distintos autores, Kregiel et al., (2018) reafirma lo propuesto por Cuti & Prado, (2019) y sugiere que las variaciones pueden estar asociadas con la hábitat de la planta, su ubicación y condiciones climáticas, también puede influir las técnicas aplicadas para la extracción y métodos de evaluación. 31 CAPITULO IV CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES 4.1. Conclusiones Se identificó que los extractos metanólicos obtenidos mediante el método Soxhlet generan rendimientos superiores a los extractos hidroalcohólicos. U. dioica y U. leptophylla exhibieron los mejores rendimientos en la extracción metanólica, con valores de 2,487 ± 0,08 y2,340 ± 0,08, respectivamente. En este contexto, las especies vegetales junto con los solventes influyen significativamente en el rendimiento de los extractos. Todos los extractos analizados presentaron índices aceptables de actividad antioxidante. Se evidenció que la concentración de los extractos y las especies vegetales influyen directamente al porcentaje de inhibición de DPPH. A medida que la concentración aumentó, también lo hizo el porcentaje de inhibición. El extracto metanólico de U. baccifera presentó resultados superiores en relación a sus contrapartes, alcanzando un porcentaje de inhibición de 76,83 ± 0,93 %, equivalente a 435,80 ± 2,79 µmol ET/L. Por otra parte, en lo concerniente a los extractos etanólico, U. dioica demostró un alto poder antioxidante (62,49 ± 2,49% y 356,02 ± 8,57 µmol ET/L). Los extractos presentan índices considerables de compuestos fenólicos, que varían dependiendo de la matriz vegetal, el método de extracción, el tipo de solvente y la temperatura. Basado en estos parámetros, se evidenció que los extractos etanólicos superan ampliamente a los metanólicos. Los fenoles totales se ven influenciados significativamente por los métodos de extracción y la matriz vegetal. La extracción hidroalcohólica de U. dioica y U. baccifera mostraron una mayor cantidad de compuestos fenólicos (87,840 ± 2,835 mg GAE/g y 83,333±1,111 mg GAE/g). Los extractos etanólicos y metanólicos de las cuatro especies de ortiga presentaron actividad inhibitoria frente a bacterias patógenas. En el caso de E. coli, U. 32 baccifera demostró ser una buena opción para inhibir a E. coli, puesto que, necesitó concentraciones menores tanto para el extracto metanólico como etanólico (16,00 ± 0,35; 27,00± 0,87 µg/mL). En el caso de S. aureus, el extracto etanólico de U. urens, inhibió a una menor concentración (13,00±0,87 µg/mL). L. monocytogenes fue neutralizada a una concentración de 13,77±0,46 µg/mL de extracto metanólico de U. dioica y finalmente el extracto metanólico de U.urens inhabilitó a B.cereus con 13,27±0,40 µg/mL. Los métodos de extracción y las especies vegetales afectan considerablemente la CMI de cada bacteria. 