DIPLOMATURA EN BIOQUÍMICA CLÍNICA Módulo 7: Líquidos de Punción Clase N.º 4 Estudio microbiológico del LCR Docente: Mg. Dina Pedersen ¡Hola a todos!... ¡Bienvenidos a la microbiología de los líquidos de punción! Trataremos de dar una visión amplia del tema y luego enfocarnos en los microorganismos que más frecuentemente podemos encontrar en un LCR. Así que no se agobien porque parece extenso, pero es necesaria esta mirada primero para luego en función del paciente, su epidemiología y el análisis integral del líquido llegar al diagnóstico correcto. Las infecciones del sistema nervioso central (SNC) presentan una elevada mortalidad y morbilidad. Pueden ser causadas por diferentes microorganismos, incluyendo bacterias, virus, hongos y protozoos. Además, algunas etiologías no infecciosas pueden causar síndromes parecidos a las infecciones del SNC, entre las que figuran: enfermedades neoplásicas, tumores y quistes intracraneales, medicamentos, entre otros. Según la presentación clínica, las infecciones del SNC pueden ocasionar: ✓ Meningitis ✓ Abscesos epidurales ✓ Abscesos subdurales ✓ Encefalitis ✓ Abscesos cerebrales 1 El curso clínico puede ser agudo, subagudo o crónico dependiendo del organismo causal, de la localización de la infección y de la inmunidad del paciente. La mayoría de los pacientes con infecciones del SNC manifiesta fiebre, cefalea, alteración del estado mental o un déficit neurológico focal. Sin embargo, estos hallazgos son inespecíficos y no todos los pacientes con infecciones del SNC tienen todas estas manifestaciones clínicas. Es importante en las infecciones del SNC el estudio del líquido cefalorraquídeo (LCR), ya que como veremos a continuación en muchos casos resulta útil para determinar el diagnóstico etiológico específico. 1. Meningitis Es la inflamación de las meninges, membranas de tejido conectivo que cubren el SNC (cerebro, cerebelo y médula espinal). Es la infección del SNC más común y más severa, y requiere inmediata intervención médica. INFLAMACIÓN 2 Las 3 capas de las meninges son: a) DURAMADRE: es la capa externa, compuesta por tejido conectivo no elástico, resistente que se adhiere a los huesos del cráneo y de la columna vertebral. b) ARACNOIDES: es la membrana del medio, compuesta por colágeno denso y tejido conectivo elástico, se une a la duramadre y a piamadre por prolongaciones cubiertas por epitelio escamoso. c) PIAMADRE: es la membrana interna, compuesta de fino colágeno, tejido conectivo elástico y está cubierta por tejido escamoso epitelial. Es la única membrana meningea que está en contacto con el SNC. 3 ¿¿Todas las MENINGITIS son por microorganismos?? Podemos clasificar las MENINGITIS en INFECCIOSAS Y NO INFECCIOSAS. Dentro de las MENINGITIS INFECCIOSAS, tenemos: 1) MENINGITIS PRIMARIAS: aquellas cuyo agente etiológico proviene de las vías aéreas superiores y son habitualmente de la comunidad, pueden ser bacterianas o asépticas. 2) MENINGITIS SECUNDARIAS: aquellas cuyo origen es debido a un traumatismo o a un acto quirúrgico. Diferentes agentes etiológicos 4 5 Las MENINGITIS INFECCIOSAS, según el tiempo de aparición de las manifestaciones clínicas se agrupan en: MENINGITIS AGUDA: la aparición de signos y síntomas meníngeos ocurre en el transcurso de unas horas a varios días. Los agentes etiológicos involucrados son bacterias y virus. MENINGITIS CRÓNICA: de comienzo insidioso, tiene una aparición media de semanas a meses. Se define cuando los síntomas y signos meníngeos persisten durante al menos cuatro semanas, acompañados de un LCR anormal. Es importante la exploración física de los pacientes, ya que pueden manifestar signos de una enfermedad sistémica asociada que proporcione una fuente potencial para el diagnóstico rápido. Por ejemplo lesiones cutáneas como nódulos o abscesos presente en varias enfermedades sistémicas (criptococosis, infecciones por Acanthamoeba, coccidiodomicosis, sífilis secundaria, entre otros). MENINGITIS BACTERIANA (MB) La meningitis bacteriana adquirida en la comunidad es causada principalmente por tres patógenos, Streptococcus pneumoniae , Neisseria meningitidis y Haemophilus influenzae tipo b. Además, Streptococcus suis en el sudeste asiático, Listeria monocytogenes, estreptococos del grupo B y bacterias gramnegativas como Escherichia coli y Klebsiella pneumoniae , causan meningitis en grupos específicos, incluidos los recién nacidos, las mujeres embarazadas, los receptores de trasplantes y los adultos mayores. 