Área de Ciencias Básicas y Ambientales Biología II Manual de Laboratorio Santo Domingo, República Dominicana Profesor(a):_____________________________________ Monitor(a):_____________________________________ Estudiante:_____________________________________ Matrícula:_____-________ ID: ______________ Reglas a seguir 1. Debe ser puntual a las prácticas de laboratorio. Todas las prácticas iniciaran a la hora establecida en el horario. No se permitirá la entrada a los estudiantes que lleguen 15 minutos después de iniciar el laboratorio. 2. Todos los estudiantes deben tener la bata de laboratorio. Los estudiantes que no posean la bata no recibirán la práctica. La bata para el laboratorio de biología ha de ser blanca. 3. Dentro del laboratorio está prohibido fumar y el consumo de comida y bebida. 4. Todo desecho sólido debe ser descartado en los basureros y no en los fregaderos del laboratorio. 5. Al finalizar la práctica es responsabilidad de todos los estudiantes dejar el laboratorio completamente limpio y ordenado. 6. Por su seguridad y la de los instrumentos trátelos con cuidado. 7. No ingerir, tocar y oler directamente los reactivos utilizados en el laboratorio. Trate todos los reactivos como peligrosos, cuidando no derramarlos ni echarlos sobre la piel. Cualquier incidente reportarlo al profesor o al monitor inmediatamente. 8. Cualquier estudiante que sea encontrado haciendo fraude (material de apoyo, copiarse de un compañero, etc.) en un examen de laboratorio se le anulara el pruebín sin derecho a reposición. Procedimiento General En esta sección se describe brevemente el procedimiento general a seguir en el LAB de biología, si el profesor o monitor no indica lo contrario todos los pasos en esta sección se deben llevar a cabo. Antes del laboratorio 1. Leer la introducción de la práctica. Después del título de cada práctica empieza una introducción general al laboratorio del día. 2. Leer la práctica del laboratorio. Esto le ayudará a enfocarse mejor en las partes a estudiar del libro. 3. Estudiar el capítulo del libro de Biología asociado. El examen de laboratorio puede incluir cualquier tema que este comprendido en el capítulo. 4. Responder las preguntas del encabezado “Investigue y estudie”. Estas preguntas son la clave del éxito en el laboratorio, responderlas le ayudará a entender mejor la práctica. 5. Realizar los ejercicios en el encabezado “Para la casa”. 6. Revisar y llevar los materiales que estén bajo el acápite de estudiante. Durante el laboratorio 1. Iniciado el laboratorio el profesor o monitor iniciara una evaluación de contenidos o fogueo de manuales cerrados en el cual los estudiantes podrán participar para acumular puntos de participación. El fogueo incluye todas las preguntas del manual así como material abarcado en el libro de Biología. 2. Terminado el fogueo iniciara la práctica con asesoría del profesor o monitor. 3. Una vez terminada la práctica se procederá a un pruebín de los contenidos revisados en el laboratorio. 4. Durante cualquiera de las partes del laboratorio el monitor o profesor revisara los manuales. Evaluación Los siguientes son modelos estándares de evaluación. La evaluación de las prácticas puede ser modificada por el profesor(a): Pruebínes bisemanales Participación oral Asistencia 24 pts. (6 pts. c/u) 4 pts. 2 pts. Pruebínes bisemanales Participación oral Asistencia Manual 5 pts. c/u (20 pts.) 4 pts. 2 pts. 4 pts. Importante Los estudiantes no admitidos al LAB no tienen derecho a recibir el examen. Una vez concluida la semana de laboratorio no es posible reponer prácticas. PRÁCTICA # 1: ADN, Cariotipo Humano, Cromosomas y Mitosis ADN y Replicación del ADN El ácido desoxirribonucleico, frecuentemente abreviado como ADN, es un ácido nucleico que contiene instrucciones genéticas usadas en el desarrollo y funcionamiento de todos los organismos vivos conocidos y algunos virus, y es responsable de su transmisión hereditaria. El papel principal de la molécula de ADN es el almacenamiento a largo plazo de información. A pesar de ser una molécula de gran tamaño y aparentemente compleja, su estructura es asombrosamente simple. En 1900, se inicia la genética con el redescubrimiento de las leyes de Mendel, en 1906 el británico William Bateson acuñó el término y escribió el primer libro de texto. En 1784 Nageli enuncia la teoría del idioplasma, que establece que el núcleo celular es el vehículo de la herencia. En 1883 Van Beneden trabajando en el nematodo Ascaris descubre la meiosis y reconoce la individualidad de los cromosomas. El ADN fue aislado por Friedrich Miescher en 1869, utilizando el esperma de salmón y de pus de heridas abiertas, y debido a que lo encontró solamente en los núcleos, Miescher denominó a este compuesto como nucleína. A posteriori se lo cambió a ácido nucleico y por último a ácido desoxirribonucleico (ADN). Cuando una célula se divide, la información contenida en el ADN, debe replicarse fielmente y el material genético debe ser transmitido a cada célula hija, mediante una serie de pasos muy precisos y sincronizados. En casi todos los organismos, la replicación o duplicación de las moléculas de ADN tiene lugar en el núcleo, justo antes de la división celular. El ADN lleva la información necesaria para dirigir la síntesis de proteínas. Cromosoma y Cariotipo humano Un cromosoma es una estructura organizada de ADN y proteína encontradas en las células. Se trata de una pieza única de espiral de ADN que contiene muchos genes, elementos reguladores y otras secuencias de nucleótidos. Los cromosomas también contienen ADN-proteínas unidas, que sirven para empaquetar el ADN y controlar sus funciones. El cariotipo humano, también llamado complemento cromosómico, es el conjunto de cromosomas de una especie determinada. Su determinación se realiza observando durante la metafase la dotación cromosómica de una célula, y la obtención de una fotografía durante esta observación permite investigaciones genéticas sobre ese individuo o esa especie, además de ordenar posteriormente los cromosomas según criterios establecidos por el ‘International System for Human Cytogenetics Nomenclatures’. ~4~ Las células con la que generalmente se realiza el cariotipo se obtienen a partir de un cultivo de sangre periférica, después se tratan con tripsina y posteriormente tinción con Giemsa para obtener un bandeo G. El cariotipo humano está formado por 23 pares de cromosomas: 44 autosomas + 2 gonosomas o cromosomas sexuales y se representa por 46 XX para las mujeres y 46 XY para los varones, estos 23 pares de cromosomas se ordenan en 7 grupos de mayor a menor (nombrados A, B, C, D, E, F y G). Mitosis La mitosis es la división celular a partir de la cual, de una célula se obtienen 2 células hijas (2N), genéticamente idénticas a la madre. El hecho es que las células somáticas (células de un organismo eucariótico que no van a convertirse en células sexuales) se reproducen mediante mitosis, esta garantiza el mantenimiento del estado diploide (2N) de una generación a la siguiente, como consecuencia de ello, las células que se reproducen por mitosis tienden a ser genéticamente iguales. La mitosis es un proceso continuo en el cual se distinguen convencionalmente cuatro etapas: profase, metafase, anafase y telofase, que se reconocen por el arreglo de los cromosomas en el citoplasma. El lapso entre una división y otra se denomina interfase. Objetivos - Identificar y explicar las etapas de la mitosis. Describir la función de las estructuras envueltas en el ciclo celular y la mitosis. Utilizar técnicas sencillas para extraer ADN de células animales y vegetales. Capítulos del Libro de Biología Solomon et al. 2013 [9na Edición]: Capítulo 10. Cromosomas, mitosis y meiosis: págs. 213-223 y Capítulo 12. ADN: Molécula portadora de la información genética: págs. 263-281. Investigue y Estudie 1. 2. 3. 4. 5. 6. ¿De qué está compuesto el ADN? ¿Dónde se encuentra el ADN en la célula? ¿Cuántos cromosomas tenemos? ¿Cuántos genes tenemos? ¿Cuál es la función que poseen los genes? Las estructuras presentes en la figura 1 se llaman telómeros. ¿Qué son y cuál es su función? 7. ¿Cómo se pueden utilizar los telómeros en ~5~ Figura 1. Telómeros medicina forense? 8. ¿En qué consistió el proyecto del Genoma Humano? 9. Describe brevemente las etapas de la mitosis. 10. Si la célula no está en mitosis, ¿en qué puede estar? y ¿haciendo qué? 11. Define y describe brevemente cada una de las etapas del ciclo celular. 12. ¿Cuál es la importancia del conocimiento del ciclo celular en medicina? 13. ¿Cuántas veces se divide una célula somática? (para esto consultar el concepto del “Límite de Hayflick”). Destacar la importancia de esto en la medicina. 14. ¿Qué es la apoptosis? 15. Define: centrómero, centriolo, centrosoma, huso acromático, citocinesis, citoplasma, haploide, diploide, cromátide, cromatina y microtúbulos. 16. ¿Qué es el tejido meristemático? Materiales - Estudiante: bulbos de cebolla blanca con raíces (ver Parte 1. Preparación de las raíces), lentejas, cuerda larga (3-5 metros), ablandador de carne. Laboratorio: orceína aceto-clorhídrica, agua destilada, NaCl 5%, ablandador de carne, etanol, 30 ml de solución de sal al 1%, 5ml de solución jabonosa al 25%, 30 ml de alcohol etílico frío, cristal de reloj, pinzas, tijera, navaja, papel de filtro, laminillas, portaobjetos, cubreobjetos, microscopio, plaquitas de mitosis, probeta, beaker, tubo de ensayo, licuadora, colador, tubo de ensayo con tapa, taza plástica, barra de madera para mezclar. Para la casa Parte 1: ¡Encontré ADN en mi Comida! 