4.2. Recomendaciones Examinar métodos de extracción convencionales y no convencionales que permitan mejorar el rendimiento de los extractos, así como también la cantidad y calidad de compuestos bioactivos extraíbles. Utilizar solventes como el agua, acetona, glicerina, hexano a distintas concentraciones, con el fin de evaluar su rendimiento y capacidades biológicas de los extractos vegetales. Analizar otras actividades biológicas como la actividad antiinflamatoria fotoprotectora, antifúngica, hipoglucemiante, antineurodegenerativas, entre otras. Realizar un análisis cromatográfico que permita identificar todos los metabolitos secundarios presentes en cada una de las especies de ortiga. Ejecutar pruebas antimicrobianas con cepas resistentes a antibióticos, con el fin de determinar una posible alternativa a partir de fuentes vegetales para combatir la resistencia microbiana. 33 BIBLIOGRAFÍA Ahmed, N., Dahmane, D., Hafitha, M., Soumeya, M., & Soumeya, K. (2022). Effect of extraction mode on phenolics contents and biological activities of two species of thyme extracts . E ffet dumode d ’ extraction sur les contenus phénoliques et les. 12(2), 3204–3216. 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Fuente Ortigas Extractos Ortigas*Extractos Error Total GL SC Ajust. MC Ajust. Valor F Valor p 3 1 3 8 15 2,16260 4,08343 0,12133 0,05541 6,42278 0,72087 4,08343 0,04044 0,00693 104,07 589,51 5,84 0,000 0,000 0,021 Tabla C2. Prueba de rangos multipes Tukey para los rendimientos de los extractos. Ortigas*Extractos U.dioca -Metanólico U.leptophylla - Metanólico N 2 2 Media 2,4870 A 2,3395 A U.urens -Metanólico U.leptophylla -Etanólico U.baccifera -Metanólico U.dioca -Etanólico U.urens -Etanólico U.baccifera -Etanólico 2 2 2 2 2 2 2,1505 1,4025 1,3665 1,3180 0,9740 0,6075 Las medias que no comparten una letra son significativamente diferentes. ANEXO D. Análisis estadístico de actividad antioxidante 46 Agrupación B B C C C D E Tabla D1. Análisis de varianza ANOVA para la actividad antioxidante Fuente Ortigas Extractos Concentraciones Concentraciones*Extractos Concentraciones*Ortigas Extractos*Ortigas Concentraciones*Extractos*Ortigas Error Total GL 3 1 5 5 15 3 15 96 143 SC Ajust. MC Ajust. 13917,8 4639,26 596,3 596,32 27101,2 5420,24 135,3 27,07 722,0 48,14 16338,6 5446,20 649,2 43,28 207,1 2,16 59667,6 Valor F 2150,59 276,43 2512,62 12,55 22,31 2524,65 20,06 Tabla D2. Prueba de rangos múltiples Tukey para actividad antioxidante Concentraciones*Extractos*Ortigas 3000 Metanólico U. baccifera 2000 Metanólico U. baccifera 1500 Metanólico U. baccifera 1000 Metanólico U. baccifera 3000 Metanólico U. urens 2000 Metanólico U. urens 3000 Etanólico U.dioica 3000 Etanólico U. baccifera 1500 Metanólico U. urens 2000 Etanólico U.dioica 3000 Etanólico U. urens 2000 Etanólico U. baccifera 1500 Etanólico U.dioica 500 Metanólico U. baccifera 3000 Etanólico U. leptophylla 1000 Etanólico U.dioica 2000 Etanólico U. urens 1000 Metanólico U. urens 3000 Metanólico U.dioica 250 Metanólico U. baccifera 1500 Etanólico U. urens 1500 Etanólico U. baccifera 3000 Metanólico U. leptophylla 500 Metanólico U. urens N Media Agrupación 3 78,2910 A 3 74,6728 A B 3 72,7483 B 3 67,7444 C 3 67,2825 CD 3 62,6636 D 3 62,4901 D 3 57,1316 E 3 55,6582 E 3 54,3735 EF 3 53,0339 EFG 3 49,8818 FGH 3 49,8030 