6 A nivel mundial, el número de casos de meningitis bacteriana notificados a los sitios de vigilancia global aumentó entre 2006 y 2016, con una incidencia fuertemente relacionada con la pobreza. En entornos con buenos recursos, la incidencia de MB ha caído por debajo de 0,5– 1,5/100.000 habitantes. Por el contrario, en los países de la región africana del Sahel, donde persiste la meningitis epidémica por N. meningitidis y S. pneumoniae , la incidencia alcanza los 1000/100.000 casos. Más allá del cinturón de la meningitis, la incidencia en África se acerca a 2,5-25/100 000 por población. “Cinturón de la meningitis” en África sub-sahariana 7 La epidemiología mundial de la meningitis es muy dinámica. Los cambios en los últimos 25 años entre adultos y niños se han visto influidos por el uso generalizado de vacunas conjugadas, la epidemia de VIH-1, el despliegue del tratamiento antirretroviral y antibacteriano, y avances significativos en las estrategias de desarrollo y reducción de la pobreza incluida la mejora de la atención materna y neonatal. La MB es una enfermedad de rápido inicio, con gran potencial de brote epidémico y altas tasas de mortalidad y morbilidad. 8 9 El inicio de la infección generalmente comienza cuando el huésped adquiere un microorganismo por colonización nasofaríngea. Muchos de los patógenos meníngeos principales tienen características en la superficie que facilitan la colonización de la mucosa. Por ejemplo las fimbrias (o pili) de N. meningitidis y H. influenzae intervienen en la adherencia de nasofaríngeas. esos microorganismos También constituyen a las factores celulas de epiteliales virulencia para colonización e invasión sistémica la presencia de cápsula de polisacáridos y la producción de proteasas que destruyen la IgA local. Después de la colonización nasofaríngea se produce la diseminación hemática, ya sea a través de la ruptura entre las uniones de las células epiteliales o por un mecanismo intracelular de endocitosis. Una vez en la sangre deben superar los mecanismos de defensa del huésped; la presencia de cápsula inhibe la fagocitosis por neutrófilos y resiste la actividad bactericida mediada por complemento clásico. Los patógenos 10 meningeos mas frecuentes (H. influenzae, N. meningitidis, S. pneumoniae, E. coli, S. agalactiae) son capsulados. El huésped posee varios mecanismos de defensa para contrarrestar los efectos antifagocíticos de la cápsula bacteriana. Por ejemplo; la activación de la vía alterna del complemento por el polisacárido capsular de S. pneumoniae produce la escisión de C3 con unión a la superficie bacteriana. Esto facilita la opsonización y la eliminación intravascular del microorganismo. Aquellos pacientes que tengan alteraciones en la vía alterna del complemento (por ej. pacientes con anemia depranocítica o esplenectomizados), tendrán un factor predisponente para el desarrollo de meningitis neumocócica. Los mecanismos por los cuales los patógenos invaden el SNC desde la sangre no están muy claros. Se ha sugerido que el desarrollo de una bacteriemia mantenida e intensa es un factor importante; pero no es el único responsable. Estarían involucrados factores bacterianos como la presencia de ciertas proteínas de membrana externa (ibe10, Omp10) , fimbrias, y asociación con monocitos circulantes. Una vez que los patógenos ingresan en el espacio subaracnoideo se replican e invaden, ya que las defensas del huésped no son adecuadas. Las concentraciones de inmunoglobulinas y de los componentes del complemento son mínimas en el LCR. Se produce la liberación de componentes bacterianos ( pared celular, lipooligosacáridos) que provocan un aumento en la permeabilidad de la membrana hematoencefálica (BHE) y la liberación de citoquinas por macrófagos, neutrófilos y otras células del SNC. Esto genera inflamación del espacio subaracnoideo con hidrocefalia, aumento de la presión intracraneana y una grave alteración del flujo sanguineo cerebral que puede desencadenar en isquemia o infarto 11 cerebral. La diseminación hematógena y la invasión al espacio subaracnoideo puede producirse también a partir de focos distantes como endocarditis e infecciones respiratorias (neumonía) o contiguos (otitis, mastoiditis, sinusitis, abscesos subdurales). Estas infecciones invasivas se observan con mayor frecuencia en pacientes con enfermedades subyacentes (mieloma múltiple, hipogammaglobulinemia, alcoholismo, desnutrición, enfermedad renal o hepática grave, diabetes, inmunosupresión). En la MB causada por L. monocytogenes , S. agalactiae bacteriemia pueden originarse en el tracto y S. suis , la gastrointestinal o genitourinario. En neonatos, el microorganismo más frecuentemente aislado es S. agalactiae. Se ha generalizado el estudio de la colonización vaginorectal en las gestantes (semanas 35-37 del embarazo) y la administración de antibióticos intraparto a las colonizadas, y profilaxis antibiótica a los recién nacidos pretérmino. En la República Argentina, la Ley Nº 26369 12 promulgada en el 2008 establece la obligatoriedad de realizar dichos cultivos en todas las embarazadas dentro del período gestacional señalado. Se han descripto en la literatura tasas de colonización que van desde 10 al 40%. En nuestro país esos valores oscilan entre el 5% y el 18%. En el Hospital Municipal de Bahia Blanca entre los meses de junio de 2016 y mayo de 2018 se estudiaron 350 mujeres embarazadas