Subido por María Elizabeth Villalobos Alcalá

Biologia-celular-biomedica- -St-Alfonso-20200410-53488-1aguts2

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Table of Contents
Instrucciones para el acceso en línea
Portada
Índice de capítulos
Página de créditos
Dedicatoria
Colaboradores
Prefacio
Agradecimientos
Capítulo 1: Introducción a la biología de las células
Introducción
Organización celular de distintos organismos
Organización de agentes subcelulares patógenos
Capítulo 2: Cómo se estudian las células. Métodos y técnicas básicas en biología celular
Introducción
Microscopía óptica convencional
Microscopía electrónica
Procesamiento de muestras para microscopía óptica y electrónica
Tecnología del ADN recombinante y aislamiento de ácidos nucleicos
Reacción en cadena de la polimerasa
Fingerprint de ADN
Secuenciación de ADN
Hibridación in situ de ácidos nucleicos
Terapia génica
Microarrays y microchips para estudios genómicos de expresión a gran escala
Transferencia de ADN a células y embriones de mamíferos. Desarrollo de animales transgénicos y knock out
2
Técnicas citogenéticas
Producción de anticuerpos policlonales y monoclonales
ELISA
Citometría de flujo
Cultivos celulares
Fraccionamiento celular y centrifugación diferencial
Capítulo 3: Estructura de la membrana plasmática
Introducción
Modelos estructurales de la membrana: perspectiva histórica
Singer y Nicolson: estructura en mosaico fluido
Lípidos de membrana
Balsas lipídicas
El mosaico proteico
La cubierta de glúcidos: estructura y función del glucocáliz
Determinación de la temperatura de fusión de las membranas biológicas
Cuestiones
Respuestas
Capítulo 4: Microtransporte a través de la membrana plasmática
Introducción
Transporte pasivo
Transporte activo
Importancia de los canales iónicos en la generación del potencial de membrana
Ecuación de Nernst
Capítulo 5: Macrotransporte a través de la membrana plasmática: endocitosis y exocitosis
Introducción
Endocitosis
3
Exocitosis
Gemación y fusión de vesículas en los procesos de endocitosis y exocitosis
Exocitosis y endocitosis en la sinapsis neuronal
Mecanismos de infección que dependen del macrotransporte a través de la membrana plasmática
Capítulo 6: Especializaciones de la membrana plasmática e interacción de la célula con su entorno
Especializaciones de la membrana plasmática
Membrana basal
Matriz extracelular (MEC)
Capítulo 7: El núcleo. Parte I: organización de la cromatina y conservación de la información genética
Introducción
Envoltura nuclear. Poros nucleares
Organización del núcleo en interfase
Estructura de la cromatina en interfase. Histonas
Eucromatina y heterocromatina
Cromosomas
Complejidad del ADN humano. Tipos de secuencias en el ADN
Proyecto genoma humano
Replicación del ADN genómico
Estabilidad y reordenamiento del ADN genómico
Recombinación homóloga
Mutación y reparación del ADN genómico
Capítulo 8: El núcleo. Parte II: transcripción y maduración del ARN y estructura del nucléolo
Introducción
Síntesis del ARN: transcripción
El nucléolo: expresión morfológica del proceso de transcripción
Maduración del ARN
4
Metabolismo del ARN maduro
Capítulo 9: Síntesis y modificación de proteínas
Introducción
Maquinaria para la síntesis proteica
Código genético
Proceso de síntesis proteica en los ribosomas
Estructura tridimensional, plegamiento y localización de las proteínas
Modificaciones postraduccionales y regulación de la función proteica
Degradación de proteínas
Uso biomédico de proteínas recombinantes
Capítulo 10: Sistema de endomembranas celulares: retículo endoplasmático, aparato de Golgi y lisosomas
Introducción
Retículo endoplasmático rugoso
Retículo endoplasmático liso
Aparato de Golgi
Lisosomas
Capítulo 11: Mitocondrias y peroxisomas. Bioenergética y metabolismo oxidativo
Estructura y composición de las mitocondrias
Genoma mitocondrial
Incorporación de proteínas a la mitocondria
Metabolismo oxidativo mitocondrial
Especies reactivas de oxígeno y defensa antioxidante mitocondrial
Patologías relacionadas con la mitocondria
Peroxisomas. Estructura y participación en el metabolismo oxidativo
Capítulo 12: El citoesqueleto
Introducción
5
Microtúbulos
Microfilamentos de actina y filamentos gruesos de miosina
Filamentos intermedios
Capítulo 13: Mecanismos de señalización celular
Mecanismos generales de señalización intracelular
Tipos de señalización celular mediados por la secreción de moléculas
Receptores de señales y señalización intracelular
Señalización a través de contactos célula-célula y célula-sustrato
Capítulo 14: Ciclo celular y destinos vitales de la célula
Introducción
Fases del ciclo celular
Regulación del ciclo celular: puntos de control
Regulación en cada punto de control y consecuencias del avance a la siguiente fase
Elementos de retrocontrol del ciclo celular
Elementos extrínsecos que influyen en el control del ciclo celular
Destinos vitales de la célula y respuestas celulares al estrés
Capítulo 15: División celular y muerte programada
División celular
Muerte celular programada (apoptosis)
Capítulo 16: Biología celular del cáncer
Introducción
Epidemiología y factores de riesgo
Características de las células tumorales
Tipos de cáncer
Inducción del cáncer por carcinógenos y microorganismos
Bases genéticas del cáncer
6
Alteraciones epigenéticas
Virus oncogénicos
Carcinogénesis. Modelo del cáncer de colon
Angiogénesis y metástasis
Evasión del sistema inmunitario
Tratamientos del cáncer
Capítulo 17: Bases celulares de la respuesta inmunitaria
Propiedades generales del sistema inmunitario. Inmunidad innata y adaptativa
Reconocimiento del antígeno
Activación linfocitaria
Mecanismos efectores
Regulación de la respuesta inmunitaria
Disfunciones del sistema inmunitario y sus consecuencias
Capítulo 18: Las células madre y sus aplicaciones terapéuticas
Células madre: definición y clasificación
Plasticidad de las células madre
Fuentes tisulares de células madre
Potencial y limitaciones de las células madre
Aplicación clínica de las células madre: presente y futuro
Conclusiones
Índice alfabético
7
8
Biología celular biomédica
Dr. Alfonso Calvo
Departamento de Histología y Anatomía Patológica
Facultad de Medicina y Programa de Tumores Sólidos, CIMA
Universidad de Navarra
Pamplona, España
9
10
Índice de capítulos
Instrucciones para el acceso en línea
Cubierta
Portada
Página de créditos
Dedicatoria
Colaboradores
Prefacio
Agradecimientos
Capítulo 1: Introducción a la biología de las células
Introducción
Organización celular de distintos organismos
Organización de agentes subcelulares patógenos
Capítulo 2: Cómo se estudian las células. Métodos y técnicas básicas en biología celular
11
Introducción
Microscopía óptica convencional
Microscopía electrónica
Procesamiento de muestras para microscopía óptica y electrónica
Tecnología del ADN recombinante y aislamiento de ácidos nucleicos
Reacción en cadena de la polimerasa
Fingerprint de ADN
Secuenciación de ADN
Hibridación in situ de ácidos nucleicos
Terapia génica
Microarrays y microchips para estudios genómicos de expresión a gran escala
Transferencia de ADN a células y embriones de mamíferos. Desarrollo de animales transgénicos y knock out
Técnicas citogenéticas
Producción de anticuerpos policlonales y monoclonales
ELISA
Citometría de flujo
Cultivos celulares
Fraccionamiento celular y centrifugación diferencial
Capítulo 3: Estructura de la membrana plasmática
Introducción
Modelos estructurales de la membrana: perspectiva histórica
12
Singer y Nicolson: estructura en mosaico fluido
Lípidos de membrana
Balsas lipídicas
El mosaico proteico
La cubierta de glúcidos: estructura y función del glucocáliz
Determinación de la temperatura de fusión de las membranas biológicas
Cuestiones
Respuestas
Capítulo 4: Microtransporte a través de la membrana plasmática
Introducción
Transporte pasivo
Transporte activo
Importancia de los canales iónicos en la generación del potencial de membrana
Ecuación de Nernst
Capítulo 5: Macrotransporte a través de la membrana plasmática: endocitosis y exocitosis
Introducción
Endocitosis
Exocitosis
Gemación y fusión de vesículas en los procesos de endocitosis y exocitosis
Exocitosis y endocitosis en la sinapsis neuronal
Mecanismos de infección que dependen del macrotransporte a través de la membrana plasmática
13
Capítulo 6: Especializaciones de la membrana plasmática e interacción de la célula con su entorno
Especializaciones de la membrana plasmática
Membrana basal
Matriz extracelular (MEC)
Capítulo 7: El núcleo. Parte I: organización de la cromatina y conservación de la información genética
Introducción
Envoltura nuclear. Poros nucleares
Organización del núcleo en interfase
Estructura de la cromatina en interfase. Histonas
Eucromatina y heterocromatina
Cromosomas
Complejidad del ADN humano. Tipos de secuencias en el ADN
Proyecto genoma humano
Replicación del ADN genómico
Estabilidad y reordenamiento del ADN genómico
Recombinación homóloga
Mutación y reparación del ADN genómico
Capítulo 8: El núcleo. Parte II: transcripción y maduración del ARN y estructura del nucléolo
Introducción
Síntesis del ARN: transcripción
El nucléolo: expresión morfológica del proceso de transcripción
14
Maduración del ARN
Metabolismo del ARN maduro
Capítulo 9: Síntesis y modificación de proteínas
Introducción
Maquinaria para la síntesis proteica
Código genético
Proceso de síntesis proteica en los ribosomas
Estructura tridimensional, plegamiento y localización de las proteínas
Modificaciones postraduccionales y regulación de la función proteica
Degradación de proteínas
Uso biomédico de proteínas recombinantes
Capítulo 10: Sistema de endomembranas celulares: retículo endoplasmático, aparato de Golgi y lisosomas
Introducción
Retículo endoplasmático rugoso
Retículo endoplasmático liso
Aparato de Golgi
Lisosomas
Capítulo 11: Mitocondrias y peroxisomas. Bioenergética y metabolismo oxidativo
Estructura y composición de las mitocondrias
Genoma mitocondrial
15
Incorporación de proteínas a la mitocondria
Metabolismo oxidativo mitocondrial
Especies reactivas de oxígeno y defensa antioxidante mitocondrial
Patologías relacionadas con la mitocondria
Peroxisomas. Estructura y participación en el metabolismo oxidativo
Capítulo 12: El citoesqueleto
Introducción
Microtúbulos
Microfilamentos de actina y filamentos gruesos de miosina
Filamentos intermedios
Capítulo 13: Mecanismos de señalización celular
Mecanismos generales de señalización intracelular
Tipos de señalización celular mediados por la secreción de moléculas
Receptores de señales y señalización intracelular
Señalización a través de contactos célula-célula y célula-sustrato
Capítulo 14: Ciclo celular y destinos vitales de la célula
Introducción
Fases del ciclo celular
Regulación del ciclo celular: puntos de control
Regulación en cada punto de control y consecuencias del avance a la siguiente fase
16
Elementos de retrocontrol del ciclo celular
Elementos extrínsecos que influyen en el control del ciclo celular
Destinos vitales de la célula y respuestas celulares al estrés
Capítulo 15: División celular y muerte programada
División celular
Muerte celular programada (apoptosis)
Capítulo 16: Biología celular del cáncer
Introducción
Epidemiología y factores de riesgo
Características de las células tumorales
Tipos de cáncer
Inducción del cáncer por carcinógenos y microorganismos
Bases genéticas del cáncer
Alteraciones epigenéticas
Virus oncogénicos
Carcinogénesis. Modelo del cáncer de colon
Angiogénesis y metástasis
Evasión del sistema inmunitario
Tratamientos del cáncer
Capítulo 17: Bases celulares de la respuesta inmunitaria
17
Propiedades generales del sistema inmunitario. Inmunidad innata y adaptativa
Reconocimiento del antígeno
Activación linfocitaria
Mecanismos efectores
Regulación de la respuesta inmunitaria
Disfunciones del sistema inmunitario y sus consecuencias
Capítulo 18: Las células madre y sus aplicaciones terapéuticas
Células madre: definición y clasificación
Plasticidad de las células madre
Fuentes tisulares de células madre
Potencial y limitaciones de las células madre
Aplicación clínica de las células madre: presente y futuro
Conclusiones
Índice alfabético
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Página de créditos
© 2015 Elsevier España, S.L.U.
Avda. Josep Tarradellas 20-30, 1.°
08029 Barcelona, España
Fotocopiar es un delito (Art. 270 C.P.)
Para que existan libros es necesario el trabajo de un importante colectivo (autores, traductores, dibujantes, correctores,
impresores, editores…). El principal beneficiario de ese esfuerzo es el lector que aprovecha su contenido.
Quien fotocopia un libro, en las circunstancias previstas por la ley, delinque y contribuye a la «no» existencia de
nuevas ediciones. Además, a corto plazo, encarece el precio de las ya existentes.
Este libro está legalmente protegido por los derechos de propiedad intelectual. Cualquier uso fuera de los límites
establecidos por la legislación vigente, sin el consentimiento del editor, es ilegal. Esto se aplica en particular a la
reproducción, fotocopia, traducción, grabación o cualquier otro sistema de recuperación y almacenaje de información.
ISBN (versión impresa): 978-84-9022-036-8
ISBN (versión electrónica): 978-84-9022-487-8
Depósito legal (versión impresa): B. 17.821-2015
Depósito legal (versión electrónica): B. 17.822-2015
Impreso en España
Servicios editoriales: Gea Consultoría Editorial, s.l.
Advertencia
20
La medicina es un área en constante evolución. Aunque deben seguirse unas precauciones de seguridad estándar, a
medida que aumenten nuestros conocimientos gracias a la investigación básica y clínica habrá que introducir cambios
en los tratamientos y en los fármacos. En consecuencia, se recomienda a los lectores que analicen los últimos datos
aportados por los fabricantes sobre cada fármaco para comprobar las dosis recomendadas, la vía y duración de la
administración y las contraindicaciones. Es responsabilidad ineludible del médico determinar las dosis y el
tratamiento más indicados para cada paciente, en función de su experiencia y del conocimiento de cada caso concreto.
Ni los editores ni los directores asumen responsabilidad alguna por los daños que pudieran generarse a personas o
propiedades como consecuencia del contenido de esta obra.
El Editor
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22
Dedicatoria
A mi hermana Mercedes, joven víctima del cáncer, con la ilusión de que este libro
estimule el estudio de la célula normal y patológica
A toda mi familia, en especial a mis padres
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Colaboradores
José J. Abad,
Departamento de Biología Celular y Tisular, Facultad de Medicina, UNAM, Ciudad de México, D.F.,
México
Xabier Agirre,
Programa de Tumores Hematológicos, CIMA, Universidad de Navarra, Pamplona, España
Jackeline Agorreta,
Programa de Tumores Sólidos, CIMA, y Departamento de Histología y Anatomía Patológica,
Facultad de Medicina, Universidad de Navarra, Pamplona, España
Tarek Ajami,
Servicio de Urología, Hospital Clínic i Provincial, Barcelona, España
Matías Ávila,
Programa de Hepatología, CIMA, Universidad de Navarra, Pamplona, España
María S. Aymerich,
Programa de Neurociencias, CIMA, y Departamento de Bioquímica y Genética, Facultad de
Ciencias, Universidad de Navarra, Pamplona, España
Eva Bandrés,
Servicio de Inmunología, Complejo Hospitalario de Navarra, Pamplona, España
Iosune Baraibar,
Servicio de Oncología, Clínica Universidad de Navarra, Pamplona, España
Carmen Berasain,
Elena Bodegas,
Programa de Hepatología, CIMA, Universidad de Navarra, Pamplona, España
Departamento de Histología y Anatomía Patológica, Facultad de Medicina, Universidad de
Navarra, Pamplona, España
Carlos Bravo,
Departamento de Histología y Anatomía Patológica, Facultad de Medicina, Universidad de Navarra,
Pamplona, España
María Ángela Burrell,
Departamento de Histología y Anatomía Patológica, Facultad de Medicina, Universidad de
Navarra, Pamplona, España
Alfonso Calvo,
Departamento de Histología y Anatomía Patológica, Facultad de Medicina y Programa de Tumores
Sólidos, CIMA, Universidad de Navarra, Pamplona, España
Eduardo Castañón,
Servicio de Oncología, Clínica Universidad de Navarra, y Programa de Tumores Sólidos,
CIMA, Universidad de Navarra, Pamplona, España
25
Raúl Catena,
Institute for Molecular Life Sciences, University of Zurich, Zúrich, Suiza
Vicente Fresquet,
Mariana García,
Programa de Tumores Hematológicos, CIMA, Universidad de Navarra, Pamplona, España
Departamento de Medicina Celular y Molecular, Facultad de Ciencias Biomédicas, Universidad
Austral, Pilar, Argentina
Ignacio Gil-Bazo,
Servicio de Oncología, Clínica Universidad de Navarra, y Programa de Tumores Sólidos, CIMA,
Universidad de Navarra, Pamplona, España
María Gutiérrez,
Programa de Tumores Hematológicos, CIMA, Universidad de Navarra, Pamplona, España
Igor Hernández,
Programa de Tumores Sólidos, CIMA, Universidad de Navarra, Pamplona, España
Juan José Lasarte,
Programa de Hepatología, CIMA, Universidad de Navarra, Pamplona, España
Estefanía Maldonado,
Departamento de Histología y Anatomía Patológica, Facultad de Medicina, Universidad de
Navarra, Pamplona, España
Álvaro Martín,
Unidad Docente Multiprofesional (UDM) de Pediatría y Áreas Específicas, Hospital Universitario
Virgen del Rocío, Sevilla, España
Luis Montuenga,
Programa de Tumores Sólidos, CIMA, y Departamento de Histología y Anatomía Patológica,
Facultad de Medicina, Universidad de Navarra, Pamplona, España
Paul Nguewa,
Instituto de Salud Tropical (ISTUN), y Departamento de Microbiología y Parasitología, Facultad de
Medicina, Universidad de Navarra, Pamplona, España
Estanislao Nistal,
Programa de Hepatología, CIMA, Universidad de Navarra, Pamplona, España
Beatriz Pelacho,
Programa de Terapia Celular, CIMA, Universidad de Navarra, Pamplona, España
Diego Peñafiel,
Servicio de Pediatría y sus Áreas Específicas, Complejo Hospitalario de Navarra, Pamplona,
España
Rubén Pío,
Programa de Tumores Sólidos, CIMA, y Departamento de Bioquímica y Genética, Facultad de Ciencias,
Universidad de Navarra, Pamplona, España
Felipe Prósper,
Programa de Terapia Celular, CIMA, Universidad de Navarra, Pamplona, España
26
Ángela María Suburo,
Departamento de Medicina Celular y Molecular, Facultad de Ciencias Biomédicas,
Universidad Austral, Pilar, Argentina
Ignacio Tuñón,
Programa de Tumores Sólidos, CIMA, Universidad de Navarra, Pamplona, España
José Luis Vizmanos,
Departamento de Bioquímica y Genética, Facultad de Ciencias, Universidad de Navarra,
Pamplona, España
María Isabel Zudaire,
Programa de Tumores Sólidos, CIMA, Universidad de Navarra, Pamplona, España
27
28
Prefacio
Presentamos la primera edición de la obra Biología celular biomédica. Este libro reúne una serie de características
apropiadas para la enseñanza moderna de la Biología Celular que nos parecían insuficientemente tratadas en otras
obras: a) un enfoque marcadamente biomédico; b) una extensión que permite tratar los temas con profundidad, pero
sin abrumar al alumno, teniendo en cuenta la duración relativamente breve de esta materia en las carreras
universitarias; c) una redacción de fácil lectura, que permite comprender los procesos biológicos, muchas veces
complejos; d) la inclusión de algunos temas muy novedosos, como las células madre y la terapia celular, o los
tratamientos personalizados contra el cáncer, y e) material didáctico complementario online, con preguntas de
autoevaluación.
La Biología Celular es una materia cuyos conocimientos avanzan a una rapidez extraordinaria. Esto refleja la
importancia de conocer los intrincados procesos que ocurren en las células y cómo sus alteraciones dan lugar a
patologías. Según mi experiencia personal de años como profesor de Biología Celular e Histología de alumnos de
Medicina, Bioquímica y Biología, la «dimensión patológica» de la célula es uno de los temas que más atrae y motiva a
los estudiantes. Por eso hemos insistido en comentar brevemente, a lo largo de los diferentes capítulos del libro,
enfermedades que se originan como consecuencia de fallos en orgánulos o estructuras celulares. Pensamos que este
enfoque puede aumentar el entusiasmo por el estudio de esta materia por parte de los alumnos a los que va dirigida
esta obra: estudiantes de Medicina, Biología, Bioquímica, Biotecnología, Farmacia, Enfermería, Nutrición, Veterinaria
y otras carreras con enfoque biomédico.
En los últimos años hemos asistido, además, a la eclosión del apasionante mundo de las células madre, la terapia
celular, la regeneración y bioingeniería de tejidos, y al posible desarrollo de órganos en el laboratorio. Estos campos
abren unas perspectivas nunca antes soñadas sobre la posibilidad de tratar, de modo totalmente novedoso, numerosas
enfermedades que hasta el momento no tienen curación. Pero este reto solo se conseguirá si somos capaces de
comprender de un modo mucho más profundo cómo funcionan las células y cómo se pueden controlar sus procesos
de proliferación, diferenciación y muerte celular. Queremos lanzar a nuestros alumnos el reto de que muchos de ellos
sean los protagonistas de estos descubrimientos. De hecho, nos gustaría que nuestra obra reflejara la importancia de la
investigación para hacer avances significativos en biomedicina y poder contribuir así a solucionar las enfermedades
que afligen a la humanidad.
En este libro han contribuido un grupo de profesores e investigadores con experiencia docente, expertos en diversos
campos relacionados, directa o indirectamente, con la Biología Celular. También han contribuido algunos alumnos de
últimos cursos de Medicina, cuyo papel ha sido esencial para asegurar que la materia explicada sea comprensible para
los estudiantes.
29
Todos los autores tenemos un sincero deseo de que este libro sea una herramienta útil para el estudio de la Biología
Celular, particularmente en el ámbito de la biomedicina. Agradeceríamos que cualquier error que podamos haber
cometido o sugerencia acerca de cómo mejorar esta obra se nos haga llegar por e-mail o correo ordinario a:
Dr. Alfonso Calvo [email protected]
Departamento de Histología y Anatomía Patológica
Facultad de Medicina (C/ Irunlarrea, 1); y
Programa de Tumores Sólidos (C/ Pío XII, 55), CIMA
Universidad de Navarra
Pamplona, 31008. España
30
31
Agradecimientos
Son innumerables las personas a las que deberíamos agradecer su contribución a este libro. En primer lugar damos las
gracias a todos los miembros actuales y pasados del Departamento de Histología y Anatomía Patológica de la
Universidad de Navarra, por su apoyo constante y por permitirnos usar muchas de las imágenes de microscopía que
aparecen en el libro. Queremos expresar también nuestra gratitud a los Dres. Luis Miguel Pastor (Universidad de
Murcia), Luis Santamaría (Universidad Autónoma de Madrid), Agustín España (Universidad de Navarra), Miguel
Idoate (Universidad de Navarra) y a la Editorial EUNSA (en especial a Esperanza Melero), por haber donado algunas
de las fotos que ilustran la obra; a Cristina Calvo, Alberto Calvo y Fernando Calvo por su excelente trabajo de edición;
a los alumnos de la Facultad de Medicina de la Universidad de Navarra por inspirar la idea de llevar a cabo este libro;
a la Editorial Elsevier (en especial a Silvia Serra y Jorge García) por creer en nuestro proyecto. Queremos agradecer de
modo especial el trabajo de los doctorandos/as y personal técnico que han contribuido a nuestra investigación y que
pueden haber sufrido en algún momento nuestra falta de dedicación por habernos consagrado a esta obra.
Agradecemos también a todas las personas que hayan colaborado de un modo u otro a la redacción y edición de este
libro.
32
CAPÍTULO 1
33
Introducción a la biología de las células
Alfonso Calvo
Objetivos de aprendizaje
• Conocer las características generales de las células eucariotas.
• Definir los rasgos propios de las células procariotas, comparándolos con los de las células eucariotas.
• Conocer los elementos básicos de organización de agentes subcelulares, como virus, viroides y priones.
34
Introducción
La Biología Celular estudia las células desde una perspectiva integradora, esto es, considerando aspectos
morfológicos, bioquímicos, genéticos y funcionales. Así, en la génesis de esta ciencia, han confluido a lo largo de la
historia otras muchas disciplinas, cada una con su propia metodología de investigación y aproximación al estudio
celular, que han contribuido a nuestro conocimiento actual de la célula.
Las investigaciones sobre la célula vienen ligadas históricamente a la invención y desarrollo de los microscopios,
que tuvo lugar a partir del siglo xvi. En el siglo xvii, Robert Hooke (1635-1703) fue el primero en acuñar el término
«célula», observando al microscopio finas láminas de corcho en las que describió las celdillas que componían su
estructura. Estas observaciones fueron publicadas en su libro Micrographia (1665). Antony Van Leeuwenhoek (16321723) fabricó microscopios muy simples pero muy precisos, con los que describió la presencia de células sanguíneas,
protozoos, espermatozoides y bacterias, a los que denominó animáculos. En 1837-1839, Schleiden y Schwann
definieron la teoría celular, y establecieron que todos los organismos estaban formados por células, siendo estas, por
lo tanto, las unidades estructurales, funcionales y reproductivas de los seres vivos. En 1885, el patólogo Virchow
completó la teoría celular, al afirmar que «todas las células provienen de otra célula».
El posterior desarrollo de microscopios más precisos y de técnicas de tinción de las preparaciones permitió conocer
la estructura microscópica de los diferentes tejidos. En este aspecto, merece la pena destacar los trabajos de Camilo
Golgi (1843-1926) y Santiago Ramón y Cajal (1852-1934), quienes utilizaron tinciones de sales de plata, oro y osmio
que permitieron extender la teoría celular al sistema nervioso. En 1906 ambos obtuvieron el premio Nobel de
Medicina.
En 1930 se fabricó el primer microscopio electrónico, con el que se consiguieron ver orgánulos celulares, lo que
supuso un avance tremendo en el conocimiento de las células. Poco después se desarrollaron las técnicas de
fraccionamiento celular y centrifugación diferencial, que permitieron aislar orgánulos de acuerdo a su velocidad de
sedimentación en la centrifugación; esto posibilitó su estudio funcional. De 1940 en adelante se pusieron en marcha las
técnicas de cultivos celulares, esenciales también para el estudio funcional de las células. En 1953, Watson y Crick
propusieron la estructura en doble hélice del ADN, basándose en experimentos fundamentalmente cristalográficos.
Con este descubrimiento nació la genética moderna y se sentaron las bases moleculares de las enfermedades
genéticas.