FGH 3 49,3457 GH 3 47,9905 H 3 46,8085 HI 3 43,0260 IJ 3 42,8022 IJ 3 41,6474 J 3 38,2602 JK 3 35,9338 KL 3 35,8550 KL 3 35,7968 KL 3 35,1809 KLM 47 Valor p 0,000 0,000 0,000 0,000 0,000 0,000 0,000 500 Etanólico U.dioica 2000 Etanólico U. leptophylla 2000 Metanólico U.dioica 1000 Etanólico U. urens 1000 Etanólico U. baccifera 1500 Etanólico U. leptophylla 250 Metanólico U. urens 1500 Metanólico U.dioica 500 Etanólico U. urens 2000 Metanólico U. leptophylla 250 Etanólico U.dioica 1000 Etanólico U. leptophylla 1500 Metanólico U. leptophylla 1000 Metanólico U. leptophylla 1000 Metanólico U.dioica 500 Etanólico U. baccifera 250 Etanólico U. urens 500 Etanólico U. leptophylla 500 Metanólico U. leptophylla 250 Etanólico U. leptophylla 500 Metanólico U.dioica 250 Etanólico U. baccifera 250 Metanólico U.dioica 250 Metanólico U. leptophylla 3 33,4121 3 33,0181 3 30,7159 3 28,3688 3 27,8172 3 26,9504 3 26,0200 3 25,7891 3 24,0347 3 23,0947 3 22,7738 3 21,1190 3 20,2463 3 15,2425 3 15,1655 3 13,4752 3 13,4752 3 10,4019 3 9,7768 3 6,7770 3 6,6205 3 5,9102 3 3,6952 3 3,0793 KLM LMN MNO NOP OQ OQ R OQ R S Q R S Q R S T Q R S T R S T S T T Tabla D3. Análisis de varianza ANOVA para el equivalente Trolox. Fuente Extracto Especies Extracto*Especies Error Total GL SC Ajust. MC Ajust. Valor F Valor p 1 19,6 19,6 1,15 0,316 3 47622,1 15874,0 929,24 0,000 3 40334,8 13444,9 787,05 0,000 8 136,7 17,1 15 88113,2 Tabla D4. Prueba de rangos múltiples para el equivalente Trolox Extracto*Especies Metanólico U. baccifera Metanólico U. urens Etanólico U. dioica N Media Agrupación 2 435,797 A 2 382,501 B 2 356,023 C 48 U U U V U V U V W V W W X W X W X X X Etanólico U. baccifera Etanólico U. urens Etanólico U. leptophylla Metanólico U. dioica Metanólico U. leptophylla 2 2 2 2 2 323,021 297,427 263,077 225,905 204,192 D E F G H Las medias que no comparten una letra son significativamente diferentes. ANEXO E. Análisis estadístico de los compuestos fenólicos totales. Tabla E1. Análisis de varianza ANOVA de los compuestos fenólicos Fuente Extractos Especies Extractos*Especies Error Total GL SC Ajust. MC Ajust. Valor F Valor p 1 3 3 16 23 4764,7 6004,6 2858,6 34,8 13662,7 4764,68 2001,53 952,87 2,17 2192,88 921,18 438,54 0,000 0,000 0,000 Tabla E2. Prueba de rangos múltiples Tukey para compuestos fenólicos Extractos*Especies N Etanólico U. dioica 3 Etanólico U. baccifera 3 Metanólico U. urens 3 Etanólico U. urens 3 Metanólico U. baccifera 3 Etanólico U. leptophylla 3 Metanólico U. dioica 3 Metanólico U. leptophylla 3 Media Agrupación 87,8365 A 83,3333 B 70,4938 C 70,1577 C 52,1358 D 41,1111 E 27,4346 F 19,6543 G Las medias que no comparten una letra son significativamente diferentes. ANEXO F. Análisis estadístico de la actividad antimicrobiana. 