con 35 a 40 semanas de gestación. S. agalactiae se recuperó en 28 muestras de las 350 estudiadas, obteniéndose una prevalencia de 8,0%. La mayoría de los casos de meningitis neonatal se da en el primer mes de vida y están causados por S. agalactiae subtipo III. Escherichia coli es otro agente de meningitis neonatal, cerca del 84% de los casos están causados por cepas que tienen el antígeno K1 (capsular). Su presencia se relaciona con prematurez, bajo peso, prolongación del embarazo tras la rotura prematura de membranas, tratamientos antibióticos previos e infecciones urinarias maternas durante el embarazo. La infección por Listeria monocytogenes es frecuente en niños menores de un mes y en adultos mayores de 60 años. Se transmite al bebé durante el parto y también vía trasplacentaria. En adultos son factores predisponentes: alcoholismo, inmunodepresión, diabetes, hepatopatías, nefropatías crónicas, enfermedades del colá- geno, entre otros. Neisseria meningitidis y Streptococcus pneumoniae son responsables de más del 80% de los episodios de meningitis aguda de la comunidad; excluyendo las edades extremas de la vida. Si bien la incidencia de meningitis por Haemophilus influenzae b ha disminuido debido a la incorporación de la vacuna conjugada, hay que 13 tener en cuenta que pueden observarse casos en niños que no han sido vacunados o con vacunación incompleta. El aislamiento de este microorganismo en niños mayores y adultos puede señalar la presencia de ciertas alteraciones subyacentes, como sinusitis, otitis media, epiglotitis, esplenectomía, alcoholismo, diabetes mellitus o traumatismo craneoencefálico. MENINGITIS ASÉPTICA Los virus son la principal causa del síndrome de meningitis aséptica, un término que se usa para definir una meningitis en la cual hay pleocitosis linfocitaria del LCR y donde las coloraciones y cultivos son negativos. 14 Entre los virus que causan con mayor frecuencia meningitis, se encuentran los enterovirus (EV) (principalmente los enterovirus no polio). Los echovirus 4, 6, 9, 11 y 30 son reconocidos como productores de grandes epidemias y los coxsackie A y B como productores de brotes, aunque con menor incidencia en la población. En los lugares con climas templados, los EV tienen una estacionalidad marcada en verano y otoño, y en zonas tropicales y subtropicales se observa una incidencia alta durante todo el año. Los períodos calurosos parecen facilitar la diseminación fecal-oral de estos microorganismos. Los lactantes y niños son los huéspedes más susceptibles en la comunidad ya que generalmente no tienen exposición previa ni inmunidad adquirida. Los herpes virus, herpes simple 1 y 2 (VHS), varicela zoster (VVZ), los citomegalovirus (CMV) y el virus de Epstein Barr (VEB) le siguen en importancia, junto con arbovirus y adenovirus. En los pacientes que han pasado el período neonatal, es muy importante diferenciar la 15 encefalitis por herpes simple (una forma potencialmente mortal) de la meningitis por herpes simple, (un síndrome autolimitado). Dentro de los virus herpes, tenemos que mencionar los virus herpes 6, 7 y 8 que se han relacionado con meningoencefalitis; sin embargo estos virus pueden persistir en el SNC y se ha demostrado tambien en el LCR de personas asintomáticas. En las poblaciones no inmunizadas, el virus de la parotiditis (de la familia Paramyxoviridae género Rubulavirus) es causa de meningitis aséptica y encefalitis. Las enfermedades del SNC causadas por este virus pueden surgir en pacientes sin síntomas de parotiditis (del 40 al 50% de pacientes con meningitis urleana no tiene signos de inflamación de las glándulas salivales). El virus de la inmunodeficiencia humana (VIH) puede atravesar las meninges precozmente y persistir en el SNC después de la infección inicial. Puede surgir una meningitis asociada al VIH como parte de la primoinfección o en un paciente ya infectado. Sin embargo no se produce meningitis aguda en todos los individuos que se infectan y puede ser silente. Los virus respiratorios (incluido el SARS-CoV-2) pueden penetrar en el SNC, afectar tanto a neuronas como a células gliales (neurotropismo) e inducir diversas patologías neurológicas. El SARS-CoV-2 puede causar encefalitis, ictus isquémico y polineuropatía en pacientes infectados con el virus. Ingresa a las células del SNC uniéndose al receptor de la enzima convertidora de angiotensina II (ECA II). Se ha detectado ARN vírico en el LCR de pacientes que padecieron encefalitis y estudios de necropsias por SARS-CoV-2 confirmaron la infección de neuronas en la corteza y en el hipotálamo en pacientes fallecidos. 