En la segunda mitad del siglo xx la investigación biológica creció exponencialmente: se realizaron numerosos
avances científicos y se desarrollaron muchas técnicas con las que se consiguió un conocimiento muy profundo de la
estructura y función de las células. Un hito histórico destacable es el proyecto Genoma Humano, que se gestó en la
etapa final del siglo xx y consistió en la secuenciación completa del genoma humano (que fue publicada en el año
2003). Esto se consiguió en un tiempo récord gracias al desarrollo de potentes técnicas de secuenciación y
35
bioinformáticas. Con los datos del genoma humano completo se pueden estudiar de un modo muy amplio y preciso
las alteraciones genéticas que originan muchas de las enfermedades humanas, así como la regulación génica que
gobierna la fisiología celular.
36
Organización celular de distintos organismos
Los organismos vivos se caracterizan por su capacidad de crecer, responder a estímulos, interactuar con su
microambiente externo, evolucionar y reproducirse autónomamente gracias a una compleja organización celular en la
que tienen lugar los procesos metabólicos. Aunque los organismos vivos pueden ser unicelulares (bacterias,
levaduras, protozoos y ciertas algas) o multicelulares (plantas, animales y algunas algas y hongos), se pueden
clasificar, básicamente, en dos tipos, atendiendo a su organización celular: procariotas y eucariotas. Aunque el objeto
de estudio del presente libro es la célula eucariota humana, conviene conocer el esquema de organización básica de
los organismos procariotas, así como de otros organismos eucariotas causantes de infecciones en humanos.
Analizaremos también brevemente la organización de agentes subcelulares (virus, viroides y priones) que también
pueden causar importantes patologías humanas.
Organización de las células eucariotas
La estructura celular interna básica de las células eucariotas está bastante conservada en los distintos organismos. Su
característica fundamental es la presencia de núcleo, que es la parte esencial de la célula, pues contiene el material
genético. El ADN posee la información necesaria para sintetizar las proteínas requeridas para la estructura y el
funcionamiento normal de la célula. A diferencia de los procariotas, que contienen solamente un cromosoma circular,
los núcleos eucariotas tienen múltiples cromosomas lineales, cada uno de los cuales puede ser replicado, condensado
y separado de su copia (su cromátida hermana) antes de la división celular. Las células eucariotas animales poseen
distintos orgánulos celulares, citoesqueleto, ribosomas de un tamaño de 80 S y centrosomas, y realizan procesos de
tráfico intracelular de vesículas (como la endocitosis, la exocitosis, etc.). La división celular tiene lugar por
mecanismos complejos que ocurren durante la mitosis (o meiosis, en el caso de las células germinales). En el caso de
organismos vegetales, las células están rodeadas por una pared de celulosa y contienen cloroplastos (para la
realización de la fotosíntesis) y grandes vacuolas, pero carecen de centrosomas y lisosomas. La figura 1-1 muestra un
esquema de la organización de las células eucariotas humanas, con la indicación del capítulo de este libro en el que se
hará referencia a cada una de dichas estructuras. A continuación hablaremos brevemente de la organización biológica
de protozoos y hongos (células eucariotas), por ser algunos de ellos agentes patógenos en humanos. El conocimiento
de la estructura de estos agentes patógenos y sus mecanismos de infección es de gran importancia para desarrollar
terapias eficaces contra estas patologías.
37
FIGURA 1-1 Esquema general de la organización de la célula eucariota. En las principales estructuras celulares se indica el capítulo de
este libro donde se estudia dicha estructura.
Protozoos
El término «protozoo» se refiere a una familia de organismos unicelulares con organización estructural de célula
eucariota, que incluye miles de especies. La mayoría de las especies de protozoos se reproducen asexualmente por
fisión binaria, mientras que otros son capaces de llevar a cabo reproducción sexual. Algunas especies son parásitas y
pueden infectar a las células sanguíneas, los aparatos urogenital y digestivo y otros tejidos. Como ejemplo general,
comentaremos brevemente la estructura y el ciclo biológico del género Plasmodium (fig. 1-2). Este género incluye un
grupo de protozoos que causa la malaria en humanos (una enfermedad que ocasiona cientos de miles de muertes al
año, predominantemente en las áreas tropicales). P. falciparum es la especie que transmite la forma más frecuente y
grave de malaria. La transmisión a humanos ocurre por una picadura del mosquito Anopheles, dentro del cual tiene
lugar la reproducción sexual de los protozoos. Los plasmodios, que se han replicado dentro del tubo digestivo del
mosquito, viajan a sus glándulas salivales, donde pasan al humano tras una picadura. Entonces, los plasmodios (que
en esta fase se llaman esporozoítos) se instalan en el hígado, donde se replican de modo asexual. Los parásitos
permanecen en el hígado en forma de esquizonte, hasta que se liberan (en forma de merozoítos) al torrente sanguíneo, e
invaden los eritrocitos. Dentro de cada eritrocito infectado, los parásitos (llamados ahora «trofozoítos») se nutren de la
hemoglobina y, en un momento dado, se replican, lo que causa lisis celular. Los picos de fiebre alta y los escalofríos
típicamente asociados a la malaria son causados por los productos tóxicos de la hemólisis.
38
FIGURA 1-2 Imagen de un frotis de sangre donde se observa un plasmodio (flecha) entre los eritrocitos. (Procedente de: http://dpd.cdc.gov.)
Hongos
Los hongos son eucariotas de metabolismo heterótrofo que constituyen organismos unicelulares o pluricelulares, con
reproducción asexual y sexual. Los hongos unicelulares son redondeados y se denominan levaduras. La mayoría de
los hongos son pluricelulares y están formados por células cilíndricas alargadas dispuestas linealmente para constituir
filamentos, denominados «hifas». Las hifas pueden crecer hasta formar micelios, visibles macroscópicamente. La
organización de estos organismos es la de una típica célula eucariota, pero con la peculiaridad de estar rodeada por
una pared de polisacáridos fibrilares (como la quitina) y estructuras amorfas de glucanos y mananos (que contienen
los principales antígenos de la pared). La pared forma un exoesqueleto rígido que posee una función protectora, pero
no permite la endocitosis. Las enfermedades causadas por hongos se denominan micosis. Hay ciertas especies de
hongos que son muy importantes desde el punto de vista clínico, porque constituyen patógenos oportunistas que
causan enfermedades en pacientes inmunodeprimidos (como los géneros Candida y Aspergillus). Los tratamientos
incluyen anfotericina B y antifúngicos imidazólicos.
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Candida albicans es una especie de hongo unicelular (levadura) que puede vivir de modo comensal en la piel y en las
mucosas de individuos sanos, pero cuando se dan las condiciones externas adecuadas de humedad, ambiente cálido e
inmunodepresión, provoca infecciones con distinto grado de sintomatología. La candidiasis mucocutánea puede
afectar a las manos, pies, genitales, axilas y cavidad orofaríngea, generando lesiones eritematosas, picor, pápulas y
pústulas. Si la inmunodepresión es muy severa, esta levadura es capaz de entrar en el torrente sanguíneo (en cuyo
caso, la infección se denomina candidemia), y puede afectar así a órganos como los ojos (con riesgo de sufrir ceguera)
y riñones (oliguria y fallo renal). Entre los síntomas sistémicos se incluyen coagulación intravascular, fiebre, shock y,
potencialmente, la muerte.
Entre los hongos filamentosos hay algunos que causan micosis cutáneas, subcutáneas o sistémicas. El género
Aspergillus (fig. 1-3) está constituido por especies oportunistas que dan lugar a micosis sistémicas (la infección
pulmonar es la localización más frecuente). Este hongo puede provocar asma aspergilar, bronquitis, otitis o fungemias
de pronóstico muy grave.
FIGURA 1-3 Fotografía microscópica del género patógeno Aspergillus.
Otro hongo que mencionaremos es Saccharomyces cerevisiae, una levadura utilizada industrialmente para la
fabricación de pan y cerveza que constituye, además, un modelo de estudio ampliamente utilizado en biología celular
y molecular. Estas levaduras se pueden cultivar con facilidad en el laboratorio y se han empleado durante años para
estudiar muchos aspectos relacionados con la replicación del ADN, la transcripción y la traducción proteicas, y el ciclo
y la división celulares.
Organización de las células procariotas
Los procariotas son organismos unicelulares de reproducción asexual, sin núcleo y, normalmente, sin orgánulos
rodeados de membrana. Son organismos de distribución ubicua en la naturaleza, lo que demuestra su grado de
adaptación al medio y su diversidad de metabolismos, que pueden ser de tipo autótrofo o heterótrofo. En la tabla 1-1
se muestran las diferencias estructurales y funcionales entre los organismos eucariotas y los procariotas. Los
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procariotas se pueden clasificar en dos grandes grupos (llamados «dominios»): bacterias y archaea (antiguamente
denominados «arqueobacterias»). Este último grupo incluye organismos extremófilos (con capacidad de sobrevivir en
ambientes adversos) que no tienen gran relevancia médica, por lo que nos centraremos únicamente en las bacterias.
Tabla 1-1
Resumen de las diferencias entre células eucariotas y procariotas
Eucariotas
Procariotas
10-100 μm
0,2-2 μm
Localización del genoma
Dentro del núcleo, recubierto por la envoltura nuclear
En el citoplasma, sin envoltura nuclear
Estructura del genoma
Lineal, segmentado en cromosomas, asociados a histonas
Un solo cromosoma circular; sin histonas
Citoesqueleto
Presente
Ausente
Pared celular
En células animales, inexistente; en plantas, celulosa; en algunos hongos, quitina; en levaduras, glucanos y mananos Peptidoglucano y otras estructuras
Movilidad
Cilios y flagelos en algunas células animales
Flagelos rotatorios de locomoción
División celular
Mitosis o meiosis
Fisión binaria
Ribosomas
80 S en el citoplasma
70 S
Orgánulos cubiertos de membrana
Núcleo, mitocondrias, retículo endoplasmático, aparato de Golgi, endosomas, vacuolas; cloroplastos (en plantas
Ninguno. Algunas bacterias poseen mesosomas (orgánulos
fotosintéticas)
primitivos)
Tamaño de la célula (diámetro
promedio)
Bacterias
Las bacterias (fig. 1-4) son procariotas recubiertos por una pared que les confiere protección frente al medio externo.
En función de la estructura de la pared, las bacterias se clasifican en dos grandes grupos: grampositivas y
gramnegativas, dependiendo de la coloración frente a la tinción de Gram. Algunas bacterias pueden ser clasificadas
como ácido-alcohol resistentes (tinción de Ziehl-Neelsen); son bacterias de alto contenido en ácido micólico y sus
paredes son muy hidrófobas. Un ejemplo es Mycobacterium tuberculosis, agente causal de la tuberculosis.
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FIGURA 1-4 Esquema de la organización celular de las bacterias. A. Organización general con sus estructuras principales. B.
Esquema de la estructura de la pared de bacterias grampositivas. C. Pared de bacterias gramnegativas.
Las bacterias presentan una gran diversidad de formas y agrupaciones, características de cada especie y, por lo
tanto, con interés taxonómico. Las más frecuentes son los cocos (esféricos), los bacilos (bastoncillos) y los espirilos (en
forma de sacacorchos). Metabólicamente son organismos extraordinariamente diversos; los hay aerobios estrictos,
anaerobios estrictos y otras situaciones intermedias. Dependiendo del tipo, podrán fermentar, respirar, fotosintetizar
e, incluso, obtener energía de la oxidación de compuestos inorgánicos. Algunas bacterias son muy plásticas y,
dependiendo de las condiciones, utilizarán un sistema u otro para obtener energía.
Los procariotas carecen de orgánulos de membrana, aunque algunos pueden poseer pseudo-orgánulos
(mesosomas) donde se acumulan compuestos orgánicos o inorgánicos. Los ácidos nucleicos de los procariotas no
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están rodeados por una membrana nuclear, de tal modo que el ADN, los ribosomas, las enzimas y los metabolitos se
distribuyen a lo largo del citoplasma. El típico genoma bacteriano consiste en una molécula de doble cadena de ADN
circular (cromosoma bacteriano), no unido a histonas. Las bacterias pueden tener también varias cadenas de material
genético extracromosómico, llamadas plásmidos. Estas secuencias circulares de ADN son mucho más pequeñas que el
cromosoma y codifican para genes que les confieren algunas ventajas para la supervivencia, como, por ejemplo, la
capacidad de resistencia frente a antibióticos, la adaptación a determinados medios o la capacidad de ser más
virulentas. Entre otras características típicas de los procariotas podemos decir que la traducción de proteínas tiene
lugar en ribosomas de un tamaño de 70 S y la membrana celular carece de colesterol y esteroides.
La estructura y la composición de la pared bacteriana difieren entre las bacterias grampositivas y gramnegativas. El
componente esencial de la pared es el peptidoglucano, que proporciona rigidez y estabiliza la estructura de la misma.
En la pared de las bacterias grampositivas hay una capa gruesa de peptidoglucano, mientras que en las bacterias
gramnegativas constituye una capa fina, separada de la membrana plasmática por el espacio periplasmático y
recubierta exteriormente por otra membrana que contiene lipopolisacáridos. El lipopolisacárido es conocido como
endotoxina, ya que produce fiebre, activación de la cascada del complemento, elevación de los niveles de citoquinas,
etc. Algunas bacterias poseen por encima de estas estructuras un glucocáliz (cápsula), formado normalmente por
polisacáridos; puede estar presente tanto en bacterias gramnegativas como en grampositivas. La cápsula protege a la
bacteria de la desecación y de la fagocitosis y le permite adherirse a determinados sustratos o tejidos.
Las bacterias pueden tener también uno o múltiples flagelos que utilizan principalmente para la locomoción. Para la
adherencia pueden presentar, además, unas proyecciones proteicas denominadas «fimbrias». Los pili (pilus en
singular) tienen una estructura similar a las fimbrias, aunque son más largos y gruesos; están especializados en la
conjugación bacteriana para transferir material genético de una bacteria a otra. Algunas especies (la mayoría de las
cuales son bacilos grampositivos) son capaces de formar endosporas en condiciones adversas, que constituyen una
forma muy resistente frente a agentes químicos o físicos. Las endosporas pueden sobrevivir en estas condiciones
latentes durante cientos de años, y pueden germinar de nuevo, retornando a su estado normal cuando se exponen a
condiciones favorables.
Existen innumerables ejemplos de bacterias patógenas; de entre ellas, nos referiremos a algunas que serán citadas
posteriormente en capítulos de este libro. Helicobacter pylori es una especie acidófila, de forma helicoidal,
gramnegativa, que coloniza la mucosa gástrica en humanos. Esta bacteria se adapta bien a ambientes muy ácidos,
característicos del estómago. H. pylori produce una infección crónica que puede permanecer asintomática o dar lugar a
úlceras que incluso perforan el estómago, además de aumentar el riesgo de sufrir cáncer gástrico y linfoma de tipo
MALT (v. capítulo 16). En el pasado, cuando se desconocía que la úlcera gástrica podía ser causada por este
microorganismo, esta patología tenía un tratamiento difícil. Actualmente, una adecuada combinación de antibióticos e
inhibidores de la bomba de protones constituye un tratamiento rápido y eficaz.
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Otro ejemplo que consideraremos es Vibrio cholerae, un bacilo curvo, gramnegativo, flagelado, anaerobio facultativo
y agente causante de las epidemias de cólera. V. cholerae (y otras especies de Vibrio) se transmite mediante la ingesta de
alimentos contaminados. Al igual que otras bacterias patógenas del tubo gastrointestinal, V. cholerae evade el sistema
inmune del huésped (incluidos la lisozima, el ácido gástrico, las células fagocíticas, etc.) y se adhiere a las células
epiteliales del intestino. La subunidad B de la toxina colérica se une a los gangliósidos en la superficie de la célula,
mientras que la subunidad A penetra en el citosol. Esto conlleva el inicio de una cascada de señalización intracelular
que aumenta los niveles de AMPc (v. capítulo 13), lo cual altera el balance normal de electrólitos: los niveles de Na y
+
Cl aumentan en la luz intestinal, y entonces arrastran agua hacia la luz por ósmosis, provocando diarrea y vómitos.
−
Salmonella es un género de bacterias gramnegativas, en forma de bacilos flagelados, anaerobios facultativos, que
incluye varias especies y serotipos patógenos para los humanos. S. enterica serovariedad typhi causa la fiebre tifoidea,
que provoca diarreas, dolores abdominales, vómitos y náuseas. S. enterica serovariedad enteritidis, es el agente causal
de la gastroenteritis típicamente asociada a la intoxicación alimentaria debida a la ingesta de huevos, pollo o carne no
bien cocidos. Una vez ingerida, S. enteritidis (al igual que otras serovariedades de Salmonella) es capaz de evadir la
respuesta inmune del huésped, adherirse a la mucosa (v. capítulo 5) e invadir las células epiteliales, o ser fagocitada
por macrófagos. Como muchas otras bacterias gramnegativas, Salmonella tiene lipopolisacáridos abundantes en su
membrana externa, que desencadenan una respuesta inmunológica potente y muchos de los síntomas asociados a la
salmonelosis.
La bacteria Escherichia coli es un bacilo gramnegativo, anaerobio facultativo, que se encuentra en el intestino (y otros
órganos) normalmente en forma de simbionte, como parte de la microbiota intestinal normal. Algunas cepas son, no
obstante, altamente patógenas, y causan infecciones intestinales, urinarias, etc. (v. capítulo 9). Esta bacteria tiene gran
importancia en investigación biomédica. E. coli es la bacteria más utilizada en ingeniería genética para la obtención de
compuestos de interés biológico o terapéutico. Muchas proteínas recombinantes se producen en E. coli modificadas
genéticamente. Esta bacteria se ha empleado para el estudio de numerosos procesos biológicos como la replicación o
la transcripción del ADN. Las variantes genéticas mutantes nos han permitido, además, conocer aspectos clave de la
resistencia de las bacterias frente a los antibióticos.
Finalmente hablaremos de los micoplasmas, bacterias que carecen de pared celular, por lo que son resistentes a
penicilinas y a otros antimicrobianos que actúan sobre esta estructura. En humanos, los micoplasmas pueden
colonizar superficies mucosas de las vías respiratorias (como Mycoplasma pneumoniae) y el aparato urogenital
(Mycoplasma hominis). M. pneumoniae entra en cuerpo por inhalación provocando infecciones en las vías respiratorias.
Tras un período largo de incubación de 2 a 3 semanas, comienzan los síntomas, que incluyen dolor de cabeza, tos y
fiebre. Algunos pacientes pueden presentar bronquitis o neumonía.
Los micoplasmas son células muy pequeñas (de unos 200 nm). La especie Mycoplasma genitalium tiene solamente 482
genes, y recientemente se ha descubierto que 100 de estos genes podrían no ser esenciales para su supervivencia. El
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instituto Venter (EE. UU.) ha conseguido sintetizar en el laboratorio un micoplasma con solo 382 genes absolutamente
necesarios para que este microorganismo pueda cultivarse in vitro y replicarse. Este microorganismo se ha conseguido
eliminando (uno a uno) genes de M. genitalium que no se requieren para la vida. El microorganismo resultante se ha
llamado Mycoplasma laboratorium. La simplicidad de los micoplasmas, junto a la capacidad de ser modificados
genéticamente de modo relativamente sencillo, les convierte en «herramientas biológicas» idóneas para la generación
artificial de nuevos organismos útiles para el hombre.
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Organización de agentes subcelulares patógenos
Virus
Estructura y replicación
Los virus son agentes infecciosos que consisten básicamente en un genoma empaquetado por una cubierta proteica,
sin capacidad de replicarse independientemente (fig. 1-5). Son parásitos intracelulares obligados, lo que significa que
deben entrar en una célula huésped y aprovecharse de sus enzimas y sustratos para poder replicarse. Aunque los
virus pueden tener una gran variedad de formas y estructuras, así como estrategias de replicación y capacidad de
invadir diferentes células huésped, hay unos rasgos básicos característicos de todos ellos. Su cubierta, llamada
«cápside», está formada por unidades (fundamentalmente de naturaleza proteica) denominadas «capsómeros». Por
encima, algunos pueden presentar una envoltura lipoproteica (membrana que adquieren de la célula en la que se
replicaron). Sus genomas pueden consistir en ADN o ARN, que pueden ser de cadena doble o simple, lineal o
circular, segmentado o no. Para simplificar, vamos a dividir los virus en tres clases de acuerdo al tipo de ácido
nucleico y modelo de replicación: 1) virus de ADN; 2) virus de ARN, y 3) virus que requieren transcriptasa inversa.
1. Los virus de ADN pueden ser de cadena doble (bicatenarios [ADNbc]) o simple (monocatenarios [ADNmc]). Se
replican mediante una ADN polimerasa codificada bien por el genoma vírico, o bien por el de la célula huésped. Los
poxvirus (como el virus de la viruela) son virus de ADNbc que se replican en el citoplasma de la célula en vez de en el
núcleo y, por lo tanto, deben codificar su propia ARN polimerasa dependiente de ADN. Otros virus de ADNbc son los
adenovirus (que provocan infecciones de las vías respiratorias y el sistema gastrointestinal, entre otras patologías), los
herpesvirus (que causan el herpes labial y, algunos de ellos, tumores) y los papovavirus (causantes de papilomas) (v.
capítulo 16). La familia de los parvovirus (que provocan artritis y eritema) es un buen ejemplo de virus con genoma de
ADNmc.
2. Los virus de ARN (o ribovirus) también pueden ser bicatenarios o monocatenarios, dependiendo de las especies, y
deben producir una polimerasa dependiente de ARN (conocida como replicasa) para replicar sus genomas. Los virus
monocatenarios pueden tener polaridad positiva cuando son inmediatamente traducidos por la célula huésped, al
igual que cualquier otro ARNm (dirección 5′-3′). Otros, en cambio, presentan polaridad negativa contraria a la del
ARNm (por lo tanto, antisentido) y no pueden ser traducidos directamente a proteínas: el ARN debe convertirse
primeramente en positivo para ser traducido. Algunos ejemplos de virus ARNmc(+) son los picornavirus (causantes del
resfriado común y de la poliomielitis) y los togavirus (causantes, p. ej., de la rubéola). Virus ARNmc(−) se encuentran,
por ejemplo, en las familias de ortomixovirus (agente causal de la gripe), paramixovirus (responsables de enfermedades
como el sarampión y las paperas) y rabdovirus (que incluye el virus de la rabia y de la estomatitis vesicular). La
mayoría de los virus ARNbc pertenecen a la familia de los reovirus y tienen un genoma segmentado.
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3. El tercer tipo incluye virus que codifican para la enzima transcriptasa inversa, con la que sintetizan ADN a partir de
un molde de ARN. El genoma vírico puede consistir en ADN, como en los hepadnavirus (que incluyen los virus que
causan la hepatitis B), o en ARN, en el caso de la familia de retrovirus, en cuyo grupo está el virus del VIH (causante
del sida); en ambos casos se requiere la transcriptasa inversa para completar su ciclo de multiplicación.
FIGURA 1-5 Estructura de algunos virus. A. Representación de un adenovirus. B. Esquema de un bacteriófago. C. Imagen de
microscopía electrónica de un adenovirus. (C, procedente de: http://www.med.upenn.edu/gtp/morphology_gallery.shtml.)
Las cápsides víricas son típicamente icosaédricas (tienen 20 caras, cada una de las cuales equivale a un triángulo
equilátero) o cilíndricas (formadas por proteínas en disposición helicoidal). Algunas cápsides de bacteriófagos (virus
que infectan bacterias) pueden ser más complejas (v. fig. 1-5). Una vez traducidas por la maquinaria enzimática del
huésped, los capsómeros se autoensamblan alrededor del genoma vírico. Hay ciertos virus que poseen una envoltura
lipídica por encima de la cápside. Esta envoltura procede de la célula huésped en donde se replicó, por lo que contiene
no solo proteínas víricas (fundamentales para facilitar la futura invasión celular), sino además los propios
componentes de la membrana de la célula huésped.
De entre los numerosos virus que causan patologías en humanos, comentaremos brevemente algunos aspectos del
virus del papiloma humano, de la gripe y del sida.
Virus del papiloma humano
El virus del papiloma humano (HPV, del inglés human papilomavirus) es un virus sin envoltura, con una cápside
icosaédrica y genoma de ADN circular de doble cadena. Las partículas víricas infecciosas no codifican su propia
polimerasa, sino que la replicación del genoma vírico se lleva a cabo por la polimerasa de las células del hospedador
(fig. 1-6). Tras la entrada del ADN en la célula, se produce la transcripción del ARN y la traducción de proteínas
víricas, que genera viriones (partículas víricas completas listas para infectar a otra célula). El ADN vírico queda en el
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núcleo en forma de episoma (sin integrarse en el genoma del hospedador) y se replica durante los ciclos de replicación
de la célula, lo que mantiene de modo crónico la infección. En general, el HPV infecta células de epitelio escamoso —
por ejemplo, las de la piel (epitelio escamoso queratinizado)— y del aparato genital (epitelio escamoso mucoso). Un
rasgo típico de la infección por papilomavirus es la presencia de verrugas o papilomas, que están esencialmente
formadas por células escamosas que crecen en forma de tumor benigno. La transmisión del HPV ocurre típicamente a
través de contacto directo con la piel de los genitales. Las células infectadas desarrollan vacuolas citoplasmáticas
(pasando a llamarse entonces coilocitos), que constituyen un signo distintivo para la detección de esta infección.
Aunque las verrugas causadas por el HPV son benignas, la incorporación del genoma vírico dentro de la célula
huésped se asocia con progresión a carcinomas. En estas células, la presencia del genoma vírico conduce a una
expresión de dos proteínas víricas (E6 y E7), que inactivan proteínas de la célula huésped involucradas en la supresión
tumoral (p53 y proteína del retinoblastoma, respectivamente) (v. capítulo 16).
FIGURA 1-6 Esquema del ciclo de infección del virus del papiloma humano (HPV). Este es un virus oncogénico que puede causar
tumores de cérvix, entre otros, por inactivación de las proteínas Rb y p53.
En individuos inmunodeprimidos infectados con HPV existe un alto riesgo de desarrollar carcinomas. Aunque hay
numerosos tipos de papilomavirus, cada variante muestra normalmente un tropismo muy específico. Mientras que
unos tipos infectan la piel y pueden dar lugar a verrugas plantares (p. ej., HPV-1), otros tienen tropismo por el aparato
genital. HPV-6 y 11 son responsables de aproximadamente el 90% de las verrugas anogenitales, mientras que HPV-16
y 18 se asocian con carcinomas cervicales y del pene. La alta prevalencia de las infecciones de HPV entre las mujeres
sexualmente activas y el riesgo que tienen de desarrollar cáncer cervical han promovido el desarrollo de vacunas
(como Gardasil y Cervarix ) que previenen de modo eficaz la patología vírica.
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Virus de la gripe
El virus de la gripe (o Influenza) es de tipo ARNmc(−) segmentado en ocho fragmentos, cada uno de los cuales es capaz
de codificar proteínas distintas (11 en total) (fig. 1-7). Algunas cepas afectan solo al hombre o solo a animales (cerdo y
aves), mientras que otras son infecciosas en ambos, y puede darse, por lo tanto, un salto entre especies. La cápside está
recubierta por una envoltura en la que quedan embebidas (sobresaliendo hacia el exterior) dos tipos de proteínas
víricas: la neuraminidasa (NA o N) y la hemaglutinina (HA o H). La HA favorece la adhesión de las partículas víricas a
la célula huésped, mientras que la NA facilita la salida de la progenie vírica. Además, esta enzima puede degradar el
ácido hialurónico, y facilitar así la diseminación del virus.