1. ¿Has comido ADN alguna vez? 2. ¿Has comido ADN genéticamente modificado? 3. ¿El ADN genéticamente modificado puede provocar problemas de salud? (cáncer, indigestión, alergia, reacción inmunitaria......) 4. ¿Puede usted observar el ADN a simple vista, sin el uso de un microscopio? Describa cómo usted se imagina el ADN. ~6~ 5. Dibuje detalladamente un cromosoma. ¿Cómo los científicos decidieron cuál cromosoma sería el cromosoma 1, el cromosoma 2, 3, etcétera? En el Laboratorio Parte 1: Observando la mitosis en tejido meristemático de cebolla Preparación de las raíces Para obtener las raíces se colocan cebollas en frascos de agua de manera que no queden sumergidas, pero que toquen la superficie del agua. Es conveniente que a las cebollas se les eliminen las escamas externas para conseguir un desarrollo más rápido de las raíces, y que cambien el agua todos los días, de esta manera se pueden conseguir raíces en un período de 48 horas. Corte los extremos de las raíces de aproximadamente 1cm de largo, colóquelos en un cristal de reloj con el colorante orceína aceto-clorhídrica y caliente en la estufa hasta que se inicien vapores. Deje enfriar y de nuevo caliente repitiendo tres veces la operación. Es importante no calentar mucho. Con la ayuda de una navaja corte el meristemo sobre una laminilla dejando solamente el extremo que contiene las células en división. Agregue una gota de azul de metileno y coloque un cubreobjetos y con la punta de un lápiz de golpecitos sobre el cubreobjetos para que las células se separen. Con un papel de filtro quite el exceso de colorante y con el dedo presione bien fuerte para hacer el aplastado de la preparación. Esto se hace poniendo papel absorbente sobre el cubreobjetos y haciendo presión uniforme sobre el mismo hasta que vea que el material se ha dispersado, es más fácil hacer esto colocando la laminilla en el borde de la mesa. Responda: -- ¿Cuáles fases puedes observar? -- ¿En cuál fase se distinguen mejor los cromosomas? -- ¿Cuál es la fase más abundante en su preparación? Realice las observaciones bajo el microscopio, comenzando por ubicar las agrupaciones de células meristemáticas sobre el portaobjetos para luego cambiar a un aumento de observación mayor e identificar las distintas fases que caracterizan la ~7~ división celular (interfase y mitosis) y de la mitosis (profase, metafase, anafase y telofase). Calcule el índice mitótico (IM) utilizando los datos anteriores, de acuerdo a la siguiente fórmula: IM = Número total de células en mitosis Número total de células x 100 El índice mitótico da una idea de la velocidad de división de un tejido. IM de su preparación = ______________ x 100 = Parte 2: Actuando las fases de la Mitosis Para esta parte del laboratorio se necesitará una cuerda o hilo para simular la membrana nuclear y tener a mano unas tijeras. Este debe ser lo bastante largo como para rodear al menos 6 personas. Ahora todos los integrantes del laboratorio, sin excepciones, van a actuar o simular el proceso de la mitosis en el aula de laboratorio. Tome en cuenta las siguientes recomendaciones: 1. Elija a una persona para ser el reportero. El trabajo de esta persona será el de ir explicando lo que va ocurriendo. 2. Si pueden graben un video del proceso. 3. Elija al menos, 4 estudiantes para interpretar los cromosomas, 2 estudiantes para ser los centriolos y un estudiante para manipular la membrana nuclear. Los demás estudiantes pueden ser la membrana celular. A medida que vayan actuando todas las fases de la mitosis, deberán buscar la manera de representar cada fase de la célula y cada evento que ocurre durante la división celular. Parte 3: Extracción de ADN casera Prepare 80 ml de agua destilada con NaCl al 5% en un beaker de 100ml (4 gramos de sal + 80 ml de agua destilada). Luego agregue 10 ml de una solución jabonosa (jabón líquido). Agregue 25-35 lentejas más la solución preparada en una licuadora durante 60 segundos. Asegúrese de colocarle la tapa a la licuadora. Luego filtre con un colador la solución en un beaker. Lo que nos interesa es el sobrenadante. ~8~ Prepare 10 ml de una solución con ablandador de carne al 10% (1 gramo de ablandador de carne + 10 ml de agua destilada) y mézclela con el sobrenadante. Ahora tome un tubo de ensayo y agregue 5 ml de la solución preparada y agréguele 5 ml de etanol. 1. Describa lo que va sucediendo: ___________________________________________________________________________________ ___________________________________________________________________________________ 2. ¿Qué función lleva a cabo el detergente en la extracción? ___________________________________________________________________________________ 3. ¿Qué función cumple el ablandador de carne para la extracción? ___________________________________________________________________________________ 4. ¿Qué papel juega el etanol en la extracción de ADN? ____________________________________________________________ 5. ¿Puede usted ver el ADN? ____________________________________________________________ 6. ¿Cómo se ve? Describa y dibuje lo que observa. ___________________________________________________________________________________ ________________________________________________________________________________ Parte 4: Extracción de ADN de las Células de la Mejilla Humana Agregue 5 ml de una solución jabonosa al 25% en un tubo de ensayo (solución jabonosa al 25% = 2.5 ml de jabón líquido en 10 ml de agua destilada). Haga un buche de la solución de agua salada al 5% (no se la trague) por 30 segundos, asegurándose de frotar la lengua a lo largo de sus mejillas. Escupa cuidadosamente la mezcla del agua de su boca dentro del tubo de ensayo con la solución jabonosa. Mezcle, invirtiendo 5 veces el tubo de ensayo. ~9~ Agregue bastante alcohol etílico hasta duplicar el volumen de la solución que se tiene hasta el momento (aprox. 8 ml de alcohol etílico). Luego de esto no incline, ni sacuda, ni mezcle el tubo de ensayo, porque puede que no vea su ADN. Si usted mira a la línea de separación entre la capa de agua y la capa de alcohol (el interfaz) usted comenzará a ver burbujas adheridas como pelos minúsculos en forma de secuencias o tiritas blancas que se levantan a través del alcohol. Estas secuencias o tiras son su ADN. Dibuje y tabule lo que observó en su tubo de ensayo con ADN. ~ 10 ~ PRÁCTICA # 2: Meiosis y Gametogénesis Introducción La meiosis es un tipo de división celular que se realiza exclusivamente en las células sexuales, y mediante la cual se reduce el número de cromosomas a la mitad, formándose los gametos (óvulos y espermatozoides). Antes de considerar los detalles de este proceso debemos conocer ciertos términos que describen la constitución cromosómica en los núcleos de las células. A los cromosomas en el núcleo de una célula sexual (óvulo; espermatozoide) se les aplican el término haploide o simplemente n; mientras que aquellos presentes en el cigoto y en células derivados de mitosis se le aplican el término diploide o 2n. Por ejemplo, un óvulo humano antes de ser fecundado posee 23 cromosomas (n), mientras que el cigoto tiene 46 cromosomas (2n). Estos 46 cromosomas existen en 23 pares, donde los miembros de cada par son similares entre sí en cuanto a forma, tamaño y contenido genético. Cada miembro de un par se considera homólogo del otro y no homólogo con respecto a otros cromosomas. En el cigoto cada par de homólogos consiste de un cromosoma que aportó el óvulo y otro que aportó el espermatozoide. La meiosis provee el mecanismo para mantener la consistencia cromosómica y genética de una generación a otra. Esta se logra mediante una duplicación cromosómica y dos divisiones celulares. La primera división celular (meiosis I) es reductora y la segunda (meiosis II) es una división mitótica de los núcleos haploides que es resultado de la anterior. Mediante el proceso de meiosis, los órganos reproductores producen células con la mitad de los cromosomas y genéticamente diferentes a las células originales. La diferencia genética que pueden presentar se debe al intercambio genético que ocurre por entrecruzamiento o “crossing over”. Los ovarios a partir de células llamadas ovogonios producen óvulos y los testículos a partir de los espermatogonios producen espermatozoides. Fundamentalmente, el proceso de meiosis es bien parecido en el testículo y en el ovario, aunque existen ciertas diferencias en los detalles. Objetivos - Explicar el proceso de división celular llamado meiosis y el proceso de gametogénesis (ovogénesis y espermatogénesis). Establecer las similitudes y diferencias entre los procesos de mitosis y meiosis. ~ 11 ~ Capítulos del Libro de Biología Solomon et al., 2013 [9na Edición]: Capítulo 10. Cromosomas, mitosis y meiosis: págs. 223-236 y Capítulo 50. Reproducción: págs. 1077-1096. Investigue y Estudie 1. 2. 3. 4. Describe brevemente las etapas de la meiosis. ¿Cuáles son las principales diferencias entre mitosis y meiosis? ¿Cuál es la importancia genética de la meiosis? ¿Qué evento importante en el ciclo celular se requiere que ocurra previo a una meiosis? 5. ¿Cuántas meiosis ocurren en las células? ¿Cuál es la meiosis reductiva y cuál es la división de separación? 6. ¿Cuáles son las fases de la Meiosis I y II? 7. ¿Qué es una tétrada o bivalente y cómo se forma? 