49 ANEXO F1. ANOVA para E. coli Fuente Extractos Especies Extractos*Especies Error Total GL SC Ajust. MC Ajust. Valor F Valor p 1 186,48 186,48 497,29 0,000 3 4937,80 1645,93 4389,16 0,000 3 897,55 299,18 797,82 0,000 16 6,00 0,37 23 6027,84 ANEXO F2. Prueba de rangos múltiples Tukey para E. coli Extractos*Especies Metanólico U.leptophylla N 3 Media Agrupación 66,0 A Metanólico U. urens Etanólico U.leptophylla 3 3 54,0 53,5 B B C Etanólico U.dioica Metanólico U.dioica Etanólico U. urens Etanólico U. baccifera 3 3 3 3 52,0 52,0 33,0 27,0 C C Metanólico U. baccifera 3 15,8 D E F Las medias que no comparten una letra son significativamente diferentes. ANEXO F3. ANOVA para S. aureus Fuente Extractos Especies Extractos*Especies Error Total GL SC Ajust. MC Ajust. Valor F Valor p 1 33,84 33,84 2,14 0,163 3 3667,39 1222,46 77,15 0,000 3 161,86 53,95 3,40 0,043 16 253,53 15,85 23 4116,64 ANEXO F4. Prueba de rangos múltiples Tukey para S. aureus Extractos*Especies Metanólico U.dioica Etanólico U.dioica Etanólico U.leptophylla N 3 3 3 Media 48,5000 A 38,1667 A 28,5000 Metanólico U.leptophylla 3 26,0000 Metanólico U. baccifera 3 16,7000 50 Agrupación B B C C D D E Etanólico U. baccifera 3 13,0333 E Etanólico U. urens Metanólico U. urens 3 3 13,0000 11,0000 E E Las medias que no comparten una letra son significativamente diferentes. ANEXO F5. ANOVA para L monocytogenes Fuente Extractos Especies Extractos*Especies Error Total GL SC Ajust. MC Ajust. Valor F Valor p 1 111,37 111,370 205,29 0,000 3 722,07 240,692 443,67 0,000 3 1133,46 377,820 696,44 0,000 16 8,68 0,543 23 1975,59 ANEXO F6. Prueba de rangos múltiples Tukey para L. monocytogenes Extractos*Especies N Media Agrupación Etanólico U. urens Metanólico U.leptophylla Metanólico U. baccifera 3 3 3 41,5000 A 28,5000 27,0000 B B Etanólico U.leptophylla 3 23,0000 C Etanólico U. baccifera 3 21,5000 C Metanólico U. urens Etanólico U.dioica Metanólico U.dioica 3 3 3 13,7667 13,7667 13,2667 D D D Las medias que no comparten una letra son significativamente diferentes. ANEXO F7. ANOVA para B. cereus Fuente Extractos Especies Extractos*Especies GL SC Ajust. MC Ajust. Valor F Valor p 1 96,40 96,400 226,60 0,000 3 187,29 62,430 146,75 0,000 3 719,64 239,880 563,87 0,000 51 Error Total 16 23 6,81 1010,14 0,425 ANEXO F8. Prueba de rangos múltiples Tukey para B. cereus. Extractos*Especies Etanólico U.leptophylla Metanólico U. baccifera Etanólico U. urens Etanólico U.dioica Metanólico U.leptophylla Metanólico U.dioica Etanólico U. baccifera Metanólico U. urens N 3 3 3 3 3 3 3 3 Media Agrupación 31,5000 A 28,5000 B 26,0000 C 17,0000 D 16,5000 D 16,2000 D 16,0000 D 13,2667 E Las medias que no comparten una letra son significativamente diferentes. ANEXO G. Absorbancia de los extractos en la inhibición de DPPH. ANEXO G1. Absorbancia del extracto etanólico de U. dioica Concentración 3000 2000 1500 1000 500 250 Blanco Control Absorbancia 515 nm (U. dioica) 1 2 3 0,203 0,194 0,215 0,232 0,238 0,245 0,252 0,263 0,258 0,263 0,273 0,275 0,328 0,324 0,329 0,373 0,379 0,364 0,042 0,047 0,047 0,471 0,441 0,493 52 Promedio Desviación 0,204 0,238 0,258 0,270 0,327 0,372 0,045 0,468 0,011 0,007 0,006 0,006 0,003 0,008 0,003 0,026 ANEXO G2. Absorbancia del extracto etanólico de U. urens Concentración 3000 2000 1500 1000 500 250 Blanco Control Absorbancia 515 nm (U. urens) 1 2 3 0,243 0,241 0,248 0,279 