ANTEFREEZE PROTEINS 2.1

Machine Translated by Google Hans Ramlov Dennis Steven Friis Editores Anticongelante Proteínas Volumen 2 Bioquímica, Biología Molecular y Aplicaciones Machine Translated by Google Proteínas Anticongelantes Volumen 2 Machine Translated by Google Hans Ramløv • Dennis Steven Friis Editores Proteínas Anticongelantes Volumen 2 Bioquímica, Biología Molecular y Aplicaciones Machine Translated by Google Editores Hans Ramlov Dennis Steven Friis Departamento de Ciencias Naturales Universidad de Roskilde Roskilde, Dinamarca Copenhague, Dinamarca ISBN 9783030419479 ISBN 9783030419486 (libro electrónico) https://doi.org/10.1007/9783030419486 © Springer Nature Suiza AG 2020 Este trabajo está sujeto a derechos de autor. Todos los derechos están reservados por el Editor, ya sea total o parcialmente el material, específicamente los derechos de traducción, reimpresión, reutilización de ilustraciones, recitación, radiodifusión, reproducción en microfilmes o de cualquier otra forma física, y transmisión o almacenamiento de información. y recuperación, adaptación electrónica, software de computadora, o por metodología similar o diferente ahora conocida o desarrollada en el futuro. El uso de nombres descriptivos generales, nombres registrados, marcas comerciales, marcas de servicio, etc. en esta publicación no implica, incluso en ausencia de una declaración específica, que dichos nombres estén exentos de las leyes y reglamentos de protección pertinentes y, por lo tanto, libres para uso general. usar. El editor, los autores y los editores pueden asumir con seguridad que los consejos y la información de este libro se consideran verdaderos y precisos en la fecha de publicación. Ni el editor ni los autores o los editores dan garantía, expresa o implícita, con respecto al material contenido en este documento o por cualquier error u omisión que pueda haberse cometido. El editor se mantiene neutral con respecto a los reclamos jurisdiccionales en mapas publicados y afiliaciones institucionales. Este pie de imprenta de Springer es publicado por la empresa registrada Springer Nature Switzerland AG. La dirección de la empresa registrada es: Gewerbestrasse 11, 6330 Cham, Suiza Machine Translated by Google Este libro está dedicado a las dos grandes mentes e investigadores más creativos en el campo de las proteínas anticongelantes y la fisiología de la tolerancia al frío: el profesor Arthur L. DeVries y el difunto profesor Karl Erik Zachariassen Machine Translated by Google Prefacio Cuando Springer Verlag me preguntó a mí (Hans Ramløv) si consideraría editar un libro sobre proteínas anticongelantes, me sentí muy honrado y acepté el proyecto con mucho gusto. Le pregunté a mi buen amigo y anterior estudiante de doctorado (Dennis Steven Friis) si se uniría a mí como editor, ya que podríamos complementarnos con mi experiencia en fisiología comparada y la suya en biología molecular. También estaba entusiasmado con la idea y con mucho gusto se asoció conmigo. Se han publicado dos libros centrados en las proteínas anticongelantes, el último en 2010. Desde entonces se ha avanzado considerablemente en varios aspectos del tema. Hay un número cada vez mayor de laboratorios en todo el mundo que participan en la investigación de proteínas anticongelantes, y hay una serie de conferencias dedicadas específicamente a este tema. Por lo tanto, nuestra comprensión de la diversidad, las estructuras, los mecanismos por los cuales las proteínas anticongelantes interactúan con el hielo, la evolución y el valor adaptativo, así como las ideas de aplicaciones y los problemas involucrados en esto, ha aumentado considerablemente durante la última década. Por lo tanto, creímos oportuno editar un libro donde se incluyeran todos los aspectos de las proteínas anticongelantes mostrando el “estado del arte” del tema en este momento. Lograr esto no sería posible sin la ayuda de los principales expertos en las diferentes ramas de la investigación de proteínas anticongelantes. Por lo tanto, nos pusimos en contacto con los respectivos científicos y, afortunadamente, pudimos reunir un equipo sólido de autores contribuyentes en poco tiempo. Queremos extender nuestro más sincero agradecimiento a todos ellos. Nos gustaría dedicar este libro a los dos brillantes científicos en el campo de las proteínas anticongelantes y las adaptaciones fisiológicas al frío en ectotermos: el profesor Arthur L. DeVries y el difunto profesor Karl Erik Zachariassen. Art DeVries es la figura clave en el descubrimiento de las proteínas anticongelantes a fines de la década de 1960, y desde entonces ha trabajado sin descanso para arrojar luz sobre todos los aspectos de la biología, el papel y el mecanismo de estas proteínas, especialmente en los peces polares. Sus descubrimientos han abierto todo un nuevo campo de investigación, que ahora es investigado por un gran número de científicos y que ha abierto los ojos del público a las emocionantes adaptaciones que albergan los organismos ectotérmicos tolerantes al frío. viii Machine Translated by Google viii Prefacio Karl Erik Zachariassen fue uno de los científicos menos dogmáticos, menos ortodoxos y creativos que uno podría conocer. Junto con Ted Hammel, descubrió los agentes de formación de núcleos de hielo en los insectos, y durante su carrera hizo varias contribuciones importantes a la comprensión de la tolerancia a la sequía y al frío en los insectos. Karl Erik Zachariassen trabajó durante muchos años en la tolerancia al frío de los escarabajos noruegos. Siempre trató de poner este trabajo en una perspectiva más amplia y generalizada, a menudo haciendo observaciones inesperadas y, a veces, declaraciones audaces, lo que crearía discusiones acaloradas en la comunidad científica. Les agradecemos a ambos por todos sus esfuerzos, contribuciones e iluminación. Roskilde, Dinamarca Copenhague, Dinamarca Hans Ramlov Dennis Steven Friis Machine Translated by Google Contenido 1 Contenido del volumen 2—Proteínas anticongelantes: bioquímica, Biología Molecular y Aplicación .................................. Hans Ramløv y Dennis Steven Friis 1 Parte I La Bioquímica y Biología Molecular del Anticongelante Proteínas 2 Características de las Proteínas Anticongelantes ....................... 9 Erlend Kristiansen 3 Propiedades fisicoquímicas de las proteínas anticongelantes. . . . Dennis Steven Friis y Hans Ramlov . . . . . . . . . 43 . . . . . 69 4 Estructurafunción de los IBP y sus interacciones con el hielo . Maya BarDolev, Koli Basu, Ido Braslavsky y Peter L. Davies 5 Interacción de proteínas anticongelantes con agua. . . . . . . . . . . . . . . . . 109 Ilja Karina Voets y Konrad Meister Parte II Mecanismos Moleculares Afectados por Proteínas Anticongelantes 6 Histéresis térmica. . . Erlend Kristiansen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 131 7 Inhibición de la recristalización. Carsten Budke y Thomas Koop . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 159 8 Otras medidas de protección de las proteínas anticongelantes . . . . . . . . . . . . . . 185 Hans Ramløv y Dennis Steven Friis 9 Medición de la actividad de la proteína anticongelante . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 205 Johannes Lorup Buch ix Machine Translated by Google Contenido X Parte III Aplicaciones de Proteínas Anticongelantes 10 Proteínas anticongelantes en los alimentos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 231 Nebahat Sule Ustun y Sadettin Turhan 11 Preservación de células, tejidos y órganos con péptidos anticongelantes derivados de insectos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 261 Kelvin GM Brockbank, John D. Duman, Zhen Chen, Elizabeth D. Greene, Henry M. Vu y Lia H. Campbell 12 Proteínas anticongelantes e inhibición de hidratos de gas . . . . . . . . . . . . . . . 287 Nicolás von Solms 13 Superficies cubiertas de proteína anticongelante . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 307 Woongsic Jung, YoungPil Kim y EonSeon Jin 14 Estudios mutacionales en proteínas anticongelantes . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 327 Dennis Steven Friis y Hans Ramlov Clausura de la Parte IV 15 Resumen y direcciones futuras . . Hans Ramløv y Dennis Steven Friis . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 357 Machine Translated by Google abreviaturas ABA Antiaglomeración Ácido abscísico PAA Péptido de unión a aluminio CAC Corriente circumpolar antártica ADIS Sistemas antihielo y deshielo AFGL Glicolípido anticongelante AFGP Glicoproteína anticongelante AF(G)P AFP/AP Proteína anticongelante o glicoproteína anticongelante AFPP Proteína potenciadora de anticongelantes alternativa Alanina aminotransferasa Automóvil club británico AQP ASW Proteína anticongelante (xAFP, x ¼ especie o identificador de tipo) acuaporina BAC Agua sólida amorfa Vector de brazo de cromosoma bacteriano EXPLOSIÓN(P) Herramientas básicas de búsqueda de alineación local (proteína) BSA Albúmina de suero bovino PCCh Proteína concentrada de zanahoria CD Dicroísmo circular CDS Secuencia de codificación FC Carboxifluoresceína CNT Teoría clásica de la nucleación DPC Deshidratación crioprotectora DRC Dominio de reconocimiento de carbohidratos CTLD(cps) CTmín Dominio tipo lectina tipo C (que contiene proteínas) Mínimo térmico crítico DDC Jaulas de doble diamante DEPC Dielaidoilfosfatidilcolina DEP Dielaidoilfosfatidiletanolamina DEPG Dielaidoilfosfatidilglicerol DGDG digalactosildiacilglicerol xi Machine Translated by Google xi DMPC abreviaturas Dimiristoilfosfatidilcolina DMSO Dimetilsulfóxido DPC dodecilfosfocolina DPPC Dipalmitoilfosfatidilcolina DSC Microcalorímetro de barrido diferencial/microcalorimetría DT Tiempo de retardo EAC Escapar del conflicto adaptativo EPC Fofatidilcolina de huevo est Etiqueta de secuencia expresada FFS Muestreo de flujo directo fi fracción de hielo FIPA Afinidad del plano de hielo basado en fluorescentes FP Punto de congelación FTIR Transformada de Fourier para infrarrojos GCEM Espectrometría de masas por cromatografía de gases GFP Proteína fluorescente verde GH soldado americano Hormona del crecimiento Gastrointestinal HC Jaulas hexagonales HDA Hielo amorfo de alta densidad HDL Líquido de alta densidad ÉL ES Punto de congelación de hFP histéresis de hidroxietil almidón HGW Punto de fusión de histéresis de hMP agua vítrea hiperapagada HPDSC Microcalorímetro/microcalorimetría de barrido diferencial de alta presión HRP Peroxidasa de rábano picante EII Dominio de unión al hielo FIB cara de unión de hielo PI Proteína de unión al hielo SII Sitio de unión de hielo ic Hielo cúbico IDTA Análisis térmico diferencial infrarrojo yo Hielo hexagonal EN UN Agente de nucleación de hielo INLP Lipoproteína nucleadora de hielo EN P Proteína nucleante de hielo Infrarrojo infrarrojos IRI Inhibición de la recristalización del hielo. IRRINA Ensayo de inhibición de la tasa de recristalización del hielo ISP Proteína estructurante de hielo TIC Calorimetría isotérmica o calorimétrica JH hormona juvenil KHI Inhibición de hidratos cinéticos Machine Translated by Google XIII abreviaturas LDA Hielo amorfo de baja densidad LDH Lactato deshidrogenasa LDHI Inhibidor de hidratos de baja dosis LDL Líquido de baja LGT LL densidad Transferencia lateral de LLCP genes Ladderlectin Punto crítico LLT líquidolíquido Baja LPIN temperatura letal Lipoproteína nucleador de hielo LT50 Temperatura con 50% de mortalidad (estudios de supervivencia) LUV Vesículas unicelulares grandes MD Dinámica molecular MGDG Monogalactosildiacilglicerol MP Punto de fusión MW Agua monoatómica Mya Hace millones de años Myr Millones de años NANS Ácido Nacetilneuramínico sintasa ND Difracción nuclear NIBF Cara que no se une al hielo RMN Resonancia magnética nuclear Nt Nucleótido ORF Marco de lectura abierto PBS Fosfato solución salina tamponada PCR Reacción en cadena de la polimerasa PDB (XXXX) Banco de datos de proteínas (ID no.) Polidimetilsiloxano PDMS Poli(Etilen)glicol Fosfatidilinositol PoliN Pi Acetilglucosamina Poli(N CLAVIJA PNAG Isopropilacrilamida) PNIPAAm PPII relaciones públicas Poliprolina tipo II Proteína de cálculos PSP pancreáticos relacionada PTFE con la patogenia Politetrafluoroetileno (teflón) PVA Alcohol de polivinilo) Tapón de PVC Polivinilcaprolactama JcJ Polivinilpirrolidona Poli(N PVPip Vinilpiperidona) QAE RCH Endurecimiento rápido proteína REG RFU en frío Proteína regeneradora Unidad ROTURA fluorescente relativa Proteína inhibidora de la recristalización Aminoetilo cuaternario Machine Translated by Google xiv abreviaturas ROS Especies reactivas de oxígeno S.A.S. Ácido siálico sintasa, eucariotas (NeuB en procariotas). También llamado NANS SAXOS Dispersión de rayos X de ángulo pequeño SCP punto de sobreenfriamiento SDM Mutagénesis dirigida al sitio SDS Dodecil sulfato de sodio SEM Microscopía electrónica de barrido SHS Superficie superhidrofóbica sI, sII Estructuras de tipos de hielo, I, II Oceano del Sur ENTONCES SP sulfopropilo SPI Aislado de proteína de soja RSS Repeticiones de secuencias simples STM TCA Microscopía de túnel de barrido Ácido tricloroacético TEM Microscopía electrónica transmitida T.f. Temperatura muy fría Tg J/J Histéresis térmica/actividad de histéresis térmica THF Tetrahidrofurano/factor de histéresis térmica THP Proteína de histéresis térmica TL similar a la taumatina Temperatura de transición del vidrio TLP Proteasa tipo tripsinógeno Tm Temperatura de fusión o temperatura de transición TMB tetrametilbencidina TSS Sitio de inicio de la transcripción ÚLTIMO Temperatura letal superior UTR región sin traducir VHDA Hielo amorfo de muy alta densidad. VSFG Generación de frecuencia de suma vibratoria Península Antártica Occidental WAP XDM ZnO difracción de rayos X Óxido de zinc Machine Translated by Google Capítulo 1 Contenido del Volumen 2—Proteínas anticongelantes: Bioquímica, Biología Molecular y Aplicación Hans Ramløv y Dennis Steven Friis En el primer volumen del libro, presentamos la historia de las proteínas anticongelantes (AFP), su papel fisiológico en las especies que evitan o toleran las heladas, así como la evolución y agrupación de las proteínas anticongelantes. En el presente volumen profundizamos en las funciones e interacciones de las proteínas anticongelantes a nivel molecular. El volumen se divide en tres partes (Parte I, II y III de este trabajo) seguidas de un resumen final de ambos volúmenes. La Parte I se centra en la bioquímica de las proteínas anticongelantes y su interacción con el hielo y el agua. La Parte II describe el modo de acción para obtener la histéresis térmica y la inhibición de la recristalización y cómo medirla. La Parte III se refiere a los campos en los que las aplicaciones de las proteínas anticongelantes han llegado más lejos, así como a las posibilidades de mutar y adaptar las proteínas. En este capítulo ofrecemos un breve resumen de los capítulos que constituyen este segundo y último volumen del libro. 1.1 Parte I Bioquímica y Biología Molecular de Proteínas Anticongelantes En el cap. 2, el Dr. Erlend Kristiansen presenta las características de las proteínas anticongelantes que se encuentran en los diferentes filos taxonómicos, centrándose en los artrópodos y los peces polares, ya que se han encontrado y caracterizado varias AFP diferentes en estos grupos. Como el capítulo es el primero del segundo volumen, también contiene información introductoria a las AFP que también se encuentra en el primer volumen. La caracterización de las A H. Ramlov (*) Departamento de Ciencias Naturales, Universidad de Roskilde, Roskilde, Dinamarca Correo electrónico: [email protected] DS Friis Copenhague, Dinamarca © Springer Nature Suiza AG 2020 H. Ramløv, DS Friis (eds.), Proteínas anticongelantes Volumen 2, https://doi.org/10.1007/9783030419486_1 1 Machine Translated by Google 2 H. Ramløv y DS Friis cubre su estructura, diversidad de isoformas, síntesis, distribución de tejidos y los sitios de unión al hielo. Se observa mucha diferencia entre las AFP, incluso entre especies relativamente estrechamente relacionadas, como los peces teleósteos, supuestamente debido a la evolución convergente de las proteínas. En el cap. 3, el Dr. Dennis Steven Friis y el Prof. Dr. Hans Ramløv presentan el conocimiento actual de las propiedades fisicoquímicas de las AFP, también centrándose en los artrópodos y los peces polares. Las propiedades a las que se refiere este capítulo son los tamaños/pesos de las proteínas en relación con la actividad anticongelante, la solubilidad/hidrofobicidad y la estabilidad con respecto a la temperatura y el pH. Los tamaños de las AFP varían mucho y, en general, parece haber una correlación positiva entre el tamaño de las AFP y la histéresis que pueden provocar las proteínas. Sin embargo, las diferentes formas de cuantificar la actividad entre los grupos de investigación dificultan la comparación de los resultados. Aunque las AFP investigadas son estables al pH, la termoestabilidad varía; sin embargo, los experimentos de estabilidad son bastante escasos. Ambos caps. 2 y 3 concluye que las AFPs son un grupo bastante diverso de proteínas, que esencialmente no comparten otras propiedades además de su capacidad de unión al hielo que también las define. Varias especies han desarrollado AFP de forma convergente, lo que explica las grandes diferencias. El hecho de que diferentes filos taxonómicos tengan AFP también implica diferentes demandas de las proteínas. Por ejemplo, las temperaturas a las que los organismos están expuestos y la forma de evitar la intrusión de hielo varía en los peces y los insectos, y en las plantas, lo que da lugar a AFP con diferentes propiedades. En el cap. 4, Prof. Dr. Peter L. Davies et al. sumérjase profundamente en el nivel molecular y describa los sitios de unión al hielo de las AFP y otras proteínas de unión al hielo y su interacción con las superficies de hielo. La interacción entre la proteína y el hielo es en sí misma un par inusual de ligando/sustrato. Se describen las características clave de los sitios de unión de hielo de proteínas que son importantes para la interacción del hielo, así como las variaciones de las proteínas en cuanto a tamaño, planos de hielo con los que interactúan y el grado de histéresis térmica que pueden provocar. Se discuten las dificultades para desentrañar el problema del reconocimiento del hielo y las teorías anteriores y actuales de la interacción hielo proteína. La teoría más plausible es el modelo de capa de hidratación, donde la interacción entre la proteína y las moléculas de agua libre es la clave para la posterior unión al hielo. En el cap. 5, la Prof. Dra. Ilja Karina Voets y el Dr. Konrad Meister describen el mecanismo y la importancia del agua para la función de las proteínas en general, así como para las AFP en particular, incluida la formación de una capa de hidratación. Los modelos de dinámica molecular han sido una herramienta valiosa para investigar la interacción de las proteínas con las moléculas de agua y respaldan las teorías del modelo de capa de hidratación. Sin embargo, los estudios de espectroscopia de generación de frecuencia de suma vibratoria no mostraron el mismo agua similar al hielo ordenada para todos los tipos de AFP. En este capítulo se analizan los diferentes métodos para estudiar las interacciones proteínaagua y sus resultados sobre las AFP. Los capítulos 4 y 5 brindan una visión completa de las interacciones entre las proteínas anticongelantes y su "sustrato" H2O, ya sea en estado líquido o sólido. El hecho de que el sustrato sea H2O y que la reacción se produzca justo alrededor de la transición de fase de agua a hielo ha dificultado bastante los estudios y, por lo tanto, han surgido varias teorías sobre el mecanismo de unión a lo largo del tiempo. La teoría predominante de una capa de hidratación está confirmada por varios estudios; sin embargo, el grado de Machine Translated by Google 1 Contenido del volumen 2—Proteínas anticongelantes: bioquímica, biología molecular y... 3 esta capa de hidratación puede diferir entre los diferentes tipos de AFP y, por lo tanto, solo puede explicar el mecanismo en parte. Los estudios continúan sobre esta interacción compleja y crucial. 1.2 Parte II Mecanismos moleculares afectados por el anticongelante Proteínas En el cap. 6, el Dr. Erlend Kristiansen desarrolla el concepto de histéresis térmica y su conexión con el efecto Kelvin y las presiones de vapor, incluidos los determinantes de la magnitud de la histéresis, así como los mecanismos detrás del "punto de falla", donde el sistema vuelve a su estado de equilibrio. Se describe cómo las AFP pueden causar histéresis térmica cuando se unen a la superficie del hielo y qué determina el límite de histéresis térmica o actividad anticongelante que provocan. Las diferencias entre las AFP se analizan en relación con su actividad anticongelante, incluidos los tamaños y el reconocimiento de los planos de hielo, al igual que los factores generales que afectan la actividad anticongelante, como la solubilidad de las proteínas y el efecto de "salificación". El conocimiento básico de la histéresis térmica está bien fundado y la esperada unión de las proteínas anticongelantes a las superficies de hielo se alinea con la teoría. Además, los factores que afectan la potencia de la AFP parecen depender tanto de las propiedades de la proteína relacionadas con el sitio de unión del hielo como de las propiedades de la solución. Este último es importante cuando se analizan las aplicaciones de las AFP, pero también es un factor importante a tener en cuenta al comparar estudios de AFP. En el cap. 7, el Dr. Carsten Budke y el Prof. Dr. Thomas Koop abordan la capacidad de las AFP para inhibir la recristalización del hielo, así como su relevancia en organismos especialmente tolerantes a la congelación. El capítulo contiene la teoría detrás de la recristalización, incluida la fuerza impulsora y las velocidades, así como una descripción de los métodos utilizados para cuantificar la recristalización. Se compara y analiza la eficacia de las moléculas AFP y no AFP con respecto a la inhibición de la recristalización del hielo. La capacidad de las AFP, o proteínas fijadoras de hielo en general, para inhibir la recristalización tiene un gran interés, ya que las convierte en una herramienta valiosa, por ejemplo, en la crioconservación (véase el capítulo 11), donde la recristalización es uno de los mayores peligros, o en la elaboración de cultivos transgénicos resistentes al frío. Por lo tanto, la investigación en este aspecto de las proteínas también es muy interesante. Sin embargo, aunque sabemos mucho sobre la inhibición de la recristalización, el problema radica ahora en cómo utilizar las proteínas en las diferentes aplicaciones. En el cap. 8, el Prof. Dr. Hans Ramløv y el Dr. Dennis Steven Friis presentan los informes actuales sobre otras funciones de las AFP además de su función principal. La función principal de las proteínas anticongelantes es, sin duda, su capacidad para inhibir el crecimiento y la recristalización del hielo al interactuar con la superficie del hielo. Sin embargo, varios estudios han revelado que las AF(G)P pueden tener funciones secundarias que, al menos en algunos casos, son de valor adaptativo para el organismo, es decir, interacción con membranas, antivirulencia en artrópodos e inhibición de patógenos de plantas. . Machine Translated by Google 4 H. Ramløv y DS Friis La función secundaria más estudiada es la interacción de las AF(G)Ps con las membranas. En estos estudios se ha demostrado que las AF(G)P pueden cambiar la temperatura de transición de fase (Tm) de las membranas modelo artificiales, además de inhibir las fugas a través de las membranas durante la transición de fase. En algunos estudios interesantes de un AFGP de la garrapata Ixodes scapularis (IAFGP) se muestra que este AFGP inhibe la formación de biopelícula y, por lo tanto, hace que las bacterias sean vulnerables a la eliminación por parte del sistema inmunitario de los organismos. Estas propiedades se extendieron incluso a los invertebrados y vertebrados transgénicos. En las plantas, las proteínas anticongelantes rara vez muestran altos niveles de actividad anticongelante y probablemente se desarrollan a partir de proteínas relacionadas con patógenos para inhibir la recristalización. Al menos algunas proteínas vegetales anticongelantes han conservado la propiedad antipatógena y, por lo tanto, participan en la lucha contra patógenos psicrófilos como el moho de la nieve. Los estudios son pocos y variados; por lo tanto, se necesitan más estudios tanto para dilucidar los mecanismos detrás de estas propiedades secundarias como para dilucidar las cuestiones evolutivas del origen y la adaptabilidad. En el cap. 9, el Dr. Johannes Lørup Buch presenta diferentes métodos utilizados en varios aspectos del campo de las AFP. El capítulo cubre diferentes técnicas para la cuantificación de la actividad anticongelante y la inhibición de la recristalización. Además, se presentan técnicas más cualitativas para detectar AFP, por ejemplo, mediante la observación de la morfología de los cristales durante la congelación de muestras, el mapeo de la capa de hidratación mediante espectroscopia de tetrahercios o mediante el uso, por ejemplo, de inmunohistoquímica para visualizar la presencia de AFP in situ en diferentes tejidos. Muchas técnicas diferentes se utilizan en la investigación de AFP y han sido impulsadas por una cantidad significativa de creatividad, lo que ha ayudado a desarrollar la investigación. Sin embargo, no existen ensayos o técnicas estándar para, por ejemplo, cuantificar la actividad de AFP, que es un método muy sensible, por ejemplo, en relación con los tamaños de muestra, las tasas de congelación o la composición de la solución. Esto también significa que la comparación de datos entre grupos científicos debe hacerse con mucho cuidado y no sin reservas. 1.3 Parte III Aplicaciones de Proteínas Anticongelantes En el cap. El 10 de octubre, el Dr. Nebahat Sule Ustun y el Prof. Dr. Sadettin Turhan presentan el estado actual de las proteínas anticongelantes en los alimentos. Muchas fuentes dietéticas contienen AFP de forma natural, ya que muchos peces y plantas diferentes las expresan. Sin embargo, las AFP también se utilizan como ingrediente activo en varios alimentos procesados, debido a su efecto beneficioso durante el frío/congelación. Se presentan las diferentes formas en que se pueden utilizar las AFP y cuál es el efecto en los alimentos, incluida la reducción del punto de congelación y la inhibición de la recristalización, mecanismos que se presentan anteriormente en el libro. Además de los estudios actuales y los usos actuales de las AFP en los alimentos, los autores también abordan el tema de las AFP como un aditivo alimentario confiable, ya que esto se discute a menudo cuando se agregan ingredientes activos a los alimentos, así como otros factores que afectan el uso de AFP en los alimentos. Aquí, las posibilidades de producir y aislar grandes cantidades de AFP, y los costos relacionados con ello, también son algunos de los principales obstáculos discutidos. Hay mucho desarrollo dentro del área de producción a gran escala de recombinantes Machine Translated by Google 1 Contenido del volumen 2—Proteínas anticongelantes: bioquímica, biología molecular y... 5 proteína, y con el gran potencial que tienen las AFP, es probable que las AFP sean un aditivo en más alimentos en el futuro. En el cap. 11, Prof. Dr. Kelvin GM Brockbank et al. presentan su trabajo sobre cómo se pueden usar las AFP (principalmente de Dendroides canadensis) en el campo de la crioconservación y discuten sus hallazgos en relación con otras investigaciones actuales en el campo. Presentan estudios a nivel celular, tisular y de órganos. Hay muchas formas y ensayos diferentes para cuantificar el daño o la protección de la materia orgánica, en relación con la crioconservación, que también se presentan en este capítulo. Se discute el potencial del uso de diferentes tipos de AFP en relación con la crioconservación de diferentes materiales orgánicos, ya que se han generado resultados tanto positivos como negativos. También se discute el potencial con respecto al almacenamiento no congelado hipotérmico, ya que las AFP también han mostrado efectos en células y órganos a temperaturas superiores a 0 C. Aunque tienen un gran potencial, aún se necesita mucha investigación para comprender completamente y explotar el uso de AFP en la crioconservación. En el cap. 12, el Dr. Nicolas von Solms presenta los estudios sobre el efecto de las AFP en la inhibición de los hidratos de gas. Los hidratos de gas son un problema en la industria del petróleo y el gas, donde su formación interrumpe el flujo de la tubería. El capítulo describe la base molecular de los hidratos de gas y su similitud con el hielo, y las medidas actuales para prevenir su formación junto con los métodos que se pueden usar para medir y cuantificar la formación e inhibición de hidratos de gas a pequeña escala. Se compara la eficacia de diferentes inhibidores de hidratos de gas con las AFP y se discuten los pros y los contras. En una perspectiva ambiental, las AFP tienen un gran potencial como inhibidores de hidratos de gas, ya que son biodegradables y más amigables con el medio ambiente que los inhibidores actuales. Sin embargo, aunque los estudios preliminares muestran buenos resultados, los experimentos a mayor escala y, finalmente, la aplicación a tamaño natural, se ven obstaculizados por el gran costo de producir las cantidades requeridas de AFP. Además, se necesita mucha investigación en este campo relativamente nuevo, tanto en lo que respecta a experimentos mejorados como más profundo en las AFP, tal vez encontrando o diseñando variantes de AFP con una gran capacidad de inhibición de hidratos de gas. En el cap. 13, Prof. Dr. EonSeon Jin et al. presentar los conocimientos actuales sobre la creación de superficies con superficies recubiertas de AFP. Este tema tiene potencial en varias industrias donde la formación de hielo en las superficies es un gran peligro y costoso. El capítulo describe los diferentes métodos para crear superficies antihielo, con énfasis en el recubrimiento de superficies. Se describen los diferentes materiales de recubrimiento y se discuten los resultados de estos y estudios comparables con una AFP. Este campo muy nuevo (en lo que respecta a las AFP) tiene un gran potencial, ya que muchas industrias necesitan una buena solución antihielo. Hasta ahora se han realizado muy pocos experimentos con AFP, pero los estudios preliminares inducen al optimismo. Todavía se necesita mucha investigación para descubrir el verdadero potencial de las superficies cubiertas con AFP. En el cap. 14, el Dr. Dennis Steven Friis y el Prof. Dr. Hans Ramløv presentan los conceptos generales de la manipulación genética y los resultados de los estudios de mutación que se han llevado a cabo en varias AFP. Como no se dispone de un buen método de cribado para las proteínas anticongelantes, todos los mutantes se han producido mediante mutagénesis dirigida al sitio y se han investigado por separado. Los propósitos de los estudios de mutación son muchos e incluyen Machine Translated by Google 6 H. Ramløv y DS Friis mejora de las posibilidades de purificación de proteínas, creación de proteínas de fusión, por ejemplo, mediante marcado fluorescente, localización de dominios de unión al hielo o exploración de los mecanismos de unión al hielo mediante cambios sutiles en las estructuras de aminoácidos. Algunos estudios también se han centrado en aumentar la potencia de la AFP, o en crear organismos transgénicos, con el objetivo de hacerlos más resistentes al frío. Aunque el campo se ve obstaculizado por la falta de un método de detección adecuado, la herramienta de la manipulación genética sigue siendo muy valiosa y puede ayudar a responder muchas de las preguntas que aún quedan sin respuesta. A medida que se amplíe el conocimiento de las AFP, es de esperar que las aplicaciones industriales para utilizar las proteínas también se amplíen. Es poco probable que esto genere la necesidad de adaptar las AFP para fines específicos y, en este sentido, la manipulación genética también será la herramienta esencial. En el cap. 15, damos un resumen final y perspectivas sobre la proteína anticongelante campo que cubre ambos volúmenes de este trabajo. Machine Translated by Google Parte I La Bioquímica y Biología Molecular de Proteínas anticongelantes Machine Translated by Google Capitulo 2 Características de las Proteínas Anticongelantes Erlend Kristiansen 2.1 Introducción Las proteínas anticongelantes (AFP) y las glicoproteínas anticongelantes (AFGP) se caracterizan como grupo solo por su capacidad común para evitar que los cristales de hielo existentes crezcan en soluciones sobreenfriadas. Se encuentran en muchas formas de vida diferentes que habitan en hábitats fríos y, a menudo, cargados de hielo, actuando como medio de protección contra un entorno térmico hostil. Algunos organismos unicelulares polares, incluidas las diatomeas, los hongos y las bacterias, excretan AFP para modificar su entorno helado externo (Hoshino et al. 2003; Janech et al. 2006; Hanada et al. 2014), y una bacteria antártica usa un AFP unido a una membrana para adherirse al hielo flotante, lo que le permite residir en la parte superior rica en nutrientes de la columna de agua (Bar Dolev et al. 2016) . Muchos organismos tolerantes a la congelación, que adaptativamente permiten que sus fluidos corporales extracelulares se congelen, producen proteínas que se clasifican como AFP, ya que provocan una separación de las temperaturas de fusión y congelación del hielo in vitro. Dichos organismos incluyen muchas plantas (Urrutia et al. 1992; Duman y Olsen 1993; Worrall et al. 1998) y artrópodos (Tursman y Duman 1995; Duman et al. 2004; Wharton et al. 2009; Walters et al. 2009). Estas proteínas presumiblemente funcionan para controlar la forma y distribución de la masa de hielo extracelular endógena. Los AF(G)P actúan como agentes anticongelantes en organismos que evitan la congelación, es decir, animales que mueren si se forma hielo endógeno y que, en consecuencia, dependen del sobreenfriamiento de sus fluidos corporales para sobrevivir. Se ha demostrado que estabilizan el estado sobreenfriado al inactivar estructuras dentro de los fluidos corporales que podrían iniciar la congelación y al evitar que el hielo penetre a través de la pared corporal del animal (Olsen y Duman 1997a, b; Olsen et al. 1998 ; Duman 2002 ) . Permiten que los peces óseos hipoosmóticos ocupen las frías aguas polares, donde estos peces pueden pasar toda su vida. E. Kristiansen (*) Biblioteca de la Universidad NTNU, Trondheim, Noruega Correo electrónico: [email protected] © Springer Nature Suiza AG 2020 H. Ramløv, DS Friis (eds.), Proteínas anticongelantes Volumen 2, https://doi.org/10.1007/9783030419486_2 9 Machine Translated by Google E. Kristiansen 10 en un estado sobreenfriado, a menudo en contacto con hielo externo (DeVries 1982). La evolución de las AF(G)P de los peces polares ha sido impulsada por el enfriamiento de las aguas del Ártico y la Antártida, procesos que resultaron en temperaturas bajo cero del agua que se alcanzaron hace unos 5–14 millones de años en la Antártida, y 13–18 millones hace años en el Ártico (Kennett 1977; Eastman 1993). También se encuentran en muchos artrópodos terrestres que evitan las heladas, incluidos insectos y arañas (Husby y Zachariassen 1980; Duman et al. 2004) y collem bolans (Graham y Davies 2005; Hawes et al. 2014). Incluso en estas formas de vida terrestres, pueden brindar protección contra la congelación letal en todo el rango de sobreenfriamiento del animal, en ocasiones hasta 30 C o menos (Zachariassen y Husby 1982). Así, estas estructuras tienen funciones comunes en diversos organismos asociados a la vida en un ambiente frío. Las AF(G)P se clasifican como hiperactivas o moderadamente activas, según su potencia para causar actividad anticongelante en concentraciones equimolares. Además de las claras diferencias en la potencia anticongelante, la forma de los cristales de hielo que se forman en presencia de AF(G)P moderadamente activas e hiperactivas también son características: bipirámides hexagonales (por ejemplo, Baardsnes et al. 2001; Loewen et al. 1998 ) . ; Ewart et al. 1998) y discos hexagonales aplanados, respectivamente (por ejemplo, Liou et al. 2000; Graether et al. 2000). La causa estructural subyacente de las diferencias entre estos dos grupos de actividad parece ser la diferencia en sus sitios de unión al hielo (IBS). La intención de este capítulo es señalar algunas características estructurales, fisiológicas y evolutivas de las AF(G)P que se encuentran en los peces polares y artrópodos que evitan la congelación. De ningún modo es exhaustivo y se remite a los Caps. 5 y 6 del vol. 1 para una discusión más detallada de los peces y los insectos AF(G)Ps y Caps. 7 y 8 del vol. 1 para AFP en plantas y otras especies. Capítulo 9 del vol. 1 y cap. 4 de este volumen brindan un análisis más profundo de los aspectos evolutivos y la interacción entre AF (G) Ps y hielo, respectivamente, y el Cap. 6 de este volumen se centra en el mecanismo anticongelante. 2.2 Estructura La evolución independiente de AF(G)Ps en varios taxones ha dado como resultado una diversidad estructural dentro de este grupo funcionalmente definido (Graether et al. 2000; Fletcher et al. 2001; Graham y Davies 2005; Graham et al. 2007; Kiko 2010; Lin et al. 2011; Hawes et al. 2014). Sin embargo, las similitudes estructurales también son abundantes. 2.2.1 Peces polares Actualmente se informan cinco tipos distintos de proteínas anticongelantes en peces polares: AFGP y AFP tipo IIV. Sin embargo, la categorización de AFP tipo IV como AFP funcional ha sido cuestionada recientemente (ver más abajo). La tabla 2.1 muestra la Machine Translated by Google 11 2 Características de las Proteínas Anticongelantes Tabla 2.1 Listado taxonómico de las AF(G)Ps de peces polares Subdivisión Teleostei Familia género/especie Tipo Infradivisión Clupeomorpha Infradivisión Euteleostei clupeidae arenque II (+ Ca2+) Superorden Protocanthopterygii Osmeridae Eperlano Superorden Paracanthopterygii Gadidae Bacalaos del norte II (+ Ca2+) AFGP I/IV Superorden Acanthopterygii Orden Scorpaeniformes Suborden Cottoidei Superfamilia Cottoidea Superfamilia Cyclopteroidea Orden Perciformes Cotidae esculpir Hemitripteridae Cuervo de mar Agónidos Cazador furtivo de hocico largo Cyclopteridae pez caracol II ( Ca2+) I I II ( Ca2+) Suborden Labridae Labridae astuto Suborden Zoarcoidei Zoárcidos Eelpouts tercero Anarhichadidae pez lobo tercero Suborden Notothenioidei 5 familias Orden Pleuronectiformes Pleuronectidae AFGP/IV Platijas de ojo derecho I la ocurrencia taxonómica de las AF(G)Ps, y sus estructuras se ilustran en la Fig. 2.1. Como se puede ver en la tabla, tipos similares de AF (G) P se encuentran dispersos entre grupos de teleósteos relacionados de manera lejana. Estos patrones de distribución se han atribuido para los diferentes tipos a la evolución convergente (Chen et al. 1997a, b; Graham et al. 2013), a la transferencia lateral de genes (Graham et al. 2008a, 2012) y al desarrollo a partir de un ancestro común. (Graham et al. 2013). Según los informes, la mayoría de los peces AF (G) P son moderadamente activos, con la excepción de algunas variantes grandes que son hiperactivas. 2.2.1.1 Tipo I Las AFP de tipo I son proteínas helicoidales α (Yang et al. 1988), véase la Fig. 2.1a. Hay tres tipos de AFP tipo I, según su genética y el tamaño de las proteínas maduras. La estructura general es anfipática, con el lado que se une al hielo algo hidrofóbico (Baardsnes et al. 2001). Están ampliamente distribuidos entre los peces óseos, habiéndose identificado en miembros de cuatro superfamilias en tres órdenes diferentes, a saber, Pleuronectiformes (en platijas), Perciformes (en cunners) y Scorpaeniformes (en snailfish y sculpins) (Hew et al. 1980 ; Evans y Fletcher 2001; Hobbs et al. 2011), ver Tabla 2.1. Hay dos subconjuntos de AFP tipo I dentro de cada especie examinada, codificados por dos familias de genes diferentes; las AFP de tipo hepático tienen péptidos señal y estas isoformas se secretan al torrente sanguíneo (Gourlie et al. 1984). El tipo de piel, por el contrario, carece de tales péptidos de señal y se encuentra principalmente dentro de la piel y otros periféricos. Machine Translated by Google 12 E. Kristiansen Fig. 2.1 Los cinco tipos diferentes de AF(G)Ps en peces polares. (a) Tipo I (PDB 1WFA) junto con AFP maxi hiperactiva (PDB 4KE2). (b) Tipo II (PDB 2PY2). (c) Tipo III (PDB 1HG7). (d) Tipo IV, la ilustración es de Apolipophorin III, un homólogo estructural de AFP tipo IV (PDB 1LS4). ( e ) La unidad principal de repetición AAT de AFGP que muestra su enlace o con su disacárido. Las diferentes ilustraciones no muestran proporciones correctas entre sí. Códigos de color: Gris: columna vertebral peptídica. Azul: hélice α. Verde: hebras β (Gong et al. 1996; Low et al. 1998; Evans y Fletcher 2006). Ambos tipos de isoformas son péptidos pequeños con masas de alrededor de 3,3 a 4,5 kDa. Las AFP de tipo hepático circulantes de las platijas (Gourlie et al. 1984; Graham et al. 2008a) y el cunner (Hobbs et al. 2011) se construyen a partir de 3–4 repeticiones de una secuencia de 11 aminoácidos TxxD/ Nxxxxxxx, donde x suele ser Ala (Chao et al. 1996), mientras que el tipo de hígado circulante en el pez caracol carece de una repetición tan básica (Evans y Fletcher 2005a). El tipo de piel de las platijas, los longhorn sculpins y el cunner son muy similares entre sí y están construidos a partir de la misma repetición de 11 aminoácidos que se observa en el tipo de hígado de la platija y el cunner (Low et al. 2001) . Además, la escultura de cuerno corto tiene una isoforma de tipo piel más grande de 95 aminoácidos que carece de patrón repetido (Low et al. 1998), y los tipos de piel del pez caracol, como es el caso de su tipo de hígado, carecen de la isoforma de 11 aminoácidos. repetición ácida (Evans y Fletcher 2005a). Un tercer tipo de AFP tipo I se encuentra en varios Pleuronectiformes y se caracteriza por ser mucho más grande que los otros tipos de piel e hígado. Además, este tipo es hiperactivo. La platija de invierno (Pseudopleuronectes americanus), la platija de cola amarilla (Limanda ferruginea) y la solla americana (Hippoglossoides platesoides) contienen cada una una gran isoforma hiperactiva de tipo I (Gauthier et al. 2005; Graham et al. 2008b). El mejor estudiado de estos es el de la platija de invierno, y esta variante Machine Translated by Google 2 Características de las Proteínas Anticongelantes 13 se denota Maxi, ver Fig. 2.1a. Una AFP de tipo I tan grande es la única AFP conocida de la sangre de la solla americana (Gauthier et al. 2005). Estas moléculas de 17 kDa se construyen a partir de repeticiones de 11 residuos similares que se observan en muchas de las formas más pequeñas (Graham et al. 2008b). Son dímeros en solución de 34 kDa de masa, y cada monómero se pliega sobre sí mismo, dando como resultado un haz de cuatro hélices (Sun et al. 2014). Curiosamente, también se propusieron patrones de plegado comparables para una AFP de un hongo (Badet et al. 2015) y de un insecto himenóptero (Xu et al. 2018), lo que sugiere una configuración efectiva para la unión del hielo. Graham et al. (2013) propusieron que la amplia distribución filogenética de AFP tipo I es el resultado de la evolución independiente de estas proteínas dentro de cada una de las cuatro superfamilias en las que se encuentran. Esta propuesta se basó en estudios de sus secuencias genéticas, que revelaron diferencias tanto en el uso de codones como en las regiones no codificantes, lo que sugiere fuertemente diferentes progenitores en los cuatro grupos. Gautier et al. (2005) sugirieron que las isoformas más pequeñas de las platijas pueden haber evolucionado a partir de los tipos más grandes de AFP I de este grupo. Esto se basó en la observación de que la solla americana solo contiene una sola isoforma grande. Evans y Fletcher (2005b) sugirieron que las AFP del pez caracol pueden ser el resultado de un cambio en el marco de lectura de los genes que codifican las proteínas de la cáscara de huevo o la queratina. 