8. ¿Por qué las especies que se reproducen por meiosis son diferentes? 9. ¿Qué son los gametos? 10. ¿Cuántas cromátides tiene un espermatocito primario humano? 11. ¿Cuántas cromátides tiene un espermatocito secundario humano? 12. ¿Cuántas cromátides tiene un esperma humano? 13. ¿Qué proceso de diferenciación debe sufrir un espermatozoide? Materiales: Estudiante: cuerda larga (3-5 metros) y lápices de colores. Laboratorio: plaquitas de meiosis. En el laboratorio Parte 1: Actuando las fases de la meiosis Para esta parte del laboratorio se necesitará un hilo para simular la membrana nuclear y tener a mano unas tijeras. Este debe ser lo bastante largo como para rodear al menos 6 personas. Ahora todos los integrantes del laboratorio, sin excepciones, van a actuar o simular el proceso de la meiosis en el aula de laboratorio. Tome en cuenta las siguientes recomendaciones: 1. Elija a una persona para ser el reportero. El trabajo de esta persona será el de ir explicando lo que va ocurriendo. 2. Elija al menos, 4 estudiantes para interpretar los cromosomas, 2 estudiantes para ser los centriolos y un estudiante para manipular la membrana nuclear. Los estudiantes que sobren serán la membrana celular. 3. Si pueden graben un video del proceso. ~ 12 ~ A medida que vayan actuando todas las fases de la meiosis, deberán buscar la manera de representar cada fase de la célula y cada evento que ocurre durante la división celular. Parte 2: Llena el siguiente cuadro con las diferencias entre mitosis y meiosis. Mitosis Célula en las que ocurre Número de cromosomas Número de fases S por división celular Entrecruzamiento Apareamiento de cromosomas homólogos Número de divisiones celulares Número de células hijas Las células hijas genéticamente son ~ 13 ~ Meiosis Parte 3: Dibuje las etapas de la meiosis e indique el nombre de cada etapa e incluya las siguientes estructuras: dos cromosomas, centrómero, centríolos, centrosoma, huso acromático y microtúbulos, citocinesis, entrecruzamiento, etc. Profase I Profase II Metafase I Metafase II Anafase I Anafase II ~ 14 ~ Telofase I Telofase II Parte 4: Use estos problemas para probar su comprensión de la meiosis. 1. Una célula humana tiene 46 cromosomas (o 23 pares de cromosomas). A continuación de la mitosis, las células hijas tendrán cada una un total de _____ cromosomas. Después de la meiosis I, las dos células hijas tendrán _____ cromosomas, y después de la meiosis II _____ cromosomas. a. 46, 46, 23 b. 46, 23, 23 c. 23, 23, 23 d. 46, 12, 12 2. El proceso de meiosis produce cuatro células con cromosomas no idénticos. Esta diversificación ocurre durante: a. Metafase I b. Profase I c. Metafase II d. Profase II 3. ¿Cuál de los siguientes enunciados es único a la mitosis y no una parte de la meiosis? a. Cromosomas homólogos se aparean formando bivalentes b. Cromosomas homólogos intercambian segmentos c. Las cromátidas se separan durante anafase d. Cromosomas se comportan independientemente 4. El estado de meiosis dónde las células se vuelven haploides es: a. Profase I b. Profase II c. Anafase I d. Anafase II 5. La ________________________ es la que más se parece a los eventos de la mitosis excepto que las células son _______________________. a. Meiosis I, diploide c. Meiosis II, diploide b. Meiosis I, haploide d. Meiosis II, haploide ~ 15 ~ PRÁCTICA # 3: Genética Mendeliana Introducción Las leyes de la herencia de Mendel fueron derivadas de las investigaciones sobre cruces entre plantas realizadas por Gregor Mendel, un monje agustino austriaco, en el siglo XIX. Entre los años 1856 y 1863, Gregor Mendel cultivó y probó cerca de 28,000 plantas de la especie Pisum sativum (guisante). Sin embargo, la genética como ciencia nació en el 1900 cuando los trabajos de Mendel fueron redescubiertos por tres científicos europeos de forma separada. Sus experimentos le llevaron a concebir dos generalizaciones que después serían conocidas como Leyes de Mendel de la herencia o herencia mendeliana. 1ra ley de Mendel: Ley de la uniformidad Establece que, si se cruzan dos razas puras para un determinado carácter, los descendientes de la primera generación serán todos iguales entre sí fenotípica y genotípicamente, e iguales fenotípicamente a uno de los progenitores (de genotipo dominante), independientemente de la dirección del cruzamiento. Por ejemplo, expresado con letras mayúsculas los rasgos dominantes (AA - amarillos) y minúsculas los rasgos recesivos (aa - verdes). 2da ley de Mendel: Ley de la segregación Esta ley establece que, durante la formación de los gametos, cada alelo de un par se separa del otro miembro para determinar la constitución genética del gameto filial. Mendel obtuvo esta ley al cruzar diferentes variedades de individuos heterocigotos (diploides con dos variantes alélicas del mismo gen: Aa), y pudo observar en sus experimentos que obtenía muchos guisantes con características de piel amarilla y otros (menos) con características de piel verde, comprobó que la proporción era de 3:4 de color amarilla y 1:4 de color verde (3:1). Por ejemplo, Aa x Aa = AA + Aa + Aa + aa. 3ra ley de Mendel: Ley de la recombinación independiente de los factores Diferentes rasgos son heredados independientemente unos de otros, no existe relación entre ellos, por lo tanto, el patrón de herencia de un rasgo no afectará al patrón de herencia del otro. Sólo se cumple en aquellos genes que no están ligados (en diferentes cromosomas) o que están en regiones muy separadas del mismo cromosoma. La generación parental (Generación P) para dos características puede ser representada por los rasgos A = color y V = textura. A su vez la dominancia es representada por la mayúscula o minúscula. Los genotipos de la generación parental ~ 16 ~ serían = AAVV (homocigótico dominante) x aavv (homocigótico recesivo). Por entrecruzamiento de razas puras (siguiendo la 1era Ley), resultarían los siguientes gametos AAVV x aavv = AaVv, AaVv, AaVv, AaVv. Las unidades descritas por Mendel como Factor Hereditario recibieron el nombre de genes. Durante los primeros decenios posteriores al redescubrimiento del trabajo de Mendel, los genetistas empezaron por ampliar los principios de Mendel al correlacionar la transmisión de información genética de generación en generación con el comportamiento de los cromosomas durante la meiosis (Solomon et al., 2001). Los genetistas estudian no sólo la transmisión de genes, sino también la expresión de la información genética. Objetivo Aprender a realizar ejercicios de genética mendeliana, cruces di-híbridos, ejercicios de herencia ligada al sexo, de epítasis, de entrecruzamiento y mapeo de los genes y del pedigrí. - Capítulos del Libro de Biología Solomon et al., 2013 [9na Edición]: Capítulo 11. Los principios básicos de la herencia: págs. 237-262. Investigue y Estudie 1. Definir los siguientes términos: gametos, gen, loci, alelo, alelos múltiples, alelos dominantes, alelos recesivos, dominancia incompleta, codominancia, fenotipo, genotipo, homocigote, heterocigote, di-híbrido, poli-híbrido. 2. Formule las leyes de Mendel en sus propias palabras. 3. ¿Qué son los genes mitocondriales y cómo se heredan? 4. ¿Qué es el pedigrí y cómo se interpreta? 5. ¿Qué es el factor Rh y cómo se hereda? 6. ¿Qué es el cuadro de Punnet y cómo se organiza? Materiales - Estudiante: lápiz, goma, sacapuntas. ~ 17 ~ Para la casa Parte 1: Genética mendeliana 1. En plantas de guisantes el genotipo para semillas lisas es (S), el cual es dominante sobre semillas rugosas (s). En un cruce genético de dos plantas que son heterocigotas para el carácter "forma de la semilla", ¿qué fracción de los descendientes deberían tener semillas lisas? Realice el cruce. 2. En la primera ley de Mendel, plantas de guisante con semillas homocigotas lisas se cruzaron con plantas heterocigotas (siendo las semillas lisas dominante). ¿Qué resultados obtuvo en la generación F2? 3. En el hombre el color pardo de los ojos es dominante (A) sobre el color azul, el cual es recesivo (a). Una pareja en la que el hombre tiene los ojos pardos y la mujer ojos azules tienen dos hijos, uno de ellos es de ojos pardos y otro de ojos azules. De acuerdo a esto determinar: 3.1 El genotipo del padre. 3.2 La probabilidad de que el tercer hijo sea de ojos azules. 4. La acondroplasia es una anomalía determinada por un gen autosómico que da lugar a un tipo de enanismo en la especie humana. Dos enanos acondroplásicos tienen dos hijos, uno acondroplásico y otro normal. 4.1 La acondroplasia, ¿es un carácter dominante o recesivo? ¿Por qué? 4.2 ¿Cuál es el genotipo de cada uno de los progenitores? ¿Por qué? 4.3 ¿Cuál es la probabilidad de que el próximo descendiente de la pareja sea normal y de qué sea acondroplásico? Hacer un esquema del cruce. Parte 2: Cruces di-híbridos 5. En los conejillos de india, el pelo ruvido o “malo” es dominante (R) sobre el pelo liso o “bueno” (r) y el pelo negro (N) es dominante sobre el pelo blanco (n). ¿Qué fenotipo tiene a) un macho Rrnn; b) una hembra rrNn y c) la generación F1? 6. En los caballos, el negro se debe a un alelo dominante (B) y el marrón a un alelo recesivo (b). El trotar se debe a un gen dominante (T) y el paso a un alelo recesivo (t). Un heterocigoto negro trotador se cruza con un homocigoto marrón de paso. ¿Cuál es la proporción genotípica y fenotípica de este cruce? ~ 18 ~ En el laboratorio Parte 1: Herencia autosómica 7. La fenilcetonuria (FCU) es un desorden metabólico que se hereda con carácter autosómico recesivo. Dos progenitores sanos tienen un hijo con FCU. 7.1 ¿Cuáles son todos los posibles genotipos y fenotipos parentales para este caso? 7.2 ¿A cuál de los cruces de 7.1 pertenece el caso descrito? 