9-12-2023 PORTAFOLIO DE EVIDENCIAS Universidad Tecnológica de la Costa. Ingeniería en Agrobiotecnología. Arturo Javier Ledesma Becerra. ÍNDICE Reporte UI.- Elaboración de bioproductos ................................................................................... 2 Rúbrica de evaluación UI ............................................................................................................ 0 Exámen UI ......................................................................................................................................... 0 Unidad II.- Técnicas de caracterización ........................................................................................ 2 Reporte UII.- Confrontación biológica de Bacillus subtilis contra patógenos de interés agrícola........................................................................................................................................... 2 Rúbrica reporte ........................................................................................................................... 13 Examen UII ...................................................................................................................................... 15 Unidad III.- Formulación, uso y manejo de bioproductos ........................................................ 17 Rúbrica reporte ............................................................................................................................. 32 Examen UIII ..................................................................................................................................... 34 Reporte UI.- Elaboración de bioproductos Instrumento Reporte Alumno: Arturo Javier Ledesma Becerra Fecha:09.10.2023 Carrera: Ingeniería en Agrobiotecnología Grupo: IAB102 Asignatura: Caracterización de Unidad temática: I.- Introducción a bioproductos la caracterización de bioproductos Profesor: Ing. Martín Ponce Contreras Elaboración de bioproductos elaborados a partir de microorganismos benéficos para cultivos agrícolas I.- Introducción Las aplicaciones de manera excesiva de productos de síntesis química en la agricultura han llevado a una calidad perjudicial para la producción de cultivos, por ende, de alimentos. Además de ser de costo más elevado, alteran las propiedades fisicoquímicas y biológicas del suelo (Altieri, 1997). De acuerdo a Rivera-cruz en 2008 comentó que la intervención de la biotecnología nos ha dado la pauta para crear y promover los bioproductos para el campo agrícola. González- león en 2020 dijeron que, para esto, se aprovecha la capacidad que tienen algunos microorganismos específicos que fueran promotores de crecimiento, todo esto gracias a mecanismos que hacen qué haya mayor disponibilidad de nutrientes, ayudar en el control de plagas y enfermedades además de reducir erosión del suelo y el uso de productos de síntesis química. Una alternativa con mayor participación en el manejo de los cultivos, trabajando de manera integral es el uso de los bioproductos (biofertilizantes, bioestimulantes y bioplaguicias) por ser económicos y biológicamente aceptables. Un bioinsumo es un producto compuesto o de extractos de microorganismos o plantas, con la capacidad de mejorar la productividad, calidad o sanidad de la planta, sin generar condiciones negativas en el ambiente (Gerwick y Sparks, 2014; Dayan y Duke, 2014; Duke, 2018). La bacteria del Género: Bacillus y especie: subtilis (además de trichoderma) es un microorganismo que ha ganado importancia ya que ha demostrado efectividad como promotor de crecimiento vegetal (PGPR) e inductores de resistencia de diferentes tipos de estrés en la planta (ISR) (Su, Liu & Zhang, 2020; Tseng et al., 2020). Bacillus subtilis, es procariota, en forma de bacilo con diámetro de 850 nm, Gram positiva, es móvil con flagelos perítricos, aerobia y anaerobia facultativa, también de catalasa positiva que degrada almidón. Con un intervalo de crecimiento de 4.9 a 9.4 de pH, con temperaturas de los 10 a 48°C y un óptimo de 28 a 35°C, con la capacidad de formación de endosporas además de poder crear compuestos antimicrobianos (Ravel & Fraser, 2005; Errington &Wu, 2017; Nagórsaka, Bikowski & Obuchowski, 2007; Chen et al., 2008). Villareal et al., 2018, comentó qué este microorganismo posee mecanismos de acción eficientes, como: secreta de antibióticos, endotoxinas, producción de sideróforos, enzimas líticas y coadyuvan a la resistencia sistémica inducida. Dichos mecanismos de acción son; • Producción de lipopéptidos para la interacción con la membrana citoplasmática de células bacterianas o fúngicas, provocando la formación de poros y un desbalance osmótico, lo que desencadena la muerte celular de los microorganismos fitopatógenos (Aranda et al., 2005; Gong et al., 2006). • Degradación de la pared celular de hongos fitopatógenos por enzimas líticas • Los sideróforos como mecanismo de inhibición gracias a la producción de metabolitos secundarios, disminuyendo la disponibilidad para patógenos (Neilands 1995; Wilson et al. 2016). • Producción de δ-endotoxinas; proteína cry (cristal): por el cual se efectúa un desequilibrio osmótico, que finalmente destruye el epitelio intestinal y en consiguiente la muerte celular (Portela-Dussán et al., 2013; Xu et al., 2014). • Producción de moléculas elicitoras que inducen a la resistencia sistémica inducida en la planta. B. subtilis coloniza la rizosfera mediante mecanismos de desplazamiento como: “swarmin”: deslizándose en grupos de bacterias en forma de película por medio de flagelos, “swwiming”: esto es de forma individual por flagelos en un medio semi