2.2.1.2 Tipo II Las AFP de tipo II son homólogas al dominio de reconocimiento de carbohidratos de las lectinas dependientes de Ca2+ (tipo C) (Ewart et al. 1998; Loewen et al. 1998). Se encuentran en especies de cuatro familias diferentes de tres grupos de teleósteos relacionados lejanamente (ver Tabla 2.1). El arenque (Clupeidae) pertenece a la infradivisión Clupeomorpha, mientras que el eperlano (Osmeridae), el cuervo marino (Hemitripteridae) y el cazador furtivo (Agonidae) pertenecen a diferentes grupos dentro de la infradivisión Euteleostei. Los dos últimos son de la misma superfamilia, mientras que el olor es de un superorden diferente. Las AFP de tipo II tienen masas que varían de 14 a 24 kDa y una estructura globular general que consta de dos hélices α y nueve hebras β en dos láminas β (Gronwald et al. 1998, véase también la figura 2.1b ) . El patrón de plegamiento tridimensional observado es muy similar a la proteína de unión a manosa de rata, un miembro de la familia de lectinas de tipo C de la que probablemente derivan. Las AFP de tipo II son únicas porque tienen cinco enlaces SS internos en lugar de 2 a 4 enlaces de este tipo que se encuentran en las lectinas de tipo C. Hay dos tipos distintos de AFP Tipo II; los aislados de eperlanos (Osmeridae) y arenques (Clupeidae) requieren Ca2+ como cofactor para la actividad, mientras que los aislados de cuervos marinos (Hemitripteridae) y cazadores furtivos (Agonidae) son completamente activos en ausencia de este cofactor. El SII de estas formas dependientes de Ca2+ e independientes de Ca2+ se localiza en diferentes partes de sus superficies. Aquellos que requieren Ca2+ para su actividad tienen SII correspondiente al sitio de unión a carbohidratos de las lectinas tipo C (Ewart et al. 1998), mientras que el SII de las variantes independientes de Ca2+ se encuentran fuera de esta región (Loewen et al. 1998). Todas las AFP II tienen un patrón de enlace SS único que no se ve en las proteínas relacionadas y también comparten una gran identidad (>85 %) tanto en la secuencia de aminoácidos como en la genética conservada. Machine Translated by Google 14 E. Kristiansen secuencias, incluidas las regiones de intrones y exones. Debido a esta gran similitud entre las AFP tipo II, Graham et al. (2008a) y Sorhannus (2012) propusieron que es poco probable que su patrón filogenético disperso de distribución sea el resultado de una evolución convergente, como en el caso de las AFP de tipo I. En cambio, probablemente sea el resultado de una transferencia de genes entre los diferentes grupos de peces productores de AFP tipo II. Tal llamada transferencia lateral de genes puede haber ocurrido durante eventos de desove masivo. En el caso de la AFP tipo II dependiente de Ca2+, Graham et al. (2012) encontraron pruebas que sugerían que el eperlano era el receptor del material genético del arenque. 2.2.1.3 Tipo III Las AFP de tipo III son proteínas globulares de 7 kDa que solo se encuentran en las dos familias estrechamente relacionadas Zoarcidae (eelpouts) y Anarhichadidae (pez lobo) en el suborden Zoarcoidei, véase la Fig. 2.1c . La secuencia primaria no tiene repeticiones obvias y el patrón de plegamiento es complejo, involucrando varias hebras cortas emparejadas en dos láminas β antiparalelas, además de varias hélices. Las AFP de tipo III se encuentran en dos variantes estructurales que se clasifican por sus puntos isoeléctricos (Chao et al. 1993). Un grupo, las formas QAE, tienen un pI inferior a 7 y, por lo tanto, son aniónicos a pH fisiológico, mientras que el otro grupo, las formas SP, tienen un pI superior a 7 y, por lo tanto, son catiónicos a pH fisiológico. Ambas formas QAE y SP están presentes en el animal. Según se informa, las formas SP tienen una actividad menor que las formas QAE (Nishimiya et al. 2005). Takamichi et al. (2009) informaron que la adición de cantidades diminutas de una forma QAE completamente activa a una forma SP inactiva aislada del pez japonés Zoarces elongatus Kner dio como resultado que la forma SP obtuviera la misma actividad que la forma QAE. Estos hallazgos sugieren que estas dos formas pueden cooperar in vivo. Se ha identificado un dímero intramolecular natural de 14 kDa, en el que dos AFP III monoméricas están unidas por una cadena corta (Miura et al. 2001). Dado que la aparición de AFP tipo III se limita solo a dos familias de peces estrechamente relacionadas, estas formas presumiblemente se originaron en un ancestro común (Graham et al. 2013). Baardsnes y Davies (2001) informaron que la secuencia de proteína de una AFP de tipo III mostró aproximadamente un 40 % de identidad y un 50 % de similitud con partes del dominio Cterminal de la ácido siálico sintasa, una enzima que se une a carbohidratos como parte de su función. Deng et al. (2010) elaboraron sobre los eventos evolutivos que presumiblemente precedieron al desarrollo de la actual AFP tipo III. Aparentemente, la parte Nterminal de una molécula de ácido siálico sintasa funcional, que mostró actividad anticongelante rudimentaria asociada con su Cterminal, fue reemplazada por un péptido señal. Esto hizo que el precursor de AFP fuera secretado por las células, y este desacoplamiento molecular de las funciones enzimática y anticongelante permitió que la presión selectiva actuara únicamente hacia la función anticongelante. Machine Translated by Google 2 Características de las Proteínas Anticongelantes 15 2.2.1.4 Tipo IV La AFP de tipo IV es una proteína similar a una lipoproteína de 12 kDa con un contenido de hélice α de alrededor del 60 %, véase la figura 2.1d. Su estructura propuesta consta de cuatro hélices α anfipáticas de longitud similar plegadas en un haz de cuatro hélices (Deng y Laursen 1998). La AFP tipo IV se ha encontrado en muchas especies, incluido el esculpido de cuernos largos del Ártico (Myoxocephalus octodecemspinosus) y el esculpido de cuernos cortos (M. scorpius) (Deng y Laursen 1998; Gauthier et al. 2008) y dos nototénidos antárticos, Pleuragramma antarcticum y Notothenia coriiceps (Lee et al. , 2011; Lee y Kim, 2016). Sin embargo, se ha cuestionado su papel como AFP funcional, ya que es una AFP muy débil, que provoca histéresis térmica de solo 0,07 C a una concentración de 0,5 mg/mL, y está presente en sangre en concentraciones inferiores a 100 μg/mL, lejos demasiado baja para proteger a estos peces contra la congelación en aguas heladas (Gauthier et al. 2008; Lee y Kim 2016). Por lo tanto, su capacidad para causar histéresis térmica podría ser incidental. Gautier et al. (2008) propusieron que, aunque el tipo IV tiene el potencial de convertirse en una AFP funcional, no ha sido seleccionada para este propósito debido a la presencia de otras AFP funcionales. Esto está respaldado por la presencia de AFP tipo IV en especies templadas, subtropicales y tropicales, incluidas las especies que viven en agua dulce (Liu et al. 2009; Xiao et al. 2014; Lee et al. 2011; Lee y Kim 2016). Estas especies no necesitan ninguna protección contra la congelación y, en cambio, la AFP tipo IV puede estar involucrada en la embriogénesis, ya que varios de sus homólogos son esenciales en este proceso. 2.2.1.5 AFGP Los AFGP se encuentran en dos grupos de peces teleósteos distantemente relacionados y separados geográficamente, los bacalaos árticos (familia Gadidae del superorden Paracanthopterygii) y los nototeniidos antárticos (suborden Notothenioidei del superorden Acanthopterygii). Contienen un número variable del tripéptido AAT, donde el grupo hidroxilo de cada Thr está unido a un disacárido (βDgalactosil (1,3)αDNacetilgalactosamina), véase la Fig. 2.1e para una ilustración de la unidad básica. En esta unidad, el resto carbohidrato constituye aproximadamente el 60% de la masa. Las variantes más pequeñas contienen solo 4 de estas unidades repetidas y tienen una masa de alrededor de 2,6 kDa y las más grandes contienen alrededor de 50 unidades repetidas con una masa de 33 kDa. Los AF (G)P de diferentes tamaños se organizan en ocho grupos de tamaños distintos (DeVries 1982), y cada grupo contiene varias isoformas (Wu et al. 2001). La estructura secundaria de las AFGP ha sido difícil de dilucidar. Cada vez hay más evidencia que sugiere que obtienen una hélice de poliprolina tipo II, pero solo a bajas temperaturas (Franks y Morris 1978; Bush et al. 1984; Mimura et al. 1992; Tachibana et al. 2004). En esta configuración, cada triplete AAT da una vuelta en la bobina, lo que da como resultado que las unidades de carbohidratos estén en una disposición regular en un lado de la molécula. Tal disposición le da a la molécula un carácter anfipático general, donde el lado del carbohidrato es más hidrofílico y la columna vertebral de la proteína con el grupo metilo de Ala es más hidrofóbica. La forma de los cristales de hielo que Machine Translated by Google E. Kristiansen dieciséis la forma en presencia de AFGP también sugiere una configuración regular; estos cristales de hielo son bipirámides hexagonales, que exponen solo un plano de cristal único a la solución circundante en la que se adsorben los AFGP. Tal especificidad del plano cristalino probablemente requiere que todas las moléculas adsorbidas tengan la misma configuración. Wöhrmann (1996) informó que una AFGP excepcionalmente grande de 150 kDa del nototeniido Pleuragramma antarcticum era hiperactiva. No se sabe que ningún otro AFGP sea hiperactivo. Las AF(G)P que se encuentran en gadoides y nototeniidos, miembros de diferentes superórdenes de teleósteos, han evolucionado de manera independiente (Chen et al. 1997a). Los de los nototeniidos antárticos aparentemente evolucionaron a partir de un gen de tripsinógeno (Chen et al. 1997b) hace unos 5 a 14 millones de años, mientras que los de los gádidos árticos evolucionaron a partir de una parte no codificante de su ADN hace unos 13 a 18 millones de años ( Baalsrud et al. 2018). El momento de su emergencia independiente coincide bien con el tiempo informado en que las aguas del Ártico y la Antártida alcanzaron temperaturas bajo cero (Kennett 1977; Eastman 1993). 2.2.2 Artrópodos La Tabla 2.2 muestra una lista taxonómica de AFP de artrópodos conocidas o tentativas con algunas características estructurales indicadas. La tabla sugiere que las AFP en especies estrechamente relacionadas son estructuras homólogas con un progenitor común. Casi todas las AFP de artrópodos se construyen como segmentos repetitivos más cortos en serie y casi todas contienen variaciones del patrón tripéptido TxT dentro de las repeticiones. La tabla también muestra la alta prevalencia del patrón de plegamiento βhelicoidal, una característica que sin duda ha evolucionado por evolución convergente en grupos relacionados distantemente (Liou et al. 2000; Graether et al. 2000; Graether y Sykes 2004). Algunas de las variantes de AFP que se encuentran en los artrópodos se ilustran en la figura 2.2. 2.2.2.1 Insectos Hay información estructural disponible sobre AFP o AFP putativas de cinco órdenes de insectos, coleópteros, himenópteros, lepidópteros, dípteros y hemípteros. Coleópteros Todos los escarabajos dentro de la superfamilia Tenebrionidea tienen AFP con secuencias muy similares que muy probablemente sean estructuras homólogas (Tabla 2.2). Estas AFP están formadas por 5 a 7 repeticiones en tándem de la secuencia de aminoácidos consenso de 12 o 13 unidades TCTxSxxCxxAx. En particular, Thr en la posición 1 y 3 y Cys en la posición 2 y 8 en la repetición están altamente conservados en isoformas dentro y entre especies. Las posiciones conservadas de la Cys dentro de la estructura de repetición de 12 unidades observada en las AFP identificadas de especies dentro de la superfamilia Tenebrionidea dan como resultado que cada sexto residuo de la secuencia esté ocupado por una Cys. Los dos Cys dentro escarabeaoidea Scarabaeformia crisomeloidea Tenebrionoidea Orden Hymenoptera Clase Insecta Orden Colémbolo Tabla 2.2 Listado taxonómico ycaracterísticas estructurales de conocidas AFP ysupuestas de artrópodos artrópodos Clase Entognatha filo orden coleópteros Superfamilia Cucujoidea Cucujidae superfamilia Infraorden superfamilia superfamilia Cerambycidae Rhagium inquisitor12,13 RiAFP Lucanidae R. mordax14 Dorcus curvidensb Cucujus clavipesa RmAFP 13 11.4– 14.3 TCTxSxxCxxAx 13 ” (X) (A) Rh β hélice (sim. a TmAFP) ” TxTxTxT + x9– 15 (D) Hélice β aplanada (A) ”a RiAFP) (sim. politac,11 Anatolica ~ 12 10.9 y11.4 PLAFP ApAFP ” ” (A) " (") (A) " (") Pterocoma loczyic,10 punctipennis9 Microdera Intraorden Cucujiformia Tenebrionidae Dendroides canadensis8 DAFP Hypogastruridae Hypogastrura harveyi1,2 sfAFP Gomphiocephalus hodgsoni21 Tenebrio molitor6,7,19 TmAFP MPAFP 12.7 ” (X) TCTxSxxCxxAx ? Rico en Gly yCys ? (D) Rh β hélice Familia Especies Gomphy 9 AFP Código 6.5 y15.7 8.3– 12 7.3– 12.4 ” (A) ”a TmAFP) (sim. (A) " (") (A) " (") MW (kDa) Repetición primaria Gxx apilados en dos conjuntos. (D) Hélices Lh PPII antiparalelas, Secundario (continuado) 2 Características de las Proteínas Anticongelantes 17 Machine Translated by Google (2007); (7) Liou et al. (2000); (8) yDuman Andorfer (2000); (9) Qiu et al. (2010); (10) Ma et al. (2008); (11) Ma et al. (2012); (12) Kristiansen et al. (2011); (13) Hakim et al. (2013); (14) Kristiansen et al. (2012); (15) Guz et al. (2014); (16) Basu et al. (2015); (17) Neelakanta et al. (2010); (18) Bryan et al. (2013); (19) Liou et al. (1999); (20) Kiko (2010); (21) Hawes et al. (2014); (22) Xu et al. (2018) (A): Abreviaturas: asumidas por este autor en base a la similitud de secuencia. (D): determinado. (M): modelado. Lh: Zurdo. Rh: diestro. Sim. a: similar a. Glyco.: Glicosilado. a Mencionado en Duman (2015). bSecuencia publicada únicamente en NCBI. cSolo se supone que es un ya AF(G)P, que no se informa actividad de histéresis. (1) Graham yDavies (2005); (2) Pentelute et al. (2008); (3) Tyshenko et al. (2005); (4) Graether et al. (2000); (5) Lin et al. (2011); (6) Graham et al. Clase Maxillopoda Orden Calanoida Orden Trombidiformes 10– 21 26kDa Tetranychus urticaec,18 Stephos longipes20 Tetranychidae Stephidae clase arácnido geometroidea Tortricoidea Suborden Heterópteros Orden Lepidópteros Orden Ixodida Ixodidae Tortricidae Geométridos superfamilia superfamilia yespecies hermanas Orden Hemípteros Cuadro 2.2 (continuación) Suborden Apocrita Eurygaster maurac,15 EmAFP choristoneura esp. “Mosquito del lago Ontario”16 CfAFP ápidos cerebrona Apis cerebrona22 AFP Acer 9– 12 3.5 y8.3 TxTxTxTxTxxx (M) Hélice β aplanada Rh filo artrópodos orden dípteros quironómidos Scutelleridae Campaea perlata5,6 fumiferana3,4 Ixodes scapularisc, 17 iwAFP IAFGP ~ 23 Probablemente NCTxCxxCxNCx (M) β hélice Glico. TAA Sin aparente repetición β hélice con un paralelo 10.2 5.7– 10.4 xxCxGxYCxG. (D) Lh β hélice 60 Familia Especies Código MW (kDa) Repetición primaria Glico. TxT + x10 TCT + x12 ? α hélice (M) Bobina solenoide izquierda (M) Lh β hélice (M) 3 α hélices entrelazadas Secundario 18 E. Kristiansen Machine Translated by Google Machine Translated by Google 2 Características de las Proteínas Anticongelantes 19 Fig. 2.2 Algunos tipos diferentes de AFP de artrópodos. ( a ) TmAFP del coleóptero T. molitor (PDB 1L1I). ( b ) CfAFP del lepidóptero C. fumiferana (PDB 1M8N). ( c ) Una AFP del colémbolo Hypogastrura harveyi (PDB 2PNE). (e) Un AFP de crustáceo de Stephos longipes. La ilustración es de la AFP de Colwellia sp., un homólogo estructural (PDB 3WP9). Las ilustraciones superiores son vistas frontales, las ilustraciones inferiores son vistas desde arriba. Las diferentes ilustraciones no muestran proporciones correctas entre sí. Códigos de color: Gris: columna vertebral peptídica. Azul: hélice α. Verde: hebras β cada repetición forma un enlace SS (Li et al. 1998a; Liou et al. 2000). Liou et al. (2000) mostró que las AFP de Tenebrio molitor, TmAFP, se pliegan como un solenoide diestro regular apretado, donde cada segmento repetido de 12 mer forma una vuelta completa en la bobina. Cada segmento forma cadenas β y las cadenas forman láminas β. Este patrón de plegamiento da como resultado una hélice β donde los residuos Thr en las posiciones 1 y 3 en cada repetición se apilan en un lado de la estructura y forman una escalera muy regular de 5 a 7 motivos TCT. Las cadenas laterales de los residuos Thr dentro de cada motivo apuntan hacia fuera de la estructura, mientras que los enlaces SS entre las posiciones 2 y 8 dentro de cada repetición cruzan la espiral de manera regular, contribuyendo a la estanqueidad y estabilidad de la estructura. Li et al. (1998a) encontraron que el patrón de disulfuro en AFP de Dendroides canadensis, DAFP, estrechamente relacionado, es similar al de TmAFP. Li et al. (1998b) informaron un alto contenido de lámina β también en DAFP, y Jia y Davies (2002) y Wang et al. (2009) modelaron DAFP según el patrón de plegamiento de TmAFP. Otras especies de tenebriónidos que supuestamente tienen la misma secuencia de consenso que T. molitor y D. canadensis son Microdera punctipennis (Qiu et al. 2010), Pterocoma loczyi (Ma et al. 2008) y Anatolica polita (Ma et al. 2012). Dado el grado de similitud de secuencia entre AFP de diferentes especies dentro de Tenebrionidea (Tabla 2.2), no hay duda de que se pliegan en la misma configuración que TmAFP. En la figura 2.2a se muestra una ilustración del patrón de plegado de TmAFP . Machine Translated by Google E. Kristiansen 20 Fig. 2.3 Planitud y regularidad del SII. RiAFP del escarabajo cerambícido Rhagium inquisitor (PDB 4DT5) orientado a representar la planitud y la regularidad del SII y las distancias entre los residuos de Thr en los motivos TxTxTxT dentro 4,5 Å y entre los soportes β en el SII. Las cadenas laterales de los residuos de Thr sobresalen hacia arriba desde la hoja β. 7,4 Å Las dos especies estrechamente relacionadas de escarabajos de cuernos largos, Rhagium inquisitor y R. mordax, expresan AFP, RiAFP y RmAFP, respectivamente, que contienen una versión ampliada del motivo TxT visto en las AFP de Tenebrionidea. La secuencia de consenso de RiAFP y RmAFP es la repetición TxTxTxT interrumpida por tramos de 13 a 20 residuos que no tienen ningún patrón obvio (Kristiansen et al. 2011, 2012). Seis de estos segmentos se pliegan en una configuración de hélice β aplanada con los motivos TxTxTxT apilados en un lado en una escalera regular (Kristiansen et al. 2012; Hakim et al. 2013). En el caso de los escarabajos de cuernos largos, solo hay dos cisteínas presentes (Kristiansen et al. 2011), y estas forman un enlace SS único en el extremo N de la molécula (Hakim et al. 2013). En la figura 2.3 se muestra una ilustración de RiAFP. El escarabajo Dorcus curvidens pertenece a la familia Lucanidae en el intraorden Scarabaeiformia. Sin embargo, sus secuencias de nucleótidos informadas que codifican AFP (Nishimiya et al. 2007) son muy similares a las de los tenebriónidos del intraorden Cucujiformia. Una búsqueda BLAST de una de estas secuencias (AB264320.1) mostró una identidad del 86 % con una secuencia de nucleótidos que codifica una isoforma de Tenebrio molitor (AF159114.1), y una búsqueda BLASTp mostró que la identidad era del 75 % a nivel de aminoácidos, superior que entre varias de las isoformas de D. curvidens. Esto es bastante digno de mención, dado el hecho de que estas especies están más lejanamente relacionadas que los escarabajos tenebriónidos y cerambícidos, que no comparten similitud de secuencia entre sus AFP. Himenópteros Xu et al. (2018) informaron sobre una AFP de la abeja china, Apis cerena cerena, denominada AcerAFP. Esta AFP de 60 kDa consta de 365 aminoácidos, es rica en alanina y contiene 11 repeticiones de los cuatro residuos AAxA. La proteína recombinante expresó una actividad anticongelante de 0,5 C y se encontró que tenía Machine Translated by Google 2 Características de las Proteínas Anticongelantes 21 63–96 % de similitud de secuencia con las secuencias de genes de otras 9 especies que abarcan varios subórdenes de himenópteros, informados en la base de datos del NCBI (Xu et al. 2018), lo que sugiere una amplia distribución de himenópteros de AcerAFP. Alrededor del 96,4% de la proteína consta de hélices α y el resto son bucles, y la estructura terciaria propuesta consta de tres regiones helicoidales α de la proteína que se pliegan entre sí. Curiosamente, esta estructura terciaria es bastante similar a la del pez Maxi hiperactivo tipo I AFP que se encuentra en la platija de invierno (Sun et al. 2014). Lepidópteros La aparición repetitiva de dos residuos de Thr espaciados con un residuo que se observa en las AFP de coleópteros también se encuentra comenzando en cada posición 15 a lo largo de la secuencia de CfAFP, las AFP que se encuentran en el género de lepidópteros, Choristoneura. No hay un patrón de repetición de consenso aparente en CfAFP más allá del motivo TxT. Esto es análogo a la situación con RiAFP del escarabajo R. inquisitor, donde el motivo TxT más ancho está separado por tramos desprovistos de una secuencia de consenso clara. No obstante, se ha demostrado que estas AFP se pliegan en una configuración de hélice β de manera similar a la del coleóptero TmAFP (Graether et al. 2000). Cada giro en la hélice se compone de 15 residuos, lo que da como resultado que los motivos TxT repetitivos se apilen en un lado de la hélice para formar una escalera de motivos TxT, como se ve en TmAFP. En el caso de CfAFP, la hélice es zurda en lugar de derecha, y aunque estas AFP también están estabilizadas por muchos enlaces SS internos que cruzan la hélice, estos no forman el patrón altamente regular que se observa en TmAFP (Gauthier et al. 1998 ; Graether et al. 2000). La Figura 2.2b muestra una ilustración del patrón de plegado de CfAFP. Tyshenko et al. (2005) sugirieron que las isoformas encontradas en Choristoneura fumiferana y especies estrechamente relacionadas del mismo género surgieron de un progenitor común antes de la divergencia de especies, hace unos 3,2–3,7 millones de años. Este marco de tiempo corresponde al período frío que precede a las glaciaciones del Pleistoceno que comenzó hace unos 3 millones de años. Lin et al. (2011) informaron que las AFP del gusano medidor lepidóptero Campaea perlata, CpAFP, se construyen a partir de una serie de la repetición de consenso básica TxTxTxTxTxxx. Se identificaron diferentes isoformas que formaron dos subconjuntos, cuatro isoformas pequeñas de ~3.5 kDa y cinco isoformas con masas de ~8.3 kDa. Una de las isoformas más grandes se modeló como una hélice β aplanada, donde cuatro motivos de la repetición TxTxTxTxT más ancha se apilan en una escalera en un lado de la hélice aplanada (Lin et al. 2011), análoga a la estructura determinada en el coleóptero RiAFP (Hakim et al. 2013). Dípteros Basu et al. (2015) informaron que un mosquito de la familia Chironomidae produce una AFP que consta de repeticiones de la secuencia consenso de 10 residuos xxCxGxYCxG. Esta proteína de 9,1 kDa tiene un contenido de cisteína aún mayor que TmAFP, DAFP y CfAFP. Se construyó un modelo de energía estabilizada basado en la configuración helicoidal, donde cada una de las ocho vueltas en la construcción consta de solo 10 residuos. Las dos cisteínas dentro de cada repetición de 10 residuos forman un enlace SS interno y estos enlaces cruzan la bobina de manera regular similar al patrón observado en el coleóptero TmAFP. En esta construcción, un lado de la molécula consta de una escalera regular de motivos YCx apilados. La posición x suele estar ocupada por Thr o Val. Las cadenas laterales de los residuos que flanquean la Cys en el motivo apuntan hacia afuera y Machine Translated by Google 22 E. Kristiansen son el sitio sospechoso de unión de hielo. No es probable que la estructura enrollada forme hojas β y, por lo tanto, su configuración se describió como un solenoide (Basu et al. 2015). Varias isoformas parecen estar presentes en la especie, que van desde 5,7 a 10 kDa. Hemípteros Guz et al. (2014) identificaron una AFP putativa, EmAFP, en la plaga solar Eurygaster maura. Aunque la actividad anticongelante no se informó explícitamente, se interpretó como una AFP según las características de la secuencia y su asociación con la etapa de hibernación. La proteína de 10 kDa muestra una similitud del 52 % con el lepidóptero CfAFP y tiene un patrón repetitivo de TxT espaciados 12–13 residuos a lo largo de la secuencia. Contiene cuatro residencias Cys sospechosas de formar dos enlaces SS internos. Se propuso plegarse como una hélice para zurdos, dejando el motivo TxT como una escalera regular en un lado plano de la proteína, como se informó para TmAFP y CfAFP. 2.2.2.2 Colémbolos Graham y Davies (2005) descubrieron una AFP hiperactiva rica en glicina, sfAFP, de la pulga de nieve colémbolo, Hypogastrura harveyi. La secuencia principal es una repetición del triplete Gxx, donde la primera posición x suele ser también una Gly. La proteína existe en dos isoformas, una variante pequeña de 6,5 kDa y una variante de 15,7 kDa. La forma más pequeña tiene dos enlaces SS internos, mientras que la más grande solo tiene uno. Sus secuencias no son muy similares, lo que sugiere que su separación es antigua. Se ha demostrado que la isoforma más pequeña se pliega en seis hélices cortas de poliprolina, donde cada triplete da una vuelta en la hélice (Lin et al. 2007; Pentelute et al. 2008). Curiosamente, el pliegue de hélice de poliprolina tipo II es también la configuración probable de AFGP de peces polares. La disposición general de estas hélices en sfAFP es una estructura que consta de dos láminas planas, donde cada lámina consta de tres hélices de poliprolina de tipo II paralelas y las tres hélices en cada una de las dos láminas son antiparalelas entre sí. Este patrón de plegado da como resultado que la estructura general tenga dos lados planos, uno más hidrofóbico que el otro. Mok et al. (2010) modelaron la isoforma más grande de acuerdo con el mismo patrón de plegado. De esta forma, hay 13 hélices de poliprolina tipo II donde 12 de estas forman dos láminas planas, cada una compuesta por seis hélices. En la figura 2.2c se muestra una ilustración del patrón de plegamiento de la isofo Hawes et al. (2014) informaron sobre la composición de aminoácidos de una AFP de 9 kDa del colémbolo antártico, Gomphiocephalus hodgsoni, denominada GomphyAFP. Aunque G. hodgsoni y H. harvey pertenecen a la misma familia de colémbolos, la composición de estas AFP colémbolos es claramente diferente. GomphyAFP contiene mucha menos glicina que sfAFP (~12 % frente a ~50 %) y mucha más cisteína que sfAFP (~14 % frente a 1–5 %). El contenido de glicina es alto en comparación con las AFP no colémbolos conocidas, mientras que el alto contenido de cisteína sugiere una estructura estabilizada por muchos enlaces disulfuro, como se ve en la mayoría de las AFP de insectos conocidas. Machine Translated by Google 2 Características de las Proteínas Anticongelantes 23 2.2.2.3 Arácnidos Neelakanta et al. (2010) informaron sobre una supuesta proteína anticongelante en la garrapata Ixodes scapularis, del orden Ixodida. La proteína tiene una identidad de secuencia de alrededor del 70 % con el andamiaje de proteínas de AFGP de peces polares, que consta de tramos largos del triplete AAT, y posteriormente se denominó IAFGP. No se proporcionó información para demostrar que esta proteína es una AF(G)P o si está glicosilada de una manera similar a la observada en las AFGP de los peces polares. La expresión de IAFGP en I. scapularis está aumentada por la presencia de la bacteria Anaplasma phagocytophilum, un patógeno humano del que la garrapata es huésped y vector. Esto se interpretó como reflejo de una relación simbiótica, ya que implica que la bacteria induce una mayor tolerancia al frío en su huésped. Bryan et al. (2013) informaron sobre la regulación al alza de genes que codifican AFP supuestas en individuos en diapausa del ácaro Tetranychus urticae, del orden Trombidiformes. Estas proteínas se examinaron solo in silico, y la identidad como AFP solo se infirió, en función de la comparación con las características estructurales de AFP conocidas de insectos. Las AFP predichas constan de 92–210 residuos con el patrón de repetición de 12 residuos de consenso identificable NCTxCxxCxNCx. Este patrón contiene dos residuos de Cys más que los de los escarabajos tenebriónidos y el lepidóptero C. fumiferana. La generación automática de configuración 3D sugiere que se pliegan de manera similar a las AFP de T. molitor, donde una pila del motivo tripéptido NCT forma una hoja β que comprende el IBS tentativo de la proteína. En esta configuración propuesta, dos de los residuos de Cys de cada repetición forman un patrón de disulfuro similar al observado en TmAFP, mientras que los dos residuos de Cys adicionales en la repetición están dirigidos hacia adentro y también pueden formar enlaces SS. 2.2.2.4 Crustáceos Kiko (2010) informó que el copépodo Stephos longipes expresa dos isoformas de una AFP hiperactiva que muestra una fuerte homología con las AFP identificadas en varias diatomeas, bacterias y moho de la nieve. Esta amplia distribución filogenética de una estructura homóloga aparente tanto en procariotas como en eucariotas es, a todas luces, el resultado de la transferencia lateral de genes, como aparentemente también es el caso de las AFP de tipo II de los peces. Hanada et al. (2014) describieron un homólogo encontrado en la bacteria del hielo marino antártico Colwellia sp.; la estructura consta de un dominio de hélice β y una hélice α alineada paralelamente a la hélice β. El dominio helicoidal β se pliega en una hélice levógira con una sección transversal triangular y tres láminas β paralelas. El SII de la proteína está ubicado en uno de los lados planos de la hélice β. En la figura 2.2d se muestra una ilustración del patrón de plegamiento de esta proteína . Machine Translated by Google 24 E. Kristiansen 2.3 Diversidad de isoformas Como se mencionó en la sección anterior, la aparición filogenética de los diversos tipos de peces AF(G)Ps son supuestamente los resultados de la evolución convergente independiente (tipo I y AFGP), la transferencia lateral de genes (tipo II) y el desarrollo a partir de un ancestro común (tipo III). Entre los artrópodos, un progenitor común está implícito para muchos, y las características estructurales secundarias comunes han evolucionado por evolución convergente entre especies lejanamente relacionadas. A nivel de organismo, hay muchas isoformas diferentes de AFP presentes en los fluidos corporales y son el resultado de una gran cantidad de genes. Estos genes generalmente están dispuestos en tándem, lo que sugiere una extensa duplicación de genes (Scott et al. 1985; Hew et al. 1988). Los AFGP tanto de los nototeniidos antárticos como de los bacalaos del Ártico están codificados por genes de poliproteína, donde la poliproteína se escinde postraduccionalmente para producir los AFGP maduros (Chen et al. 1997a, b; Hsiao et al. 1990; Baalsrud et al . 2018 ) . Uno de estos genes encontrado en Notothenia coriiceps negligencia codifica 46 proteínas maduras (Hsiao et al. 1990). En Dissostichus mawsoni, Chen et al. (1997b) encontraron 41 copias de secuencias de poliproteínas, codificando isoformas pertenecientes a cuatro de los ocho grupos de isoformas de tamaño conocido, y Baalsrud et al. (2018) encontraron que la cantidad de copias de genes en los bacalaos del Ártico variaba con la especie según su entorno térmico. Scott et al. (1985) informaron que la platija de invierno tiene alrededor de 40 genes que codifican AFP I, y Hew et al. (1988) encontraron 150 genes que codifican AFP tipo III en faneca oceánica. Hay una situación similar en los insectos; en el coleóptero T. molitor hay entre 30 y 50 copias del gen (Liou et al. 1999), y hasta la fecha se han descrito unas 27 isoformas de TmAFP (Graham et al. 2007). Se han descrito unas 30 isoformas en la D. canadensis relacionada (Nickell et al. 2013). La CfAFP del lepidóptero C. fumiferana está codificada por unos 17 genes diferentes, cada uno de los cuales se encuentra en 2 a 5 copias dispuestas en tándem dentro del genoma (Doucet et al. 2002). Por lo tanto, la expresión de AF (G) P se ve aumentada por una alta dosis de genes causada por la duplicación de genes tanto en insectos como en peces. Muchos AF(G)P se construyen como segmentos repetidos en serie, y parte de la variación entre las isoformas se debe a un número variable de segmentos repetidos. Como se mencionó, los AFGP no relacionados de los nototeniidos antárticos y los bacalaos del Ártico tienen de 4 a 50 segmentos de la unidad AAT básica. Varias de las AFP tipo I contienen tres o cuatro segmentos de su unidad repetida de 11 residuos (Chao et al. 1996; Gourlie et al. 1984; Low et al. 2001; Graham et al. 2008b; Hobbs et al. 2011). Las isoformas de los coleópteros T. molitor y D. canadensis varían de cinco a ocho copias de un patrón repetido (Liou et al. 1999; Andorfer y Duman 2000), mientras que las del lepidóptero C. fumiferana tienen cinco o siete segmentos de la repetición (Doucet et al. 2000). Así, tanto en los peces como en los insectos, los propios genes que codifican estas proteínas funcionales aparentemente evolucionaron por mecanismos similares; duplicación de patrones internos repetidos, que dan como resultado grupos de isoformas dentro del organismo que difieren en su número de repeticiones, análogo al proceso aparente por el cual evolucionó la alta dosis de genes. En el caso de las variantes de tipo I de peces grandes que se encuentran en las platijas, Gauthier et al. (2005) propusieron que las isoformas más pequeñas pueden derivarse de precursores más grandes. Machine Translated by Google 2 Características de las Proteínas Anticongelantes 25 La duplicación de genes da como resultado que ciertas isoformas dentro del organismo estén más estrechamente relacionadas con un gen original común que con otras, lo que hace que las isoformas formen subconjuntos basados en la similitud estructural. Por ejemplo, las formas QAE y SP de AFP tipo III comparten aproximadamente un 50% de identidad, mientras que la similitud es de aproximadamente un 7590% dentro de cada grupo (Chao et al. 1993). Como se mencionó, el tipo I de AFP que se encuentra en las platijas, sculpins, snailfish y cunner del ojo derecho está codificado por dos familias de genes; un grupo codifica proteínas con péptidos de señal y se producen en el hígado y se secretan al torrente sanguíneo, mientras que otro grupo, el tipo de piel, en su mayoría carece de codificación de péptidos de señal y se producen y localizan en otros tejidos (Gong et al. 1996) . Low et al. 1998; Evans y Fletcher 2006). Las isoformas del coleóptero D. canadensis se dividen en tres subconjuntos, grupo I, II y III, según la similitud de secuencia (Andorfer y Duman 2000). En el lepidóptero C. fumiferana, también se clasifican en tres subconjuntos, según la longitud de la región no traducida (UTR) 30 de sus ARNm: aquellos con UTR cortos (9 kDa), aquellos con UTR intermedia (12 kDa) y aquellos con UTR largas (9 kDa). Los miembros de cada grupo son estructuralmente más similares a otros miembros de ese grupo que a los miembros de los otros dos grupos de isoformas (Doucet et al. 2000). Las isoformas de especies de insectos y peces estrechamente relacionadas son estructuras homólogas, ya que probablemente evolucionaron en un ancestro común antes de la divergencia de especies. Tyshenko et al. (2005) caracterizaron isoformas homólogas a las del lepidóptero C. fumiferana en otras tres especies de Choristoneura; La comparación filogenética de las secuencias encontradas en estas cuatro especies hermanas mostró que las isoformas formaban dos subconjuntos. Cada subconjunto contenía isoformas de las cuatro especies. Las similitudes dentro de cada subconjunto fueron mayores que entre subconjuntos, lo que demuestra que la similitud de secuencia entre algunas de las isoformas fue mayor entre especies que dentro. Esto contrasta con la situación cuando se comparan isoformas homólogas de los dos escarabajos tenebriónidos más distantes, Tenebrio molitor y Dendroides canadensis (Graham et al. 2007), donde las isoformas son más similares dentro de cada especie. No está claro si el impulso evolutivo hacia esta gran cantidad de isoformas ha sido una selección hacia alguna funcionalidad de isoforma específica desconocida o una selección hacia el aumento de la producción de proteínas. Scott et al. (1985) señalaron que los ~40 genes que codifican AFP tipo I en la platija de invierno parecen muy altos, ya que la producción de proteínas podría mejorarse mediante otros mecanismos además de la dosificación génica, es decir, mediante tasas mejoradas de transcripción o traducción o una mayor estabilidad del ARNm. Las platijas producen sus AFP durante períodos de varias semanas, y el alto número de genes parece algo excesivo. Swanson y Aquadro (2002) sugirieron que la diversidad de isoformas en el coleóptero T. molitor es el resultado de la selección funcional a nivel de aminoácidos, lo que sugiere una funcionalidad específica. Graham et al. (2007) no encontró apoyo para esta afirmación y sugirió que, en cambio, la selección ha operado en el nivel de nucleótidos hacia un mayor contenido de AT en la posición del tercer codón. Esta selección de nucleótidos presumiblemente facilita la transcripción a baja temperatura y es funcionalmente neutral a nivel de proteína. Por lo tanto, la selección puede haber sido hacia una expresión más efectiva en lugar de una función específica. Esto está respaldado por las observaciones de que las poblaciones de peces polares que habitan en aguas más cálidas tienen genes más bajos Machine Translated by Google E. Kristiansen 26 codificación de dosis AF(G)Ps (Hew et al. 1988; Desjardins et al. 2012; Baalsrud et al. 2018; Yamazaki et al. 2019). Por otro lado, Duman et al. (2002) encontraron un patrón específico de expresión de diferentes isoformas en el coleóptero D. canadensis, Ma et al. (2012) encontraron expresión diferencial de dos isoformas de AFP del coleóptero A. polita y Doucet et al. (2000, 2002) encontraron que la expresión de algunas isoformas es específica de la etapa de vida en el lepidóptero C. fumiferana, lo que sugiere una diferenciación en la función de la isoforma. 2.4 Síntesis y Distribución Las bajas temperaturas y la corta duración del día son señales ambientales del invierno, y se ha demostrado que ambas condiciones estimulan la producción de AFP en insectos (Duman 1977; Patterson y Duman 1978; Horwath y Duman 1983a; Ma et al. 2012), un colémbolo ( Meier y Zettel 1997), y pescado (Duman y DeVries 1974; Fourney et al. 1984; Fletcher et al. 1989a). Además, las condiciones secas y el hambre también estimulan la producción de AFP en varios insectos (Duman 1977; Patterson y Duman 1978; Graham et al. 2000). Los días cortos parecen actuar al afectar el control hormonal de la expresión. En la platija de invierno, la expresión del tipo hepático está fuertemente influenciada por el fotoperíodo, que actúa a través del sistema nervioso central sobre la glándula pituitaria (Fourney et al. 1984 ; Fletcher et al. 1989a). Durante el verano, la duración prolongada del día provoca la liberación de la hormona del crecimiento de la hipófisis que bloquea la transcripción de los genes AFP. A medida que la duración del día se acorta durante el otoño, el nivel de la hormona del crecimiento disminuye y se produce la transcripción de los genes AFP en el hígado. La eliminación de la pituitaria en individuos durante el verano provocó una fuerte producción de AFP de tipo hepático (Fourney et al. 1984; Fletcher et al. 1989a). Sin embargo, dicha eliminación no afecta los niveles de AFP del tipo de la piel, lo que sugiere que estos genes no están bajo el control de la hipófisis (Gong et al. 1995). Dado que la expresión de las AFP de tipo piel es sensible a la temperatura, su regulación puede ser postranscripcional, aumentando la vida media de sus ARNm a baja temperatura (Gong et al. 1995 ). En los coleópteros D. canadensis y T. molitor, el fotoperíodo corto aparentemente afecta la producción de AFP al afectar el nivel de hormona juvenil (Horwath y Duman 1983b; Xu y Duman 1991; Xu et al. 1992), una hormona liberada principalmente por el cuerpo allatum. Los individuos tratados con hormona juvenil y mantenidos en condiciones de luz solar prolongada ya temperatura ambiente produjeron altos niveles de AFP, mientras que los individuos de control no lo hicieron. En D. canadensis, la adición de la hormona antijuvenil Precocene II impidió que las AFP se expresaran en un fotoperíodo corto a temperatura ambiente, mientras que los controles no tratados expresaron AFP. El Precoceno II también impidió la expresión de AFP en individuos mantenidos en condiciones invernales (Xu y Duman 1991). En células de grasa corporal aisladas, la hormona juvenil induce la transcripción tanto en T. molitor como en D. canadensis, pero solo si los individuos habían estado expuestos previamente a la hormona juvenil (Xu y Duman 1991; Xu et al. 1992 ) . Machine Translated by Google 2 Características de las Proteínas Anticongelantes 27 lo que sugiere que se necesitan algunos factores distintos de la hormona juvenil para inducir la producción de AFP. En contraste con la sensibilidad ambiental de la expresión de AFP observada en muchas especies, la del lepidóptero C. fumiferana parece estar estrictamente controlada por el desarrollo. Individuos de diferentes etapas de la vida expresaron diferentes niveles de AFP y estos niveles fueron bastante insensibles a las condiciones cambiantes de luz y temperatura (Doucet et al. 2002), y los niveles de transcripción se ven afectados negativamente por las hormonas in vitro (Qin et al. 2007). 