FIGURA 1-7 Esquema representativo del ciclo del virus de la gripe. El proceso secuencial de infección se explica en el texto.
En humanos la infección comienza típicamente en las vías respiratorias superiores, tras la invasión del epitelio por
parte del virus; allí el ácido siálico de las superficies celulares interactúa con la HA. Tras la adhesión, la partícula
vírica entra por un mecanismo de endocitosis mediada por receptor (v. capítulo 5) en vesículas cubiertas de clatrina
(v. fig. 1-7, paso 1). El bajo pH típico de los endosomas permite que el virus se libere y salga hacia el citoplasma y,
posteriormente, al núcleo (v. fig. 1-7, paso 2). Allí, el ARNmc(−) puede ser transcrito por la ARN polimerasa vírica en
ocho moléculas de ARNmc (v. fig. 1-7, paso 3a) que, o bien son exportadas al citoplasma (donde son traducidas para
producir proteínas víricas) (v. fig. 1-7, paso 4) o bien permanecen dentro del núcleo, sirviendo como molde para la
replicación del genoma (v. fig. 1-7, paso 3b). Algunas proteínas recién sintetizadas son internalizadas hacia el núcleo
para formar nuevas partículas víricas (v. fig. 1-7, paso 5a); otras (neuraminidasa y hemaglutinina) pasan al aparato de
Golgi y terminan ancladas en zonas concretas de la membrana plasmática (v. fig. 1-7, paso 5b). El ARNmc(−) generado
por replicación, junto con otras proteínas víricas, sale del núcleo (v. fig. 1-7, paso 6) y migra hacia las zonas de la
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membrana donde se encuentran la neuraminidasa y la aglutinina, produciéndose el ensamblaje del virus y su liberación
(v. fig. 1-7, paso 7).
Como muchos otros virus, el virus de la gripe puede evadir el sistema inmunitario mediante un cambio de
estructura en sus antígenos, dando lugar así a nuevas cepas. Cada nueva forma antigénica se enumera en función de
las proteínas H y N seguidas de números. La recombinación que tiene lugar entre los fragmentos del genoma, aparte
de las mutaciones puntuales que puedan ocurrir, es responsable de la generación de estas variantes antigénicas. Si dos
cadenas distintas de ácido nucleico vírico infectan la misma célula huésped, la progenie vírica puede ser empaquetada
con una nueva combinación de segmentos de ARN. Estos fenómenos pueden ser suficientes para generar variantes
proteicas que no sean reconocidas por los anticuerpos creados durante una infección previa, por lo que las vacunas de
la gripe tienen que cambiar cada año. La generación de la variante H1N1 está ligada a la epidemia devastadora que
tuvo lugar en 1918 (llamada «gripe española»), que condujo a la muerte de unos 50 millones de personas, así como a la
de la pandemia de 2009-2010. Otra variante especialmente virulenta es la H5N1 (gripe aviar), que afecta tanto a
algunas aves como a los humanos.
Virus de la inmunodeficiencia humana (VIH)
El virus de inmunodeficiencia humana (VIH) (fig. 1-8) infecta células que expresan CD4 en su superficie, como los
linfocitos T cooperadores y los macrófagos. La propagación de la infección y la muerte de estas células conducen al
síndrome de inmunodeficiencia adquirida (SIDA), que aumenta la susceptibilidad del paciente a infecciones
oportunistas. El VIH es un retrovirus y, por lo tanto, pertenece al grupo de virus que codifican la transcriptasa
inversa. El genoma del VIH es de tipo ARNmc(+), con dos copias idénticas dentro de un virión maduro. Dentro de la
cápside, el virus contiene tres enzimas: la transcriptasa inversa, una proteasa y una integrasa. La cápside está rodeada
por proteínas de la matriz vírica que están asociadas con una envoltura esférica. Dos glucoproteínas víricas (gp120 y
gp41) sobresalen de la envoltura lipídica y permiten al VIH entrar en la célula huésped. Para el proceso de adhesión,
la proteína vírica gp120 debe unirse al CD4 y posteriormente a un correceptor: CXCR4 en el caso de células T
cooperadoras, o CCR5 en los macrófagos. La unión al receptor permite entonces la formación de un poro de fusión
que permite la entrada del virión (v. fig. 1-8, B, paso 1).
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FIGURA 1-8 Esquema de la estructura del virus del VIH (A) y del proceso de infección (B). El mecanismo básico de infección se
explica en el texto.
Una vez dentro, la replicación vírica requiere la acción de la transcriptasa inversa: el ARN vírico es transcrito en el
citoplasma para formar una copia de ADN (v. fig. 1-8, B, paso 2). La cadena de ADN sirve como molde para generar el
ADN bicatenario provírico, que es transportado al núcleo, donde se integra en el genoma de la célula con la ayuda de
la enzima integrasa vírica, que tiene actividad endonucleasa (v. fig. 1-8, B, paso 3). El provirus puede permanecer en
estado latente (asintomático), pero en presencia de determinados factores de transcripción, las ARN polimerasas de la
célula transcriben los ARNm de genes víricos (v. fig. 1-8, B, paso 4) que se traducen en el citoplasma (v. fig. 1-8, B,
paso 5). Las proteínas estructurales del VIH son codificadas por los siguientes genes: gag, que codifica varias proteínas
que forman la cápside y la matriz en el virión; pol, que codifica la transcriptasa inversa, la integrasa y la proteasa; y
env, que da lugar a las glucoproteínas destinadas a la superficie de la envoltura vírica. Los diferentes transcritos se
originan a partir del producto inicial de la traducción mediante un procesamiento llamado splicing (v. capítulo 8), para
poder formar las proteínas funcionales. El ensamblaje y la liberación de nuevos virus se producen en la membrana
plasmática de la célula huésped (v. fig. 1-8, B, pasos 6 y 7).
Viroides
El término «viroide» se usa para describir un grupo de patógenos intracelulares que causan enfermedades en plantas.
Son estructuralmente más simples y pequeños que los virus. Consisten esencialmente en ARN circular de cadena
simple sin una cubierta de proteínas ni otra envoltura, y son capaces de autorreplicarse dentro de la célula huésped.
51
Los viroides poseen normalmente de 250 a 400 nucleótidos, y no parecen codificar ninguna proteína. Se sospecha que
su estructura de ARN interactúa con componentes celulares, causando así su replicación, patogenicidad y movimiento
dentro de las células. Estos agentes son resistentes a ribonucleasas y la replicación parece que tiene lugar mediante la
utilización de las ARN polimerasas de la célula huésped. Originan enfermedades porque interfieren con los procesos
fisiológicos celulares cuando su número es abundante. Los viroides se caracterizan por poseer estructuras secundarias
en forma de bastón con regiones altamente conservadas. Estos agentes entran en el sistema vascular de la planta (el
floema), donde pueden circular y, eventualmente, invadir nuevas células, repitiendo así su ciclo replicativo de vida.
Priones
Las proteínas priónicas (PrP) normales se expresan en las superficies de neuronas en los humanos y en otros
mamíferos, aunque su papel exacto dentro del sistema nervioso es desconocido. Sin embargo, su plegamiento anormal
se asocia con varias enfermedades neurodegenerativas, incluidas la enfermedad de Creutzfeldt-Jakob (ECJ), el
insomnio familiar fatal, el scrapie y el kuru. A pesar de que estas enfermedades son relativamente infrecuentes y tienen
características propias, todas ellas causan encefalopatías espongiformes transmisibles. La PrP mal plegada (de aquí
en adelante nos referiremos a esta simplemente como «el prión») se convierte en un agente infeccioso que activa una
reacción en cadena capaz de cambiar el plegamiento de PrP normales. Cuando un prión patógeno (PrP , del inglés
Sc
scrapie isoform) entra en contacto con una PrP normal (PrP , del inglés celular isoform), induce un cambio
C
conformacional en la PrP que la transforma en PrP (y, por lo tanto, en patógena e infecciosa). Aunque no se han
C
Sc
elucidado plenamente los detalles de esta transformación priónica, se ha postulado que la conversión de PrP en PrP
C
Sc
depende de la actividad catalítica del prión y/o de la polimerización dependiente de nucleación.
El prión patógeno puede ser el resultado de mutaciones del gen que codifica la PrP (localizado en el cromosoma 20p
en los humanos), o puede ser transmitido por la contaminación con tejidos infectados. Entre las enfermedades
priónicas familiares se incluyen la ECJ, el síndrome de Gerstmann-Sträussler-Scheinker y el insomnio familiar fatal.
Entre las enfermedades originadas por ingestión de alimentos contaminados están el kuru (enfermedad endémica de
Nueva Guinea), el scrapie (que se transmite entre ovejas) y las encefalopatías espongiformes bovinas (la enfermedad
de las vacas locas). Los PrP son resistentes a proteasas y a tratamientos antisépticos tradicionales, como la cocción, la
Sc
irradiación o el tratamiento con agentes químicos desnaturalizantes. Los PrP interfieren en el funcionamiento normal
Sc
de las neuronas, causando su muerte y dando lugar al aspecto espongiforme del cerebro. La clínica de las
enfermedades priónicas suele incluir déficits neurológicos y demencia.
Lecturas recomendadas
52
Gamazo C, Sánchez S. Camacho AI. Microbiología basada en la experimentación. España: Elsevier; 2014.
Neumann G, Noda T, Kawaoka Y. Emergence and pandemic potential of swine-origin H1N1 influenza virus. Nature. 2009;459:931–939.
Ramón, Cajal S. Reglas y consejos sobre investigación científica. Madrid: Austral; 2007.
Willey J, Sherwood L, Woolverton C. Prescott’s Microbiology. 9.ª ed. Mc Graw Hill; 2013.
53
CAPÍTULO 2
54
Cómo se estudian las células. Métodos y técnicas
básicas en biología celular
Alfonso Calvo
Jackeline Agorreta
Raúl Catena
Ángela María Suburo
Mariana García
María Isabel Zudaire
Objetivos de aprendizaje
• Conocer los fundamentos de la microscopía óptica y electrónica, así como los diferentes tipos de microscopios.
• Comprender los mecanismos básicos de las principales técnicas empleadas en biología celular y molecular, con
ejemplos concretos sobre su uso en biomedicina.
• Entender cómo se modifican genéticamente las células y la utilidad de estos procedimientos en el conocimiento
de la fisiología celular y en la terapia génica.
• Valorar la utilidad diagnóstica de las técnicas explicadas (en especial la inmunohistoquímica, las técnicas
citogenéticas y la PCR, así como sus metodologías derivadas).
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Introducción
Actualmente existen innumerables técnicas que se emplean en biología celular para conocer la estructura y función de
las células. Lógicamente, no es el objetivo de este capítulo hacer una exposición exhaustiva de todas ellas y explicar su
metodología. Nos interesa únicamente destacar las principales herramientas utilizadas para el estudio más rutinario
de las células y su aplicación en biomedicina. Nos centraremos en el microscopio y en las técnicas relacionadas con la
microscopía. Algunas otras técnicas más propias de la biología molecular o la bioquímica con interés diagnóstico
serán explicadas en el material adicional de la web asociada a la presente obra.
56
Microscopía óptica convencional
El microscopio es un elemento imprescindible para el conocimiento y análisis de las células y tejidos. En el estudio de
las células se presentan dos problemas fundamentales: su pequeño tamaño y el hecho de que la mayoría de las
estructuras celulares son translúcidas, por lo que no se pueden distinguir con claridad. El primer problema se
soluciona por medio de los microscopios, que consiguen aumentar la imagen unas 1.500 veces, en el caso de un
microscopio óptico convencional, y unas 150.000-200.000 veces en el caso del microscopio electrónico. El segundo
problema se soluciona mediante la utilización de técnicas de contraste, como las tinciones o el uso de sistemas ópticos
especiales, que permiten distinguir las diferentes estructuras de células y tejidos. El microscopio óptico convencional
está formado por tres sistemas (fig. 2-1):
1. Mecánico: consta de pie, platina, tubo y columna.
2. Óptico: formado por el objetivo y el ocular.
3. De iluminación: constituido por el foco de luz, el condensador y el diafragma.
FIGURA 2-1 Partes del microscopio óptico clásico (de campo claro). (Dibujo procedente de: Montuenga et al. Técnicas en histología y biología celular.
Barcelona: Elsevier; 2009.)
Aumentos, poder de resolución y límite de resolución
No siempre que aumentamos una imagen conseguimos verla con más nitidez. El ejemplo más claro de esta evidencia
lo tenemos en una fotografía impresa que aumentamos una serie de veces. Si la imagen tiene pocos píxeles por
pulgada (es decir, tiene poca resolución), aunque aumentemos mucho la imagen, solo conseguiremos verla más
grande (pero pixelada, sin mejorar la definición). En microscopía, la calidad de la imagen viene determinada, por un
lado, por la correcta preservación de las estructuras del tejido, pero fundamentalmente por la calidad de la óptica del
microscopio y por la longitud de onda de la luz empleada. Por eso, en microscopía se ha introducido el concepto de
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poder de resolución, que se define como la capacidad que tiene un microscopio para distinguir como separados o
diferentes dos puntos muy cercanos entre sí. Un concepto inverso es el de límite de resolución (LR), que es la
distancia mínima que debe haber entre dos puntos muy cercanos entre sí para poder ser distinguidos como
independientes.
El LR para el ojo humano es de alrededor de 0,1 mm, de tal manera que si dos puntos están situados a una distancia
menor, no los podríamos distinguir con claridad como separados, sino que nos parecería que están juntos. El LR para
el microscopio óptico convencional es de
∼0,2 separado
esté
μm. Todopor
lo que
una distancia menor, o tenga un
tamaño inferior a esta medida, no podrá ser observado con claridad al microscopio óptico. El LR para el microscopio
electrónico de transmisión es de 10-20 Å. Las células (10-100 μm), el n
lisosomas (
úcleolas
μm),
celular
mitocondrias
(
∼10 y
∼0,5μm)
-10
μm),etc.,
las pueden
bacteriasser
(0,5
observados al microscopio óptico; en cambio,
estructuras como los ribosomas (25 nm), los virus (30-100 nm), la membrana plasmática (7 nm), etc., solo se pueden
observar con el microscopio electrónico.
Matemáticamente el LR se define como el cociente entre la longitud de onda empleada (λ) multiplicada por una
constante k, dividido por la apertura numérica (AN) del objetivo (fig. 2-2). AN se define, a su vez, como el producto
del índice de refracción del medio que existe entre la muestra y el objetivo, multiplicado por el seno del semiángulo
de haz de luz incidente (α). Como se utiliza luz del espectro visible, comprendida entre 400 y 700 nm, para el cálculo
del LR se utiliza un valor intermedio de λ (550 nm; k es una constante que tiene un valor de 0,65). En condiciones
óptimas, poniendo todos estos datos en la ecuación, obtendríamos un LR para el microscopio óptico convencional de
0,24 μm.
FIGURA 2-2 Definición matemática del límite de resolución (LR). En las mejores condiciones ópticas, el LR del microscopio óptico está
en torno a 0,2 μm.
La naturaleza ondulante de la luz establece que no se puedan alcanzar límites de resolución inferiores a
∼0,2
para un microscopio óptico convencional. Cuando un tren de ondas lumínicas que están en fase atraviesa los bordes
de un objeto, estas sufren desviaciones y chocan con las ondas que viajan paralelas a ellas. Esta interferencia (que se
denomina difracción óptica) hace que el borde de dicho objeto no se observe nítido, sino difuso. Por lo tanto, si dos
objetos pequeños están muy juntos entre sí, la difracción óptica haría que se confundieran como uno solo. Si se
utilizara luz de menor λ se conseguiría que esa desviación fuera menor y, por lo tanto, se disminuiría la interferencia,
58
obteniéndose así un LR más pequeño. Algunos microscopios utilizan luz ultravioleta (por debajo del espectro visible),
pero esto implica el empleo de sistemas ópticos que transformen posteriormente la luz en visible (una vez que el haz
ha atravesado la muestra). Como se verá más adelante, en el microscopio electrónico se utiliza un haz de electrones
acelerado como fuente de iluminación, que posee una λ muy pequeña, lo que permite aumentar considerablemente la
resolución.
Obtención de contraste
El contraste es la propiedad que nos permite distinguir estructuras celulares por su diferente color o brillo. Se puede
obtener contraste básicamente mediante dos métodos: a) mediante variaciones en la λ que atraviesa distintas
estructuras celulares, y b) mediante variaciones en la amplitud de la onda. Los colorantes modifican la λ, por lo que,
cuando se tiñe una célula o un tejido, la tinción diferencial de las diversas estructuras celulares hace que las veamos
con distinto color, lo cual proporciona el contraste. El uso combinado de varios colorantes, como por ejemplo la
hematoxilina (que nos permitirá ver los núcleos celulares de color azulado) y la eosina (que tiñe de rosa el citoplasma),
proporciona un mejor contraste. Cada colorante impide el paso de luz de determinadas λ y permite el paso de otras.
El otro modo de obtener contraste es el empleo de sistemas ópticos que consiguen variaciones en la amplitud de la
onda en zonas específicas del tejido o célula, lo cual proporciona diferencias en brillos (claros u oscuros). Cuando un
tren de ondas en fase atraviesa un tejido sin teñir sufre diferentes retrasos en función de la estructura que atraviese.
Por ejemplo, si atraviesa el núcleo o una estructura densa, ese tren de ondas se retrasará con respecto al que haya
atravesado una estructura menos densa, como el citoplasma (fig. 2-3). Pero el retraso en los trenes de ondas no
proporciona un claro contraste en el ojo humano; es decir, el hecho de que las ondas se retrasen no logra un contraste
suficiente. Algunos microscopios, como el de contraste de fases, poseen sistemas ópticos por los que se pueden
transformar dichos retrasos en diferencias en amplitud, que darían lugar a claroscuros y, por lo tanto, a contraste. Esto
se consigue mediante la recombinación de un haz de luz de referencia (que no atraviesa la preparación) con los haces
que atraviesan las distintas partes de la muestra. Como los retrasos de estos haces son diferentes, puede que la
recombinación con el haz de referencia tenga lugar fuera de fase (dando lugar a oscuridad) o en fase (lo que causaría
brillo) (v. fig. 2-3).
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FIGURA 2-3 Microscopía de contraste de fases. A. Las ondas que atraviesan una muestra (incluso sin teñir) sufren retrasos de fase
con respecto a la onda que no atraviesa la muestra (referencia). B. Si se hace interferir la onda de referencia con las ondas retardadas,
puede suceder que se anulen (por coincidir fuera de fase), dando lugar a oscuridad, o que se potencien (por coincidir en fase),
produciéndose brillo. C. El microscopio de contraste de fases utiliza este sistema óptico para la observación de células en cultivo (entre
otras aplicaciones). (C, procedente de: http://www.microscopyu.com/galleries/phasecontrast/index.html.)
El uso de estos microscopios tiene ventajas importantes. Los colorantes habituales que se utilizan en microscopía
son «no vitales» (es decir, causan la muerte celular), lo que impide hacer estudios de células vivas. El microscopio de
contraste de fases (al igual que el microscopio de interferencia) permite hacer estudios in vivo. En los laboratorios de
cultivos celulares se utilizan rutinariamente microscopios de contraste de fases especiales (para poder observar células
directamente en placas de cultivos), lo cual permite analizar propiedades celulares como el movimiento, la formación
de seudópodos, etc. (v. fig. 2-3).
Microscopía de fluorescencia y confocal
La microscopía de fluorescencia se basa en la propiedad que tienen las sustancias fluorescentes de absorber luz de una
determinada λ y emitir luz con una λ mayor. Este microscopio (fig. 2-4) permite ver solo las estructuras que se han
marcado selectivamente con fluorocromos (sustancias fluorescentes). En este caso, el contraste se obtendría por
marcaje selectivo de una estructura marcada fluorescentemente, que se observaría al microscopio sobre un fondo
oscuro (v. fig. 2-4). Algunas estructuras de los tejidos son autofluorescentes, como las fibras elásticas; pero la mayoría
de ellas no lo son, de tal modo que, para su observación, se tienen que conjugar con fluorocromos. Se pueden utilizar
colorantes fluorescentes para teñir algunos componentes específicos de la célula, como el naranja de acridina, que tiñe
selectivamente el núcleo. Pero para el marcaje se suelen emplear anticuerpos conjugados con fluorocromos, que
reconocen específicamente las proteínas presentes en el tejido que se quiere estudiar (como veremos más adelante).
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FIGURA 2-4 A. Partes esenciales del microscopio de fluorescencia. La luz de excitación es filtrada (para que solo incida la luz que
excita máximamente al fluorocromo que se ha empleado) y reflejada sobre la muestra por un espejo dicroico. La muestra emite luz con
una λ mayor que la de excitación y puede atravesar el espejo dicroico, filtrándose de nuevo para evitar interferencias y llegándole al
observador. B. Imagen de inmunofluorescencia de una célula en cultivo en la que se han empleado anticuerpos antitubulina marcados
con una sustancia fluorescente.
Existen gran cantidad de fluorocromos con distintas propiedades ópticas que se pueden utilizar en microscopía. El
microscopio de fluorescencia tiene una serie de filtros que permiten seleccionar la λ que excita máximamente a un
fluorocromo determinado antes de que pase por la muestra. Tras la excitación del fluorocromo, se emite luz
fluorescente de una λ específica. Otro filtro situado entre la muestra y el ocular filtra las ondas lumínicas que se hayan
podido generar que no correspondan específicamente a la λ de emisión, para evitar que la imagen se vea borrosa. Un
fluorocromo muy utilizado es la fluoresceína, que se excita máximamente cuando se hace incidir luz de una λ de 494
nm (color azul) y emite luz de una λ de 521 nm (color verde).
El microscopio confocal se puede considerar una variante mejorada del microscopio de fluorescencia. La fuente de
iluminación utilizada es, en este caso, un rayo láser, que permite una excitación de los fluorocromos mucho más eficaz
que el uso de la luz. Otra ventaja esencial es que el microscopio confocal permite una focalización muy precisa de los
puntos que emiten fluorescencia y elimina selectivamente las señales de interferencia generadas por esta. En efecto, en
el microscopio de fluorescencia, la imagen que se observa tiene una cierta contaminación lumínica procedente de la
fluorescencia que está fuera de foco, lo que disminuye la calidad de la imagen. El microscopio confocal ilumina solo
un punto concreto de la muestra, de un modo muy intenso. Para ello el haz láser se hace pasar por un pinhole, un
pequeño agujero que permite focalizar el rayo en un punto concreto de la muestra. Tras la excitación de la muestra, la
luz fluorescente emitida se filtra también a través de otro pinhole, de tal manera que solo se recoge la fluorescencia
específica que proviene del punto que ha sido iluminado, evitándose la luz que está fuera de foco (por eso se llama
confocal, es decir, en foco con el punto iluminado). Esto hace que la calidad de las imágenes sea mucho mayor que la
de un microscopio de fluorescencia rutinario.
Otra característica esencial del microscopio confocal es que posee un sistema de barrido, capaz de desplazar el rayo
láser por la preparación en las tres dimensiones del espacio, iluminando así puntos específicos de la misma a distintos
tiempos. Como el láser tiene más capacidad de penetración que la luz visible, los tejidos pueden ser más gruesos
cuando se utiliza el microscopio confocal. Cada imagen captada por el microscopio corresponde a un plano de
fluorescencia que se llama z-stack. El acoplamiento de los diferentes stacks en una computadora con sistemas de
análisis de imagen permite hacer una reconstrucción para obtener una imagen tridimensional. Mediante
61
determinados programas informáticos se pueden, además, eliminar señales de interferencia originadas por el uso
simultáneo de diferentes fluorocromos, a través de un proceso llamado «deconvolución» y se pueden realizar estudios
cuantitativos de las estructuras analizadas.
62
Microscopía electrónica
Funcionamiento y tipos
El microscopio electrónico utiliza como fuente de «iluminación» un haz de electrones acelerados, lo que consigue
mejorar el poder de resolución con respecto al microscopio óptico, permitiendo así la observación de orgánulos
celulares. El microscopio electrónico de transmisión (MET) consiste en un tubo de rayos catódicos con una columna
de aproximadamente 1 m de longitud. En la parte superior de la columna se encuentra el cátodo, consistente en un
filamento tungsteno o wolframio, que emite un haz de electrones, mediante una diferencia de potencial, hacia un
ánodo perforado situado más abajo (fig. 2-5). El haz atraviesa el ánodo y se dirige hacia la parte basal de la columna.
En su recorrido, el haz es primeramente modificado por una bobina electromagnética que actúa a modo de
condensador, focalizando los electrones hacia la muestra. Esta se sitúa en una rejilla de cobre o níquel del tamaño
aproximado de una lenteja. El haz atraviesa la muestra y es modificado entonces por una bobina que actúa a modo de
objetivo y otra que sirve como sistema de proyección (semejante al ocular en el microscopio óptico). Para poder
visualizar la imagen originada por los electrones, es necesario convertir la radiación electrónica en una imagen visible
por el ojo humano. Esta imagen se obtiene en una pantalla fluorescente situada en la base del microscopio, que recibe
la radiación de los electrones (λ no visible) y emite radiación a una λ mayor (luz visible) (v. fig. 2-5).
FIGURA 2-5 Partes del microscopio electrónico de transmisión y comparación de sus sistemas de generación y modificación del haz de
electrones con la óptica del microscopio de luz. (Dibujos procedentes de: Montuenga et al. Técnicas en histología y biología celular. Barcelona: Elsevier; 2009.)
Para la conducción de los electrones se necesita alto vacío, lo que requiere un sistema de bombas que extraigan el
aire de la columna. Esto determina que en este tipo de microscopio no se puedan realizar estudios in vivo. Para que el
haz de electrones atraviese la muestra, esta tiene que tener un espesor extraordinariamente fino: unos 10-100 nm. El
contraste en microscopía electrónica de transmisión se obtiene por absorción diferencial de metales pesados en forma
de sales, que se unen a las estructuras biológicas. Las sustancias más típicas para el contraste son el citrato de plomo y
el acetato de uranio. Las estructuras tisulares y celulares presentan diferente afinidad por los metales de elevado peso
molecular. Las estructuras que absorben estas sustancias impiden en parte el paso de los electrones, lo que se ve en la
63
pantalla como una zona oscura (también llamada electrodensa). En cambio, las zonas que absorben menos sales
permiten el paso de los electrones, y se ven como zonas claras en la pantalla (electrolúcidas) (fig. 2-6).
FIGURA 2-6 Imágenes de microscopía electrónica. Las zonas oscuras se denominan electrodensas y las claras, electrolúcidas. A.
Imagen de un asa glomerular normal que muestra una célula epitelial (Ep) con delicados podocitos sobre una lámina densa (flechas).
E, célula endotelial. B. Glomerulonefritis proliferativa aguda (postestreptocócica). La glomerulonefritis aguda se caracteriza
anatómicamente por alteraciones inflamatorias en el glomérulo. En la imagen se observa una proliferación de células endoteliales
intracapilares (E) y depósitos electrodensos subepiteliales (D) o «gibas» bajo los podocitos epiteliales. L, luz del vaso. (Imágenes
procedentes de: Departamento de Anatomía Patológica de la Universidad de Navarra.)