7.3 ¿Cuál es la probabilidad de que el siguiente hijo padezca también la enfermedad? 7.4 ¿Cuál será la probabilidad de que un hijo normal (sano) de estos padres sea portador de la enfermedad? 8. El albinismo es un carácter recesivo con respecto a la pigmentación normal. ¿Cuál sería la descendencia de un hombre albino en los siguientes casos?: 8.1 Si se casa con una mujer sin antecedentes familiares de albinismo. 8.2 Si se casa con una mujer normal cuya madre era albina. 9. Inventa un cruce di-híbrido original para tu compañero: ~ 19 ~ Parte 2: Herencia ligada al sexo 10. ¿Qué patrón de herencia llevaría a un genetista sospechar que un trastorno hereditario del metabolismo celular se debe a un gen mitocondrial defectuoso? 11. El daltonismo rojo-verde es ligado al cromosoma Xd. Si una mujer daltónica (XdXd) tiene hijos con un hombre normal (XY), ¿qué probabilidad tienen sus hijos e hijas de ser daltónicos? ¿Qué ocurre si la mujer es portadora (XXd )? Parte 3: Epítasis 12. El color de pelo de los ratones es determinado por 2 genes que muestran epítasis. La presencia de pigmento es expresada por medio de un alelo dominante (NN o Nn) y la ausencia de color es representada por alelos recesivos (nn). Si el color está presente, un segundo locus determina el color del pelo (AA o Aa) por pelo agutí, y (aa) por pelo negro. ¿Qué proporción fenotípica y de genotipos esperan encontrar en las generaciones F1 y F2 como resultado de un cruce entre un ratón AANN x aann? ~ 20 ~ Parte 4: Pedigrí 13. ¿Estos rasgos son dominantes o recesivos? ¿Por qué? _____________________________ _____________________________ 14. Albinismo: El albinismo es causado por un alelo recesivo en un autosoma. Responde las siguientes preguntas: 14.1 ¿Cuáles son los genotipos de los individuos 1, 3 y 4 de la última generación (IV); y 2, 3, 7 y 8 de la III generación? 14.2 ¿Qué probabilidad tiene el individuos 6 de la IV generación de ser heterocigoto? ~ 21 ~ Parte 5: Codominancia y alelos múltiples 15. Los grupos sanguíneos en los seres humanos (A, B, AB y O) son los resultados de 3 alelos para un gen en la población humana (IA, IB, i). Cada persona puede tener solamente ___ alelos. De los siguientes cruces, indique los genotipos para la generación F1 y en qué frecuencia se encuentran. 15.1 IA i x IB i 15.2 IA IB x IA i 16. Investigue en la clase: 16.1 ¿Cuántas personas poseen cada tipo de genotipo de la sangre? 16.2 ¿Qué pasa si una persona con un grupo sanguíneo A recibe sangre tipo B? 16.3 ¿Cuál grupo sanguíneo es llamado Donador Universal y por qué? 16.4 ¿Qué significa ser A+ o A-? 17. En un caso de paternidad ambiguo, Madame Jolie tiene sangre tipo A, y su hijo sangre O. Madame Jolie tenía 2 amantes en el momento de la concepción. Señor Pitt, de sangre tipo A y Señor Thornton, de sangre tipo AB. ¿Quién es el padre y porqué? ~ 22 ~ PRÁCTICA # 4: Replicación, Transcripción y Traducción Replicación del ADN Es el mecanismo que permite al ADN duplicarse (es decir, sintetizar una copia idéntica). De esta manera de una molécula de ADN única, se obtienen dos o más "clones" de la primera. Esta duplicación del material genético se produce de acuerdo a un mecanismo semiconservativo, lo que indica que las dos cadenas complementarias del ADN original, al separarse, sirven de molde cada una para la síntesis de una nueva cadena complementaria de la cadena molde, de forma que cada nueva doble hélice contiene una de las cadenas del ADN original. Gracias a la complementación entre las bases que forman la secuencia de cada una de las cadenas, el ADN tiene la propiedad de duplicarse idénticamente, lo que permite que la información genética se transmita de una célula madre a las células hijas. Transcripción del ADN Es el primer proceso de la expresión génica, mediante el cual se transfiere la información contenida en la secuencia de ADN hacia la secuencia de proteína utilizando diversos tipos de ARN como intermediarios. Durante la transcripción, las secuencias de ADN son copiadas al ARN mediante una enzima llamada ARN polimerasa que sintetiza un ARN mensajero (ARNm) el cual mantiene la información de la secuencia del ADN. De esta manera, la transcripción del ADN también podría llamarse síntesis del ARN mensajero. Traducción del ADN Es el proceso en el que la información genética contenida en el ADN y transcrita a ARNm va a ser utilizada para sintetizar una proteína. Este proceso se lleva a cabo en los ribosomas. La traducción del mensaje genético desde el ARN hasta una proteína no es suficiente, en algunos casos, para que se exprese correctamente. Es necesario que el polipéptido que se va sintetizando por el ribosoma se pliegue de forma adecuada para que pueda desarrollar su función biológica correctamente (Jiménez, 2012). Las proteínas son muy importantes en la determinación de las características de nuestro cuerpo. La función primordial de las proteínas es producir tejido corporal y sintetizar enzimas. Las instrucciones para hacer una proteína son proporcionadas por los genes. Cada gen contiene una secuencia específica de nucleótidos. Los genes son aproximadamente 99% idénticos en todos los seres humanos, pero ¡el 1% de variación es muy importante! La variación en la secuencia de los nucleótidos produce alelos de un mismo gen y los alelos producen variación a nivel proteínico. ¡Por esto no somos todos idénticos! ~ 23 ~ Figura 1. Izquierda: replicación del ADN. La doble hélice es desenrollada y cada hebra hace de plantilla para la síntesis de la nueva cadena. El ADN polimerasa añade los nucleótidos complementarios a los de la cadena original. Derecha: proceso de transcripción del ARN mensajero y síntesis de proteínas. Objetivo - Modelar la transcripción y traducción de una cadena de ADN. Capítulos del Libro de Biología Solomon et al., 2013 [9na Edición]: Capítulo 13. Expresión génica: págs. 282-306. Investigue y Estudie 1. A su criterio, ¿cómo piensa usted que se lleva a cabo la duplicación del ADN, de manera conservativa, semiconservativa o dispersiva? Consulte y describa el experimento de Meselson y Stahl. 2. Explique el proceso de replicación, incluyendo las enzimas involucradas en este. 3. ¿Qué es una proteína? Diga algunos ejemplos de proteínas. 4. ¿Qué proteína es la encargada de romper los puentes de hidrógenos que unen las dos hebras del ADN? a) Primasa b) ADN polimerasa c) ARN polimerasa d) Helicasa 5. Explique el proceso de transcripción, incluyendo las enzimas involucradas en este. 6. ¿Qué es el TATA box? ¿Dónde se encuentra? ¿Para qué se usa? 7. Explique el proceso de traducción, incluyendo las enzimas involucradas en este. 8. ¿Qué es el ARNm, ARNr y ARNt? ¿Cuál es la función de cada uno? 9. ¿Qué es el factor de transcripción? 10. ¿Cuál es la función de los ribosomas? ¿Cuál es la diferencia entre la subunidad mayor y la subunidad menor de un ribosoma? ~ 24 ~ Materiales - Laboratorio: tijera, tape transparente. En el laboratorio Parte 1: ¿Cómo se producen las proteínas? Compare la replicación del ADN y las 2 fases en la síntesis de proteínas: Proceso Forma de la molécula molde Tipo de molécula creada Lugar en la célula donde ocurre Fase No. 1: ___________________________ 1. ¿Cuál proteína es la principal responsable de esta fase? 2. ¿Qué semejanzas y diferencias tiene este proceso con la replicación del ADN? 3. ¿Qué es un codón? 4. De acuerdo a cómo se transcribe la cadena de ADN en la de ARNm. Añada los nucleótidos correspondientes a la Tabla 1. Tabla 1. Transcripción Nucleótido ADN Nucleótido ARN A G C T ~ 25 ~ Fase No. 2: ________________________ 1. ¿Qué tipo de ARN se necesita para esta fase? Dibújelos e identifique las partes importantes. 2. ¿Qué es un anticodón? 3. Marque en el dibujo los siguientes nombres: aminoácidos, ARNt, codón, anticodón, ribosoma (subunidad mayor y menor), ARNm: 4. Complete la tabla 2 para indicar el anticodón apropiado en el ARNt para cada uno de los aminoácidos incluidos: Tabla 2: Complete con el anticodón Aminoácido codón ARNm Treonina (Thr) ACU Histidina (His) CAU Prolina (Pro) CCU Leucina (Leu) CUG Ácido Glutámico (Glu) GAG Valina (Val) GUG Anticodon en la molécula de ARNt Que lleva este aminoácido UGA ~ 26 ~ 5. ¿Para qué sirve la Tabla 3 y cómo se utiliza? Tabla 3: Código genético Parte 3: ¿Cómo el ADN determina los rasgos de un organismo? En esta simulación, vamos a examinar el ADN de SNORKS, una especie nueva descubierta en el planeta. Los snorks tienen solamente un cromosoma, con 9 genes. Su misión es la de analizar los genes y determinar qué rasgos tiene el organismo seleccionado y dibujar su identikit. ~ 27 ~ Para simplificar, las secuencias de los genes serán mucho más cortas que la de los genes reales. Cada gen, tendrá 2 alelos. Gen Gene 1 - pelo Gene 2 - cuerpo Gene 3 - piernas Gene 4 - cabeza Gene 5 – “snork” Gene 6 - cejas Gene 7 - ojos Gene 8 - boca Gene 9 - orejas Secuencia de aminoácidos val - ser - leu val - ser - lys tyr - pro - glu - glu - lys val - leu - thr - pro - lys leu - leu - leu - pro leu - leu - ser - ala ala - val - val val - ala - ala his - ile his - his ser - pro - val val - phe - tyr asp - ile - leu - leu - pro - thre asp - ile - pro - pro - pro - thre val - asn - asn - ala