16 Los virus inicialmente colonizan las mucosas (respiratoria, gastrointestinal, etc.) y si son capaces de eludir los mecanismos de defensa iniciales del huésped (moco, células ciliadas, macrófagos alveolares, acidez gástrica, enzimas gastrointestinales, etc.); pueden multiplicarse y diseminarse vía hematógena con la posibilidad de invadir el SNC. Una vez que se produce la infección del SNC, se desarrolla la respuesta inflamatoria. Hay llegada de inmunoglobulinas por el aumento en la permeabilidad de la BHE y también se produce una síntesis local de las mismas. La respuesta inmunológica intacta del huésped es importante para eliminar los virus del SNC. Las meningitis virales pueden ocurrir como casos esporádicos, o bien como brotes epidémicos en distintas épocas del año de acuerdo con el comportamiento epidemiológico del agente causal. 17 Las medidas de distanciamiento social y el confinamiento introducidos durante la pandemia del SARS-CoV2 llevaron a una disminución del 2030 % en la incidencia de meningitis en los últimos dos años. La meningoencefalitis es uno de los eventos de comunicación o denuncia obligatoria. En nuestro país en abril del 2018 se comenzó a implementar el nuevo Sistema Nacional de Vigilancia de la Salud (SNVS2.0 ). El mismo es un sistema de información desarrollado en el marco del Sistema de Información Sanitaria Argentina (SISA) que permite integrar distintas fuentes y estrategias de vigilancia. El laboratorio es uno de los actores, y somos nosotros los bioquímicos los responsables de notificar aquellos eventos de denuncia obligatoria. Dentro de las meningitis aséptica, y con mucho menor frecuencia tenemos que incluir también a otras bacterias, hongos y parásitos. 18 T. pallidum se disemina al SNC al principio de la infección. La neurosífilis se puede clasificar en formas tempranas y tardías. Las formas tempranas involucran el líquido cefalorraquídeo, las meninges y la vasculatura. Las formas tardías involucran el parénquima de la médula y el encéfalo. La incidencia global de neurosífilis ha aumentado y muchos de estos casos se observan en pacientes con infección por el VIH. La infección en los seres humanos con amebas de vida libre (AVL) es un hecho poco frecuente que suele ser fatal, tanto en individuos sanos como en personas inmunocomprometidas. A diferencia de otros protozoos patógenos, en estos organismos no se conocen vectores predisponentes y no hay estado portador humano. Dentro de los causados por las AVL tenemos a la síndromes clínicos meningoencefalitis amebiana primaria (MAP) y la encefalitis granulomatosa amebiana (EGA). La MAP es causada por Naegleria fowleri y ocurre más comúnmente en niños sanos y adultos jóvenes con exposición reciente en agua dulce. Constituye una enfermedad de forma aguda con un periodo de incubación muy breve. La Naegleria obtiene acceso al SNC por la invasión directa a través de la mucosa nasal y la lámina cribosa, pudiendo provocar una meningoencefalitis mortal en un plazo de 3-7 días. La EGA causada por Acanthamoeba spp., Balamuthia mandrillaris y Sappinia pedata es una infección subaguda o crónica que se disemina de forma hematógena de lesiones pulmonares o de la piel al SNC , resultando en un déficit neurológico focal progresivo durante días o meses a una meningoencefalitis difusa y posteriormente la muerte, en personas inmunocomprometidas. La meningitis tuberculosa puede producirse por vía hematógena durante la primoinfección o una reactivación; o bien por ruptura y drenaje al 19 espacio subaracnoideo de un foco parameningeo ya existente. El agente causal es generalmente M. tuberculosis . La meningitis criptocócica puede manifestarse como una meningitis subaguda o crónica. Producida por el hongo levaduriforme Cryptococcus neoformans var. neoformans de distribución universal , que afecta generalmente a pacientes con algún tipo de inmunosupresión; y C. neoformans var. gatti relacionado a ciertas áreas tropicales y subtropicales de Australia, Asia, África y Sudamérica que afecta a pacientes previamente sanos . MENINGITIS SECUNDARIAS Las infecciones post-quirúrgicas del SNC, los traumas penetrantes de huesos del cráneo y malformaciones congénitas como mielomeningocele pueden producir infecciones en el espacio subaracnoideo. Los bacilos Gram (-) aerobios (Klebsiella spp, Escherichia coli, Serratia marcescens, Pseudomonas aeruginosa, Acinetobacter spp) pueden aislarse del LCR de pacientes después de un traumatismo craneoencefálico o procedimientos neuroquirúrgicos. También pueden encontrarse en neonatos, ancianos, pacientes inmunocomprometidos y pacientes sépticos. En aquellos pacientes internados en las Unidades de Cuidados Intensivos, la etiología de la meningitis post quirúrgica dependerá también de la epidemiología local. 20 En pacientes con algún grado de inmunocompromiso, la meningitis muchas veces se presenta de manera subaguda o crónica. La distribución de los patogenos está determinada por la naturaleza del defecto de las defensas del huesped. Una historia de exposición puede ser relevante a la hora de sugerir ciertas enfermedades infecciosas como tuberculosis, coccidiodomicosis, histoplasmosis, brucelosis, cisticercosis, sífilis, etc. 21 22 Entonces…..ante la sospecha clínica de una meningitis, se debe realizar una punción lumbar!! Es un procedimiento médico que no debe retrasarse; el diagnóstico y tratamiento precoz va a resultar en una mejor evolución del paciente con una disminución en las complicaciones y secuelas. 