sólidos, “twitching”: mediante un movimiento de contracción de pilis bacterianos, “glidig”: dezlisamienso sin ayuda de apéndices y el “sliding”: por extensión sobre una superficie usando compuestos tensoactivos, los cuales les permiten a las bacterias moverse hacia los rizodepósitos de nutrientes, siendo estos los principales mecanismos bacterianos de la promoción del crecimiento vegetal (Constanza et. al., 2014). Los ácidos húmicos y fúlvicos, conocidos también como sustancias húmicas son compuestos biosintéticos orgánicos, generalmente se pueden encontrar en los suelos además de hacerlo en varias concentraciones y provenir de diferentes fuentes como: ríos, lagos, océanos, de la leonardita, sedimentos, etc. (Yanagi et. al., 2003). De acuerdo a Stevenson 1994, documento que, las sustancias húmicas se clasifican en cuanto a la solubilidad en función del pH como: huminas (color negro), ácidos húmicos (coloración café y/o grisáceo) y ácidos fúlvicos (amarillos y/o naranjas). En 2002 Nardi et. al., realizó un estudio dónde presentó los efectos de estas sustancias en el proceso de crecimiento y desarrollo, pudiendo resumir que ayuda a la influencia positiva del transporte de iones lo cual facilita la absorción, además del aumento de la respiración celular y de la velocidad de las reacciones enzimáticas del ciclo de Krebs, resultando en un a mayor producción de ATP. Aumentando el contenido de clorofila, la velocidad de síntesis de acidos nucleicos, provocando un efecto selectivo en la síntesis de proteínas y también en el aumento o inhibición de la actividad de diferentes enzimas. Por su parte las bacterias necesitan un mínimo de nutrientes: agua, una fuente de carbono, una fuente de nitrógeno y algunas sales minerales (Corrales et. al., 2015). Por lo tanto la Maltodextrina es un polvo de carbohidratos que tiene alta solubilidad y dispersabilidad (Europharma, 2023) funcionando como fuente de carbono para estos microorganismos. Otra fuente de carbono es la melaza, alimenta los microorganismos del suelo, promoviendo la actividad microbiana, estimula el crecimiento y desarrollo de las plantas debido a los aminoácidos y vitaminas que posee pudiendo tener una mejor absorción de nutrientes además de estimular la producción de enzimas y promover la síntesis de hormonas (Lima et. al., 2022) La NOM-232-SSA1-2009, Plaguicidas (en conjunto de otras 14 NOM más): señala todos los requisitos para el envasado de productos de grado técnico, para uso agrícola, forestal, pecuario, urbano, industrial y doméstico. Donde menciona que el envase no debe presentar daños, debe estar bien etiquetado, con sellos de seguridad y cierres herméticos, también si funge como paquete tecnológico ya que todo debe estar visible e impreso, también el nombre común, los cultivos y plagas autorizadas con sus respectivas bandas de seguridad. Por otro lado la NOM-182SSA1, 2010, Etiquetado de nutrientes vegetales, nos dice que, el producto debe tener todas las características y leyendas en el etiquetado con letra legible y con lenguaje común para todo público, además debe contener datos de la empresa, composición y registro, y, de manera detallada debe de contener porcentajes de cada elemento que lo compone, si son microorganismos debe indicar género y especie y mencionar todas las precauciones, advertencias y recomendaciones de uso. Por lo tanto, se optó por el uso de polietileno de alta densidad. Conocido como PEAD, Robson en el 2000 menciono que es uno de los materiales más idóneos para el almacenamiento de productos con microorganismos, esto, por las siguientes peculiaridades: resistencia química, tolerancia a la radiación UV e impenetrabilidad de los gases, por ello, este tipo de material puede tolerar productos químicos. Resultando seguro para resguardas y proteger dichos productos. Los productos que son elaborados con microorganismos se recomiendan guardar en lugares frescos y fuera de las condiciones ambientales, no es obligatorio la conservación por refrigeración, a menos que la hoja de seguridad lo indique la conservación de estos productos seria de 2 a 8 °C, ya que evita la muerte de las células y mantiene una viabilidad. II. Objetivos: General: Elaborar un bioproducto a base de Bacillus subtilis para su aplicación en cultivo de berenjena (Solanum melongena L.) en la Universidad Tecnológica de la Costa. Específicos: Consultar literatura a cerca de características morfofisiologías del microorganismo a utilizar Realizar aislamiento y purificación de B. subtilis para su multiplicación III.- Metodología Aislamiento de Bacillus subtilis Tabla 1: Materiales y equipos utilizados para el aislamiento de Bacillus subtilis Materiales Equipos 1 pala 1 plancha con agitador magnético 1 cubeta 1 campana de flujo laminar Muestra de suelo 1 incubadora 1 trozo de madera 1 balanza analítica 90 ml de agua destilada 1 Vortex 1 auxiliar de pipeteo 1 pipeta 1 matraz Erlenmeyer de 500 ml 3 tubos de ensaye 1 gradilla 1 micropipeta y puntillas 2 cajas Petri con medio de cultivo BDK 1 asa de siembra Papel parafilm 1 plumón Procedimiento: Se tomó una muestra de suelo “virgen” en la Universidad Tecnológica de la Costa. Se homogeneizo bien la muestra de suelo en una cubeta con ayuda de un trozo de madera. Se agregó 90 ml de agua destilada y 10 g de muestra de suelo a un matraz Erlenmeyer de 500 ml. Se colocó el matraz en la plancha con agitador magnético hasta que se disolvió la muestra de suelo. Se realizó una dilución seriada hasta una concentración de 0.001 % en la campana de flujo laminar. Se inoculo 1 ml por caja Petri con medio de cultivo BDK de la dilución (0.001 %) y se dispersó por toda la caja con