2.4.1 Sitios de síntesis y distribución en peces polares Se han identificado varios sitios de síntesis de AF(G)Ps. En las especies del Ártico, una fuente importante es el hígado. Estas variantes de tipo hepático se exportan directamente al torrente sanguíneo. Contrariamente a la creencia de larga data, Cheng et al. (2006) demostraron que los nototeniidos antárticos no sintetizan ninguno de sus AFGP en el hígado sino que utilizan el páncreas y los tejidos asociados. Después de la síntesis, las AFGP se liberan en el líquido intestinal a través del conducto pancreático. Dado que el páncreas es el único sitio identificado de producción de AFGP en los nototeniidos antárticos, sus AFGP circulantes aparentemente han ingresado a su sangre por absorción del intestino. Chen et al. (2006) también descubrieron que el páncreas era un segundo sitio importante de síntesis en las especies del Ártico que producían todos los tipos conocidos de AF(G)P. Dado que el fluido intestinal de los peces polares expresa actividad anticongelante (O'Grady et al. 1982; Præbel y Ramløv 2005; Cheng et al. 2006), un patrón circulatorio similar basado en la absorción de AF(G)Ps del intestino bien puede ser una segunda fuente de AF (G) P en el torrente sanguíneo de los peces no nototeniidos, además de los secretados directamente en el vapor sanguíneo desde el hígado. Esta ruta indirecta desde el sitio de síntesis a través del fluido intestinal hasta el torrente sanguíneo en los nototeniidos antárticos probablemente refleja la importancia de evitar que los cristales de hielo ingeridos inoculen el fluido intestinal (Cheng et al. 2006) ; dado que los peces polares son hipoosmóticos con respecto a su entorno, ingieren agua de mar como parte de su osmorregulación obligada. Esto los expone potencialmente a cristales de hielo en el agua ingerida. Además del peligro de la inoculación directa de fluidos corporales a través de la pared intestinal, tales cristales de hielo ingeridos pueden crecer potencialmente a medida que se eliminan las sales durante el proceso de absorción de agua y el fluido intestinal se vuelve progresivamente hipoosmótico al agua de mar a lo largo del intestino (O 'Grady et al. 1983). La necesidad de combatir este peligro aparentemente ha provocado que el páncreas, con su conexión directa con el fluido intestinal a través del conducto pancreático, se convierta en un importante sitio de síntesis en diversos taxones de peces polares y el único sitio de este tipo en los nototeniidos antárticos. ¿Por qué los peces del Ártico dependen de dos sitios principales de síntesis de sus AF (G)P transmitidas por la sangre y los nototeniidos antárticos tienen solo uno? Quizás se deba a las diferencias en la necesidad de aumentar rápidamente los niveles circulantes de AF(G)Ps. Las temperaturas del agua de la Antártida están permanentemente bajo cero. peces que viven en Machine Translated by Google E. Kristiansen 28 estas aguas no tendrían necesidad de aumentar rápidamente las cantidades circulantes de AF (G) Ps en respuesta a cambios ambientales, es decir, tendrían síntesis hepática con una excreción directa a la sangre. Los peces del Ártico, por otro lado, pueden necesitar aumentar su protección anticongelante debido a las variaciones estacionales o debido a la migración a aguas más frías, y la ruta directa desde el sitio de síntesis en el hígado hasta la sangre puede ser relevante. Las isoformas tipo piel de AFP tipo I se sintetizan en tejidos que están expuestos al ambiente exterior helado. Estos tejidos incluyen la piel, los filamentos branquiales y las aletas dorsales, además del intestino y el cerebro (Gong et al. 1996; Low et al. 1998; Evans y Fletcher 2006). En sculpin, no hay expresión de genes del tipo de la piel en el hígado (Low et al. 1998), mientras que la coexpresión de isoformas del tipo de la piel en el hígado sí ocurre en la platija de invierno (Gong et al. 1996). Aunque todos los peces polares que producen AF(G)P contienen AF(G)P en la sangre, se sabe menos sobre su distribución en otros compartimentos de fluidos corporales. Los nototeniidos antárticos producen AFGP de ocho grupos de tamaños distintos. Ahlgren et al. (1988) informaron que los grupos de AFGP de todos los tamaños se distribuyen pasivamente en los fluidos corporales extracelulares de dos especies de nototeniidos antárticos, pero no estaban presentes intracelularmente. No se encontraron AFGP en el cerebro ni en la orina, atribuibles a la barrera hematoencefálica y los riñones aglomerulares de estos peces (ver más abajo). La bilis contiene AFGP y O'Grady et al. (1983) argumentaron que esta es una ruta para la transferencia de AFGP transmitidos por la sangre para ingresar al intestino. Evans et al. (2011) también observaron AFGP marcados con fluorescencia inyectados en la mayoría de los fluidos extracelulares, excepto en la orina y el cerebro En el caso de la platija de invierno del Ártico y la escorpina de cuernos cortos, los genes de sus AFP del tipo de la piel carecen de regiones codificantes para péptidos señal, lo que indica que no se excretan de las células sino que funcionan intracelularmente (Gong et al. 1996; Low et al. 1998 ) . Sin embargo, en el pez caracol, la AFP I del tipo de piel es idéntica a la que circula en la sangre, lo que sugiere que se excreta en el torrente sanguíneo después de la síntesis (Evans y Fletcher 2005a). Además, la AFP II de tipo hepático del cuervo de mar, H. americanus, se encuentra en el tejido de la piel (Evans y Fletcher 2006), lo que sugiere la captación de AFP II de tipo hepático de la sangre o la síntesis de AFP similares en la piel y el hígado. Bajo et al. (1998) también encontraron expresión de AFP de tipo piel en el cerebro de la escultura de cuerno corto. Por lo tanto, en contraste con los hallazgos de los nototeniidos antárticos, se ha demostrado que varias especies no nototeniidas del Ártico tienen AFP en sus células y tejido cerebral. Prevención de la pérdida urinaria de AF(G)Ps en peces polares La pérdida de AF(G)Ps representa un gasto energético para el organismo. La aparente absorción de AFGP del intestino en los nototeniidos (Cheng et al. 2006) probablemente reduce su pérdida durante la evacuación del intestino. Sin embargo, las AF(G)P que circulan en la sangre pueden perderse potencialmente a través de la orina. Las moléculas con tamaños inferiores a 68 kDa se filtran en los glomérulos (Eastman 1993), lo que sugiere que las AF(G)P pueden filtrarse fuera del plasma durante la formación de la orina. Tal filtración podría ser contrarrestada por la reabsorción energéticamente costosa de AF(G)Ps del filtrado. En los nototeniidos antárticos, este problema potencial se evita de manera efectiva mediante la degeneración evolutiva de sus glomérulos (Eastman y DeVries 1986). Formación de orina en tal aglomerular Machine Translated by Google 2 Características de las Proteínas Anticongelantes 29 especies se basa en la secreción en lugar de la filtración, y la pérdida de AFGP se evita de manera efectiva (Dobbs y DeVries 1975; Eastman 1993). Eastman et al. (1987) no encontraron riñones aglomerulares al examinar diversos taxones de teleósteos del Ártico que producen AF(G)Ps. En cambio, los peces del Ártico tienen una barrera de repulsión aniónica en la membrana basal de la nefrona. Esta barrera de repulsión funciona de la misma manera que la barrera de repulsión aniónica de los mamíferos (Kenwar et al. 1980), donde las glicoproteínas ricas en carboxilo en la membrana basal restringen la filtración de moléculas aniónicas, incluidas las AF(G)P aniónicas (Petzel y DeVries 1980 ; Boyd y DeVries 1983, 1986). Según se informa, las AFP de tipo I son repelidas en la membrana basal por este mecanismo (Petzel y DeVries 1980; Boyd y DeVries 1983). Como se mencionó anteriormente, las variantes QAE y SP de AFP tipo III tienen cargas opuestas a pH fisiológico y ambas están presentes en el animal. Boyd y DeVries (1986) encontraron que las anguilas norteñas productoras de AFP tipo III tienen riñones glomerulares y un mecanismo de repulsión aniónica. Por lo tanto, aunque la retención de las formas QAE aniónicas puede ser similar a la observada para las AFP tipo I de la platija de invierno, se esperaría que las formas SP catiónicas se filtren. Muchos de los peces del Ártico solo expresan AF(G)Ps durante partes del año (Scott et al. 1985; Reisman et al. 1987). En estas especies, una forma de reducir la pérdida de orina puede ser reducir su filtración glomerular durante el invierno (Hickman 1968). Curiosamente, Eastman et al. (1979) encontraron que, contrariamente a las angulas del norte, las angulas antárticas productoras de AFP III tienen glomérulos no funcionales. En este caso, no habría problema con la pérdida potencial de las variantes SP de la AFP tipo III, y la orina no contenía ninguna AFP tipo III (Eastman et al. 1979). Contrariamente a los hallazgos anteriores (Petzel y DeVries 1980; Boyd y DeVries 1986; Eastman et al. 1987), Fletcher et al. (1989b) encontraron AF(G)P en la orina de varias especies del Ártico. Estos incluyeron AFP tipo I en la orina de lenguado de invierno (Pseudopleuronectes americanus), AFP tipo II en la orina de cuervo marino (Hemitripterus americanus), AFP tipo III en la orina de faneca oceánica (Macrozoarces americanus) y AFGP en la orina de Atlantic bacalao (Gadus morhua). No había AFP tipo I en la orina de la escultura de cuerno corto (Myoxocephalus scorpius). Los niveles en la orina variaron sustancialmente, y la presencia de concentraciones relativamente altas de AFP en la orina puede ser una consecuencia de la concentración de pequeñas cantidades de AFP de un gran volumen de orina por reabsorción de agua (DeVries y Cheng 2005) . La presencia de AF(G)P en la orina puede ser funcional, ya que presumiblemente brindan la misma protección contra la congelación a la orina que a otros compartimentos de líquidos (Fletcher et al. 1989b). 2.4.2 Sitios de síntesis y distribución en insectos Solo unos pocos estudios brindan información sobre el sitio de síntesis y/o distribución de AFP en insectos. En conjunto, estos estudios informan la presencia de AFP en uno o varios de los diferentes compartimentos de fluidos corporales: hemolinfa, fluido intestinal, tejido muscular y tejido epidérmico (Duman et al. 2002; Nickell et al . 2013 ; Machine Translated by Google E. Kristiansen 30 Ramsay 1964; Graham et al. 2000; Kristiansen et al. 1999, 2005; Buch y Ramlov 2017; Guz et al. 2014). El cuerpo graso es el sitio principal de síntesis de proteínas en insectos (Arrese y Soulages 2010), y todas las especies examinadas han mostrado síntesis de AFP en este órgano. Otros tejidos que se ha demostrado que transcriben genes AFP son el tejido intestinal, los túbulos de Malpighian y la epidermis. Todas las especies examinadas tienen varias isoformas de AFP y existe evidencia de una distribución específica de isoformas en los fluidos corporales y entre las etapas de la vida. Duman et al. (2002) informaron sobre la expresión y distribución de 12 isoformas en el escarabajo D. Canadensis. Estos se dividen en tres grupos, I, II y III, en función de su similitud de secuencia. Las isoformas maduras pertenecientes al grupo I solo se localizan en la hemolinfa mientras que las del grupo II y III se localizan en el líquido intestinal. Los genes de todas las isoformas se transcriben en el cuerpo graso, mientras que los del grupo II y III también se transcriben en el tejido intestinal. Además, hay expresión de varias de las isoformas pertenecientes al grupo I y II, pero no al III, en tejido epidérmico. Nickel et al. (2013) informaron que 24 isoformas de D. canadensis, de las cuales 18 eran previamente desconocidas, se transcribieron en los túbulos de Malpighi. Los representantes de todos los grupos (I, II, III) se transcribieron en el tejido de Malpighian. La actividad de histéresis en esta especie se ha informado a partir del líquido del túbulo de Malpighian, el líquido rectal excretado (Nickell et al. 2013), el líquido intestinal y la hemolinfa (Duman et al. 2002). Ramsay (1964) observó actividad de histéresis en todos los compartimentos de líquido extracelular del escarabajo estrechamente relacionado Tenebrio molitor, excepto en el líquido de los túbulos de Malpighian. Los individuos evaluados por Ramsay se criaron a temperatura ambiente. Estos compartimentos extracelulares incluían fluido intestinal, hemolinfa y fluidos perirrectales. Graham et al. (2000) informaron de la transcripción de AFP en T. molitor en el cuerpo graso, el intestino medio y el intestino posterior, pero no en los ovarios ni en el aparato reproductor masculino. Kristiansen et al. (1999) estudiaron la actividad de histéresis en diferentes compartimentos de fluidos corporales del escarabajo Rhagium inquisitor y encontraron actividad tanto en el fluido intestinal como en la hemolinfa. Además, los extractos de tejido larvario, donde la hemolinfa había sido eliminada por lavado y el cuerpo graso y el intestino eliminados por disección, mostraron una actividad considerable. Estos hallazgos sugirieron fuertemente la presencia de cantidades sustanciales de AFP intracelulares en los tejidos musculares. Además, los extractos del cuerpo graso también mostraron una alta actividad. Aunque la secuencia completa de aminoácidos de una sola isoforma de 13 kDa se conoce de R. inquisitor, Kristiansen et al. (2005) observaron al menos seis picos de actividad distintos adicionales durante la cromatografía de intercambio iónico de su hemolinfa, lo que sugiere que hay múltiples isoformas presentes en la hemolinfa. Buch y Ramløv (2017) utilizaron anticuerpos monoclonales marcados con fluorescencia producidos contra una sola isoforma homóloga de la R. mordax estrechamente relacionada y descubrieron que la proteína estaba presente en el tejido intestinal, el fluido intestinal y la cutícula. El patrón de fluorescencia en individuos de verano fue indicativo del almacenamiento celular de estas AFP durante el verano. Guz et al. (2014) informaron que la AFP tentativa, EmAFP, del hemíptero Eurygaster maura solo mostró niveles de transcripción significativos para esta proteína en el tejido intestinal. Solo se detectaron trazas de ARNm en el cuerpo graso, ovario, túbulos de Malpighian, tráquea, corazón, músculo volador o el sistema nervioso. Machine Translated by Google 2 Características de las Proteínas Anticongelantes 31 2.5 Características de los sitios de unión de hielo Según se informa, los sitios de unión al hielo (IBS) de las AFP son muy planos y más hidrofóbicos que el resto de la estructura (Yang et al. 1988; Sönnichsen et al. 1996; Haymet et al. 1998; Yang et al. 1998; Graether et al. 2000; Liou et al. 2000). El carácter hidrofóbico del IBS presumiblemente hace que la proteína se oriente lejos de la solución y hacia la superficie del hielo, mientras que la planitud del IBS es probablemente para obtener un buen ajuste estructural al plano del cristal. El carácter plano del SII de RiAFP se ilustra en la figura 2.3. Los residuos que forman los sitios de unión al hielo de las AF(G)P generalmente están organizados de manera repetitiva, lo que da como resultado distancias repetitivas entre los residuos. Por ejemplo, en la configuración de hélice de poliprolina tipo II helicoidal propuesta para las AFGP moderadamente activas (Franks y Morris 1978; Bush et al. 1984; Mimura et al. 1992; Tachibana et al. 2004), la distancia repetida entre los grupos hidroxilo de la unidades de disacárido es de aproximadamente 9,31 Å (Knight et al. 1993). Esta distancia es muy cercana a la que existe entre los átomos de oxígeno en la red de hielo en el plano cristalino primario orientado a lo largo del eje a, el plano de adsorción determinado experimentalmente y la orientación de estos AFGP (Knight et al. 1993) . De manera similar, para la AFP tipo I moderadamente activa, la separación de 11 residuos entre los grupos hidroxilo en las cadenas laterales de los residuos Thr en la hélice α es de 16,5 Å, lo que coincide muy de cerca con la separación de 16,7 Å de los átomos de oxígeno a lo largo de una sola dirección en la hélice α. plano cristalino que se sabe que adsorben (Knight et al. 1991). En las AFP helicoidales β, el ancho entre los grupos hidroxilo de los residuos Thr que se proyectan hacia el exterior en los motivos TxT es de aproximadamente 7,4 Å dentro de cada hebra β. La longitud entre hebras es de aproximadamente 4,5 Å (Liou et al. 2000). Estas distancias en el IBS de RiAFP se ilustran en la Fig. 2.3 y ocurren entre moléculas de agua en múltiples orientaciones en varios planos de cristal. Exactamente cómo las AF(G)P se adsorben en los cristales de hielo ha sido un tema de debate (Garnham et al. 2011). Varios estudios han demostrado que las AF(G)P tienen moléculas de agua unidas dispuestas en una red similar al hielo en sus sitios de unión al hielo (Liou et al. 2000; Leinala et al. 2002; Garnham et al. 2011; Hakim et al. 2013; sol et al. 2014). Con toda probabilidad, estas moléculas de agua se fusionan con la superficie del hielo solidificado a temperaturas por debajo del punto de fusión y se desacoplan de la superficie del hielo a medida que la temperatura se eleva por encima del punto de fusión. Esencialmente, los AF(G)P se “congelan” y se “derriten” en el hielo, dependiendo de la temperatura (Kristiansen y Zachariassen 2005). Por lo tanto, la funcionalidad de la disposición específica de los residuos en el SII bien puede ser estructurar el agua de hidratación en el sitio de unión del hielo en lugar de interactuar directamente con oxígenos específicos en el hielo (Sun et al. 2014; Chakraborty y Jana 2019 ) . 2.5.1 AF(G)Ps moderadamente activo En los AF(G)Ps de peces moderadamente activos, los sitios de unión al hielo consisten en residuos organizados de manera que restringen la adsorción de los AF(G)Ps en un solo hielo específico. Machine Translated by Google E. Kristiansen 32 plano cristalino y en una orientación específica en ese plano. La especificidad en la orientación de la absorción fue documentada por Laursen et al. (1994) quienes demostraron que las variantes quirales L y D de AFP tipo I se adsorben en orientaciones de imagen especular en el mismo plano cristalino. Debido a su adsorción específica en un solo plano, los cristales de hielo en presencia de AF(G)P de peces moderadamente activos adquieren la forma de una bipirámide hexagonal (p. ej., Baardsnes et al. 2001; Loewen et al. 1998; Ewart et al . 1998 ) . Esta forma es la única forma posible que expone un solo plano protegido hacia la solución circundante. Característicamente, estos cristales de bipirámide hexagonal se congelan desde su vértice en el punto de congelación por histéresis. Aparentemente, las AF(G)P moderadamente activas solo protegen débilmente los vértices de los cristales bipiramidales, lo que es la causa probable de su actividad moderada (Jia y Davies 2002). 2.5.2 AF(G)P hiperactiva El SII de las AFP hiperactivas, como las formas βhelicoidales que se encuentran en muchos insectos (Tabla 2.2), tienen un ancho y un largo, lo que les permite adsorberse en múltiples planos y en múltiples orientaciones. La alta incidencia del patrón de plegamiento de la hélice β entre las AFP hiperactivas puede reflejar el buen ajuste 2D entre las distancias internas de residuo a residuo dentro de la lámina β y las distancias entre los átomos de oxígeno en el hielo (Graether y Sykes 2004) . Esta puede haber sido la fuerza impulsora que causó la abundancia actual de este andamiaje estructural en AFP no relacionadas (Cuadro 2.2). Curiosamente, tanto la gran variante Maxi hiperactiva del pez AFP tipo I como la AFP hiperactiva de la pulga de la nieve colémbolo obtienen el ancho y el largo de sus sitios de unión al hielo al tener varias hélices una al lado de la otra. Los cristales que se forman en presencia de AFP hiperactivas expresan varios planos cristalinos hacia la solución circundante. Es probable que su hiperactividad se deba a su capacidad para adsorberse en múltiples planos de cristal y, por lo tanto, proteger eficazmente toda la superficie. Se ha propuesto que la capacidad de adsorberse en el plano basal es la causa raíz de su hiperactividad (Liou et al. 2000; Graether et al. 2000; Pertaya et al. 2008). 2.6 Conclusiones Los AF(G)P han evolucionado de forma independiente en muchos grupos diferentes de peces y artrópodos que habitan en regiones frías. Su distribución taxonómica actual refleja procesos evolutivos complejos, donde la evolución convergente y la transferencia lateral de genes han llevado a que se encuentren estructuras tanto análogas como homólogas en especies lejanamente relacionadas. La construcción repetitiva simple de las AFGP, las AFP de tipo I y muchas AFP que se encuentran en los artrópodos, como una serie de secuencias repetidas más cortas, es presumiblemente el resultado de la duplicación interna de las repeticiones que ha dado como resultado genes funcion Las estructuras más complejas (AFP tipo II y III) aparentemente se derivan de Machine Translated by Google 2 Características de las Proteínas Anticongelantes 33 Proteínas funcionales involucradas originalmente en la unión de carbohidratos. En el caso de las estructuras repetitivas, todas se pliegan en configuraciones helicoidales con su IBS compuesto de residuos regularmente espaciados ubicados en un lado de la bobina. Tanto los peces como los insectos tienen una alta dosis de genes de AF(G)Ps que aparentemente es el resultado de la duplicación de genes. Todas las especies examinadas tienen un alto número de isoformas, y no está claro si esto se debe a una presión selectiva hacia la divergencia en la función de las isoformas o exclusivamente hacia el aumento de la producción de proteínas. Se han identificado varios sitios de síntesis tanto en peces como en insectos, y prevalece la ubicación de expresión específica de la isoforma. En muchas especies, la expresión está regulada por señales ambientales que actúan a través de mecanismos hormonales, pero algunas especies parecen ser insensibles a tales señales y la expresión puede estar relacionada con la etapa de desarrollo En los peces polares, tanto el(los) sitio(s) de síntesis como el(los) mecanismo(s) para prevenir la pérdida urinaria de AF(G)Ps parecen estar relacionados con la permanencia de su ambiente térmico; Las aguas antárticas son permanentemente frías y térmicamente estables, mientras que la temperatura de las aguas árticas varía según el lugar y la estación. Los AFGP de los nototenioides antárticos toman una ruta indirecta ("lenta") desde su sitio de síntesis pancreático a la sangre a través del intestino, mientras que las especies productoras de AF(G)P del Ártico también tienen síntesis hepática, lo que les otorga una vía directa adicional ("rápida"). ”) secreción del hígado a la sangre. En las especies antárticas, la prevención de la pérdida urinaria de AF(G)Ps se logra principalmente mediante la degeneración de los glomérulos renales, una adaptación fisiológica permanente a un entorno constante. En las especies del Ártico, por otro lado, un mecanismo de repulsión basado en cargas en la membrana basal de la nefrona evita la pérdida urinaria de AF(G)P, lo que permite que estas especies tengan riñones funcionales durante todo el año. La funcionalidad de las AF(G)Ps surge de la capacidad de su SII para adsorberse irreversiblemente en la superficie de los cristales de hielo. Según los informes, el SII es más hidrofóbico que el resto de la superficie de la proteína, lo que presumiblemente orienta al SII hacia el hielo. En presencia de AF(G)Ps moderadamente activos, se forman cristales bipiramidales que exponen solo un único plano de cristal protegido a la solución circundante. En presencia de AF(G)P hiperactivas, los cristales de hielo exponen varios planos protegidos a la solución. Estos hábitos cristalinos deben surgir de las características del SII. En las AFGP y AFP tipo I de peces moderadamente activas, el plegamiento helicoidal da como resultado que el SII consista en una sola fila de residuos que se unen al hielo, lo que aparentemente otorga a estas proteínas la capacidad de adsorberse solo en un solo plano. En las AFP de artrópodos helicoidales hiperactivas, el SII se compone de varias filas paralelas de residuos que hacen que el SII se ajuste a varios planos y orientaciones. En algunas AFP hiperactivas, el SII está formado por varias hélices intermoleculares o intramoleculares una al lado de la otra. Esta organización de las hélices da como resultado varias filas paralelas de residuos de unión de hielo y, en consecuencia, proporciona la capacidad necesaria de la AF (G) P para adsorberse en múltiples planos y orientaciones similares a otras AFP hiperactivas. Machine Translated by Google E. Kristiansen 34 Referencias Ahlgren J, Cheng CHC, Schrag JD, DeVries AL (1988) Prevención de la congelación y distribución de glicopéptidos anticongelantes en fluidos corporales y tejidos de peces antárticos. J Exp Biol 137:549–563 Andorfer CA, Duman JG (2000) Aislamiento y caracterización de clones de ADNc que codifican proteínas anticongelantes del escarabajo pirocroide Dendroides canadensis. J Insect Physiol 46:365–372 Arrese EL, Soulages JL (2010) Cuerpo graso de insectos: energía, metabolismo y regulación. 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Biophys J 74:2142–2151 Zachariassen KE, Husby JA (1982) El efecto anticongelante de los agentes de histéresis térmica protege a los insectos altamente sobreenfriados. Naturaleza 298: 865–867 Machine Translated by Google Capítulo 3 Propiedades fisicoquímicas del anticongelante Proteínas Dennis Steven Friis y Hans Ramlov 3.1 Introducción Como se indicó en los capítulos anteriores, las proteínas anticongelantes (AFP) se encuentran en varias especies donde en varios casos han evolucionado de manera convergente (descrito en detalle en el Capítulo 9 del Vol. 1), y se han encontrado en diferentes formas y tamaños. Aparentemente, el único denominador común de las proteínas anticongelantes es su afinidad por el hielo. La gran diversidad de las AFP también implica una diversidad de sus propiedades fisicoquímicas, descritas en este capítulo. Las propiedades fisicoquímicas de las proteínas son un campo amplio y abarcan numerosos parámetros, y lejos de todos estos han sido investigados por las AFPs. En este capítulo se presenta la investigación en campo, abarcando el tamaño y actividad de las AFPs, su solubilidad e hidrofobicidad y por último su estabilidad en cuanto a temperatura y pH. 3.2 Peso y actividad de las proteínas anticongelantes Los pesos de las AFP suelen ser una de las primeras propiedades que se determinan cuando se descubre una nueva AFP, junto con su actividad. Los pesos de las AFP conocidas varían mucho entre los diferentes grupos de especies en los que se encuentran y dentro de los tipos en los que se agrupan. Esta sección se centra en las AFP de peces y artrópodos, ya que son las proteínas más investigadas. En general, las AFP son proteínas monoméricas pequeñas (3–30 kDa). A continuación, se enumeran las AFP de diferentes tipos o grupos de especies. DS Friis (*) Copenhague, Dinamarca H. Ramløv Departamento de Ciencias Naturales, Universidad de Roskilde, Roskilde, Dinamarca Correo electrónico: [email protected] © Springer Nature Suiza AG 2020 H. Ramløv, DS Friis (eds.), Proteínas anticongelantes Volumen 2, https://doi.org/10.1007/9783030419486_3 43 Machine Translated by Google 44 DS Friis y H. Ramløv discutidos en cuanto a la histéresis que provocan en relación con el peso de las AFP. Dentro de cada grupo, las AFP pueden diferir mucho, no solo en tamaño, sino también, por ejemplo, en las secuencias peptídicas o el plano de hielo específico al que se unen, ya que proceden de diferentes especies. Además, aunque todas las actividades de histéresis térmica presentadas aquí se han medido en un osmómetro de nanolitros o un dispositivo similar (a menos que se indique lo contrario), todavía puede haber diferencias en los procedimientos de medición entre laboratorios. Estas diferencias pueden afectar las mediciones de actividad y perjudicar las comparaciones directas, y hacer que la relación tamañoactividad sea más difícil de evaluar. En los resultados a continuación, los datos de todos los laboratorios y diferentes AFP en cada subgrupo se presentan juntos, y la conclusión general se presenta al final del subcapítulo. 3.2.1 AFP de pescado Las AFP de peces se dividen en cinco tipos, según su estructura, como se describe en detalle en el Cap. 5 del vol. 1, administrado como tipo I a IV y glicoproteínas anticongelantes (AFGP); sin embargo, se puede discutir si la AFP tipo IV sirve como anticongelante in vivo debido a su baja concentración. Se observan varias isoformas de las AFP dentro de cada grupo, que difieren tanto en peso como en actividad, manteniendo la estructura general. Los datos presentados aquí se dividen en los tipos de peces AFP, centrándose en las diferentes isoformas y su peso y actividad dentro de cada grupo. Las glicoproteínas anticongelantes (AFGP), las AFP glicosiladas, se encuentran en una amplia gama de tamaños y abarcan tanto las AF(G)P más pequeñas como las más grandes encontradas. El AFGP más pequeño informado se encuentra en el bacalao calvo, Pagothenia borchgrevinki, pesa 2,6 kDa y consta de cuatro repeticiones de AAT con un disacárido unido a la treonina que constituye los AFGP en general (Feeney 1974) . En la misma especie se encuentra el AFGP más grande hasta ahora, que es de 32 kDa y consta de 50 repeticiones AAT (DeVries et al. 1970). Aunque se encuentra en varias especies, la base estructural es la misma: repeticiones de AAT glicosiladas, con solo unas pocas variaciones en el grupo de azúcar unido, así como algunas sustituciones de alanina con prolina en la secuencia de aminoácidos. Las Figuras 3.1ayb muestran las actividades de AFGP de varios tamaños de Gadus ogac (bacalao de roca), en comparación tanto en peso (Fig. 3.1a) como molar (Fig. 3.1b). Los AFGP de tamaño pequeño (2,610 kDa) son menos activos que los tres AFGP más grandes (13,724,1 kDa), tanto en la cantidad de proteína total como en la concentración molecular (Wu et al. 2001) . En general, se puede observar una tendencia de mayor actividad para los AFGP más grandes, y es más clara cuando se comparan las concentraciones molares. Esto también es evidente en el estudio de las AFGP de P. borchgrevinki (Fig. 3.1c) , donde se compara la actividad de diferentes tamaños de AFGP a una concentración de 1 mM (DeVries 1988) Aunque está correlacionada, la actividad de las AFGP no parece depender únicamente del tamaño, y es probable que factores como el tipo de glicosilación y la cantidad de sustituciones de prolina influyan en la actividad de las AFGP. Curiosamente, mientras el Machine Translated by Google 45 3 Propiedades fisicoquímicas de las proteínas anticongelantes A B 0.8 0.8 0.6 0.6 0.4 0.4 Histéresis (°C) 0.2 Histéresis (°C) 0.2 0 0 5 0 10 15 20 0 Concentración de AFGP (mg/ml) 4 2 6 8 10 Concentración AFGP (mM) C 1.2 1 0.8 0.6 Histéresis (°C) 0.4 0.2 0 0 5 10 15 20 25 30 Peso molecular (kDa) Fig. 3.1 Tamaño y actividad de AFGP. La histéresis evocada por AFGP de Gadus ogac se correlacionó con la concentración en mg/l (a) o mM (b). Leyenda: triángulo abierto: 2,6 kDa, cuadrado relleno: 3,3 kDa, círculo relleno: 3,9 kDa, triángulo relleno: 610 kDa, cuadrado abierto: 13,7 kDa, círculo abierto: 21,7 kDa, diamante relleno: 24,1 kDa (Wu et al. 2001). ( c ) Histéresis evocada a una concentración de 1 mM de AFGP de Pagothenia borchgrevinki de diferentes tamaños. El punto de datos a 2 kDa es el AFGP de 2,6 kDa que se ha acortado en una unidad de glicotripéptido por degradación de Edman (DeVries 1988) los AFGP pequeños son los menos activos, estos son los AFGP más abundantes en la sangre de los peces (Burcham et al. 1984). Las AFP de tipo I, la estructura simple de hélice α, se encuentran entre las AFP más pequeñas. La proteína más pequeña de este grupo se encuentra en la esculpida de cuerno corto, Myoxocephalus scorpius (Hew et al. 1985). Consta de 33 aminoácidos y pesa 2,9 kDa. La AFP de tipo I de hélice única más grande se encuentra en la platija de cola amarilla, Limanda ferruginea, (Scott et al. 1987), que consta de 48 aminoácidos y pesa 4,5 kDa. Los tamaños intermedios se encuentran en la platija de invierno, Pseudopleuronectes americanus, con un peso en torno a los 3,3 kDa, denominados HPLC6 y HPLC8, siendo el primero una de las AFP más estudiadas. Recientemente, también se ha encontrado una nueva AFP Tipo I que muestra la misma estructura helicoidal en P. americanus, pero consiste en un homodímero de dos subunidades largas de 196 aminoácidos cada una con un peso de 16,7 kDa dispuestas en cuatro hélices paralelas en su forma dimérica (PDB ID: 4KE2) (Sun et al. 2014). Esta AFP tipo I muestra una alta actividad anticongelante y se denomina hiperactiva (Marshall et al. 2004b), un término Machine Translated by Google 46 DS Friis y H. Ramløv A B 1 1 0.8 0.8 0.6 0.6 Histéresis (°C) Histéresis (°C) 0.4 0.4 0.2 0.2 0 0 5 10 15 20 Concentración de AFP (mg/ml) 0 02468 Concentración de AFP (mM) Fig. 3.2 Tamaño y actividad de la AFP tipo I. Histéresis evocada por AFP Tipo I de diferentes tamaños correlacionada con la concentración en mg/ml (a) o mM (b). Leyenda: triángulo abierto: Limanda ferruginea, 4,5 kDa (Scott et al. 1987), cuadrado relleno: Tautogolabrus adspersus, 4,1 kDa (Hobbs et al. 2011), círculo relleno: Pseudopleuronectes americanus, 3,3 kDa (Scott et al. 1987), triángulo lleno: Myoxocephalus scorpius, 2,9 kDa (Kao et al. 1986), cuadrado abierto: dímero de P. americanus, 33,4 kDa (Marshall et al. 2005) reservado recientemente a las proteínas anticongelantes de insectos. Las actividades de las AFP Tipo I correlacionadas con su peso y concentraciones molares se presentan en la Fig. 3.2. La AFP de tipo I, con mucho, la más grande (dímero de P. americanus 33,4 kDa) también es la más activa. Esta AFP muestra una histéresis de más de 2 C a solo 0,4 mg/ml (Marshall et al. 2004b). Además, la AFP Tipo I más pequeña (M. scorpius, 2,9 kDa) muestra la actividad más baja, lo que indica cierta correlación entre sus tamaños y su actividad. Sin embargo, la AFP de L. ferruginea (4,5 kDa), que tiene un giro helicoidal extra en comparación con la AFP de P. americanus (3,3 kDa), no es más activa que esta última. La razón de esto podría muy bien estar relacionada con la secuencia de las proteínas, ya que L. ferruginea no tiene tantas de las treoninas que se cree que impulsan la unión al hielo, a pesar del aumento de tamaño (Scott et al. 1987) . ). Teniendo esto en cuenta, parece haber una buena correlación entre el tamaño de la AFP tipo I y la actividad que proporciona, suponiendo que los motivos de unión al hielo estén intactos. Las AFP de tipo II son proteínas anticongelantes globulares grandes, con tamaños conocidos que van desde 13,8 kDa en el cazador furtivo de hocico largo, Brachyopsis rostratus, (ID de PDB: 2ZIB) (Nishimiya et al. 2008) a 24,0 kDa en el Rainbow Smelt, Osmerus mordax (Ewart y Fletcher 1990). Los tamaños intermedios se encuentran en Sea Raven, Hemitripterus americanus, (14,0 kDa, PDB ID: 2AFP) (Gronwald et al. 1998), Atlantic Herring, Clupea harengus (14,6 kDa, PDB ID, 2PY2) (Liu et al. 2007), y el eperlano japonés, Hypomesus nipponensis (16,8 kDa) (Yamashita et al. 2003). Mientras que O. mordax y C. harengus dependen de los iones Ca2+ para estar activas, las otras tres AFP Tipo II funcionan independientemente de los iones Ca2+ (Liu et al. 2007; Venketesh y Dayananda 2008). A primera vista, la correlación entre el tamaño y la actividad de las AFP de tipo II parece ser negativa (fig. 3.3). Mientras que la AFP Tipo II más grande (C. harengus, 24 kDa) parece ser una de las menos activas, especialmente cuando se compara la actividad con el total Machine Translated by Google 47 3 Propiedades fisicoquímicas de las proteínas anticongelantes A B 0.75 0.75 0.5 0.5 Histéresis (°C) Histéresis (°C) 0.25 0.25 0 0 0 5 10 15 Concentración de AFP (mg/ml) 20 0 0.5 1 1.5 Concentración de AFP (mM) Fig. 3.3 Tamaño y actividad de la AFP tipo II. Histéresis evocada por AFP Tipo II de diferentes tamaños correlacionada con la concentración en mg/ml (a) o mM (b). Leyenda: cuadrado abierto: Clupea harengus, 24 kDa (Ca2+) (Ewart y Fletcher 1990), triángulo abierto: Hypomesus nipponensis, 16,8 kDa (Yamashita et al. 2003), cuadrado relleno: Osmerus mordax, 14,6 kDa (Ca2+) (Ewart y Fletcher 1990), círculo relleno: Hemitripterus americanus, 14 kDa (Slaughter et al. 1981), triángulo relleno: Brachyopsis rostratus, 13,8 kDa (Nishimiya et al. 2008) concentración de proteína (Fig. 3.3a), la AFP Tipo II más pequeña (B. rostratus, 13.9 kDa) es la más activa. Sin embargo, la actividad de las AFP Tipo II parece más agrupada por su dependencia de los iones Ca2+ . La actividad de las AFP de C. harengus y O. mordax (cuadrados en la figura 3.3) es mucho menor que la de las AFP de tipo II independientes del calcio. El mecanismo de esta correlación no está claro. Al observar únicamente las AFP de tipo II independientes del calcio, la correlación entre la actividad y el tamaño todavía parece ser negativa, ya que la AFP más grande evoca el grado más bajo de histéresis, contrariamente a la tendencia observada para las otras AFP presentadas en las otras curvas de actividad. en este capítulo; sin embargo, el tamaño de estas AFP es aproximadamente el mismo. Las AFP de tipo III son proteínas globulares pequeñas con aproximadamente el mismo tamaño, alrededor de 6,9 kDa. Se dividen en dos grupos, QAE y SP, según a cuál de estas resinas cromatográficas (Aminas cuaternarias o Sulfopropilo, respectivamente) se unan (Desjardins et al. 2012; Wilkens et al. 2014). Las AFP de tipo III se encuentran en el pez lobo del Atlántico, Anarhichas lupus, (64 aminoácidos, 6,9 kDa) (Scott et al. 1988), faneca oceánica, Macrozoarces americanus, (66 aminoácidos, 7,0 kDa, (Hew et al. 1988), PDB ID: 1KDF (Sönnichsen et al. 1996)), anguila europea, Zoarces viviparus (66 aminoácidos, 6,9 kDa (Sørensen et al. 2006), PDB ID: 4UR4 (Wilkens et al. 2014)), y La faneca antártica, Lycodichthys dearborni, (64 aminoácidos, 6,9 kDa, PDB ID: 1UCS (Ko et al. 2003)). También se ha encontrado en L. dearborni una AFP que consta de prácticamente dos subunidades de AFP tipo III unidas con un enlazador. Esta proteína consta de 134 aminoácidos y pesa 14,5 kDa (PDB ID: 1C8A) (Miura et al. 2001). No se publica mucho sobre la actividad de las AFP Tipo III nativas. En la Fig. 3.4 se presentan las curvas de actividad de las AFP de 7,0 kDa de M. americanus y de 14,5 kDa de L. dearborni, junto con un “monómero” recombinante de esta última (74 aminoácidos, 7,4 kDa). Machine Translated by Google 48 DS Friis y H. Ramløv A B 0.8 0.8 0.6 0.6 0.4 0.4 Histéresis (°C) Histéresis (°C) 0.2 0.2 0 0 0 10 20 30 0 Concentración de AFP (mg/ml) 0.5 1 1.5 2 Concentración de AFP (mM) Fig. 3.4 Tamaño y actividad de la AFP tipo III. Histéresis evocada por AFP Tipo III de diferentes tamaños correlacionada con la concentración en mg/ml (a) o mM (b). Leyenda: círculo relleno: Macrozoarces americanus, 7 kDa (Sönnichsen et al. 1993), cuadrado relleno: Lycodichthys dearborni 7,4 kDa (Miura et al. 2001), triángulo vacío: Lycodichthys dearborni 'dímero', 14,5 kDa (Miura et al. 2001 ) Para estas AFP Tipo III, el tamaño de las proteínas también parece tener un impacto en la histéresis cuando se compara la AFP de L. dearborni (14,5 kDa) con la versión monomérica recombinante de la proteína (7,4 kDa), especialmente cuando se comparan las actividades. frente a las concentraciones molares Fig. 3.4b). Aquí, la AFP grande de L. dearborni es mucho más eficiente para provocar actividad anticongelante que su contraparte monomérica. Sin embargo, aunque se observa una gran diferencia en la actividad entre estas proteínas, en comparación con la pequeña AFP de M. americanus de 7,0 kDa, la AFP de 14,5 kDa provoca una histéresis casi idéntica, según la concentración molar (Fig. 3.4b) . La AFP de M. americanus de 7,0 kDa es ca. 82% idéntica a la mitad Nterminal de la AFP de L. dearborni de 14,5 kDa, pero a pesar de la gran similitud, la AFP de M. americanus parece más activa que las otras AFP de tipo III. En un estudio mutacional en L. dearborni, centrado tanto en el tamaño de la proteína como en el área del sitio de unión al hielo, se investigó el tándem, el monómero y el tándem con un sitio de unión al hielo anulado (Bar Dolev et al. 2016 ) . Sobre una base molar, el tándem mostró el doble de actividad que el monómero, mientras que el tándem con un sitio de unión al hielo eliminado fue solo un poco más activo que el monómero. Estos resultados muestran que aunque el tamaño en sí mismo puede aumentar la actividad de las proteínas, el tamaño del área de unión al hielo es probablemente un factor más importante. Las AFP de tipo IV son un tipo de AFP recientemente descrito (Deng et al. 1997) y se describen como haces helicoidales (Deng y Laursen 1998). Como se indicó anteriormente, no se cree que las AFP de tipo IV sirvan como agente anticongelante en su pez huésped y, por lo tanto, se puede discutir su relevancia. Sin embargo, aquí se presentan las observaciones anticongelantes realizadas en aislamientos de estas proteínas. No se han descrito muchas AFP Tipo IV; sin embargo, muchas especies de peces tienen secuencias de genes que se asemejan a las secuencias de genes de las AFP de tipo IV conocidas (Lee et al. 2011). Se han descrito cuatro AFP tipo IV, con origen en M. scorpius (Gauthier et al. 2008), longhorn sculpin, Myoxocephalus octodecimspinosis, (Deng et al. 1997), lepisma antártica, Pleuragramma antarcticum y pez negro antártico. Machine Translated by Google 49 3 Propiedades fisicoquímicas de las proteínas anticongelantes A B 0.6 0.6 0.4 0.4 Histéresis (°C) Histéresis (°C) 0.2 0.2 0 0 0 5 10 15 20 25 Concentración de AFP (mg/ml) 0 0.5 1 1.5 2 Concentración de AFP (mM) Fig. 3.5 Tamaño y actividad de la AFP tipo IV. Histéresis evocada por AFP Tipo IV de diferentes tamaños correlacionada con la concentración en mg/ml (a) o mM (b). Leyenda: triángulo vacío: Myoxocephalus octodecimspinosis, 12,3 kDa (Deng et al. 1997), cuadrado relleno: Myoxocephalus scorpius, 12,2 kDa (Gauthier et al. 2008), círculo relleno: Pleuragramma antarcticum, 12,1 kDa (Lee et al. 2011), triángulo relleno: Notothenia coriiceps, 12,2 kDa (Lee et al. 2011) bacalao de roca, Notothenia coriiceps (Lee et al. 2011). Todos estos consisten en 108 aminoácidos en su forma madura y pesan entre 12,1 y 12,3 kDa y, por lo tanto, son un grupo muy homogéneo de proteínas. Las actividades obtenidas se presentan en la Fig. 3.5. Sin embargo, es difícil concluir sobre la actividad versus el peso de las AFP Tipo IV, tanto por la falta de curvas de actividad reales, como porque las AFP tienen pesos casi idénticos. Kao et al. han realizado estudios adicionales que comparan los diferentes tipos de AFP de los peces en relación con sus pesos. 1986. Concluyen una correlación positiva general entre la actividad anticongelante y la concentración molar de proteína. Sin embargo, los aumentos en el peso molecular por encima de 4 kDa resultaron en una disminución de la actividad anticongelante por mg de proteína (Kao et al. 1986). 