Existe otro tipo de microscopio electrónico llamado microscopio electrónico de barrido (MEB), que se utiliza para
observar superficies de células y tejidos a gran aumento y con gran resolución (fig. 2-7). En este caso, las muestras
(situadas en la base del microscopio) no van a ser atravesadas por el haz de electrones, sino que, tras un proceso de
metalización, van a ser barridas por el haz de electrones, que recorre toda la muestra superficialmente en las tres
direcciones del espacio para dar una imagen tridimensional. El MEB permite observar muestras de tamaño
considerable, como trozos de tejido, organismos enteros (insectos), etc. El impacto del haz primario de electrones
sobre la muestra hace que los electrones situados en los orbitales periféricos de los átomos de la muestra salgan
despedidos (son los denominados electrones secundarios). La cantidad de electrones secundarios emitidos tras el
choque dependerá del ángulo de incidencia del haz primario. Los electrones secundarios son recogidos por un sensor
y proyectados en un monitor de televisión, donde se observa la imagen con un aspecto metalizado y tridimensional
(v. fig. 2-7).
64
FIGURA 2-7 A. Esquema del funcionamiento del microscopio electrónico de barrido. B. Imagen de la superficie del intestino colonizada
por bacterias, observadas con el microscopio electrónico de barrido. (A, dibujo procedente de: Montuenga et al. Técnicas en histología y biología celular.
Barcelona: Elsevier; 2009. B, procedente de: http://www.birmingham.ac.uk.)
Técnicas especiales en microscopía electrónica
El contraste negativo es una técnica que permite observar macromoléculas al MET con una alta resolución. Esto se
debe a que no se utilizan secciones, sino extensiones de material, tal y como este se encuentra, sin cortar. Se puede
observar material biológico como bacterias, virus, orgánulos celulares, macromoléculas, etc. Las muestras se tratan
con una solución de ácido fosfotúngstico, que queda rodeando estas macromoléculas, pero sin impregnarlas
propiamente; de esta manera en la pantalla se observa un fondo oscuro (proporcionado por el ácido fosfotúngstico)
rodeando al material que se quiere observar, que posee un aspecto blanquecino (es decir, es como una imagen en
negativo) (fig. 2-8).
65
FIGURA 2-8 A. Dibujo que muestra una visión lateral de una extensión de partículas tratadas con ácido fosfotúngstico para su
observación mediante contraste negativo. B. Imagen del bacteriófago P2 observada al microscopio electrónico de transmisión tras
aplicar la técnica de contraste negativo. (A, dibujo procedente de: Montuenga et al. Técnicas en histología y biología celular. Barcelona: Elsevier, 2009.)
El sombreado metálico es otra técnica que permite observar macromoléculas al MET. Para ello, se vaporizan con un
determinado ángulo átomos metálicos sobre una superficie donde se pone la muestra (p. ej., bacterias, virus,
macromoléculas, etc.), de tal manera que se crea una metalización desigual, porque hay un lado en el que aparece una
sombra (el lado contrario al de emisión de los metales). Se crea así un efecto tridimensional.
En la criofractura (fig. 2-9) las muestras se congelan rápidamente a la temperatura del nitrógeno líquido (−160 °C),
se someten al vacío y se golpean con el borde de una cuchilla afilada. Las muestras congeladas a tan bajas
temperaturas se fracturan a través de las zonas celulares que son más débiles, normalmente por el interior hidrófobo
de las membranas. Posteriormente se emplea una técnica de sombreado metálico que recubre la superficie de fractura.
A continuación se deposita una capa de carbono sobre la película metalizada (que sirve para grabar y estabilizar el
metalizado). Por último, se digiere con detergentes el material biológico que está por debajo, permaneciendo
solamente la capa fina de metal-carbón (réplica de la superficie de corte), que es lo que se observa al MET.
66
FIGURA 2-9 A. Procedimiento para realizar la técnica de la criofractura. 1, preparación de la muestra en un soporte; 2, congelación; 3,
aplicación de un golpe con la cuchilla; 4, la fractura tiene lugar normalmente por las zonas débiles de las células, que corresponden a
las zonas hidrófobas de las membranas; 5, metalización y aplicación de la capa de carbono; 6, digestión del tejido biológico y obtención
de la réplica metalizada. B. Imagen de una célula observada al microscopio electrónico tras la realización de la criofractura. Se pueden
observar la doble membrana nuclear y los poros nucleares. (B, imagen procedente de: Portada de la revista “Molecular Biology of the Cell”, 13 (1), 2002.)
Existe una técnica muy relacionada con la anterior, llamada grabado por congelación o criograbado, que añade un
paso más a la criofractura, aunque la técnica es inicialmente similar. Después de la fractura de la muestra, y antes del
sombreado, tiene lugar una sublimación de una pequeña cantidad de agua de la superficie de la muestra, lo que
consigue «ahondar» en la superficie de corte. La sublimación produce un efecto de grabado, que consiste en una
acentuación de los detalles de la superficie; por lo tanto, no se observa la superficie de corte, sino orgánulos que
quedaron por debajo de la línea de fractura. Posteriormente se realizaría la metalización como se ha explicado antes.
Esta técnica ha sido muy útil para estudiar el citoesqueleto celular.
67
Procesamiento de muestras para microscopía óptica y
electrónica
La observación microscópica de una muestra biológica requiere la aplicación de un procesamiento previo de la
misma, que debe asegurar que lo observado se corresponda lo más ajustadamente a la realidad, sin que se modifique
su morfología. El procesamiento histológico consta de cuatro pasos fundamentales: a) fijación; b) inclusión; c)
microtomía (corte), y d) tinción. En cada apartado del procesamiento existen ciertas diferencias entre la técnica
aplicada para microscopía óptica y para electrónica.
Fijación
La fijación de los tejidos permite detener los procesos de degradación que ocurren tras la muerte celular, como la
autolisis mediada por enzimas lisosómicas o bacterianas (putrefacción). Asimismo, provoca reacciones fisicoquímicas
que preservan las estructuras y componentes químicos de las células (principalmente proteínas), y da consistencia
mecánica a la pieza (endurecimiento), de modo que permite manipulaciones posteriores. Es un paso crítico dentro del
procesamiento histológico.
Los métodos de fijación se pueden clasificar en métodos físicos y químicos. El método físico más utilizado es la
criofijación o congelación. El tejido se expone a temperaturas inferiores a −70 °C, disminuyendo así la actividad de lisis
enzimática e inmovilizando las estructuras celulares. Este método de fijación tiene dos inconvenientes; por un lado, es
un método reversible que deja de funcionar al aumentar la temperatura, y por otro, se pueden formar cristales de
hielo que pueden dañar la estructura del tejido. Existen sustancias crioprotectoras (sacarosa, glicerol) que impiden la
formación de cristales. Como ventaja, cabe destacar que es un método de fijación muy rápido, por lo que se suele
utilizar cuando se necesita un diagnóstico urgente (como, p. ej., en el caso de las biopsias intraoperatorias). En la
fijación química se emplean agentes químicos que reaccionan con las macromoléculas, estabilizándolas. Según su
mecanismo de acción, podemos distinguir tres tipos de fijadores químicos: agentes entrecruzantes (dan lugar a un
entrelazamiento de las proteínas), oxidantes y precipitantes. Los agentes entrecruzantes más utilizados son el
formaldehído y el glutaraldehído. El formaldehído es el fijador más usado para microscopía de luz, mientras que el
glutaraldehído se usa preferentemente para microscopía electrónica. El tetróxido de osmio (OsO ) es un fijador
4
oxidante muy utilizado en microscopía electrónica, ya que es capaz de fijar y dar contraste a los lípidos, y permite
observar con definición las membranas celulares.
Inclusión
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El objetivo de la inclusión es eliminar el agua de los tejidos y reemplazarla por un medio que solidifica, lo que
posibilita el corte posterior. La inclusión es un paso dirigido a proporcionar soporte estructural a la pieza, para
obtener cortes suficientemente finos para que puedan ser atravesados por el haz de luz (o de electrones en el caso de
la microscopía electrónica). El grosor de los cortes es muy diferente en ambas técnicas, por lo que el proceso previo de
inclusión también es distinto.
La inclusión puede tener lugar en parafina (para muestras procesadas para el microscopio óptico) o en resinas
(para el microscopio electrónico). La parafina es una mezcla de ceras compuesta por hidrocarburos de cadena larga
con punto de fusión de 50 °C. Para que la parafina pueda penetrar en el tejido hay que hacer un paso previo de
deshidratación. Posteriormente, la pieza se sumerge en parafina líquida, que infiltra los espacios intra- y
extracelulares del tejido. Las resinas son más duras que la parafina, por lo que permiten realizar cortes mucho más
finos. Como en el caso de la parafina, es necesario realizar un proceso previo de deshidratación. Las resinas son
sustancias líquidas cuando se encuentran en su forma monomérica, y polimerizan tras tratamientos de calor o
tratamientos con luz ultravioleta, dando lugar a polímeros sólidos de gran dureza que permiten hacer cortes muy
finos. Asimismo, esta técnica de inclusión permite realizar cortes semifinos (1 μm de espesor) que pueden ser
observados al microscopio de luz.
Microtomía
Los cortes histológicos para microscopía óptica se realizan con un aparato denominado microtomo, y habitualmente
tienen entre 3 y 5 μm de grosor. Para microscopía electrónica se hacen cortes finos (10-100 nm) con un aparato
denominado ultramicrotomo. Los cortes de parafina se recogen en portaobjetos de vidrio; sin embargo, los cortes
finos se colocan en redes de cobre o níquel para su observación al MET. En el caso de las muestras fijadas por
congelación, los cortes suelen ser más gruesos (grosor mínimo de entre 6 y 8 μm) y se utiliza un aparato denominado
criostato, que mantiene las muestras a una temperatura de −20 °C durante el corte. Estas muestras no requieren el
paso de deshidratación.
Hay muestras que no precisan de los procesos de inclusión y corte, sino que la visualización se realiza directamente.
Es el caso de las de células sueltas (p. ej., frotis de sangre) o muestras de diversos fluidos biológicos (como esputo o
lavado bronquioalveolar), para las que se pueden realizar extensiones directamente sobre el portaobjetos.
Tinción
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Como hemos indicado previamente, las estructuras biológicas presentan dificultades para ser observadas
directamente al microscopio, ya que tienen un escaso contraste por su alto contenido en agua. Para mejorar el
contraste se utilizan tinciones que permiten colorear artificialmente diferentes elementos tisulares.
En el procesamiento para microscopía óptica se utiliza una variedad de colorantes que tiñen diversas estructuras
según su composición química. Las tinciones son una combinación de colorantes que resaltan los aspectos que más
nos interesan de la preparación. La tinción más utilizada en el diagnóstico anatomopatológico es la hematoxilinaeosina. En el caso de muestras de citología exfoliativa, el método más utilizado es el de Papanicolaou, que combina la
hematoxilina con diversas mezclas de colorantes citoplasmáticos. Además de estos procedimientos rutinarios, existen
numerosas tinciones que se aplican específicamente a tejidos concretos, como las técnicas de impregnación argéntica
para el estudio del sistema nervioso.
En el procesamiento para microscopía electrónica de transmisión, el contraste se efectúa mediante moléculas de alto
peso molecular que intensifican la capacidad de dispersión de la muestra. Los más utilizados, como ya se ha
comentado, son el acetato de uranio y el citrato de plomo.
Técnicas inmunohistoquímicas
Las técnicas inmunohistoquímicas permiten identificar la presencia de una proteína concreta en una sección de tejido,
mediante el uso de anticuerpos. En situaciones patológicas, los tejidos pueden contener proteínas que no estaban en el
tejido sano. Por ejemplo, en un tejido infectado por un virus se puede detectar la presencia de proteínas víricas que
solo estarán presentes en el tejido infectado. Igualmente, en un tejido tumoral puede haber proteínas que se
produzcan en cantidades anormalmente altas o bajas con respecto al tejido normal. Estas alteraciones pueden ser
detectadas mediante inmunohistoquímica, que es actualmente una herramienta esencial en los laboratorios de
anatomía patológica, por la capacidad que tiene de ayudar en el diagnóstico de enfermedades.
Para poder localizar en un tejido humano una determinada proteína, antes hay que haber purificado un anticuerpo
que sea capaz de reconocer esa proteína de modo específico. Para obtener dicho anticuerpo se necesita haber
inyectado previamente la proteína en un animal (v. proceso completo en el contenido en la web de este capítulo). En la
práctica, los anticuerpos para las proteínas utilizadas en diagnóstico están comercialmente disponibles, por lo que no
es necesario producir el anticuerpo en animales para su uso rutinario. Las técnicas inmunohistoquímicas se pueden
dividir en dos grandes grupos:
1. Técnicas directas: el anticuerpo que reconoce el antígeno de interés (anticuerpo primario) está conjugado con una
sustancia que pueda ser detectada al microscopio (como una enzima, fluorocromo o partícula de oro) (fig. 2-10). Es el
método más sencillo, ya que la reacción tiene lugar en único paso.
70
2. Técnicas indirectas: el anticuerpo primario no está conjugado, sino que se utiliza un anticuerpo secundario
conjugado con la molécula detectable al microscopio, cuya región Fab reconoce la región Fc del anticuerpo primario
(v. fig. 2-10). Por lo tanto, la señal vendrá del anticuerpo secundario. En general, los métodos indirectos son los más
utilizados. La razón es que los anticuerpos secundarios pueden ser utilizados para reconocer las fracciones Fc de una
especie determinada, por lo que pueden emplearse para detectar todos los anticuerpos primarios obtenidos en dicha
especie, independientemente del antígeno que reconozcan. Por ello, es más conveniente desde el punto de vista
técnico utilizar anticuerpos secundarios conjugados.
71
FIGURA 2-10 A. Esquema de la inmunohistoquímica directa (anticuerpo primario directamente unido por su fracción Fc a la
peroxidasa). B. Esquema de la inmunohistoquímica indirecta (el anticuerpo secundario, que se une a la fracción Fc del anticuerpo
primario, es el que se une a la peroxidasa). (Dibujos procedentes de: Montuenga et al. Técnicas en histología y biología celular. Barcelona: Elsevier; 2009.)
La técnica más utilizada en los laboratorios de diagnóstico es la del marcaje indirecto con anticuerpos secundarios
unidos a la enzima peroxidasa. El esquema general es el siguiente (fig. 2-11):
• Desparafinación e hidratación los tejidos.
• Incubación del tejido con el anticuerpo primario.
72
• Lavado de la preparación para eliminar las inmunoglobulinas no unidas específicamente al tejido.
• Incubación con el anticuerpo secundario (obtenido frente a las inmunoglobulinas de la especie del anticuerpo
primario) unido a peroxidasa.
• Lavado para eliminar el anticuerpo secundario no unido.
• Revelado: demostración histoquímica de la actividad enzimática de la peroxidasa ligada al anticuerpo secundario.
• Observación.
FIGURA 2-11 Esquema del procesamiento de tejidos en la inmunohistoquímica. En este ejemplo se muestran, por un lado, una
hipotética sección histológica de hígado infectado con un virus y, por otro, una sección de hígado no infectado. El procedimiento de
marcaje indirecto con anticuerpos secundarios unidos a peroxidasa resultaría en la observación de células de color marrón en el primer
caso.
La presencia de peroxidasa se revela mediante una reacción histoquímica consistente en añadir su sustrato (H O ) en
2
2
presencia de un donador de electrones (normalmente diaminobencidina, DAB). Como consecuencia de la actividad
peroxidasa, el H O se reduce y la DAB se oxida, dando lugar a un precipitado de color marrón. Si el antígeno está
2
2
presente en el tejido, se observa el color marrón de las células donde se encuentra dicho antígeno. Posteriormente se
utilizan colorantes de contraste, como la hematoxilina, para poder visualizar mejor la estructura del tejido.
El uso de la inmunohistoquímica es de gran importancia en el diagnóstico; un claro ejemplo es el cáncer de mama:
las pacientes con tumores positivos para el receptor de estrógenos tienen mejor pronóstico que las negativas y se
pueden tratar con fármacos como el tamoxifeno. Las pacientes con tumores Her-2/ErbB2 positivos tienen peor
pronóstico, pero pueden ser tratadas con un fármaco específico (transtuzumab), que inhibe la proliferación inducida
por este receptor (fig. 2-12).
73
FIGURA 2-12 La inmunohistoquímica es una herramienta muy valiosa para el diagnóstico. En el diagnóstico de cáncer de mama es
importante conocer si el tumor es positivo para el receptor de estrógenos (A) (como se ve en la imagen, con marcaje nuclear), en cuyo
caso las pacientes pueden ser tratadas con fármacos como el tamoxifeno. También es importante conocer si el tumor es positivo para
el receptor de membrana Her-2/ErbB2 (B), debido a que se podría aplicar una terapia con transtuzumab.
Los anticuerpos también se pueden conjugar con sustancias fluorescentes en su región Fc. El marcaje de anticuerpos
con moléculas fluorescentes no requiere la aplicación de revelados enzimáticos para poder observar el marcaje
específico, pero precisa del uso de un microscopio de fluorescencia y, además, la señal fluorescente se va perdiendo
progresivamente a lo largo del tiempo. Para microscopía electrónica se emplean anticuerpos marcados con partículas
de oro o ferritina, que son electrodensas y permiten así su visualización. Estas técnicas se utilizan fundamentalmente
para investigación y no para diagnóstico.
FIGURA 2-13 Esquema de técnicas relacionadas con la biología celular. KO, knout out; PCR, reacción en cadena de la polimerasa.
Lecturas recomendadas
Beesley JE. Immunohistochemistry and in situ hybridization in the biological sciences. Boston: Birkhäuser; 2000.
Burrell MA, Calvo A, Sesma MP. Atlas de ultraestructura celular. Pamplona: EUNSA; 2011.
74
Freshney RI. Culture of animal cells. A manual of basic technique. 4.ª ed. New York: Wiley-Lis; 2000.
Gartler SM. The chromosome number in humans: a brief history. Nature Reviews. 2006;7:655–660.
Green JE. Genetically engineered mice for cancer research. New York: Springer; 2012.
Montuenga L, Esteban F, Calvo A. Técnicas en histología y biología celular. Barcelona: Elsevier; 2009.
Moreno V, Solé X. Uso de chips (microarrays) en medicina: fundamentos técnicos y procedimientos básicos para el análisis estadístico de resultados.
Barcelona: Elsevier; 2004.
Sato-Otsubo A, Sanada M, Ogawa S. Single-nucleotide polymorphism array karyotyping in clinical practice: where, when, and how?
Semin Oncol. 2012;1:13–25.
Speicher MR, Carter NP. The new cytogenetics: blurring the boundaries with molecular biology. Nature Reviews Genetics. 2005;6:782–
792.
Watson JD, Gilman M. Recombinant DNA. 2.ª ed. New York: Scientific American Books; 1998.
Tecnología del ADN recombinante y aislamiento de ácidos
nucleicos
La tecnología del ADN recombinante incluye una serie de procedimientos que permiten generar, cortar y pegar
fragmentos de ADN, lo que posibilita fabricar secuencias de ADN que tengan interés científico o terapéutico. Para
poder manipular el ADN, primeramente hay que aislarlo de los tejidos o células. Existen diferentes métodos para
aislar ADN (y ARN); los métodos clásicos se basan en su mayoría en una primera separación mediante una extracción
en fases orgánicas seguida de una precipitación de los ácidos nucleicos presentes en la fase acuosa resultante,
mediante soluciones alcohólicas. Una vez obtenido el ácido nucleico, es importante analizarlo para verificar su
calidad. Un método rápido y ampliamente extendido para tal propósito es la electroforesis en geles de agarosa (fig.
e2-1). Estos geles están constituidos por matrices porosas en las que se introduce la muestra de ácido nucleico, se
aplica una diferencia de potencial (voltaje) a lo largo de la matriz y, en virtud de la carga negativa que poseen tanto el
ARN como el ADN, estos migran a través de dicha matriz. En el caso del ADN, debido a su gran longitud, debe ser
fragmendo previamente mediante enzimas de restricción (v. más adelante), para que pueda tener lugar la migración.
Los fragmentos de ADN generados mediante PCR (v. «Reacción en cadena de la polimerasa») pueden ser sometidos
directamente a electroforesis, ya que sus tamaños son compatibles con la migración a través del gel. Debido al tamaño
de los poros del gel (que es del orden de magnitud del de las propias moléculas de ácido nucleico), se da un fenómeno
de separación de los distintos ácidos nucleicos en función de su tamaño (fenómeno llamado «movilidad
electroforética»). Determinar que el tamaño de los fragmentos de ADN/ARN analizados es el esperado es una prueba
75
importante para asegurar su calidad y comprobar que se ha obtenido el fragmento adecuado. La aparición de especies
de tamaño menor del esperado puede indicar degradación de la muestra. La visualización de los ácidos nucleicos en
los geles se logra con el colorante bromuro de etidio (que se une de forma estequiométrica a los ácidos nucleicos de
doble cadena) y la aplicación de luz ultravioleta. También es importante la cuantificación de la cantidad de ácido
nucleico obtenido. Para ello se utiliza la propiedad física de la absorbancia, ya que las bases nitrogenadas de los ácidos
nucleicos absorben luz con una longitud de onda de 260 nm. Realizando la medición de absorbancia de una solución
de ácido nucleico a 260 nm, se puede estimar con mucha precisión la concentración de este.
FIGURA E2-1 Electroforesis en gel de agarosa para la observación del ADN. A. Esquema de la técnica. El ADN se carga en unos
pocillos realizados en el gel y, tras someterlo a un campo eléctrico, se desplaza a través del gel. La longitud recorrida en el gel
depende del tamaño de cada una de las especies de ADN. B. Imagen de un gel de agarosa observado en un transiluminador tras
teñirlo con bromuro de etidio (foto superior) y tras obtener una foto del mismo (imagen inferior).
Para cortar el ADN se utilizan las llamadas «endonucleasas de restricción» o, en general, enzimas de restricción.
Estas enzimas de origen bacteriano son capaces de cortar el ADN cuando reconocen una secuencia concreta de
nucleótidos. Las secuencias que la mayor parte de las enzimas reconocen tienen de 4 a 6 nucleótidos, y se caracterizan
por un tipo especial de simetría interna: se llaman secuencias palindrómicas, es decir, secuencias que son iguales si se
leen en una dirección, o en la dirección contraria (fig. e2-2). Existen gran cantidad de enzimas que cortan el ADN en
secuencias específicas. Los cortes originados por algunas enzimas dejan extremos escalonados (o cohesivos) de ADN
con un pequeño fragmento monocatenario que puede unirse a otra molécula semejante de ADN para restaurar la
doble cadena. Otras enzimas de restricción cortan las dos hebras a la misma altura, generando lo que se llaman
fragmentos de restricción de extremos romos. Para unir los fragmentos de ADN se utilizan enzimas denominadas
ligasas.
76
FIGURA E2-2 A. El ADN puede ser cortado por diversas enzimas de restricción. En el ejemplo se muestra el corte de un plásmido y de
ADN genómico por la enzima EcoR1. El corte produce extremos cohesivos (escalonados) en el ADN, lo que permite la unión por
hibridación del ADN del plásmido linearizado con fragmentos del ADN genómico, con la ayuda de una ADN ligasa. B. Mediante este
procedimiento se pueden clonar genes de interés en plásmidos que pueden ser introducidos en bacterias y multiplicados durante su
crecimiento normal.
El corte y empalme del ADN permite clonar genes para obtener múltiples copias del mismo. Existen dos formas
principales de clonar un gen: la clonación celular y la clonación acelular. En la clonación celular se utilizan organismos
(normalmente bacterias) para producir billones de copias de nuestro fragmento de ADN (cuya cantidad inicial suele
ser muy escasa). El ADN se introduce en bacterias en forma de plásmido modificado (al que se denomina vector) y
estas, mediante su crecimiento normal, multiplican las copias del plásmido (v. fig. e2-2). La clonación acelular sucede
en un tubo de ensayo. El método principal de este tipo de clonación es la PCR (v. «Reacción en cadena de la
polimerasa»). Mediante esta reacción se puede multiplicar millones o incluso billones de veces la cantidad de una
determinada secuencia de ADN. La clonación permite crear vectores con genes de uso terapéutico que pueden ser
utilizados en terapia génica o para producir proteínas recombinantes. Un ejemplo de la aplicación de la tecnología del
ADN recombinante y la clonación es la producción de insulina. El gen de la insulina humano se corta y pega en un
vector adecuado que permitirá la producción de grandes cantidades de la proteína en bacterias o células de mamífero,
con vistas a su uso terapéutico en pacientes con diabetes de tipo I.
77
Reacción en cadena de la polimerasa
En el año 1985, el investigador norteamericano Kary Mullis desarrolló el método de la reacción en cadena de la
polimerasa (PCR, del inglés polymerase chain reaction) por el que recibió el premio Nobel de Química en 1993. La
técnica se basa en multiplicar de forma exponencial un segmento determinado de ADN, a partir de una muestra muy
pequeña (menos de 1 μg de ADN). Previamente, es necesario conocer la secuencia de los nucleótidos correspondientes
a los extremos del fragmento que se desea amplificar para diseñar dos oligonucleótidos sintéticos de ADN
complementarios a las secuencias de sus extremos 3’. Estos oligonucleótidos cebadores (primers) tienen una extensión
promedio de 20 nucleótidos. El desarrollo de esta técnica ha supuesto un enorme avance en biomedicina, ya que la
PCR tiene innumerables aplicaciones diagnósticas y terapéuticas.
Amplificación del ADN
La reacción tiene tres etapas: desnaturalización, hibridación y extensión. La desnaturalización consiste en la
separación de las dos hebras del ADN por ruptura de los puentes de hidrógeno intercatenarios, generando moléculas
de ADN en forma de cadena simple. Esto se logra por un aumento de la temperatura (90-94 °C) durante unos 5 min
para asegurar la desnaturalización total de todas las moléculas de ADN; en caso contrario, el ADN tenderá a
renaturalizarse, dificultando la etapa siguiente. En el paso de hibridación se disminuye la temperatura de la reacción
hasta 40-60 °C para permitir la unión por complementariedad entre los cebadores (primers en inglés) y las secuencias
que flanquean el fragmento que se desea amplificar. La temperatura de hibridación debe ser unos 5-8 ºC menor que la
temperatura de fusión (Tm) de los cebadores. La Tm depende de la longitud de los cebadores y el porcentaje de CG de
su secuencia. Si la temperatura de hibridación es inferior a la óptima, los cebadores se unirán inespecíficamente, y si la
temperatura es superior, disminuirá la eficiencia de la reacción. La Tm puede aproximarse para cebadores de 18 a 24
bases con la fórmula de Wallace, que contempla la proporción de bases del oligonucleótido:
Finalmente, la extensión ocurre a 72 °C y consiste en la adición de los desoxirribonucleótidos a partir de los extremos
3’ de los cebadores, utilizando el ADN como molde y por acción de la polimerasa Taq. Esta enzima, llamada así
porque se aisló de la bacteria termófila Thermus aquaticus, es resistente a la desnaturalización por calor, lo que le
permite ejercer su actividad aun a altas temperaturas. Normalmente una extensión de 20 s es suficiente para
fragmentos menores de 500 pares de bases, y 40 s para fragmentos por encima de 1,2 Kb. Tras este primer ciclo se
obtienen dos moléculas bicatenarias del fragmento de interés (fig. e2-3). En cada repetición del ciclo se produce un
aumento exponencial del número de copias de la secuencia específica (2 , siendo n el número de ciclos), ya que las
n
78
moléculas amplificadas en el ciclo anterior sirven de molde para el próximo ciclo. Por lo tanto, tras 20 ciclos se
obtienen un millón de copias de la molécula molde (fig. e2-3).