ayuda de un asa. Se selló las cajas Petri con papel parafilm. Se etiqueto las cajas Petri y se le introdujo en la incubadora a temperatura ambiente. Figura 1: Toma de muestra de suelo y aislamiento de Bacillus subtilis Purificación de Bacillus subtilis Tabla 2: Materiales y equipos utilizados para la purificación de Bacillus subtilis Materiales Equipos Cajas Petri con siembra bacteriana 1 campana de flujo laminar 1 asa bacteriológica 1 incubadora Cajas Petri con medio de cultivo BDK 1 mechero Cerillos Papel parafilm 1 plumón Procedimiento: Se hizo una identificación de Bacillus subtilis de acuerdo a sus características visibles en las cajas Petri previamente sembradas. Se realizó una siembra estriada en cajas Petri con medio de cultivo BDK dentro de la campana de flujo laminar partiendo de una caja donde se identificó Bacillus subtilis. Se selló y etiquetó las cajas y se les guardo en la incubadora. Figura 2: Purificación de Bacillus subtilis Reproducción de Bacillus subtilis Tabla 3: Materiales y equipos utilizados para la reproducción de Bacillus subtilis Materiales Equipos 2 vasos de precipitado de 250 ml 1 horno de microondas 1 trozo de papel aluminio 1 campana de flujo laminar 150 ml de agua destilada 1 balanza analítica 1 asa de siembra 1 bomba aireadora Cajas Petri con Bacillus subtilis 1 microscopio con cámara digital 1 agitador de vidrio 200 g de proteína de suero de leche 2 L de agua purificada Alcohol 1 recipiente plástico (5 L) 1 espátula Concentrado de Bacillus subtilis Navaja 1 hoja de papel 1 plumón 4 tubos de ensaye 1 gradilla 1 micropipeta y puntillas 1 cámara de neubauer 1 libreta y lápiz Procedimiento: Se esterilizo un vaso de precipitado de 250 ml en el horno microondas durante tres minutos. Se tapó el vaso precipitado con papel aluminio una vez retirado del horno de microondas y se llevó a la campana de flujo laminar. Se agregó 150 ml de agua destilada al vaso precipitado. Se extrajo la bacteria de las cajas Petri con ayuda de un asa de siembra y se añadió al vaso precipitado. Se mezcló el contenido con ayuda de un agitador de vidrio. Se pesó 200 g de proteína de suero de leche. Se agregó 2 L de agua purificada a un recipiente plástico previamente esterilizado con capacidad de 5 L. Se añadió los 200 g de proteína al recipiente y se disolvió con ayuda de una espátula. Se agregó la solución madre de Bacillus subtilis al recipiente con la proteína. Se realizó un orificio pequeño a la tapa del recipiente y se colocó la bomba aireadora para iniciar la reproducción de la bacteria. Se etiqueto y se colocó en un lugar seguro el recipiente con concentrado de Bacillus subtilis. Se realizó un conteo de UFC/ML en cámara de Neubauer 4 días después de que se inició la reproducción. Figura 3: Reproducción de Bacillus subtilis Elaboración del bioproducto a base de Bacillus subtilis. Tabla 4: Materiales y equipos utilizados para la elaboración del bioproducto a base de Bacillus subtilis: Materiales Equipos 1 envase de plástico PEAD (20 L) 1 balanza granataria Jabón Agua corriente 1 probeta 250 g de melaza 250 g de maltodextrina 500 g de ácidos húmicos Concentrado de Bacillus subtilis Hoja de papel y plumón Procedimiento: Se lavó el envase de plástico PEAD con agua y jabón y se le agregó 9 litros de agua corriente. Se pesó 250 g de melaza, 500 g de ácidos húmicos y 250 g de maltodextrina en la báscula. Se disolvió la melaza en 1 L de agua caliente y se agregó al envase. Se agregó los ácidos húmicos y la maltodextrina al envase. Se añadió el concentrado de Bacillus subtilis al envase y se agito para homogeneizar la mezcla. Se etiqueto y se guardó el bioproducto a temperatura ambiente, listo para ser aplicado. Figura 4: Elaboración del bioproducto a base de Bacillus subtilis IV. Resultados Tabla 5: Materiales utilizados para la elaboración del bioproducto Materiales Concentración Ácidos húmicos 5% Melaza 2.5 % Maltodextrina 2.5 % Bacillus subtilis 1.4 x 106 UFC/ML El 7 de septiembre de 2023 se realizó el aislamiento de Bacillus subtilis de una muestra de suelo obtenida en la Universidad Tecnológica de la Costa. Posteriormente se dejó las cajas Petri en la incubadora a temperatura ambiente durante 4 días para lograr una mejor identificación de acuerdo a las características de crecimiento visibles de Bacillus, el día 11 se realizó la primera purificación y se dejaron las cajas Petri durante 8 días en la incubadora a temperatura ambiente para obtener un mejor crecimiento, para el día 19 se llevó a cabo una nueva purificación en la que ya se tuvo una mayor certeza que lo que creció fue Bacillus subtilis, el día 22 se dio inicio a la reproducción de la bacteria y para el 26 se realizó el conteo de UFC/ML, el día 3 de octubre de 2023 después de 10 días en reproducción se envaso el bioproducto terminado listo para ser aplicado. Discusión: El producto elaborado es un biofertilizante a base de Bacillus subtilis, que por definición un biofertilizante es todo aquello que alimenta a la planta o suelo, que estos bioproductos pueden contener diferentes compuestos como: sales minerales, aminoácidos libres, quelatos orgánicos naturales, lignosulfonatos, ácidos húmicos y fúlvicos, hormonas e inclusive microorganismos. Gracias a su funcionalidad sobre la fisiología de la planta, ayuda en el desarrollo de la misma, también logra incrementar la productividad y aumentar la tolerancia a condiciones adversas y contra patógenos (Reynders y Vlassa, 1982; Holopainen, 2004; Travers-Martin y Müller, 2008; Baset Mia y Shamsuddin, 2010; Heil y Karban, 2010; Perelló y Dal Bello, 2011; Ludwig-Müller, 2015). V.