asn - asn - asn - ala phe - ser - his phe - phe - gly Fenotipo liso crespo gordito delgado 3 piernas 2 piernas redonda cuadrada derecho curvo espesas delgadas almendra redonda grande chiquita con puntas redondas Los genomas de “snorks” voluntarios han sido recolectados. Traduce la información y dibuja el snork según el fenotipo obtenido para el mismo: Snicker Snork AUG | GUC AGC AAA | UAC CCC GAA GAG AAA | CUC UUA AGU GCG | GCU GUU GUG | CAU CAU | GUU UUU UAC | GAU AUC UUA CUG CCC ACC | AAU AAC AAU GCC | UUU UCU CAC | UAA Snuffle Snork AUG |GUA UCU AAA | GUU CUC ACU CCA AAG | CUU CUC CUC CCC | GUU GCG GCU | CAU CAC | GUA UUU UAU | GAC AUU CUU CUG CCC ACA | AAU AAU AAU GCA | UUC UCG CAC | UAA Snapple Snork AUG | GUC AGC AAA | UAC CCC GAA GAA AAA | CUC UUA AGU GCG | GUU GCG GCU | CAC AUU | UCU CCC GUA | GAU AUU CUC CUC CCC ACC | GUU AAU AAU GCA | UUC UUU GGU | UAA ~ 28 ~ Snoopy Snork AUG | GUA UCC CUC | UAC CCC GAA GAG AAA | UUA UUG CUG CCC | GUG GCA GCU | CAU AUU | UCU CCC GUA | GAC AUU CUU CUG CCC ACA | AAU AAC AAU GCC | UUU UCU CAC | UAA ID Snork: _______________________ Gen Gene 1 – pelo Secuencia de aminoácidos Gene 2 – cuerpo Gene 3 – piernas Gene 4 – cabeza Gene 5 – “snork” Gene 6 – cejas Gene 7 – ojos Gene 8 – boca Gene 9 – orejas Selecciona el gen #7 del snork seleccionado y completa la tabla: Snork Secuencia gen Secuencia ARNm (codón) Secuencia ARNt (Anticodon) Aminoácido Rasgo ~ 29 ~ Fenotipo PRÁCTICA # 5: Reacción en Cadena de la Polimerasa y Electroforesis Reacción en cadena de la polimerasa (PCR) La reacción en cadena de la polimerasa, conocida como PCR por sus siglas en inglés (Polymerase Chain Reaction), es una técnica de biología molecular descrita en 1986 por Kary Mullis, cuyo objetivo es amplificar un fragmento de ADN o un gen de interés partiendo de ADN genómico. El PCR es una técnica que posee múltiples aplicaciones para la ciencia y la medicina. Por medio de esta técnica se pueden identificar anomalías en la secuencia de nucleótidos que apunten a posibles patologías, se llevan a cabo pruebas de paternidad, así como pruebas de parentesco entre individuos, se puede determinar la presencia de microorganismos, lo cual es útil para el diagnóstico de infecciones y para probar la eficacia de un tratamiento. Adicional a esto, mediante el PCR se pueden identificar cepas resistentes a antibióticos, así como identificar virus o bacterias causantes de alguna enfermedad. Ya en el ámbito de las ciencias básicas el PCR es una técnica crucial para el estudio de la genética de las poblaciones silvestres de los reinos de vida. Estos usos derivados de la amplificación han hecho que se convierta en una técnica muy extendida, con el consiguiente abaratamiento del equipo necesario para llevarla a cabo. Electroforesis La electroforesis es una técnica para la separación de moléculas según la movilidad de estas en un campo eléctrico. La variante de uso más común para el análisis de mezclas de proteínas o de ácidos nucleicos utiliza como soporte un gel, habitualmente de agarosa o de poliacrilamida. Los ácidos nucleicos ya disponen de una carga eléctrica negativa, que los dirigirá al polo positivo, mientras que las proteínas se cargan al unirse con sustancias como el SDS (detergente) que incorpora cargas negativas de una manera dependiente de la masa molecular de la proteína. Al poner la mezcla de moléculas y aplicar un campo eléctrico, éstas se moverán y deberán ir pasando por la malla del gel (una red tridimensional de fibras cruzadas), por lo que los fragmentos pequeños se moverán más rápidamente. La electroforesis es un procedimiento utilizado en varias áreas de la Biotecnología, y en laboratorios de investigación en Biología Molecular, Biomedicina y Ciencias Forenses. Objetivos - Identificar y conocer sobre el funcionamiento del PCR y electroforesis de agarosa. Aprender las distintas aplicaciones que posee la técnica de PCR en la biomedicina. ~ 30 ~ Capítulos del Libro de Biología Solomon et al., 2013 [9na Edición]: Capítulo 15. Tecnología ADN y genómica: págs. 323-346. Investigue y Estudie 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. ¿Qué significa PCR y cuál es su función? ¿Cómo funciona el PCR? Describa cada uno de los pasos. ¿Qué reactivos se necesitan para realizar la técnica de PCR? Describa la función de cada reactivo necesario para realizar el PCR. Mencione 2 o 3 aplicaciones que tiene el PCR para la medicina. ¿Para qué sirve la electroforesis? ¿Qué es y para qué sirve el gel de agarosa? ¿Por qué se utiliza una solución amortiguadora (buffer) en la electroforesis y no agua destilada? 9. ¿Cómo influye el peso molecular del ADN en la electroforesis? Explique la migración de acuerdo a la carga. 10. ¿Qué es una micropipeta? 11. ¿Qué es la cámara de rayos UV y para qué se utiliza? 12. ¿Qué es la secuenciación y qué tipo de información obtenemos de la misma? Materiales - Laboratorio: gel de agarosa, tinte de carga, escalera, ADN, tips para micropipetas, micropipetas, guantes, tubitos de PCR, agua destilada, 10X PCR buffer, cebadores según la especie, dNTPs (nucleótidos), polimerasa Taq. En el laboratorio Parte 1: PCR Se preparará un producto PCR de un volumen total de 20µl en cada tubito. En cada uno de los tubitos se echarán los reactivos en las siguientes proporciones y siguiendo el orden establecido: 1. 11.9µl 2. 2.0µl 3. 0.5µl 4. 5. 6. 0.4µl 0.2µl 5.0µl H2O destilada 10X PCR buffer Oligomix (= 10µl cebador 1+ 10µl cebador 2+ 80µl agua destilada) dNTPs AmpliTag DNA Polymerase ADN genómico ~ 31 ~ Para facilitar este proceso se mezclarán los reactivos 1-5 en un tubo de 2ml, el cual se va a tabular como “PCR Mix”. Por ejemplo: si se van a realizar 4 reacciones de PCR para 4 muestras de ADN se multiplica el volumen de cada reactivo por 4 y con una micropipeta se hace la mezcla en el orden establecido. Una vez la mezcla está hecha, el tubo “PCR Mix” se mezcla en el vortex y se echa 15µl de “PCR Mix” en cada tubito de PCR. Luego, se echa 5µl de ADN para completar el volumen de 20µl. Una vez colocado todos los reactivos en el tubito de PCR, el mismo se coloca en el equipo de PCR y se programa la corrida de la siguiente manera: Pasos 1 2 3 4 5 Nombre Desnaturalización inicial Desnaturalización Alineamiento/unión del cebador Extensión/elongación de la cadena Elongación final Temperatura 94°C 94°C 52°C Tiempo 5 minutos 30 segundos 30 segundos 30 ciclos 72°C 90 segundos 72°C 5 minutos Parte 2: Electroforesis Preparación gel de agarosa: tomar el molde para hacer los geles y cerrar los extremos con los topes de goma. Después colocar el peine para formar los pocillos una vez se eche el gel de agarosa caliente (Figura 1 Izquierda). Figura 1. Izquierda: molde para echar gel de agarosa caliente con topes de goma en cada extremo y peine para la posterior formación de pocillos. Derecha: gel de agarosa se echa caliente y líquido en el molde y luego se espera a que se solidifique. Utilizar un vaso precipitado o Erlenmeyer de 500ml para preparar la solución (gel de agarosa). Añadir 60ml de 1X TAE Buffer + 0.6gr de agarosa + 1% de tinte de ADN. Agitar la mezcla para disolver los grumos de agarosa. Calentar la mezcla en el microondas para disolver la agarosa. La solución final debe aparecer clara sin partículas aparentes. ~ 32 ~ Enfriar la solución de agarosa más o menos a 55ºC (para acelerar el proceso se puede enfriar colocando el envase debajo de un grifo de agua y agitar). Si se produce mucha evaporación del líquido, añadir más buffer o tampón de electroforesis (1X TAE Buffer). Finalmente, añadir la solución de agarosa al molde (Figura 1 Derecha). Después que el gel se ha solidificado con mucho cuidado sacar los topes de goma y colocar el gel en la cámara de electroforesis correctamente orientado con los pocillos hacia el polo negativo (color negro). Figura 2. Aparato de electroforesis. Polo negativo (negro), polo positivo (rojo). Una vez terminado el proceso siga los siguientes pasos: 1. En un cubreobjetos eche 1µl del tinte para cargar el gel. 2. Luego con la micropipeta tome 10µl de su producto de PCR y pipetee o mezcle su producto PCR con el tinte para cargar. 