23 24 25 26 27 Como vemos, la sensibilidad del Gram depende de la concentración del inóculo, del tipo de microorganismo y por supuesto también de la experiencia o entrenamiento del profesional. Si el paciente está tratado con antibióticos, por supuesto también afectará la sensibilidad y la especificidad, porque los antibióticos provocan cambios en la pared de los microorganismos que afectan su coloración y distorsiona su apariencia. La técnica de Burri o de la Tinta China, en muchos lugares no se hace de rutina, sino solo cuando el paciente es VIH (+) y lo solicita el médico. Es importante realizarla también en pacientes con otras inmunosupresiones como por ejemplo pacientes en tratamiento crónico con corticoides o enfermedades del colágeno. Si el LCR para el recuento celular se va a pasar por un contador hematológico tener en cuenta que las levaduras pueden ser contabilizadas como células o leucocitos por algunos equipos 28 y por lo tanto obtener un valor falsamente aumentado. Es IMPORTANTE, realizar una observación en fresco entre porta y cubre del LCR, antes de pasar la muestra por el contador. 29 Las levaduras de criptococo se ven en la coloración de Gram como estructuras redondas Gram (+). 30 Se han desarrollado varias pruebas de diagnóstico rápido para ayudar en el diagnóstico de la meningitis bacteriana. Las técnicas detectan los antígenos de H. influenzae tipo b, S.pneumoniae, N. meningitidis, E. coli K1 y S. agalactiae. Sin embargo, en muchos de los equipos no está incluido el serotipo B del meningococo, debido a la inmunogenicidad limitada de los polisacáridos de este serotipo. Las guías clínicas no recomiendan el uso RUTINARIO de métodos rápidos para el diagnóstico etiológico de las meningitis; sino en presencia de LCR patológicos y ausencia de gérmenes en la coloración de Gram. 31 32 La PCR resulta especialmente útil en los pacientes con meningitis bacteriana que han recibido tratamiento antibiótico previo y cuyos cultivos son negativos. La PCR bacteriana de amplio espectro (PCR Multiplex, como Film Array) es útil para excluir el diagnóstico de meningitis en un corto tiempo (3 horas) . 33 N. meningitidis es uno de los microorganismos que causa MB con mayor frecuencia en el mundo. Existen variaciones geográficas y climáticas en cuanto a su incidencia. En los pacientes con deficiencias en los componentes terminales del complemento (C5, C6, C7, C8 y C9), denominados complejo de ataque a membrana están aumentados las infecciones por neisserias. En nuestro país los serotipos predominantes han fluctuado a lo largo del tiempo, la vigilancia de los mismos y su sensibilidad a los antibióticos la realiza el INEI-ANLIS con las cepas que les derivan los Laboratorios pertenecientes a las Redes de Vigilancia de todo el país. 34 En los siguientes gráficos, se muestra como han ido variando los serotipos predominantes a lo largo del tiempo. 35 36 Inmunización: Vacuna antimeningocóccica conjugada tetravalente (ACYW). Se incorporó al Calendario regular Nacional a partir del año 2017, de forma gratuita y obligatoria para: Lactantes • 3 meses: 1° dosis • 5 meses: 2° dosis • 15 meses: 1° refuerzo Adolescentes • 11 años: Dosis única. 37 38 El método de dilución en agar o la microdilución en caldo se consideran los métodos de elección, aunque también es aceptable el método epsilómetrico con tiras con gradiente de concentración antibiótica, mientras que el método de difusión con discos no es aceptable para evaluar sensibilidad a penicilina. Medios de cultivo: los recomendados por el CLSI son agar Mueller Hinton (MH) con 5% de sangre ovina par el método de difusión; y caldo MH ajustado por cationes (CAMHB) suplementado con 2-5% de sangre de caballo lisada (LHB) para el método de microdilución. Se debe incubar a 35 °C, en atmósfera de 5% CO2, durante 20-24 h. SOLO REALIZAR PRUEBAS DE SENSIBILIDAD SI CUENTA CON CABINAS DE SEGURIDAD BIOLÓGICA TIPO II 39 Streptococcus pneumoniae (neumococo): Es un diplococo grampositivo, lanceolado, con cápsula. Al momento se han identificado 90 serotipos y más de 40 subgrupos de neumococos. Sin embargo, 18 de los serotipos más comunes causan aproximadamente el 82% de todos los casos de meningitis. El INEI-ANLIS también realiza la vigilancia continua de serotipos de S. pneumoniae a través de unidades centinela; observándose una disminución de la enfermedad neumocócica invasiva después de la introducción al calendario de la vacuna antineumocóccica conjugada 13 valente en el año 2011 para niños menores de 2 años. Ver Anexo. Tablas de vigilancia SIREVA II. Argentina 2020. 