Universidad Michoacana de San Nicolás de Hidalgo Instituto de Investigaciones de los Recursos Naturales Licenciatura en Biotecnología Instituto de Investigaciones Agropecuarias y Forestales Laboratorio de Innovación Agropecuaria “Desarrollo de un refresco probiótico de mango a partir de cepas de bacterias ácido lácticas y levaduras aisladas del mango” ¿Cómo afecta la adición de diferentes cepas de bacterias probióticas en el desarrollo, estabilidad y propiedades organolépticas de un refresco probiótico elaborado a partir de mango? ¿Cómo afecta la fermentación del mango mediante cepas específicas de bacterias probióticas a las propiedades sensoriales, nutricionales y funcionales del refresco resultante, y cuál es su impacto en la viabilidad y estabilidad de los probióticos durante el almacenamiento? Presentado por Samira Meza Ruiz - 2108623g Asesores D.C Enrique Pascual Alvarado D.C Mauricio Perea Peña Resumen El presente estudio investiga el impacto de la adición de diferentes cepas de bacterias y levaduras probióticas en el desarrollo, estabilidad y propiedades organolépticas de un refresco probiótico a base de mango. Los ensayos se llevaron a cabo mediante la fermentación controlada de jugo de mango a una dilución 1:3. Se analizaron parámetros como el pH, producción de alcohol por grados Brix y la viabilidad de las cepas. Además, se realizaron pruebas sensoriales para evaluar la aceptabilidad del sabor, aroma, textura y apariencia del refresco probiótico entre un panel de catadores. Los probióticos afectan positivamente la salud humana al mejorar el equilibrio de la microbiota intestinal y la defensa de la mucosa contra patógenos. Los resultados preliminares indican que el uso de diferentes cepas específicas puede cambiar significativamente tanto la estabilidad como las propiedades organolépticas del producto, proporcionando una bebida saludable y agradable al paladar. Este estudio ofrece una base para el desarrollo de nuevos productos probióticos de frutas, destacando la importancia de la selección adecuada de microorganismos para optimizar tanto la funcionalidad probiótica como la calidad sensorial. Palabras clave: salud, fermentación, estabilidad, aceptabilidad, productos, selección Introducción CUKTIVOS DE MANGO BENEFICIOS DEL MANGO COMPONENTES DEL MANGO USOS DEL MANGO (METER PROBIOTICO) Probiotic bacteria appear to be used in the fermentation of juice to produce beverages with high nutritional benefits and regarded organoleptic quality (Naeem et al., 2020) . La creciente prevalencia de enfermedades crónicas ha llevado a un aumento en la demanda de alimentos y bebidas funcionales, ya que previene y mejora la salud de los consumidores. Sin embargo, la formulación de alimentos probióticos está poco promovida en los países de bajos ingresos, ya que estos últimos requieren matrices alimentarias apreciadas y asequibles para su supervivencia (Marius et al., 2023). Prebiotics and probiotics are very vital components of the human diet today. It has been seen these years that there is a huge development regarding the classification and verification of the advantages of probiotics and prebiotics related to human health.[11,12] Prebiotics (as a source of energy in the process of fermentation) ingestion changes the composition of the gut by fermenting the substrates that increase the number of microbes. Prebiotics have a tremendous impact on the intestinal beneficial bacteria (Bifidobacteria and Lactobacilli) that improves physiological functions like shortchain fatty acids construction and spread the microorganism chain. Besides such profitable effects on the colon, prebiotics also plays a positive in the urogenital tract, skin, and oral cavity. The integral basis for counting other compounds such as polyphenols, whole grain, arabinoxylan, pectin noncarbohydrate, and starches in the list of prebiotics was promoted by authors.