3. Con su producto PCR en la micropipeta valla al gel de agarosa y eche cuidadosamente su producto en uno de los pozos marcados. Asegúrese de ver bien en qué pozo echó su producto. Figura 3. Cargando en los pocillos del gel de agarosa el producto PCR utilizando una micropipeta. ~ 33 ~ Correr el gel a 120 V (voltios), 400 A (amperes) durante 45 minutos como se ve en la Figura 4: Figura 4. Aparato de electroforesis listo. Por último, se coloca el gel de agarosa en la cámara de rayos ultravioletas para poder visualizar la banda de ADN amplificada. Debido a que el fragmento que vamos a amplificar es de unas 740pb (pares de bases), vamos a ver la banda bien abajo en el gel, ya que este fragmento de ADN es bastante pequeño. ~ 34 ~ PRÁCTICA # 6: Reproducción Introducción La reproducción es un proceso biológico que permite la creación de nuevos organismos, siendo una característica común de todas las formas de vida conocidas. Las modalidades básicas de reproducción se agrupan en dos tipos, que reciben los nombres de asexual o vegetativa y de sexual o generativa. La capacidad de reproducirse y perpetuar a sus especies es una característica fundamental de los seres vivos. En la reproducción asexual, un solo progenitor da origen a descendientes genéticamente idénticos a él (salvo que se produzcan mutaciones). Este único progenitor se divide por la mitad, forma yemas o se fragmenta para originar dos o más descendientes. La reproducción sexual es aquella en la que intervienen células especializadas llamadas gametos, que se forman en órganos especiales denominados gónadas y cuya finalidad es formar una gran variedad de combinaciones genéticas en los nuevos organismos para mejorar las posibilidades de supervivencia. El proceso clave de la reproducción sexual es la meiosis. La reproducción sexual es un proceso complejo que comprende tres etapas: (1) Gametogénesis: es la formación de gametos masculinos y femeninos haploides mediante la meiosis. (2) Fecundación: es la fusión de dos gametos, el masculino llamado espermatozoide y el femenino llamado óvulo, para formar un cigoto diploide. Recuperando así, el número de cromosomas propio de la especie. La fecundación de los gametos puede ser externa, si se realiza fuera de los organismos, o interna si ocurre en el interior de la hembra, como en el caso de los animales. (3) Desarrollo embrionario: es el proceso que conduce del cigoto a la formación de un nuevo organismo por sucesivas divisiones mitóticas hasta su forma definitiva según la especie. Objetivos - Identificar las partes de los aparatos reproductores masculinos y femeninos. Llevar a cabo una disección animal e identificar las estructuras sexuales. Capítulos del Libro de Biología Solomon et al., 2013 [9na Edición]: Repasar Capítulo 50. Reproducción: págs. 10771105. ~ 35 ~ Investigue y Estudie 1. ¿Qué ventajas y desventajas tiene la reproducción sexual? 2. ¿Cuál consideras que es la diferencia más grande entre la producción de gametos en los hombres y las mujeres? 3. Explica la relación entre el ciclo menstrual y las hormonas. ¿Qué función tiene cada hormona, en qué momento actúan y de dónde son producidas? 4. Una pareja quiere tener hijos, y quiere saber en qué momento del ciclo menstrual sería mejor tener relaciones sexuales. ¿Qué les aconsejarías? 5. Un hombre tiene problemas de infertilidad (produce muy pocos espermatozoides) y quiere saber a) la causa y b) si hay alguna solución. ¿Qué explicaciones le darías y qué soluciones? 6. ¿En qué se diferencian los aparatos reproductores masculinos y femeninos de los ratones y el humano? 7. ¿Cuál estrategia de reproducción emplea el humano en su ciclo de vida? ¿Y los ratones? Materiales - Laboratorio: un ratón de laboratorio Mus musculus, pinzas, bisturí, porta bisturí, tijeras, guantes, bandeja de disección, alcohol, anestésico y materiales de demostración. Para la casa Parte 1: Aparato reproductor masculino y femenino Tabule las partes principales del aparato reproductor masculino y femenino y mencione la función de cada una: ~ 36 ~ En el laboratorio Parte 1: Disección animal Coloque los materiales de disección y el ratón Mus musculus en la mesa de laboratorio. Una vez el individuo se encuentra sobre la bandeja de disección, anestesiar el animal con éter o cloroformo según indique su profesor(a). Coloque el animal en posición abdominal posterior y realice un corte ventral empleando un bisturí siguiendo las líneas punteadas en la Figura 1. Luego corte con tijeras finas y separe la piel de los tejidos (Figura 2). Figura 1. Líneas de disección de ratón blanco de laboratorio. Observe la anatomía interna del animal. ¿Qué estructuras, órganos y/o sistemas puede identificar? ~ 37 ~ Figura 2. Segundo paso de la disección de ratón blanco de laboratorio. Proceder de la misma forma con la membrana transparente que lo cubre. Luego de este procedimiento, el estudiante procederá a identificar, dibujar y señalar cada una de las partes de los órganos reproductores masculino y femenino observados en la disección: Aparato reproductor masculino: Aparato reproductor femenino: ~ 38 ~ PRÁCTICA # 7: Microbiología Introducción La microbiología es la ciencia encargada del estudio de los microorganismos. Es la rama de la biología dedicada a estudiar los organismos que son solo visibles a través del microscopio como los virus, procariontes y eucariontes simples. Son considerados microbios todos los seres vivos microscópicos, estos pueden estar constituidos por una sola célula (unicelulares), así como pequeños agregados celulares formados por células equivalentes (sin diferenciación celular); estos pueden ser eucariotas (células con núcleo) tales como hongos y protistas, procariotas (células carentes de núcleo) como las bacterias, y archaebacterias. Actualmente, el conocimiento microbiológico se ha especializado tanto que lo encontramos dividido en: la microbiología médica que estudia los microorganismos patógenos y la posible cura para las enfermedades que lo producen; la inmunología que averigua las causas de la aparición de las enfermedades desde una perspectiva inmunológica; la microbiología ecológica que estudia el nicho que le corresponde a los microorganismos en el medio; la microbiología agrícola que estudia las relaciones existentes entre plantas y microorganismos; y la biotecnología que estudia los posibles beneficios que puede llevar para el hombre la explotación de microbios. Se denomina levadura a cualquiera de los diversos hongos microscópicos unicelulares que son importantes por su capacidad para realizar la fermentación de hidratos de carbono, produciendo distintas sustancias. Las bacterias al igual que otros microorganismos requieren para su crecimiento de una fuente de energía exógena y nutriente esenciales tales como son el agua, carbón, nitrógeno, minerales y factores de crecimiento, además de las condiciones ambientales apropiadas como son pH, temperatura, presión osmótica y oxígeno atmosférico. Cuando las bacterias se cultivan en el laboratorio tales requerimientos se llenan con los medios de cultivo los cuales pueden ser de muy variados tipos de acuerdo al microorganismo que se desee estudiar. Muchos materiales naturales como jugos, leche, vegetales y carnes pueden ser usados como bases para medios de cultivo. El medio de cultivo puede ser líquido como los caldos, semisólido o sólido dependiendo de la consistencia que adquiere el medio líquido al agregar diferentes concentraciones de un solidificante como el agar, que es un extracto de algas marinas. El agar no es utilizado como nutriente por la mayoría de las bacterias, así pues, actúa solamente como solidificante. Se funde alrededor de 100° C y permanece líquido hasta que se enfría de 42° a 43°C. La gelatina se puede usar también, pero ~ 39 ~ con el inconveniente de que funde a 25°C y puede ser hidrolizada por muchas bacterias. Clasificación de los medios de cultivo Existen diversas clasificaciones de los medios de cultivo: se abocará a dos de uso práctico, una de acuerdo a su composición y la otra de acuerdo a su uso en el laboratorio: Clasificación de los medios de cultivo de acuerdo a su composición: Sintéticos: son aquellos medios preparados con alta pureza y en los cuales la composición se conoce en forma precisa. Su uso es muy definido, por ejemplo, medios para ensayo de vitaminas o para enriquecimiento. No sintéticos: estos se preparan a partir de una gran variedad de productos crudos como son extractos de carne, extractos de levaduras, hidrolizados proteicos (peptonas) etc. y aunque se conoce cuáles son los ingredientes, estos pueden variar ligeramente, por ejemplo, el contenido de aminoácidos entre la carne de un animal y otro. Clasificación de los medios de cultivo de acuerdo a su uso en el laboratorio: Medios de cultivo de uso general: en este grupo se encuentran los medios que contienen los nutrientes básicos y no contienen sustancias inhibitorias por lo que en ellos pueden crecer una gran variedad de heterótrofos. Entre estos medios tenemos agar de soya y tripticaseína, agar de Müller Hinton, agar nutritivo, etc. Medios de cultivo diferencial: este tipo de medios es usado para distinguir entre diferentes tipos de bacterias. Usualmente contienen colorantes o indicadores de pH que darán un color característico a las colonias o virarán el color del medio de cultivo de acuerdo al microorganismo que se trate. [Un medio puede ser diferencial y selectivo al mismo tiempo] Medios de cultivo selectivos: este es un medio nutritivo al que se le añaden productos que actúan como agentes inhibitorios, de tal manera que sólo permiten el crecimiento de ciertos grupos de microorganismos. Se usan para aislar organismos particulares e inhibir el crecimiento de los no deseados. Entre los medios selectivos y diferenciales tenemos: Agar de MacConkey: el cual contiene una mezcla de sales biliares que inhiben a los microorganismos grampositivos, además de lactosa y como indicador rojo de fenol para distinguir las bacterias que fermentan la lactosa de las que no lo hacen. ~ 40 ~ Agar EMB (eosina azul de metileno): mediante el azul de metileno y la eosina inhibe los organismos grampositivos. Al mismo tiempo, al igual que el Agar de MacConkey, permite diferenciar bacterias que fermentan la lactosa y/o a la sacarosa de las que no lo hacen. El agar de sal y manitol: por su alto contenido de NaCl (7.5%) inhibe a las bacterias que no lo toleran, al mismo tiempo con el indicador rojo de fenol sirve para detectar la fermentación del manitol. Se utiliza para el aislamiento y diferenciación del género Staphylococcus. Medios de cultivo deshidratados Hasta 1930 la preparación de medios de cultivo requería de mucho tiempo ya que se debía de partir de