- Conclusiones y/o recomendaciones:. Se logro elaborar un bioproducto a base de Bacillus Subtilis, el cual se aplicará al cultivo de berenjena que será establecido en los invernaderos de la universidad. Esto se logro debido a la revisión previa de la literatura, conociendo las propiedades y bondades que ofrecen todos los componentes de este biofertilizante a las plantas. VI.- Bibliografía: Altieri, M. Agroecología. Bases científicas para una agricultura sustentable. 3 ed. ACAO, La Habana: 1997, 249 p. Recuperado de Ruiz, J., Tejeda, T., Terry, E., & Díaz, M. M. (2009). Aplicación de bioproductos a la producción ecológica de tomate. Cultivos Tropicales, 30(3), 60-64. Aplicación de bioproductos a la producción ecológica de tomate (sld.cu) Chen, H., Wang, L., Su, C. X., Gong, G. H., Wang, P. & Yu, Z. L. (2008). Isolation and characterization of lipopeptide antibiotics produced by Bacillus subtilis. Letters in Applied Microbiology, 47, 180-186. http://doi.org/10.1111/j.1472- 765X.2008.02412.x Dayan F., Duke S. (2014). Natural compounds as next-generation herbicides. Plant Physiology 166: 1090-1105. Duke S. (2018). Pest Management Science in 2017.Pest Management Science 74 (1): 78. 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Rúbrica de evaluación UI Exámen UI Unidad II.- Técnicas de caracterización Reporte UII.- Confrontación biológica de Bacillus subtilis contra patógenos de interés agrícola Instrumento Reporte Alumno: Kevin Nazaret Garcia Cota, Vladimir Chavarín Perez, Ailin Islas Raymundo, Arturo Ledesma Becerra, Joel Guadalupe Benitez Castillo. Fecha: 04/12/2023 Carrera: Ingeniería en Agrobiotecnología Grupo: IAB 102 Asignatura: Caracterización de bioproductos Unidad temática II: Técnicas de caracterización. Profesor: Ing. Martin Ponce Contreras Confrontación biológica de Bacillus subtilis contra patógenos de interés agrícola. I.- Introducción Bacillus subtilis es una bacteria Gram positiva, que se aísla de una gran variedad de ambientes (Earl et al., 2008; Alcaraz et al., 2010). Bacillus subtilis es promotora del crecimiento vegetal por la producción de metabolitos como auxinas, sideróforos, ácidos orgánicos y antibióticos, tiene un efecto altamente bioestimulante al acelerar y amplificar los cambios fenológicos en la planta aumentando la cantidad de raíces, flores y frutos (Arkhipova, et al., 2005). La bacteria Bacillus subtilis, ha sido considerada como uno de los microorganismos de mayor importancia en la agricultura, ya que se ha demostrado su efectividad como promotores del desarrollo e inductores de resistencia a diferentes tipos de estrés en las plantas (Su et al., 2020; Tseng et al., 2020); así como, en el control de las enfermedades que año con año merman la producción agrícola (VillarrealDelgado et al., 2018). Es por eso que se ha optado por el uso de los microorganismos antagonistas ya que tienen la capacidad de ejercer un efecto de control sobre diversos patógenos y se han empleado para controlar enfermedades en frutos y hortalizas. Bacillus subtilis presenta un alto grado de tolerancia a factores ambientales y ha sido utilizado como biocontrol de hongos fitopatógenos. A pesar de que la antibiosis es el mecanismo antagónico más utilizado por los microorganismos biocontroladores para inhibir a los hogos fitopatógenos, los principales mecanismos de acción para controlar el desarrollo de patógenos pueden ser resultado de la competencia por espacio o nutrientes, interacciones directas con el patógeno (micoparasitismo y lisis enzimática), producción de bacteriocinas y otros compuestos antagonistas derivados del metabolismo secundario como los péptidos que presentan actividad antimicrobiana o antifúngica y la inducción de resistencia en las plantas (Claus et al., 1986). Bacillus subtilis ha sido utilizado para la prevención de por lo menos 8 patógenos de distinta etiología: Colletotrichum, Erysiphe, Leveillula, Botrytis, Sphaerothecamacularis, en más de 20 cultivos agrícolas; incluso señalan que el éxito de su formulado reside, además del sustento científico, en la publicación de sus resultados en una revista de divulgación consultada por los profesionales en agronegocios, permitiendo con esto el vínculo que enlazó a las compañías exportadoras de cultivos en búsqueda de alternativas sustentables que les permitiera el control de fitopatógenos (Villarreal et al., 2018). Los cultivos agrícolas afectados se encuentran, tales como maíz, arroz, frutales, entre otros (Wang et al., 2014; Li et al., 2015). De tal manera se ha optado como objetivo principal de este trabajo medir el crecimiento de los hongos patógenos Rhizopus, Fusarium y Colletrotrichum y observar el comportamiento de la bacteria Erwinia en presencia de Bacillus subtilis fungiendo como antagonista. II. Objetivo general: Medir el crecimiento de los hongos patógenos Rhizopus, Fusarium y Colletrotrichum y observar el comportamiento de la bacteria Erwinia en presencia de Bacillus subtilis fungiendo como antagonista. III.