3.2.2 AFP de artrópodos Las proteínas anticongelantes se encuentran en los fluidos corporales de varios grupos de artrópodos, incluidos colémbolos, arañas, ciempiés, mosquitos, ácaros, polillas y escarabajos. Sin embargo, la mayor parte de la investigación se ha realizado dentro de este último. Las AFP probablemente sean muy abundantes en los artrópodos que viven en regiones frías. Un estudio sobre 75 especies recolectadas en Alaska encontró que los fluidos corporales del 26% de estas podrían provocar histéresis térmica (Duman et al. 2004). Los tamaños de las AFP de artrópodos nativos conocidos oscilan entre 8 y 16 kDa. Con unas pocas excepciones, las AFP de los artrópodos son muy parecidas en su estructura general: una forma de hélice β o solenoide β. Las hélices pueden ser tanto para diestros como para zurdos y varían en la longitud de la espiral y el número de espirales que componen la proteína. En los insectos, que son el grupo de artrópodos más investigado, las AFP generalmente consisten en un lado plano que consta de motivos TxT repetitivos (la unión Machine Translated by Google 50 DS Friis y H. Ramløv A B 7 7 6 6 5 5 4 4 Histéresis (°C) Histéresis (°C) 3 3 2 2 1 1 0 0 0123 0 Concentración de AFP (mg/ml) 0.1 0.2 0.3 0.4 Concentración de AFP (mM) Fig. 3.6 Tamaño y actividad de AFP en artrópodos. La histéresis evocada por AFP de artrópodos de diferentes tamaños se correlacionó con la concentración en mg/ml (a) o mM (b). Leyenda: triángulo abierto: Choristoneura fumiferana (Leinala et al. 2002), 12,5 kDa, cuadrado relleno: Rhagium mordax, 12,4 kDa (Kristiansen et al. 2012), círculo abierto: Hypogastrura harveyi, 15,7 kDa (Mok et al. 2010), círculo relleno: Dendroides canadensis, 8,7 kDa (Wang y Duman 2005), triángulo relleno: Tenebrio molitor, 8,5 kDa (Liou et al. 2000), cuadrado abierto: Lake Ontario Midge, 8,2 kDa (Basu et al. 2016) sitio). Las variaciones entre las AFP se encuentran principalmente entre los aminoácidos que no forman parte de los motivos TxT, el número de espirales en la hélice β, la extensión de los puentes de sulfuro y el ancho del motivo TxT. Varias especies tienen diferentes isoformas de AFP y, en algunos casos, las isoformas de una especie difieren en el número de espirales en la hélice β que componen la proteína. Aunque se han detectado AFP, o al menos histéresis térmica, en una amplia gama de especies, en muchos casos aún no se han producido mediciones de la actividad de las proteínas purificadas. Así, no es posible discutir la actividad anticongelante de la garrapata (Ixodes scapularis, 23,2 kDa AFGP) (Neelakanta et al. 2010), el ciempiés (Lithobius forficatus) (Tursman y Duman 1995), la araña (índice de Bolyphantes ) (Husby y Zachariassen 1980), y el ácaro (Alaskozetes antarcticus) (Block y Duman 1989) en relación a sus tamaños. Sin embargo, las actividades de varias AFP de escarabajo están bien investigadas, y las curvas de actividad de una isoforma de cada especie investigada se presentan en la Fig. 3.6, donde también se representan las actividades de una AFP de polilla, una AFP de mosquito y una AFP colémbolo. La diferencia entre las actividades evocadas por las AFP de artrópodos es grande, con la AFP del gusano cogollero del abeto, Choristoneura fumiferana, que muestra una actividad cinco veces mayor que la AFP de un mosquito del lago Ontario (familia Chironomidae). Al observar los tamaños de las AFP, parece existir una correlación positiva con la actividad. Las AFP más grandes (12,5 a 15,7 kDa) provocan actividades más altas que las AFP más pequeñas (8,2 a 8,7 kDa). Sin embargo, la menor actividad de la AFP del mosquito se debe a la diferencia en la naturaleza del sitio de unión al hielo, ya que esta proteína no tiene motivos TxT, y el patrón de unión al hielo, es decir, los planos de cristal de hielo a los que se une. , por lo que su actividad no es comparable (Basu et al. 2016). La pulga de las nieves, Hypogastrura harveyi, AFP se diferencia del resto en que no es un betasolenoide (PDB ID: 2PNE), pero la actividad parece comparable a las AFP de insectos (Mok et al. 2010) . el pirocroide Machine Translated by Google 51 3 Propiedades fisicoquímicas de las proteínas anticongelantes A B 7 7 6 6 5 5 4 4 Histéresis (°C) Histéresis (°C) 3 3 2 2 1 1 0 0 0 0.5 1 1.5 Concentración de AFP (mg/ml) 0 0.05 0.1 0.15 Concentración de AFP (mM) Fig. 3.7 Actividad de C. fumiferana. La actividad de una isoforma de AFP natural grande (Cf501), una isoforma de AFP natural pequeña (Cf339) y una AFP mutante en la que se han ejercido dos bobinas desde la isoforma grande, para hacerla del tamaño de la isoforma natural pequeña. Las actividades están correlacionadas con la concentración de AFP en mg/ml (a) o mM (b). Leyenda: cuadrado relleno: isoforma Cf501, 12,5 kDa, triángulo relleno: isoforma Cf339, 9,0 kDa, círculo abierto: mutante Cf501, 9,2 kDa (Leinala et al. 2002) . Todas las mediciones se realizan mediante la técnica capilar. escarabajo, Dendroides canadensis, la actividad de AFP se mide utilizando una técnica capilar y no un osmómetro de nanolitros (Wang y Duman 2005), lo que podría sesgar la comparación. La estructura repetitiva (cada espiral) ha dado lugar a isoformas con diferente número de espirales en muchas de las AFP de artrópodos (Liou et al. 1999; Nickell et al. 2013; Lin et al. 2011; Ma et al. 2012; Qiu et al. 2010b; Doucet et al. 2002). Sin embargo, sólo en unos pocos casos se ha comparado la actividad de las isoformas. La estructura repetitiva también facilita los estudios mutacionales, ya que se pueden construir mutantes de AFP de diferentes tamaños. Una ventaja de estos estudios es que los realizan los mismos investigadores, utilizando el mismo método, equipo y tampones para medir la actividad, lo que hace que las observaciones estén menos sesgadas y sean más adecuadas para las comparaciones. Leinala et al. han estudiado dos isoformas de AFP de C. fumiferana: la CfAFP501 (121 aminoácidos, 12,5 kDa) y la CfAFP337 (89 aminoácidos, 9,0 kDa). La isoforma más grande consta de dos espirales más que la más pequeña (Leinala et al. 2002). La actividad, que se muestra en la Fig. 3.7, de la isoforma más grande es claramente mayor tanto a nivel molar como en cuanto a la cantidad de proteína total que la más pequeña. El estudio también incluyó una forma mutante de CfAFP501 en la que se eliminaron dos espirales, lo que la convierte en 90 aminoácidos y 9,2 kDa, para que sea comparable a la pequeña isoforma CfAFP337. La actividad del mutante es aproximadamente la misma que la de la isoforma pequeña CfAFP337, aunque la identidad de aminoácidos es solo del 72 %, lo que indica que la diferencia de actividad entre las dos formas nativas se debe principalmente a los diferentes tamaños y no a las diferentes secuencia (Leinala et al. 2002). La misma tendencia se observa en los peces tipo I AFP de P. americanus, donde la actividad de la isoforma de 4,3 kDa supera a la de la isoforma de 3,3 kDa y provoca una histéresis aproximadamente dos veces mayor con la misma cantidad de proteína (Chao et al. 1996) . ) (los datos no se muestran aquí). Machine Translated by Google 52 DS Friis y H. Ramløv A B 7 7 6 6 5 5 4 4 Histéresis (°C) Histéresis (°C) 3 3 2 2 1 1 0 0 0 0.5 1 1.5 2 2.5 3 0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 Concentración de AFP (mM) Concentración de AFP (mg/ml) Fig. 3.8 Actividad de las isoformas de D. canadensis. La actividad de una isoforma de AFP grande (DAFP1), una isoforma de AFP pequeña (DAFP4) se correlacionó con la concentración de AFP en mg/ml (a) o mM (b). Leyenda: círculo abierto: DAFP1, 8,7 kDa, cuadrado relleno: DAFP4, 7,4 kDa (Wang y Duman 2005) A B 7 7 6 6 5 5 4 4 Histéresis (°C) Histéresis (°C) 3 3 2 2 1 1 0 0 0123 0 Concentración de AFP (mg/ml) 0.1 0.2 0.3 Concentración de AFP (mM) Fig. 3.9 Actividad de mutantes de T. molitor. La actividad de la isoforma TmAFP49 de T. molitor y varios mutantes con eliminación o adición de espirales se correlacionó con la concentración en mg/ml (a) o mM (b). Leyenda: triángulo abierto: TmAFP49 de tipo salvaje, 8,5 kDa, círculo relleno: +1Coil mutante, 9,8 kDa, triángulo relleno: +2Coil mutante, 11,1 kDa, cuadrado abierto: +3Coil mutante, 12,4 kDa, círculo abierto: +4Coil mutante , 13,6 kDa, cuadrado relleno: mutante 1Coil, 7,3 kDa (Marshall et al. 2004a) Wang y Duman han estudiado las isoformas de las AFP de D. canadensis. Investigaron cuatro isoformas diferentes con seis (DAFP4, DAFP6) o siete (DAFP1, DAFP2) bobinas. Al comparar DAFP1 (83 AA, 8,7 kDa) y DAFP4 (71 AA, 7,4 kDa), como se ve en la Fig. 3.8, la diferencia en la actividad es pequeña; sin embargo, la isoforma DAFP1 más grande tuvo una actividad ligeramente mayor. Aparte de las espirales adicionales, las dos isoformas solo difieren en tres aminoácidos (Wang y Duman 2005). marshall et al. han realizado un estudio mutacional completo en el gusano de la harina, Tenebrio molitor, AFP “49” (7 espirales, 85 AA, 8,5 kDa), donde investigaron el efecto de eliminar una espiral de la proteína o agregar de 1 a 6 espirales adicionales bobinas Las actividades de TmAFP49 y sus mutantes se muestran en la Fig. 3.9. Aquí observaron que Machine Translated by Google 53 3 Propiedades fisicoquímicas de las proteínas anticongelantes A B 7 7 6 6 5 5 4 4 Histéresis (°C) Histéresis (°C) 3 3 2 2 1 1 0 0 0 0.25 0.5 0.75 1 0 Concentración de AFP (mg/ml) 0.025 0.05 0.075 0.1 Concentración de AFP (mM) Fig. 3.10 Actividad de RiAFP. La actividad de la AFP nativa de R. inquisitor y una proteína de fusión AFPGFP se correlacionó con la concentración en mg/ml (a) o mM (b). Leyenda: triángulo relleno: tipo salvaje RiAFP, 13,4 kDa, triángulo abierto: fusión RiAFPGFP, 41,4 kDa (Hakim et al. 2013) quitando una bobina disminuyó la actividad, mientras que agregando una y especialmente dos bobinas, la actividad aumentó. La adición de tres y cuatro espirales provocó una disminución de la actividad (en comparación con el mutante +2 espirales). La adición de seis espirales dio como resultado un bajo rendimiento de proteína y no se investigó más. No se hizo ningún mutante con cinco espirales adicionales. Este estudio muestra una clara correlación entre el tamaño y la actividad de TmAFP, aunque solo en el rango de tamaño bajo. Esto podría indicar que las posibilidades de unión al hielo no aumentan más, lo que se especula que se debe a la acumulación de un pequeño desajuste entre las ubicaciones de unión del hielo/proteína y/o una mayor flexibilidad de la AFP larga (Marshall et al. 2004a) . Se realiza un estudio similar en el escarabajo de apoyo de las pinzas de manchas negras, Rhagium mordax, AFP1, que tiene un motivo de unión al hielo TxTxTxT más amplio (Friis et al. 2014b). Aquí se construyó un mutante con una bobina adicional, que mostró una mayor actividad en comparación con el tipo salvaje. Curiosamente, el aumento de la actividad anticongelante no parece depender solo de una superficie de unión de hielo más grande. Hakim et al. observó que el barrenador del pino, Rhagium inquisitor, AFP fusionado con una proteína fluorescente verde (RiAFPGFP, 41,4 kDa) tenía una actividad significativamente mayor que la proteína nativa (13,4 kDa), como se ve en la Fig. 3.10 (Hakim et al . 2013 ) . El mismo patrón es observado por DeLuca et al., al estudiar una AFP de pescado Tipo III fusionada con tiorredoxina (12 kDa) o proteína de unión a maltosa (42 kDa). Los mecanismos que causan la actividad mejorada de una proteína de fusión podrían ser que cada proteína de fusión AFP unida ocupa un área más grande en la superficie del hielo que la proteína nativa, aumentando así la curvatura de la superficie del hielo entre las proteínas (DeLuca et al. 1998) . Otra teoría implica que la solubilidad de la proteína de fusión es más baja que la nativa, impulsando más proteínas a la interfaz hielo/agua y, por lo tanto, uniendo más proteínas al hielo, lo que produce una mayor actividad anticongelante. Este mecanismo se describe en profundidad en el Cap. 6 de este volumen. Machine Translated by Google 54 DS Friis y H. Ramløv 3.2.3 Conclusión de la relación entre peso y actividad Las AFP difieren en estructura y se unen a diferentes planos de la superficie del hielo, lo que en sí mismo provoca diferentes grados de histéresis y hace que las comparaciones de actividad anticongelante estén sesgadas. Aquí pueden variar los tiempos de recocido, las velocidades de calentamiento o las diferencias en el tamaño inicial del cristal, que tienen un gran impacto en las medidas de histéresis térmica. Por lo tanto, los mejores resultados se obtienen cuando se comparan las mediciones de una isoforma de AFP realizadas en un laboratorio (preferiblemente medido por la misma persona) y se cambia el tamaño mediante estudios mutacionales, o al comparar isoformas de AFP con alta identidad pero de diferentes tamaños. Haciendo esto, se evidencia que el tamaño de las AFP juega un pap Cuanto más grande es la proteína, mayor es la histéresis térmica. El efecto parece estabilizarse cuando la proteína alcanza cierto tamaño, e incluso puede disminuir nuevamente. Curiosamente, el aumento de tamaño en sí mismo tiene un efecto, ya que las fusiones con empresas que no son AFP han proporcionado actividades mejoradas; sin embargo, la fusión con otras AFP, lo que también aumenta el área de unión del hielo, contribuye aún más al efecto. Puede parecer redundante que un organismo tenga otras AFP además de la isoforma más efectiva, pero una explicación podría ser que las interacciones de las diferentes isoformas conducen a un efecto sinérgico (Lin et al. 2010; Wang y Duman 2005). Esta mejora podría ser una interacción directa entre las proteínas, lo que conduce a una unión más eficiente al hielo, o tal vez que las diferentes isoformas se unen a diferentes planos en el cristal de hielo, logrando así una mejor cobertura general. Las AFP pequeñas y menos activas parecen tener un papel importante, ya que a menudo son las isoformas pequeñas las que se encuentran en mayor cantidad y son las AFP dominantes (Marshall et al. 2004b; Graham y Davies 2005). Es posible que esto esté relacionado con la mayor solubilidad o una difusión más rápida de las AFP más pequeñas. 3.3 Solubilidad e hidrofobicidad Aunque es una característica clave de las proteínas, no se ha investigado mucho sobre la solubilidad de las AFP. Generalmente, las AFP son bastante solubles debido a su tamaño relativamente pequeño y bajo contenido de aminoácidos muy hidrofóbicos. Solo en unos pocos casos se ha informado la concentración de AFP en los diferentes organismos. Por ejemplo, se estima que la concentración de AFP tipo III en M. americanus es de hasta 25 mg/ml en la sangre (Fletcher et al. 1985 ), mientras que para la AFP tipo IV en M. octodecimspinosis se estima que es de hasta 25 mg/ml. ser inferior a 0,1 mg/ ml (Gauthier et al. 2008). Para la AFP tipo III, se estima que tres isoformas están presentes en la sangre a 20 mg/ml, aunque en este punto la isoforma grande comienza a precipitar (Wang et al. 1995). Se estima que los AFGP (de varios tamaños) componen aproximadamente 3,5 (P/V) de la sangre de los peces nototenioides de la Antártida (DeVries 1983). Muchos de los peces productores de AFP viven en agua de mar con temperaturas de hasta 1,9 C. Como el punto de congelación coligativo de la sangre es de alrededor de 0,9 C, las AFP tienen que provocar una histéresis de alrededor de 1 C para evitar el crecimiento de hielo letal. A Machine Translated by Google 3 Propiedades fisicoquímicas de las proteínas anticongelantes 55 acomodar esto, especialmente las AFP menos efectivas tienen que estar presentes en altas concentraciones en la sangre. Sin embargo, dado que muchas especies tienen varias isoformas de AFP, que también podrían tener un efecto sinérgico entre sí, la concentración de una sola isoforma de AFP podría reducirse. En cuanto a los insectos y otras especies terrestres productoras de AFP, estos organismos están sometidos a temperaturas mucho más bajas que los peces. Esto se acomoda por medio de AFP más eficientes (es decir, mayor actividad anticongelante por proteína), en lugar de concentraciones inmensas. Muchas AFP ahora se producen mediante la expresión de genes heterólogos, generalmente en levaduras o bacterias, en lugar de recuperar las proteínas directamente de la fuente original. Estos organismos de expresión están diseñados para producir proteínas individuales a una concentración muy alta. Hasta el momento, ningún experimento se ha centrado en los puntos de precipitación de las AFP, desafiando su solubilidad. Sin embargo, se ha demostrado que la adición de sales a las soluciones de AFP aumenta la actividad de las AFP (Kristiansen et al. 2008). Una teoría que explica esta observación es que las proteínas están siendo “saladas”, es decir, disminuyendo la solubilidad, conduciendo a las AFP a la interfaz hielo/agua. Esto se explica en profundidad en el Cap. 6 de este volumen. La hidrofobicidad de la superficie de una proteína también está relacionada con la solubilidad, y este tema ha tenido más atención, ya que ha sido un gran tema sobre el mecanismo de unión entre el hielo y la AFP. La teoría prevaleciente del mecanismo de unión del hielo se denomina mecanismo de clatrato anclado, que se describe en detalle en el Cap. 4 de este volumen. En resumen, establece que las moléculas de agua están dispuestas en una estructura similar al hielo alrededor del sitio hidrofóbico de unión al hielo de la AFP, que se congela en la superficie del hielo (Cheng y Merz 1997; Garnham et al. 2011 ) . Las AFP son generalmente anfifílicas, con una superficie relativamente hidrofóbica en la región plana de la proteína que se une al hielo, mientras que el resto de la superficie expuesta al solvente de las proteínas se considera relativamente hidrofílica (Davies et al. 2002) . Los aminoácidos que facilitan la unión del hielo son generalmente alanina (peces) o treonina (artrópodos, bacterias). Si bien estos aminoácidos no se consideran particularmente hidrofóbicos, en relación con el resto de la proteína lo son, y su estructura ordenada en una superficie, a menudo, plana, lleva a las moléculas de agua a una disposición ordenada similar al hielo. Aunque el sitio de unión al hielo se considera hidrofóbico, es probable que las AFP se consideren en general hidrofílicas (Davies et al. 2002). La hidrofobicidad es difícil de cuantificar y existen muchas escalas diferentes para esto (Cornette et al. 1987). Un método para comparar la hidrofobicidad de las proteínas es por gravedad térmica, donde el peso de una proteína se mide en un rango de temperatura grande. A medida que aumenta la temperatura, las moléculas de agua débilmente unidas se evaporan primero (unidas a las partes hidrofóbicas de la superficie de la proteína), mientras que las moléculas de agua estrechamente unidas se evaporan a temperaturas más altas (unidas a las partes hidrofílicas). Así, durante el calentamiento (p. ej., de 20 a 150 °C), la tasa de pérdida de peso da una medida relativa de la hidrofobicidad de la proteína. Aunque este método no ha sido ampliamente utilizado en AFP, un estudio en Anatolica polita AFP mostró que las proteínas tenían una mayor hidrofilicidad que la proteína de control, y generalmente la proteína hidrofílica, la albúmina de suero bovino (Mao et al. 2011) . Sin embargo, la alta hidrofilia podría estar limitada a las AFP de insectos (Graham et al. 1997), ya que las AFP de peces, especialmente el tipo II, tienen superficies hidrofóbicas (Sönnichsen et al. 1995). como el Machine Translated by Google 56 DS Friis y H. Ramløv Las AFP son un grupo muy diverso de proteínas y evocan diferentes niveles de histéresis térmica, sus características hidrofílicas y cómo afectan la unión del hielo, pueden no ser lo mismo. Los diferentes aminoácidos que se encuentran en los sitios activos también lo indican. La treonina, un aminoácido importante en muchos sitios de unión al hielo, tiene una parte hidrófoba, un grupo metilo, y una parte hidrófila, un grupo hidroxilo, y se cree que ambos juegan un papel en una interacción exitosa con el hielo (Bar Dolev et al. otros 2016). Una descripción detallada de la interacción entre la proteína anticongelante y el agua circundante y con el hielo se encuentra en los siguientes capítulos. 4 y 5 de este volumen. 3.4 Estabilidad Las investigaciones sobre la estabilidad de las proteínas anticongelantes se han centrado principalmente en su estabilidad térmica y, en cierta medida, en su estabilidad del pH. Esto a menudo ha sido relevante para investigar con respecto a la elección de métodos de purificación óptimos al aislar la proteína o al discutir su relevancia en aplicaciones industriales. Además, cuando se estudia la estructura secundaria de las proteínas usando espectroscopia de dicroísmo circular (CD), el experimento puede expandirse fácilmente para incluir una determinación del punto de fusión de la proteína, lo que también podría ser el caso para algunos de los estudios de AFP. El método se describe con más detalle más adelante en este capítulo. La estabilidad de las proteínas puede entenderse como estabilidad termodinámica o estabilidad cinética (SanchezRuiz 2010). La estabilidad termodinámica se define con respecto al equilibrio entre la forma nativa activa de la proteína (normalmente denominada N) y varias conformaciones no nativas en una forma a menudo desplegada (denominada U). Las transiciones entre las dos formas se describen mediante constantes de velocidad de primer orden, k+ para la transición de N a U, yk de U a N. La estabilidad termodinámica se define como la constante de equilibrio K dada como k+/k. El curso de la reacción se puede describir mediante la fórmula: kþ N!tu k ð3:1Þ Con respecto a la estabilidad cinética, también se tiene en cuenta una forma inactivada irreversible (denominada I). Por lo general, esto implica que la forma nativa debe pasar por el estado desplegado antes de que sea propensa a la inactivación. La transición a la forma inactiva, de U a I, se describe mediante otra constante de primer orden, kag, pero como la reacción es irreversible, no hay transiciones en la otra dirección, de I a U. En su forma más simple, el curso de la reacción puede describirse como (Lumry y Eyring 1954): kþ N! k U! kag yo ð3:2Þ Machine Translated by Google 3 Propiedades fisicoquímicas de las proteínas anticongelantes 57 Es común para las proteínas que la ruta hacia la forma inactiva sea la agregación. Sin embargo, algunas proteínas pueden evitar esto y, por lo tanto, volver a la forma nativa. Esta capacidad se denomina frecuentemente estabilidad coloidal (Chi et al. 2003). Por lo tanto, la estabilidad de las proteínas es algo más que la transición a un estado desplegado (estabilidad termodinámica), sino que también implica la capacidad de volver a plegarse en una proteína nativa (estabilidad cinética o coloidal). 3.4.1 Termoestabilidad Aunque solo unos pocos estudios se han centrado en la estabilidad de las proteínas AFP (Friis et al. 2014a; GarcíaArribas et al. 2007; Chi et al. 2003), varios estudios han incluido investigaciones sobre el punto de fusión de la proteína o han observado observaciones relacionadas con la estabilidad, en relación con su estudio. Muchos estudios de AFP han incluido investigaciones de la estructura proteica secundaria utilizando espectroscopía de CD. Esta técnica puede proporcionar mucha información sobre una proteína, por ejemplo, la entalpía de van't Hoff, la entropía de despliegue o la energía libre de plegamiento (Greenfield 2006). Sin embargo, por lo general solo se ha utilizado para determinar el punto medio de la transición del desdoblamiento, correspondiente al “punto de fusión” de la proteína. En este capítulo, el punto medio de transición, Tm acortado (que no debe confundirse con el punto de fusión de la solución, que es un término que se usa a menudo cuando se estudian las AFP), se refiere a la temperatura a la que la mitad de las proteínas estarán en el estado nativo (N). y la otra mitad en el desplegado (U) estado. En resumen, la espectroscopia de CD analiza la diferencia entre la absorción de la luz polarizada circularmente hacia la izquierda y hacia la derecha y, a menudo, se mide en elipticidad molar [θ] (grados cm2 dmol1 ). Las proteínas plegadas a menudo tienen elementos estructurales que son muy asimétricos, como hélices α o hélices β. Por lo tanto, estas estructuras tendrán espectros de CD característicos (Greenfield 2006), que generalmente abarcan desde 190 a 250 nm. Las proteínas se componen de varios elementos estructurales secundarios, dando a cada proteína un espectro de CD distinto. Los espectros de CD de una amplia variedad de AFP se muestran en la figura 3.11. A partir de los espectros de CD, se pueden estimar los elementos estructurales que constituyen la proteína (Greenfield 2006) y, por ejemplo, los espectros para peces AFP tipo I y tipo IV están en gran concordancia con los espectros esperados para proteínas con estructura αhelicoidal predominante. (Figura 3.11a). Del mismo modo, las AFP de insectos generalmente tienen un alto contenido de hojas β que muestran una caída de alrededor de 218 nm, que también es la imagen general en la Fig. 3.11b. Cuando las proteínas se despliegan, por ejemplo, por calentamiento, pierden su estructura ordenada y, por lo tanto, cambia su espectro de CD. Supervisando el cambio de estado mediante la copia de espectros de CD durante el calentamiento, se puede determinar la termodinámica del proceso, en lo sucesivo la transición del punto medio. Esto se ilustra en la Fig. 3.12 para R. mordax AFP1 (Friis et al. 2014a). Los espectros de CD se obtienen a varias temperaturas (aquí de 1 a 49 C), que abarcan un intervalo en el que todas las proteínas se encuentran en estado plegado (N, 1 C, línea azul oscuro) hasta el lugar en el que la población total de proteínas se encuentra en estado desplegado (U, 49 C, línea azul claro). Una sola longitud de onda adecuada que contiene un buzamiento o una colina, que cambia durante Machine Translated by Google 58 DS Friis y H. Ramløv A B 30 35 20 25 10 15 0 5 [θ]∙103 (Grado∙cm2∙dmol) 10 5 20 15 30 190 200 210 220 230 240 250 25 190 200 210 220 230 240 250 [θ]∙103 (Grado∙cm2∙dmol) Longitud de onda (nm) Longitud de onda (nm) Fig. 3.11 Espectros de CD de AFP. Elipticidad molar en el espectro de CD de rango ultravioleta lejano de varias AFP. (a) espectros de CD de AFP de peces; Azul: Tipo I (Fairley et al. 2002), Verde: Tipo II (Slaughter et al. 1981), Negro: Tipo III (Li et al. 1991), Naranja: Tipo IV (Deng y Laursen 1998), y Rojo: AFGP (DeVries et al. 1970). ( b ) espectros de CD de AFP de insectos; Azul: R. mordax (Friis et al. 2014a), Verde: C. perlata (Lin et al. 2011), Negro: D. canadensis (Li et al. 1998b), Naranja: C. fumiferana (Gauthier et al. 1998 ), Rojo: A. polita (Mao et al. 2011) y Púrpura: T. molitor (Liou et al. 2000) 30 20 10 [θ]∙103 (Grado∙cm2∙dmol) 0 10 20 200 210 220 230 240 250 Longitud de onda (nm) Fig. 3.12 Espectros de CD y temperatura. La figura muestra un ejemplo de espectros de CD obtenidos de la misma muestra de proteína (R. mordax) a diferentes temperaturas. A medida que la temperatura aumenta de 1 C (azul oscuro) a 25 C, 30 C, 33 C y 49 C, habrá más proteínas en estado desplegado. Esta transición se puede cuantificar monitoreando el [θ] en un punto caliente específico de la proteína, aquí 218 nm, marcado con una línea discontinua. Estos valores se transforman y representan en la figura 3.13 aumento de temperatura, se elige para los cálculos de las estimaciones de los estados N y U. En el caso de la figura 3.12, se elige 218 nm. La fracción de proteína plegada nativa (FN) se puede calcular como: FN θt θU ¼ θN θU ð3:3Þ donde θt, θU y θN son la elipticidad a la temperatura medida, la temperatura a la que todas las proteínas están completamente desplegadas y la temperatura a la que todas las proteínas están completamente plegadas, respectivamente. Una ilustración gráfica de esto (usando el estudio Machine Translated by Google 3 Propiedades fisicoquímicas de las proteínas anticongelantes 59 1 0.75 0.5 1PFA mR dedl de noitcarF 0.25 0 0 10 20 30 40 50 60 Temperatura (°C) Fig. 3.13 Determinación de la temperatura del punto medio de transición. Los valores extremos de [θ], a una longitud de onda específica, obtenidos a temperaturas en las que todas las proteínas están plegadas o desplegadas, se establecen en 1 y 0, respectivamente. Los valores intermedios obtenidos a temperaturas intermedias se normalizan según los valores extremos (0 < x < 1). La figura muestra datos del ejemplo de la Fig. 3.12 (218 nm). Entonces, la Tm se puede leer como la temperatura donde N ¼ U, correspondiente a 0,5. En este caso Tm ¼ 28,5 C (Friis et al. 2014a) de la figura 3.12), con θN igual a 0 y θU igual a 1, se ilustra en la figura 3.13. A partir de esto, la Tm se puede derivar como la temperatura donde FN ¼ FU ¼ ½ (la cantidad de N es igual a la cantidad de proteínas U indicadas), que en el ejemplo de las figuras corresponde a 28,5 C. Este método, o sus derivados, tiene se ha utilizado para determinar la Tm de diversas AFP, que se recogen en la Tabla 3.1, junto con otras observaciones relacionadas con la Tm de AFP. Se ha observado que el escarabajo del desierto, Microdera punctipennis, MpAFP698, 18 cisteínas, mantuvo casi toda su actividad después de calentar a 100 C durante 5 min, lo que indica una Tm muy alta o un alto grado de replegamiento (Qiu et al. 2010a) . ). De manera similar, el R. inquisitor RiAFP, 2 cisteínas, mantiene la actividad después de calentar a 70 C durante 5 min (Kristiansen et al. 2005). Aunque los puentes de cisteína brindan estabilidad a las proteínas, no se observa una correlación clara entre el número de puentes de cisteína y la Tm de las AFP (ver Tabla 3.1). Sin embargo, en general, las AFP de peces no tienen cisteínas (excepto el tipo II) y tienen Tms intermedias alrededor de 4050 C. Las AFP de insectos con alto contenido de cisteína tienen Tms muy altas de >60 C y las AFP de insectos con bajo contenido de cisteína tienen Tms bajas. de <30 C. Con respecto a la estabilidad coloidal, la capacidad de replegarse en una proteína nativa, las investigaciones son bastante escasas. Si bien varios investigadores han informado de un alto grado de replegamiento después de la desnaturalización por calor (GarcíaArribas et al. 2007; Salvay et al. 2007; Basu et al. 2016; Bar et al. 2008; marshall et al. 2005), solo en unos pocos casos se ha confirmado el replegamiento en una forma activa nativa mediante la realización de mediciones de actividad de seguimiento; El DAFP4 recuperó toda la actividad después de calentar a 100 C durante 5 min (Li et al. 1998a) y el RmAFP1 recuperó casi toda la actividad después de varios ciclos de calor a 70 C (Friis et al. 2014a); sin embargo, después de los ciclos de calor a 80 C, la actividad recuperada disminuyó gradualmente. Machine Translated by Google 60 DS Friis y H. Ramløv Tabla 3.1 Tm de varias AFP Tm Especies ( C) cisteínas AFP9 (Tipo I) (Chao et al. 1996) Pseudopleuronectes americanus 55 0 17kDA (Tipo I) (Marshall et al. 2005) Pseudopleuronectes americanus 18 0 Proteína anticongelante Pez HPLC12 (Tipo III) (Salvay et al. 2007) Macrozoarces americanus HPLC6 (Tipo III) 50 0 Macrozoarces americanus AB1 40 0 43 0 45 0 14 (Li et al. 1991) (Tipo III) (Cheng y DeVries Austrolycicthys 1989) braquicéfalo LS12 (Tipo IV) (Deng y Laursen Myoxocephalus 1998) octodecimspinosis Insecto DAFP4 (Li et al. 1998a) Dendroides canadensis 84 YL1 (Bar et al. 2008) tenebrio molitor 66 dieciséis RmAFP1 (Friis et al. 2014a) Rhagium mordax 29 2 Mezcla (Lin et al. 2011) Campaea perlata <22 0–1 Otro 40a 16 Midge AFP (Basu et al. 2016) sfAFP quironómidos (pulga de nieve) (Graham y Davies 2005) Hipogastrura harveyi <22 4 Bacteria AFP (Wang et al. 2016) Flavobacteriaceae 53.5 2 a Estimado por fórmula (3) Aunque también hay ejemplos de AFP que no se repliegan y pierden actividad después de la exposición al calor (Deng y Laursen 1998; Lin et al. 2011; Graham y Davies 2005; Kawahara et al. 2007), por lo general parecen tener una Tm o alta estabilidad coloidal, especialmente cuando se considera que su función nativa está restringida a 0 C e inferior. No se sabe si esto es solo una reliquia de las proteínas de las que han evolucionado las AFP, el efecto secundario de la combinación con el hielo o porque algunas AFP tienen funciones diferentes. 3.4.2 Estabilidad del pH En cuanto a la termoestabilidad, no se ha investigado mucho sobre la estabilidad del pH de las AFP. Sin embargo, una serie de estudios ha incluido mediciones de actividad anticongelante o espectros de CD de las AFP a diferentes valores de pH. Estas observaciones se presentan en la Tabla 3.2. A partir de aquí se puede ver que las AFP son generalmente activas (o plegadas en su estado nativo para las observaciones de CD) en un amplio rango de pH. En algunas mediciones, la actividad no se vio afectada en todo el espectro de pH med Machine Translated by Google 61 3 Propiedades fisicoquímicas de las proteínas anticongelantes Tabla 3.2 Estabilidad del pH de varias AFP Proteína anticongelante Especies Rango de pH Método Pseudopleuronectes americanus 3–11 Actividad + CD 2–11 Actividad 6–10 Actividad + CD Pez HPLC6 (Tipo I) (Chakrabartty y Hew 1991) rQAE m1.1 (Tipo III) (Chao et al. 1994) Macrozoarces americanus LS12 (Tipo IV) (Deng y Laursen 1998) Myoxocephalus octodecimspinosis Insecto DAFPH1 + H2 (Wu et al. 1991) Dendroides canadensis 4–9.6 Actividad DAFP4 (Li et al. 1998a) Dendroides canadensis 2–11 Actividad YL1 (Bar et al. 2008) tenebrio molitor 6–12.5a CD 3– RiAFPH4 (Kristiansen et al. 2005) sbwTHP inquisidor de Rhagium 12a Actividad 6–12 (Gauthier et al. 1998) Choristoneura fumiferana Actividad a Activo/plegado en todo el rango de pH medido La alta estabilidad del pH de las AFP podría deberse a los relativamente pocos aminoácidos cargados que se observan generalmente en las proteínas. Además, no hay aminoácidos cargados involucrados en la interacción con el hielo y, por lo tanto, el mecanismo de unión no se ve afectado por los cambios de pH. Los cambios de pH pueden afectar la estabilidad estructural de las AFP que contienen puentes salinos, y las diferencias en la estabilidad de pH que después de todo se observan entre las AFP probablemente estén relacionadas con esto. La gran caída en la actividad observada para la mayoría de las AFP a pH alto probablemente se deba a una titulación del grupo hidroxilo (pKs alrededor de 13) de la treonina (a menudo asociada con la interacción con el hielo) (Wu et al. 1991), que obstruye la unión al hielo . y por lo tanto perjudicando la actividad. La razón biológica de por qué las AFP tienen una estabilidad de pH tan alta no está clara. Sin embargo, en el caso de D. canadensis, la AFP se encuentra tanto en la hemolinfa neutra como en el intestino medio ácido, por lo que podría haber habido una presión de selección para que esta AFP fuera funcional en un amplio rango de pH (Wu et al. 1991) . ). Esto también podría aplicar para otras AFP. 3.5 Conclusiones En general, las propiedades fisicoquímicas de las proteínas anticongelantes son todavía un campo con muchos caminos sin explorar. Las propiedades básicas como el tamaño, la actividad y la secuencia se exploran para la mayoría de las AFP conocidas. A partir de aquí, se puede ver una correlación positiva entre el tamaño y la actividad. Debido a las diferencias de las AFP, incluso dentro de cada especie, la correlación es más clara entre isoformas con alta identidad de secuencia (pero de diferentes tamaños). Los estudios mutacionales posteriores han confirmado la correlación, y aunque se muestra que un sitio de unión de hielo aumentado aumenta la actividad, la fusión de AFP con no AFP también aumenta la actividad. Machine Translated by Google 62 DS Friis y H. Ramløv También se ha investigado la estabilidad de la temperatura de varias AFP. Aquí, sin embargo, los resultados son notablemente divergentes, ya que algunas AFP son muy termolábiles y comienzan a perder actividad alrededor de la temperatura ambiente y algunas soportan períodos cortos a 100 C. La termoestabilidad se correlaciona hasta cierto punto con la cantidad de cisteínas en las AFP que varían mucho. Las AFP son generalmente estables y activas en un amplio rango de pH, probablemente porque no Los aminoácidos cargados están directamente involucrados en el mecanismo de unión del hielo. Los detalles sobre la energía de unión y la cinética de reacción de las AFP aún no se han descubierto por completo. Las proteínas anticongelantes son un grupo bastante diverso de proteínas, que difieren mucho en tamaño, actividad, formas y composición de aminoácidos. Por lo tanto, también es difícil generalizar los resultados y las observaciones. La única propiedad común de las AFP es su capacidad para unirse al hielo, lo que se puede correlacionar con el área del sitio de unión al hielo. Las teorías predominantes sobre el mecanismo de unión del hielo se abordan en el siguiente capítulo. Referencias Bar Dolev M, Braslavsky I, Davies PL (2016) Proteínas de unión al hielo y su función. Annu Rev Biochem 85:515–542. https://doi.org/10.1146/annurevbiochem060815014546 Bar M, Scherf T, Fass D (2008) Visualización de superficie bidimensional de grupos funcionales en un andamio de proteína beta helicoidal anticongelante. 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Comp Biochem Physiol B Biochem Mol Biol 128 (2):265–273 Yamashita Y, Miura R, Takemoto Y, Tsuda S, Kawahara H, Obata H (2003) Proteína anticongelante tipo II de un pez de agua dulce de latitud media, eperlano japonés (Hypomesus nipponensis). Biosci Biotechnol Biochem 67(3):461–466 Machine Translated by Google Capítulo 4 EstructuraFunción de los IBP y sus Interacciones con hielo Maya BarDolev, Koli Basu, Ido Braslavsky y Peter L. Davies 4.1 Introducción Uno de los factores clave para comprender cómo funciona una proteína es conocer su estructura tridimensional (3D) a resolución atómica. En muchos casos, la estructura de la proteína proporciona pistas suficientes para deducir su mecanismo de acción. Sin embargo, en el caso de las proteínas de unión al hielo (IBP), aunque las estructuras de alta resolución de algunas IBP se determinaron experimentalmente hace más de dos décadas, sus interacciones con el hielo, su ligando natural, siguen siendo un tema de debate y una extensa investigación. Después de que se publicara la estructura tridimensional de la AFP tipo I de la platija en 1988 (Yang et al. 1988), se realizaron muchos estudios experimentales y teóricos para dilucidar su sitio de unión al hielo (IBS) y descubrir cómo se adhiere al hielo en el nivel molecular. La publicación de otras estructuras de AFP y el descubrimiento de AFP en otros reinos biológicos han aumentado el interés por comprender la fuerza impulsora para el reconocimiento del hielo y los elementos cruciales involucrados en la depresión del punto de congelación. El misterio de las interacciones proteínahielo resulta de varias cuestiones. Uno es la ambigüedad de la interfaz entre el hielo y el agua, lo que dificulta la definición del ligando a nivel molecular (Guo et al. 2012; Vance et al. 2014). Otra es que la diferencia entre el agua a granel y el hielo, el ligando, está solo en la organización espacial de las moléculas de agua. Estos aspectos hacen que el reconocimiento del hielo sea un problema Otra complicación radica en la diversidad de estructuras y funciones de los IBP, lo que dificulta la formulación de conclusiones generalizadas. Este capítulo describe la diversidad estructural de las IBP con énfasis en las estructuras de las IBS y sus especificidades. M. BarDolev ∙ I. Braslavsky Universidad Hebrea de Jerusalén, Rehovot, Israel Correo electrónico: [email protected]; [email protected] K. Basu ∙ PL Davies (*) Queen's University, Kingston, ON, Canadá Correo electrónico: [email protected]; [email protected] © Springer Nature Suiza AG 2020 H. Ramløv, DS Friis (eds.), Proteínas anticongelantes Volumen 2, https://doi.org/ 10.1007/9783030419486_4 69 Machine Translated by Google 70 M. BarDolev et al. para diferentes planos de hielo. Se presentan los temas de formación de hielo bajo diferentes regímenes de temperatura, que es una consecuencia de las especificidades de IBP para diferentes planos de hielo, los efectos del tamaño de la proteína en la actividad y los estudios de ingeniería de proteínas en IBP. Discutimos las funciones opuestas de las proteínas de nucleación de hielo (INP) y las AFP en el contexto de las diferencias estructurales entre estas proteínas. Además, explicamos las interacciones de los IBP con el agua y el hielo a nivel molecular, con énfasis en las teorías recientes sobre la importancia de la capa de hidratación, el mecanismo de agua del clatrato anclado, el tema de la unión reversible/irreversible y los aspectos dinámicos de la unión del hielo por diferentes tipos de IBP. El término "proteínas que se unen al hielo" se usa en este capítulo para abarcar todas las proteínas que se unen al hielo. Estos incluyen aquellos que funcionan como depresores del punto de congelación (AFP) y otros como inhibidores de la recristalización del hielo, INP y adhesinas de hielo. 4.2 Diversidad estructural de los IBP Las estructuras de IBP son increíblemente diversas considerando que todas comparten la misma función de unión al hielo (Davies 2014). Que sus estructuras primarias y terciarias sean radicalmente diferentes atestigua el hecho de que han evolucionado en muchas ocasiones separadas a partir de diferentes progenitores en varias ramas del árbol de la vida (Bar Dolev et al. 2016b) (discutido en detalle en el Capítulo 9 del Vol . . 1). Las estructuras de las AFP de peces tipo I, II y III, así como algunas de las IBP de insectos y plantas, han sido descritas en detalle y revisadas extensamente (Bar Dolev et al. 2016b; Davies 2014; Duman 2001 ; Feeney et al . 1986 ; Venketesh y Dayananda 2008). Algunas ramas (como los artrópodos, las plantas y las bacterias) solo se han inspeccionado escasamente en busca de actividad de unión de hielo, y la probabilidad de que se encuentren nuevas estructuras IBP aquí es alta. Las IBP suelen ser proteínas pequeñas de un solo dominio, la mayoría de las cuales tienen una estructura repetitiva. Los detalles de las estructuras tridimensionales del IBP resueltas y modeladas de manera convincente se presentan en la Tabla 4.1. Estos incluyen los tres tipos de AFP que se encuentran en los peces: AFP de tipo I αhelicoidales cortas (3–4 kDa) que han surgido de forma independiente cuatro veces en los peces (Graham et al. 2013), así como un dímero de AFP de tipo I largo que se pliega en un haz de cuatro hélices (Maxi), y las AFP globulares tipo II y tipo III. Se encuentran varios tipos de IBP de solenoide β en insectos, plantas y microorganismos, y se ha descrito un haz de hélice de poliprolina tipo II en las pulgas de las nieves (Collembola), un artrópodo primitivo. El pliegue IBP DUF3494, que está ampliamente disperso en los microorganismos debido a la transferencia lateral de genes (Raymond y Kim 2012), tiene un solenoide β discontinuo con una hélice α de apoyo (ver Tabla 4.1). Se han modelado IBP adicionales con alta confianza (Basu et al. 2015; Lin et al. 2011). La regularidad de las estructuras repetitivas podría facilitar la interacción con una red cristalina y ayudar a explicar la evolución frecuente del pliegue betasolenoide en los IBP. Los IBP funcionan a 0 C o menos. Algunos de ellos dependen casi por completo de los enlaces de hidrógeno para la estabilidad de sus pliegues (ver pulga de nieve y AFP tipo I en la Tabla 4.1) y se desnaturalizan fácilmente al calentarlos a temperatura ambiente. Algunas IBP se estabilizan mediante puentes disulfuro, como la AFP tipo II y la AFP del insecto Tenebio molitor (TmAFP), y algunas mediante la coordinación de iones Ca2+ , como la tipo II. Machine Translated by Google 4 EstructuraFunción de los IBP y sus interacciones con el hielo 71 Tabla 4.1 Estructuras y principales propiedades de los IBP Nombre y estructura AFP tipo I Detalles Organismos: Varias ramas de peces: lenguados de ojo derecho (Duman y DeVries 1976; Knight et al. 1991), escorpiones (Hew et al. 1985; Low et al. 2001), pez caracol (Evans y Fletcher 2001), cunner (Hobbs et al. . 2011). Estructura: Hélice α anfipática con 50–65 % de Ala. A pesar de la aparente homología basada en la riqueza de Ala, las AFP de tipo I han evolucionado de manera independiente en al menos cuatro ocasiones (Graham et al. 2013) . La hélice tiene una periodicidad de 11 residuos, con 3,7 aa/vuelta. Tamaño: ~55 6 6 Å. Isoformas: muchas, incluidas las específicas de tejido. La mayoría son péptidos de 33 a 42 aa. SII: Involucra el indicado Thr y Ala en TxxxAxxxAxx repite ese proyecto en un lado de la hélice. Planos de hielo: Las AFP de platija y solla se unen al plano piramidal [2021]. Sculpin AFP se une al plano del prisma secundario [1120]. Actividad: Moderada actividad de TH. Producir formas de hielo bipiramidales con una relación de eje a:c constante de 3,3 (Wen y Laursen 1992b). AP: 1wfa AFP larga tipo I, Maxi Organismos: Platija de invierno (Sun et al. 2014). Estructura: un homodímero de haz de cuatro hélices. Cada monómero de hélice α tiene un pliegue en horquilla y las dos horquillas se alinean de manera antiparalela. Las dos hélices son homólogas a la AFP tipo I pero 5 veces más largas. Tamaño: ~145 20 20 Å. Isoformas: (Corta) tipo I AFP. IBS: Las aguas heladas organizadas por el núcleo acuoso se extienden a la superficie de la proteína entre las hélices. Planos de hielo: Múltiples incluyendo el plano basal. Actividad: Hiperactiva. PFA tipo II Organismos: Varias especies de peces; cuervo de mar (Patel y Graether 2010), eperlano arco iris y japonés (Yamashita et al. 2003), arenque (Ewart y Fletcher 1990) (Liu et al. 2007), cazador furtivo de hocico largo (Nishimiya et al. 2008). Estructura: Proteína globular de 14–24 kDa con un pliegue de lectina tipo C. Contiene cinco enlaces disulfuro. Ocurre como formas dependientes e independientes de Ca2+. La proteína forma un dímero en el olor arcoíris (Achenbach y Ewart 2002). Tamaño: ~30 30 40 Å. Isoformas: muchas, incluidas las específicas de órganos (Liu et al. 2007). SII: Mal definido. En las AFP de tipo II dependientes de Ca2+, el ion metálico es parte del sitio de unión del hielo (Liu et al. 2007), pero las regiones vecinas de la proteína también están involucradas en la unión del hielo (Loewen et al. 1998). AP: 2py2 Planos de hielo: No basales. Actividad: Produce formas de hielo bipiramidales y tiene una actividad TH moderada. (continuado) Machine Translated by Google 72 M. BarDolev et al. Cuadro 4.1 (continuación) Nombre y estructura PFA tipo III Detalles Organismos: Varias familias de peces de un suborden; por ejemplo, faneca oceánica (Li et al. 1985) y otras fanecas (Cheng y DeVries 1989). Estructura: 7 kDa, globular y rígida con hebras β cortas e imperfectas y un giro de una sola hélice (Jia et al. 1996). Tamaño: ~30 20 20 Å. Isoformas: Numerosas con 50% de identidad (Hew et al. 1988; Nishimiya et al. 2005). Se han visto un dímero (Wilkens et al. 2014) y una repetición en tándem natural (Wang et al. 1995). SII: Compuesto. Dos superficies de unión de hielo adyacentes se encuentran inclinadas entre sí y unen diferentes planos de hielo (Garnham et al. 2010). Planos de hielo: varios, incluido el plano de prisma primario [1010], piramidal [2021] y quizás algunos planos adicionales inclinados por una pequeña rotación de estos planos (Antson et AP: 5MSI al. 2001). Actividad: Las isoformas QAE tienen actividad TH moderada. Las isoformas SP dan forma al hielo pero solo detienen su crecimiento en presencia de las isoformas QAE (Nishimiya et al. 2005). Producir hielo con formas piramidales con diferentes relaciones de eje a:c (DeLuca et al. 1996). AFGP Organismos: Dos ramas distintas de peces: merluza negra antártica (DeVries y Wohlschlag 1969) y bacalaos (Chen et al. 1997). Estructura: De 4 a 50 repeticiones del tripéptido TA/PA con todos los grupos hidroxilo de las treoninas glicosilados por el disacárido 3O(βD galactosil)(α1 ! 