FIGURA E2-3 Esquema de la reacción de PCR. Cada ciclo incluye una desnaturalización de la doble cadena del ADN, hibridación de
los cebadores sintéticos (P1 y P2) y extensión de las cadenas. Al finalizar un ciclo, comienza otro tomando a las cadenas recién
sintetizadas como molde, por lo que la amplificación es exponencial.
La mezcla de reacción contiene el ADN que se quiere amplificar, dos oligonucleótidos sintéticos (cebadores o
primers: P1 y P2) que servirán como cebadores, una ADN polimerasa termoestable (Taq), los cuatro
desoxirribonucleótidos trifosfato (dATP, dGTP, dCTP y dTTP), una solución tamponada y el cofactor de la Taq
polimerasa (magnesio). La reacción se lleva a cabo de forma rápida y automatizada con un termociclador, que
básicamente consiste en un bloque térmico que aumenta y disminuye la temperatura de acuerdo a las condiciones
programadas por el operador. El producto de la amplificación se analiza por electroforesis en gel de agarosa,
colocando además un marcador de peso molecular y, por comparación, se comprueba si el producto amplificado tiene
el tamaño esperado. Finalmente, se puede secuenciar el producto de amplificación (v. más adelante), con el fin de
verificar su correspondencia con la secuencia de ADN estudiada.
Variantes del procedimiento
La PCR anidada consiste en la amplificación de una secuencia dentro de otra secuencia previamente amplificada, lo
que permite aumentar la especificidad del producto obtenido. En la PCR multiplex se amplifican varios fragmentos
simultáneamente. Se aplica para la detección de posibles mutaciones o polimorfismos en un gen grande, y es muy útil
cuando se requiere la identificación de varios patógenos en la sangre u otros fluidos corporales. La PCR-RFLP
(polimorfismos de longitud de fragmentos de restricción) (v. más adelante) amplifica regiones con posibles
polimorfismos genéticos que, al ser tratados con enzimas de restricción específicas, producen fragmentos de ADN de
diferentes longitudes según la presencia o ausencia de determinados polimorfismos. La RT-PCR es una variante de la
PCR que utiliza la enzima transcriptasa inversa (o retrotranscriptasa) para obtener ADN complementario (ADNc) a
partir del ARN. El ADNc es luego utilizado como molde en la PCR. De esta forma se puede evaluar la cantidad de
ARN mensajero (ARNm), es decir, la expresión de un gen concreto en un tejido o incluso en una única célula, lo que
equivaldría (aunque no siempre es así) a conocer la cantidad de esa proteína. Esto puede ser de gran utilidad cuando
se quieren analizar variaciones en la expresión génica debidas a situaciones patológicas.
Actualmente se utiliza la PCR a tiempo real o cuantitativa (qPCR, del inglés quantitative PCR). A diferencia de la
PCR convencional, donde se detecta el producto acumulado al cabo de cierto número de ciclos, en la qPCR el
producto se mide a medida que se va formando. Para ello se utilizan sondas o reactivos fluorescentes que, a medida
79
que el producto se amplifica, emiten un nivel de fluorescencia que es proporcional a la cantidad de ADN (o ADNc)
presente en la muestra.
Aplicaciones biomédicas
Son numerosas las aplicaciones biomédicas derivadas de la PCR. A partir del ADN genómico humano, generalmente
obtenido de linfocitos, se puede detectar la presencia de mutaciones y polimorfismos asociados con enfermedades
hereditarias (talasemias, hemofilias, deficiencia de antitripsina, distrofias musculares y muchas otras), o con la
predisposición a distintas enfermedades (como los polimorfismos de ciertos genes asociados a la aparición de algunos
tumores malignos).
También permite diagnosticar la presencia de gérmenes patógenos, bacterianos o víricos con una alta sensibilidad,
gracias al elevado poder de amplificación de esta técnica. El ADN o ARN del microorganismo puede ser detectado
antes de la producción de anticuerpos específicos («período ventana» o estado seronegativo de las enfermedades
infecciosas), e incluso antes de la aparición de síntomas. Por ejemplo, es habitual utilizar la PCR para la detección e
identificación del virus de la inmunodeficiencia humana (VIH) (fig. e2-4). Además de su utilidad en el seguimiento de
las terapias retrovíricas, esta técnica permite la detección precoz del virus en bancos de sangre o en neonatos de
madres seropositivas. La técnica consiste en detectar secuencias específicas de los genes víricos gag, env o pol, ya sea de
ARN vírico o del ADN provírico inserto en las células del hospedador. El ARN vírico se detecta en muestras de
plasma sanguíneo mediante RT-PCR; es decir, primero se hace la retrotranscripción de ARN vírico a ADNc y luego se
amplifican las secuencias de interés. Existen diversos productos comerciales para detectar las secuencias de interés
diagnóstico, que generalmente utilizan qPCR por proporcionar resultados cuantitativos.
80
FIGURA E2-4 Ejemplo de amplificación por RT-PCR del gen env del VIH-1 a partir de plasma de pacientes portadores del virus (calles
2, 3 y 4) y no portadores del virus (calles 5 y 6). La calle 1 es el marcador de peso molecular y las calles 7 y 8 son controles positivos
(muestras que dan a conocer el resultado positivo de la RT-PCR). (Imagen procedente de: Dra. A. M. Suburo. Facultad de Ciencias Biomédicas, Universidad
Austral.)
Fingerprint de ADN
La huella genética o fingerprint de ADN permite la identificación de diferentes individuos dentro de una misma
especie o población. Aunque en una misma especie los genomas poseen una secuencia común, también poseen
regiones variables que son propias de cada sujeto. Estos polimorfismos pueden ser utilizados para la identificación de
personas, ya que es poco probable que dos seres humanos no relacionados tengan los mismos polimorfismos. El
conjunto de polimorfismos específicos de cada persona se conoce como perfil genético y es único e invariable a lo
largo de la vida.
Actualmente se conoce la ubicación física (locus), en cada cromosoma, de las distintas secuencias codificantes o no
codificantes que componen el genoma. Cada locus cromosómico puede tener una o más variantes de esa secuencia,
conocidas como alelos. En la población pueden existir múltiples alelos, pero cada célula diploide solo tiene dos alelos
de cada gen: uno de origen materno y otro de origen paterno. El polimorfismo se define como la existencia
simultánea, en una población, de genomas con distintos alelos para un locus determinado. Los polimorfismos pueden
encontrarse tanto en regiones codificantes como no codificantes del genoma. Cuando el polimorfismo afecta a un
único nucleótido se denomina polimorfismo de nucleótido único (SNP, del inglés single-nucleotide polymorphism). Por
ejemplo, en el gen del receptor tipo 1 de TGF-β (TGFBR1) se describen diversas variantes polimórficas. Una de ellas es
la Int7G24A, denominación que indica que la G24 del intrón 7 puede estar reemplazada por una A (fig. e2-5). Para
determinar la presencia de una u otra variante, la zona del ADN genómico correspondiente al TGFBR1 es amplificada
por qPCR.
FIGURA E2-5 Secuenciación para determinar el polimorfismo Int7G24A del TGFBR1 en pacientes con cáncer colorrectal. Los
esquemas muestran las secuencias de tres pacientes, un homocigoto para la variante G (G/G), un heterocigoto (G/A) y un homocigoto
para la variante A (A/A). (Imagen procedente de: Castillejo et al. BMC Cancer 2009;9:406.)
Existen diversos tipos de polimorfismos, como las secuencias repetidas VNTR-minisatélites (del inglés variable
number of tandem repeats) y las STR (del inglés short tandem repeats) que difieren en el número de repeticiones. El
análisis de los polimorfismos de longitud de los fragmentos de restricción (RFLP, del inglés restriction fragment length
polymorphism) fue la primera técnica utilizada para evaluar estas variantes en 1985 por Sir Alec Jeffreys. Como se
mencionó en el apartado de la PCR, el fragmento que se va a estudiar se amplifica previamente y luego es digerido
81
por enzimas de restricción, que producen fragmentos diferentes según la secuencia amplificada. Actualmente existen
diversas técnicas más eficientes y rápidas, como las amplificaciones de secuencia por PCR multiplex y la separación
de los fragmentos por electroforesis capilar o ensayos comerciales de amplificación por qPCR. En el caso de los SNP,
puede utilizarse la secuenciación (v. más adelante) para verificar las bases modificadas.
Los polimorfismos son de gran utilidad en medicina forense, ya que el análisis de restos humanos (especialmente
en casos de incendios, accidentes o desastres), mediante fingerprint de ADN permite la identificación de sospechosos
de delitos y puede utilizarse también en pruebas de paternidad o parentesco. Otros polimorfismos se asocian con
determinadas patologías, ya que indican susceptibilidad a presentar determinadas enfermedades como cáncer,
enfermedades cardiovasculares, diabetes o patologías del sistema nervioso. También se conocen polimorfismos
asociados a la distinta respuesta a fármacos. Este es un campo novedoso, aunque sujeto a controversias, de desarrollo
cada vez más acelerado, ya que se intenta llegar a una medicina personalizada, donde los métodos de diagnóstico y el
tratamiento se adecúen al genoma de cada individuo.
El ADN mitocondrial (ADNmt) también puede ser utilizado para el análisis de individuos. Las mitocondrias
contienen ADN circular que codifica para 37 genes y que es de herencia materna. El uso del ADNmt es ventajoso, ya
que en cada célula existen hasta 1.000 copias, superando enormemente a las dos copias del ADN genómico. Esto
permite la obtención de ADN aun en casos de muestras muy escasas, con ADN degradado o que sufrieron el paso del
tiempo (p. ej., restos esqueléticos). Además puede resultar útil para determinar la filiación por vía materna. Las STR
del cromosoma Y son muy convenientes para estudiar el patrón genético de un individuo masculino. Por ejemplo, en
los casos de agresión sexual, permiten identificar pequeñas cantidades de ADN masculino en presencia de grandes
cantidades de ADN femenino. También se pueden usar para determinar el parentesco de varones a través de la vía
paterna.
82
Secuenciación de ADN
Junto con la PCR, la secuenciación del ADN es, sin duda, otro gran pilar en el campo de la biología molecular y del
diagnóstico médico. Secuenciar el ADN significa determinar la secuencia de nucleótidos (A, T, G, C) que conforma
una hebra de ADN (y, por lo tanto, su complementaria) en el orden correcto. Algunos ejemplos de los usos que tiene
la secuenciación del ADN son el diagnóstico genético, las pruebas forenses, el desarrollo de medicamentos basados en
la tecnología del ADN recombinante, el desarrollo de terapias génicas, etc. Durante las décadas de los sesenta y
setenta del siglo xx se desarrollaron diversos métodos para la secuenciación del ADN. Sanger y sus colaboradores
crearon un método que se estableció como referencia y en el cual se han basado otros sistemas de secuenciación
posteriores. Los secuenciadores de alto rendimiento de final del siglo xx (que permitieron, entre otros hitos, secuenciar
el genoma humano) se basan en la tecnología desarrollada por Sanger.
El método de secuenciación de Sanger se fundamenta en el concepto de «interrupción de la cadena». Se trata de una
reacción de PCR especial. A esta PCR se añaden desoxirribonucleótidos dA, dC, dT y dG como en las PCR rutinarias,
pero además se añade una versión modificada de cualquiera de los cuatro nucleótidos ddA, ddC, ddT o ddG (aquí dd
significa «didesoxi-»). Se realizan cuatro reacciones de secuenciación. En ellas, la PCR sigue su curso normal, pero
cuando la polimerasa añade un nucleótido dd a la cadena sintetizada, la reacción se para. Los nucleótidos dd son
suficientemente parecidos químicamente a los d, que son los verdaderos componentes del ADN, como para ser
reconocidos por la polimerasa y añadidos a la hebra de ADN, pero la carencia de un grupo hidroxilo 3′ imposibilita la
unión covalente del siguiente nucleótido en la secuencia, parándose entonces la reacción. Puesto que en la reacción
coexisten los nucleótidos d y los dd, la inclusión de unos u otros en la cadena se produce al azar. Por lo tanto, en la
reacción se generan productos de PCR de todos los tamaños posibles. Mediante electroforesis de ADN, se pueden
analizar estos fragmentos y determinar la secuencia. Una modificación que sufrió esta técnica fue la adición de
marcadores fluorescentes de distintos colores a los didesoxirribonucleótidos; de este modo, en vez de cuatro
reacciones, se pasó a un único tubo y se posibilitó en análisis automático informatizado de los resultados de la
electroforesis (fig. e2-6).
83
FIGURA E2-6 Esquema del proceso de secuenciación del ADN. La reacción de PCR incluye los desoxirribonucleótidos empleados
para construir la cadena normal de ADN, junto con didesoxirribonucleótidos (ddATP, ddGTP, ddCTP y ddTTP) marcados con
sustancias fluorescentes. La introducción al azar de cualquiera de estos didesoxirribonucleótidos en la hebra de ADN en formación
interrumpe la adición de un nuevo nucleótido. Esto hace que se formen especies de ADN con todos los tamaños posibles: desde las
que contienen todos los nucleótidos hasta las que solo han incorporado uno; esto permite conocer la secuencia del ADN.
Existen otras técnicas de secuenciación que han sido desarrolladas recientemente y que, basándose en distintos
principios, alcanzan una mayor eficacia en la secuenciación a precios más asequibles (lo cual es importante debido a la
gran longitud de los genomas). A estas tecnologías se les denomina secuenciación de nueva generación. Algunos
ejemplos son la pirosecuenciación, SOLiD o Solexa. En un futuro próximo, estos tipos de secuenciación irán
sustituyendo la metodología basada en la reacción de Sanger, que sigue siendo actualmente el método más utilizado.
Hibridación in situ de ácidos nucleicos
La técnica de hibridación in situ (ISH) permite localizar una secuencia específica de ácidos nucleicos en cortes de
tejidos. Actualmente, se ha convertido en una herramienta muy útil en cualquier laboratorio de investigación
dedicado a la biología molecular y celular. La hibridación in situ se aplica para estudiar la expresión génica diferencial
o las alteraciones genómicas en distintas patologías. Esta técnica se basa en la complementariedad de bases de los
ácidos nucleicos, de modo que un polinucleótido marcado denominado sonda hibridará con una secuencia
complementaria (diana) localizada en una sección histológica, en células aisladas o en cromosomas (fig. e2-7).
FIGURA E2-7 Hibridación in situ de ácidos nucleicos. A. Esquema simplificado de la técnica. La hibridación in situ implica la fabricación
de una sonda marcada cuya secuencia es complementaria a la que se quiere detectar en el ADN problema. La molécula marcadora
permitirá detectar la unión de la sonda solo en las células en las cuales está presente la secuencia problema. B. Imagen de hibridación
in situ que muestra un ganglio linfático con células infectadas por el virus Epstein Barr (en color azul oscuro). En este caso, la sonda
hibrida específicamente con una secuencia del genoma viral. (Imagen procedente de: Dra. Jackeline Agorreta, Departamento de Histología y Anatomía
Patológica, Universidad de Navarra.)
En función de las moléculas implicadas, podemos encontrar tres tipos de uniones: ADN-ADN, ADN-ARN y ARNARN. La técnica de ISH permite detectar cambios estructurales en el genoma (ADN-ISH), o cambios en los niveles de
expresión del ARN (ARN-ISH). El marcaje de la sonda puede ser radiactivo (algunos átomos de los nucleótidos se
sustituyen por isótopos radiactivos como P, P, H, S, I) y no radiactivo (unión a los nucleótidos de moléculas no
32
33
3
35
125
radiactivas como la biotina, digoxigenina o fluorocromos). Las moléculas marcadoras se pueden detectar
84
posteriormente por una reacción antígeno-anticuerpo. Cuando la molécula marcadora es un fluorocromo, la técnica se
denomina hibridación in situ fluorescente (FISH) y la reacción se puede visualizar directamente en un microscopio de
fluorescencia.
En la detección de ARN se pueden usar sondas de ARN o ADN, aunque el empleo de sondas de ARN (ribosondas)
es más frecuente, ya que la unión ARN-ARN es más estable que la unión ARN-ADN, y las sondas de ARN hibridan
mejor in situ que las de ADN. A pesar de las numerosas ventajas de las ribosondas, su obtención es laboriosa y
requiere el empleo de diferentes técnicas de biología molecular. Además, el manejo y la conservación del ARN son
delicados debido al carácter ubicuo de las ARNasas, enzimas de difícil inactivación. Las ribosondas se obtienen
mediante transcripción in vitro a partir de una secuencia de ADN clonada en un vector que posea los promotores para
su transcripción. El marcaje de los transcritos se realiza mediante la incorporación de nucleótidos marcados en la
reacción de transcripción. Para localizar secuencias de ADN se utilizan sondas de ADN. En el protocolo es necesario
incluir un paso de desnaturalización del ADN para que pueda tener lugar la hibridación de la sonda diana. También
existen sondas LNA y PNA, constituidas por análogos de ácidos nucleicos, que hibridan con mayor especificidad y
estabilidad.
Las aplicaciones de la ISH en el diagnóstico clínico se centran principalmente en dos aspectos:
• Detección de la expresión de ARNm en patologías. Se emplea por ejemplo en tumores neuroendocrinos para
confirmar que las células del tumor son las responsables de un aumento del nivel de alguna hormona en sangre,
pero el tumor es negativo por inmunohistoquímica. Asimismo, la técnica de ISH se emplea en el diagnóstico de
tumores hepáticos y linfomas de células B.
• En virología, esta técnica se utiliza tanto para identificar una infección vírica como para determinar su extensión.
Se usa para el análisis de diversas infecciones como las del virus del papiloma humano, virus de la hepatitis B y C
y virus Epstein Barr (v. fig. e2-7). La combinación de la técnica de ISH con la inmunohistoquímica permite
localizar los lugares de infección activa y detectar infecciones víricas ocultas en pacientes inmunodeprimidos.
85
Terapia génica
Como hemos indicado con anterioridad, la tecnología del ADN recombinante permite la manipulación y transferencia
de genes entre distintos organismos. Tras su desarrollo, no tardó mucho en plantearse el empleo de dicha tecnología
en el campo de la medicina. La terapia génica consiste en tratar enfermedades mediante la introducción en el
organismo de genes terapéuticos, es decir, genes «sanos» que reemplacen los genes que están alterados o ausentes en
una determinada enfermedad. Por lo tanto, en vez del uso clásico de fármacos, consistiría en corregir el defecto
genético que da lugar a esa enfermedad, mediante la aplicación exógena de genes (fig. e2-8).
FIGURA E2-8 Esquema de la terapia génica ex vivo. El gen terapéutico se inserta en un virus modificado para que no se produzcan
efectos adversos. Las células patológicas extraídas del paciente (médula ósea, sangre, etc.) se infectan con el virus y el gen
terapéutico corrige su defecto. Posteriormente las células se reintroducen en el paciente.
Actualmente se investiga sobre la posibilidad de aplicar la terapia génica en un gran número de enfermedades,
pero, por desgracia, solo un pequeño porcentaje de ellas están siendo tratadas con éxito en humanos. No obstante, el
campo de la terapia génica sigue mirando con optimismo al futuro, y va incorporando nuevos avances técnicos de la
biología molecular para solventar las dificultades de bioseguridad que en su momento impidieron la aplicación eficaz
de estrategias terapéuticas concretas.
Dependiendo del defecto genético causante de la patología, la estrategia de la terapia génica será distinta. En el caso
de que una enfermedad sea causada por la falta de un gen concreto, la introducción del gen permite que se produzca
la proteína. En cambio, en otros casos la causa molecular es la mutación de un gen que genera una proteína anómala
que causa la enfermedad. En este caso, la terapia génica intenta corregir dicha mutación o eliminar las variantes
mutantes. Las alternativas terapéuticas de la terapia génica son fundamentalmente las siguientes:
• Terapia de aumento génico (GAT, del inglés gene augmentation therapy): consiste en introducir el gen terapéutico
del cual carece el tejido enfermo.
86
• Corrección de mutaciones.
• Eliminación selectiva de las células patológicas, mediante la transferencia de genes «tóxicos».
• Activación del sistema inmunitario contra el tejido enfermo mediante estrategias de terapia génica, como
vacunación con ADN recombinante o transferencia de ADN codificante para citoquinas inmunoestimuladoras.
• Inhibición génica: mediante estrategias con ácidos nucleicos «antisentido» o de ARN de interferencia.
La terapia génica puede realizarse tanto directamente sobre el individuo enfermo (in vivo) como sobre tejidos
previamente aislados de este para su posterior reimplantación (ex vivo). Un ejemplo de método ex vivo es la extracción
de sangre o médula ósea de un paciente, su cultivo en el laboratorio (durante el cual se introduce el gen o ADN
recombinante de interés) y la posterior reinfusión en el paciente (v. fig. e2-8). La terapia génica puede clasificarse en
somática o germinal. En la terapia somática se tratan células del organismo adulto, pero el defecto genético no es
corregido en las células germinales, por lo que no sería transmitido a la descendencia. La terapia génica germinal
acarrea serios problemas éticos al modificar la información genética de la línea germinal de un individuo. Por
ejemplo, podría aplicarse con vistas a la mejora genética, por lo que su uso no está permitido.
De modo teórico, muchas enfermedades podrían ser corregidas mediante terapia génica. La principal dificultad que
encuentra su aplicación es el desarrollo de métodos eficaces y selectivos para la introducción del gen en las células
adecuadas en cada caso. Muchas veces no se consigue introducir el factor terapéutico en el suficiente número de
células enfermas. En otras ocasiones, la introducción del factor terapéutico en células sanas puede resultar peligrosa
(un gen puede curar a un tipo celular pero afectar gravemente a otro). Por todo esto, los mayores esfuerzos en el
campo de la terapia génica se centran en el desarrollo de vehículos (vectores) que transfieran el factor terapéutico a las
células deseadas de un modo selectivo. Los principales vectores empleados en terapia génica son virus que causan
enfermedades en mamíferos. Estos virus son modificados de modo que dejen de ser peligrosos y patógenos, pero
mantengan su capacidad de penetrar en células de mamífero. En el genoma de estos virus se incluye la secuencia
terapéutica que se quiere introducir en la célula enferma, eliminando las secuencias que permiten la replicación vírica
(v. fig. e2-8). Se pueden utilizar diferentes tipos de virus, cada uno de ellos con ventajas e inconvenientes. La elección
de uno u otro depende de la patología, de la estrategia terapéutica que se quiera utilizar y del tejido diana. Los
adenovirus y virus adenoasociados son virus frecuentemente utilizados en terapia génica. Otro tipo de virus (cuyo
genoma se integra en el genoma del hospedador) es el retrovirus, pero la aparición de tumores en varios pacientes
durante los ensayos clínicos los ha descartado por el momento para la terapia génica. Además de los virus, existen
otras alternativas para introducir ADN recombinante en células. En general, los principales métodos que se están
probando en terapia génica son:
• Virus: adenovirus, virus adenoasociados, retrovirus, virus del herpes simple y lentivirus.
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• Microbalas: consiste en recubrir diminutas partículas de metal con el ADN recombinante. Mediante una pistola
especial (pistola génica), se lanzan las partículas contra el tejido diana.
• Reactivos químicos: existen reactivos químicos capaces de transportar el ADN e introducirlo a través de la
membrana celular.
• Anticuerpos: mediante un anticuerpo se puede vehiculizar un complejo que contenga el factor génico terapéutico
para que entre en la célula diana.
Existen muchas circunstancias que hacen que una patología pueda ser más o menos tratable mediante terapia
génica. Las más importantes son las siguientes:
• Complejidad genética de la enfermedad: las enfermedades genéticas monogénicas son, en principio, mejores
candidatas para la terapia génica que las complejas, en las que están involucrados varios defectos genéticos.
• Dominancia y penetrancia del defecto genético: los defectos genéticos recesivos y/o poco penetrantes auguran
mayor probabilidad de éxito que los dominantes.
• Tipo de defecto: la falta de un gen es más fácilmente tratable que el exceso o la mutación.
La carencia de un gen se puede tratar mediante terapia de aumento génico, y en muchas ocasiones no requiere la
transferencia del factor a todas las células enfermas. En cambio, cuando el defecto incluye la presencia de un gen
alterado, es complicado eliminarlo o corregirlo totalmente, algo que, por lo general, incluiría un acceso de la terapia a
todas las células portadoras del defecto. El primer caso célebre de terapia génica fue la introducción en 1990 del gen
ADA (adenosina desaminasa) ex vivo en la sangre de dos niñas con inmunodeficiencia combinada severa (causada por
la falta de dicho gen). Tras ser reinfundida la sangre en la que se corrigió el defecto genético, las niñas comenzaron a
desarrollar las funciones inmunológicas de las que carecían. Hoy en día se investiga profusamente en modelos
animales la aplicación de terapias génicas aplicadas a un gran número de patologías humanas. Existen actualmente
ensayos clínicos para enfermedades genéticas hereditarias (inmunodeficiencia combinada severa, fibrosis quística o
hipercolesterolemia familiar), cáncer, desórdenes inmunológicos, Parkinson o SIDA.
Microarrays y microchips para estudios genómicos de
expresión a gran escala
Fundamento de la técnica
Muchos procesos biológicos ocurren por cambios en la expresión de diversos genes, lo que desencadena una
modificación en la fisiología celular. Para investigar estos cambios, tradicionalmente se han utilizado técnicas como el
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northern blot, RT-PCR (ambas destinadas a conocer la cantidad de ARNm para un gen concreto presente en un tejido o
célula) o Western blot (para el caso de proteínas; v. más adelante). Pero estas tecnologías permiten el análisis de pocos
ARNm/proteínas en cada ensayo. La técnica de microarrays proporciona métodos rápidos y proporcionalmente
asequibles desde el punto de vista económico para el estudio de la expresión de miles de genes en un solo ensayo, lo
que permite una visión global de la actividad celular.
Los microarrays consisten generalmente en fragmentos de ADN inmovilizados en puntos definidos de una manera
ordenada y precisa, en un soporte físico (fig. e2-9). Los soportes están fabricados de vidrio, silicona o plástico, donde
se depositan las sondas, que consisten en fragmentos de ADN con una secuencia de nucleótidos que hibridará con un
gen concreto. El ADN sonda de los microarrays puede tratarse de:
• Oligonucleótidos (de una longitud de 20-65 pares de bases): se emplean frecuentemente en experimentos de
genotipado con el fin de detectar mutaciones o polimorfismos, así como en experimentos para evaluar la
expresión génica.
• ADNc completo o parcial (500-5.000 pares de bases): se emplean para el análisis de la expresión génica.