0,296 0,284 0,31 0,325 0,314 0,352 0,345 0,348 0,364 0,369 0,367 0,414 0,415 0,405 0,042 0,047 0,038 0,471 0,471 0,441 Promedio Desviación 0,244 0,286 0,316 0,348 0,367 0,411 0,042 0,461 0,004 0,009 0,008 0,004 0,003 0,006 0,005 0,017 ANEXO G3. Absorbancia del extracto etanólico de U. leptophylla Concentración 3000 2000 1500 1000 500 250 Blanco Control Absorbancia 515 nm (U. leptophylla) 1 2 3 0,268 0,261 0,267 0,326 0,332 0,328 0,355 0,349 0,359 0,377 0,374 0,386 0,426 0,426 0,421 0,447 0,432 0,440 0,042 0,047 0,047 0,471 0,441 0,493 Promedio Desviación 0,265 0,329 0,354 0,379 0,424 0,440 0,045 0,468 0,004 0,003 0,005 0,006 0,003 0,008 0,003 0,026 Promedio Desviación 0,227 0,257 0,317 0,351 0,411 0,443 0,045 0,007 0,004 0,002 0,005 0,005 0,002 0,003 ANEXO G4. Absorbancia del extracto etanólico de U. baccifera Concentración 3000 2000 1500 1000 500 250 Blanco Absorbancia 515 nm (U. baccifera) 1 2 3 0,226 0,234 0,22 0,253 0,261 0,258 0,319 0,316 0,315 0,351 0,355 0,346 0,416 0,407 0,411 0,443 0,445 0,442 0,042 0,047 0,047 53 Control 0,471 0,441 0,493 0,468 0,026 Promedio Desviación 0,298 0,345 0,367 0,413 0,450 0,462 0,045 0,478 0,006 0,003 0,005 0,003 0,003 0,003 0,003 0,013 Promedio Desviación 0,187 0,207 0,237 0,293 0,326 0,366 0,042 0,461 0,009 0,009 0,004 0,009 0,012 0,005 0,005 0,017 ANEXO G5. Absorbancia del extracto metanólico de U. dioica Concentración 3000 2000 1500 1000 500 250 Blanco Control Absorbancia 515 nm (U. dioica) 1 2 3 0,303 0,292 0,299 0,344 0,349 0,343 0,362 0,366 0,372 0,409 0,414 0,415 0,453 0,449 0,447 0,465 0,46 0,462 0,042 0,047 0,047 0,471 0,471 0,493 ANEXO G6. Absorbancia del extracto metanólico de U. urens Concentración 3000 2000 1500 1000 500 250 Blanco Control Absorbancia 515 nm (U. urens) 1 2 3 0,183 0,181 0,197 0,199 0,216 0,206 0,233 0,238 0,241 0,284 0,301 0,294 0,324 0,339 0,315 0,370 0,361 0,366 0,042 0,047 0,038 0,471 0,471 0,441 ANEXO G7. Absorbancia del extracto metanólico de U. leptophylla Concentración 3000 2000 1500 1000 500 250 Absorbancia 515 nm (U. leptophylla) 1 2 3 0,335 0,318 0,317 0,389 0,376 0,37 0,375 0,395 0,402 0,407 0,411 0,419 0,443 0,431 0,434 0,463 0,465 0,467 54 Promedio Desviación 0,323 0,378 0,391 0,412 0,436 0,465 0,010 0,010 0,014 0,006 0,006 0,002 Blanco Control 0,042 0,471 0,047 0,471 0,038 0,441 0,042 0,461 0,005 0,017 ANEXO G8. Absorbancia del extracto metanólico de U. baccifera Concentración 3000 2000 1500 1000 500 250 Blanco Control Absorbancia 515 nm (U. baccifera) 1 2 3 0,135 0,143 0,14 0,154 0,15 0,161 0,157 0,161 0,172 0,191 0,18 0,184 0,264 0,262 0,268 0,308 0,319 0,311 0,042 0,047 0,038 0,471 0,471 0,441 Promedio Desviación 0,139 0,155 0,163 0,185 0,265 0,313 0,042 0,461 0,004 0,006 0,008 0,006 0,003 0,006 0,005 0,017 ANEXO H. Curvas de calibración % Inhibición DPPH Figura 7 Curva de calibración para Trolox 100 90 80 70 60 50 40 30 20 10 0 y = 0,1755x + 1,3083 R² = 0,9958 0 100 200 300 400 Concentración de Trolox (µm/mL) 55 500 600 Figura 8 Curva de calibración de ácido gálico. ANEXO I. Concentración Mínima Inhibitoria ANEXO I1. Primera