3)Nacetilgalactosamina. Producido a partir de poliproteínas mucho más grandes. Lo más probable es que se pliegue como una hélice anfipática del tipo PPII (Tachibana et al. 2004) Isoformas: En el bacalao de roca (Gadus ogac), las isoformas AFGP varían en tamaño de 2,6 a 24 kDa, según lo medido por espectrometría de masas por electropulverización (Wu et al. 2001). SII: desconocido. Límite de planos: Planos de prisma primario (Knight et al. 1993). Actividad: baja actividad de TH para las isoformas más pequeñas; actividad moderada para las isoformas más largas. (Jia y Davies 2002) TmAFP Organismos: Insecto. Gusano amarillo de la harina (Tenebrio molitor) (Graham et al. 1997; Liou et al. 2000), escarabajo piróquido (Dendroides canadensis) (Duman et al. 1998). Estructura: 8–9 kDa, solenoide β hermético con una sección transversal rectangular. Las bobinas están compuestas por la secuencia repetida en tándem de 12 aa TCTXSXXCXXAX. Ocho enlaces disulfuro entrecruzan las bobinas y endurecen la estructura que carece de un núcleo hidrofóbico (Liou et al. 2000). La mayoría de las isoformas contienen un sitio de Nglicosilación de consenso cerca AP:1EZG del extremo Cterminal (no esencial para la actividad y el plegamiento) (Liou et al. 1999). Tamaño: ~32 14 12 Å. Isoformas: Muchas. La mayoría tiene 7 bobinas; algunos tienen de 8 a 11 bobinas (84 a 120 aa) (Liou et al. 1999). IBS: una hoja β plana con motivos ThrCysThr espaciados regularmente (Liou et al. 2000). Límite de planos: múltiples, incluido el basal (Bar Dolev et al. 2016b; Scotter et al. 2006). Actividad: TH alta (hiperactiva). Produce cristales de hielo en forma de limón. (continuado) Machine Translated by Google 4 EstructuraFunción de los IBP y sus interacciones con el hielo 73 Cuadro 4.1 (continuación) Nombre y estructura sbwAFP Detalles Organismos: Insecto. Gusano de las yemas del abeto (Choristoneura fumiferana) (Graether et al. 2000). Estructura: 9–12,5 kDa, solenoide β apretado de bobinas de ~ 15 residuos con una sección transversal triangular y un motivo TXT. 4–5 enlaces disulfuro entre soportes. Tamaño: ~36 20 18 Å. Isoformas: Varias con 5 o 7 repeticiones, en algunas hay 16 o 17 aa/coil (Doucet et al. 2000). SII: Hoja β plana de motivos TXT (Graether et al. 2000). AP: 1M8N Límite de planos: plano del prisma primario y plano basal (Graether et al. 2000; Pertaya et al. 2008). Actividad: TH alta (hiperactiva). Produce cristales de hielo de punta plana y forma hexagonal (Graether et al. 2000; Pertaya et al. 2008). RiAFP Organismos: Insecto. Rhagium inquisitor (Hakim et al. 2013) y el escarabajo de cuernos largos Rhagium mordax (Kristiansen et al. 2011, 2012). Estructura: 13 kDa, sándwich β plano con sección transversal rectangular. La estructura consta de 7 bucles de 13–20 aa que forman dos láminas β escalonadas con una separación de 6 Å, con cadenas laterales Ser y Ala interdigitadas en el interior, lo que hace que el empaque apretado sea similar a las fibras de seda, sin un núcleo hidrofóbico. Un enlace S–S (Hakim et al. 2013). Tamaño: ~35 30 6 Å. Isoformas: cinco isoformas con el mismo número de bucles en el escarabajo Rhagium AP: 4DT5 mordax (Kristiansen et al. 2011, 2012). IBS: se prevé que sea una de las dos hojas β, que se compone de una matriz de cinco hebras expandidas del motivo TXTXTXT (Hakim et al. 2013). Límite de planos: múltiples, incluido el prisma primario y los planos basales (Hakim et al. 2013) Actividad: TH alta (hiperactiva). sfAFP Organismos: Artrópodo primitivo, Collembola Hypogastrura harveyi (pulga de las AP: 2PNE nieves) (Graham y Davies 2005). Estructura: Seis bobinas antiparalelas de poliprolina tipo II para zurdos, apretadas en dos conjuntos de tres, formando superficies planas en ambos lados, una hidrófoba y otra hidrófila (Pentelute et al. 2008) . Compuesto por repeticiones GXY. En la isoforma pequeña hay dos enlaces SS y uno en la isoforma grande. Extremadamente termolábil (Graham y Davies 2005). Tamaño: ~40 10 5 Å. Isoformas: una pequeña (6,5 kDa) y una grande (15,7 kDa). IBS: supuestamente el lado hidrofóbico del disco plano. Planos delimitados: Múltiples, incluido el basal (Mok et al. 2010). Actividad: TH alta (hiperactiva). Produce cristales en forma de grano de arroz (Graham y Davies 2005; Mok et al. 2010). LpIBP Organismos: Planta: hierba de centeno (Lolium perenne). Estructura: Solenoide β de 12 kDa con 8 bobinas compuestas por repeticiones en tándem de la secuencia consenso XXNXVXG de 7 aa, repitiéndose dos veces en cada bobina. Las tres primeras bobinas contienen un residuo más por bucle, lo que forma un bulto en un lado del solenoide (Middleton et al. 2012). Tamaño: ~33 20 10 Å. Isoformas: varias, la mayoría están vinculadas a un dominio de repetición rico en leucina Nterminal de función desconocida. Uno contiene un bucle adicional (Kumble et al. 2008). IBS: una hoja β plana con un rango imperfecto de motivos TXT (~30 % Thr, la mayoría de los otros residuos son Ser, Ala y Val) (Kumble et al. 2008 ). Límite de planos: Prisma primario y planos basales (Middleton et al. 2012). Actividad: Baja TH, alta inhibición de la recristalización del hielo. Produce cristales de AP: 3ult hielo de punta plana y forma hexagonal que crecen en todas las direcciones una vez que se excede el punto de congelación. (continuado) Machine Translated by Google 74 M. BarDolev et al. Cuadro 4.1 (continuación) Nombre y estructura TisAFP y LeAFP Detalles Organismos: Microorganismos. Ejemplos: hongo del moho de nieve Typhula ishikariensis (TisAFP) (Kondo et al. 2012); Levadura ártica Leucosporidium sp. (LeAFP) (Lee et al. 2012). Muchos homólogos en bacterias, hongos, algas y diatomeas. Estructura: solenoide β derecho de 23 kDa con una sección transversal triangular compuesta por 6 bobinas con 18 (o más) aa por bobina junto con una hélice α. La secuencia no es repetitiva sin motivo de consenso (Kondo et al. 2012). LeAFP tiene un residuo glicosilado y un bucle Cterminal que lo convierte en un dímero (Lee et al. 2012). Tamaño: ~47 30 27 Å. Isoformas: varias isoformas con SII mal conservado y rango de actividades de moderadas a hiperactivas. IBS: una cara plana pero irregular en el solenoide sin motivo repetitivo y sin residuos AP:3UYU conservados en los homólogos. Probado por mutagénesis en TisAFP6 (Kondo et al. 2012) Planos ligados: Varios dependiendo de la isoforma estudiada; p. ej., plano basal y plano séxtuple adicional que no es un prisma primario o secundario para TisAFP6 (Kondo et al. 2012). Actividad: Produce formas de cristal que pueden ser bipirámides picadas. La mayoría de las variantes tienen una TH moderada y explotan a lo largo del eje c. Al menos un homólogo (isoforma TisAFP8) es hiperactivo y estalla normal al eje c (Kondo et al. 2012). MpIBPRIV Organismos: Bacteria antártica: Marinomonas primoryensis (Garnham et al. 2011a). Estructura: El dominio de unión al hielo MpIBPRIV de la adhesina bacteriana es un solenoide β de 34 kDa con 13 repeticiones en tándem de bobinas de 19 residuos. Los iones Ca2+ dentro de las bobinas endurecen el SII. Tamaño: ~70 27 17 Å. Isoformas: Ninguna detectada. IBS: dos filas paralelas de residuos que se proyectan hacia afuera, uno Thr, el otro Asx. Planos ligados: Múltiples, incluido el basal. Actividad: el MpIBPRIV recombinante es hiperactivo pero funciona como una adhesina de hielo bacteriana en lugar de un anticongelante (Bar Dolev et al. 2016a; Guo et al. 2012). AP: 3P4G Mosquito AFP Organismos: Midge (Chironomidae) (Basu et al. 2016). Estructura: Solenoide ajustado para zurdos compuesto por 8 bobinas de 10 residuos en tándem repeticiones de CXGXYCXGXX. Ocho enlaces disulfuro entrecruzan las bobinas. El solenoide está tan apretado que no hay carácter de cadena β. Tamaño: ~40 20 15 Å. Isoformas: cuatro isoformas con diferencias de secuencia menores y variaciones en el número de espiras. IBS: se predijo que sería una fila de Tyr apilados con una separación de 4,5 Å en una cara del solenoide. Planos ligados: Plano piramidal intermedio entre los planos basal y prismático. Produce cristales de hielo bipiramidales. (modelo) Actividad: Actividad TH intermedia. Explosión normal al eje c. Código de color: hélice alfa, rojo; hebras beta, amarillas; bobina, verde; enlaces disulfuro, naranja; Ca2+, azul Machine Translated by Google 4 EstructuraFunción de los IBP y sus interacciones con el hielo 75 AFP y la adhesina de hielo bacteriana de Marinomonas primoryensis. Muchos de los IBP tienen múltiples isoformas que varían en tamaño y actividad. En general, cuanto mayor es la isoforma, mayor es su actividad TH. Aunque no existe una estructura cristalina para las glicoproteínas anticongelantes (AFGP), es probable que se plieguen como una hélice de poliprolina tipo II porque esto se ajustará a la periodicidad de tres residuos (Tabla 4.1) y producirá una hélice anfipática que parece tan importante para el funcionamiento de la AFP tipo I (Baardsnes et al. 1999; Graham et al. 2013). Las AFP de tipo IV de pescado no se incluyen en la tabla porque la evidencia reciente sugiere que no funcionan como IBP en la naturaleza (Gauthier et al. 2008). Algunas de las estructuras IBP recientemente publicadas poseen características interesantes que han llevado a nuevas preguntas y a una ampliación del alcance de la relación estructurafunción en IBPs. Un ejemplo es el IBP hiperactivo de la platija de invierno: Maxi. Esta proteína forma un homodímero en solución, sin forma de monómero estable. El monómero de Maxi es como una versión cinco veces más larga de la pequeña AFP tipo I del mismo pez. Uno se pregunta cómo evolucionó esta versión gigante de AFP tipo I y si precedió o siguió a la pequeña hélice única (Sun et al. 2014). Lo que es especialmente desconcertante en este contexto es que el papel de los residuos de unión de hielo en AFP tipo I cambia en Maxi para formar y mantener la red interior de 400 aguas de clatrato que mantienen unida la estructura del haz de cuatro hélices. Otro ejemplo interesante de relaciones estructurafunción es el IBP de la bacteria antártica Marinomonas primoryensis (MpIBP). El peso molecular de MpIBP es >1,5 MDa y consta de ~130 dominios. La estructura de esta proteína se puede dividir en cinco regiones, de las cuales solo una (MpIBPRIV) se une al hielo. MpIBPRIV es un dominio único que se pliega en un solenoide β con una fila de iones Ca2+ que estabilizan la estructura helicoidal (Garnham et al. 2011a). Cuando esta región se expresó de forma recombinante, tenía los valores altos de TH y las características de formación de hielo de un IBP hiperactivo (Garnham et al. 2008). Sin embargo, MpIBP es una adhesina de hielo en su contexto natural (Bar Dolev et al. 2016a), y sus otras regiones tienen otras funciones específicas (Guo et al. 2012, 2017; Vance et al. 2014). Esta es una función inusual para un IBP (Bar Dolev et al. 2016a) , pero ahora hay evidencia de que el pliegue DUF3494 se ha incorporado a esta función de adhesión en otra bacteria marina (Vance et al. 2018). 4.3 Identificación y mapeo de sitios de unión de hielo Cada IBP tiene una superficie, el IBS, que ha evolucionado para acoplar la proteína al hielo (Fig. 4.1). La clave para definir experimentalmente esta superficie ha sido producir el IBP como una proteína recombinante (Chao et al. 1993), resolver su estructura tridimensional (Sonnichsen et al. 1993) y luego sondear la extensión del IBS utilizando sitio mutagénesis dirigida (Chao et al. 1994). Este proceso está muy bien ilustrado por estudios sobre AFP tipo III, el primer SII para el que se definió experimentalmente el SII. La AFP tipo III es un buen ejemplo porque el SII de esta AFP no podía predecirse inicialmente por la planitud y la regularidad como había sido para la AFP tipo I (DeVries y Lin 1977) y posteriormente para AFP como TmAFP (Liou et al. 2000) y Rhagium inquisidor AFP (RiAFP) Machine Translated by Google 76 M. BarDolev et al. Fig. 4.1 Sitios de unión al hielo de los IBP. Las estructuras IBP se muestran en presentación de superficie y están a escala. Los residuos de los SII putativos o determinados experimentalmente están coloreados (átomos de carbono en verde, oxígeno en rojo y nitrógeno en azul). Los residuos que no son SII están en gris. La representación de barra de las cadenas laterales de residuos de IBS se superpone en cada estructura. (a) AFP tipo I de lenguado de invierno. PDB 1WFA (Sicheri y Yang 1995). (b) AFP tipo III de faneca oceánica, isoforma HPLC12. PDB 1MSI (Jia et al. 1996). ( c ) Región IV de la adhesina de hielo de Marinomonas primoryensis (MpIBPRIV). PDB 3P4G (Garnham et al. 2011a). ( d ) Hongo del moho de la nieve IBP de Typhula ishikariensis, isoforma moderadamente activa (TisAFP6). PDB 3VN3 (Kondo et al. 2012). (e) Tenebrio molitor AFP (TmAFP), isoforma 4–9. PDB 1EZG (Liou et al. 2000). (f) AFP del gusano cogollero del abeto (sbwAFP), isoforma 501. PDB 1M8N (Leinala et al. 2002). g) Rhagium inquisitor AFP (RiAFP). PDB 4DT5 (Hakim et al. 2013). (h) Lolium perenne AFP (LpAFP). PDB 3ULT (Middleton et al. 2012). (i) Modelo de midge AFP (Basu et al. 2015) (Hakim et al. 2013). El único otro indicador de la función del SII en este estudio inicial fue la conservación de los residuos que componen el SII cuando se alinearon con una docena de isoformas diferentes. Los residuos internos conservados son probablemente esenciales para el plegamiento de la proteína. Pero es probable que los residuos superficiales conservados, especialmente aquellos que forman un parche, estén involucrados en la función de la proteína, que en este caso es la unión del hielo. Los residuos superficiales conservados de la AFP de tipo III que fueron el primer objetivo de la mutagénesis incluyeron T18, N14 y Q44. La justificación inicial de las opciones de mutagénesis, cuando todavía se pensaba que las IBP se unían al hielo a través de una red de enlaces de hidrógeno (DeVries y Lin 1977; Wen y Laursen 1992a), era alterar este patrón de enlaces de hidrógeno, como por ejemplo con el mutantes efectivos T18N, N14S y Q44T. Cuando se descubrió que el IBS era la superficie más hidrofóbica del IBP (Sonnichsen et al. 1996) y se especuló que el efecto hidrofóbico era la fuerza de unión para mantener el IBP en hielo, el éxito de estos experimentos de mutagénesis se atribuyó al estado estérico. obstáculo para la unión cuando se reemplaza una cadena lateral pequeña por una más grande (DeLuca et al. 1996), o para estropear el ajuste "ajustado" cuando se reemplaza Machine Translated by Google 4 EstructuraFunción de los IBP y sus interacciones con el hielo 77 Fig. 4.2 Sitio de unión de hielo compuesto de AFP tipo III de faneca oceánica (isoforma QAE1, también llamada HPLC12). ( a ) El sitio de unión al hielo de AFP tipo III que muestra sus dos subsitios adyacentes, cada uno de los cuales une un plano o conjunto de planos de hielo diferentes. ( b – c ) Análisis FIPA de ( b ) una proteína de tipo salvaje marcada con GFP y ( c ) un mutante A16H marcado con GFP. Los hemisferios de hielo monocristalino se montaron con el plano del prisma secundario orientado normal al eje largo del dedo frío. La gran señal de fluorescencia en b indica unión a más que el plano del prisma primario de hielo. La fluorescencia reducida en c demuestra que el mutante ha reducido la actividad del plano de hielo. No hay unión en la parte superior e inferior de los hemisferios porque las proteínas no se unen al plano basal del hielo. Reimpreso (adaptado) con permiso de (Garnham et al. 2010) Copyright (2010) American Chemical Society era más pequeño que el residuo original (Baardsnes y Davies 2002). En el último estudio, una serie de reemplazos de residuos hidrofóbicos en el IBS de AFP tipo III con cadenas laterales generalmente más pequeñas fueron perjudiciales para la actividad anticongelante medida por histéresis térmica (TH). Actualmente, se cree que el mecanismo de unión de los IBP al hielo se debe a la hipótesis del agua de clatrato anclada (Garnham et al. 2011a) , donde los grupos hidrofóbicos en el IBS están enjaulados por moléculas de agua que están unidas y estabilizadas por enlaces de hidrógeno a hidrofílicos cercanos. grupos (discutido en la Sec. 4.10). En retrospectiva, cambiar la forma y las capacidades de enlace de hidrógeno de los residuos en el SII también interferiría con la unión del hielo por este mecanismo de agua de clatrato anclado. Otra complicación añadida a la dificultad de definir el SII de AFP tipo III es que las isoformas más activas tienen dos SII adyacentes en ángulo entre sí. Juntos forman un SII compuesto (fig. 4.2) (Garnham et al. 2010). Estas isoformas QAE1 se unen tanto al prisma primario como al plano piramidal. Sin embargo, las isoformas SP y QAE2 se unen solo al plano piramidal y, como tales, pueden retrasar el crecimiento del hielo pero no detenerlo. Estos SII adyacentes se han definido mediante mutagénesis dirigida al sitio y se han validado mediante análisis de afinidad de plano de hielo basado en fluorescencia (FIPA). La prueba de principio proviene de un estudio de ingeniería en el que una isoforma QAE2 inactiva se convirtió en una forma completamente activa por tan solo cuatro mutaciones superficiales (Garnham et al. 2012 ). Lo que debería haber sido un sistema de estudio más simple para definir el SII ha sido la AFP tipo I de las platijas del ojo derecho (Sicheri y Yang 1995). Inicialmente, se predijo que esta única hélice α se uniría al hielo mediante enlaces de hidrógeno de los residuos Thr y Asx espaciados regularmente (Chou 1992; Wen y Laursen 1992a). La periodicidad de estos Thr y Asx los coloca en el mismo lado de la hélice con 11 residuos de diferencia cada uno. La isoforma HPLC6 de 37 residuos de AFP tipo I es lo suficientemente pequeña para la producción en una buena Machine Translated by Google 78 M. BarDolev et al. rendimiento y a un costo razonable por síntesis de péptidos en fase sólida. Por lo tanto, se hicieron numerosas variantes para probar la hipótesis vinculante. El reemplazo del putativo Thr que se une al hielo por Ser o Val demostró ser informativo (Chao et al. 1997; Haymet et al. 1998, 1999; Zhang y Laursen 1998). El cambio de los dos Thr centrales a Ser provocó una gran pérdida de actividad, mientras que el cambio a Val tuvo un efecto mínimo (Chao et al. 1997). Esto enfatizó la importancia de los grupos metilo de Thr en relación con los hidroxilos. Una vez más, la alineación de las isoformas y los ortólogos fue muy informativa para definir que el SII conserva los residuos de Thr y Ala en el mismo lado de la hélice. El papel de los residuos de Ala fue confirmado por la síntesis de sustituciones estéricas donde Leu reemplazó a Ala. El papel de Thr y Ala adyacente en la unión del hielo encaja bien con la hipótesis del agua anclada al clatrato. Las aguas alrededor de los grupos metilo de estos residuos de unión al hielo pueden anclarse al grupo Thr OH o al esqueleto peptídico que es accesible a las aguas solventes debido al alto contenido de Ala (65 %) de la hélice. Aunque este patrón de agua de clatrato no se observó en la estructura cristalina original de rayos X de la AFP tipo I del lenguado de invierno porque la proteína se cristalizó en acetona (Sicheri y Yang 1995) , esta disposición de clatrato se ha visto recientemente en la estructura cristalina de Maxi, una isoforma extremadamente divergente de tipo I AFP. Maxi puede servir como sustituto para mostrar aproximadamente cómo se verían las aguas de clatrato ancladas en los residuos de unión al hielo de AFP tipo I (Sun et al. 2014 ). La identificación y mapeo de un SII por mutagénesis dirigida al sitio incluso ha funcionado bien con modelos de un SII antes de que su estructura fuera determinada por cristalografía o resonancia magnética nuclear (RMN). Un ejemplo convincente de este método fue la mutagénesis sistemática del dominio de unión al hielo de la adhesina de hielo gigante de la bacteria antártica Marinomonas primoryensis. Habiendo modelado este dominio como un solenoide beta extendido, se realizaron una serie de mutaciones estéricas que apuntan hacia afuera (y una que apunta hacia adentro) a intervalos alrededor de la circunferencia del solenoide. Mutaciones en la superficie exterior que se curvan alrededor de la interior La fila de iones Ca2+ atenuó gravemente la actividad de TH, mientras que los que se encontraban en otras partes de la superficie no tuvieron un efecto significativo. La mutación interna que intentó colocar una cadena lateral de arginina en el interior de la proteína (V93R) también fue muy perjudicial. Por lo tanto, el estudio de mutación primero validó el pliegue de la proteína modelada al confirmar los residuos que apuntaban hacia afuera y hacia adentro, y luego reveló que el SII estaba compuesto por las dos filas paralelas de Thr y Asx que corren a lo largo del solenoide en un lado (Garnham et al. . 2008). 4.4 Aviones con destino a las AFP Un resultado de la diversidad estructural de los IBP es que pueden tener diferentes preferencias de unión al plano de hielo. Que sus IBS tengan diferentes residuos funcionales y diferentes espacios entre los grupos químicos expuestos les otorga especificidad para planos particulares de hielo en orientaciones específicas. Cuando una molécula de IBP se adhiere a su sitio favorecido energéticamente en el hielo, el crecimiento del hielo en las inmediaciones se ralentiza. debido a la Machine Translated by Google 4 EstructuraFunción de los IBP y sus interacciones con el hielo 79 periodicidad de los cristales de hielo, múltiples moléculas de IBP del mismo tipo se unen a sitios adyacentes equivalentes en el plano de hielo. En consecuencia, se desarrolla una faceta. Esta especificidad de unión es notable porque el IBP se dirige a un patrón específico de moléculas de agua cristalina entre muchas posibilidades similares en una situación en la que el hielo está rodeado por un gran exceso de agua líquida en la que los IBP son libremente solubles. Además, la superficie del hielo no está directamente expuesta a los IBP, sino que está cubierta por una fina capa de agua casi líquida (Hayward y Haymet 2001; Limmer 2016). La respuesta a cómo cada IBP se une a un plano específico a nivel molecular todavía es algo especulativa. Los estudios de grabado en hielo (consulte el Capítulo 9 de este volumen para obtener detalles sobre el método) realizados a principios de la década de 1990 han demostrado que las AFP de tipo I, que son péptidos repetitivos cortos, de la platija de invierno (Pseudopleuronectes americanus) y la solla de Alaska estrechamente relacionada (Pleuronectes quadritaberulatus) se unen a los [2 0 2 1] planos piramidales de hielo. Sin embargo, la AFP tipo I (isoforma SS8) de la escorpina de cuerno corto (Myoxocephalus scorpius) se adsorbe en [2 1 10], los planos del prisma secundario (Knight et al. 1991) . Aunque estas dos versiones de AFP de tipo I comparten una alta identidad de secuencia, no son homólogas. Surgieron de forma independiente para formar IBP similares por un caso notable de evolución convergente (Graham et al. 2013). De hecho, el hecho de que las AFP tipo I de platija y escultura se unan a diferentes planos de hielo es un argumento adicional para sus orígenes independientes. El grabado en hielo de dos isoformas de tipo III (isoforma AB1 de A. brachycephalus y la isoforma HPLC12 de M. americanus) reveló un patrón más complejo, lo que sugiere que ambas proteínas se unen a varios planos de hielo, incluido el plano del prisma primario [1 0 1 0], el plano piramidal [2 0 2 1], y algunos planos adicionales inclinados por una pequeña rotación de estos planos (Antson et al. 2001). Por lo tanto, una AFP que se une a varios planos de hielo aún puede tener una actividad TH moderada. El compuesto IBS de tipo III AFP que consta de dos partes adyacentes yuxtapuestas en un ángulo de 150 entre sí (Fig. 4.2) demuestra claramente cómo la proteína se une a más de un plano cristalográfico (Garnham et al. 2010). Se ha demostrado que un número creciente de IBP se unen al plano basal del hielo. La mayoría de estas proteínas tienen actividades TH particularmente altas, por lo que se denominan "hiperactivas". De hecho, la hiperactividad de los IBP se ha relacionado con su capacidad para adherirse al plano basal del hielo además de a otros planos, y detener el crecimiento del hielo en las direcciones a y c (Scotter et al. 2006; Pertaya et al . 2008). Los estudios de grabado en hielo de Choristoneura fumiferana (gusano de las yemas del abeto) AFP (sbwAFP) mostraron que se une al plano del prisma primario y al plano basal (Graether et al. 2000). La versión basada en fluorescencia del método de grabado en hielo, el análisis FIPA (Basu et al. 2014), produjo un cristal de hielo cubierto desde todas las direcciones cuando se cultivó en soluciones TmAFP (Basu et al. 2014) y RiAFP (Hakim et al. 2013). (Fig. 4.3e yg, respectivamente), al igual que una isoforma más potente de sbwAFP, la isoforma 501 (Fig. 4.3f). Esto sugiere que estas proteínas pueden unirse a múltiples planos de hielo. Los tres IBP mencionados anteriormente tienen estructuras repetitivas con IBS bien definidos, determinados a partir de estructuras cristalinas tridimensionales, modelado y, en los casos de TmAFP, mediante extensos estudios de mutagénesis superficial (Marshall et al. 2002) . Los IBS de estas proteínas son planos y están compuestos por múltiples conjuntos de residuos de treonina que apuntan hacia afuera y que presumiblemente se unen a varios planos de hielo. Esto contrasta con el SII de Machine Translated by Google 80 M. BarDolev et al. Fig. 4.3 Comparación de las propiedades de unión al hielo de los IBP. Morfología típica del hielo unido a IBP (i) dentro del espacio TH y (ii) justo después del estallido. La flecha blanca indica la dirección del eje c. (iii) Análisis FIPA con el eje c normal al campo de visión. (a) AFP tipo I de lenguado de invierno (Bar Dolev et al. 2012; Basu et al. 2014). (b) AFP tipo III de faneca oceánica, isoforma HPLC12 (Bar Dolev et al. 2012; Basu et al. 2014). (c) MpIBPRIV (Bar Dolev et al. 2012; Basu et al. 2014). (d) IBP del hongo del moho de la nieve de Typhula ishikariensis, isoforma moderada (TisAFP6) (Kondo et al. 2012; Xiao et al. 2010). (e) TmAFP, isoforma 4–9 (Bar et al. 2008a; Basu et al. 2014). (f) sbwAFP, isoforma 501 (Bar Dolev et al. 2012; Basu et al. 2014). (g) RiAFP (Hakim et al. 2013). (h) LpAFP (Middleton et al. 2012). (i) Midge AFP (Basu et al. 2016). Imágenes reimpresas de las referencias anteriores con permiso. Un asterisco a la izquierda indica que el IBP es hiperactivo. Las barras de escala son de 10 μm a menos que se especifique lo contrario AFP tipo III, que se une a diferentes planos desde distintas posiciones en su SII compuesto (Garnham et al. 2010). Otro ejemplo interesante es el IBP de ryegrass (LpIBP), que se une tanto al plano basal como al plano del prisma primario (Middleton et al. 2012), los mismos planos unidos por sbwAFP. Sin embargo, sbwAFP es hiperactiva con una actividad de TH que supera los 5 C a una concentración de 1 mg/ml (para la isoforma 501). Por el contrario, la LpAFP tiene una baja actividad TH, en el rango de 0,3 C a una concentración de 2 mg/ml. Las dos proteínas tienen aproximadamente el mismo tamaño (~12 kDa), pero el sitio de unión al hielo de LpIBP es menos repetitivo que el de sbwAFP, y el hemisferio de hielo que crece en la solución de LpIBP (Fig. 4.3h) está menos cubierto por proteína en comparación con a los hemisferios cultivados con las proteínas de insectos (Fig. 4.3e–g). El IBP recientemente caracterizado de midge se une a un plano de hielo piramidal ubicado en un punto intermedio entre los planos del prisma basal y primario. Este plano es diferente de los observados con otros IBP moderados, y parece ser al menos parcialmente responsable Machine Translated by Google 4 EstructuraFunción de los IBP y sus interacciones con el hielo 81 para la actividad TH intermedia de esta proteína, superior a las IBP moderadamente activas, pero inferior a la de las proteínas hiperactivas (Basu et al. 2016). Otro ejemplo de unión inusual al hielo es EfcIBP (una proteína de tipo DUF3494) que muestra afinidad en el plano basal sin afinidad en el plano del prisma y tiene una actividad TH moderada (Kaleda et al. 2019; Mangiagalli et al. 2018). Esto apunta a la posibilidad de un espectro más amplio de IBP aún no definidos que tienen actividades entre moderadas e hiperactivas. 4.5 Formación de hielo La capacidad fundamental de los IBP para unirse al hielo puede hacer que cese el crecimiento hacia afuera de la superficie unida según lo dictado por el efecto GibbsThomson (Wilson 1993). Esta inhibición del crecimiento conduce a la formación de formas de hielo distintas de la forma de disco del hielo en agua pura (Kawahara 2013). En la Fig. 4.3(i) se muestran ejemplos de formas inducidas por los IBP . El mismo efecto provoca la inhibición del derretimiento, lo que también conduce a la formación de hielo (Bar Dolev et al. 2012; Liu et al. 2012; Pertaya et al. 2007a). La especificidad de las IBP para diferentes planos de hielo y las tasas de unión al hielo de cada proteína a cada plano de hielo dictan las formas particulares del hielo, características de un tipo de IBP. Describimos la formación de hielo en presencia de IBP en tres regímenes de temperatura separados: por debajo del punto de congelación por histéresis (el patrón de "explosión"), por encima del punto de congelación por histéresis (dentro de la brecha TH) y por encima del punto de fusión (patrón de fusión). 4.5.1 Formación de hielo por debajo del punto de congelación por histéresis Cuando un cristal de hielo sobreenfriado se lleva a su punto de congelación, se observa un rápido crecimiento repentino. Esta temperatura de "explosión" define el punto de congelación del cristal y el límite inferior de la brecha TH. Las proteínas con valores altos de TH, como las IBP hiperactivas de los insectos, pueden sobreenfriarse varios grados, por lo que el estallido es abrupto con un patrón de crecimiento dendrítico (fig. 4.3(ii), c, e–g). Las proteínas con TH baja pueden producir formas de estallido más leves, incluido solo un aumento constante en el tamaño del cristal en todas las dimensiones, un ejemplo de lo cual lo proporciona la planta IBP, LpAFP. La dirección en la que crece el cristal durante el estallido depende de los planos cubiertos por IBP. En general, los IBP que pueden unirse a los planos basales dirigirán el estallido de hielo normal al eje c, mientras que los IBP que no se unen al plano basal inducen el estallido de hielo a lo largo del eje c (Scotter et al. 2006) . Aún así, existen diferencias en el patrón de ráfaga entre los IBP de unión no basal. Por ejemplo, en las soluciones de AFP de pescado de tipo I y tipo II, el hielo estalla como una única aguja afilada que emerge de la punta de los cristales, mientras que en las soluciones de AFP de tipo III emergen muchos cristales pequeños del original en el momento de la explosión (Fig. 4.3 ( ii), a–b). Un caso interesante es LpAFP, que se une a los planos basal y prismático y tiene una baja actividad de TH (Middleton et al. 2012). Esto conduce al crecimiento de hielo con forma de caja hexagonal (Bar Dolev et al. 2012; Middleton et al. 2012) (Fig. 4.3(ii), h). Machine Translated by Google 82 M. BarDolev et al. El midge IBP recientemente caracterizado es un ejemplo de una proteína que no se une al plano basal del hielo y, sin embargo, hace que el cristal de hielo estalle perpendicular al eje c (Fig. 4.3 (ii), i) (Basu et al. 2016) . Otro ejemplo interesante es la AFP tipo I de una platija de ojo derecho, la solla barfin (bpAFP), que tiene una solubilidad excepcionalmente alta (Mahatabuddin et al. 2017). A bajas concentraciones, bpAFP se comporta como una AFP de tipo I típica con unión al plano piramidal, baja actividad de TH y dirige el estallido de cristales a lo largo del eje c. En altas concentraciones, los valores de TH pueden alcanzar los 3 C y el cristal de hielo estalla perpendicular al eje c. En este sentido, bpAFP se comporta más como Maxi y, de hecho, hay evidencia de oligomerización. Recientemente, se ha observado una forma similar a la de Saturno como patrón de crecimiento de hielo en la solución efcIBP. Este patrón de crecimiento es consistente con la afinidad de efcIBP por el plano basal del hielo sin afinidad por el plano del prisma (Kaleda et al. 2019). 4.5.2 Formación de hielo dentro de la brecha TH Las formas bipiramidales del hielo en soluciones de AFP moderadas de pescado están ampliamente documentadas (Bar Dolev et al. 2012). Sin embargo, un examen cuidadoso mostró que por debajo y cerca del punto de fusión, los cristales tienen forma de bipirámide truncada, con algún plano basal expuesto. A temperaturas más bajas, los cristales continúan creciendo en la dirección c y los planos basales se encogen hasta alcanzar un tamaño crítico en el que no se pueden incorporar nuevas capas de agua (Knight y DeVries 2009 ). En esta etapa, el cristal está poblado por moléculas IBP en las 12 superficies equivalentes de la bipirámide hexagonal, que es la base de su capacidad para detener el crecimiento del hielo. A temperaturas más bajas, el tamaño crítico para la formación de núcleos de hielo es más pequeño, por lo que las puntas continúan creciendo y se vuelven más afiladas. Estas puntas están menos protegidas que los planos de cristal y el estallido suele partir de ellos. En el caso de los IBP hiperactivos, que se unen a los planos basales, los cristales de hielo están cubiertos por proteínas desde todas las direcciones (Pertaya et al. 2008), por lo que están protegidos del crecimiento (y derretimiento) a lo largo de la brecha TH. Por lo tanto, el crecimiento de las puntas de las pirámides no es aparente y sus formas permanecen constantes (Bar Dolev et al. 2012). A principios de la década de 1990, los investigadores observaron que, en concentraciones bajas variables de AFP tipo I de la platija de invierno, los cristales de hielo siempre crecían con una relación constante del eje c:a de 3,3:1. Esta relación se mantuvo constante también en una serie de mutantes con actividades TH más bajas en relación con el tipo salvaje. Sin embargo, la proporción del eje de los cristales de hielo en soluciones diluidas de AFP tipo III de faneca oceánica (isoforma QAE1) cambió a medida que el cristal siguió creciendo y cambió con la concentración de AFP. Además, los mutantes de AFP tipo III parcialmente inactivados produjeron diferentes proporciones de ejes (DeLuca et al. 1996). Una teoría desarrollada para explicar este fenómeno sugiere que la platija AFP, que se une solo a un plano piramidal de hielo, se alinea en los planos piramidales sin formar escalones. La AFP tipo III se une a los planos prismáticos, por lo que se razonó que se deben formar escalones para obtener formas piramidales. La duración de cada paso depende de la concentración, lo que conduce a una variación en la relación del eje a diferentes concentraciones de proteína (DeLuca et al. 1996). Sin embargo, otra AFP tipo I de Machine Translated by Google 4 EstructuraFunción de los IBP y sus interacciones con el hielo 83 sculpin se adsorbe en los planos del prisma secundario (Knight et al. 1991), que parecen requerir un mecanismo de crecimiento escalonado para lograr una forma de cristal de hielo bipiramidal. Estudios posteriores demostraron que el tipo III se une más allá del plano prismático (Antson et al. 2001; Garnham et al. 2010) añadiendo complejidad a este fenómeno. Un escenario plausible para explicar los cambios en las proporciones de los ejes debido a la concentración o la mutagénesis es que las velocidades de crecimiento del hielo dependen de las tasas de adsorción de cada proteína a un plano de hielo en particular (Drori et al. 2014a; Knight y DeVries 2009 ). 4.5.3 Conformación del hielo al derretirse Los cristales de hielo bipiramidales en soluciones IBP moderadas siempre comienzan a derretirse desde sus puntas, donde la cobertura de hielo es menos efectiva. La fusión avanza a lo largo del eje c, exponiendo más superficie basal hasta que el cristal adquiere una forma de ojo con puntas normales al eje c (Bar Dolev et al. 2012). Los IBP hiperactivos, que se unen con eficacia a los planos basales, dan como resultado una forma característica del hielo durante el derretimiento (v. fig. 4.3(i)—c, e, f y g). Esto es contrario a la intuición porque el cristal se está retirando. Sin embargo, se demostró que los IBP pueden ralentizar el derretimiento del hielo e incluso inhibir por completo el derretimiento, lo que da como resultado un hielo sobrecalentado (Celik et al. 2010; Cziko et al. 2014; Knight y DeVries 1989). Además, los métodos utilizados para observar la formación de cristales incluyen la congelación instantánea de toda la solución, por lo que las formas de fusión posiblemente se formen debido a la proteína atrapada en el cristal. Las variaciones en las formas obtenidas con cada IBP durante la fusión están relacionadas con las diferencias en las velocidades de fusión en las direcciones axiales ay c. Un modelo de derretimiento del hielo que considera una baja velocidad de derretimiento en la dirección c en relación con la dirección a predijo con éxito la formación de la estructura en forma de limón, característica de TmAFP (Liu et al. 20 4.6 Tamaño y efectos cooperativos de la actividad del IBP 4.6.1 Tamaño de la molécula AFP y cooperatividad Un rompecabezas para comprender la actividad de IBP fue la observación de que TH aparece solo por encima de un cierto umbral de concentración de proteína. Por debajo de esta concentración, las AFP fueron suficientes para dar forma al hielo pero no para detener su crecimiento. Un modelo temprano propuso que a altas concentraciones de proteína hay un efecto cooperativo: las moléculas de proteína forman interacciones lado a lado que crean un parche de AFP con varios SII alineados en la superficie del hielo (Wen y Laursen 1992a) . Para probar esta hipótesis, la AFP tipo III de 7 kDa se fusionó con proteínas de 12 kDa o 42 kDa, aumentando su tamaño total a ~20 y ~50 kDa, respectivamente. Se esperaba que la actividad TH de la proteína de fusión fuera menor que la TH del tipo salvaje porque las proteínas fusionadas imponen una intervención estérica e interrumpen cualquier posible interacción AFP lado a lado. Sin embargo, se observó lo contrario. Los conjugados más grandes (más voluminosos) dieron como resultado una mayor TH Machine Translated by Google 84 M. BarDolev et al. (DeLuca et al. 1998). Estos hallazgos descartan la hipótesis del efecto de unión cooperativa de los parches de AFP y están respaldados por el modelo de adsorcióninhibición (Raymond y DeVries 1977) y el efecto Kelvin (Wilson 1993). Aumentar el tamaño de las AFP reduce la distancia entre las moléculas adyacentes, ya que cada molécula cubre una mayor parte de la superficie del hielo. Esto reduce la probabilidad de que se agregue agua a la superficie del hielo y reduce el punto de congelación. Hemos probado fusiones de proteína fluorescente verde (GFP) de AFP tipo III y la TmAFP hiperactiva (9 kDa), donde la molécula GFP (26 kDa) aumenta el tamaño total de las proteínas ~ cuatro veces. Observamos que las fusiones GFP son > dos veces más activas que la TmAFP no conjugada sobre una base molar. Otro estudio demostró que la adición de bajas concentraciones de anticuerpos policlonales generados contra TmAFP o su homólogo del escarabajo Dendroides canadensis (DcAFP) a la solución de antígeno aumentó varias veces la actividad de TH. La adición de anticuerpos secundarios (anticonejo de cabra) que se unían a los anticuerpos primarios elevaba aún más la TH (Wu et al. 1991). Claramente, los IBP más grandes conducen a niveles más altos de TH. Estas observaciones plantean la pregunta: ¿por qué las IBP evolucionaron para convertirse en proteínas pequeñas y altamente expresadas? La expresión de bajo nivel de proteínas más grandes podría haber sido favorecida metabólicamente. Puede ser que las moléculas más pequeñas tengan mayor accesibilidad a otras áreas del cuerpo a través de la extravasación del sistema circulatorio (Bar Dolev et al. 2016b). Además, las moléculas pequeñas se difunden más rápido que las más grandes. En particular, aunque las interacciones lado a lado entre las moléculas de IBP se pueden descartar en los ejemplos mencionados anteriormente, los efectos cooperativos todavía son posibles en ciertos casos. En un estudio de AFP tipo III de eelpout de aleta con muescas (nfeAFP), se observó un aumento significativo en la actividad de TH de una isoforma apenas activa al agregar concentraciones bajas de una isoforma más activa. Esto puede deberse a una forma de cooperatividad entre las dos isoformas (Nishimiya et al. 2005; Takamichi et al. 2009) que probablemente implique la estabilización de los planos de unión para la isoforma menos activa (Berger et al. 2019). En muchos peces e insectos, se han identificado isoformas de AFP de baja actividad además de moderadas e hiperactivas (Hew et al. 1988; Liou et al. 1999). Múltiples isoformas pueden cooperar para brindar una mejor protección general contra el crecimiento del hielo. 