• ADN genómico (50.000 pares de bases): su uso está destinado principalmente al estudio de pérdidas o ganancias
génicas (arrays de CGH, véase más adelante).
FIGURA E2-9 A. Esquema de la preparación de muestras para un microarray de expresión. El ARNm de muestras sanas y patológicas
se convierte mediante retrotranscripción en ADNc marcado con un fluorocromo que emite luz verde (para la muestra sana) o rojo (para
la patológica). A continuación, estos ADNc se hibridan competitivamente con sondas específicas para cada gen situadas en cada uno
de los puntos del microarray. Dependiendo de la cantidad de ADNc «verde/rojo» para cada gen en la muestra sana/patológica se
obtendrá un color distinto, que se relaciona con la cantidad de expresión (cantidad de ARNm) que tenía cada muestra. B. Imagen de
un microarray de expresión hibridado.
En los microarrays de expresión, las muestras de ARNm se preparan a partir de células en cultivo o tejidos de
interés. Se procede a la obtención del ADNc a partir del ARNm mediante retrotranscripción, utilizando nucleótidos
marcados con sustancias fluorescentes, para conseguir ADNc marcado. El ADNc se deposita sobre el microarray para
su hibridación con las sondas. Una vez se ha producido la hibridación, se procede a eliminar el ADNc no hibridado y
a la cuantificación de cada una de las sondas hibridadas del microarray mediante programas informáticos.
Habitualmente, el ADNc de la muestra patológica, marcada con una sustancia fluorescente (p. ej., con un fluorocromo
de color rojo) se mezcla en la hibridación con el ADNc de la muestra normal (marcada, p. ej., con un fluorocromo de
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color verde). Por lo tanto, si la cantidad de ARNm expresada por un gen se encuentra incrementada en la muestra
patológica con respecto a la muestra normal, el color resultante en el punto donde se localizaba la sonda
correspondiente será el rojo. Si, por el contrario, hay una mayor cantidad de ARNm en la muestra normal, el color
resultante será el verde. Una expresión equivalente de un gen en la muestra normal y en la patológica daría lugar a un
color amarillo. Este patrón de colores se utiliza para valorar y cuantificar los datos de los microarrays y poder
interpretar los resultados de expresión (v. fig. e2-9).
Aplicaciones biomédicas
Aunque la tecnología de los microarrays todavía no se utiliza con fines diagnósticos de modo rutinario, es una técnica
con un gran potencial en este sentido. Las aplicaciones posibles de los microarrays son muy diversas:
• Conocimiento de los cambios globales en la expresión génica de tejidos patológicos.
• Descubrimiento de nuevos genes causantes de enfermedades.
• Estimación de la evolución de una enfermedad. El estudio de genes asociados con la evolución de los pacientes
tras la aplicación de una terapia podría predecir el pronóstico de dicha enfermedad.
• Farmacogenómica: gracias a la identificación de genes centinelas (o biomarcadores) que demuestran una
expresión alterada en una célula o tejido determinado tras la aplicación de un fármaco, se podría determinar si
dicho fármaco va a ser efectivo y no va a causar toxicidad en un paciente.
Transferencia de ADN a células y embriones de mamíferos.
Desarrollo de animales transgénicos y knock out
La capacidad de introducir genes de nuestro interés en una célula y expresarlos en grandes cantidades (o, por el
contrario, disminuir artificialmente su expresión basal) permite conocer mejor la función de dichos genes. Por otro
lado, la terapia génica se basa también en la capacidad de transferir determinados genes en células alteradas. El
proceso de introducción de ADN exógeno en células se llama transfección, cuando se hace de modo directo, y
transducción cuando se introduce mediante infección vírica. Existen varios métodos de transfección, entre los que
citaremos: a) la electroporación, por el que las células se incuban con ADN en unos tubos de ensayo especiales que
contienen electrodos y se aplica una pequeña corriente eléctrica que hace que en la membrana se creen poros por los
que se introduce el ADN, y b) el uso de liposomas, pequeñas esferas de membrana artificial donde se puede meter el
ADN por determinados métodos químicos. Los liposomas se fusionan con la bicapa lipídica de la membrana celular e
introducen el ADN en el citoplasma.
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Estos métodos permiten modificar genéticamente las células para ver cómo cambian sus propiedades o para la
creación de animales transgénicos y knock out. Para la creación de animales transgénicos (habitualmente ratones),
primero hay que fabricar un vector adecuado que contendrá la secuencia de ADN de interés, la cual lleva el gen
codificante para la proteína que se quiere introducir. La expresión de este gen puede estar controlada por un
promotor específico de tejido o por un promotor genérico que permitirá la expresión del gen en todas las células del
organismo. En ambos casos, el promotor está situado en la región 5 de dicho gen introducido en el vector. El vector se
transfiere a un cigoto, donde el ADN se integrará en los cromosomas y, tras su implantación en una hembra
preparada para la gestación, se obtendrán animales que llevarán en todas sus células ese transgén. Pero eso no quiere
decir necesariamente que todas sus células vayan a expresar o a producir la proteína codificada por el transgén,
porque como se puede utilizar un promotor específico, solo se expresará en células del tejido que sea capaz de activar
al promotor (fig. e2-10).
FIGURA E2-10 A. Esquema simplificado de la generación de ratones transgénicos. En la región 5’ del transgén (en este caso el
oncogén antígeno T) se introduce un promotor que permitirá la expresión del mismo en un tejido específico, como por ejemplo la
glándula mamaria. Tras la transferencia del ADN a un cigoto e introducción del mismo en una ratona preparada hormonalmente para la
gestación, se obtendrá una progenie que lleva en todas sus células el transgén, pero que solo lo expresa en el tejido específico. B.
Fotografías de ratones transgénicos C3(1)/Tag hembras donde la expresión del antígeno T en la glándula mamaria genera tumores.
(Imágenes procedentes de: Dr. A. Calvo. Departamento de Histología y Anatomía Patológica, Universidad de Navarra.)
Los ratones knock out (KO) son ratones alterados genéticamente en los que, utilizando técnicas de ingeniería
genética, se elimina uno de sus genes. Si en los ratones transgénicos lo que se intenta es aumentar la expresión de un
gen concreto, en los ratones KO se elimina la función de un gen. El propósito es ver qué papel tienen dichos genes en
el organismo; si se elimina un gen y no ocurre nada, es que ese gen no es vital para el ratón, pero si observamos un
fenotipo patológico podremos conocer en qué funciones fisiológicas participaba ese gen.
El primer paso para generar estos ratones es construir un fragmento de ADN con una secuencia modificada que
reemplace a la secuencia original del gen, con el fin de inactivarlo. Este fragmento debe incluir una secuencia «de
selección» (que va a expresar un gen de resistencia frente a un agente tóxico) flanqueada por secuencias idénticas a la
del locus del gen que se quiere inactivar, para que pueda tener lugar la recombinación homóloga. Tras la
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recombinación entre el ADN exógeno y el ADN genómico, se cultivan las células con el agente tóxico cuyo gen de
resistencia lleva el vector (p. ej., la neomicina); solo sobrevivirán entonces las células que lo hayan incorporado (fig.
e2-11).
FIGURA E2-11 Primeras etapas de la generación de un ratón knock out (KO) para un gen concreto. 1, aislamiento de células
embrionarias (ES) de blastocisto de ratón; 2, cultivo; 3, inyección del ADN exógeno (transgén) que lleva el gen alterado, el cual sufrirá
recombinación homóloga con el gen que se quiere eliminar presente en las células. El transgén lleva incorporado el gen de resistencia
Neor; 4, inyección de las células modificadas en un blastocisto de un ratón con pelaje distinto al original e introducción en una ratona
preparada para la gestación; 5, la descendencia dará lugar a ratones quimera.
A partir de un blastocisto de ratón (un embrión temprano, formado por una masa esférica de células
indiferenciadas rodeada por células extraembrionarias) se aíslan las células madre embrionarias (ES, del inglés
embryonic stem) que se cultivan in vitro. En estas células se transfiere el fragmento de ADN que hemos generado para
que tenga lugar la recombinación homóloga. El ADN exógeno se integrará en el genoma mediante recombinación
homóloga con el ADN genómico de la célula, de tal manera que se sustituye la secuencia original por la del ADN
exógeno. Pero la frecuencia de recombinación es muy baja, y en la mayoría de las células se recombina uno solo de los
alelos. Por lo tanto, las células modificadas son heterocigóticas para ese gen. Las células que han incorporado el
transgén se seleccionan mediante la adición del agente tóxico que va a permitir que solo sobrevivan las que han
incorporado esta secuencia de ADN.
En este momento tenemos células embrionarias con uno de los alelos deficientes para el gen que queremos eliminar.
¿Cómo conseguir, a partir de esto, un ratón en el cual todas las células de su organismo tengan las dos copias
deficientes para ese gen? Para ello hay que recurrir a determinadas técnicas genéticas. Supongamos que las células ES
se obtuvieron de un ratón marrón; en este caso, las células ES con una copia deficiente de nuestro gen de interés se
introducen en un blastocisto de un ratón cuyo pelaje sea de otro color (p. ej., negro). Los blastocistos se implantan
entonces en el oviducto de una ratona a la que se ha preparado hormonalmente para que pueda llevar a cabo la
gestación. Los blastocistos contienen en este momento dos tipos de células madre: las originales, que provienen de la
ratona portadora de color negro, y las modificadas, provenientes de una ratona de color marrón. Los ratones que
nazcan serán quimeras, porque parte del cuerpo se ha desarrollado a partir de células madre originales de la ratona
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negra, y otra parte de las células que nosotros les hemos inyectado (de la ratona marrón). El pelaje de estos ratones
tendrá, por lo tanto, zonas negras y zonas marrones.
Los ratones quiméricos solo nos sirven si sus células germinales (las de las gónadas) han incorporado también las
células que nos interesan (las que llevan un alelo mutado, provenientes de la ratona marrón), ya que podrán
transmitir este gen a la descendencia. Solo si esto es así, tras cruzar los ratones quimera con otros negros se obtendrá
una progenie no quimérica marrón (fig. e2-12). Los ratones obtenidos de este modo aún contienen solo una copia
funcional del gen (son heterocigóticos) en todas las células de su organismo. Estos ratones tienen que someterse a un
cruzamiento endogámico posterior para producir un ratón que no lleve ninguna copia funcional del gen que se quiere
inactivar, consiguiendo así una homocigosis de ese alelo. Por lo tanto, el cruce de los ratones marrones heterocigóticos
para el transgén con otros del mismo tipo dará lugar a una descendencia en la que el 25% de los ratones serán
homocigóticos para el gen alterado. Tras este largo procedimiento obtenemos ratones KO para nuestro gen de interés.
FIGURA E2-12 Segunda parte de la generación de un ratón KO. A. Los ratones quimera se cruzan con otros de color negro. Los
ratones quimera que tengan células germinales procedentes de las células que llevaban el transgén (que venían de un ratón negro)
generarán una descendencia de ratones negros heterocigóticos para el gen que se quiere eliminar; 6, el cruce endogámico de estos
ratones producirá una descendencia con un 25% de ratones negros con deleción homocigótica para el gen de interés. B. Ejemplo de
ratones wild type (WT) (con fenotipo salvaje; ratón de la izquierda) y ratones obesos (los dos de la derecha) generados por la
eliminación de genes que controlan la obesidad. (Imagen procedente de: Sakkou et al. Cell Metabolism 2007;5:450-63.)
Esta técnica es valiosa, pero tiene algunas limitaciones; aproximadamente un 15% de los genes que se eliminan son
letales para el desarrollo, por lo que los embriones genéticamente alterados no pasan a adultos. Esto indica que son
genes imprescindibles para la vida, pero no podemos estudiar qué ocurre en los ratones adultos. Empleando esta
tecnología se han conseguido ratones que sirven como modelos para estudiar el cáncer, la obesidad, la diabetes, la
ansiedad, el Parkinson o el envejecimiento. Actualmente se están desarrollando tecnologías novedosas como la técnica
CRISPR/Cas9, que permite «editar» el genoma de una manera muy precisa, introduciendo las modificaciones que sean
de nuestro interés científico.
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Técnicas citogenéticas
Las técnicas citogenéticas tienen como objetivo estudiar los cromosomas en el contexto celular. Son técnicas de
desarrollo reciente, que en los últimos años han experimentado un crecimiento exponencial. Se pueden clasificar en
dos grupos: técnicas de análisis convencional y técnicas de análisis molecular. El análisis citogenético convencional
consiste en el estudio de los cromosomas metafásicos presentes en las células de interés, obtenidos tras el cultivo in
vitro del tejido.
Fundamento de la técnica
El protocolo básico para conseguir cromosomas en metafase de una célula conlleva los siguientes pasos (v. también
capítulo 7):
• Cultivo in vitro del tejido (sangre, médula ósea, piel, un tumor, etc.) con un medio de cultivo específico a 37 °C y
con fitohemaglutinina para inducir la mitosis celular.
• Interrupción de la división celular mediante la adición de un agente antimitótico como la colchicina, que detiene
la división en la metafase.
• Tratamiento de la suspensión celular con una solución hipotónica para romper las membranas celulares, fijación
de las estructuras obtenidas y tinción de los cromosomas para la obtención de un patrón de bandas específico.
• Recuento y análisis de la estructura de los cromosomas para el estudio de las posibles alteraciones.
La técnica de tinción más utilizada en citogenética convencional es la tinción de bandas G. Consiste en el
tratamiento de los cromosomas con tripsina y tinción con el colorante Giemsa. De esta manera, los cromosomas
aparecen teñidos con un patrón de bandas claras y oscuras que es específico de cada cromosoma, puesto que es reflejo
de la secuencia de ADN presente en cada uno de ellos. La disposición ordenada de los cromosomas presentes en la
célula, denominada cariotipo (fig. e2-13), permite detectar tanto alteraciones numéricas (monosomías, trisomías, etc.)
como estructurales (translocaciones, inversiones, deleciones, etc.). Esta es la técnica más utilizada para el estudio
citogenético, debido a que, de forma rápida y económica, permite llevar a cabo un análisis de todo el genoma célula a
célula. Sus principales inconvenientes son: la necesidad de disponer de tejido fresco para poder cultivar las células de
interés, y su resolución, ya que no son detectadas alteraciones que afectan a regiones de un tamaño menor de 5 Mb.
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FIGURA E2-13 Imagen de cariotipo humano.
Las técnicas de citogenética molecular están basadas en la hibridación in situ fluorescente (FISH), que consiste,
como se ha comentado previamente, en la hibridación de un fragmento de ADN o ARN con secuencia conocida
(sonda), marcada con una sustancia fluorescente (fig. e2-14). El esquema básico de la técnica de FISH convencional es
el siguiente:
• Preparación de la sonda: marcaje fluorescente del fragmento de ADN que actúa como sonda.
• Preparación del ADN diana, que puede tratarse de cromosomas en metafase o núcleos en interfase.
• Desnaturalización de las moléculas de ADN (tanto de la sonda como de la diana) e hibridación de las secuencias.
• Procesos de lavado para eliminar las uniones inespecíficas de la sonda.
• Análisis mediante el microscopio de fluorescencia.
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FIGURA E2-14 Técnica FISH para la detección de la amplificación del gen ERBB2 en una muestra de tumor de mama. La sonda de
color rojo identifica el gen ERBB2 y la sonda de color verde, el centrómero del cromosoma 17, donde se localiza este gen. Las flechas
rojas indican células tumorales con ganancia génica (5-10 copias del gen), y la flecha blanca señala una célula normal con dos copias
del gen y del centrómero del cromosoma. (Imagen procedente de: Servicio de Análisis Genéticos de la Universidad de Navarra.)
La técnica de FISH ha revolucionado el mundo de la citogenética desde sus primeras aplicaciones a finales de la
década de los ochenta del siglo xx, ya que permite llevar a cabo el estudio cromosómico sin la necesidad de tener
células en cultivo. Es capaz de detectar no solo ganancias y pérdidas génicas, sino también translocaciones e
inversiones en interfase. Además, dado que permite el análisis célula a célula, puede describir la posible
heterogeneidad celular de la muestra. Su principal desventaja es que no se trata de una técnica de cribado, porque
requiere conocer de antemano cuál es la región genética que se va a estudiar para poder disponer de la sonda
adecuada. La visualización de los resultados resulta laboriosa, puesto que implica contar señales fluorescentes, célula
a célula. En la actualidad existen algunos equipos capaces de automatizar el análisis de FISH.
Con el fin de resolver las principales limitaciones de la técnica de FISH, se han ido desarrollando nuevas
metodologías derivadas de ella; una de las más importantes es la hibridación genómica comparada (CGH) (v.
capítulo 7). La técnica de CGH consiste en mezclar dos ADN en cantidades equimoleculares (un ADN problema y un
ADN normal de referencia) marcados con fluorocromos diferentes (rojo y verde). Estos ADN compiten por hibridar
sobre un ADN diana normal en forma de cromosomas en metafase o, más recientemente, chips con miles de
secuencias genómicas que pueden llegar a diferenciarse en un único nucleótido (microarray-CGH y microarray-SNP).
La diferencia de material genómico entre el ADN problema y el de referencia se manifiesta en una diferencia de
intensidad rojo-verde en cada punto del microarray. La imagen obtenida en el microscopio de fluorescencia o en un
escáner es cuantificada por un programa informático que calcula el cociente de las intensidades de cada fluorocromo
en cada región, dando información de la ganancia o pérdida de material genómico para dicha región.
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La gran ventaja de la técnica CGH es que, al igual que la citogenética convencional, describe las alteraciones
presentes en todo el genoma, pero con una elevada resolución. Su principal inconveniente reside en no ser capaz de
detectar reordenaciones equilibradas que no supongan un cambio en la cantidad de material genómico.
Aplicaciones biomédicas
Las diversas técnicas anteriormente descritas permiten estudiar alteraciones presentes en enfermedades tanto
congénitas como adquiridas. Las enfermedades congénitas son aquellas que afectan al individuo desde el nacimiento.
Muchas de ellas tienen un origen cromosómico. Tras el examen clínico, su diagnóstico citogenético se lleva a cabo
obteniendo el cariotipo principalmente a partir del cultivo de sangre periférica del paciente. En ocasiones, es necesario
además recurrir a la técnica de FISH para describir el mosaicismo de la enfermedad (presencia de clones celulares con
dotaciones cromosómicas diferentes). Para algunas enfermedades causadas por microdeleciones, la resolución del
cariotipo no es suficiente, por lo que se recurre al análisis mediante FISH utilizando una sonda específica de la región
delecionada y/o microarrays de CGH.
Recientemente se están haciendo grandes esfuerzos para identificar las alteraciones que causan retraso mental. En
muchas ocasiones, el cariotipo de los pacientes es normal, y sus características clínicas y fenotípicas no permiten
identificar la enfermedad que pueda ser estudiada mediante una sonda de FISH. En estos casos, la técnica de
microarrays de CGH ha posibilitado la identificación de alteraciones que afectan a regiones de menos de 3 Mb,
características de este tipo de enfermedades. En la tabla e2-1 se presentan algunas de las enfermedades congénitas
más importantes y las alteraciones cromosómicas asociadas a ellas.
Tabla e2-1
Ejemplos de enfermedades congénitas en relación a sus alteraciones citogenéticas
del, deleción, pérdida de un fragmento cromosómico; p,
brazo corto del cromosoma; q, brazo largo del
cromosoma.
En cuanto a las enfermedades adquiridas, el
análisis citogenético se ha incorporado en los
laboratorios de genética como una técnica que
complementa el diagnóstico morfológico e
inmunofenotípico de neoplasias hematológicas y
tumores sólidos. La citogenética no solo aporta
valor diagnóstico, sino que además permite:
• Definir el pronóstico del paciente: por
ejemplo, en las leucemias agudas linfoides tipo
B, la hiperdiploidía de más de 50 cromosomas y la presencia de la translocación t(12;21)/ETV6-AML1 definen un
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pronóstico favorable, mientras que la casi haploidía (23-28), la presencia de la t(9;22) y la t(4;11)/AF4-MLL indica
un pronóstico desfavorable.
• Definir la respuesta que va a tener a un determinado tratamiento: por ejemplo, la presencia de la t(15;17) en la
leucemia aguda promielocítica permite seleccionar a los pacientes que son susceptibles de ser tratados con ácido
retinoico.
• Controlar la progresión de la enfermedad.
• Controlar el éxito de un trasplante de médula ósea.
La lista completa de alteraciones cromosómicas descritas en neoplasias hematológicas puede consultarse en la
siguiente base de datos: http://www.ncbi.nml.nih.gov/CCAP.
En la rutina diagnóstica, la técnica de FISH es la técnica de elección para el estudio de tumores sólidos, debido a las
dificultades encontradas en la obtención de cariotipos de calidad en este tipo de tumores. Los ejemplos más
representativos del diagnóstico citogenético en tumores sólidos son los siguientes:
• Análisis de translocaciones en distintos tipos de sarcoma: utilizando FISH, junto con otras técnicas de genética
molecular como la PCR, se pueden identificar translocaciones que caracterizan distintos subtipos de sarcoma; así,
una translocación entre el cromosoma 11 y 22, t(11;22)(q24; q12), que produce la fusión de los genes EWS y FLI1,
caracteriza a los sarcomas de Ewing. La translocación t(X;18)(p11;q11) (fusión de los genes SYT/SSX) caracteriza a
los sarcomas sinoviales y las translocaciones t(2;13)(q35;q14) y t(1;13)(p36;q14) a los rabdomiosarcomas.
• Análisis de la amplificación del gen ErbB2 (o Her-2) en cáncer de mama y del gen EGFR (Her-1) en cáncer de
pulmón: los genes de la familia de Her son receptores de membrana encargados de transmitir señales de
proliferación celular al interior de la célula. Alrededor del 30% de los tumores de mama y el 80% de los
carcinomas de pulmón de células no pequeñas sobreexpresan ErbB2 y EGFR, respectivamente. El estudio
mediante FISH de la amplificación de ambos oncogenes está resultando de gran utilidad como complemento al
análisis de la sobreexpresión de la proteína, no solo para caracterizar el peor pronóstico de los pacientes, sino
también para definir el subgrupo que puede beneficiarse de tratamientos basados en fármacos diseñados para
bloquear estos receptores.
El enorme desarrollo tecnológico y bioinformático de los últimos años en el ámbito de la secuenciación masiva hace
prever una nueva revolución en el campo de la citogenética, con el desarrollo de plataformas que permitirán
diagnosticar y pronosticar el curso de una enfermedad, así como poder predecir la respuesta de cada paciente a
tratamientos cada vez más individualizados.
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Producción de anticuerpos policlonales y monoclonales
Para obtener anticuerpos específicos contra una proteína de nuestro interés, lo primero que hay que conseguir es
aislar y purificar la proteína (o sintetizar un péptido de esa proteína contra el cual se quieren dirigir los anticuerpos).
Pongamos por caso una proteína de la cápside del virus de la hepatitis C. Esa proteína, cuando se inyecte en un
animal, constituirá un antígeno (Ag), ya que es una sustancia extraña que, introducida en un mamífero, provoca una
respuesta inmunitaria que estimula la producción de anticuerpos. Los Ag tienen diversos epítopos o determinantes
antigénicos: regiones concretas del Ag que estimulan la producción de anticuerpos. Un mismo antígeno puede tener
distintos epítopos.
Como se describe con detalle en el capítulo 17, los anticuerpos (o inmunoglobulinas) son glucoproteínas producidas
por los linfocitos B en respuesta a una estimulación antigénica. Están constituidos por la asociación de cuatro cadenas
polipeptídicas (dos pesadas y dos ligeras) unidas por puentes disulfuro. A su vez, cada cadena posee una región
variable, cuya secuencia de aminoácidos es característica de cada anticuerpo y constituye la región del mismo que
reconoce y se une al epítopo correspondiente; y otra región constante, con la misma secuencia para cada clase de
inmunoglobulina de una especie. Mediante digestión con papaína se obtienen dos fragmentos Fab (antigen binding),
que contienen las regiones variables (y, por lo tanto, las que se unen al antígeno), y un fragmento Fc (región
constante).
La inyección del Ag en el animal causa la producción de un conjunto de anticuerpos que provienen de diferentes
clones de linfocitos B y, por lo tanto, tienen diferente especificidad para reconocer diferentes epítopos de ese Ag. Esta
es una respuesta policlonal, ya que implica la diferenciación de varios clones de linfocitos B (uno por cada epítopo). Si
se obtiene el suero de ese animal, se consigue un suero policlonal, rico en una mezcla de anticuerpos que reconocen
los diferentes epítopos del Ag (fig. e2-15). El suero poseerá además muchos otros anticuerpos que reconocen proteínas
generadas en otras respuestas inmunes. Por medio de diversas técnicas, se puede purificar la fracción sérica que es
rica en nuestro anticuerpo de interés.
99
100
FIGURA E2-15 Representación de la unión de anticuerpos policlonales a distintos epítopos del antígeno (A) y de anticuerpos
monoclonales a un único epítopo del antígeno (B). Cada uno de los tipos de estructura geométrica representa un determinante
antigénico.
Muchas veces, en las técnicas inmunohistoquímicas y en otras aplicaciones de diagnóstico o terapéuticas interesa
poder utilizar anticuerpos que solo se dirijan contra un epítopo, es decir, que sean monoclonales (v. fig. e2-15), ya que
todos provienen de un único clon de linfocitos B. El aislamiento y mantenimiento en cultivo de un linfocito B
productor de un determinado anticuerpo permitiría la obtención de grandes cantidades del mismo, con idénticas
características y con la misma afinidad por el Ag. Sin embargo, los linfocitos B no pueden mantenerse en cultivo
durante un tiempo suficiente para obtener una cantidad adecuada de anticuerpos. Para solucionar este problema se
fusionan los linfocitos B con células de mieloma (células cancerosas que, al ser tumorales, pueden crecer en placas de
cultivo de modo indefinido). La fusión celular se consigue mediante polietilenglicol, una sustancia que favorece la
fusión de las membranas. Las células de mieloma poseen una deficiencia genética que les impide crecer en un medio
de cultivo llamado «HAT» (que contiene hipoxantina, aminopterina y timidina). Por lo tanto, solo van a crecer en
cultivo aquellas células de mieloma que se hayan fusionado con linfocitos B (hibridomas), pero no las de mieloma que
no se hayan fusionado, debido a que no pueden replicar su ADN en este medio. Los hibridomas se diluyen entonces
hasta que se obtiene solo una célula por pocillo de cultivo. Los anticuerpos que estas células generan se analizan
entonces por ELISA (v. más adelante) para comprobar que se produce el anticuerpo que nos interesa en grandes
cantidades (fig. e2-16).
101
FIGURA E2-16 Esquema del proceso de producción de anticuerpos monoclonales. (Dibujos procedentes de: Montuenga et al. Técnicas en histología y
biología celular. Barcelona: Elsevier; 2009.)