[13] (Bashir et al., 2023). An option already highlighted and of interest to researchers is the production of probiotic drinks from fruitjuices. Fruit juices offer natural nutrients and sugars that favor the growth of microorganisms. In addition, thedigestion of these products is facilitated, which results in less permanence in the stomach, resulting in agreater number of viable cells of microorganisms in the intestine (Santos et al., 2023) Probiotics when added to any product produce antioxidants and vitamins after fermentation. Probiotic drinks are used as a potential functional food (Bashir et al., 2023). Fruit juices are consumed and enjoyedworldwide, not only for their taste but also because they are nutritionally important in the human diet. Theycontain water, sugar, proteins, amino acids, vitamins, and minerals and are an appropriate medium formicrobial growth (Santos et al., 2023) The objectiveof this research was to develop a probiotic fermented drink with whole grape juice and to evaluate themicrobiological, physical-chemical, and sensory aspects, as well as the probiotic viability during cold storage Although some studies available in the literature deal with probiotic drinks, we still lack understanding of the viability and survival of probiotic strains during probiotic orange juice storage processes. In this context, the importance of studies on the development of new probiotic products is highlighted. The main objective of this study was to Antecedentes . Hipótesis El refresco probiótico elaborado a partir de mango inoculado con cepas específicas probióticas permite aumentar la vida útil, viabilidad y estabilidad del producto durante el almacenamiento Objetivo general Desarrollar un refresco probiótico de mango y evaluar sus características organolépticas, estabilidad y vida útil Objetivos específicos 1. Seleccionar cepas probióticas adecuadas para la formulación del refresco 2. Desarrollar una fórmula de refresco que permita la viabilidad de las cepas probióticas seleccionadas 3. Evaluar la estabilidad de los probióticos en el refresco bajo diferentes condiciones de almacenamiento 4. Determinar la vida útil del refresco probiótico mediante análisis microbiológicos, fisicoquímicos y sensoriales Materiales y métodos AGREGAR ECUACIONES QUE SE NECESITARÁN O COMO ME VA A DAR EL RESULTADO La investigación se realizará en el Laboratorio de Microbiología Ambiental del Instituto de Investigaciones Agropecuarias y Forestales de la Universidad Michoacana de San Nicolás de Hidalgo, Morelia, Michoacán, México, que se encuentra ubicado en Carretera Morelia Zinapécuaro Kilómetro 9.5, 58880 Tarímbaro, Michoacán. Las variables de respuesta que se determinarán son tiempo, temperatura, pH, concentración de probióticos, Brix, evaluación sensorial, viabilidad, estabilidad nutricional y vida util del refresco de mango durante su almacenamiento Aislamiento de cepas probióticas COMO AISLARON LAS CEPAS DE LACTOBACILUS EN SUERO DE LECHE Para el caso de las levaduras, los mangos Ataulfo (Mangifera indica L. var Ataulfo) y mangos bola (Mangifera indica), se obtuvieron de la Central de Abastos ubicada en Morelia. Se enjuagaron, se cortaron, se les extrajo la pulpa, se licuaron, se colocaron en recipientes desinfectados y se dejó fermentar el concnetrado por 96 h. Después se sembraron ambos concentrados por estriado en agar YPD (Merck) y se incubó a 35°C / 24 h. Preparación del cepas probióticas Se obtuvieron 3 cepas probióticas; Lactobacillus obtenida del suero de leche y 2 cepas de levaduras obtenidas del mango Ataulfo (Mangifera indica L. var Ataulfo) y mango bola (Mangifera indica). Se utilzó suero de leche (colocar composición) para el caso de Lactobacillus (Merck) y caldo malta para las levaduras cuya composición es (g/L) dextrosa 10, peptona 4, extracto de levadura 3 y extracto de malta 3 mL, seguidamente la mezcla se calentó hasta el punto de ebuliición para disolver por completo; ambos medios se esterilizaron a 121 °C a 15 lb de presión por 15 minutos. Los cultivos iniciadores se incubaron a 35 °C por 96 h Los cultivos de lactobacillus, levaduras de mangos Atulfo y Bola tenían alrededor de ,1x 108, UFC/ml de células respectivamente. Preparación del concentrado de mango El mango bola se mezcló en una licuadora, se calentó hasta que alcanzara 60 °C, se agregó 100 gr de azúcar con 100 mL de agua por cada kg de concentrado y se vació en un frasco desinfectado. Seguidamente, el jugo de mango se preparó en las proporciones 1:1, 1:3, y 1:5 (v/v) y se seleccionó la formulación preferida tras una prueba hedónica. Posteriormente se inoculó con las cepas probióticas en condiciones asépticas y las bebidas se mantuvieron a temperatura ambiente (20-23 °C) por 7 días. Pasado el tiempo de fermentación, todas las muestras se almacenaron a 4°C en refrigerador. Cada tratamiento tuvo tres repeticiones. Variables de respuesta hysico-chemical and microbiological determinationsThe chemical composition and microbiological analysis of the whole juice and beverage made with kefirwere analyzed. Soluble solids (SS) (°Brix) were measured in a digital refractometer (Milwaukee, USA) by the directreading method and pH was determined at room temperature in a bench pHmeter Kefir-like beverages were microbiologically evaluated according to Silva and coauthors [18]. Decimaldilutions of samples were prepared in peptonized water (Himedia, India). Total Aerobic Mesophilic Bacteria(MB) were enumerated by spread plating and incubated aerobically at 35°C for 48 h, while lactic acid bacteria(LAB) by pour plating on Man-Rogosa-Sharpe (MRS) agar and incubated anaerobically at 30°C for 48 h.Molds and yeasts (MY) were spread plated on potato dextrose agar (PDA), incubated aerobically at 25°C for5 days. The results were expressed in CFU.mL-1. Total and thermotolerant coliforms were estimated usingthe most probable number technique using lauryl sulfate tryptose broth (LST). To confirm the presence oftotal coliforms, aliquots from the LST tubes exhibiting gas production were transferred to tubes containingbrilliant green broth (BGB) (Difco, Brazil) and EC broth (Difco, Brazil) for thermotolerant coliforms. The tubeswith BGB broth were incubated at 35°C for 48 h, while the tubes containing EC broth were incubated for 24h at 45°C. The results were calculated in the NMP of coliforms.ml-1. All microbiological analyses were donein triplicate a) Tiempo de fermentación Se reportarán 7 tiempos de fermentación 24 h, 48 h y 72 h. b) Temperatura Se evaluarán diferentes grados (°C) 25, 30, 35 La temperatura se determinará con termómetro. c) Concentración de probióticos Se realizó por cuenta viable en placa, para ello, se tomó muestras de 1 mL del inóculo cada 24 h por 120 horas. Se siguió la NOM-092-SSA1-1994 para la cuenta de bacterias aerobias en placa a una proporción 1:10, por lo que para desarrollar las diluciones se necesita de 6 tubos de ensayo con 2.25 mL de SSD cada uno y al primer tubo se le agrega 0.25 mL de medio inoculado, se homogeneiza por 30 segundos con el vórtex y se etiqueta como “dilución 1x10-1”. Posteriormente de la “dilución 1x10-1” se toma 0.25 mL de muestra y se agrega a otro tubo de ensayo con SSD, se homogeneiza y se etiqueta como “dilución 1x10-2”y sucesivamente se siguió este método hasta la “dilución 1x10-6”. Seguidamente se toman los tubos con las diluciones 4, 5 y 6 y se agrega 0.01 mL de muestra a cajas de Petri con agar Sabouraud cuya composición química es (g/L) glucosa 25, peptona de caseina 5, extracto de levadura 1, azul de bromotimol 0.01; pH 5.5. Determinación de unidades formadoras de colonias (UFC) Las UFC de aislados de levadura se calcularon mediante la técnica de placa puntual seguida por Thapa et al. (2015). Brevemente, se inocularon 5 μL de muestras diluidas en serie con la ayuda de una micropipeta en el área marcada en el medio YPD. Las placas se etiquetaron según el factor de dilución y se incubaron a 28 °C por 12 horas. Se contaron las colonias individuales en las muestras más diluidas y se calculó el número de células viables en el cultivo original. Utilizando agar Sharpe Man Rogosa (MRS), se enumeró el medio Lactobacillus rhamnosus. La incubación de las placas se realizó a 35ºC durante 48 h.[21] El número de bacterias se estima indirectamente en función del número de colonias generadas por las células de los microorganismos después de la termostatización a 37°C durante 48 h. Se utilizó agar MRS para contar el recuento total de placas como lo describen Caleja et al. [22] Se tomaron 20 g de agar MRS en placa y luego se disolvieron en los 300 ml de agua destilada. Luego se colocó en un autoclave. Después del autoclave, se mantuvo durante algún tiempo para bajar su temperatura y, después de enfriarse, se prepararon diluciones de seis veces de todas las muestras. Se tomó un suero fisiológico de 9 mL en seis tubos de ensayo cada uno. En el 1er tubo de ensayo, se agregó una muestra de bebida de albaricoque de 1 mL, lo que elevó el volumen a 10 mL. En el siguiente paso, se agregó 