4.6.2 Tamaño del SII El concepto intuitivo de que los IBP con IBS más grandes tendrán actividades anticongelantes más altas es consistente con los modelos de unión de hielo reversible e irreversible (discutido en la Sección 4.11). Los IBP con un SII más grande tienen más posibilidades de adherirse al hielo que aquellos con un SII pequeño. También es consistente con la hipótesis de capa de hidratación/clatrato anclado (ver Sección 4.10), ya que un SII grande tiene más posiciones para unir agua, lo que aumenta la probabilidad de formación de un quórum de moléculas de agua similares al hielo. Esto eventualmente aumenta la posibilidad de que las aguas de clatrato en el IBP se fusionen con la capa casi líquida en la interfaz hieloagua y se conviertan en hielo. La ventaja de un IBS grande se ha observado en organismos que producen IBP Machine Translated by Google 4 EstructuraFunción de los IBP y sus interacciones con el hielo 85 isoformas con diferentes tamaños de SII de estructuras repetitivas o no repetitivas, moderadas e hiperactivas. Las correlaciones entre el tamaño de IBP y la actividad de TH se describen en el cap. 3 de este volumen. Aquí observamos específicamente esta relación en isoformas del mismo tipo donde la estructura de los SII es la misma, pero sus tamaños son diferentes. Un ejemplo sencillo son los AFGP. Las isoformas pequeñas de AFGP son mucho menos potentes que las más grandes, tanto naturales (Wu et al. 2001) como sintéticas (Tachibana et al. 2004), como se muestra en la Fig. 3.1. Otro ejemplo son las abundantes AFP tipo I αhelicoidales de 3,3 kDa de la platija de invierno, que consisten en 3 repeticiones de la secuencia consenso de 11 aminoácidos (aa). Una isoforma de esta proteína (AFP9) tiene 4 repeticiones de la secuencia consenso y, por lo tanto, un área de superficie de IBS más grande. Esta isoforma tenía casi el doble de la actividad TH de la proteína de 3 repeticiones, aunque su tamaño es solo un 30% mayor (Chao et al. 1996). De acuerdo con esta relación de tamaño a actividad, un péptido sintético que consiste en una sola unidad repetitiva de la misma AFP no mostró ninguna actividad de TH. Sin embargo, el péptido produjo la formación de hielo, lo que indica que todavía podía unir el hielo. Dos isoformas bien caracterizadas de la AFP βhelicoidal izquierda hiperactiva del gusano de las yemas del abeto (sbwAFP) son la de 9 kDa (isoforma337) (Graether et al. 2000) y la de 12 kDa (isoforma 501), que consta de 5 y 7 bucles helicoidales, respectivamente. Los motivos TXT paralelos comprenden la cara de unión al hielo de ambas isoformas, pero en la isoforma 501 hay dos posiciones en las que Thr se reemplaza: en un caso por Ile y Val en el otro. Aunque el IBS general es solo ~ 30% más grande en la isoforma 501, su TH es de tres a cuatro veces mayor que la de la isoforma más pequeña (Leinala et al. 2002), como se muestra en la figura 3.7. En las pulgas de las nieves, la TH de una isoforma más grande (15,7 kDa) es el doble de la actividad de TH de una isoforma más pequeña (6,5 kDa) a bajas concentraciones (<0,2 mg/ ml) (Graham y Davies 2005) . La anguila antártica, Lycodichthys dearborni, produce una gran isoforma de AFP tipo III llamada RD3 que consta de dos unidades consecutivas de la proteína de 7 kDa. Los monómeros son similares entre sí en estructura (Miura et al. 2001) y actividad (Wang et al. 1995), y están conectados por un conector flexible de 9 aminoácidos. Los estudios de RMN indicaron que este enlazador permite la unión simultánea del hielo de ambos IBS (Holland et al. 2008). En el cap. 3 (figura 3.4). A bajas concentraciones (<0,5 mM), la TH del dímero alcanza seis veces la actividad de los monómeros en base molar, aunque el tamaño total aumentó solo el doble. Los efectos cooperativos de las dos unidades explicaron esta mejora significativa (Miura et al. 2001; Wang et al. 1995). En particular, en este caso se duplicaron tanto el tamaño del IBP como el tamaño/número del IBS. En un estudio de un modelo recombinante basado en el dímero RD3, en el que se usó mutagénesis para eliminar uno de los SII, el área del SII contribuyó con el 80 % del aumento de la actividad de TH y el tamaño más grande representó el 20 % restante (Baardsnes et al. otros 2003). Estudios previos con proteínas de fusión de AFP de tipo III habían demostrado que la actividad de TH aumenta con el tamaño total del complejo. Un aumento del 20% en la actividad al duplicar el tamaño de la proteína fue consistente con el rango de aumentos observados con otras isoformas naturales (Chao et al. 1996; Leinala et al. 2002) y proteínas de fusión. Machine Translated by Google 86 M. BarDolev et al. 4.7 Ingeniería de proteínas de mejores IBP Los IBP han evolucionado en muchas ocasiones en diferentes organismos para cumplir funciones específicas (Davies 2014). Aquellos que sirven como AFP para evitar que el pescado se congele en agua de mar helada tienen un límite inferior definido de depresión del punto de congelación de ~1.2 C para lograr. Esto lo logran con poco margen de maniobra (Scotter et al. 2006), y solo mediante la producción de altas concentraciones (mM) de AFP en la sangre. En varios peces, estas concentraciones de 10–30 mg/ml han requerido una amplificación masiva de los genes AFP para satisfacer la demanda de concentración (Chen et al. 1997; Hew et al. 1988; Hsiao et al. 1990; Scott et al. 1988). Algunos insectos terrestres deben pasar el invierno a temperaturas de – 30 C sin congelarse. Según los ensayos in vitro de sus AFP, es probable que otros factores además de la TH contribuyan a esta depresión del punto de congelación. Sin embargo, las AFP de insectos son considerablemente más potentes en TH que las AFP de peces. Atribuimos esta hiperactividad a la capacidad de las AFP de los insectos para unirse al plano basal del hielo además de otros planos, como se analiza en la Secc. 4.4. Aunque se conocen isoformas hiperactivas para la AFP de tipo I, en general, las AFP de los peces parecen tener un bajo rendimiento al no desarrollar la unión al plano basal. ¿Por qué la evolución no ha hecho que las AFP de pescado sean de mayor potencia, en menor cantidad y con un costo metabólico reducido? Aunque la naturaleza no ha funcionado de esta manera, las AFP hiperactivas introducidas transgénicamente en los peces podrían proporcionar una solución biotecnológica para la acuicultura del salmón en áreas de agua de mar donde la mortalidad por superenfriamiento es un problema (Hew et al. 1992) . Aparte de la lección de la unión del plano basal, la naturaleza ha proporcionado otras pistas sobre cómo mejorar la actividad anticongelante. Cuando hay múltiples isoformas de una AFP repetitiva, las isoformas más grandes son invariablemente mejores en TH en comparación con una base molar (ver discusión anterior, Sección 4.6.2). Este principio se confirmó en un estudio de ingeniería de proteínas en el que se añadieron y restaron bobinas de la estructura de solenoide β de TmAFP. La eliminación de solo una bobina de las siete encontradas en la isoforma TmAFP más abundante provocó una gran pérdida de actividad; mientras que la inserción de una o dos bobinas tuvo el efecto contrario (Marshall et al. 2004a). ¿Cómo se puede racionalizar esto cuando la unión de un IBP al hielo es necesariamente irreversible? Podemos citar argumentos similares para explicar por qué la TH es una función de la concentración de AFP. Detener el crecimiento de un cristal de hielo semilla a temperaturas de sobreenfriamiento requiere la difusión y la unión a la superficie de suficientes AFP para aprovechar el efecto GibbsThompson. Pero para un contacto productivo que conduzca a la unión entre el IBP y el hielo, debe haber una buena coincidencia entre las aguas de clatrato "ancladas" en el IBS y la capa de agua casi líquida que recubre la superficie del hielo. Tener un IBS más grande hace que sea estadísticamente más probable que se encuentre una coincidencia. Las construcciones artificiales que multimerizan las IBP han producido aumentos significativos en la actividad anticongelante (Can y Holland 2011). Estos aumentos se presentan de manera óptima por las concentraciones más bajas necesarias para lograr la misma TH que las IBP libres. La unión de las AFP tipo I y tipo III a andamios como los dendrímeros demuestra el potencial de la multimerización como un enfoque de ingeniería de proteínas para mejorar el anticongelante, pero adolece de una reacción incompleta (Stevens et al. 2015) . Se ha logrado un enfoque más controlado mediante el uso de proteínas de autoensamblaje. Machine Translated by Google 4 EstructuraFunción de los IBP y sus interacciones con el hielo 87 jaulas (King et al. 2014; Padilla et al. 2001) para unir un número fijo de IBP en una orientación definida con sus IBS proyectados hacia afuera (Phippen et al. 2016). Cuando la actividad de TH se compara en términos molares, un multímero que muestra 12 IBP es un orden de magnitud más activo que el monómero. Este aumento en la depresión del punto de congelación se refleja en un aumento similar en la capacidad de los multímeros para inhibir la recristalización del hielo. Siguiendo este enfoque, hay muchas posibilidades para formar matrices 1, 2 y 3D de diferentes tipos de IBP y mezclas de los mismos para diseñar formas de controlar y dar forma al crecimiento del hielo. Más detalles sobre este tema se dan en el Cap. 14 de este volumen. 4.8 INP: Proteínas de nucleación de hielo Los agentes de formación de núcleos de hielo se encuentran ampliamente dispersos en la naturaleza y sirven para elevar la temperatura a la que se congela el hielo mediante la organización de un núcleo de hielo de tamaño suficiente para promover su rápido crecimiento (Pummer et al. 2015) . De relevancia para este capítulo son los agentes biológicos de formación de núcleos de hielo que se encuentran en la superficie de algunas bacterias. Estos INP se agrupan como agregados en la superficie bacteriana que pueden promover la congelación a temperaturas de hasta 2 °C (Guriansherman y Lindow 1993; Kawahara 2002; Kieft 1988; Wolber y Warren 1989). La secuencia principal de estos INP bacterianos de >120 kDa se compone de tres regiones. La región central es la más grande y es una serie de repeticiones en tándem de 16 aminoácidos de secuencia consenso GYGSTxTAxxxSxLxA, que promueven la nucleación (Green et al. 1988) (Warren y Corotto 1989). Esta región repetitiva está flanqueada por regiones no repetitivas más cortas, de las cuales se cree que la Nterminal ancla el INP a la membrana externa de la bacteria (Kawahara 2002; Wolber y Warren 1989). Aunque no existen estructuras de INP resueltas experimentalmente, se han predicho algunos modelos estructurales para la región repetitiva (Guriansherman y Lindow 1993). Inspirado en los pliegues helicoidales β de algunas AFP de insectos (Graether et al. 2000; Liou et al. 2000), las regiones repetitivas de INP de P. syringae (PsINP) (Graether y Jia 2001) y un pariente cercano P. borealis , (PbINP) (Garnham et al. 2011b) se modelaron como βsolenoides. La lógica de esta elección es que tanto los IBP como los INP tienen repeticiones de longitud similar y que un pliegue de solenoide coloca motivos repetitivos en línea en la misma cara de la hélice. En los IBP, el pliegue del solenoide alinea los motivos de unión al hielo TXT en una matriz bidimensional que funciona como el IBS. Como se describe en la Secc. 4.10 a continuación, la hipótesis del agua de clatrato anclada para la unión del hielo sugiere que el SII funciona organizando las aguas en un patrón similar al hielo suficiente para fusionarse con las aguas casi líquidas en el hielo y, a su vez, convertirse en hielo. El hecho de que un pliegue de solenoide para INP pueda potencialmente formar una matriz aún más larga de motivos TXT sugiere fuertemente un mecanismo similar de ordenamiento de aguas superficiales. Esta hipótesis se ve reforzada por simulaciones de moléculas de agua alrededor de los arreglos TXT del modelo PbINP, que muestran que el INP podría ordenar agua en este sitio (Garnham et al. 2011b). En los INP, la longitud exagerada de la región de organización del agua va mucho más allá de las seis a ocho espirales necesarias para la unión del hielo hasta una longitud en la que el exceso de agua ordenada puede promover la nucleación Machine Translated by Google 88 M. BarDolev et al. área de organización de agua de 4200 Å2 en PsINP (para un monómero) (Graether y Jia 2001), y 25,600 Å2 en PbINP (para un dímero) (Garnham et al. 2011b). Teniendo en cuenta que se necesita una molécula de INP para obtener un núcleo de hielo a 12 C (Govindarajan y Lindow 1988), el tamaño total del área de organización de agua de los modelos INP está aproximadamente de acuerdo con el tamaño necesario de los núcleos de hielo a esta temperatura. temperatura, que es de 20 100 Å2 Este . cálculo, junto con varios estudios que demostraron que los INP se agregan para facilitar la nucleación a temperaturas elevadas (~ 2 C) (Guriansherman y Lindow 1993), respaldan la idea de que las INP forman hielo mediante el mismo mecanismo de agua de clatrato anclado que utilizan las AFP para unir el hielo (Garnham et al. 2011a). Así, la diferencia básica entre las AFP y las INP es su tamaño. El IBS grande de los INP puede unir suficientes moléculas de agua en una organización similar al hielo, suficiente para servir como un núcleo de hielo heterogéneo en lugar de suprimir el crecimiento del hielo. En consecuencia, algunas IBP tienen una ligera actividad de nucleación de hielo, como la AFP tipo I en altas concentraciones (Wilson et al. 2010). Estudios recientes muestran una baja actividad de nucleación de hielo para AFP tipo III, TmAFP y sfAFP que coincide con el tamaño pequeño de las proteínas (Bissoyi et al. 2019; Eickhoff et al. 2019). Los estudios computacionales respaldaron estos hallazgos (Qiu et al. 2019). Otro estudio mostró que el INP truncado tiene actividad anticongelante (Kobashigawa et al. 2005). Estos resultados brindan un respaldo adicional de que las INP y las AFP se unen al hielo mediante el mismo mecanismo. En una cuestión de semántica, incluimos los INP en el grupo de IBP no solo por su mecanismo común predicho, sino porque en el instante en que los INP forman hielo, se unen efectivamente a su superficie. 4.9 La base molecular de las interacciones proteínahielo El mecanismo por el cual los IBP se unen al hielo a nivel molecular ha sido un tema intensamente debatido en la investigación del IBP. La interfaz entre la proteína y el hielo en un medio acuoso es difícil de sondear experimental y teóricamente. El hielo en el agua no tiene límites claros entre los estados cristalino y líquido que puedan definir un sitio de unión a nivel molecular. En cambio, hay una zona delgada (capa cuasi líquida) de agua que tiene un estado intermedio entre el agua sólida y la líquida y desdibuja efectivamente el límite entre los dos estados (Hayward y Haymet 2001; Limmer 2016 ) . Además, es fascinante que los IBP realmente puedan seleccionar superficies de hielo particulares, compuestas solo de moléculas de agua ordenadas, cuando están rodeadas por <55 M de agua a granel. A estos desafíos se suma la determinación del SII de muchos IBP donde no hay motivos obvios para ayudar a identificarlo y sugerir una coincidencia con el hielo. Incluso en los casos en los que el SII son superficies repetitivas planas como TmAFP (Liou et al. 2000) y RiAFP (Hakim et al. 2013), existen numerosos planos de hielo diferentes que pueden desarrollarse durante el crecimiento cuando están presentes inhibidores como los IBP. Las diferencias entre muchos de estos planos (energéticamente o estéricamente) pueden ser lo suficientemente pequeñas como para ser prácticamente indistinguibles. Desde los primeros estudios de los mecanismos de IBP, se han sugerido muchas teorías para explicar la base molecular del reconocimiento de hielo por parte de IBP (revisado en (Davies et al. 2002; Vrielink et al. 2016; Yeh y Feeney 1996)). Una primera explicación fue que el Machine Translated by Google 4 EstructuraFunción de los IBP y sus interacciones con el hielo 89 abundantes restos hidrofílicos en los AFGP inmovilizan las moléculas de agua en su vecindad y reducen la cantidad de agua disponible para la formación de hielo. Esta idea fue cuestionada por los estudios de RMN que muestran que la cantidad de moléculas de agua unidas en las superficies AFGP es pequeña (DeVries y Price 1984). Luego se sugirió que las AFP se unen al hielo a través de enlaces de hidrógeno entre las cadenas laterales de proteínas (o fracciones de disacáridos en el caso de las AFGP) y las moléculas de agua disponibles en la superficie del hielo (DeVries y Price 1984; Knight et al. 1991 ) . El bajo número de enlaces de hidrógeno y su debilidad en comparación con los enlaces covalentes parecían insuficientes para explicar la unión irreversible de las IBP al hielo. Una expansión de esta idea basada en una excelente coincidencia entre el IBS y el plano de hielo unido fue que los grupos hidroxilo en la superficie de la proteína podrían incorporarse a la red de hielo (Knight et al. 1993) . Sin embargo, los estudios de mutagénesis del SII de AFP tipo I (Chao et al. 1997; Haymet et al. 1998; Zhang y Laursen 1998) y TmAFP (Bar et al. 2008b) mostraron que los restos hidrófobos en el SII son más importantes que los hidroxilos de superficie para mantener la actividad de TH. Además, los trabajos teóricos demostraron que no hay ganancia de enlaces de hidrógeno al unirse la AFP tipo I al hielo (Madura et al. 2000; Wierzbicki et al. 2007). 4.10 La teoría de la capa de hidratación Las simulaciones dinámicas moleculares propusieron que la primera capa de hidratación en el SII de AFP tipo I (Yang y Sharp 2005) y tipo III (Smolin y Daggett 2008; Yang y Sharp 2004) hace una contribución considerable a la unión de las proteínas al hielo. Estos estudios mostraron que los surcos apolares en el SII de las proteínas están llenos de moléculas de agua que están unidas por puentes de hidrógeno a los grupos polares del SII. Estas moléculas de agua están dispuestas en una organización tetraédrica, similar a la organización de las moléculas de agua en el hielo. La capa cuasihielo unida a la proteína facilita la fusión de la proteína con la capa cuasilíquida sobre hielo en medios acuosos (Gallagher y Sharp 2003; Wierzbicki et al. 2007). Una verificación experimental de este concepto provino de la estructura cristalina de la faneca oceánica tipo III AFP, que se determinó mediante datos combinados de difracción de rayos X y neutrones. Se observaron cuatro moléculas de agua dispuestas en un patrón similar al hielo en la estructura combinada, lo que sugiere que estaban ancladas en esta organización a la proteína en solución. Sin embargo, solo tres de estas moléculas de agua estaban suficientemente bien ordenadas para ubicar los átomos de hidrógeno en la estructura cristalina. La cuarta molécula de agua en este quórum de agua se resolvió con ocupación parcial (Fig. 4.4) (Howard et al. 2011). La evidencia más clara de la organización del agua similar al hielo provino de la estructura cristalina del dominio de unión al hielo de MpIBP (MpIBPRIV). Una matriz de ~50 moléculas de agua dispuestas en una estructura similar al hielo estaba presente en el SII de esta proteína (Fig. 4.5) (Garnham et al. 2011a). Estas aguas formaron jaulas alrededor de los grupos metilo de la superficie y esta matriz de clatratos se "ancló" a los grupos amida del esqueleto peptídico y hidroxilo cercanos. Aunque los rangos de moléculas de agua similares al hielo se observaron antes en las estructuras cristalinas de otros IBP (Liou et al. 2000), sus IBS siempre fueron Machine Translated by Google 90 M. BarDolev et al. Fig. 4.4 Aguas superficiales ordenadas en el SII de AFP tipo III. El modelo de cúmulo de agua tetraédrico se superpone al mapa de densidad de dispersión nuclear 2Fo Fc ponderado por σA (nivel de contorno ¼ 1 rms) para el cúmulo de agua tetraédrico. Tenga en cuenta que si bien hay grandes picos de dispersión nuclear para las tres moléculas de agua 1001, 1002 y 1003, el pico de dispersión nuclear del agua 1004 es mucho más débil, lo que indica desorden. Como tal, solo se puede modelar como un átomo de oxígeno. Reimpreso de (Howard et al. 2011). Derechos de autor (2011) WILLEY Fig. 4.5 Aguas superficiales ordenadas en el IBS de MpAFPRIV. ( a ) Representación superficial del SII de una de las moléculas de proteína expuestas libremente al solvente en la celda unitaria. Los átomos de carbono son blancos, los de nitrógeno son azules y los de oxígeno son rojos. Las aguas superficiales ordenadas se representan como esferas acuáticas. (b) Aguas superficiales ordenadas que muestran algo de hidrógeno unido directamente al SII. Los iones Ca2+ estructurales están en verde. (c–d) Las aguas superficiales organizadas hacen una excelente coincidencia tridimensional con los planos de hielo basales (c) y del prisma primario (d). La dirección del eje c se indica en ambas figuras. Modificado de (Garnham et al. 2011a) Machine Translated by Google 4 EstructuraFunción de los IBP y sus interacciones con el hielo 91 directamente opuesto al SII de otra molécula de IBP, por lo que la organización de cualquier resto de agua podría interpretarse como un artefacto inducido por cristales. En la estructura de MpIBP RIV, dos de las cuatro moléculas de proteína en la celda unitaria tenían su SII expuesto total o parcialmente al solvente, lo que sugiere que la organización de las aguas superficiales era la que se observa en solución (Garnham et al. 2011a) . El apoyo adicional para el modelo de agua de clatrato anclado proviene de simulaciones de dinámica molecular (MD) que mostraron estructuras de agua ordenadas en el IBS de TmAFP (Yang et al. 2003) (Liu et al. 2016), sbwAFP (Nutt y Smith 2008 ) , y PbINP (Garnham et al. 2011b) en solución. Mientras que otras simulaciones encuentran solo una ligera preestructuración de las moléculas de agua en la superficie de unión de hielo de TmAFP en solución, también respaldan la formación de agua ordenada antes de la unión de AFP al hielo, lo que sugiere la necesidad de hielo para estabilizar el agua de clatrato en el IBP. superficie (Hudait et al. 2018). En otro estudio experimental, se revelaron aguas adicionales unidas al SII en AFP tipo III al cristalizar la proteína como una fusión con proteína de unión a maltosa que cambia la orientación del SII hacia el solvente (Sun et al. 2015) . En una variante menos activa de la misma AFP, las mutaciones que mejoraron la actividad se asociaron con una red de aguas polipentagonales en la cara que une el hielo (Mahatabuddin et al. 2018) Una extensión de la teoría de la capa de hidratación sugiere una contribución de las caras de los IBP que no se unen al hielo a su actividad. Las simulaciones de MD de la capa de hidratación alrededor de las tres caras de la sbwAFP βhelicoidal mostraron que, si bien la cara de unión al hielo facilita el ordenamiento de las estructuras de agua tetraédricas, las otras dos caras interrumpen los grupos de agua de modo que el agua similar al hielo queda excluida de esos planos. . Se concluyó que las caras de los IBP que no se unen al hielo cooperan con el SII al prevenir el crecimiento excesivo de la proteína por el hielo (Knight y Wierzbicki 2001; Nutt y Smith 2008). Aunque se cree que el papel de las moléculas de agua en el reconocimiento molecular del hielo por parte de las AFP es genérico para todas las IBP, es necesario resolver algunas controversias. La espectroscopia de generación de frecuencia de suma vibratoria, que es similar a la dispersión Raman pero sensible solo a las moléculas en entornos no simétricos, como las superficies, se utilizó para observar las moléculas de agua superficial en el IBS de algunos IBP. Un pico claro atribuido a las aguas heladas unidas a la proteína IBS en solución estuvo presente en los espectros de AFP eelpout tipo III pero estuvo ausente en los espectros de un mutante inactivo de la misma proteína. Este pico también se observó en el espectro de la proteína de tipo salvaje tomada a temperatura ambiente, aunque con menor intensidad en relación con la observada a bajas temperaturas, lo que indica que la estabilidad de la estructura del agua similar al hielo depende de las temperaturas (Meister et al. 2014). Sin embargo, experimentos similares con DcAFP hiperactiva de escarabajos no mostraron tal organización del agua. Los autores concluyeron que la DcAFP βhelicoidal altamente ordenada no necesita un clatrato de agua para el reconocimiento del hielo (Meister et al. 2015). Otros datos contradictorios sobre TmAFP, un homólogo de DcAFP, sugirieron la presencia (Yang et al. 2003) o la ausencia (Modig et al. 2010) de moléculas de agua similares al hielo en su SII. Otro problema sin resolver se refiere a la gama de moléculas de agua involucradas en el reconocimiento del hielo. Una simulación MD en faneca oceánica tipo III AFP predijo que el clatrato de agua alrededor del SII de la proteína consiste en moléculas de agua de la capa de hidratación primaria pero no más allá Machine Translated by Google 92 M. BarDolev et al. (Smolin y Daggett 2008). Sin embargo, la espectroscopia de absorción de terahercios realizada para investigar las interacciones de largo alcance de las AFGP (Ebbinghaus et al. 2010), las AFP tipo I (Ebbinghaus et al. 2012) y el insecto hiperactivo DcAFP (Meister et al. 2013) con agua sugieren que Los IBP pueden retardar la dinámica de los enlaces de hidrógeno hasta 20 Å desde la superficie de la proteína. Aunque en el caso de AFP tipo I, un mutante débilmente activo tuvo el mismo efecto en la solución que la proteína de tipo salvaje altamente activa (Ebbinghaus et al. 2012 ), los autores concluyeron que la perturbación de largo alcance de la dinámica de la solución es esencial para reconocimiento de hielo por IBP. En un estudio teórico de la primera y segunda capas de hidratación de AFP tipo III, se encontró que la proteína de tipo salvaje y dos mutantes con 10% y 54% de la actividad de tipo salvaje tenían las mismas propiedades de hidratación. En este caso se sugirió que no existe correlación entre los efectos de las proteínas sobre el agua de solvatación y la actividad anticongelante (Grabowska et al. 2016). Claramente, las discrepancias entre los estudios antes mencionados necesitan ser resueltas. 4.11 El conflicto de vinculación reversibleirreversible La teoría de la inhibición de la adsorción (Raymond y DeVries 1977) sugiere que las IBP se unen a la superficie de un cristal de hielo y lo fijan de tal manera que el hielo puede crecer solo entre las moléculas de proteína unidas. Esta fijación local da como resultado una curvatura de la superficie que aumenta a medida que crece el hielo, lo que lleva a la reducción del punto de congelación debido al efecto GibbsThomson y, posteriormente, a la inhibición del crecimiento del hielo. La observación de que el crecimiento del hielo puede detenerse por completo en condiciones de sobreenfriamiento (en el intervalo TH) indica que las IBP se unen irreversiblemente a la superficie del hielo. Si la unión fuera reversible, el hielo habría crecido en cualquier posición donde una molécula de IBP se desorbiera de la superficie. Sin embargo, esta descripción básica no explica la observación de que la TH medida de las IBP es una función de su concentración en solución, normalmente proporcional a la raíz cuadrada de la concentración (Wen y Laursen 1992b ). Si se descarta la suposición de irreversibilidad, tal proporcionalidad se puede respaldar suponiendo que la concentración superficial del IBP en el hielo es el resultado de un equilibrio entre la adsorción y la desorción de los IBP. Se han sugerido varios modelos de equilibrio, donde la densidad de IBP en la superficie del hielo es una función de la concentración de IBP en solución. La distancia entre moléculas se puede calcular a partir de la densidad superficial y se relaciona con la TH mediante la ecuación de GibbsThomson (Yeh y Feeney 1996); pero en algunos casos, la densidad superficial se relacionó con TH sin justificación (Jorov et al. 2004; Liu y Li 2006). La unión irreversible de IBP al hielo se probó mediante una serie de experimentos utilizando IBP marcados con fluorescencia (Celik et al. 2013; Drori et al. 2014b, 2015; Haleva et al. 2016; Meister et al. 2018; Pertaya et al. 2007b; Zepeda et al. 2008). La recuperación de la fluorescencia después del fotoblanqueo mostró que las moléculas de AFP tipo III se unen a la superficie de un cristal de hielo y no se intercambian con la proteína circundante en solución durante 20 h de observación. Este hallazgo condujo a la estimación del IBPice más rápido Machine Translated by Google 4 EstructuraFunción de los IBP y sus interacciones con el hielo 93 Fig. 4.6 Cristal de hielo en un dispositivo microfluídico. ( a ) Una ilustración de un cristal de hielo recubierto por IBP etiquetados con GFP en un canal de microfluidos. ( b – c ) Imágenes de un cristal de hielo recubierto con AFP tipo III marcada con GFP en el canal de microfluidos. El color verde es la señal fluorescente de la proteína marcada con GFP. (b) El cristal de hielo se mantiene en una solución que contiene proteína. El cristal es más oscuro que la solución porque no contiene proteína en su interior. (c) El mismo cristal en b después de lavar la solución de proteína del canal de microfluidos. La proteína marcada permanece unida a la superficie del hielo. Reimpreso (adaptado) con permiso de (Drori et al. 2015) Copyright (201 sociedad Química Americana la tasa de desfase es una semana1 y la más lenta es infinito, esencialmente unión cuasipermanente (Pertaya et al. 2007b). Los experimentos en dispositivos de microfluidos que permiten el intercambio de la solución alrededor de los cristales de hielo brindaron más apoyo para la unión irreversible. Los cristales de hielo recubiertos con IBP se lavaron de manera que la solución alrededor de los cristales se reemplazó con una solución que casi no contenía proteínas. Se demostró que la señal de fluorescencia de las superficies de hielo no se redujo después del lavado (Fig. 4.6) (Celik et al. 2013; Drori et al. 2014b, 2015). Más aún, la histéresis de congelación por AFP hiperactiva (TmAFP) se mantuvo incluso cuando las únicas proteínas en el sistema estaban en la superficie del hielo y no en la solución. En dos situaciones en las que se permitió que los IBP marcados con fluorescencia se acumularan en una superficie de cristal de hielo, después de lo cual se forzó el crecimiento de hielo en el sistema, la señal de fluorescencia se perdió o se redujo. Con una mezcla de AFGP 4 a 6 (70 % AFGP 6) que se marcaron en el extremo N con isotiocianato de fluoresceína, la fluorescencia en la superficie del hielo desapareció cuando una capa de hielo cubrió el área. Machine Translated by Google M. BarDolev et al. 94 que estuvo expuesto a las AFP (Zepeda et al. 2008). Sin embargo, con los IBP hiperactivos, aunque la fluorescencia de sus etiquetas GFP se redujo considerablemente cuando una capa de hielo cubrió el área donde se había acumulado la proteína, la señal de fluorescencia regresó cuando la capa de hielo recién formada se derritió hasta el punto de acumulación ( Haleva et al.2016 ). La explicación más probable para este fenómeno es que el crecimiento excesivo de hielo causó suficiente distorsión del fluoróforo de la proteína como para estropear su fluorescencia, y que cuando el hielo se derritió, se alivió la tensión estructural en la fracción GFP y se restableció la fluorescencia. Parece poco probable que esta misma explicación pueda explicar la pérdida de fluorescencia cuando el área AFGP marcada estaba cubierta de hielo. Si bien este experimento podría sugerir que los AFGP son aglutinantes reversibles, también podría indicar que bajo la condición de crecimiento del hielo utilizada en ese experimento, los AFGP fueron empujados fuera del hielo en lugar de crecer demasiado. Por el contrario, otros experimentos con AFGP respaldan su unión irreversible al hielo (Meister et al. 2018). En general, estos resultados ofrecen apoyo adicional para la unión irreversible de las AFP hiperactivas y sugieren también la unión irreversible de otras IBP. La unión irreversible de las IBP al hielo es la base para la purificación por afinidad con el hielo (Adar et al. 2018; Garnham et al. 2010; Kuiper et al. 2003; Marshall et al. 2004b, 2016), el grabado en hielo (Knight et al. 1991, 2001) y la modificación FIPA del grabado en hielo (Basu et al. 2014; Garnham et al. 2010). En estos métodos, el hielo crece lentamente en soluciones de IBP, alrededor de dedos fríos o en una capa de hielo formada alrededor de un matraz de fondo redondo (Marshall et al. 2016), o en una placa fría vertical sobre la que fluye la solución ( Adar et al. 2018). El frente de hielo de crecimiento lento rechaza todos los solutos excepto los IBP que se incorporan a él. Por lo tanto, la unión de las IBP al hielo les permite resistir el rechazo de las capas de hielo en crecimiento. En general, los resultados experimentales indican que la mayoría de los IBP, al menos los moderados e hiperactivos, se unen irreversiblemente a las superficies de hielo. Para conciliar el concepto de unión irreversible del hielo con la dependencia de la TH de la concentración de la solución de proteína, Kristiansen y Zachariassen sugirieron un modelo de unión de dos pasos. En el primer paso, las densidades superficiales de las proteínas se equilibran cerca del punto de fusión en la interfase aguahielo. Al enfriarse, las IBP se “bloquean” en su posición sobre la superficie del hielo (Kristiansen y Zachariassen 2005). Sin embargo, esta explicación no tiene apoyo experimental. Por ejemplo, se demostró que además de detener el crecimiento del hielo, los IBP también inhiben el derretimiento del hielo (Celik et al. 2010; Cziko et al. 2014; Knight y DeVries 1989). Por lo tanto, el superenfriamiento no es necesario para "bloquear" las moléculas de IBP en las superficies de hielo, y el modelo de irreversibilidad es relevante a temperaturas cercanas al punto de fusión. Además, las mediciones de fluorescencia mostraron que las IBP se acumulan en la superficie del hielo a temperaturas inferiores al punto de fusión (Drori et al. 2014a, 2015; Haleva et al. 2016; Takamichi et al. 2007; Zepeda et al. 2008). Conceptos recientes sugieren que la coexistencia de la unión irreversible y la dependencia medida de la TH de la concentración de la solución de proteínas están relacionadas con la cinética de la unión de las IBP a las superficies de hielo, como se analiza en la próxima sesión sobre la cinética de unión de las IBP al hielo. Machine Translated by Google 4 EstructuraFunción de los IBP y sus interacciones con el hielo 95 4.12 La dinámica de la vinculación Si la TH proviene de un fenómeno superficial, se debe esperar que la dinámica del proceso de adsorción tenga un papel crucial (Burcham et al. 1986; Kubota 2011). Primero se intentaron experimentos para detectar la acumulación de AFGP en superficies de hielo mediante elipsometría y arrojaron evidencia de que existe una escala de tiempo de minutos para la acumulación de AFGP en superficies de hielo (Wilson 1993 ). Chapsky y Rubinsky utilizaron una medición de TH unidireccional basada en capilares de AFP tipo I para evaluar la naturaleza dinámica de la actividad de TH. En estos experimentos, se controló la propagación del hielo en los capilares en un gradiente de temperatura controlada. Los autores descubrieron que, en presencia de las AFP, el hielo deja de crecer a una temperatura justo por debajo del punto de fusión y vuelve a crecer a temperaturas más bajas. Este sobreenfriamiento adicional necesario para el crecimiento dependía del tiempo. El TH aumentó con el tiempo hasta cinco veces cuando el hielo se mantuvo a temperaturas por debajo del punto de fusión durante una hora sin crecimiento. Los autores concluyeron que la dependencia del tiempo observada es demasiado lenta para ser limitada por la cinética de unión, y que el aumento de TH fue el resultado de la reorganización de la superficie del hielo y las proteínas que se unen a ella (Chapsky y Rubinsky 1997) . Se descubrió que el largo tiempo de incubación de los cristales de hielo en soluciones de AFP tipo III en un osmómetro de nanolitros aumenta la histéresis térmica hasta 2,5 veces durante un período de 2 h si el cristal se mantiene a un sobreenfriamiento alto (cerca del punto de congelación) (Takamichi et al. 2007). La figura 4.7a representa el curso de un experimento de este tipo utilizando un osmómetro de nanolitros. Se encontró una dependencia del tiempo mucho más fuerte para las AFP hiperactivas, como se muestra en la Fig. 4.7b (Braslavsky y Drori 2013; Drori et al. 2014a; Xiao et al. 2014). Cuando se permitió que el cristal se incubara justo por debajo del punto de fusión durante ~ 16 h en una solución de AFP hiperactiva, la TH aumentó 40 veces sobre el valor obtenido después de solo unos segun (Figura 4.7b). Por el contrario, las AFP moderadas, como la AFP tipo III, lograron la mayor parte de su actividad completa incluso con tiempos de exposición cortos de unos pocos segundos (Drori et al. 2014a; Takamichi et al. 2007). La diferencia en la respuesta dinámica entre las AFP hiperactivas y moderadas también se mostró en experimentos de sonocristalización, en los que una solución de IBP de 1 ml se enfrió a varios grados por debajo del punto de fusión antes de nuclearla mediante un pulso acústico. Después de la nucleación, la solución se estabilizó a una temperatura inferior al punto de fusión y la diferencia con el punto de fusión se determinó como TH. Se demostró que los valores de TH de la AFP tipo III eran similares cuando se midieron con un osmómetro de nanolitros y sonocristalización, pero la AFP hiperactiva tenía valores de TH muy pequeños en el ensayo de sonocristalización en comparación con el osmómetro de nanolitros (Olijve et al. 2016) . Las mediciones de la señal de fluorescencia de las IBP marcadas en cristales de hielo permiten determinar sus tasas de acumulación, así como la identificación de los planos en los que se reúnen las IBP (Celik et al. 2010; Drori et al. 2014a, b, 2015; Haleva et al . 2016 ) . ; Kaleda et al. 2019; Pertaya et al. 2008). Se demostró que las AFP hiperactivas como TmAFP, sbwAFP, MpIBPRIV y RiAFP se acumulan en el plano basal de los cristales de hielo, además de en otros planos. Para algunas de las AFP hiperactivas, la acumulación continúa durante horas, sin un punto final claro (Drori et al. 2014a, b; Haleva Machine Translated by Google M. BarDolev et al. 96 Fig. 4.7 Dependencia del tiempo de la actividad de TH. ( a ) Representación del procedimiento experimental realizado con un osmómetro de nanolitros. ( b ) TH en función del tiempo de exposición para una solución de 4 μM (círculos abiertos) y 8 μM (cuadrados rellenos) sbwAFP recocido a 0,05 C por debajo del punto de fusión (Modificado de (Drori et al. 2014a)) . (c) TH en función del tiempo de exposición para una solución de 100 μM de AFP tipo III (nfeAFP) recocida a 0,25 C (círculos rellenos) o 0,05 C (círculos abiertos) por debajo del punto de fusión (reimpreso de (Takamichi et al. . 2007) .Copyright (2007) WILLEY) et al. 2016; Pertaya et al. 2008). Para ajustar la intensidad de la fluorescencia en función de una escala de tiempo que va desde unos pocos segundos hasta una hora, fueron necesarios tres exponentes (Drori et al. 2014a). Por el contrario, la acumulación de AFP moderadas en planos no basales se ajusta a un solo exponente, con una constante de tasa de Kon ¼ 0,008 μM1 S1 . Usando esta constante de velocidad, podemos calcular para una solución con una concentración de AFP de C ¼ 50 μM, por ejemplo, un tiempo típico para la acumulación de proteínas como τ ¼ CKen ¼ 2:5 s: Por lo tanto, la débil dependencia observada de TH Machine Translated by Google 4 EstructuraFunción de los IBP y sus interacciones con el hielo 97 de AFP tipo III en tiempos de exposición mucho más prolongados probablemente no esté relacionado con la tasa de acumulación de las proteínas en la superficie del hielo (Drori et al. 2014a). Una teoría desarrollada por Knight y DeVries basada en experimentos sobre crecimiento de hielo en presencia de AFGP da una buena explicación de la dependencia de TH de la concentración de AFP tipo III (Knight y DeVries 2009 ). De acuerdo con esta teoría, el límite de TH está determinado por la capacidad de la AFP para bloquear cinéticamente el hielo nuevo que crece en la cara desprotegida del cristal de hielo, típicamente el plano basal para las AFP moderadamente activas. Las AFP se unen irreversiblemente al prisma de hielo y los planos piramidales, pero se necesitan AFP adicionales en solución para inhibir un mayor crecimiento que pueda emerger del plano basal. De acuerdo con esta teoría, los experimentos de Drori et al. El uso de AFP tipo III en dispositivos de microfluidos mostró que cuando la solución alrededor de los cristales de hielo unidos a proteínas se intercambió con una solución que contenía solo trazas de proteínas, las proteínas originalmente unidas permanecieron en el hielo (Fig. 4.6), pero la TH se redujo un poco ( Drori et al. 2015). Si la dependencia de la concentración de la solución observada proviene de la tasa de adsorción de IBP y no de la densidad de la proteína acumulada en la superficie del hielo, la dependencia de la raíz cuadrada observada de la concentración de la solución en TH sigue siendo una pregunta abierta. Sander y Tkachenko desarrollaron una teoría de fijación cinética para la inhibición del crecimiento de hielo por parte de los IBP. Asumieron que la unión es irreversible, con la opción de que las proteínas sean engullidas por el hielo en crecimiento si el ángulo de contacto entre el hielo y la proteína se vuelve demasiado grande. Bajo estas suposiciones, demostraron que para una cierta concentración de proteína y sobreenfriamiento, la velocidad del crecimiento del hielo se detiene. Obtuvieron una relación de raíz cuadrada entre la TH y la concentración de proteína (Sander y Tkachenko 2004). La combinación de las teorías de Sander y Knight brinda una explicación plausible de los hallazgos experimentales para los IBP moderados que no se unen a los planos basales del hielo. Sin embargo, existe una clara evidencia experimental de que las AFP hiperactivas se unen a los planos basales e inhiben su crecimiento, como se analiza en la Secc. 4.4. También se demostró que la TH de las AFP hiperactivas no disminuía cuando no había proteína en solución (Celik et al. 2013), a diferencia de la AFP tipo III (Drori et al. 2015). La observación de que la TH aumenta con tiempos más largos de exposición del hielo a las proteínas (Drori et al. 2014a), la insensibilidad de la TH a la concentración de proteína en solución (Celik et al. 2013), así como los largos tiempos de acumulación de AFP hiperactivas (Drori et al. 2014a; Haleva et al. 2016), llevó a la conclusión de que existe una conexión directa entre la concentración de proteína de superficie y la TH medida en el caso de AFP que se unen a los planos basales además del prisma aviones Es interesante señalar que, si bien la TH en función de la concentración de una variedad de AFP moderadas puede coincidir bien con el modelo de fijación cinética, no existe una buena coincidencia para las AFP hiperactivas (Chasnitsky y Braslavsky 2019; Kozuch et al . 