40 Inmunización: VACUNA CONJUGADA DE 13 SEROTIPOS (VCN13): Fue incorporada al calendario de Vacunación en el año 2011. Contempla la aplicación de 2 dosis en la infancia y un refuerzo (2, 4 y 12 meses respectivamente). La fórmula incluye 13 serotipos de neumococo (1, 3, 4, 5, 6A, 6B, 7F, 9B, 14, 18C, 19A, 19F y 23F) conjugados con el transportador CRM197, una variante no tóxica recombinante de la toxina diftérica. A diferencia de las vacunas polisacáridas, las conjugadas tienen una respuesta inmune T-dependiente, por lo que presentan memoria inmunológica y son efectivas en menores de 2 años. Además, previenen la portación respiratoria del S. pneumoniae. VACUNA POLISACÁRIDA DE 23 SEROTIPOS (VPN23): Es una vacuna que contiene polisacáridos purificados de 23 serotipos de neumococo (1, 2, 3, 4, 5, 6B, 7F, 8, 9N, 9V, 10A, 11A, 12F, 14, 15B, 17F, 18C, 19A, 19F, 20, 22F, 23F y 33F) con el agregado de fenol como conservante. Produce una respuesta inmune T-independiente por lo que no genera inmunidad de memoria. No tiene impacto sobre la portación respiratoria. Tiene una efectividad del 75 % para la prevención de la enfermedad invasiva neumocócica en la población inmunocompetente mayor de 65 años, siendo esta efectividad menor en poblaciones con inmunodepresión. La vacuna no es inmunogénica en menores de 2 años, por lo cual no está indicada en este grupo de edad. 41 En la coloración de Gram se observan diplococos Gram (+), lanceolados o en cortas cadena. Si movemos el micro vamos a notar un espacio alrededor de la bacteria sin colorear, poniendo en evidencia la cápsula. A veces cuando el paciente ya tiene una dosis de antibiótico, los neumococos se ven como Gram (-) e incluso pierden su morfología clásica de diplococo, dificultando el diagnóstico preliminar. En agar sangre desarrollan colonias alfa hemolíticas, transparente y pueden ser mucosas. En agar chocolate, colonias verdosas. Son catalasa (-), optoquina sensible y solubilidad en bilis (+). 42 Streptococcus pneumoniae, cepa mucosa en agar sangre. 43 44 Para el método de difusión debe emplearse Mueller Hinton con 5 % de sangre ovina, y para el método de dilución en caldo, caldo Mueller-Hinton suplementado con cationes y 2,5-5% de sangre lisada de caballo. La incubación debe realizarse por 20-24 hs, en atmósfera de CO2 para el método de difusión y atmósfera normal para e método de dilución. Se deben ensayar los siguientes antibióticos: oxacilina, clindamicina, eritromicina, TMS, tetraciclina, rifampicina, levofloxacina y vancomicina. El disco de oxacilina se utiliza como screening para sensibilidad a penicilina. Haemophilus influenzae es un cocobacilo gramnegativo. Se han identificado seis serotipos antigénicos capsulados (designados con las letras “a” a la “f”). H. influenzae serotipo b (Hib) es el agente más virulento, causante de las infecciones invasivas como las meningoencefalitis. Las cepas que carecen de cápsula de polisacárido se denominan 45 generalmente no tipificables y producen infecciones de mucosas como otitis media aguda. Es una de las tres causas principales de MB. Se ha observado una notable reducción en la incidencia de infecciones invasivas por este microorganismo; esto se atribuye, en parte, al uso extendido de vacunas conjugadas. Como se observa en la tabla, la mayor incidencia de enfermedad invasiva por Hi se da en los niños menores de 12 meses, que es justo la población con el esquema incompleto de vacunación. Ver Anexo. Tablas de vigilancia SIREVA II. Argentina 2020. Hi. 46 Inmunización: Vacuna anti Haemophilus Influenzae b fue incorporada al Calendario Nacional de vacunación en 1998. En menores de un año se utiliza combinada como vacuna quíntuple (DTP-Hib-HB) a los 2, 4 y 6 meses y a los 18 meses como vacuna cuádruple (DTP-Hib). La indicación de vacuna monovalente anti-Hib se circunscribe a personas inmunocomprometidas mayores de 5 años infectados con VIH (sintomáticos o asintomáticos), aun con esquema completo y para niños mayores de 5 años esplenectomizados, con deficiencias IgG2, pacientes con cáncer o trasplantados con precursores hematopoyéticos, aun con esquema completo. 47 Colonias de Haemophilus creciendo “en satélite” alrededor de colonias de estafilococos. Las colonias son muy pequeñas y deben ser miradas con atención. El uso de Agar chocolate, y la incubación en estufa de CO2 mejora notablemente la recuperación de Haemophilus. 48 El medio de cultivo requerido para la prueba de difusión por discos y para la CIM es el Haemophilus Test Medium (HTM), que contiene los factores V (NAD) y X (hemina), necesarios para permitir el desarrollo in vitro de éste microorganismo. Se debe incubar por 16-18 hs en una atmósfera con 5% de CO2 Para estudios epidemiológicos, los antibióticos a considerar son: ampicilina, amoxicilina-ac.clavulanico, azitromicina, cefaclor, trimetro- prima/sulfametoxazol, cloranfenicol , ácido nalidixico y cefuroxima. En aislamientos resistentes a ampicicilina, cefaclor o cefuroxima, evaluar la actividad de cefotaxima. En caso de no tener HTM realizar alguna prueba de beta lactamasa (por método microbiológico, iodométrico, acidimétrico o cefalosporinasa cromogénica). H. influenzae en Agar chocolate casero 49 H. influenzae en Agar chocolate comercial En la tabla siguiente se especifican las características más importantes de los agentes etiológicos más frecuentes: 50 Los estreptococos del grupo B también pueden causar meningitis en los adultos. Los factores de riesgo incluyen la edad superior a 60 años, la diabetes mellitus, el embarazo o el post-parto, cardiopatías, enfermedades del colágeno vascular, tumores, alcoholismo, entre otros. 