materiales crudos que se iban pesando individualmente y algunos se tenían que preparar como las infusiones y extractos por métodos muy tediosos. Sin embargo, ahora se cuenta con medios de cultivo deshidratado que han simplificado mucho el trabajo ya que solo hace falta leer las instrucciones en cada frasco, disolver la cantidad necesaria en agua, ajustar el pH, dispensar en tubos y esterilizar. Disolución de los medios de cultivo Para disolver los medios de cultivo deshidratados se debe utilizar agua recién destilada o desmineralizada con un pH lo más cercano posible a 7.0. El recipiente que se utilice debe ser de preferencia un matraz Erlenmeyer con una capacidad mayor al volumen de medio que se va a preparar para que se pueda agitar fácilmente. Los medios que no contienen agar se pueden disolver fácilmente en agua fría o con un ligero calentamiento, sin embargo, si el medio contiene agar o gelatina requerirá de calentamiento. Ajuste del pH Si se utiliza agua neutra y un medio deshidratado de buena calidad el pH del medio usualmente quedará dentro de los límites adecuados, aún así es conveniente ajustar el pH lo que se puede hacer con un potenciómetro o en su defecto con papel pH 4.0-7.0. Si el medio es sólido la medición y el eventual ajuste se hace a 45°-50°C (aún está liquido) y en los medios líquidos se hace a temperatura ambiente. La corrección del pH se efectúa con HCl o NaOH 1N o 0.1N tomando una muestra del medio de cultivo preparado y estéril, se mide el pH y si fuera necesario se ajusta en la muestra calculando después el volumen de ácido o base que sea requerido para el total de medio. ~ 41 ~ Esterilización Los medios que van en tubo se pueden esterilizar directamente en los tubos; en el caso de los medios en cajas de Petri se pueden esterilizar en tubos con el volumen para vaciar una placa (aprox. 20 ml cada uno) o bien matraces para varias placas. Si en las instrucciones del medio no se indica otra cosa, la esterilización se lleva a cabo en autoclave a 121 grados Celsius por 15 minutos. Objetivos Observar en preparaciones fijas microorganismos representativos de diferentes reinos. Aprender aspectos básicos de la microbiología médica. - Capítulos del Libro de Biología Solomon et al., 2013 [9na Edición]: Capítulo 24. Virus y agentes subvirales: págs. 501516 y Capítulo 25. Bacterias y arqueas: págs. 517-536. Investigue y Estudie 1. ¿Qué es un microorganismo? 2. ¿En cuáles reinos se encuentran los microorganismos? 3. Mencione 2 o 3 características de los siguientes reinos: protistas, hongos, bacterias, archaebacterias, animal, planta. 4. ¿A qué se le denomina tinción? ¿Qué tipos de tinción existen y para qué se utilizan? 5. ¿Por qué se deben de esterilizar los medios de cultivo? 6. ¿Quién rompió con el paradigma de la generación espontánea y cuál otro descubrimiento realizó? 7. ¿Cuáles son los principales microorganismos que afectan la salud humana? 8. ¿Cuál es la diferencia entre una bacteria y una archaebacteria? Materiales - Laboratorio: beakers, levadura, azúcar, plaquitas preparadas de microorganismos, dos portaobjetos, asa bacteriológica, aceite de inmersión, microscopio, mechero, papel filtro, lámpara de alcohol, cepa de Bacillus subtilis, ácido acético al 5%. En el laboratorio Parte 1: Levadura y fermentación 1. Llene un beaker con 200 ml de agua, y caliéntelo hasta 35 grados Celsius. 2. Échele 1 cuchara de levadura fresca. 3. Divida la solución en 2 beakers (100 ml cada uno). ~ 42 ~ 4. Añada 1 cucharada de azúcar a uno de los beakers. 5. Observe qué ocurre después de 30 minutos: ¿Cuál beaker tenía más espuma, y por qué? 6. ¿Es la azúcar necesaria para que se multiplique la levadura? 7. ¿Para cuáles productos es importante que la levadura tenga azúcar? Parte 2: Cultivo En cada una de las mesas de laboratorio encontrarán 3 placas de Petri con diferentes medios de cultivo. A cada una de estas placas de Petri se les sembrará con un agente diferente (como, por ejemplo, agua del baño, frotis de la meseta de la cafetería, frotis de la meseta del baño, frotis del piso, entre otros). Una vez sembradas, estas placas serán incubadas a temperatura ambiente en un área donde las condiciones ambientales sean lo más estables posibles y cada 2 días se tomarán notas sobre lo observado. Deben determinar si existe o no crecimiento de algún microorganismo y describir lo observado. Complete la tabla: I. Medio de Cultivo Composición: 48 horas (2 días) Dibuje y describa: 96 horas (4 días) Dibuje y describa: ~ 43 ~ 144 horas (6 días) Dibuje y describa: II. Composición: Dibuje y describa: Dibuje y describa: Dibuje y describa: Parte 3: Tinción de Gram El fundamento de la tinción de Gram es que la pared celular es responsable de la tinción de Gram. El procedimiento se inicia con una tinción de las células bacterianas fijadas mediante el colorante básico cristal violeta. Posteriormente se trata con una disolución de yodo, que a su vez forma un complejo con el cristal violeta insoluble en agua y sólo medianamente soluble en alcohol o acetona. Las células se tratan después con alcohol para diferenciarlas: las células Gram positivas retienen el complejo colorante-yodo, por lo que las vemos de color morado-azules; y las células Gram negativas son decoloradas por el alcohol, por lo que se hacen visibles mediante la coloración de contraste, en este caso la fucsina. Los pasos a seguir para la realización de la tinción de Gram son: 1. Colocar el frotis correspondiente en el puente de coloración. 2. Cubrir los frotis con cristal violeta (colorante primario) durante un minuto. 3. Lavar los frotis con agua de la llave para eliminar el exceso de colorante. 4. Cubrir los frotis con lugol durante un minuto. 5. Lavar los frotis con agua de la llave. 6. Aplicar gota a gota el alcohol-acetona (decolorante). 7. Lavar inmediatamente con agua de la llave. 8. Cubrir los frotis con safranina (colorante secundario) durante 30 segundos. 9. Lavar los frotis con agua de la llave. 10. Dejar secar los frotis, colocar una gota de aceite de inmersión y observarlos al microscopio con el objetivo 100 X. ~ 44 ~ Figura 1. Preparación de un frotis bacteriano. Dibuje, describa y tabule lo observado en la preparación: Descripción: ¿Qué tipo de bacteria puede observar? ________ X ~ 45 ~ PRÁCTICA # 8: Embriología y Desarrollo Embrionario Introducción La embriología o biología del desarrollo, es la rama de la biología que se encarga de estudiar la morfogénesis, el desarrollo embrionario y nervioso desde la gametogénesis hasta el momento del nacimiento de los seres vivos. La formación y el desarrollo de un embrión son conocidos como embriogénesis. El desarrollo embrionario consiste en la transformación del cigoto en un organismo completo, que estará constituido por cientos, miles o millones de células según la especie. Este organismo se asemejará a sus padres de la misma manera en que sus padres se asemejaron a sus propios progenitores. El proceso de desarrollo embrionario implica una etapa de multiplicación de células (segmentación), de organización de tejidos y órganos (gastrulación y organogénesis), y de modelado de la forma corporal y aumento de tamaño (crecimiento). Cuando finaliza el proceso durante el cual se generan todas las principales estructuras y órganos del producto (primer mes), el embrión se denominará feto. La embriología humana es la parte de la embriología que estudia la formación y desarrollo del embrión y del feto en la especie humana. Se encuadra, junto con la anatomía, dentro de las ciencias morfológicas y es materia de estudio dentro de la medicina. Comprende el estudio de los nueve meses de gestación, desde su concepción hasta su forma final antes del parto. Los patrones básicos de desarrollo son notablemente similares en todos los animales, en particular entre los vertebrados. Los estudios experimentales sobre el desarrollo de los erizos de mar, los anfibios, las aves y los mamíferos han provisto un fundamento sólido sobre la comprensión del desarrollo humano. No obstante, el estudio de los embriones humanos en la etapa previa a la implantación fue posible con el advenimiento, hace aproximadamente veinte años, de las técnicas de fecundación in vitro (FIV) para el tratamiento de la infertilidad. Objetivos - Observar, describir y comentar modelos embriológicos facilitados por el profesor(a). Conocer las etapas del desarrollo embrionario. Ver un documental del vientre materno y responder el cuestionario anexo. Capítulos del Libro de Biología Solomon et al., 2013 [9na Edición]: Capítulo 51. Desarrollo animal: págs. 1106-1126. ~ 46 ~ Investigue y Estudie 1. 2. 3. 4. 5. ¿Qué es un embrión? ¿Qué son las capas germinales? Defina: mórula, blástula, gástrula, gastrulación, organogénesis, vérnix y lanugo. ¿Qué órganos o estructuras derivan de cada una de las capas germinales? Realicen una búsqueda sobre los principales eventos ocurridos durante el desarrollo embrionario y fetal humano, desde la fecundación hasta el nacimiento, y descríbanlos brevemente. 6. ¿Qué es el aborto y cómo se puede clasificar? 