Subido por claudioaugusto

Protocolo de extracción de DNA genómico de plantas

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Protocolo Claudio.
Protocolo optimizado de extracción de DNA genómico limpio (con CTAB)
Buffer de extracción (50 ml)
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5 ml de Tris 1 M pH 8
14 ml de NaCl 5 M
2 ml de EDTA 0.5 M
1 g de CTAB
→ Mezclar todo y aforar con agua a 50 ml.
1. Colectar tejido, de preferencia no muy viejo. Pueden ser 3 hojas de buen tamaño, o 2-3 cm
de tallos florales o 4-5 silicuas frescas. Congelar tejido en tubos de 1.5 ml con nitrógeno
líquido.
2. Triturar tejido congelado con pistilos previamente enfriados con nitrógeno líquido, hasta
dejas un polvo fino. No dejar que el tejido se descongele.
3. Agregar 700 µl de buffer de extracción y vortexear hasta que el tejido se haya mezclado
perfectamente con el buffer. En caso de que hayan quedado restos de tejido sin triturar
bien, homogeneizar con el mismo pistilo.
4. Incubar a 65°C por 15 min con agitación leve (400 rpm) en termoblock.
5. Centrifugar a máxima velocidad por 6 min. Transferir el sobrenadante a tubos nuevos.
6. Agregar un volumen (600 µl aprox) de fenol:cloroformo:isoamyl-alcohol (casero) y
vortexear por unos segundos hasta que se ponga de color verde lechoso.
7. Centrifugar a máxima velocidad 6 minutos.
8. Transferir 500 µl de la fase acuosa (fase superior transparente) a tubos nuevos. Con
cuidado de no tomar la fase orgánica ni los precipitados blancos de la interfase.
9. Añadir 500 µl de isopropanol frío (-20°C) y vortexear unos segundos.
10. Centrifugar a velocidad máxima por 10 minutos.
11. Lavar pellet con 300 µl de etanol al 70%. Vortexear unos segundos y centrifugar 4 min a
máxima velocidad.
12. Retirar el etanol y dejar secar el pellet (de preferencia con el tubo de cabeza sobre una
toalla de papel) hasta que se haga transparente.
13. Una vez seco, agregar 50 µl de agua grado molecular.
14. Añadir 2 µl de RNAsa (10 mg/ml) e incubar a 37°C por 40-60 min.
15. Guardar DNA a -20°C o si se va a usar seguido, se puede guardar a 4°C el tiempo que se
vaya a usar.
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