51 Colonias de S. agalactiae en Agar Sangre Prueba de CAMP + (Punta de flecha): En agar sangre de carnero. 52 C: Control positivo/? cepa en estudio. Aunque las tasas de colonización son bajas, las mujeres embarazadas pueden ser portadoras de L. monocytogenes de forma asintomática en el aparato genital y el recto; y transmitir la infección a sus hijos. Listeria monocytogenes, beta hemólisis en agar sangre. 53 54 Prueba de CAMP + (“cabeza de fósforo”) Las pruebas de susceptibilidad a los antimicrobianos se realizan por CIM, el medio de cultivo recomendado es el caldo Mueller Hinton ajustado por cationes (CAMHB) suplementado con 2-5% de sangre de caballo lisada (LHB). Se evalúa la sensibilidad a penicilina, ampicilina y trimetroprima sulfametoxazol. 55 Meningitis tuberculosa Los métodos de diagnóstico directo por microscopía, permanecen sin cambios hace más de 100 años. Las micobacterias son difíciles de colorear debido al alto contenido en lípidos de su pared. Forman sí complejos estables con colorantes como fucsina y auramina; y este complejo es resistente a la decoloración con alcohol y ácidos fuertes. La coloración de Ziehl-Neelsen (ZN) es la más utilizada por todos los laboratorios. Las coloraciones basadas en colorantes fluorescentes (auramina, rodamina) permiten un mayor contraste y al mirarse con menor aumento (400X) se puede analizar más material en menos tiempo. Sin embargo, requiere de un observador experimentado y los resultados positivos deben confirmarse con ZN. La baciloscopía debe ir acompañada de cultivo. Es posible usar tanto medios sólidos como líquidos. Los líquidos son más sensibles a la contaminación, pero permiten el desarrollo en menor tiempo. En los últimos años han aparecido métodos de cultivo en medio líquido con indicador de crecimiento, lo cual acorta aún más el tiempo de detección. Los primeros sistemas se basaban en la detección de CO2 radiactivo producido a partir de un sustrato marcado (BACTEC, Becton Dickinson). Posteriormente se 56 desarrollaron sistemas no radioactivos basados en la detección de productos fluorescentes (MGIT, Becton Dickinson y BACTEC BD), aumento de la presión en la botella de cultivos o sensores colorimétricos (MB/BacT, BioMerieux). Si tomamos en consideración uno de los últimos consensos que considera el diagnóstico de la meningitis tuberculosa como confirmado (aislamiento de M. tuberculosis en cultivo) o altamente probable (manifestaciones clínicas compatibles, pleocitosis linfocitaria e hipoglucorraquia, respuesta al tratamiento tuberculostático), la sensibilidad de los métodos de moleculares oscila entre el 60% y el 100%, y la especificidad del 80% al 100%. La sensibilidad se correlaciona con la baciloscopía, disminuyendo significativamente en casos de baciloscopías negativas. Los métodos moleculares son de elección en el diagnóstico de meningitis tuberculosa por su rapidez, especificidad y sensibilidad. El cultivo en cualquiera de sus formas, continúa siendo el método de referencia para el aislamiento, tipificación, antibiotipo y epidemiología de las micobacterias. Esto puede combinarse, reemplazarse en parte y enriquecerse con el uso de técnicas moleculares. Técnicas moleculares 1) Secuenciación: se emplean en laboratorios de referencia y brindan información para el diseño de sondas especie específicas. Mediante esta técnica se han identificado nuevas especies, indiferenciables mediante pruebas bioquímicas. 2) Utilización de sondas para tipificación: debido a que la tipificación bioquímica de los aislamientos de micobacterias es sumamente compleja y lenta se han publicado secuencias de ADN especie-específicas que permiten la tipificación molecular a partir de aislamientos primarios. 3) Amplificación directa a partir de muestras clínicas: la sensibilidad y especificidad es muy variable y depende de factores como una óptima extracción del ADN, si se realiza el procedimiento "en casa" ("in house") o con un kit comercial y la correcta aplicación de los pasos para la reacción de polimerasa en cadena (RPC); todo ello relacionado con la experiencia del operador. 57 Existen diversas secuencias de ADN específicas de M tuberculosis que pueden ser amplificadas como la IS986, Ag85, MPB-64, TRC4. Sin embargo, la IS6110 ha demostrado ser el ensayo de PCR de un solo paso de mejor sensibilidad y especificidad. Las técnicas de RPC en tiempo real podrían llegar a ser la principal prueba diagnóstica para el diagnóstico de meningitis tuberculosa. El sistema de PCR real time GeneXpert MTB/RIF detecta M. tuberculosis y resistencia a rifampicina en 2 horas. 