fase de diluciones de los extractos hidroalcohólicos. Bacteria Extracto U. dioica U. urens E. coli U. leptophylla U. baccifera S. aureus U. dioica U. urens Réplicas 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 10 / + + + + + + + + + + + + + + + 20 + + + + + + + + + + + + + + 56 CMI (µg/mL) 40 60 + + + + + + - 80 - 100 - 2 + 3 + + 1 + + U. 2 + + leptophylla 3 + + 1 + U. 2 + baccifera 3 + 1 + 2 + U. dioica 3 + + + 1 + + + 2 + + + U. urens L. 3 + + monocytogenes 1 + + U. 2 + + leptophylla 3 + + 1 + + U. 2 + + baccifera 3 + 1 + + 2 + + + U. dioica 3 + + 1 + + 2 + + U. urens 3 + + B. cereus 1 + + U. 2 + + leptophylla 3 + + + 1 + U. 2 + baccifera 3 + Nota: Los signos positivos (+) muestran aquellos pocillos en los cuales hubo crecimiento - microbiano y los signos negativos (-) aquellos en los que no hubo crecimiento. ANEXO I2. Primera fase de diluciones de los extractos metanólicos, método Soxhlet. Bacteria E. coli Extracto U. dioica U. urens Réplicas 1 2 3 1 2 10 + + + + + 20 + + + + + 57 CMI (µg/mL) 40 60 + + + 78+/+ - 80 - 100 - 3 + + + 1 + + + + U. 2 + + + + leptophylla 3 + + + + 1 + + U. 2 + + baccifera 3 + 1 + + + 2 + + + U. dioica 3 + 1 + 2 + U. urens 3 + + S. aureus 1 + + U. 2 + + leptophylla 3 + + 1 + U. 2 + baccifera 3 + 1 + 2 + U. dioica 3 + + 1 + 2 + U. urens L. 3 + monocytogenes 1 + + U. 2 + + leptophylla 3 + + 1 + + U. 2 + + + baccifera 3 + + 1 + + 2 + U. dioica 3 + + 1 + 2 U. urens 3 + B. cereus 1 + + U. 2 + leptophylla 3 + 1 + + U. 2 + + + baccifera 3 + + Nota: Los signos positivos (+) muestran aquellos pocillos en los cuales hubo crecimiento microbiano y los signos negativos (-) aquellos en los que no hubo crecimiento. 58 - ANEXO J. Fotografías Figura 9 Macerado de los extractos Figura 10 Extracción Soxhlet Figura 11 Extractos etanólicos Figura 12 Figura 13 Extracto metanólico de U. uren Extracto etanólico U. urens Figura 14 Extracto metanólico de U. leptophylla 59 Figura 15 Soluciones stock para actividad Figura 16 Diluciones para actividad antioxidantes antimicrobiana 60 Figura 17 Primera dilución de los extractos etanólicos A: E. coli; B:B.cereus; C: S. aureus; D: L. monocytogenes Figura 18 Primera dilución de los extractos metanólicos A: E.coli: B: L. monocytogenes; C:S.aureus; C:B.cereus 61 Figura 19 Segunda y tercera dilución de los extractos metanólicos. A: Segunda dilución de E. coli y S. aureus; B: Segunda dilución de L. monocitogenes y B.cereus; C: Tercera dilución de E. coli y S. aureus; D: : Tercera dilución de L. monocitogenes y B.cereus. Figura 20 Actividad antioxidante de los extractos etanólicos 62 Figura 21 Actividad antioxidante de los extractos metanólicos Figura 22 Cuantificación del contenido fenólico 63 Figura 23. Concentración Mínima Bactericida de los extractos etanólicos y metanólicos Extractos etanólicos Extractos metanólicos En las dos figuras la primera final presenta la CMB de los extractos de U. dioica, las siguientes filas hacen referencia a U. urens, U. leptophylla y U. baccifera, respectivamente. 64
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