- Desarrollo: Tabla 6: Materiales y equipos utilizados para la práctica Materiales Equipo Cajas Petri con medio de cultivo PDA Campana de flujo laminar Fusarium purificado Rhizopus purificado Cholletrotrichum purificado Erwinia purificada Aza bacteriológica Mechero Vernier Alcohol Papel parafilm Plumón Metodología: Metodología de siembra para microorganismos patógenos la 1. Se seleccionó los patógenos de interés Rhizopus Erwinia Fusarium Cholletrotrichum confrontación biológica contra 2. Se realizó la siembra de los microorganismos dentro de campana de flujo laminar usando 3 cajas Petri con medio de cultivo PDA para cada confrontación excepto para Erwinia que solo fue una caja. Confrontación biológica Bacillus subtilis contra Fusarium Se utilizó la técnica de siembra estriada dividiendo la mitad de la caja Petri con Bacillus Subtilis, para la otra mitad se tomó una rodaja del medio de cultivo donde se encontraba el hongo Fusarium y se colocó en la caja Petri con PDA. Confrontación biológica Bacillus subtilis contra Rhizopus Se utilizó la técnica de siembra estriada dividiendo la mitad de la caja Petri con Bacilus Subtilis, para la otra mitad se tomó una rodaja del medio de cultivo donde se encontraba el hongo Rhizopus y se colocó en la caja Petri con PDA. Confrontación biológica Bacillus subtilis contra Cholletrotrichum Se utilizó la técnica de siembra estriada dividiendo la mitad de la caja Petri con Bacilus Subtilis, para la otra mitad se tomó una rodaja del medio de cultivo donde se encontraba el hongo Cholletrotrichum y se colocó en la caja Petri con PDA. Confrontación biológica Bacillus subtilis contra Erwinia Se utilizó la técnica de siembra estriada dividiendo la mitad de la caja Petri con Bacilus Subtilis, para la otra mitad se realizó la misma técnica de siembra estriada con la bacteria Erwinia y se colocó en la caja Petri con PDA. Figura 5.Siembra para la confrontación biológica de Bacillus subtilis contra microorganismos patógenos Metodología para la toma de datos de las confrontaciones El 10 de noviembre del 2023 se realizó la primera toma de datos dos días después de la siembra, con la ayuda del vernier se hizo la medición del centro a la periferia, tomando en cuenta donde se encuentra la posición del hongo, esto lo hicimos con las 3 cajas, los datos arrojados se encuentran en la tabla 1. Tabla 7. Primera toma de datos de las evaluaciones Bacillus – Fusarium Bacillus – Colletotrichum Bacillus – Rhizopus Caja 1 1.4 cm 1.9 cm 3.9 cm Caja 2 1.4 cm 1.9 cm 3.5 cm Caja 3 1.7 cm 1.7 cm 3.6 cm 2.4 cm 3 cm Testigo 5 cm La segunda toma de datos se realizó el 14 de noviembre del 2023, siguiendo los mismos pasos, colocamos el vernier donde se posiciono el hongo para hacer la medición, después de cuatro días notamos más crecimiento del hongo, teniendo como resultado lo siguiente: Tabla 8. Segunda toma de datos de las evaluaciones Bacillus – Fusarium Bacillus – Colletotrichum Bacillus – Rhizopus Caja 1 2.7 cm 2.8 cm 4.2 cm Caja 2 2.5 cm 2.9 cm 4.3 cm Caja 3 3.9 cm 2.7 cm 3.9 cm Testigo 8 cm 5.4 cm 6 cm Figura 6.Toma de datos para confrontaciones IV.- Resultados: Figura 7. Confrontación biológica de Bacillus subtilis vs Colletotrichum En la figura tres se observa el crecimiento alcanzado por Colletotrichum en presencia de Bacillus subtilis, dónde fungió con efecto de antagonismo, así como su desarrollo estando solo. En la primera evaluación de Bacillus se observa un crecimiento de 1.83 cm, mientras que donde creció solo, alcanzo los 2.4 cm. En la segunda evaluación se logró alcanzar un crecimiento de 2.8 cm y por sí solo aumento a 5.4 cm. Observando los datos precisamos que Bacillus sí reduce el crecimiento de Colletotrichum. Figura 8. Confrontación biológica de Bacillus Subtilis vs Fusarium Podemos apreciar en la figura cuatro qué el crecimiento de Fusarium en presencia de Bacillus como antagonista, así como por su cuenta, en la primera evaluación el desarrollo de Fusarium en presencia de Bacillus fue de 1.5 cm, mientras que por sí solo se desarrolló hasta los 5 cm. En la segunda evaluación, el desarrollo de Fusarium en la confrontación logró ser de 3.03 cm y estando por su cuenta logró los 8 cm, lo que nos podría indicar que Bacillus sí cumple con el efecto de antagonismo en el desarrollo de Fusarium. Figura 9. Confrontación biológica Bacillus subtilis vs Rhizopus En la figura cinco muestra el crecimiento de Rhizopus, hongo fitopatógeno, en una confrontación contra Bacillus subtilis y su desarrollo estando por sí solo. En la primera evaluación se muestra que el crecimiento de Rhizopus logro crecer a los 3.67 cm en confrontación, y estando solo alcanzó los 3 cm. Para la segunda evaluación el crecimiento del hongo alcanzó los 6 cm. Indicando que Bacillus no fungió con un efecto de antagonismo contra Rhizopus debido a que en la primera evaluación se mostró más infeccioso que cuando estaba solo. Figura 10. Bacillus subtilis vs Erwinia En la figura seis se observa un crecimiento general, desarrollándose ambas bacterias previamente sembradas en los extremos de la caja Petri. Una vez que tuvieron la confrontación ya no logró desarrollarse de manera visible, pudiendo tomar en cuenta que Bacillus subtilis si cumple el efecto de antagonismo contra Erwinia spp. Posteriormente podrían hacerse pruebas de manera cuantitativa para llegar a una conclusión más fidedigna. V.- Conclusiones y/o recomendaciones: Se logró realizar la medición del crecimiento de los hongos fitopatógenos; Rhizopus, Fusarium y Collecotrichum, y su observación en conjunto de la bacteria de Erwinia en presencia de B. subtilis como antagonista, donde de manera cualitativa observamos de manera exitosa las confrontaciones que tuvieron lugar en el laboratorio de la Ut de la costa. Donde en la confrontación de la figura tres; Bacillus sí logro inhibir el crecimiento de Colletotrichum al igual que en la figura cuatro, de Bacillus contra Fusarium, sin embargo en la figura cinco Bacillus no mostro el efecto de antagonismo. Y en la figura seis a pesar que no se mostró un crecimiento más elevado de bacillus, hubo una inhibición, aunque también podría decirse que erwinia pudiera reducir el efecto de Bacillus. **A pesar de los resultados obtenidos de manera cualitativa, hubiera sido excelente hacer diluciones seriadas para su medición de manera cuantitativa para así determinar mediante el número de UFC o de esporas de manera más concreta si las confrontaciones realmente fueron efectivas. VI.