4) Sistemas moleculares de tipificación: La utilización de huellas moleculares (fingerprinting) ha conducido al desarrollo de un método estándar internacional de tipificación. Mediante la técnica de RFLP (restriction fragment length polymorphisms) que involucra extracción del ADN, restricción con endonucleasas, Souther blot, se puede obtener una verdadera huella digital de cada cepa. 58 Otras infecciones del SNC: 1- Absceso epidural Es una colección de pus localizada entre la duramadre y el cráneo o columna vertebral. Con frecuencia existe un empiema subdural asociado. Por lo tanto, la etiología bacteriana y la patogenia del absceso epidural son idénticas a las descriptas en el punto anterior; con el foco inicial situado habitualmente en los senos paranasales, oído medio o las celdillas mastoideas. Los abscesos epidurales espinales suelen ser secundarios a la diseminación hematógena desde focos distantes o por extensión de una osteomielitis vertebral. Son factores predisponentes: adictos a drogas endovenosas, pacientes con catéteres, con endocarditis infecciosa, con infecciones de piel y partes blandas, diabéticos. 59 El S. aureus está involucrado en el 50-90% de los abscesos epidurales espinales, otros agentes: estreptococos aerobios y anaerobios (8-17%), bacilos gramnegativos aerobios (12-17%), Nocardia spp, entre otros. El diagnóstico se realiza con RM. El tratamiento consiste en el drenaje quirúrgico y terapia antibiótica empírica para ajustar luego con los resultados del cultivo. 2- Absceso subdural Es una colección de pus en el espacio entre la duramadre y la aracnoides. Las afecciones predisponentes más habituales son las infecciones otorrinológicas, (en especial de senos paranasales), los traumatismos craneanos, los procedimientos neuroquirúrgicos y la infección de un hematoma preexistente. Se aíslan con mayor frecuencia: estreptococos aerobios y anaerobios (25-45%, estafilococos (10-15%), y bacilos gramnegativos aerobios (3-10%). Las infecciones polimicrobianas son comunes. Está contraindicada la punción lumbar para el estudio del LCR debido al riesgo de herniación cerebral. El diagnóstico se realiza con una tomografía computada (TC) con contraste o resonancia magnética (RM). El tratamiento consiste en el drenaje quirúrgico del material purulento y una terapia empírica basada en la coloración del Gram del material y en los factores predisponentes que condujeron al desarrollo del empiema. Se realizan cultivos (aerobios y anaerobios) del material purulento. 3- Encefalitis Es la inflamación del cerebro; cuando además están inflamadas las meninges recibe el nombre de meningoencefalitis. 60 La etiología más frecuente es la viral (EV, VHS, VVZ, CMV, entre otros). Entre las causas no virales se encuentran reacciones a fármacos, sífilis, leptospirosis, Nocardia spp, tuberculosis. En pacientes con SIDA: Toxoplasma, Cryptococcus, Histoplasma, CMV y papovavirus. La pleocitosis de la encefalitis viral es variable (10-2000células/mm3), y suelen predominar las células mononucleares. 4- Abscesos cerebrales Son procesos supurativos localizados en el parénquima cerebral. Poco frecuentes, se producen por diferentes mecanismos: • Vía hematógena (generalmente son múltiples) en pacientes con cardiopatías congénitas cianóticas o sepsis. • Por contigüidad (generalmente son únicos) en pacientes con infecciones como otitis media aguda o crónica, mastoiditis o infecciones odontógenas. • Producidos por invasión del sistema nervioso (traumatismos o cirugías). Son en general polimicrobianos. Existen enfermedades que pueden dar abscesos cerebrales como la toxoplasmosis, la criptococosis, las infecciones fúngicas y la tuberculosis. Agentes más frecuentes: estreptococos aerobios y anaerobios, S. aureus, Bacteroides spp., bacilos gramnegativos, Nocardia spp, H. influenzae, S. pneumoniae, entre otros. 61 Esto es todo por ahora…. en breve estaremos compartiendo unos casos clínicos para discutir entre todos. ¡Cualquier duda nos escribimos en el foro! 62 Bibliografía • Infecciones del Sistema Nervioso Central, Tunkel Allan en: Mandell Gerard, Bennett John, Dolin Raphael Enfermedades Infecciosas Principios y Práctica 6° edición 2006 [1079-1171] • Talleres Integrados de Redes-Infecciones de transmisión sexual-Meningitis e IRAs bacterianas-Resistencia a los antimicrobianos y Diarreas. ANLIS-MALBRÁN Buenos Aires 2013 • Informe SIREVA II ARGENTINA 2020- ANLIS-MALBRÁN • Gema Codina M, Vicente D, Echevarría JE, Prats G. Diagnóstico microbiológico de las infecciones del sistema nervioso central. Enferm Infecc Microbiol Clin. 2011; 29(2):127–134 • Chiavetta L., Chávez E., Ruzic A., Mollerach M., Regueira M. 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