1 mL de este tubo de ensayo en el segundo tubo de ensayo que tenía 9 mL de solución salina. Además, se tomó 1 ml del 2º tubo de ensayo y se vertió en el 3º tubo de ensayo y así sucesivamente. De estas muestras diluidas en serie, 0,1 mL se transfirieron a placas de Petri. Estas placas de Petri se incubaron a 37°C durante 24-48 h. Estas placas se observaron debajo del contador de colonias para contar las colonias probióticas y se registraron los resultados. Este procedimeinto fue seguido por Bashir et al., 2023 d) Brix Se evaluó la cantidad de azúcar por medio de refractómetro y se utilizó una escla e) Evaluación sensorial three formulations of whole grape juice fermented by kefir were selected for acceptability by 100untrained tasters over 18 years old who enjoyed whole grape juice and who did not have gastrointestinaldiseases. In the sensory evaluation, the tasters had to drink the sample and answer to a nine-point hedonicscale varying between “liked extremely” (Score 9) and “disliked extremely” (Score 1) for each one of theattributes: flavor, color, aroma, acidity, and overall impression. The attitude scale was also used to assessthe possible frequency of consumption of probiotic beverages by the tasters [19]. The samples (40 ml) wereevaluated in individual booths with white light and served chilled in plastic cups, randomly encoded with three-digit numbers (PDF) Probiotification of Whole Grape Juice by Water Kefir Microorganisms. Available from: https://www.researchgate.net/publication/370035690_Probiotification_of_Whole_Grape_Juice_b y_Water_Kefir_Microorganisms [accessed Jul 07 2024]. f) Evaluación de viabilidad g) Evaluación de estabilidad nutricional h) Evaluación de vida útil i) Análisis estadístico Los datos experimentales se validarán con el programa estadístico ANOVA/Tukey HSD con una diferencia significativa de P<0.05 con Statgraphics Centurion he main experiment consisted of seven proportions of kefir grains (5, 10, 20, 30, 40, 50, and 60 g) in500 ml of whole grape juice. It was outlined using a completely randomized design (CRD), with threerepetitions. Regression analysis was used for describing the correlation between the independent factors(amount of kefir) and the dependent factors (pH, SS, color, TTA, LAB, MB, FY).Another experiment consisted of evaluating three formulations of whole grape juice fermented with kefirat two different times: time 0, which corresponds to the day of storage and the 14th day. It was outlined usinga completely randomized design (CRD), with a 3x2 factorial scheme and three repetitions. The data were submitted to analysis of variance (ANOVA) and the media were compared using the Tukey test with a 5%probability.For the sensory evaluation data was used as a random block design (RBD), in which the treatmentswere the formulations and blocks the judges. The results were evaluated by an analysis of variance and themeans were compared using the Tukey test at 5% probability. All the analyses were conducted using thesoftware GENES – Computational Application for Data Analysis in Experimental Statistics and QUANTITATIVEGENETICS Resultados y discusión Characterization of whole grape juice The whole grape juice presented the following characteristics: 14.73 ± 0.05 °Brix, pH value of 4.15 ±0.03, Cuenta viable All the formulations proposed had a LAB count above 107 CFU.mL-1 (Table 1), indicating that grape juiceis a good growth matrix. For to be classified as probiotic, the minimum number of viable cells ingested fromthe microorganism must be 108 to 109 CFU in the daily product recommendation [Santos et al., 2023]. Thus, for the individualto meet the daily intake recommended by legislation [21], the consumption of probiotic grape juice must beat least 100 mL per day .Evaluación sensorial Desde el punto de vista del marketing, la aceptabilidad de los alimentos es crucial. La preferencia de los consumidores está influenciada por la aceptabilidad y la idoneidad de los productos alimenticios. Los elementos clave de la evaluación sensorial para asegurar la alta calidad de los productos alimenticios son el sabor, el aroma, la apariencia y la aceptabilidad general. El gusto suele definirse como la percepción del sabor de los productos comestibles, ya sea un alimento o una bebida, cuando se exponen a la