- Bibliografía: Guillen C., R., Hernández C., F., y Gallegos M., G. 2006. Bacillus spp., como biocontrol en el 2 suelo infestado con Fusarium spp., Rhizoctonia solani Kuhn y Phytophthora capsici 3 Leonian y su efecto en el desarrollo y rendimiento del cultivo del chile (Capsicum annuum 4 L.). Revista Mexicana de Fitopatología, pp. 105-114. Hernández F., Lira R., Gallegos G., Hernández M., y Solís S. 2014. Biocontrol de la marchitez del 7 chile con tres especies de Bacillus y su efecto en el crecimiento y rendimiento. 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El género Bacillus como agente de control biológico y sus implicaciones en la bioseguridad agrícola. Revista mexicana de fitopatología, 36(1), 95-130. Rúbrica reporte Examen UII Unidad III.- Formulación, uso y manejo de bioproductos Reporte UIII.- Evaluación del bioproducto a base de Bacillus subtilis en el cultivo de Berenjena (Solanum melongena L.) como promotor de crecimiento vegetal bajo condiciones de invernadero. Instrumento Reporte Alumno: Joel Guadalupe Benítez Castillo, Vladimir Fecha:07.12.2023 Chavarín Pérez, Kevin Nazaret García Cota, Ailin Islas Raymundo, Arturo Javier Ledesma Becerra. Carrera: Ingeniería en Agrobiotecnología Asignatura: bioproductos Caracterización Grupo: IAB102 de Unidad temática: III.- Formulación, uso y manejo de bioproductos Profesor: Ing. Martín Ponce Contreras Evaluación del bioproducto a base de Bacillus subtilis en el cultivo de Berenjena (Solanum melongena L.) como promotor de crecimiento vegetal bajo condiciones de invernadero. I.- Introducción La aplicación de fertilización es importante debido a que es la alimentación del vegetal, para el cultivo de berenjena (Solanum melongena L.) también requiere su alimentación. Dicha alimentación requiere abonos sólidos simples que sean de buena solubilidad cómo nitratos, fosfatos, sulfatos, ácido nítrico, fosfórico (Infoagro, 2023), esto debido a su bajo coste de adquisición, sin embargo hoy día muchos de estos cultivos aplican paquetes tecnológicos con las bondades de la biotecnología, como el uso de microrganismos solubilizadores de nutrientes y/o promotores del crecimiento vegetal, como el Bacillus subtilis que pueden inocularse al suelo para su aprovechamiento en el cultivo mediante aplicaciones localizadas como el drench. De acuerdo a Rivera-cruz en 2008 comentó que la intervención de la biotecnología nos ha dado la pauta para crear y promover los bioproductos para el campo agrícola. González- león en 2020 dijeron que, para esto, se aprovecha la capacidad que tienen algunos microorganismos específicos que fueran promotores de crecimiento, todo esto gracias a mecanismos que hacen qué haya mayor disponibilidad de nutrientes, ayudar en el control de plagas y enfermedades además de reducir erosión del suelo y el uso de productos de síntesis química. Una alternativa con mayor participación en el manejo de los cultivos, trabajando de manera integral es el uso de los bioproductos (biofertilizantes, bioestimulantes y bioplaguicias) por ser económicos y biológicamente aceptables. Un bioinsumo es un producto compuesto o de extractos de microorganismos o plantas, con la capacidad de mejorar la productividad, calidad o sanidad de la planta, sin generar condiciones negativas en el ambiente (Gerwick y Sparks, 2014; Dayan y Duke, 2014; Duke, 2018). La bacteria del Género: Bacillus y especie: subtilis (además de trichoderma) es un microorganismo que ha ganado importancia ya que ha demostrado efectividad como promotor de crecimiento vegetal (PGPR) e inductores de resistencia de diferentes tipos de estrés en la planta (ISR) (Su, Liu & Zhang, 2020; Tseng et al., 2020). Bacillus subtilis, es procariota, en forma de bacilo con diámetro de 850 nm, Gram positiva, es móvil con flagelos perítricos, aerobia y anaerobia facultativa, también de catalasa positiva que degrada almidón. Con un intervalo de crecimiento de 4.9 a 9.4 de pH, con temperaturas de los 10 a 48°C y un óptimo de 28 a 35°C, con la capacidad de formación de endosporas además de poder crear compuestos antimicrobianos (Ravel & Fraser, 2005; Errington &Wu, 2017; Nagórsaka, Bikowski & Obuchowski, 2007; Chen et al., 2008). Villareal et al., 2018, comentó qué este microorganismo posee mecanismos de acción eficientes, como: secreta de antibióticos, endotoxinas, producción de sideróforos, enzimas líticas y coadyuvan a la resistencia sistémica inducida. Dichos mecanismos de acción son; • Producción de lipopéptidos para la interacción con la membrana citoplasmática de células bacterianas o fúngicas, provocando la formación de poros y un desbalance osmótico, lo que desencadena la muerte celular de los microorganismos fitopatógenos (Aranda et al., 2005; Gong et al., 2006). • Degradación de la pared celular de hongos fitopatógenos por enzimas líticas • Los sideróforos como mecanismo de inhibición gracias a la producción de metabolitos secundarios, disminuyendo la disponibilidad para patógenos (Neilands 1995; Wilson et al. 2016). • Producción de δ-endotoxinas; proteína cry (cristal): por el cual se efectúa un desequilibrio osmótico, que finalmente destruye el epitelio intestinal y en consiguiente la muerte celular (Portela-Dussán et al., 2013; Xu et al., 2014). • Producción de moléculas elicitoras que inducen a la resistencia sistémica inducida en la planta. B. subtilis coloniza la rizosfera mediante mecanismos de desplazamiento como: “swarmin”: deslizándose en grupos de bacterias en forma de película por medio de flagelos, “swwiming”: esto es de forma individual por flagelos en un medio semi sólidos, “twitching”: mediante un movimiento de contracción de pilis bacterianos, “glidig”: dezlisamienso sin ayuda de apéndices y el “sliding”: por extensión sobre una superficie usando compuestos tensoactivos, los cuales les permiten a las bacterias moverse hacia los rizodepósitos de nutrientes, siendo estos los principales mecanismos bacterianos de la promoción del crecimiento vegetal (Constanza et. al., 2014). Los ácidos húmicos y fúlvicos, conocidos también como sustancias húmicas son compuestos biosintéticos orgánicos, generalmente se pueden encontrar en los suelos además de hacerlo en varias concentraciones y provenir de diferentes fuentes como: ríos, lagos, océanos, de la leonardita, sedimentos, etc. (Yanagi et. al., 2003). De acuerdo a Stevenson 1994, documento que, las sustancias húmicas se clasifican en cuanto a la solubilidad en función del pH como: huminas (color negro), ácidos húmicos (coloración café y/o grisácea) y ácidos fúlvicos (amarillos y/o naranjas). En 2002 Nardi et. al., realizó un estudio dónde presentó los efectos de estas sustancias en el proceso de crecimiento y desarrollo, pudiendo resumir que ayuda a la influencia positiva del transporte de iones lo cual facilita la absorción, además del aumento de la respiración celular y de la velocidad de las reacciones enzimáticas del ciclo de Krebs, resultando en una mayor producción de ATP. Aumentando el contenido de clorofila, la velocidad de síntesis de ácidos nucleicos, provocando un efecto selectivo en la síntesis de proteínas y también en el aumento o inhibición de la actividad de diferentes enzimas. Por su parte las bacterias necesitan un mínimo de nutrientes: agua, una fuente de carbono, una fuente de nitrógeno y algunas sales minerales (Corrales et. al., 2015). Por lo tanto, la Maltodextrina es un polvo de carbohidratos que tiene alta solubilidad y dispersabilidad (Europharma, 2023) funcionando como fuente de carbono para estos microorganismos. Otra fuente de carbono es la melaza, alimenta los microorganismos del suelo, promoviendo la actividad microbiana, estimula el crecimiento y desarrollo de las plantas debido a los aminoácidos y vitaminas que posee, pudiendo tener una mejor absorción de nutrientes además de estimular la producción de enzimas y promover la síntesis de hormonas (Lima et. al., 2022). Dicho esto, este microrganismo puede ser inoculado mediante la técnica de fertilización por drench, que de acuerdo a AEFA, la aplicación localizada es más acertada debido que va a la zona radicular de en lugar de distribuirlo de manera uniforme por todo el suelo, siendo efectiva debido a que solo se aplica lo requerido mediante los inyectores. II. Objetivos: General: Realizar la evaluación del bioproducto líquido a base de Bacillus subtilis para su valoración como promotor de crecimiento vegetal en el cultivo de Berenjena (Solanum melongena L.) bajo condiciones de invernadero en la Universidad Tecnológica de la Costa. III.- Metodología: Metodología para la inoculación del microorganismo Tabla 9. Materiales y equipo utilizados para la práctica Materiales Probeta 1L Agua Bioproducto a base de Bacillus subtilis Flexómetro Jeringa de 25 ml Cubeta Equipo Aspersora manual de mochila Planta de berenjena Fertilizante solido 1. Se estableció la planta en el invernadero con una fertilización de base el día 13 de octubre del año en curso. 2. Se diseñó la distribución de los tratamientos. Tabla 10. Distribución de los tratamientos. Tratamientos Dosis T1 T1 T6 T2 T7 T3 T8 Trichoderma + fertilización química Bacillus T2 subtilis + fertilización química Pseudomonas fluorescens + fertilización química T4 T3 10 ml/L T4 T5 T6 T7 Fertilización química T9 T8 T5 T9 25 ml/L Testigo T10 T10 3. Se realizó la primera inoculación del bioproducto el día 31 de octubre del año en curso. 4. Se agregó 3 L de agua en una cubeta, medida con la probeta. 5. Se colocó con la jeringa 10 ml de bioproducto por litro de agua en la cubeta para el tratamiento 2. 6. Se añadió con la jeringa 25 ml de bioproducto por litro de agua en la cubeta para el tratamiento 7. Figura 11. Preparación de la mezcla para la aplicación del bioproducto 7. Se vertió la mezcla realizada en la aspersora manual de mochila. 8. Se inoculó mediante la técnica de Drench, la cual consiste en aplicar la mezcla sobre el suelo, cerca del tallo. Figura 12. Inoculación del bioproducto al cultivo de berenjena Antes de aplicar la primera inoculación, se hizo lo siguiente: 1. Se eligió 5 plantas por tratamiento para la toma de datos morfológicos. 2. Se tomó la altura de las 10 plantas seleccionadas con la ayuda del flexómetro. 3. Se contó el número de hojas reales de dichas plantas. 4. Se registraron los datos obtenidos en una libreta de trabajo. 5. A las 5 semanas después de la plantación se contó dos veces el número de flores y botones por planta con un intervalo de 6 días entre la primera y segunda toma de datos. Figura 13. Toma de datos Cabe mencionar que se realizaron 4 inoculaciones por tratamiento a partir de la primera con un intervalo de una semana entre cada una, siguiendo la misma metodología, antes de cada inoculación se hacía la toma de datos morfológicos. IV.