¿Cuáles son las ventajas de utilizar anticuerpos monoclonales sobre los policlonales? La obtención de gran cantidad
de sueros policlonales implicaría inyectar numerosas veces el antígeno en animales. Esto da lugar a distintas
respuestas inmunológicas de diferente intensidad, por lo que la cantidad de anticuerpo y su especificidad pueden ser
bastante variables. En el caso de anticuerpos monoclonales, como se ha aislado un clon celular productor del
anticuerpo de interés, mediante el cultivo in vitro de dicho clon podemos tener una fuente ilimitada de anticuerpos
con una especificidad definida. Al reconocer un único epítopo, se reduce la posibilidad de reacciones cruzadas y, por
lo tanto, de que el anticuerpo reconozca otras proteínas que no son las que interesa identificar. No obstante, el
procedimiento técnico para obtener anticuerpos monoclonales es bastante más caro y laborioso que el de los
anticuerpos policlonales. Las aplicaciones biomédicas de los anticuerpos monoclonales se comentan en el capítulo 17.
102
ELISA
El ELISA (enzyme linked immunosorbent assay) es una técnica basada en el reconocimiento antígeno- anticuerpo, muy
empleada en los laboratorios de diagnóstico, con la que se puede cuantificar una proteína en un fluido o en un
extracto de tejido (fig. e2-17). El modelo más habitual es el llamado «ELISA sándwich». Imaginemos que se quiere
conocer si un paciente tiene en la sangre concentraciones altas de una determinada proteína. Si tenemos dos
anticuerpos monoclonales que reconocen dos regiones distintas de la proteína, se puede unir covalentemente uno de
ellos al fondo de cada pocillo de una placa de cultivo de 96 pocillos (por la región Fc). Se añaden entonces a cada
pocillo de la placa muestras de suero de pacientes diferentes (alguno de los cuales contendrá la proteína que se quiere
cuantificar). En los pocillos en los que haya suero de los pacientes con concentraciones detectables de la proteína, esta
se unirá al anticuerpo (por la región Fab). A continuación se añade el segundo anticuerpo monoclonal, previamente
ligado a una enzima capaz de transformar una molécula concreta (sustrato) en un producto coloreado. Finalmente se
añade el sustrato de la enzima ligada al segundo anticuerpo monoclonal. En las muestras en las que haya mucha
proteína, habrá quedado retenido mucho anticuerpo y, por lo tanto, habrá una cantidad equivalente de enzima capaz
de transformar el sustrato en la molécula coloreada. Así, los pacientes cuyos sueros se añadieron en los pocillos que
han quedado coloreados contienen niveles elevados de la proteína estudiada. La intensidad del color en cada pocillo
tiene, por lo tanto, una relación directa con la cantidad de proteína presente en el suero del paciente. La sencillez y
rapidez de esta técnica la convierten en una de las aplicaciones de los anticuerpos más empleada en los laboratorios
de investigación y de rutina clínica.
FIGURA E2-17 Ilustración del procedimiento del ELISA para la determinación de la cantidad de proteína en un fluido o extracto de
tejido.
Western blot
El Western blot es un método para la detección de proteínas en extractos de tejido o células que implica una separación
electroforética de dicha proteína y una identificación mediante interacción antígeno-anticuerpo (fig. e2-18). Con esta
103
técnica se puede identificar la naturaleza de las proteínas presentes en una muestra, así como su cantidad. Las
proteínas, debido a su composición de aminoácidos, suelen tener una carga neta positiva o negativa, de modo que si
aplicamos un campo eléctrico a un extracto de proteínas, estas migrarán hacia el polo positivo o negativo
(dependiendo de su carga), y lo harán más rápido cuanto menores sean su tamaño y su complejidad estructural. La
separación electroforética de proteínas se realiza en una matriz sólida de poliacrilamida, compuesta por monómeros
de acrilamida entrelazados entre sí, dejando unos poros que variarán de tamaño dependiendo de la proporción de
acrilamida presente en la matriz. Al aplicar un campo eléctrico a esta matriz, las proteínas migrarán dependiendo de
su carga neta. Si se quisiera determinar tamaños de proteínas, esto sería un problema, puesto que habrá proteínas de
distintos tamaños y cargas, que migrarán de forma distinta. Por ello, el Western blot utiliza una modificación de esta
electroforesis denominada electroforesis en gel de acrilamida con dodecil sulfato sódico (SDS-PAGE, del inglés
sodium dodecyl sulfate poly-acrylamide gel electrophoresis). Las proteínas se colocan en una solución que contiene el
dodecil sulfato sódico (SDS), un potente detergente con carga negativa. El SDS es capaz de unirse a regiones
hidrófobas presentes en las proteínas, de forma que la carga neta que poseían queda neutralizada y las proteínas
adquieren una carga neta negativa otorgada por el SDS. De esta forma, al aplicar un campo eléctrico, las proteínas
migrarán ahora al polo positivo, con una velocidad que dependerá solo de su tamaño. Para evitar interacciones
debidas a la estructura terciaria de las proteínas, la muestra se calienta a altas temperaturas para desnaturalizar las
proteínas. Así, cuanta más masa tenga una proteína, más lenta será al migrar por los poros del gel de poliacrilamida.
FIGURA E2-18 Procedimiento para la realización del Western blot. Las proteínas tratadas con SDS y calentamiento se separan según
su peso molecular mediante electroforesis en un gel de acrilamida; posteriormente se transfieren del gel a una membrana para su
incubación con anticuerpos específicos (primarios) y secundarios marcados con una molécula cromógena (p. ej., una enzima o un
fluorocromo). Tras el revelado y obtención de la imagen se observan las bandas positivas situadas a una altura correspondiente al
peso molecular de la proteína que se quiere identificar. El esquema muestra un ejemplo de Western blot para detectar la proteína Id1
(imagen superior) y β-actina en células tumorales. Los números indican la masa molecular en kDa. (Imagen procedente de: I. Manrique. CIMA,
Universidad de Navarra.)
A partir de esta separación de las proteínas de una muestra, en función de su tamaño, podemos identificar una
proteína concreta mediante la unión específica antígeno-anticuerpo. Para poder enfrentar estas proteínas a un
anticuerpo, se realiza primero una transferencia de las mismas a un soporte más adecuado (una membrana de
nitrocelulosa) mediante la aplicación de un campo eléctrico perpendicular al gel (blotting). Una vez que las proteínas
104
están en la membrana, se puede proceder a la incubación de esta con un anticuerpo primario específico para la
proteína de interés; posteriormente se aplica un anticuerpo secundario (que se une a la fracción Fc del anticuerpo
primario) marcado con un cromógeno que permita detectar la banda correspondiente a la proteína en estudio.
La técnica de Western blot no se aplica normalmente para el diagnóstico, pero se utiliza habitualmente en
investigación biomédica para el descubrimiento y caracterización de nuevas proteínas, y para el estudio de las
alteraciones debidas a patologías (cantidades anormales, diferencias en tamaños, etc.).
105
Citometría de flujo
La citometría de flujo es una técnica de análisis del número, tamaño y forma de una suspensión celular. También sirve
para cuantificar el número de determinadas poblaciones celulares marcadas específicamente con sustancias
fluorescentes y para aislar poblaciones celulares. Por el hecho de analizar suspensiones celulares, esta técnica es
especialmente útil para el estudio y evaluación de muestras normales y patológicas de sangre y médula ósea. También
se pueden analizar muestras procedentes de tejidos, pero hay que hacer previamente un procesamiento de los mismos
para separar las células entre sí y para separarlas también de la matriz extracelular.
El citómetro contiene las siguientes partes:
• Un sistema fluídico de transporte de células.
• Un sistema óptico de iluminación de las partículas mediante láser. Se suele utilizar un láser de argón, ya que la
luz que emite es capaz de excitar más de un fluorocromo.
• Un detector electrónico que convierte la luz en señal digital. Las señales ópticas son convertidas en señales
eléctricas y analizadas en una computadora.
En el citómetro de flujo las células se hacen pasar por un capilar muy fino, de tal modo que pasan de una en una, en
fila (fig. e2-19). Según van pasando, el rayo láser impacta sobre ellas y se produce una distorsión del rayo que es
registrada por el detector. Este sistema de análisis cuantifica el número de eventos (células) que son impactados por el
láser, pero también es capaz de analizar la forma y complejidad interna de las células. El grado de alteración que se
produce cuando el láser atraviesa los límites celulares da lugar a una dispersión frontal (FSC, del inglés forward
scatter), que se relaciona con el tamaño celular (a mayor tamaño, mayor dispersión frontal). La complejidad interna de
las células produce una dispersión lateral u ortogonal (SSC, del inglés side scatter). Por lo tanto, las células granulares o
complejas producirán mayor dispersión lateral.
106
FIGURA E2-19 Esquema del funcionamiento de la citometría de flujo. A. Las células se hacen pasar por un fino capilar (de una en
una), donde son impactadas por un rayo láser; la distorsión lumínica es recogida en un detector. B. El grado de distorsión frontal (FSC,
forward scatter) indica el tamaño de la célula y el grado de distorsión lateral (SSC, side scatter), su complejidad interna. C.
Representación del patrón observado mediante citometría de flujo de leucocitos.
Por ejemplo, si se hace pasar una población de glóbulos blancos por el citómetro y se representa tamaño frente a
complejidad, obtenemos unas nubes de puntos correspondientes a cada una de las poblaciones celulares, que sitúa a
estas en diferentes regiones de la gráfica en función de estos parámetros. Los linfocitos, células pequeñas y con escasa
complejidad interna, quedan situados hacia el borde inferior izquierdo, mientras que los neutrófilos aparecen en el
lado superior derecho (v. fig. e2-19).
Otra posibilidad es marcar una población celular específicamente con un fluorocromo para identificarla en el
citómetro. Un fluorocromo frecuentemente utilizado es el isotiocianato de fluoresceína (FITC), que absorbe luz cerca
de los 490 nm y emite luz de 525 nm. Un ejemplo que ilustra la utilidad de esta técnica es la incubación de células
sanguíneas con un anticuerpo anti-CD19 (presente solo en las membranas de los linfocitos B, y no en las de linfocitos
T o NK). Cuando el láser impacta con un linfocito B se genera información para estimar la FSC y la SSC y, además, se
capta la señal debida a la fluorescencia. De este modo, se puede distinguir un linfocito B de uno T o de uno NK. Esto
último sería imposible solo con los parámetros FSC y SSC, dado que todos los linfocitos aparecen como una población
celular única en función de estos parámetros. La presencia de un número anormalmente alto de células CD19
positivas puede ser indicativo de una leucemia. Habitualmente, se emplean otros marcadores de superficie celular
para aseverar una patología neoplásica concreta.
Otro ejemplo de uso frecuente en clínica es la detección de linfocitos CD4 positivos para monitorizar la carga vírica
de los pacientes infectados con el VIH. La proteína CD4 se encuentra en la membrana de los linfocitos T cooperadores
(helper en inglés) y es utilizada por el virus VIH para infectar dichas células. La infección va reduciendo
progresivamente el número de linfocitos CD4+, provocando inmunodepresión en el paciente. Mediante el marcaje
fluorescente de anticuerpos anti-CD4 y análisis de la sangre de pacientes infectados en el citómetro se puede hacer
una cuantificación de la población de linfocitos CD4+ y, por lo tanto, un seguimiento de la evolución de la
enfermedad. En este caso, se puede hacer una representación de tipo histograma de la intensidad de fluorescencia
frente al porcentaje de células analizadas (fig. e2-20). La población de la izquierda de la gráfica corresponde a células
no marcadas, mientras que la población de la derecha (población que emite la fluorescencia) pertenece a las células
fluorescentes CD4+.
107
FIGURA E2-20 A. Representación en forma de histograma de una población de linfocitos positivos para el marcador CD4. La población
de la derecha indica el porcentaje (44,46%) de linfocitos positivos. B. Representación en forma de nube de puntos tras el marcaje de
linfocitos con doble inmunofluorescencia (anti-CD4, en color verde; anti-INF-γ, en color rojo).
Se pueden realizar también dobles o múltiples marcajes fluorescentes. Para ello habría que utilizar diferentes
anticuerpos, cada uno conjugado con un fluorocromo concreto. Entre los fluorocromos frecuentemente utilizados en
citometría están (aparte del FITC), la ficoeritrina (PE; absorción a 480-565 nm, emisión a 578 nm), y la aloficocianina
(APC; absorción a 650 nm, emisión a 661 nm). Imaginemos que queremos responder a la siguiente pregunta: ¿cuántos
linfocitos CD4+ expresan interferón γ (INF-γ)? Esta pregunta nos puede interesar porque el INF-γ es una citoquina
reguladora de la respuesta inmunitaria, que interviene, entre otras cosas, en la activación de los macrófagos y las
células NK. Para responder a esta pregunta, lo que habría que hacer es realizar un inmunomarcaje con anticuerpos
anti-CD4 conjugados con un fluorocromo (p. ej., FITC, que produce fluorescencia en el verde) y anticuerpos anti-INFγ marcados con otro fluorocromo (p. ej., APC, que produce una fluorescencia en el rojo). En este caso podemos hacer
una representación de intensidad de fluorescencia en el verde frente a intensidad de fluorescencia en el rojo.
Observaríamos así cuatro nubes de puntos diferentes, correspondientes a cuatro poblaciones celulares. La población A
corresponde a células que no se han marcado con ninguno de los anticuerpos (CD4−/INF−). La población B es la que
emite fluorescencia en el verde pero no en el rojo (CD4+/INF−), al contrario de lo que ocurre con la C (CD4−/INF+). La
población positiva para ambos marcadores corresponde a la D (CD4+/INF+) (v. fig. e2-20).
Los citómetros «clásicos», de un solo rayo láser, permiten el análisis de cinco parámetros al mismo tiempo: FSC, SSC
y tres canales de fluorescencia. Hoy en día existen aparatos que contienen hasta 18 canales de fluorescencia, lo que
constituye un total de 20 parámetros analizables al mismo tiempo, para cada célula. Esto es algo asombroso si
tenemos en cuenta que se analizan miles de células por segundo. Con estos equipamientos se puede encontrar una
célula con características propias entre una población de cientos de miles, o incluso de millones de células. La
tecnología de la citometría de flujo continúa avanzando. El campo principal es el desarrollo de más y mejores
fluorocromos, que permitan obtener señales más nítidas y más fuertes, con lo que se potenciaría la capacidad analítica
de la técnica. Además de su conjugación con anticuerpos para encontrar proteínas en una célula, el citómetro puede
analizar muchas otras funciones y características celulares, como la apoptosis, necrosis, número de mitocondrias,
cantidad de ADN, actividad de una determinada enzima, presencia de un determinado metabolito, etc. Algunos
108
citómetros, además de todo esto, permiten el aislamiento de las células analizadas, lo que posibilita una investigación
posterior más profunda con otro tipo de técnicas.
El campo donde más se ha desarrollado la citometría de flujo es la hematología, donde constituye una técnica
diagnóstica esencial. Los distintos tipos de leucemias y tumores hematológicos se pueden clasificar en muchos casos
mediante la citometría de flujo. Además, continuamente aparecen publicaciones científicas en las que se describen
nuevas subpoblaciones celulares caracterizadas por la presencia de un grupo especial de marcadores celulares, lo cual
puede ser importante de cara al diagnóstico o pronóstico de estas enfermedades.
109
Cultivos celulares
Fundamento de la técnica
Una de las herramientas más utilizadas para el estudio de la biología de las células, tanto normales como tumorales,
son los cultivos celulares. Las células cultivadas in vitro provienen de un órgano o un tejido normal o tumoral. Estas
células se mantienen en medios de cultivo de composición conocida y condiciones de temperatura y oxigenación
controladas. De esta forma, se asegura su supervivencia y propagación, lo que ofrece una fuente ilimitada de células
para el estudio. El origen de los cultivos celulares se remonta al siglo xix, cuando se realizaron los primeros ensayos de
supervivencia de células fuera de organismos. Actualmente, en el laboratorio se cultivan células procedentes de una
amplia gama de tejidos y organismos diferentes. Los cultivos celulares pueden ser de dos tipos: cultivos primarios y
líneas celulares.
1. Cultivos primarios: cuando el cultivo proviene de células, tejidos y órganos tomados directamente del paciente o
de un animal, recibe el nombre de cultivo primario. Una de las ventajas del cultivo primario es que las células
mantienen las características del órgano del que provienen, lo que es fundamental en el campo de la ingeniería de
tejidos. En ciertas patologías, como el infarto de miocardio o algunas lesiones hepáticas, las células dañadas se pueden
reemplazar por células sanas cultivadas in vitro procedentes del propio paciente (v. capítulo 18). En el caso del
tratamiento de quemados, se han desarrollado métodos de cultivo de piel con los que se generan grandes superficies
de este tejido en muy poco tiempo, que sirven para regenerar la piel con gran eficacia.
2. Líneas celulares: cuando las células del cultivo primario adquieren capacidad ilimitada de multiplicación y son
líneas puras (es decir, sin contaminación de otros tipos celulares) reciben el nombre de línea celular (fig. e2-21). Las
líneas celulares son una herramienta de trabajo de fácil manipulación y ofrecen una fuente ilimitada y homogénea de
células fácilmente caracterizables. El desarrollo y estudio de las líneas celulares ha sido uno de los mayores logros
técnicos de la biología celular, y ha servido como herramienta para el análisis de una gran variedad de funciones
celulares: la actividad intracelular (replicación y transcripción de ADN, síntesis de proteínas), el ciclo celular, la
diferenciación, las interacciones célula-célula, los análisis genéticos, etc.
110
FIGURA E2-21 Células tumorales en cultivo. (Imagen procedente de: Dra. J. Agorreta. Departamento de Histología y Anatomía Patológica, Universidad de Navarra.)
La mayoría de las células normales son capaces de dividirse un número finito de veces, tras el cual entran en
senescencia y no son capaces de dividirse más. El proceso de senescencia está relacionado con el acortamiento
progresivo de los telómeros, situados en los extremos de los cromosomas. Las células somáticas humanas tienen
inactivada la enzima responsable del mantenimiento de los telómeros, la telomerasa, por lo que en cada división
celular se produce el acortamiento de los telómeros hasta que la célula entra en el proceso de senescencia.
Para obtener una línea celular continua («inmortalizada») es necesario realizar ciertas modificaciones genéticas que
confieran a las células capacidad ilimitada de división; por ejemplo, la introducción del gen de la telomerasa, o
inactivación de genes de control del ciclo celular como P53. La derivación de líneas celulares a partir de muestras
tumorales es una tarea más sencilla a priori, ya que las células tumorales ya poseen modificaciones genéticas que
alteran los puntos de control del ciclo celular. No obstante, el estrés al que se ven sometidas en el cultivo in vitro
impide a veces el crecimiento de las mismas.
Habitualmente, el objetivo principal del cultivo celular es reproducir las condiciones existentes in vivo. Sin embargo,
existen ciertas limitaciones inherentes a esta técnica. Las células cultivadas in vitro no se comportan exactamente igual
que en el tejido de origen, debido al cambio en las condiciones de crecimiento de las células. Se pierde la estructura
tridimensional típica de cada tejido, existen diferencias en las interacciones célula-célula y célula-matriz extracelular, y
la disponibilidad de oxígeno y nutrientes se ve fuertemente alterada. Asimismo, las células en cultivo suelen sufrir
procesos de desdiferenciación o pérdida de las características típicas del tejido del que se aislaron. Estas limitaciones
hacen necesaria una cuidadosa interpretación de los resultados obtenidos mediante esta técnica.
Aplicaciones biomédicas
En un principio se aislaron líneas celulares para profundizar en el conocimiento de muchos aspectos de su fisiología.
Posteriormente, el campo de los cultivos celulares se encaminó hacia el desarrollo de la virología. Las células
111
eucariotas en cultivo son el sustrato perfecto para la replicación de los virus, lo que permite conocer nuevos aspectos
de la biología de estos microorganismos, así como el desarrollo de medidas preventivas a través de la producción de
vacunas. Igualmente, el desarrollo de las técnicas de fusión y cultivo celular permitió la creación de los anticuerpos
monoclonales, contribuyendo así al progreso de la inmunología.
Una de las prioridades de la medicina es la comprensión de la biología de la célula tumoral. Actualmente se cuenta
con líneas celulares de la mayoría de los tumores conocidos; de hecho, la primera línea celular de origen humano se
derivó a partir de un carcinoma de cérvix en 1952 (células HeLa). Esto, junto con el desarrollo de las técnicas de
transferencia de material genético en células en cultivo, ha hecho que las líneas celulares sean el modelo más utilizado
en el estudio del cáncer. En este sentido, el cultivo primario de células de un determinado tumor podría dar una
información muy valiosa acerca de la sensibilidad del paciente frente a ciertos fármacos utilizados en quimioterapia,
lo que permitiría dar un tratamiento más personalizado.
El desarrollo de las técnicas de aislamiento y cultivo de células madre ha abierto un nuevo campo de tratamiento de
muchas enfermedades mediante la terapia celular e ingeniería de tejidos (v. capítulo 18). Las aplicaciones de la terapia
celular se extienden a áreas tan diversas como las enfermedades cardiovasculares (regeneración de tejido cardíaco
después de un infarto), la oftalmología (regeneración de la córnea) o la traumatología (regeneración de cartílago).
112
Fraccionamiento celular y centrifugación diferencial
Si se desea estudiar la composición química y la función de orgánulos y otras partículas subcelulares, necesitamos
separarlos del resto de los componentes citoplasmáticos y nucleares. Para ello habría que romper la membrana
plasmática, lo que permitiría obtener una suspensión con todos los componentes subcelulares. Existen diversos
métodos para romper las células. Uno de ellos es el choque hipotónico. Al sumergir las células en un medio con
menor cantidad de solutos que el citoplasma, el agua entra y las células se hinchan, rompiéndose fácilmente. También
se utilizan homogeneizadores mecánicos, basados en la aplicación de presión, ultrasonido y otras fuerzas. La
homogeneización se realiza en soluciones isotónicas a bajas temperaturas. Un homogenado típico es una suspensión
de orgánulos, componentes celulares y macromoléculas, que podemos separar mediante la centrifugación.
Centrifugación
Las partículas o células en suspensión tienden a sedimentar debido a la fuerza de la gravedad. La velocidad de
sedimentación de las partículas pequeñas es muy lenta, pero aumenta si utilizamos un campo centrífugo. Cuando un
cuerpo se somete a centrifugación se genera una fuerza que tiende a escapar del centro de rotación (fuerza centrífuga).
Los aparatos que utilizan este tipo de fuerza cuentan con un rotor (donde se ubican las muestras) que puede girar a
altísimas velocidades.
La fuerza centrífuga aplicada a una partícula es proporcional a la velocidad de rotación del rotor (en revoluciones
por minuto) y a su distancia con respecto al centro de rotación (en centímetros). La fuerza centrífuga relativa (RCF, del
inglés relative centrifugal force), que se expresa en relación con la fuerza gravitacional g, se calcula como:
La constante 1.119 depende de la aceleración gravitacional y la RCF se expresa en unidades × g. Por ejemplo, una
fuerza centrífuga relativa de 500 × g significa que se aplica una fuerza 500 veces mayor a la fuerza gravitacional. La
velocidad con la que sedimentan las partículas depende de su masa y de su densidad, así como de la densidad y
viscosidad del medio en el que se encuentran. La sedimentación de una partícula será directamente proporcional a su
masa y densidad, e inversamente proporcional a la densidad y viscosidad del solvente. Las moléculas y las estructuras
subcelulares se pueden definir por un coeficiente de sedimentación que se expresa en unidades Svedberg (S) (1 S = 10
−13
s). Habitualmente se definen para la sedimentación en agua a 20 °C. El coeficiente refleja no solo su masa, sino
también su forma, superficie expuesta y densidad. Esto explica por qué el coeficiente de sedimentación de
determinadas partículas celulares, como el ribosoma (80 S), no es igual a la suma de los coeficientes de sus dos
subunidades (60 y 40 S, respectivamente).
113
Centrifugación diferencial
La centrifugación diferencial aprovecha la propiedad de las partículas de mayor tamaño o densidad para sedimentar
más rápido que aquellas de menor tamaño o densidad. Se basa en sucesivas centrifugaciones a velocidades crecientes
(fig. e2-22). En el primer precipitado, obtenido a bajas velocidades, aparecen los núcleos y restos de células sin
fragmentar. El sobrenadante se centrifuga con velocidad media, precipitando entonces los orgánulos citoplasmáticos
de mayor tamaño, como las mitocondrias, lisosomas, peroxisomas y cloroplastos. Cuando el segundo sobrenadante es
centrifugado a mayor velocidad, precipita la denominada fracción microsómica, que contiene fragmentos del retículo
endoplasmático y de la membrana. La centrifugación del tercer sobrenadante permite la precipitación de los
ribosomas, mientras que en el sobrenadante quedan las moléculas solubles del citosol (v. fig. e2-22). Cuando se
requieren fuerzas superiores a 20.000 × g, se utilizan ultracentrífugas que trabajan en vacío para evitar el
sobrecalentamiento de la muestra y del equipo.
FIGURA E2-22 Esquema de una centrifugación diferencial. El homogenado es sometido a sucesivas centrifugaciones. En cada paso
se centrifuga el sobrenadante de la centrifugación anterior, pero con mayor velocidad y durante más tiempo. En la figura se muestra la
obtención de las cuatro fracciones crudas.
Este método tiene poco poder de resolución y las fracciones pueden incluir varios orgánulos con la misma
velocidad de sedimentación. Aunque cada fracción cruda (nuclear, mitocondrial, microsómica y ribosómica) está
enriquecida en un tipo de estructura u orgánulo, contiene contaminantes que deben ser eliminados mediante la
resuspensión del precipitado obtenido tras una nueva centrifugación, o bien aplicando la centrifugación en gradientes
114
de densidad. Para asegurar la pureza de las distintas fracciones se evalúa el enriquecimiento en determinadas
moléculas características de cada orgánulo, mediante procedimientos enzimáticos, inmunocitoquímicos o
microscópicos. Algunos ejemplos de marcadores son la presencia de ADN (núcleo), citocromo oxidasa (mitocondrias),
hidrolasa (lisosomas), catalasa (peroxisomas), α-manosidasa (aparato de Golgi), adenilato ciclasa (membrana
plasmática) y lactato deshidrogenasa (citosol).
Centrifugación en gradientes de densidad
La fuerza centrífuga aplicada a las partículas es contrarrestada por fuerzas de fricción y de flotación. La primera
depende de la viscosidad del medio, mientras que la segunda es proporcional a la densidad del medio. La partícula
no se mueve cuando su densidad es igual a la del medio (isopícnica). Esta propiedad se refleja en diversos métodos de
sedimentación isopícnica (igual densidad) o de equilibrio, que permiten purificar las fracciones crudas. El
homogenado o, más frecuentemente, el sobrenadante posnuclear o posmitocondrial, se aplica a un gradiente de
osmolaridad, viscosidad o densidad, continuo o discontinuo, cuya mayor densidad se encuentra en el fondo del tubo.
Después de cierto tiempo de centrifugación, las partículas forman una banda en la zona del gradiente que tiene la
misma densidad que las partículas. Este método se conoce como sedimentación isopícnica o de equilibrio (fig. e2-23,
A).
115
FIGURA E2-23 A. Ilustración de la separación isopícnica de la fracción mitocondrial cruda en un gradiente de sacarosa. La densidad
de las partículas que se deben separar está comprendida dentro del rango de densidades del gradiente y, al cabo de 2 h de
centrifugación, los lisosomas, mitocondrias y peroxisomas se encuentran en bandas situadas en niveles de distinta densidad. B.