2018). La estimación de la densidad superficial de las proteínas y la TH en función del tiempo está de acuerdo con la relación inversa básica entre TH y la distancia de las moléculas como en la ecuación de GibbsThomson. Aún así, las mediciones de TH se desvían del TH calculado usando esta ecuación. Drori et al. midió una distancia de unos pocos nanómetros entre moléculas de proteína unidas en una superficie de hielo (Drori et al. 2014b). La TH calculada para dicha concentración superficial es mucho mayor. este desacuerdo Machine Translated by Google M. BarDolev et al. 98 se observó antes y se especuló que estaba relacionado con el ángulo de contacto entre las proteínas y el hielo (Acker et al. 2001; Drori et al. 2014b; Higgins y Karlsson 2013; Karlsson et al. 2019; Mazur 1965). Otro aspecto en la evaluación de la relación entre la distancia de separación de las moléculas y la TH es la suposición arbitraria de que las proteínas están distribuidas uniformemente en la superficie del hielo. Esta suposición se puede modificar a una distribución aleatoria (HansenGoos et al. 2014). Si bien el avance en la comprensión de la actividad de los IBP es significativo, aún quedan muchos aspectos por explicar. Por ejemplo, ¿cuál es la disposición microscópica de los IBP en un plano de hielo en particular? ¿Por qué las AFP hiperactivas siguen acumulándose en la superficie del hielo durante tanto tiempo? ¿Qué determina los límites de inhibición de la recristalización? ¿Cuál es la correlación entre la inhibición de la recristalización del hielo y la TH? Para responder a estas y otras preguntas, se deben implementar enfoques experimentales adicionales con mayor resolución, junto con simulaciones elaboradas de hielo, agua e IBP. 4.13 Conclusiones Se han caracterizado IBP de muchos reinos biológicos. Nuevos IBP con estructuras novedosas esperan ser descubiertos, y el rango de sus actividades específicas y funciones naturales aún puede aumentar. Claramente, aún no hemos sondeado la complejidad de esta clase de proteínas. Muchas teorías sobre el mecanismo de unión al hielo de varios tipos de IBP han sido propuestas y descartadas mediante experimentos. En este capítulo, discutimos los avances en la comprensión de las estructuras de IBP y su mecanismo de reconocimiento de hielo, tanto para tipos específicos de IBP como para todos los IBP en general. El mecanismo más plausible que explica la forma en que los IBP interactúan con el hielo es el modelo de "agua de clatrato anclada". A pesar de las diferencias dramáticas entre los tipos de IBP, esta teoría se puede aplicar a todos los IBP. Sin embargo, la forma en que cada IBP retiene las moléculas de agua en su cara de unión al hielo y la cantidad de moléculas de agua en el clatrato pueden ser específicas del tipo. Agradecimientos Este trabajo fue apoyado por subvenciones de los Institutos Canadienses de Investigación en Salud (PLD) y la Fundación de Ciencias de Israel (IB). PLD ocupa la Cátedra de Investigación de Canadá en Ingeniería de Proteínas. Referencias Achenbach JC, Ewart KV (2002) Caracterización estructural y funcional de una proteína anticongelante tipo lectina tipo C del olor arcoíris (Osmerus mordax). Eur J Biochem 269:1219–1226 Acker JP, Elliott JAW, McGann LE (2001) Propagación de hielo intercelular: evidencia experimental de crecimiento de hielo a través de los poros de la membrana. Biophys J 81: 1389–1397 Adar C, Sirotinskaya V, Bar Dolev M, Friehmann T, Braslavsky I (2018) Afinidad del hielo de agua que cae purificación de proteínas fijadoras de hielo. Representante científico 8:11046 Machine Translated by Google 4 EstructuraFunción de los IBP y sus interacciones con el hielo 99 Antson AA, Smith DJ, Roper DI, Lewis S, Caves LSD, Verma CS, Buckley SL, Lillford PJ, Hubbard RE (2001) Comprender el mecanismo de unión del hielo por las proteínas anticongelantes tipo III. 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J Biol Chem 273:34806–34812 Machine Translated by Google Capítulo 5 Interacción de proteínas anticongelantes con agua Ilja Karina Voets y Konrad Meister 5.1 Introducción Controlar el crecimiento de cristales de hielo es un gran desafío científico con importantes ramificaciones tecnológicas para entornos tan diversos como campos petrolíferos, turbinas eólicas, superficies de carreteras y productos alimenticios congelados (Cochet y Widehem 2000; HassasRoudsari y Goff 2012; Koop y Zobrist 2009 ; Perfeldt et al., 2014; Tonelli et al. , 2015; Zeng et al. 2006). La cristalización del agua en hielo es aún más letal para la mayoría de los organismos y el proceso de recristalización del hielo al descongelarse es uno de los principales contribuyentes a la muerte celular (Briard et al. 2016; Chaytor et al. 2012; Huebinger et al . 2016 ) . Los organismos adaptados al frío que viven a temperaturas bajo cero han desarrollado una elegante solución macromolecular para hacer frente a este problema. Producen proteínas anticongelantes que reducen el punto de congelación del agua de manera no coligativa, lo que permite la supervivencia de una variedad de organismos en hábitats helados y subcongelados (DeVries 1971; DeVries y Wohlschlag 1969). Se cree que las proteínas anticongelantes actúan mediante un mecanismo de adsorcióninhibición en el que las proteínas reconocen y se unen irreversiblemente a una superficie de hielo y, por lo tanto, evitan un mayor crecimiento del cristal de hielo (Raymond y DeVries 1977) . Como resultado, el crecimiento del hielo se limita a las regiones entre los AF (G) P adsorbidos y, por lo tanto, el hielo se ve obligado a crecer en frentes curvos energéticamente desfavorables. Es votos IK Laboratorio de Materia Blanda Autoorganizada, Laboratorio de Química Macromolecular y Orgánica, Departamento de Ingeniería Química y Química, e Instituto de Sistemas Moleculares Complejos, Universidad Tecnológica de Eindhoven, Eindhoven, Países Bajos Correo electrónico: [email protected] K. Maestro (*) Departamento de Ciencias Naturales, Universidad de Alaska Sudeste, Juneau, AK, EE. UU. Departamento de Espectroscopía Molecular, Instituto Max Planck para la Investigación de Polímeros, Mainz, Alemania correo electrónico: [email protected]; Meisterk@mipmainz.mpg.de © Springer Nature Suiza AG 2020 H. Ramløv, DS Friis (eds.), Proteínas anticongelantes Volumen 2, https://doi.org/ 10.1007/9783030419486_5 109 Machine Translated by Google IK Voets y K. Meister 110 eventualmente conducirá a la terminación del crecimiento del cristal y una disminución del punto de congelación, un fenómeno que se conoce como el efecto Kelvin (Kristiansen y Zachariassen 2005). A diferencia de las máquinas hechas por el hombre, las proteínas de la naturaleza funcionan en agua líquida y dependen del papel activo del agua para determinar su estructura y funcionalidad. La idea de que el agua no es solo un espectador pasivo sino un actor activo en los procesos dinámicos de los biosistemas ha ganado terreno recientemente tanto en la experimentación como en la teoría. Se demostró que las proteínas necesitan una cantidad mínima de agua de hidratación para retener la actividad catalítica y que las moléculas de agua internas actúan como puentes entre diferentes residuos de proteínas (Careri et al. 1980; Levy y Onuchic 2006). Las moléculas de agua internas también contribuyen a la velocidad de plegamiento y la estabilidad de una proteína, mientras que la interacción desfavorable entre el agua y los grupos hidrófobos es una de las principales fuerzas impulsoras del plegamiento de proteínas (Dill 1990; Papoian et al. 2004 ) . Comprender la interacción sutil entre el agua y las biomoléculas es, por lo tanto, un requisito previo esencial para comprender su función y diseñar análogos sintétic Las proteínas anticongelantes juegan un papel extraordinario en el campo de las interacciones proteínadisolvente. Para cumplir con su tarea, las AFP deben reconocer y unir específicamente los cristales de hielo nacientes dentro del gran exceso de 55 M de agua líquida (Sharp 2011). A diferencia de otras proteínas, las AF(G)P no pueden utilizar diferencias químicas para impulsar la unión de ligandos. Son únicamente sensibles a las diferencias estructurales y/o dinámicas entre las dos fases del agua (hielo, agua), lo que podría decirse que es uno de los problemas de reconocimiento más notables en biología. 5.2 Estructuras de las proteínas anticongelantes La tarea específica de una proteína está determinada por su estructura tridimensional que se puede resolver con alta resolución mediante cristalografía de rayos X o espectroscopia de resonancia magnética nuclear (RMN). Tradicionalmente, las AFP se clasifican en AFP que no son de pescado y de pescado, que se subdividen en una clase de glicoproteínas anticongelantes (AFGP) y cuatro clases de proteínas anticongelantes (tipos I–IV). La subdivisión original de las AFP se basa en las diferencias en las secuencias de aminoácidos y las características estructurales. Los AFGP consisten predominantemente en una unidad repetitiva de tres aminoácidos (Ala AlaThr)n con el disacárido βDgalactosil(1–3)αDNacetilgalactosamina unido al oxígeno hidroxilo de cada residuo de treonina. Su masa molar varía entre 2,6 y 33,7 kDa, que corresponden a n = 4–50 repeticiones de la unidad de tripéptido glicosilado (Harding et al. 2003; Haridas y Naik 2013). Las AFGP se agrupan en ocho clases de tamaño en función de sus propiedades electroforéticas, siendo AFGP(1) la glicoproteína más grande y AFGP(8) la más pequeña (DeVries et al. 1970). Una versión simplificada de la clasificación divide los AFGP en versiones AFGP pequeñas (6–8) y AFGP grandes (1–5) . Hasta la fecha, las AFGP no se han cristalizado completamente con éxito y no se pueden expresar en líneas celulares, un aspecto que impide estudios sistemáticos de mutación y estructurafunción. No hay estructura de solución Machine Translated by Google 5 Interacción de proteínas anticongelantes con agua 111 disponibles para AFGP, ya que son polidispersos, flexibles y relativamente desordenados. Las otras cuatro clases de AFP de pescado son péptidos y proteínas pequeños sin azúcares adheridos. Las AFP de tipo I tienen estructuras αhelicoidales bien definidas y contienen secuencias de aminoácidos muy repetitivas. La AFP tipo I ampliamente investigada de la platija de invierno, por ejemplo, contiene una periodicidad de 11 residuos que es rica en alanina y treonina (Sicheri y Yang 1995). Las AFP tipo II y tipo III no son repetitivas y tienen un pliegue globular general. Las AFP de tipo II son proteínas ricas en cisteína de 11 a 24 kDa que se encuentran en peces muy divergentes (Osmerus mordax, Clupea harengus y Hemitripterus americanus). La caracterización estructural por RMN reveló que las AFP de tipo II son proteínas con estructura β con algunos puentes disulfuro (Nishimiya et al. 2008). Las AFP de tipo III son proteínas globulares de 7 kDa y 14 kDa que se encuentran en los estrechamente relacionados Macrozoarces americanus, Lycodichthys dearborni y Anarhichas lupus. Sus estructuras cristalinas se han determinado con alta resolución usando cristalografía de rayos X y RMN (Jia et al. 1996). Las AFP de tipo III a menudo se dividen además en isoformas de aminoetilo cuaternario (QAE) y sulfopropilo (SP) (Li et al. 1985), en función de su similitud de secuencia y punto isoeléctrico. Las isoformas QAE se adhieren a las resinas de intercambio iónico QAE Sephadex, mientras que las isoformas SP se adhieren a las resinas de intercambio iónico SP Sephadex. La AFP de tipo III más investigada de la faneca oceánica pertenece a las isoformas QAE (Lotze et al. 2014; Meister et al. 2014b). Las AFP de tipo IV tienen 12,3 kDa y se prevé que tengan una estructura de haz helicoidal. Solo se han descubierto en Myoxocephalus octodecimspinosis y su concentración en sangre es relativamente baja (Gauthier et al. 2008). Hoy en día, las proteínas anticongelantes no se limitan a los peces polares y se han identificado en insectos, plantas, hongos y diversos microorganismos (Duman 2001; Yeh y Feeney 1996). El motivo estructural más común en las AFP de artrópodos, hongos y bacterias es el pliegue del solenoide β. En MpAFP de Marinomonas primoryensis, CfAFP de Choristoneura fumiferana, TmAFP de Tenebrio molitor y LpAFP de Lolium perenne son los giros β formados por repeticiones regulares (Garnham et al. 2011; Leinala et al. 2002; Liou et al . 2000 ) . Por el contrario, en TisAFP del hongo del moho de la nieve Typhula ishikariensis, ColAFP de la bacteria Colwellia cepa SLW05 y LeAFP de la levadura Leucosporidium, los bucles tienen diferentes longitudes y están dispuestos en un orden irregular (Hanada et al. 2014; Kondo et al . 2012 ; Lee et al. 2012). Una hélice α se encuentra a lo largo del eje de la hélice β. Sin embargo, se encuentran otras estructuras de proteína de unión al hielo (IBP) en los insectos Rhagium inquisitor RiAFP e Hypogastrura harveyi (pulga de la nieve) SfAFP. La estructura de RiAFP y RmAFP1 del escarabajo Rhagium inquisitor y Rhagium mordax está formada por dos láminas β estrechamente empaquetadas (Hakim et al. 2013; Kristiansen et al. 2011, 2012). Se observan seis hélices izquierdas antiparalelas de poliprolina tipo II (PPII) en la estructura de SfAFP de la nieve (Pentelute et al. 2008). Al comparar la asombrosa variedad de estructuras asociadas con las proteínas anticongelantes (αhélices, βsolenoides, haces de cuatro hélices, haces de hélices de poliprolina tipo II y pequeñas proteínas globulares), queda claro que la naturaleza ideó una variedad de soluciones para cumplir con los requisitos. función común de adherirse al hielo. La diversidad estructural también apunta hacia orígenes evolutivos independientes y recientes en los diferentes reinos animales. En algunos casos, como los AFGP en el bacalao del Ártico y los nototenioides antárticos, las soluciones estructurales han evolucionado, Machine Translated by Google 112 IK Voets y K. Meister Fig. 5.1 Diferentes clases de proteínas anticongelantes en función de su estructura de unidad central y los códigos de acceso de la base de datos de proteínas (PDB) correspondientes. Los pliegues helicoidales α incluyen AFP tipo I de Pseudopleuronectes americanus (PDB: 1WFA); AFP tipo I de Myoxocephalus scorpius (PDB: 1Y03) y AFP1 maxi de Pseudopleuronectes americanus (PDB: 4KE2). Los pliegues globulares incluyen AFP tipo II de Clupea harengus (PDB: 2PY2) y AFP tipo III de Zoarces americanus (PDB: 1MSI). Las AFP βsolenoides de diferentes organismos: RiAFP de Rhagium inquisitor (PDB: 4DT5), CfAFP de Choristoneura fumiferana (PDB: 1M8N) y TmAFP de Tenebrio molitor (PDB: 1EZG) se encuentran en insectos. MpAFP se encuentra en la bacteria Marinomonas primoryensis (PDB: 3P4G), TisAFP8 en el hongo Typhula ishikariensis (PDB: 5B5H) y LpAFP proviene del raigrás Lolium perenne (PDB: 3ULT) que son virtualmente iguales (Chen et al. 1997). Además, los organismos adaptados al frío suelen producir AFP de diferentes clases estructurales o múltiples isoformas del mismo tipo (Fletcher et al. 2001; Griffith y Yaish 2004). La figura 5.1 ofrece una descripción general de las principales clases estructurales que se pueden encontrar entre las proteínas anticongelantes. La clasificación aquí se basa en la estructura de su unidad central. En comparación con las proteínas que no son anticongelantes, parece que la estabilización de las estructuras terciarias de AFP se basa menos en un núcleo hidrofóbico tradicional y más bien se realiza mediante conjuntos de enlaces de hidrógeno y disulfuro. 5.3 Estructura del sitio de unión de hielo A pesar de sus estructuras dispares, todas las AFP realizan funciones similares y comparten algunos rasgos característicos. La mayoría de las proteínas anticongelantes son relativamente pequeñas y tienen una parte activa que puede interactuar con el hielo. La parte funcional que se une a la superficie del hielo se conoce comúnmente como el sitio de unión al hielo (IBS) de la proteína (Strom et al. 2005). La extrema diversidad de motivos estructurales entre las AFP ha dificultado discernir qué características estructurales son importantes para unir al hielo. Los más comunes Machine Translated by Google 5 Interacción de proteínas anticongelantes con agua 113 Fig. 5.2 Sitios de unión al hielo de clases de proteínas anticongelantes estructuralmente diferentes. ( a ) SII de RiAFP ordenado altamente regular donde cuatro filas de residuos de treonina están dispuestas con un espacio de ~ 6.66 4.7 Å. ( b ) Vista superior del sitio de unión al hielo de AFP tipo III. El IBS parece aleatorio y contiene aminoácidos hidrofílicos e hidrofóbicos que son obligatorios para la actividad. ( c ) Sitio de unión al hielo de AFP tipo I de Pseudopleuronectes americanus. Se forma una única fila de residuos de treonina con un espacio entre residuos de 16,5 Å El enfoque experimental para identificar residuos de aminoácidos importantes del sitio de unión al hielo es a través de una combinación de medidas de mutagénesis e histéresis térmica como se describe en detalle en el Cap. 14 (Garnham et al. 2010). Por lo general, las mutaciones de aminoácidos que son esenciales para la unión del hielo dan como resultado una gran reducción de la actividad de histéresis térmica (Baardsnes et al. 1999; Hanada et al. 2014). Una segunda herramienta útil para identificar los sitios de unión al hielo ha sido hacer una alineación de secuencias de isoformas y ortólogas para un tipo particular de AFP (Kondo et al. 2012). Los residuos conservados normalmente son críticos para estabilizar el plegamiento de la proteína o están involucrados en su actividad de unión al hielo. Las características comunes de los sitios de unión de hielo conocidos son que son extensos, relativamente planos y algo hidrofóbicos. Además, rara vez contienen residuos cargados y, a menudo, tienen motivos repetitivos (Garnham et al. 2011; Liou et al. 2000; Sicheri y Yang 1995; Sun et al. 2014). En la Fig. 5.2, mostramos una descripción general de los sitios de unión al hielo de tres de las AFP más comúnmente investigadas. El sitio de unión al hielo de AFP tipo I está ubicado en el lado plano e hidrofóbico de la hélice y contiene una sola fila de residuos Thr ordenados con una separación de 16,5 Å. Este espaciado coincide bien con la repetición de 16,7 Å en el plano piramidal {2 0 2 1} (Baardsnes et al. 1999). La sustitución de treonina por serina (pérdida del grupo γmetilo) provocó una reducción de la actividad anticongelante, mientras que una mutación por valina (pérdida del grupo OH) tuvo poco efecto (Harding et al. 1999) . Este hallazgo sugiere inicialmente que el grupo γmetilo en lugar del enlace de hidrógeno del grupo OH de la treonina es importante para la unión al hielo. Sin embargo, las sustituciones de aminoácidos también pueden conducir a cambios conformacionales y, en el caso de la AFP tipo I, la conformación de hélice recta desaparece y cambia a la conformación más estable de una hélice retorcida, sin capacidad de unión al hielo (Chakraborty y Jana 2017; Ebbinghaus et al., 2017 ) . otros 2012). Los residuos de treonina también se encuentran ampliamente en los sitios de unión al hielo de la mayoría de los pliegues del solenoide β, donde normalmente están dispuestos en un orden notablemente alto. Por ejemplo, TmAFP y CfAFP tienen dos matrices de residuos Thr (Liou et al. 2000) que normalmente se denominan motivos de unión al hielo (ThrXThr). Del mismo modo, una fila de Thr Machine Translated by Google 114 IK Voets y K. Meister aparecen residuos y una fila de residuos Asx (principalmente Asn) en el IBS de MpAFP (Garnham et al. 2011). Las cadenas del lado Thr tienen la misma posición rotamérica y el espacio entre las cadenas laterales (7,4 4,6 Å) coincide con la red de hielo en el plano basal (7,83 4,52 Å) así como en el plano del prisma (7,35 4,52 Å). Además, la estructura cristalina de RiAFP del escarabajo Rhagium inquisitor y la estructura putativa de Rhagium mordax mostraron cuatro en lugar de dos matrices de residuos de treonina con un espaciado de 6,66 4,73 Å, creando un amplio (ThrXThrXThr XThr) motivo (Friis et al. 2014; Hakim et al. 2013). Por el contrario, también se conocen ejemplos de sitios de unión de hielo sin estructura aparente, incluso en IBP con estructura de βsolenoide, como TisAFP, LpIBP y ColAFP (Hanada et al. 2014; Kondo et al . 2012; Lee et al. 2012). A pesar de esta falta de regularidad en el SII, estas proteínas pueden unirse tanto al plano basal como al del prisma. En contraste con los sitios de unión al hielo altamente regulares (ThrXThr) de las AFP del pliegue del solenoide β, está el sitio de unión al hielo AFP tipo III. El SII de las AFP de tipo III tiene una composición de aminoácidos imparcial con residuos hidrofóbicos e hidrofílicos (Garnham et al. 2010). Se compone además de dos regiones situadas en un ángulo de aproximadamente 150 entre sí. Uno se une al plano del prisma primario de hielo; el otro un plano piramidal (Garnham et al. 2010). Sorprendentemente, muchas estructuras cristalinas de AFP también revelaron capas de agua ordenadas asociadas con el sitio de unión del hielo que se cree que desempeñan un papel obligatorio en la unión del hielo (Garnham et al. 2011; Hakim et al. 2013; Sun et al. 2015). 5.4 Comportamiento en solución de las proteínas anticongelantes Las estructuras de resolución atómica de las AFP proporcionan pistas importantes sobre sus estructuras y los determinantes de la unión del hielo. Sin embargo, estudiar solo la estructura de difracción de rayos X de los cristales congelados instantáneamente suprime fuertemente cualquier información dinámica o interacción de solvente de la proteína de interés. Por lo tanto, estudiar la estructura y el comportamiento de las AFP en condiciones cercanas a su entorno natural es crucial para descifrar la función de estos sistemas extraordinarios. Los estudios espectroscópicos de dicroísmo circular (CD) e infrarrojos (IR) revelaron que la estructura de DAFP1 de Dendroides canadensis en solución acuosa es similar a la estructura tridimensional modelada (Li et al. 1998) . Bajar la temperatura de la solución cerca de la temperatura de trabajo biológica relevante condujo aún más a un ligero aumento en el orden estructural y la rigidez de la hélice βsolenoide. También se encontraron soluciones similares y estructuras cristalinas para TmAFP y CfAFP usando técnicas de RMN (Daley et al. 2002). Además, las cadenas laterales conservadas, como los residuos de treonina del plano de unión del hielo, también revelaron una mayor rigidez al bajar la temperatura (Daley y Sykes 2004). La dispersión de rayos X de ángulo pequeño (SAXS) reveló que el hypAFP1 adopta una forma cilíndrica larga en solución, excluyendo la posibilidad de un dímero helicoidal completamente extendido en solución y revisando el modelo estructural original de un SII plano rico en treonina que se extiende a lo largo del proteína (Olijve et al. 2013). Machine Translated by Google 5 Interacción de proteínas anticongelantes con agua 115 La espectroscopia infrarroja bidimensional (2DIR) reveló la prevalencia del carácter de hoja β en la respuesta de amida I de acuerdo con la estructura cristalina de AFP tipo III (Lotze et al. 2014) . Las rápidas fluctuaciones conformacionales independientes de la temperatura de la hoja β de la proteína sugirieron además que la proteína permanece relativamente flexible incluso a baja temperatura. Esta noción es corroborada por la ausencia de elementos de estructura secundaria detectables por espectroscopía de CD, mientras que la estructura de rayos X con dinámica fuertemente suprimida revela un pliegue compacto con dos láminas β, un puente β y dos pequeñas hélices (Lotze et al. 2014). Se ha utilizado una variedad de técnicas para estudiar la conformación de la solución de los AFGP, incluidos CD, Raman, Fourier Transform Infrared (FTIR) y espectroscopia de RMN, así como técnicas de dispersión de luz (Feeney et al. 1986; Tsvetkova et al . 2002). Los primeros espectros de CD en AFGP sugirieron una estructura de bobina aleatoria extendida en solución. Los estudios de seguimiento que utilizaron una combinación de experimentos de RMN y CD propusieron una conformación helicoidal levógira que es similar a una hélice de poliprolina II (Franks y Morris 1978). Otros estudios de CD, dispersión de luz cuasielástica y espectroscopia Raman sugirieron la presencia de algunos elementos estructurales plegados en AFGP1–5 (Bush et al. 1981; Feeney et al. 1986). Para los AFGP de bajo peso molecular, los experimentos de RMN revelaron que la estructura general depende de la temperatura. A temperaturas más altas, los AFGP mostraron una formación de espiral aleatoria que se transformó en una hélice PPII zurda de tres pliegues a temperaturas más bajas (Bush y Feeney 1986). Hasta ahora, la estructura de la solución definitiva de los AFGP sigue siendo un tema de intenso debate y estudios más recientes incluyen efectos como el sobreenfriamiento, las interacciones proteínaagua o la presencia de cristales de hielo al descifrar la conformación de la solución absoluta de AFGP (Groot et al. 2016) . ; Tsvetkova et al. 2002; Uda et al. 2007). 5.4.1 Interacción de proteínas anticongelantes con agua La interacción con las aguas circundantes afecta la estructura, la estabilidad y la actividad de muchas, si no todas, las proteínas (Dill y MacCallum 2012; Thirumalai et al. 2012). Naturalmente, la interacción con el agua y el hielo ha sido durante mucho tiempo un punto focal de la investigación sobre las proteínas anticongelantes. En las siguientes secciones, abordaremos estudios experimentales y teóricos recientes sobre la hidratación de proteínas anticongelantes y su relación con su actividad. 5.4.1.1 Modelo de adsorcióninhibición Los anticongelantes comunes, como el etilenglicol, las sales y el etanol, reducen el punto de congelación Tf de forma coligativa. Esta depresión coligativa del punto de congelación ΔTf ¼ KF b I es proporcional a la osmolalidad de la solución b, y no depende del tipo de anticongelante. Por el contrario, en presencia de hielo, las proteínas anticongelantes reducen el punto de congelación por histéresis (hFP) de forma no coligativa, lo que es mucho más Machine Translated by Google IK Voets y K. Meister 116 eficaz. Una solución de etanol en agua 1 mM da ΔTf ~0,002 C, mientras que una solución de AFP tipo III 1 mM da hFP ¼ 0,6 C: un efecto 300 veces mayor. Para explicar este gran impacto no coligativo de las AF(G)Ps en el crecimiento de los cristales de hielo, Raymond y DeVries introdujeron un modelo de adsorcióninhibición (Raymond y DeVries 1977). En pocas palabras, este modelo de fijación de pasos propone que las proteínas anticongelantes se unan a los cristales de hielo nacientes en el camino de un paso de crecimiento de manera irreversible. Por lo tanto, las AF(G)Ps permanentemente unidas obligan al hielo a crecer entre los sitios de unión. Por encima de un umbral de cobertura superficial; es decir, por debajo de una separación crítica entre las proteínas unidas, la curvatura del frente de hielo en crecimiento aumenta, lo que reduce el punto de congelación local a través del efecto GibbsThomson o Kelvin (Kristiansen y Zachariassen 2005) . Esto genera un intervalo de temperatura bajo cero entre el punto de congelación por histéresis y el punto de congelación de la solución sin AF(G)Ps (Tf), en el que los pasos están inmóviles y se detiene el crecimiento de hielo adicional. Esto se conoce como brecha de histéresis de congelación (Cziko et al. 2014). Asimismo, el punto de fusión se eleva en presencia de AF(G)Ps, lo que genera una histéresis de fusión entre el punto de fusión por histéresis (hMP, en presencia de proteínas anticongelantes) y el punto de fusión (Tm) en ausencia de AF (G)Ps (Celik et al. 2010; Cziko et al. 2014; Knight y DeVries 1989). La brecha de histéresis térmica (TH) es la suma de las brechas de histéresis de fusión y congelación (Cziko et al. 2014; Knight y DeVries 1989), es decir, la diferencia entre el punto de fusión y congelación. La magnitud de la brecha de TH depende del tipo y la concentración de la proteína anticongelante, el tamaño del cristal de hielo y otros parámetros, y puede ser tan grande como 6 C para algunas AFP según lo determinado por crioscopia de nanolitros (Drori et al. 2014; Takamichi et al . al. 2007; Zachariassen et al. 2002). 5.4.1.2 Los estudios computacionales predicen una hidratación inusual similar al hielo en el sitio de enlace de hielo Está bien establecido que la unión del hielo es un requisito previo para la depresión del punto de congelación no coligativa por las (gluco)proteínas anticongelantes, pero los detalles moleculares de cómo y por qué las AF(G)P se unen al hielo siguen siendo una cuestión sin resolver hasta la fecha. Los primeros estudios sugirieron que las AFP pueden perturbar la estructura y/o la dinámica de una gran fracción de aguas, reduciendo significativamente la cantidad de agua que podría unirse a la red de hielo y, por lo tanto, congelarse (DeVries 1971; DeVries et al. 1970 ) . Esta hipótesis se demostró inválida mediante experimentos de RMN, que mostraron que solo pequeñas cantidades de agua se unían a la superficie (Haschemeyer et al. 1977). Los grandes avances en el poder computacional y los algoritmos de dinámica molecular permitieron simulaciones de Dinámica Molecular (MD) en AFP en modelos solventes explícitos, lo que condujo a una explicación alternativa para la actividad de las proteínas anticongelantes: una hidratación inusual similar al hielo en el sitio de unión del hielo. Sharp y sus colaboradores monitorearon la hidratación de las AFP de tipo I y tipo III de peces mutantes y salvajes mediante el estudio de las funciones de distribución del ángulo del enlace de hidrógeno aguaagua obtenidas de las simulaciones MD como se muestra en la Fig. 5.3 (Gallagher y Sharp 2003a ; Yang y Sharp 2004 , 2005). La distribución es bimodal en el primer Machine Translated by Google 5 Interacción de proteínas anticongelantes con agua 117 Fig. 5.3 Descripción de la función de distribución del ángulo del enlace de hidrógeno aguaagua en simulaciones MD. (a) Disposición tetraédrica en la red de hielo Ih. (b) Definiciones geométricas para un par de moléculas de agua: r es la distancia entre los dos átomos de oxígeno, θ es el menor de los cuatro ángulos H–O–O y φ es el ángulo H–O–O correspondiente más pequeño del otro. molécula de agua. ( c ) La función de distribución del ángulo del enlace de hidrógeno aguaagua para la primera capa de hidratación de AFP III. El pico de ángulo bajo corresponde a la disposición de agua similar al hielo. Cifras adaptadas de Sharp et al. (Sharp y Vanderkooi 2010) y Smolin et al. (Smolin y Daggert 2008) capa de hidratación, con una población de ángulo bajo y alto centrada alrededor de ~10 (disposición de agua similar al hielo) y ~50 en agua pura, respectivamente. El parámetro de orden tetraédrico corresponde a la relación de las probabilidades máximas de las dos poblaciones, que es ~27 % en agua pura. Los solutos que inducen la estructuración del agua aumentan en gran medida el parámetro de orden tetraédrico en relación con este valor (Gallagher y Sharp 2003b; Sharp y Vanderkooi 2009). Se observaron pequeñas diferencias en el parámetro de orden tetraédrico de las aguas cercanas y alejadas del SII de las AFP de tipo salvaje. Las aguas asociadas con el SII eran más tetraédricas y parecidas al hielo. Por el contrario, las aguas sin SII eran menos tetraédricas y más heterogéneas. Además, la firma tetraédrica estuvo ausente para los mutantes menos activos (o inactivos), lo que sugiere que la hidratación similar al hielo es importante para la actividad y puede facilitar la unión de las AFP al hielo. Una serie de simulaciones recientes confirman la observación anterior de aguas heladas en la primera capa de hidratación en las proximidades del SII de AFP de tipo I y tipo III de peces de tipo salvaje (Chakraborty y Jana 2017; Sharp 2014; Smolin y Daggett 2008 ; Wierzbicki et al. 2007). En este documento, la tetraedricidad se cuantifica de manera diferente, sobre la base de un parámetro de tetraedricidad θ. El parámetro de tetraedricidad mide la desviación de un tetraedro de uno ideal, lo que simplifica la distinción entre agua "a granel" y "como hielo" (Smolin y Daggett 2008 ). Los estudios experimentales (Liou et al. 2000) y de simulación (Yang et al. 2003) también han revelado aguas dispuestas regularmente en el SII de AFP βhelicoidales de insectos, como TmAFP. Yang et al. propusieron que estas aguas asociadas con el SII actúan como un "ligando" antes de la adhesión del hielo para facilitar el reconocimiento y la unión del hielo, pero finalmente se excluyen por razones entrópicas y estéricas (Yang et al. 2003) . Machine Translated by Google IK Voets y K. Meister 118 5.4.1.3 Las simulaciones de dinámica molecular revelan una doble función de la capa de hidratación y el derretimiento local del hielo Nutt y Smith se dieron cuenta de que la capa de hidratación alrededor de las proteínas β helicoidales tiene una doble función (Nutt y Smith 2008). Para adherirse al hielo y forzar un mayor crecimiento del hielo entre las proteínas unidas, las AF(G)P deben unir el hielo solo en el SII. En otros lugares, en el no SII, la congelación debe ser desfavorable para evitar la absorción de las AFP (Fig. 5.4). Los autores propusieron que las aguas en el IBS estén preconfiguradas en arquitecturas similares al hielo para promover el crecimiento del hielo en la región interfacial de 10 a 20 Å de espesor entre el hielo y el agua líquida (Nutt y Smith 2008) . Además, sugirieron que la ganancia entrópica asociada con este "mecanismo de cremallera" de aguas IBS preorganizadas que se fusionan con hielo conduce a una reducción suficientemente grande en la energía libre para inducir una unión casi irreversible. El modelo de adsorcióninhibición propuso que la unión irreversible de AF(G)Ps al hielo da como resultado una curvatura convexa del frente de hielo que crece entre las proteínas unidas. En los últimos años, varios grupos han estudiado experimentalmente si las AF (G) P se unen al hielo de manera irreversible y cuándo (Celik et al. 2013; Pertaya et al. 2007). Pero, hasta la fecha, ha sido imposible examinar la topología de la interfaz hielo/agua con suficiente resolución espacial para determinar si el frente de hielo en crecimiento entre las AF(G)Ps unidas a la superficie es realmente cóncava o no. Sin embargo, las simulaciones MD con solvente explícito pueden abordar esta pregunta abierta. Todd et al. se centró específicamente en el impacto de CfAFP (Todde et al. 2014) y AFP tipo I en la interfaz hieloagua (Todde et al. 2015), y observó el desarrollo de una curvatura cóncava en los planos de adsorción estables. Curiosamente, CfAFP desencadenó la fusión local en los planos bipy ramidal y prisma en los que las AFP no se adsorben. Futuros estudios sobre otros Fig. 5.4 Representación esquemática del mecanismo de fijación del hielo propuesto por Nutt et al. (a) Las AFP han pedido agua similar al hielo en el sitio de unión del hielo, mientras que el agua de hidratación en las regiones que no se unen está más distorsionada. (b) Superposición del agua de hidratación ordenada de AFP con la capa de hidratación de la superficie del hielo. ( c ) Unión de la AFP a la superficie del hielo. La interrupción de la estructura del agua alrededor del resto de la proteína evita que el hielo cubra la AFP. Figura adaptada de Nutt et al. (Nutt y Smith 2008) Machine Translated by Google 5 Interacción de proteínas anticongelantes con agua 119 Las AFP revelarán si se trata de un fenómeno general o, por el contrario, depende, por ejemplo, del tipo de AF(G)P. 5.4.1.4 La difracción de rayos X y de neutrones revela una hidratación ordenada Aguas en Cristales de Proteínas Anticongelantes La difracción de rayos X (XRD) y la difracción de neutrones (ND) han ofrecido una gran cantidad de información sobre la estructura y la hidratación de las proteínas anticongelantes de varias clases con detalles atomísticos (Garnham et al. 2011; Howard et al. 2011; Sun et al . 2015, 2014). Un estudio de ND sobre AFP tipo III de Zoarces americanus reveló una interacción de enlace de hidrógeno entre un residuo de treonina dentro del SII (Thr18) y un grupo de agua tetraédrico con una coincidencia estructural con el plano del prisma primario de hielo (Howard et al. 2011) . La estructura XRD de TmAFP mostró una coincidencia de red entre una matriz ordenada de moléculas de agua, espaciadas a una distancia de 4,64 0,20 Å, en las proximidades de las treoninas expuestas en la superficie (Liou et al. 2000) . Se encontró una coincidencia reticular similar entre decenas de aguas unidas al MpAFP helicoidal β y los planos de prisma primario y basal del hielo (Garnham et al. 2011). La pregunta candente que estos estudios no pudieron responder es si las aguas superficiales unidas actúan como "pegamento" que une el SII y el hielo como un "ligando" intermediario o si, por el contrario, se liberan antes o durante la unión del hielo. Sin embargo, esta distinción entre escenarios mecánicos podría hacerse para la AFP hiperactiva tipo I inusualmente grande de Pseudopleuronectes americanus (Fig. 5.5), que se conoce como “Maxi”. Sorprendentemente, se ensambla en un haz dimérico de cuatro hélices, con sus residuos de unión al hielo apuntando hacia adentro para coordinarse con dos redes polipentagonales de aguas interiores que se cruzan (Sun et al. 2014) . Por lo tanto, el IBS de los monómeros en el dímero no puede contactar directamente con la red de hielo en crecimiento. Sin embargo, los Maxidímeros permanentes obtenidos por reticulación química son activos. Por lo tanto, Maxi no necesita desmontarse ni liberar sus aguas preorganizadas para permitir la unión del hielo, lo que sugiere que, en cambio, la unión está mediada por las aguas ordenadas asociadas a la superficie (Sun et al. 2014 ). Actualmente se debate si Maxi sirve como una proteína anticongelante en su pez huésped. 5.4.1.5 Los estudios experimentales sobre la capa de hidratación revelan diferencias Entre clases de AFP Los cristales de alta calidad para XRD no se pueden cultivar a partir de soluciones de glicopéptidos anticongelantes, ya que se trata de macromoléculas flexibles. En cambio, la información estructural se ha obtenido a partir de estudios detallados de RMN. Estos proporcionaron información cuantitativa sobre la fracción de aguas superficiales, que resultó ser modesta; es decir, demasiado pequeño para racionalizar la depresión del punto de congelación inducida por AFGP en términos de una reducción significativa en la cantidad de agua no perturbada disponible para congelación (Feeney et al. 1986). Machine Translated by Google 120 IK Voets y K. Meister Fig. 5.5 Aguas de hidratación inusuales en la estructura cristalina de la gran AFP hiperactiva de tipo I. La proteína comprende una hélice dimérica de cuatro. El IBS tentativo apunta hacia adentro y está coordinado con más de 400 moléculas de agua semiclathrate dispuestas en dos redes polipentagonales insectos que se extienden desde el interior hasta la superficie exterior de la proteína. Figura adaptada de Sun et al. (2014) Para probar el movimiento colectivo de la red de agua y evaluar si, como sugieren los estudios XRD y ND, las aguas tetraédricas que median la unión del hielo están presentes en la capa de hidratación de las AFP en solución, se realizó una serie de experimentos espectroscópicos avanzados. Espectroscopia de absorción de terahercios (THz) en AFGP (Ebbinghaus et al. 2010), AFPI (Ebbinghaus et al. 2012), AFPIII (Xu et al. 2016) y β helicoidal DAFP1, un homólogo estructural de TmAFP (Meister et al. 2013, 2014a), reveló un impacto significativo en la dinámica de la capa de hidratación, presumiblemente correlacionada con la actividad de AFP. También se observó una capacidad significativa para influir en la estructura de enlaces de hidrógeno de una gran cantidad de moléculas de agua para AFP tipo III usando una combinación de espectroscopia FTIR en la configuración de reflexión total atenuada y resolución de curva de automodelado (Sun y Petersen 2017 ) . Por el contrario, no se encontró evidencia de hidratación inusual en las mediciones de dispersión de relajación magnética de 17O en TmAFP (Modig et al. 2010). Estos sondean selectivamente el movimiento de rotación y la cinética de intercambio de las moléculas de agua internas y la capa de hidratación externa. Tampoco se encontró evidencia de hidratación inusual en experimentos infrarrojos de femtosegundos resueltos por polarización de isoformas AFGP pequeñas y grandes (Groot et al. 2016). Aquí se demostró que la dinámica del agua cerca de las superficies AFGP es bastante similar a la dinámica del agua cerca de las proteínas y los azúcares que no son anticongelantes, y que la mayoría de las moléculas de agua que se reorientan lentamente son ralentizadas por la columna vertebral del péptido AFGP (Groot et al. 2016) . ). Estos hallazgos están en línea con los experimentos de viscosidad, difusión traslacional y RMN (Feeney et al. 1986), que indican que los AFGP afectan una can Machine Translated by Google 5 Interacción de proteínas anticongelantes con agua 121 Fig. 5.6 Observación directa de agua helada en la superficie de la proteína de AFP tipo III mediante experimentos VSFG. El espectro VSFG de la interfase aireagua (negro) consiste en una banda ancha entre ~3200 y ~3450 cm1 asignada al agua líquida unida por hidrógeno y un pico agudo en ~3700 cm1 que se asigna a los grupos OH colgantes que sobresalen de la superficie. El espectro VSFG de una solución de AFPIII (rojo) muestra características espectrales asociadas con las vibraciones CH de la proteína a frecuencias <3000 cm1 y un solo pico fuerte relativamente estrecho a 3200 cm1 asignado a la respuesta de capas de agua similares al hielo asociadas con la región de unión del hielo. El pico de agua similar al hielo a 3200 cm1 estaba ausente en el espectro de un mutante inactivo de AFPIII. Figura adaptada de Meister et al. (2014) glicoproteínas no anticongelantes, así como con espectros de generación de frecuencia de suma vibratoria de soluciones acuosas de AFGP que no muestran indicios de agua con forma de hielo o inusualmente estructurada alrededor de AFGP (Groot et al. 2016; Grossman et al. 2011 ) . No se observó ningún cambio de frecuencia vibratoria en la región amida I del espectro IR de AFPI, que se atribuyó a la formación de aguas similares al hielo en su IBS (Zelent et al. 2009) . La primera observación directa de este tipo de aguas heladas en la capa de hidratación de las AFP en solución a temperatura ambiente se informó en un estudio de espectroscopia de generación de frecuencia de suma vibratoria (VSFG) en AFP tipo III (Fig. 5.6) . Las bandas correspondientes a aguas heladas en el espectro VSFG de AFPIII de tipo salvaje se hicieron cada vez más prominentes a medida que las temperaturas se reducían desde la temperatura ambiente hasta los 2 °C (Meister et al. 2014b) . Además, estos estaban ausentes en el espectro VSFG del mutante T18N inactivo. Por lo tanto, las aguas ordenadas similares al hielo parecen ser esenciales para el correcto funcionamiento de la AFP tipo III, lo que presumiblemente media en el reconocimiento y la unión del hielo. Sin embargo, no se observaron aguas parecidas al hielo ordenadas en el espectro VSFG del potente DAFP1 o AFGP de tipo salvaje, lo que sugiere que estos AF(G)P no requieren la mediación de aguas unidas para la unión del hielo (Meister et al. 2015). El trabajo futuro arrojará luz sobre la razón de estas diferencias. Una explicación es que el IBS de DAFP1 tiene una coincidencia estructural suficientemente cercana con la red de hielo sin aguas unidas, mientras que AFPIII no. Los residuos de azúcar de AFGP también proporcionan una combinación estructural adecuada como sitio activo de unión al hielo, lo que hace innecesarias las capas de hidratación adicionales similares al hielo. Alte Machine Translated by Google 122 IK Voets y K. Meister puede estar relacionado con las diferencias en la estructura de los planos de adsorción de los cristales de hielo. Curiosamente, estudios recientes de VSFG sugieren que el ordenamiento estructural mejorado de la red de agua adyacente también es relevante para las proteínas de nucleación de hielo que están presentes en la superficie de la bacteria Pseudomonas syringae (Pandey et al. 2016) . La transición de congelación se ve facilitada aún más por la eliminación efectiva del calor latente del sitio de nucleación, como se muestra en los experimentos de espectroscopia VSFG de resolución temporal. 