- Resultados: Centimetros Altura de planta 45 40 35 30 25 20 15 10 5 0 T1 T2 T3 T4 T5 T6 T7 10 ml/L T8 T9 T10 25 ml/L Evaluaciones Eva 1 Eva 2 Eva 3 Eva 4 Figura 14. Altura de planta En la figura 4 se observa la altura en centímetros que alcanzó la planta después de aplicar los bioproductos con los microorganismos fungiendo como promotores de crecimiento, para los primeros tratamientos donde la dosis fue de 10 ml/L podemos apreciar la diferencia en comparación con su testigo absoluto por ejemplo en el tratamiento 2 que corresponde a Bacillus subtilis + fertilización química si lo comparamos con el tratamiento 5 el cual es el testigo nos damos cuenta de acuerdo a las diferencias que hubo en las 4 evaluaciones realizadas que las plantas donde se inoculo el microorganismo crecieron en promedio 7 cm más que las del testigo, en los tratamientos de la segunda dosis que fue de 25 ml/L también la diferencia es notoria en comparación con el testigo por ejemplo el tratamiento 7 que corresponde a Bacillus subtilis + fertilización química comparado con el tratamiento 10 que es el testigo la diferencia es evidente, de acuerdo a las diferencias en las evaluaciones realizadas podemos determinar que en promedio las plantas del tratamiento 7 crecieron 11 cm más que las del testigo. Lo que se menciona anteriormente concuerda con lo que dice Su, Liu & Zhang, 2020; Tseng et al., 2020 que Bacillus subtilis ha demostrado efectividad como promotor de crecimiento vegetal (PGPR) e inductor de resistencia de diferentes tipos de estrés en la planta (ISR). Número de hojas por planta Número de hojas por planta 12 10 8 6 4 2 0 T1 T2 T3 T4 T5 T6 T7 10 ml/L T8 T9 T10 25 ml/L Evaluaciones Eva 1 Eva 2 Eva 3 Eva 4 Figura 15. Número de hojas por planta En la figura 5 se aprecia el número de hojas por planta después de aplicar los bioproductos con los microorganismos haciendo la función de promotores de crecimiento, en los primeros 5 tratamientos la dosis fue de 10 ml/L aquí se logra ver que algunos tratamientos en comparación con el testigo si tienen diferencia a favor, en el caso del tratamiento 2 que es Bacillus subtilis + fertilización química en comparación con el tratamiento 5 que es el testigo vemos que en promedio tuvieron el mismo número de hojas por planta de acuerdo a la diferencia entre las evaluaciones realizadas, para los otros 5 tratamientos donde la dosis fue de 25 ml/L también observamos diferencia entre los tratamientos que se les inoculo un microorganismo y el testigo, por ejemplo, el tratamiento 7 que corresponde a Bacillus subtilis + fertilización química en comparación con el tratamiento 10 que es el testigo se aprecia una diferencia a favor del tratamiento 7 donde en promedio hubo 1 hoja más por planta que en el testigo según la diferencia encontrada en las evaluaciones. Número de botones por planta Número de botones por planta 12 10 8 6 4 2 0 T1 T2 T3 T4 T5 T6 10 ml/L T7 T8 T9 T10 25 ml/L Evaluaciones Eva 1 Eva 2 Figura 16. Número de botones por planta En la figura 6 se presenta el número de botones que brotaron por planta gracias a los bioproductos inoculados como promotores de crecimiento vegetal, en los tratamientos donde la concentración fue de 10 ml/L se observa la diferencia en comparación con el testigo ya que este no presentó botones, para el tratamiento 2 el cual corresponde a Bacillus subtilis + fertilización química en comparación con el tratamiento 5 el cual es el testigo podemos ver que hay una diferencia a favor del tratamiento 2, en promedio hubo 5 botones más por planta que en el testigo basándonos en la diferencia que existe entre las evaluaciones, para los tratamientos donde la dosis fue de 25 ml/L la diferencia en comparación con el testigo es evidente por que en este tampoco brotaron botones, el tratamiento 7 el cual es Bacillus subtilis + fertilización química en comparación con el tratamiento 10 el cual es testigo se aprecia una diferencia a favor del tratamiento 7, en promedio brotaron 3 botones más por planta que en el testigo según la diferencia entre las evaluaciones. V.- Conclusiones y/o recomendaciones: Logramos realizar la evaluación a nuestro bioproducto a base de Bacillus subtilis en el cultivo de berenjena, midiendo variables morfológicas de las plantas en nuestros tratamientos, como altura de planta, numero de hojas y el brote de botones florales con dos tratamientos a diferentes concentraciones. Gracias a la inoculación con este bioproducto, en base a los resultados analizados, nos muestra que el bioproducto llegó a promover el crecimiento de nuestras plantas en el invernadero y que en mayor dosis de concentración obtenemos mejores resultados, como el desarrollo de las hojas sin embargo no muestra aumento la concentración más elevada en la influencia del aumento de brotes, debido a que en ambas concentraciones el promedio de bonotes florales fue similar, obteniendo la promoción vegetal deseada de acuerdo a las variables morfológicas evaluadas comparadas con nuestro testigo. VI.- Bibliografía: Aplicación de abono localizada | AEFA - Asociación Española de Fabricantes de Agronutrientes. (s. f.). https://aefa-agronutrientes.org/aplicacion-deabono-localizada Aplicación de agroquímicos: manual de buenas prácticas y consejos. (s. f.). Asociación Española de Fabricantes de Agronutrientes. https://fitosanitariosweb.com/como-se-deben-aplicarlos-agroquimicos/ Aranda FJ, Teruel JA and Ortiz A. 2005. Further aspects on the hemolytic activity of the antibiotic lipopeptide iturin A. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Biomembranes. http://dx.doi.org/10.1016/j.bbamem.2005.05.003 1713:51-56. Chen, H., Wang, L., Su, C. X., Gong, G. H., Wang, P. & Yu, Z. L. (2008). Isolation and characterization of lipopeptide antibiotics produced by Bacillus subtilis. Letters in Applied Microbiology, 47, 180-186. http://doi.org/10.1111/j.1472-765X.2008.02412.x Constanza, L., Ramírez, C., Consuelo, L., Leal, S., Yurieth, Z., Galvez2 , A., Estefanía, V., & Burbano2 , M. (2014). 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