7. Investigue, ¿cómo se preservan los fetos o embriones post mortem para su posterior estudio? Materiales - Estudiante: cinta métrica flexible. Laboratorio: modelos de diferentes estadios de fetos. Para la casa Parte 1: Documental “En el vientre materno” Observar el video documental y responder las preguntas del cuestionario anexo al final del Manual de Biología II. Entregar al profesor(a) o monitor(a) el cuestionario. Figura 1. Se muestran las 23 etapas de Carnegie ~ 47 ~ Las etapas de Carnegie se basan en el desarrollo morfológico externo y/o interno del embrión vertebrado, y no son directamente dependientes de la edad o el tamaño. El período embrionario humano se divide en 23 etapas de Carnegie. Los criterios más allá de las características morfológicas incluyen la edad en días, el número de somitas presentes y la longitud embrionaria. Estas etapas también se muestran en la película; “Crecimiento humano de la etapa de Carnegie a través del período embrionario”. [http://www.embryology.ch/anglais/iperiodembry/carnegie02.html#st106] Estas etapas se pueden aplicar a todos los vertebrados, y la mayoría de los embriones vertebrados se desarrollan durante su período embrionario más o menos de la misma manera, por lo que podemos comparar directamente la sincronización del desarrollo para las diversas especies. En el laboratorio Parte 1: Observando embriones humanos Nos trasladaremos a los laboratorios de medicina del INTEC para observar embriones humanos reales. 1. Seleccione dos fetos. 2. Examina con cuidado la morfología externa de los fetos, medirlos, pesarlos, examinar el sexo y la etapa aproximada a la gestación en la que se encuentra y si existe algún tipo de malformación. Completa los registros. Registro de fetos ID: _________________________________ Fecha: ______________________________ Estado del feto: Bueno ________ Regular ________ Malo ________ Edad morfológica aproximada: __________________________________________________________ Sexo morfológico: ________________________________________________________________________ Peso: _______________________________________________________________________________________ Longitud Cráneo-Caudal: _________________________________________________________________ Longitud Cráneo-Talón: __________________________________________________________________ Longitud de la planta del pie: ____________________________________________________________ Perímetro cefálico: _______________________________________________________________________ Perímetro torácico: _______________________________________________________________________ Perímetro abdominal: ____________________________________________________________________ Descripción: ~ 48 ~ ID: _________________________________ Fecha: ______________________________ Estado del feto: Bueno ________ Regular ________ Malo ________ Edad morfológica aproximada: __________________________________________________________ Sexo morfológico: ________________________________________________________________________ Peso: _______________________________________________________________________________________ Longitud Cráneo-Caudal: _________________________________________________________________ Longitud Cráneo-Talón: __________________________________________________________________ Longitud de la planta del pie: ____________________________________________________________ Perímetro cefálico: _______________________________________________________________________ Perímetro torácico: _______________________________________________________________________ Perímetro abdominal: ____________________________________________________________________ Descripción: Parte 2: Observación de Modelos Observe los modelos facilitados por el profesor(a), ordénelos, y describa sus características a sus compañeros. ~ 49 ~ Práctica No. 8: Embriología Parte 2. Documental: En el vientre materno (In the Womb; National Geographic Society) Responde según la información del documental: ¿Cuántas semanas tarda en formarse un bebé? ________________________________________________________________________ ¿Qué tipo de imágenes utiliza este documental? ______________________________________________________________________ ¿Cuántos millones de espermatozoides (máx) pueden liberarse en una eyaculación? _________________________________ ¿Qué factores afectan la calidad de los espermatozoides? _____________________________________________________________ ¿Qué efecto provoca el café en los espermatozoides? _________________________________________________________________ ¿Cuál es la célula más pequeña del cuerpo? ___________________________ ¿y la más grande? ____________________________ ¿Cuál es la velocidad de un espermatozoide? __________________________________________________________________________ ¿Cuándo se crean los óvulos? __________________________________________________________________________________________ ¿Qué longitud de ADN tiene cada cromosoma (aprox)? _______________________________________________________________ ¿Cuál cromosoma es más pequeño, X ó Y? ____________________________________________________________________________ A parte de los genes, ¿cuáles otros factores intervienen en lo que será un bebé? _____________________________________ ¿Cuánto tiempo después de la fertilización se divide el huevo (cigoto) en dos? _______________________________________ ¿En qué se convierte el anillo externo de células del blastocisto? ______________________________________________________ ¿Qué son las células madre? ___________________________________________________________________________________________ ¿Cuántos días toma el blastocisto en llegar desde las trompas al útero? ______________________________________________ ¿En cuál de los trimestres del embarazo se forman los miembros y órganos del bebé? _______________________________ ¿Qué sucede con el volumen de sangre de la madre durante este trimestre? _________________________________________ ¿De dónde toma el embrión todo lo que necesita? ___________________________________________________________________ ¿A las cuántas semanas se forma el corazón? __________________________________________________________________________ ¿Qué es lo que activa a las pruebas caseras de embarazo? ____________________________________________________________ ¿Por qué ocurre el paladar hendido? ___________________________________________________________________________________ ¿Qué porcentaje de nuestros genes nos hace humanos? _______________ ¿qué % compartimos con perros? __________ ¿A partir de cuántas semanas se le llama feto al embrión? ___________________ ¿qué significa en latín? _________________ ¿Qué sustituye al saco vitelino en la 8va semana? ______________________________________________________________________ ¿Qué es la placenta? ____________________________________________________________________________________________________ ¿Qué provoca la ola hormonal de los primeros meses de embarazo? _________________________________________________ ¿Cuál es la función de la progesterona secretada durante el embarazo? ______________________________________________ ¿Cuál es la importancia del movimiento del feto? ______________________________________________________________________ ¿Cuál es el máximo número de latidos que tiene el feto y ocurre a las 9 semanas? ___________________________________ ¿A partir de cuándo se realiza el primer ultrasonido (sonografía)? _____________________________________________________ ¿Explique cómo se forman las imágenes de ultrasonido? _____________________________________________________________ ~ 50 ~ ¿Por qué el ultrasonido no sirve para visualizar el estómago o intestino de un adulto? _______________________________ ¿Qué tipo de imágenes compara el documental con el “telescopio Hubble” y son capaces de dar imágenes en tiempo real del feto? ___________________________________________________________________________________________________________ ¿Cuáles comportamientos se han podido ver en estas imágenes? ____________________________________________________ ¿Cuáles mellizos comparten el mismo saco amniótico y placenta? ____________________________________________________ ¿Cuántos tipos de células distintas se forman entre las 6 y 11 semanas? ______________________________________________ ¿En qué trimestre es más alto el riesgo de aborto? ____________________________________________________________________ ¿Cuáles factores aumentan el riesgo de aborto? _______________________________________________________________________ ¿Qué porcentaje de óvulos fertilizados sobrevive el embarazo? _______________________________________________________ ¿Cuáles dos razones posibles se mencionan para que las manos se desarrollen antes que los pies? __________________ ¿Cuál es la razón evolutiva para que el feto humano tenga tanta fuerza de sujeción en las manos? __________________ ¿A partir de qué semana comienza a funcionar el sistema digestivo? ____________ ¿qué traga el feto? _______________ ¿A partir de qué semana aumentan las probabilidades de sobrevivir si nace prematuro el feto? _____________________ ¿En cuál trimestre aumenta más de peso el feto? _____________________________________________________________________ ¿Cuál es el único sentido que el feto no puede utilizar hasta que nace? ______________________________________________ ¿De qué le sirve al feto el abrir y cerrar los ojos? ______________________________________________________________________ ¿Por qué el color de los ojos no se forma totalmente antes de nacer? ________________________________________________ ¿Cuál es el sentido más desarrollado en el feto? _____________________ ¿Por qué? ______________________________________ ~ 51 ~