boca. Todos los tratamientos mostraron puntuaciones aceptables con la adición de diferentes concentraciones de espino amarillo (Bashir et al., 2023). De acuerdo con el análisis de varianza de la Figura 1, los efectos de los tratamientos sobre el sabor, el aroma y la apariencia fueron significativos (P < .05). En la Figura 1 se describen los valores de los tratamientos T0, T2, T3 y T4 mostrando una tendencia significativamente decreciente, excepto para T1 que ha aumentado con la adición de espino amarillo en comparación con T0. Los tratamientos que tenían menos concentración de espino amarillo tuvieron una puntuación de preferencia alta en comparación con una bebida de albaricoque con alto contenido de espino amarillo. T1 y T2 tuvieron diferencias no significativas (P > .05) en comparación con otros tratamientos porque no cambiaron la acidez de la bebida. Del mismo modo, debido al aumento de ácidos orgánicos y al número de bacterias, la puntuación media de aceptabilidad global de T1 y T2 obtuvo puntuaciones altas de 6,4 y 6,2 por parte de los jueces, que fueron ligeramente inferiores a las del tratamiento control (6,8). Los resultados del presente estudio tienen semejanzas con el estudio de Shawi et al. [35] Durante los períodos de almacenamiento, hubo un cambio en la composición química del yogur de espino amarillo suplementado, donde el aumento de la acidez y la disminución del pH hacen que el yogur sea agrio o ácido y que, en última instancia, condujo a un sabor indeseable para los consumidores Grape juice with the addition of 5 g of kefir was considered the best formulation among the others sinceit obtained mean scores for all evaluated attributes ranging from 6.76 to 8.35, these values being within theregion of acceptance of a product (Table 6).When evaluating the frequency of consumption of probiotic juices, only the formulation with the additionof 5 g of Kefir differed statistically from the other drinks (p ≤ 0.05), obtaining an average score of 6.57, whichin the attitude scale indicates the option “I like this and would drink from time to time”. For the otherformulations, the averages varied from 4.14 for the juice with the addition of 60 g and 4.63 for the formulationwith 20 g of Kefir, with no significant difference between the taster's evaluations for these two formulations Some studies report that the fermentation process reduces the SS and the pH of the product, due to theproduction of lactic acid in the medium (Santos et al., 2023) Some studies report the good viability of probiotic microorganisms during the storage of the drink [26,27]. There was a reduction in the cells of the microorganism after 35 days of storage of a fermented applejuice drink without sucrose, however, this reduction did not interfere with the viability of the product [26]. Otherstudies report a reduction in the viability of probiotic strains as a function of the storage time of the drink [28,25]. In this study, 14 days is the maximum time for which probiotic drinks can be stored under refrigeration. However, Furtado and coauthors [25] reportednon-significant differences in pH and SS during the storage of probiotic mango juices In addition, the number of viable cellsof the probiotic microorganism must be high during the entire storage of the drink, so that the microorganismarrives in adequate quantities at its place of action and performs its function properly [10] 10 Hossain MI, Sadekuzzaman M, Ha SD. Probiotics as potential alternative biocontrol agents in the agriculture andfood industries: A review. Food Res Int. 2017 October; 100(Pt 1):63-73. doi: 10.1016/ j.foodres.2017.07.077 25 Furtado LL, Martins ML, Ramos AM, Silva RR, Leite Júnior BRC, Martins EMF. Viability of probiotic bacteria intropical mango juice and the resistance of the strains to gastrointestinal conditions simulated in vitro. Semin CiencAgrar. 2019 August; 40:149-62. doi: 10.5433/16790359.2019v40n1p149. 26. Pereira ALF, Almeida FDL, Jesus ALT, Costa JMC, Rodrigues S. Storage Stability and Acceptance of ProbioticBeverage from Cashew Apple Juice. Food Bioproc Tech. 2013 December; 6:3155-3165. doi.org/10.1007/s11947-012-1032-1. 27. Moreira RM, Martins ML, Leite Junior BRC, Martins EMF, Ramos AM, Cristianini M, et al. Development of a juçaraand Ubá mango juice mixture with added Lactobacillus rhamnosus GG processed by high pressure. Food Sci.Technol. 