5.5 Conclusiones La pura exuberancia de los motivos estructurales que se encuentran en las AFP plantea la pregunta de si todas las AFP funcionan mediante el mismo mecanismo. El hecho de que diferentes AFP apunten a diferentes superficies de cristales de hielo se suma a esta pregunta, ya que es probable que la unión de planos de hielo basales o prismáticos sea diferente a nivel molecular. También podrían ser necesarios roles mecánicos diferenciales de AF (G) P debido a sus diversos roles biológicos. Las AFP producidas por insectos necesitan bloquear el crecimiento del hielo cuando las temperaturas caen muy por debajo de 0 C, mientras que los peces que viven en el agua del mar polar se enfrentan a fluctuaciones de temperatura modestas pero durante todo el año en condiciones de congelación. El hallazgo de aguas ordenadas asociadas con los sitios de unión de hielo de proteínas en diferentes estructuras cristalinas de AFP proporciona los primeros indicios de un mecanismo plausible de cómo las diferentes AFP estructurales pueden realizar la misma tarea de adsorción en hielo. Sin embargo, la presencia de moléculas de agua ordenadas por sí sola solo proporciona una breve imagen estática de un mecanismo molecular que es altamente dinámico. Hoy en día, las propiedades de las AF(G)P se están investigando con herramientas fisicoquímicas y espectroscópicas más avanzadas que permiten el estudio sin etiquetas de la dinámica estructural de las AF(G)P, su capa de hidratación y, potencialmente, su mecanismo de unión al hielo. . Por lo general, solo se investiga o simula una clase de AF(G)P, lo que dificulta las comparaciones directas o el descubrimiento de características comunes. La comparación directa entre los resultados de los experimentos de caparazones de hidratación de AF (G)P se ve obstaculizada aún más por el hecho de que diferentes técnicas prueban la dinámica de hidratación en diferentes escalas de tiempo. Por ejemplo, los cambios de densidad del solvente se restringen principalmente a la primera o segunda capa. El “agua de hidratación” y el “agua a granel” se intercambian constantemente en una escala de tiempo de 100 picosegundos; por lo tanto, cualquier método que pruebe las propiedades estáticas del solvente, o los movimientos que sean más lentos que este tiempo de intercambio de difusión, observarán diferentes tamaños de capa de hidratación (más pequeños), al igual que en el caso de tiempos de exposición demasiado largos (Conti Nibali y Havenith 2014) . Una serie de experimentos de THz reveló diferencias en las capas de hidratación dinámica de diferentes clases de AFP que se interpretaron en diferentes estrategias de las AF(G)P para optimizar sus interacciones de corto alcance (como la formación de enlaces hidroxilo por treonina) o de largo alcance. (dinámica del agua inducida por proteínas) (Ebbinghaus et al. 2010, 2012; Meister et al. 2013). Los experimentos de espectroscopia de generación de frecuencia de suma específica de superficie revelaron capas de agua similares al hielo para AFP tipo III, mientras que para un insecto AFP (DAFP1) se observaron treoninas altamente ordenadas con moléculas de agua unidas, pero las moléculas de agua asociadas no mantuvieron la firma del hielo ( Meister et al.2014b , 2015). Posiblemente se necesiten diferencias en la estructura de hidratación para poder Machine Translated by Google 5 Interacción de proteínas anticongelantes con agua 123 distinguir y unir a los diferentes planos de hielo. También se observaron claras diferencias entre las clases de AFP en su tasa de unión y la concentración de la solución requerida para mantener la actividad (Drori et al. 2014; Olijve et al. 2016). Para concluir, los avances adicionales en nuestra comprensión del mecanismo de trabajo de las proteínas anticongelantes dependen de manera crucial de estudios multidisciplinarios que abarquen un amplio espectro de AF(G)P, incluidos mutantes inactivos (Olijve et al. 2016) . Además, los resultados experimentales, las simulaciones y las teorías analíticas deben compararse cuantitativamente para probar críticamente las limitaciones y oportunidades de los modelos disponibles para describir y predecir la depresión del punto de congelación no coligativa por AF(G). PD. Confiamos en que este conocimiento fundamental sobre la (in)actividad de los crioprotectores biológicos respaldará el desarrollo de análogos bioinspirados. Hasta la fecha, se han producido anticongelantes artificiales no coligativos con actividad moderada de inhibición de la recristalización del hielo, pero ninguno con fuerte actividad de histéresis térmica. Un enfoque basado en el conocimiento puede acelerar la ingeniería de imitadores potentes con el objetivo final de superar a su propia fuente de inspiración: los AF(G)P nativos. Referencias Baardsnes J, Kondejewski LH, Hodges RS, Chao H, Kay C, Davies PL (1999) Nuevo enlace de hielo cara para proteína anticongelante tipo I. FEBRERO Carta 463: 87–91 Briard JG, Poisson JS, Turner TR, Capicciotti CJ, Acker JP, Ben RN (2016) Los inhibidores de la recristalización del hielo de molécula pequeña mitigan la lisis de glóbulos rojos durante la congelación, el calentamiento transitorio y la descongelación. Sci Rep 6:23619 Bush CA, Feeney RE (1986) Conformación de la unidad de repetición glicotripéptido de la glicoproteína anticongelante de peces polares determinada a partir del espectro de RMN de protones completamente asignado. Int J Pept Protein Res 28:386–397 Bush CA, Feeney RE, Osuga DT, Ralapati S, Yeh YIN (1981) Glicoproteína anticongelante. 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Ramsay (1964) , al estudiar un mecanismo de reabsorción de agua en el escarabajo Tenebrio molitor, informó por primera vez del fenómeno. En una nota a pie de página, afirma: “Cuando se observan pequeños cristales de hielo bajo el microscopio, como en el método del punto de congelación de Ramsay y Brown, uno se da cuenta de que los cristales grandes crecen a expensas de los pequeños y que los bordes de los cristales son redondeados, las consecuencias naturales de la superficie. tensión en la interfase agua hielo. El cambio de estado entre sólido y líquido es perfectamente reversible en temperatura”. . .. . .”Por el contrario, los cristales que aparecen en el líquido del espacio perirrenal anterior tienden a tener un contorno irregular y los cristales grandes no crecen a expensas de los más pequeños. Además, el sistema no es reversible en temperatura. A medida que aumenta la temperatura, los cristales disminuyen de tamaño, pero a medida que disminuye la temperatura, no aumentan de tamaño. Después de que la temperatura ha bajado unos pocos grados, el cristal de repente comienza a crecer rápidamente. En ocasiones se observó un subenfriamiento del orden de 10 C (en presencia continua de pequeños cristales) y luego, de repente, toda la muestra pareció solidificarse instantáneamente”. El intervalo de temperatura entre las temperaturas de fusión y congelación se denomina intervalo de histéresis, y la temperatura más baja donde se inicia el rápido crecimiento del hielo se denomina punto de congelación por histéresis. La diferencia cuantitativa entre la temperatura de fusión y el punto de congelación por histéresis se denomina actividad de histéresis o actividad anticongelante. E. Kristiansen (*) Biblioteca de la Universidad NTNU, Trondheim, Noruega Correo electrónico: [email protected] © Springer Nature Suiza AG 2020 H. Ramløv, DS Friis (eds.), Proteínas anticongelantes Volumen 2, https://doi.org/ 10.1007/9783030419486_6 131 Machine Translated by Google 132 E. Kristiansen La histéresis térmica refleja el papel de las AF(G)P como protectores contra la nucleación del hielo en los fluidos corporales sobreenfriados de animales que evitan la congelación. Su presencia permite que los peces hipoosmóticos ocupen aguas polares cargadas de hielo (DeVries 1971, 1982; Raymond y DeVries 1977), y permite que los artrópodos terrestres, como insectos, arañas y colémbolos, permanezcan todo el año en las áreas polares y templadas frías. . La temperatura corporal de estos animales terrestres puede, en algunos casos, caer muy por debajo de 30 C en invierno (Zachariassen y Husby 1982; Duman 2001; Duman et al. 2004; Graham y Davies 2005). Dentro del animal, se sabe que los AF(G)P actúan inactivando estructuras en los fluidos corporales que podrían iniciar la congelación, los llamados agentes nucleadores de hielo (INA), y evitando que el hielo penetre a través de la pared del cuerpo (Olsen y Duman 1997a, b; Olsen et al. 1998; Duman 2002). Las AF(G)P se clasifican como moderadamente activas o hiperactivas, según la actividad de histéresis que provocan en concentraciones equimolares. Esta clara diferencia en la potencia anticongelante se acompaña de distintas formas de los cristales de hielo que se forman en su presencia; Los AF (G) P moderadamente activos hacen que se desarrollen cristales bipiramidales, una forma que solo expone un plano de cristal único a la solución circundante. En presencia de AF(G)P hiperactivas, los cristales de hielo expresan varios planos cristalinos, generalmente en forma de discos hexagonales. Varios factores diferentes afectan la actividad de histéresis, incluido su tamaño y la adición de macromoléculas orgánicas grandes e iones inorgánicos. Este capítulo describe la comprensión actual del modus operandi de las AF(G)P. Se intenta proporcionar algunas explicaciones sencillas sobre la potencia anticongelante de las AF(G)P, incluidas sus características como moderadamente activas o hiperactivas, y cómo su potencia anticongelante se ve afectada por su tamaño y por diferentes aditivos. También se describen algunas características de los INA y su relevancia en la tolerancia al frío. examinado brevemente. 6.2 Un mecanismo de histéresis: el efecto Kelvin La presión de vapor del hielo a granel es menor que la del agua. Por lo tanto, por debajo del punto de fusión se produce una transferencia neta de moléculas de agua desde el agua a granel al hielo y la masa de hielo crece. Sin embargo, del hecho observable de que los cristales de hielo en presencia de AF(G)Ps permanecen sin cambios dentro de un intervalo de temperatura, se deduce que las AF(G)Ps de alguna manera provocan el equilibrio de la presión de vapor entre el hielo y el agua a todas las temperaturas dentro del intervalo de histéresis. . Esto debe ser así, ya que la velocidad a la que las moléculas de agua se suman a la superficie del cristal debe ser igual a la velocidad a la que se van. De lo contrario, se produciría una transferencia neta de moléculas de agua, de la solución al hielo o viceversa, y el cristal cambiaría visiblemente de volumen. Los AF(G)P no reducen la presión de vapor del agua más que otros solutos (Westh et al. 1997). Por lo tanto, deben actuar elevando la presión de vapor del hielo para que corresponda a la mayor presión de vapor de la solución circundante. La diferencia entre la presión de vapor del agua y el hielo aumenta con la salida de temperatura por debajo de la temperatura de fusión de equilibrio. Por tanto, el efecto de las AF(G)Ps sobre la presión de vapor del hielo Machine Translated by Google 6 histéresis térmica 133 Fig. 6.1 Equilibrio de presión de vapor dentro de un intervalo de temperatura cercano a la temperatura de fusión. Para que el cristal de hielo sea estable dentro del intervalo de histéresis, los AF(G)P deben elevar la presión de vapor de la superficie del hielo para que corresponda con la de la solución sobreenfriada circundante. Esta elevación de la presión de vapor debe aumentar al disminuir la temperatura. Adaptado de Kristiansen y Zachariassen (2005) debe depender de la temperatura y aumentar con la disminución de la temperatura, consulte la Fig. 6.1. Raymond y DeVries (1977) propusieron que las AF(G)Ps actúan modificando el patrón de crecimiento microscópico de la superficie del hielo. Dado que esto se logra mediante la adsorción irreversible de las AF (G) P en la superficie del hielo, acuñaron el mecanismo como el mecanismo de inhibición de la adsorción. Desde entonces, varios investigadores han tenido enfoques similares para explicar el fenómeno por adsorción irreversible, incluidos Wilson (1993) y Kristiansen y Zachariassen (2005). Usando AFP marcadas con fluorescencia, Celik et al. (2013) intercambiaron la solución ligeramente superenfriada que rodeaba un cristal de hielo. La superficie de hielo de los cristales sobreenfriados permaneció fluorescente después del intercambio de la solución circundante, lo que demuestra que las AFP se adsorbieron en la superficie del cristal. Además, la eliminación de AFP en la solución circundante mediante el proceso de intercambio no debilitó el efecto de histéresis. Estas observaciones proporcionan la evidencia más inequívoca hasta la fecha para demostrar que las AF(G)P se adsorben irreversiblemente en la superficie del hielo y que el fenómeno es causado únicamente por las AF(G)P unidas a la superficie. Además, Chao et al. (1995) y DeLuca et al. (1998) encontraron que las AF(G)P operan principalmente como unidades monoméricas. La elevación de la presión de vapor del hielo por el cambio en el patrón de crecimiento de la superficie microscópica podría ocurrir por el llamado efecto Kelvin. A continuación, se proporciona un breve resumen histórico del efecto Kelvin. A esto le sigue una descripción de cómo se cree que opera el efecto Kelvin en la superficie del hielo. Machine Translated by Google 134 E. Kristiansen 6.2.1 El efecto Kelvin: presión de vapor en una interfaz curva En 1871, el profesor William Thomson, que luego se convertiría en el primer barón Kelvin, señaló que la presión de vapor del agua en una superficie cóncava y convexa debe ser menor y mayor, respectivamente, que en una superficie plana del agua (Thomson 1871 ) . Esto se dedujo considerando la subida y bajada de líquidos en un tubo capilar en función de la curvatura del menisco; en una atmósfera saturada de vapor, la presión de vapor disminuye con la altura sobre la superficie de un líquido. En consecuencia, dado que una interfaz cóncava en un capilar hace que el líquido se detenga a una altura fija sobre el cuerpo líquido, Thomson dedujo que la presión de vapor en el menisco cóncavo elevado se reduce en relación con la presión de vapor en la superficie del plano inferior y debe corresponden a la presión de vapor atmosférico saturado reducida a esa altura. De lo contrario, se desarrollaría un movimiento direccional neto perpetuo de las moléculas de agua, ya que habría una evaporación neta continua en el menisco elevado y, en consecuencia, una condensación neta en la superficie del plano inferior. Tal movimiento direccional perpetuo de las moléculas de agua violaría la primera ley fundamental de la termodinámica, ya que la energía podría extraerse principalmente por la eternidad de este movimiento del agua sin ser suministrada al sistema. Las interfases convexas deben tener el efecto opuesto sobre la presión de vapor, ya que tal interfase queda debajo del cuerpo líquido plano donde la presión de vapor saturado es más alta. Desde entonces, el efecto de la curvatura de una superficie sobre la presión de vapor se conoce como efecto Kelvin. 6.2.1.1 El radio crítico de curvatura Una década más tarde, el profesor John Henry Poynting (1881) reconoció que el efecto de una curvatura superficial sobre la presión de vapor resultante en el capilar de Thomson es causado por un cambio en la presión global del agua en el capilar; una interfase cóncava evoca una presión más baja dentro del agua líquida, como es evidente por el ascenso del capilar, y por lo tanto una presión de vapor más baja, y viceversa para una interfase convexa. Por lo tanto, la causa subyacente del cambio de la presión de vapor con el cambio de la curvatura de una interfaz es un cambio inducido por la curvatura en la presión global dentro del volumen curvo. Poynting aplicó su razonamiento a la temperatura de fusión del hielo. Infirió que si la presión global del hielo solo se elevaba, entonces la presión de vapor elevada resultante del hielo reduciría la temperatura a la que coinciden las presiones de vapor del hielo y el agua, es decir, una depresión inducida por la presión de la temperatura de fusión del hielo. superficie de hielo Por extensión, dado que el efecto de elevación de la presión de una convexidad aumenta con la disminución del radio, debe haber una convexidad con un radio lo suficientemente pequeño como para causar una presión lo suficientemente grande como para que se desarrolle un equilibrio de presión de vapor de agua/hielo a cualquier temperatura por debajo del punto de fusión normal. . El radio de esta convexidad a una temperatura específica se denomina radio crítico de curvatura a esa temperatura. Machine Translated by Google 6 histéresis térmica 135 6.2.2 El efecto Kelvin en la superficie del hielo De los párrafos anteriores se deduce que las AF(G)P que se adsorben irreversiblemente en la superficie del hielo podrían evocar el efecto Kelvin al hacer que la superficie del hielo crezca tantas interfases convexas diminutas entre ellas. Estas interfaces convexas elevarían la presión de vapor de la superficie del hielo y, por lo tanto, eliminarían la diferencia entre las presiones de vapor a diferentes temperaturas, como se ilustra en la Fig. 6.1. El efecto Kelvin implica que, a cualquier temperatura por debajo de la temperatura normal de fusión, el crecimiento de las zonas superficiales convexas entre los AF(G)P adsorbidos se detendrá cuando obtengan una curvatura con un radio correspondiente al radio crítico a esa temperatura. Así, a cualquier temperatura en la que se exprese el fenómeno, la superficie de todo el cristal de hielo está cubierta por regiones de crecimiento esférico con convexidades idénticas, es decir, presiones de vapor locales idénticas. Esto hace que toda la superficie del cristal de hielo esté en equilibrio de presión de vapor con la solución sobreenfriada circundante y, por lo tanto, la superficie del cristal está a su temperatura de fusión, véase la Fig. 6.2. R. Tal cristal podría, en principio, permanecer sin cambios indefinidamente. Se han observado cristales en soluciones sobreenfriadas de AF(G)Ps durante muchos días sin expresar ningún crecimiento visible (DeVries 1971; Raymond y DeVries 1977; Graether et al. 2000; Fletcher et al. 2001). A medida que la temperatura desciende aún más, las muchas zonas diminutas de la superficie se expanden hasta que sus interfaces convexas nuevamente provocan el equilibrio de la presión de vapor con el entorno circundante. Fig. 6.2 Las convexidades de las zonas de crecimiento dentro del intervalo de histéresis. (a) Todas las zonas de crecimiento deben tener la misma convexidad a una temperatura específica dentro del intervalo de histéresis. (b) Las convexidades aumentan al disminuir la temperatura y elevan la presión de vapor de la superficie del hielo en un manera dependiente de la temperatura, como se ve en la Fig. 6.1. Adaptado de Kristiansen y Zachariassen (2005) Machine Translated by Google 136 E. Kristiansen Fig. 6.3 En el punto de congelación por histéresis. (a) Cuando una de las convexidades ha alcanzado la forma de una media esfera, ha alcanzado su máxima convexidad. (b) Cualquier crecimiento adicional de esta estructura hará que la convexidad disminuya y provoque un crecimiento espontáneo. (c) La relación entre el espaciado del adsorbente, d, y el ángulo, θ. Adaptado de Kristiansen y Zachariassen (2005) solución. De esta manera, se mantiene el equilibrio de presión de vapor de agua/hielo a lo largo de un intervalo de temperatura, el intervalo de histéresis, véanse las Figs. 6.1 y 6.2b. Hay un límite de cuánto se puede enfriar un cristal de este tipo, es decir, qué tan convexas pueden llegar a ser las diminutas interfaces curvas; ninguna zona superficial puede volverse más convexa que la de una semiesfera. Una vez que se alcanza tal forma, cualquier enfriamiento adicional dará como resultado que la convexidad de la estructura disminuya con el crecimiento. La caída resultante en la presión de vapor debido a la reducción de la convexidad dará como resultado un crecimiento espontáneo. Esto se ilustra en la figura 6.3a y b. Esta temperatura es el punto de congelación por histéresis. 6.3 Actividad de histéresis En los siguientes párrafos se intenta explicar qué determina fundamentalmente el punto de congelación por histéresis, en base a la teoría expuesta anteriormente. Esta explicación se amplía luego para incorporar la diferencia característica en la actividad entre los tipos de AF(G)P moderadamente activos e hiperactivos. 6.3.1 La brecha de adsorbente intermolecular más grande determina la actividad de histéresis Si solo una sola de todas las pequeñas zonas de crecimiento que sobresalen en la superficie del cristal falla, entonces el fenómeno de histéresis termina. Por lo tanto, el punto de congelación por histéresis está determinado por la única zona de crecimiento que alcanza la forma de una media esfera a la temperatura más alta. Cualquier crecimiento adicional de esta única zona de crecimiento, es decir, cualquier enfriamiento adicional, solo dará como resultado una reducción en su convexidad y, en consecuencia, el fenómeno se termina. Dado que todas las zonas de crecimiento de la superficie tienen la misma convexidad, será la única zona de crecimiento con el diámetro más ancho la que alcanzará la forma de una media esfera en Machine Translated by Google 137 6 histéresis térmica la temperatura más alta. Por lo tanto, el punto de congelación de la histéresis y, por lo tanto, la actividad de la histéresis, está determinada por el espacio adsorbente intermolecular más grande entre las AF (G) P que comprenden una sola zona de crecimiento en la superficie del cristal. Matemáticamente, la actividad de histéresis (ΔT) en función de la mayor separación entre adsorbentes, d, puede expresarse como (Kristiansen y Zachariassen 2005): 4γTE sen θ ΔT ¼ ; ΔHd ð6:1Þ donde d es el espaciado en unidades de cm, γ es la tensión interfacial hielo/agua (tomada como 32 ergios/cm2 ), TE es la temperatura de fusión normal para una interfaz plana (unidades de K), y ΔH es el calor de fusión de agua (3.3 109 ergios/cm3 ). θ es un ángulo que describe la situación si una curvatura falla antes de alcanzar la forma de una media esfera. Para una semiesfera, θ es 90 y, por tanto, el término (sen θ) es 1. Véase la figura 6.3. C para una ilustración del ángulo θ. 6.3.2 AF(G)P moderadamente activa e hiperactiva Hay una gran diferencia en las actividades de histéresis provocadas por diferentes AF(G)P. Según sus actividades en concentraciones equimolares y la forma de los cristales que forman en solución, se dividen en dos categorías: hiperactivas y moderadamente activas. marshall et al. (2004a) encontraron que las AFP moderadas e hiperactivas se acumulan en el hielo en un grado similar. Además, las estimaciones determinadas experimentalmente de los espacios adsorbentes promedio entre los AF(G)P en la superficie de los cristales de hielo son bastante similares en el caso de los AF(G)P hiperactivos y moderados; Drori et al. (2015) estimaron la distancia adsorbente promedio entre la TmAFP hiperactiva en 7,6 a 35,2 nm en concentraciones que oscilaron entre 31,4 y 0,4 μM. Resultados comparables fueron obtenidos por Celik et al. (2013) para la misma proteína. Para la AFP de tipo III moderadamente activa, Drori et al. (2015) estimaron que la distancia adsorbente promedio era de 8,7 a 24,7 nm en concentraciones que oscilaban entre 19,8 y 1,2 μM. Otros han estimado valores similares para AF(G)Ps moderadamente activos (Wilson et al. 1993; Grandum et al. 1999; Zepeda et al. 2008). Por lo tanto, la causa principal de la gran diferencia en las actividades de los AF(G)P moderados e hiperactivos no parece deberse a diferencias en su preferencia por el hielo. Más bien, es probable que la clara diferencia entre ellos sea el resultado de que el único espacio adsorbente más grande en la superficie del hielo, por alguna razón, es mucho mayor en el caso de AF(G)Ps moderadamente activos. Machine Translated by Google E. Kristiansen 138 6.3.2.1 Moderado o hiperactivo: ¿causado por la especificidad del plano y el patrón de adsorción? Actividad moderada Un rasgo característico de las AF(G)P moderadamente activas es que solo se adsorben en un solo plano de cristal en la estructura del hielo. En particular, ninguno de los AF(G)Ps moderadamente activos se adsorbe en el plano basal de los cristales, solo en un solo plano prismático o piramidal (Knight y DeVries 1988; Knight et al. 1991). Esta adsorción específica del plano es aparentemente una consecuencia de las características estructurales de sus sitios de unión al hielo (IBS), que restringen estos AF (G) P para que solo se adsorban irreversiblemente en un solo plano y orientación. Laursen et al. (1994) demostraron esto al observar que las variantes LAFP I y DAFP I quirales moderadamente activas dieron como resultado la adsorción en direcciones de imagen especular en la superficie del hielo. El resultado de una preferencia tan específica por un solo plano de cristal es un cristal que solo expresa este único plano de cristal protegido hacia la solución sobreenfriada circundante. En consecuencia, en presencia de AF (G) Ps moderadamente activos, los cristales obtienen una forma bipiramidal, ya que esta es la única forma de cristal posible cuya superficie completa consiste en un solo En el punto de congelación por histéresis, estos cristales bipiramidales se congelan desde sus vértices (Raymond y DeVries 1977; Jia y Davies 2002). El hecho de que crezcan característicamente fuera de sus vértices en el punto de congelación por histéresis sugiere fuertemente que la potencia anticongelante de las AF(G)P moderadamente activas está limitada por un gran espacio intermolecular en el vértice del cristal bipiramidal (Jia y Davies 2002) . Esto debe surgir del hecho de que estas proteínas solo se adsorben en un plano monocristalino. El área de superficie involucrada en la determinación de la actividad de histéresis para AF(G)Ps moderadamente activos es solo esa fracción minúscula del área de superficie total del cristal que comprende los dos vértices de la bipirámide. En consecuencia, la actividad de histéresis en presencia de AF(G)Ps moderadamente activas no debería verse muy afectada por el cambio de la superficie total del hielo. De acuerdo con esto, la actividad de histéresis de las AF (G) P moderadamente activas es, según se informa, bastante insensible a la cantidad de hielo presente en la muestra; grandes variaciones en el contenido de hielo, es decir, grandes variaciones en el área total de la superficie del cristal de hielo, no afectan apreciablemente la actividad de histéresis, véase la Fig. 6.4 ( Hansen et al. 1991; Wöhrmann 1996; Sørensen y Ramløv 2001). Hiperactividad En contraste con los AF(G)P moderadamente activos, se ha demostrado que los AF (G)P hiperactivos se adsorben en varios planos cristalinos que difieren mucho en su orientación, como los planos prismático y basal (Graether et al. 2000 ; Liou et al. 2000). Los estudios estructurales han demostrado que las AFP hiperactivas tienen SII que otorgan la libertad de la proteína para adsorberse en diferentes orientaciones y en diferentes planos. Su capacidad para adsorberse en múltiples planos cristalinos, y más notablemente en el plano basal, es una característica que los separa de los AF(G)P moderadamente activos. La adsorción del plano basal se ha implicado como una característica clave que hace que sean hiperactivos (Graether et al. 2000; Liou et al. 2000; Pertaya et al. 2008). Debido a su capacidad para adsorberse en múltiples planos, los cristales formados en presencia de AF(G)P hiperactivos expresan múltiples planos en la solución sobreenfriada circundante y, por lo general, adoptan la forma de discos hexagonales (Graether et al. 2000; Liou et al. 2000 ) . ). Machine Translated by Google 6 histéresis térmica 139 Fig. 6.4 Dependencia de la actividad de histéresis del % de hielo en la muestra. Símbolos rellenos: AF(G)Ps hiperactivo. Símbolos abiertos: AFGP moderadamente activo. (Cuadrado relleno) PAGP, un AFGP hiperactivo del nototeniido Pleuragramma antarcticum (Wöhrmann 1996). (círculo relleno) Hemolinfa de Tenebrio molitor (Hansen y Baust 1988). (Triángulo relleno) Hemolinfa de Rhagium inquisitor (Zachariassen et al. 2002). (círculo abierto) Suero de P. antarcticum. (Triángulo abierto) AFGP de P. antarcticum (Wöhrmann 1996). Para explicación, ver texto Debido a su capacidad para adsorberse en diferentes planos y en diferentes orientaciones, es probable que las AFP hiperactivas se extiendan por la superficie del cristal en un patrón de adsorción bastante aleatorio. Tal patrón aleatorio debería, por pura casualidad, dar como resultado que el espacio de adsorción más grande aumente al aumentar el área superficial. En consecuencia, la actividad de histéresis de las AF(G)P hiperactivas debería disminuir al aumentar el área de la superficie del cristal. De acuerdo con esto, varios investigadores han informado una fuerte dependencia de las AF(G)P hiperactivas de la cantidad de hielo presente en la muestra, véase la Fig. 6.4 ( Zachariassen y Husby 1982; Hansen y Baust 1988; Wöhrmann 1996). Como puede verse en la figura, la “hiperactividad” aparentemente es una consecuencia del uso de pequeños cristales de hielo en el experimento, ya que la hiperactividad AF(G) Los P tienen una actividad de histéresis más baja que sus contrapartes moderadamente activas con un mayor contenido de hielo en las muestras. La forma de los vértices bipiramidales Cuando se forman cristales bipiramidales en presencia de AF(G)Ps moderadamente activos, el cristal de hielo crece desde los planos basales. Una vez que se forma esta forma bipiramidal, el cristal deja de crecer y permanece estable dentro del intervalo de histéresis. ¿Cuál es la forma física de las interfaces del ápice? Dado que los AF(G)P moderadamente activos no se adsorben en el plano basal, ¿es el vértice un diminuto plano basal plano sin protección? Si es así, entonces uno podría imaginar interfaces curvas bidimensionales que sobresalgan solo en la dirección de los planos del prisma que forman el borde circundante del plano basal del ápice expuesto (Raymond y DeVries 1977) . El efecto de estas curvaturas 2D que están en la dirección del plano del prisma también debe elevar la presión de vapor más allá de la base de la curvatura hacia el centro del plano basal plano para que la presión de vapor Machine Translated by Google 140 E. Kristiansen persista el equilibrio entre la interfase del vértice plano y la solución circundante. Otro enfoque, y quizás más simple, es suponer que los vértices son esferas tridimensionales que sobresalen en la dirección del plano basal. En cualquier caso, son estas áreas del cristal bipiramidal las que aparentemente determinan la actividad de histéresis de las AF(G)P moderadamente activas. 6.4 Factores que afectan la actividad de histéresis En los párrafos anteriores, la clasificación de las AF(G)P en moderadamente activas e hiperactivas se atribuyó a las consecuencias de la adsorción irreversible a la superficie del hielo que surge de las características de su SII. A continuación, las diferencias en la actividad de histéresis dentro de cada una de estas categorías se atribuirán a la situación que existe antes de que las AF(G)P se adsorbieran irreversiblemente. Se argumentará que, mientras el cristal de hielo se mantiene a la temperatura de fusión de equilibrio, las AF(G)P adquieren una distribución de equilibrio entre la región de fusión de la superficie del cristal y la solución circundante. Luego, luego de un evento de enfriamiento, las AF(G)P dentro de esta región de la superficie se congelan en la superficie del cristal en solidificación y, por lo tanto, se adsorben de manera irreversible (Kristiansen y Zachariassen 2005). Cualquier cambio en este patrón de distribución antes del evento de enfriamiento dará como resultado cambios en la densidad superficial de las AF(G)Ps adsorbidas irreversiblemente después del evento de enfriamiento y, por lo tanto, cambios en la actividad de histéresis observada. Las diferencias en la actividad de histéresis entre AF(G)Ps hiperactivos o moderadamente activos pueden atribuirse a diferencias en la solubilidad de los AF(G)Ps en la solución; una solubilidad reducida da como resultado un cambio en la distribución de las AF(G)P hacia la región de la superficie del hielo antes del evento de enfriamiento y, por lo tanto, aumenta la actividad de histéresis (Kristiansen y Zachariassen 2005; Kristiansen et al. 2008 ) . 6.4.1 Los factores Varios investigadores han informado que el tamaño de las AF(G)Ps puede tener un efecto profundo en su capacidad para causar histéresis térmica. Para isoformas estructuralmente similares, se informa que su potencia aumenta con el tamaño molecular para ambos AFGP moderadamente activos (Schrag et al. 1982; Chao et al. 1996; Miura et al. 2001; Baardsnes et al. 2003; Nishimiya et al. 2003) y AFP hiperactivas (Leinala et al. 2002; Marshall et al. 2004b; Liu et al. 2005; Mok et al. 2010; Friis et al. 2014). Según los informes, los oligómeros sintéticos de AFP moderadamente activas también tienen una mayor potencia (Nishimiya et al. 2005; Holanda et al. 2008; Can y Holanda 2011, 2013; Stevens et al. 2015). En todos los casos mencionados anteriormente, el aumento de tamaño se acompaña de un aumento del SII o la adición de varios SII. Otros investigadores informaron que las AFP se potencian mediante la ligadura o la interacción con estructuras grandes que no se unen al hielo (Deluca et al. 1998; Hakim et al. 2013; Wu y Duman 1991, Wu et al. 1991; Machine Translated by Google 6 histéresis térmica 141 Horwath et al. 1996; Wang y Duman 2005, 2006). En estos casos, el SII no cambia. Además del efecto del tamaño molecular, varios autores han informado que la actividad de histéresis también se eleva en presencia de varios cosolutos de baja masa. Estos solutos de baja masa incluyen azúcares, polioles, sales, aminoácidos, sales de policarboxilatos y NADH. El efecto ha sido informado tanto para AF(G)Ps moderadamente activas (Kerr et al. 1985; Caple et al. 1986; Evans et al. 2007; Gong et al. 2011) como para AFP hiperactivas (Li et al. 1998; Kristiansen et al. 2008; Amornwittawat et al. 2008; Wang et al. 2009a, b; Amornwittawat et al. 2009; Wen et al. 2011; Liu et al. 2015). Hay una cosa que tienen en común las variaciones en el tamaño molecular y los aditivos; cambian la solubilidad de las proteínas en solución. Además, informan que mejoran la actividad de histéresis de manera predicha por sus efectos generales sobre la solubilidad de la proteína. En la siguiente sección, se explora brevemente la importancia potencial de la solubilidad de las AF(G)P en su potencia anticongelante. 6.4.2 La Solubilidad de las AF(G)Ps: ¿Un Concepto General para Explicar la Variabilidad? Varios autores han implicado de diversas formas la solubilidad de las proteínas como un factor relevante en la potencia anticongelante (Kristiansen y Zachariassen 2005; Evans et al. 2007; Kristiansen et al. 2008; Wang et al. 2009a). La solubilidad de las AF (G) P también se ha implicado inadvertidamente en la forma en que se cree que las AF (G) P se orientan hacia el hielo; estas proteínas son algo anfipáticas, donde el lado más hidrofóbico que contiene el SII se orienta hacia el hielo (Yang et al. 1988; Sönnichsen et al. 1996; Haymet et al. 1998, 1999). En otras palabras, el lado menos soluble de la molécula se orienta hacia el hielo mientras que el lado más soluble se orienta hacia el agua. La extensión lógica de esto es que una AFP menos soluble tendría una mayor afinidad hacia la superficie del hielo que una AFP más soluble. En los siguientes párrafos, se presenta un breve examen de la importancia de este común denominador, la solubilidad de las AF(G)Ps, a su potencia. 6.4.2.1 La interacción AF(G)P/hielo depende de la temperatura La superficie del hielo en equilibrio con el agua líquida circundante no es distinta sino una región de transición donde la configuración de las moléculas de agua cambia de la estructura cristalina ordenada de la red de hielo a la distribución aleatoria del agua a granel en la solución circundante. Este cambio ocurre en una región de 1 a 2 nm de profundidad llamada región interfacial o región de fusión/congelación (Hayward y Haymet 2001). Como se afirma en la cita introductoria de Ramsay (1964), las AF(G)P actúan a temperaturas por debajo de la temperatura de fusión de equilibrio del hielo, no a temperaturas por encima de Machine Translated by Google 142 E. Kristiansen ella, es decir, el cristal de hielo no crece por debajo de esta temperatura sino que se derrite por encima de ella (pero vea también la siguiente sección sobre el sobrecalentamiento de los cristales de hielo). Esto sugiere que los AF(G)Ps se adsorben irreversiblemente sobre la superficie del cristal de hielo solo a temperaturas por debajo de la temperatura de fusión. Una explicación sencilla de esto es que las AF(G)P se congelan en la superficie del cristal a medida que la temperatura desciende dentro del intervalo de histéresis y luego se derriten cuando la temperatura aumenta hasta el punto de fusión (Kristiansen y Zachariassen 2005) . Tal comportamiento dependiente de la temperatura de congelación (adsorción) y fusión (desorción) explicaría por qué los cristales de hielo en presencia de AF(G)Ps normalmente se derriten a la temperatura de equilibrio independientemente de cualquier variación coligativa en esta temperatura. También proporciona una explicación intuitiva y sencilla del enigma de larga data sobre el origen de la fuerza de unión necesaria para lograr una adsorción irreversible (Wen y Laursen 1992; Knight et al. 1993; Chao et al. 1995); la fuerza de unión entre el AF(G)P adsorbido irreversiblemente y la superficie del hielo corresponde a la de las moléculas de agua en el hielo a granel a esa temperatura. Recientemente, Garnham et al. (2011a) demostraron que el agua de hidratación de una AFP hiperactiva tiene una configuración similar a la de un clatrato y está firmemente incrustada por extensos enlaces H en la columna vertebral de la proteína. Por lo tanto, esta agua cristalina en el IBS parece ser propensa a fusionarse con la interfase cristalina en solidificación una vez que se baja la temperatura y derretirse cuando la interfase se desintegra en el caos al calentarse hasta la temperatura de fusión de equilibrio. Los estudios de dinámica molecular respaldan esta afirmación (Chakraborty y Jana 2019; ZanettiPolzi et al. 2019). Pertaya et al. (2008) informaron sobre la fluorescencia asociada con un cristal de hielo en una solución que contenía AFP marcada con fluorescencia. Al fundir lentamente un cristal a una temperatura justo por encima de la del equilibrio, el cristal no mostró fluorescencia, lo que indica que no hay AFP adsorbidas. Cuando se enfrió dentro del intervalo de histéresis, la superficie del cristal se volvió fluorescente, lo que indica una adsorción irreversible. Resultados similares fueron reportados por Pertaya et al. (2007), quienes utilizaron una técnica de fotoblanqueo de AFP marcadas con fluorescencia para estudiar la asociación AFP/hielo en la superficie del cristal a temperaturas dentro y justo por encima del intervalo de histéresis. Las AFP blanqueadas en la superficie no se reemplazaron dentro del intervalo de histéresis, sino que se reemplazaron a temperaturas justo por encima, lo que demuestra que las AFP se adsorbieron irreversiblemente dentro del intervalo de histéresis y se desorbieron del hielo a la temperatura de fusión. Mientras está en estado desorbido, a la temperatura de fusión de la superficie del cristal, debe haber una distribución de AF(G)Ps entre la región de fusión/congelación y la solución a granel. Es este patrón de distribución el que presumiblemente se ve afectado por los cambios en la solubilidad de las AF(G)Ps; una solubilidad reducida de la proteína significa que el AF(G)P tiene una mayor tendencia a alejarse de la solución y hacia la región de fusión/congelación. Esto da como resultado que haya más moléculas de AF(G)P en la región interfacial hielo/agua y disponibles para congelarse en la superficie del cristal en solidificación en el instante en que se baja la temperatura. En consecuencia, la solubilidad reducida de un AF(G)P debería dar como resultado una mayor densidad superficial del AF(G)P por debajo de la temperatura de fusión y, por lo tanto, una mayor actividad de histéresis (Kristiansen y Zachariassen 2005) . Machine Translated by Google 6 histéresis térmica 143 Sobrecalentamiento de cristales de hielo Varios investigadores han informado que los cristales de hielo en soluciones de AF(G)Ps pueden sobrecalentarse ligeramente (Celik et al. 2010; Cziko et al. 2014). Celik et al. (2010) informaron que pequeños cristales de hielo se sobrecalentaron 0,04 C y 0,44 C en presencia de varias AFP hiperactivas. En el caso de las AFP moderadamente activas, se notificó un sobrecalentamiento de hasta 0,02 C con concentraciones altas de AFP. El sobrecalentamiento observado refleja la presencia de regiones superficiales cóncavas que se desarrollan entre AF(G)Ps adsorbidos irreversiblemente a temperaturas por encima de la temperatura de equilibrio (Knight y DeVries 1989). Estas observaciones contradicen potencialmente la noción de una distribución de equilibrio de AF(G)Ps que se desarrolla entre la solución y la región de la superficie del hielo a la temperatura de equilibrio, como se describe anteriormente. Las muestras que expresaron este sobrecalentamiento también expresaron actividades de histéresis que oscilaron entre 1,7 C y 4,1 C. La actividad de histéresis aumenta aproximadamente en función de la raíz cuadrada de la densidad superficial de AF(G)Ps (Raymond y DeVries 1977; Kristiansen y Zachariassen 2005 ) . ). Por lo tanto, aparentemente solo una pequeña fracción de las AFP que originalmente se congelaron en la superficie y causaron estas altas actividades de histéresis se involucraron posteriormente en el sobrecalentamiento comparativamente mucho más bajo. Es decir, la mayoría de las AFP se derritieron de la superficie del hielo. El fenómeno de sobrecalentamiento requiere que ocurra un evento de enfriamiento; cuando Celik et al. (2010) derritieron hielo en soluciones con altas concentraciones de AFP moderadas o bajas concentraciones de AFP hiperactivas, observaron que muchos cristales pequeños disminuían uniformemente en tamaño. Si el proceso de fusión se detenía brevemente, los cristales comenzaban a mostrar un ligero sobrecalentamiento. Este cambio en el comportamiento de fusión luego de un breve evento de enfriamiento sugiere que las AFP en solución no se adsorben irreversiblemente en la superficie del hielo a menos que haya un evento de enfriamiento, es decir, la adsorción es una congelación de las AFP en la superficie del hielo. La desorción posterior a medida que aumenta la temperatura es para algunas de las AFP adsorbidas un proceso retardado. ¿Por qué algunos de los AF(G)P no se derriten simplemente de la superficie a medida que la temperatura aumenta hasta el punto de fusión? La congelación de las AF(G)Ps sobre la superficie del hielo implica que el agua de hidratación en el IBS se convierte en parte de la red cristalina. Por encima de su temperatura de fusión de equilibrio, el hielo se derrite desde su superficie, a medida que las moléculas de agua reticular se liberan a la red fluida de enlaces de hidrógeno de la solución circundante. Sin embargo, si no hay agua líquida en contacto con la red que se va a derretir, por ejemplo, en el interior de un cristal, la estructura de la red puede sobrecalentarse mucho antes de que ocurra un evento de nucleación de fusión (Turnbull 1950; Chalmers 1964; Lu y Li 1998 ) . ). En consecuencia, si el agua cristalina en el IBS de una AFP adsorbida se protege de la solución líquida circundante, se evita el proceso de fusión en el IBS y la AFP permanecerá adsorbida en la superficie del cristal a temperaturas superiores al punto de fusión. La clara diferencia en las capacidades de las AFP moderadas e hiperactivas para causar sobrecalentamiento informada por Celik et al. (2010) presumiblemente reflejan diferencias en sus respectivas capacidades para proteger el agua cristalina en el IBS del agua líquida circundante cuando se adsorbe en el hielo. Observaron que en presencia de AFP hiperactivas, los cristales desaparecían esporádicamente con el tiempo hasta 4 h, lo que demuestra que esta situación puede ser bastante estable si se desarrolla. Dado que el fenómeno es muy débil en comparación con la actividad de histéresis, podría ser que solo aquellos AF

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