2017 April; 77:259-268. doi: 10.1016/j.lwt.2016.11.049. 28. Nosrati R, Hashemiravan M, Talebi M. Fermentation of vegetables juice by probiotic bacteria. Int. J. Biosc. 2013March; 4(3):171-180. doi: 10.12692/ijb/4.3.171-180 Tabla 1. Diseño experimental para el desarrollo de un refresco probiótico a partir de mango Microorganismo *Tiempo *Temperatura pH probiótico 3, 4 y 5 *Concentración *Grados de probióticos Brix 24, 48, 72 25, 30, 35 * * * * * * * * * * * * Valores repetidos = * *Número de repeticiones (n) = 3 Todos los datos experimentales obtenidos serán analizados por ANOVA-Tukey (p<0,05) 10^6, 10^8, 6%, 8%, 10^10 CFU/mL) 10% Plan de trabajo Aislamiento de cepas probióticas Cortar, macerar y aislar microorganismos del mango Selección y preparación de ingredientes Selección, lavado y pelado de mangos maduros Triturado y obtención del puré de mango Agregar azúcar Formulación del Refresco Realizar diluciones Ácido cítrico Inoculación con Cepas Probióticas Selección de cepas probióticas seleccionadas Preparación del cultivo inicial de probióticos (diferentes concentraciones) Inoculación del puré de mango con las cepas probióticas Fermentación Monitoreo de la fermentación (temperatura, pH, tiempo) Ajuste de condiciones Post-Fermentación Filtrado y eliminación de sólidos Carbonatación Envasado Evaluación de Características Organolépticas Análisis sensorial (sabor, aroma, textura, apariencia) Realizar pruebas sensoriales con paneles de consumidores para evaluar sabor, aroma, textura y apariencia (encuestas de google). Evaluación Nutricional y Funcional Análisis de contenido nutricional indirecto– LIBRO EQUILVALENTES DE MEXICO – TABLAS NUTRICIONALES Evaluación de la actividad probiótica y funcionalidad Estabilidad y Vida Útil Almacenamiento del producto en condiciones controladas Conteo de CFU/mL durante el almacenamiento. Evaluación de cambios en características organolépticas y nutricionales durante el almacenamiento Determinación de la vida útil del producto Análisis de resultados ANOVA para comparar diferencias significativas entre tratamientos. Prueba Tukey para identificar diferencias específicas. Diagrama de flujo 1: Desarrollo de un refresco probiótico a partir de mango y evaluación de características organolépticas, estabilidad y vida útil Refresco de mango Extracto (base de pulpa) Aislar microorganismos (levaduras / bacterias ácido lácticas) Diluciones Gasificar Natural Forzada (CO2) bacterias ácido lácticas (levaduras / levaduras y bacterias ácido lácticas) Medición de variables de respuesta Tiempo, pH, Brix, UFC Características organolépticas y escala Likert Cronograma de actividades Tabla 1. Cronograma de actividades del 2024 / 2023 para la Desarrollo de un refresco probiótico a partir de mango y evaluación de características organolépticas, estabilidad y vida útil. ACTIVIDADES JUNIO 1 Revisión bibliográfica Capacitación de laboratorio Aislamiento 2 JULIO 3 4 X X 1 2 X X AGOSTO 3 4 1 2 3 4 X X x x x X X x x x X x x x X X X X X de microorganismos X x X x X X probióticos Elaboración del refresco Fermentación con cepas probióticas Envasado Evaluación X de estabilidad Evaluación de vida útil Evaluación de características organolépticas Realizar artículo x x Literatura citada Bashir, M., Aamir, M., Afzaal, M., Saeed, F., Asghar, A., Ahmed, A., ... & Teferi Asres, D. (2023). Enrichment of apricot probiotic drink with sea buckthorn as a prebiotic and antioxidant source. International Journal of Food Properties, 26(1), 1351-1363. Marius, F. K. E., Marie, K. P., Blandine, M., Laverdure, T. P., Daquain, F. T. U., & François, Z. N. (2023). Development of a non-dairy probiotic beverage based on sorrel and pineapple juices using Lacticaseibacillus paracasei 62L. Journal of Agriculture and Food Research, 14, 100688. Naeem, M. M. (2023). Health Benefits of Pomegranate (Peel & Juice) and Preparation of Functional Pomegranate Drink Using Probiotic Lactobacillus Plantarum. Food Technology Research Journal, 1(2), 77-91. Santos, S. A. D., Barbosa, G. M., Bernardes, P. C., Carneiro, J. C. S., Tostes, M. D. G. V., & Coelho, J. M. (2023). Probiotification of whole grape juice by water kefir microorganisms. Brazilian Archives of Biology and Technology, 66, e23210475