Ilustración de la centrifugación zonal en gradiente de densidad. La densidad de las partículas que se deben separar es mayor que la
del medio. Al centrifugar, las partículas migran más o menos según su coeficiente de sedimentación. La centrifugación debe ser
detenida antes de que las más rápidas lleguen al fondo.
En la sedimentación zonal, la densidad de las partículas que se deben separar es mayor que la densidad del medio
de separación. La fracción que debe purificarse se coloca sobre la solución o gradiente. Al centrifugar, las moléculas se
desplazan con una velocidad determinada por su coeficiente de sedimentación. Dado que todos los componentes
tienen mayor densidad que la sustancia del gradiente, es indispensable detener la centrifugación cuando las partículas
se hayan acumulado en zonas diferentes del tubo (v. fig. e2-23, B). Si la centrifugación es demasiado prolongada,
todas las partículas sedimentarán en la base del tubo.
Los gradientes se preparan con diferentes sustancias. La sacarosa es una de las más utilizadas, en concentraciones
variables desde 5% (1,017 g/ml) hasta 50% (1,23 g/ml). El cloruro de cesio es el componente preferido para la
separación de ácidos nucleicos (ADN, ARN). La centrifugación diferencial también puede aplicarse a suspensiones de
células enteras. En estos casos suelen utilizarse gradientes de Ficoll, Percoll o Nicodenz.
Preguntas de autoevaluación
1. Si se quisiera estudiar si existe una amplificación génica en el gen EGFR en cáncer de pulmón, ¿qué técnica sería
adecuada para ello?:
a. Inmunohistoquímica.
b. Hibridación in situ fluorescente.
c. Microarrays de CGH.
d. Realizacion del cariotipo.
e. Hay dos respuestas correctas.
Respuesta correcta: e.
2. ¿Cuál es la respuesta falsa en relación con la producción de anticuerpos monoclonales?
a. Los anticuerpos monoclonales reconocen un solo epítopo del antígeno, por lo que todos los linfocitos productores
de ese tipo de anticuerpo provienen de una misma estirpe de linfocitos B.
b. Solo se conseguirán anticuerpos monoclonales si se fusionan linfocitos B con células de mieloma, ya que los
linfocitos B no se pueden mantener mucho tiempo en cultivo.
116
c. Los linfocitos B no pueden crecer en medio HAT, por lo que es necesaria su fusión con células de mieloma.
d. El uso de anticuerpos monoclonales proporciona ventajas con respecto al uso de anticuerpos policlonales, porque
constituyen una fuente ilimitada de anticuerpos con especificidad definida.
e. Para obtener hibridomas que produzcan el anticuerpo de interés habría que realizar una dilución límite hasta
conseguir un hibridoma por pocillo de cultivo.
Respuesta correcta: c.
3. ¿Cuál es la respuesta falsa con respecto a la técnica del contraste negativo?:
a. Es una técnica muy útil para observar virus.
b. Las partículas se cubren con ácido fosfotúngstico, por lo que se observan con un aspecto oscuro.
c. Una vez procesadas, las muestras se observan al microscopio electrónico de transmisión.
d. Esta técnica consigue una alta resolución, por lo que se pueden observar partículas con gran nitidez.
e. Con esta técnica no hay que utilizar el ultramicrotomo, ya que no hay que hacer cortes de las muestras que se van
a observar.
Respuesta correcta: b.
4. Si quisiera inmortalizar un cultivo primario, ¿qué sería necesario modificar en las células?:
a. Expresar el gen de P21.
b. Expresar el gen de la telomerasa.
c. Inactivar el gen de P53.
d. Disminuir la expresión de EGFR.
e. Las respuestas b y c son correctas.
Respuesta correcta: e.
5. Indique cuál de las siguientes frases es falsa en relación con las técnicas utilizadas en biología celular:
a. La longitud de onda de emisión de un fluorocromo es mayor que la longitud de onda de excitación.
b. Si se utilizara luz de una longitud de onda por debajo del espectro visible se reduciría el poder de resolución de
un microscopio.
c. Las muestras que se analizan al microscopio electrónico tienen que estar contrastadas con sales de metales
pesados, como el citrato de plomo; las zonas de la muestra que absorben más cantidad de dicha sustancia
aparecerán como electrodensas.
117
d. En un microscopio de contraste de fases, el contraste se obtiene mediante sistemas ópticos que son capaces de
detectar las diferencias en la amplitud de las ondas que han atravesado las distintas estructuras celulares.
e. El microscopio confocal permite hacer reconstrucciones tridimensionales de las muestras y cuantificación de la
señal inmunofluorescente.
Respuesta correcta: b.
6. En una imagen de citometría de flujo de glóbulos blancos donde se representa tamaño (FSC) en el eje X frente a
complejidad (SSC) en el eje Y, ¿dónde quedaría situada la población de neutrófilos?:
a. En la parte superior izquierda.
b. En la parte superior derecha.
c. En la parte inferior izquierda.
d. En la parte inferior derecha.
e. En el centro.
Respuesta correcta: b.
7. Elija la respuesta que define mejor la función del glutaraldehído en microscopía:
a. Es una sustancia de contraste utilizada en microscopía electrónica.
b. Es una sustancia utilizada como colorante en microscopía óptica.
c. Es una sustancia fijadora utilizada en microscopía electrónica.
d. Es una sustancia que fija especialmente los lípidos de membrana, utilizada en microscopía electrónica.
e. Es un componente de las resinas que se utilizan para embeber el tejido en microscopía electrónica.
Respuesta correcta: c.
8. En la centrifugación diferencial, los peroxisomas se obtienen en la fracción:
a. Nuclear.
b. Mitocondrial.
c. Microsómica.
d. Ribosómica.
e. Citosólica.
Respuesta correcta: b.
118
9. Indique la correlación falsa:
a. Gel de agarosa: separación de ácidos nucleicos en la electroforesis.
b. Cloruro de cesio: separación de ácidos nucleicos en centrifugación.
c. EcoR1: enzima de restricción de ácidos nucleicos.
d. RT-PCR: análisis de polimorfismos del ADN.
e. Didesoxirribonucleótidos: secuenciación de ADN.
Respuesta correcta: d.
10. Un criostato es:
a. Un sustancia que previene la formación de cristales en muestras biológicas congeladas.
b. Una sustancia que se utiliza para fijar las biopsias intraoperatorias que van a ser congeladas.
c. Un aparato que sirve para almacenar las muestras congeladas a baja temperatura.
d. Un aparato parecido a un microtomo que se utiliza para cortar tejidos congelados.
e. Nada de lo anterior.
Respuesta correcta: d.
119
CAPÍTULO 3
120
Estructura de la membrana plasmática
Carlos Bravo
Alfonso Calvo
Objetivos de aprendizaje
• Comprender el modelo estructural de la membrana plasmática vigente en la actualidad (y sus precedentes).
• Conocer la composición química, estructura y función de las membranas biológicas.
• Iniciarse en el estudio de las variaciones fisiológicas y patológicas de la membrana celular.
121
Introducción
Clásicamente, el término membrana era empleado en anatomía e histología para designar a las láminas de tejido
conjuntivo que recubrían los miembros (membrum en latín). En la actualidad, es una palabra ampliamente difundida,
empleada en una miríada de disciplinas. Sin embargo, dejando aparte los matices particulares de cada acepción, la
palabra membrana continúa significando estructura laminar delgada y flexible. En biología celular, la expresión completa
y precisa es la de membranas biológicas.
En todas las células existe una fina envoltura laminar que recubre su contenido y define sus límites. De esta manera,
los espacios extra- e intracelulares pueden tener una composición y actividad diferentes. La envoltura encargada de
esta tarea es una membrana biológica denominada membrana celular, plasmática o citoplasmática. Adicionalmente,
las células eucariotas presentan un sistema de membranas intracelulares o endomembranas, que dividen el citosol en
compartimentos y envuelven determinados orgánulos. Es preciso destacar que las membranas biológicas no hacen de
la célula un sistema cerrado o estanco, incompatible con la vida. En esencia, se comportan como barreras
semipermeables: permiten un intercambio selectivo de sustancias con su entorno.
El análisis bioquímico y ultraestructural de las membranas biológicas revela que están compuestas por lípidos,
proteínas y una pequeña fracción de glúcidos, y que comparten una arquitectura básica común. Los lípidos forman
una bicapa de 3-5 nm de espesor que constituye la matriz o armazón de la estructura, sobre la que están embebidas en
grado variable las distintas proteínas. Ambos aspectos, composición y estructura, permiten explicar las principales
funciones de las membranas biológicas. De estas, 1) la individualización que experimenta la célula, y 2) su
compartimentación son las más inmediatas. Otros de los procesos que tienen lugar en las membranas son: 3) el tráfico
de sustancias, aun en contra de gradiente de concentración; 4) la catálisis enzimática de una gran variedad de
reacciones; 5) el anclaje del citoesqueleto, y 6) la comunicación celular.
En este capítulo, tras el relato de los descubrimientos y avances científicos que llevaron a la comprensión lograda
hasta hoy de las membranas biológicas, se procederá a la descripción de los componentes con los que estas se
construyen (lípidos, proteínas y glúcidos). Asimismo, se hará corresponder la estructura con la función y, siempre que
sea posible, se completará el estudio de las membranas con algunos aspectos clínicos, atendiendo a los mecanismos
moleculares que subyacen a las enfermedades. Se prestará especial atención a la membrana plasmática (sobre todo a la
membrana del eritrocito), pero mucha de la información proporcionada será aplicable a las membranas intracelulares.
122
Modelos estructurales de la membrana: perspectiva histórica
La observación de la membrana plasmática solo es posible gracias a la microscopía electrónica y, hasta 1950, los
primeros pasos que condujeron hacia la concepción de una envoltura celular procedieron de evidencias indirectas,
tales como la diferente composición del exterior y el interior celulares o los fenómenos osmóticos puestos de
manifiesto por Dutrochet (1827).
Los inicios de esta labor de investigación, desprovista aún de medios adecuados, fueron los del trabajo realizado
por Overton en torno a 1890 (fig. 3-1, A). El científico comprobó que, mientras que las sustancias liposolubles
penetraban en la célula con facilidad, las hidrosolubles apenas lo hacían. En 1895, presumió la existencia de una
especie de cubierta celular que, por las propiedades mencionadas, debía poseer naturaleza lipídica. Una década
después, Langmuir estudió los lípidos de membrana como moléculas anfipáticas y propuso una organización en
monocapa (fig. 3-1, B). Extendió en agua una solución de lípidos de membrana y, al evaporarse el disolvente
aromático, observó que en la interfaz aire-agua se formaban espontáneamente monocapas lipídicas.
123
FIGURA 3-1 Desarrollo histórico del modelo estructural de las membranas biológicas, donde se incluyen los principales hitos que
condujeron a la concepción actual de la envoltura celular. (Ilustración de: E. Maldonado. Imagen de microscopía electrónica de la unidad de membrana
procedente de: Robertson JD. Membrane structure. J Cell Biol 1981;91[3]:189-204).
En 1925, Gorter y Grendel extrajeron los lípidos de las membranas plasmáticas de un número conocido de
eritrocitos y los extendieron en una monocapa cuya área resultó ser el doble de lo que debían ocupar las membranas
de los glóbulos rojos. Este experimento condujo a la conclusión de que la membrana celular debía ser una bicapa o
doble capa lipídica, compuesta por el solapamiento de dos monocapas como las descritas por Langmuir (v. fig. 3-1, C).
Años después, se descubrieron varias propiedades de la membrana plasmática que, entendida como una bicapa
lipídica pura, no se podían explicar. Entre ellas, cabe destacar dos: 1) una tensión superficial menor de lo esperado, y
124
2) una mayor permeabilidad a las moléculas hidrosolubles. Ello apuntó entonces a la necesidad de introducir
componentes proteicos. En 1935, Davson y Danielli propusieron el denominado modelo de sándwich, según el cual la
membrana plasmática estaba formada por una doble capa lipídica cubierta por finas láminas de proteína en
configuración β (v. fig. 3-1, D). Posteriormente se incluyeron en este modelo poros o canales de membrana para
explicar el paso de sustancias.
La biología celular pudo finalmente comprobar la existencia de la membrana plasmática con el microscopio
electrónico, que reveló que se trataba de una estructura trilaminar de unos 10 nm de espesor (v. fig. 3-1, E). Esta se
encontraba dividida en una banda clara central bordeada por otras dos láminas densas y de menor grosor. Robertson
acuñó el concepto de unidad de membrana para designar esta imagen de tres capas de diferente electrodensidad, ya
que se repetía en las micrografías electrónicas de las membranas de todos los tipos celulares (incluidos los sistemas de
endomembranas). Él mismo fue quien hizo corresponder el espacio menos teñido con la bicapa lipídica, y las líneas
electrodensas con las finas capas de proteína, en coincidencia con el modelo propuesto por Davson y Danielli.
125
Singer y Nicolson: estructura en mosaico fluido
Frente a su aparente verificación por las conclusiones de Robertson, el modelo de Davson y Danielli empezó a ser
cuestionado a la luz de nuevos datos obtenidos durante la década de los sesenta. Entre los hechos que contradicen las
interpretaciones del modelo de sándwich, cabe destacar dos. Uno es la alta variabilidad del cociente proteína/lípido en
las membranas biológicas (tabla 3-1), que puede oscilar desde 0,23 en la vaina de mielina hasta 3,54 en la membrana
mitocondrial interna. El otro es la presencia de proteínas de membrana globulares, con dominios en hélice α,
imposibles de conciliar con las finas láminas β preconizadas por el modelo de Davson y Danielli.
Tabla 3-1
Contenido en lípidos, proteínas y
glúcidos de ejemplos representativos
de las membranas biológicas
(expresado como porcentaje en peso)
Tomado de Robertson JD. Membrane Structure. J Cell Biol 1981;91(3):189-204.
A lo anterior se suman nuevos hallazgos de la microscopía electrónica, gracias al desarrollo de la técnica de
criofractura-réplica (fig. 3-2). En este método, primero se congelan las células y, después, el bloque de hielo resultante
se fractura con una cuchilla, de modo que el plano de dehiscencia tiende a coincidir con el espacio que separa las dos
monocapas (v. capítulo 2). Una vez logrado esto, las muestras resultantes pueden metalizarse con platino y
visualizarse al microscopio electrónico. De esta manera, la membrana plasmática fue separada en dos
hemimembranas: una externa o exoplasmática (E), orientada hacia el medio extracelular, y una interna o
protoplasmática (P), en contacto con el citosol. También se observó que la superficie de ambas monocapas presentaba
proteínas globulares de 4-16 nm. Por todo ello, la idea central de una vasta extensión de proteínas en configuración β,
propia del trabajo de Davson y Danielli, fue sustituida en 1972 por la propuesta de Singer y Nicolson, que sigue en
vigor y se aplica a todas las membranas celulares.
126
FIGURA 3-2 A. Representación esquemática de la parte interna de una bicapa lipídica sometida a criofractura. Se denomina cara E a
la hemimembrana externa y cara P a la protoplasmática. En la técnica de criofractura, la línea de separación suele coincidir con la parte
interna de la membrana. B. Muestra obtenida por criofractura. Obsérvese que sobre la hemimembrana P se aprecia un mayor número
de partículas (correspondientes a proteínas transmembrana). En su lugar, la cara E presenta las oquedades en las que encajan las
partículas que sobresalen de la monocapa interna. (A, ilustración de: E. Maldonado. B, ©1981 Rockefeller University Press. Originally published in Journal of Cell
Biology.91:189-204.doi:10.1083/jcb.91.3.189s)
La denominación de este modelo de mosaico fluido (fig. 3-3; v. fig. 3-1, F) hace alusión a las dos características de la
membrana celular que Singer y Nicolson pusieron de manifiesto. De una manera fácil de entender, los científicos
describieron la membrana como una bicapa lipídica fluida (en la que las moléculas de lípido pueden desplazarse
libremente) sobre la que quedaban incluidas y cohesionadas de forma variable miles de proteínas a modo de mosaico.
En la misma década, este modelo se reforzó al ponerse de manifiesto que, gracias a la presencia de dominios
transmembrana, las proteínas pueden adoptar configuraciones de longitud suficiente como para atravesar toda la
bicapa lipídica (v. fig. 3-1, G). No obstante, otras proteínas se presentan como unidades globulares discretas unidas a
la bicapa, o a otras proteínas de la membrana, mediante interacciones más débiles (interacciones electrostáticas o
puentes de hidrógeno).
127
FIGURA 3-3 Esquema de la membrana según el modelo de mosaico fluido. Singer y Nicolson imaginaron la membrana como una
bicapa lipídica fluida (en la que las moléculas de lípido pueden desplazarse libremente) sobre la que quedaban incluidas y
cohesionadas de forma variable miles de proteínas a modo de mosaico. La fracción glucídica de la membrana (pequeñas cadenas de
oligosacáridos unidos a lípidos y proteínas) se encuentra dirigida hacia el exterior celular. (Ilustración de: E. Maldonado.)
Por lo tanto, el armazón básico de las membranas biológicas está constituido por la bicapa lipídica, mientras que
casi todas sus funciones, dependientes de cada orgánulo y tipo celular, son llevadas a cabo por las proteínas que
actúan como enzimas, transportadores de sustancias, moléculas de adhesión o receptores de señales extracelulares. La
fracción glucídica de la membrana (pequeñas cadenas de oligosacáridos unidos a lípidos y proteínas) se encuentra
dirigida hacia el exterior celular, mientras que, por la cara citosólica, las proteínas del citoesqueleto se anclan a la
membrana de la célula.
128
Lípidos de membrana
Bicapa lipídica
Los lípidos de membrana comprenden un grupo heterogéneo de biomoléculas orgánicas formadas básicamente por
carbono, hidrógeno y oxígeno. Una característica esencial de los lípidos de membrana, conocida desde las primeras
investigaciones sobre la estructura de las membranas biológicas, es que son sustancias anfipáticas. Esto quiere decir
que son compuestos dotados de una parte polar e hidrófila (la cabeza) y otra apolar e hidrófoba (una cola de cadenas
hidrocarbonadas). Estas últimas regiones, a diferencia de las hidrófilas, no son capaces de interaccionar con el agua
mediante la formación de puentes de hidrógeno, y ello hace que los lípidos sean insolubles en disolventes polares.
Si se suspenden en agua, los lípidos de membrana, como moléculas anfipáticas que son, se orientan de forma que
las porciones hidrófilas interactúan con el medio que las envuelve, mientras que las partes hidrófobas se ven forzadas
a formar agregados. De esta manera, la reducción de la superficie de la interfaz agua-lípido supone la minimización
de las fuerzas repulsivas. Dependiendo de cuál sea la forma de las moléculas lipídicas, pueden construirse dos tipos
de agregados microscópicos: la micela y la bicapa (fig. 3-4). Las micelas son agrupaciones esféricas en las que los
compuestos anfipáticos orientan sus regiones hidrófobas de forma radial hacia un punto interior central. Los grupos
de cabeza polares quedan en la superficie, en contacto con el medio acuoso. Su formación tiene lugar fácilmente
cuando las unidades lipídicas tienen forma de cuña. Tal es el caso de los ácidos grasos, que tienen una sola cola
hidrocarbonada.
129
FIGURA 3-4 Agregados de lípidos. Las moléculas lipídicas con forma de cuña (como los ácidos grasos) se organizan en micelas,
mientras que las que tienen forma cilíndrica (como los fosfolípidos) forman bicapas. (Ilustración de: E. Maldonado.)
La bicapa (o doble capa) es una lámina de dos monocapas de lípidos anfipáticos enfrentadas por las regiones
hidrófobas. En esta ocasión, su formación se encuentra favorecida cuando las moléculas son cilíndricas. Tal es el caso
de los glicerofosfolípidos y los esfingolípidos, lípidos de membrana que, como se verá en su descripción, tienen dos
colas hidrófobas.
La bicapa lipídica presenta dos propiedades fundamentales relacionadas con la minimización de fuerzas repulsivas:
el autosellado y el autoensamblaje. Debido al autosellado, la bicapa es capaz de reparar espontáneamente una
solución de continuidad. Este fenómeno, por lo tanto, asegura la integridad de la membrana y, con ello, la viabilidad
celular. La alteración de esta propiedad de la doble capa lipídica es causa de muerte celular y es la base del
mecanismo de acción de algunos fármacos antiinfecciosos, como las polimixinas y los macrólidos polienos. Además, el
sistema inmunitario, a través de las proteínas del complemento y los linfocitos citotóxicos, destruye a muchos
patógenos construyendo en sus membranas unos poros imposibles de arreglar espontáneamente.
El autoensamblaje, por su parte, supone un paso más en la minimización de las repulsiones entre el agua y los
lípidos de la bicapa. Las porciones hidrófobas de las moléculas de lípido que están en el borde libre de la doble capa
130
lipídica están aún en contacto con el agua. Este inconveniente se resuelve si la bicapa se pliega sobre sí misma,
formando espontáneamente un compartimento sellado denominado vesícula (fig. 3-5).
FIGURA 3-5 Autoensamblaje de la bicapa lipídica, que forma una vesícula. Si esta se produce in vitro, entonces recibe el nombre de
liposoma. (Ilustración de: E. Maldonado.)
Si el fenómeno descrito se produce in vitro, las vesículas formadas se denominan liposomas. Se trata de un sistema
artificial de membranas utilizado comúnmente en el estudio de las propiedades de la bicapa lipídica, pero que
también se utiliza para administrar fármacos. La formulación de ciertos agentes terapéuticos en liposomas permite,
en primer lugar, proteger el medicamento de los mecanismos que el organismo tiene para eliminarlo, con lo que se
logra una mayor concentración y/o una prolongación de su vida media. Además, el tratamiento sistémico plantea el
problema de una escasa especificidad tisular, por lo que un fármaco no solo actúa en su tejido diana, sino que también
lo hace en muchos otros órganos sobre los que produce efectos adversos. La posibilidad de emplear liposomas con
ligandos específicos pretende vehiculizar estas sustancias hacia su diana terapéutica, aumentar su efecto beneficioso y
disminuir, a la par, su toxicidad.
Dentro de la membrana plasmática encontramos tres tipos fundamentales de lípidos (fig. 3-6): glicerofosfolípidos,
esfingolípidos y esteroles. Los ácidos grasos son componentes esenciales de los dos primeros grupos.
131
FIGURA 3-6 A. Lípidos de membrana: glicerofosfolípidos, esfingolípidos y esteroles. B. Estructura y fórmula de los fosfolípidos más
frecuentes de la membrana plasmática. (Ilustración de: E. Maldonado.)
Ácidos grasos
Los ácidos grasos son ácidos orgánicos con largas cadenas hidrocarbonadas. Los más abundantes en las membranas
biológicas tienen un número par de átomos de carbono que varía entre 12 y 20, siendo los más comunes aquellos que
poseen 16 y 18. Esto se debe a que fuera de este rango no se podría asegurar la estabilidad de la membrana. Este hecho
es el principal condicionante de que el grosor de la bicapa sea de 3-5 nm, en función de la longitud de las cadenas
hidrocarbonadas de los ácidos grasos predominantes.
Otro de los aspectos que caracterizan a algunos de los ácidos grasos presentes en los lípidos de membrana es la
presencia de dobles enlaces o insaturaciones. Todos los ácidos grasos insaturados de las membranas están en
configuración cis, es decir, poseen los grupos –H en el mismo lado de un doble enlace. Esto hace que, a nivel de la
insaturación, la cadena sufra una torsión de unos 120° aproximadamente. Como se verá más adelante, esto supone un
factor decisivo en el estado de fluidez de la membrana. Los ácidos grasos saturados más habituales en los lípidos de
membrana son el ácido palmítico y el esteárico (de 16 y 18 átomos de carbono, respectivamente). Los ácidos grasos
insaturados más frecuentes son los ácidos oleico, linoleico y linolénico (los tres con 18 átomos de carbono y uno, dos
y tres dobles enlaces, respectivamente) y el ácido araquidónico (de 20 átomos de carbono y cuatro dobles enlaces).
Glicerofosfolípidos
Los glicerofosfolípidos, o fosfoglicéridos, son ésteres de glicerol con dos ácidos grasos y un grupo de cabeza polar.
En el caso más sencillo, ese grupo de cabeza está constituido por el ácido fosfórico, y el compuesto resultante se
denomina ácido fosfatídico. En este compuesto, los grupos hidroxilo primero y segundo del glicerol están
esterificados por sendas moléculas de ácido graso, mientras que el tercer grupo hidroxilo se encuentra esterificado por
132
ácido fosfórico. El ácido fosfatídico actúa de precursor a partir del cual derivan los restantes glicerofosfolípidos por
unión al grupo fosforilo de un alcohol, que da nombre al complejo (v. fig. 3-6).
Los principales glicerofosfolípidos constituyentes de la membrana son los que contienen los aminoalcoholes colina
(fosfatidilcolina o lecitina), serina (fosfatidilserina) y etanolamina (fosfatidiletanolamina o cefalina). Los que
contienen inositol en distintos estados de fosforilación (fosfatidilinositoles) u otra molécula de glicerol
(fosfatidilglicerol) se hallan en cantidades relativamente pequeñas. En las membranas mitocondrial interna y
bacteriana es posible distinguir también un glicerofosfolípido formado por la unión de dos ácidos fosfatídicos a una
molécula de glicerol, que actúa de puente (difosfatidilglicerol o cardiolipina). Los glicerofosfolípidos son los
constituyentes mayoritarios de las membranas biológicas y, a pH fisiológico, pueden ser neutros (como la cefalina y la
lecitina) o tener carga negativa (como la fosfatidilserina, el fosfatidilinositol y el fosfatidilglicerol).
Esfingolípidos
Los esfingolípidos tienen una estructura análoga a la de los glicerofosfolípidos (un grupo de cabeza polar y dos colas
apolares), pero no contienen glicerol y, en su lugar, están compuestos por esfingosina, un aminoalcohol de cadena
larga. Sus moléculas anfipáticas tienen dos colas hidrófobas, constituidas por una molécula de ácido graso y una
esfingosina unidas por un enlace amida entre el grupo carboxilo del ácido graso y el grupo amino del C-2 de la
esfingosina. Se obtiene así una ceramida, el precursor común de los esfingolípidos. Es posible distinguir dos clases de
esfingolípidos, según el grupo de cabeza polar que se una a la ceramida: esfingomielinas y osoesfingolípidos (v. fig. 36).
Las esfingomielinas contienen como grupos de cabeza polares los aminoalcoholes fosforilados fosfocolina y
fosfoetanolamina. Como tienen fósforo, también pueden clasificarse como fosfolípidos junto a los glicerofosfolípidos.
Se hallan en las membranas plasmáticas de las células animales, siendo especialmente numerosas en la vaina de
mielina que aísla los axones de algunas fibras nerviosas. La vaina de mielina (con un cociente proteína/lípido de 0,23)
se forma por la aposición sucesiva de la membrana de las células de la glía en torno al axón de las neuronas. Como la
mielina se interrumpe de forma segmentaria en los nódulos de Ranvier, promueve una conducción saltatoria del
impulso nervioso, mucho más rápida que la que ocurre en las fibras nerviosas no mielinizadas (v. capítulo 4). La
esclerosis múltiple es una enfermedad de componente autoinmunitario que cursa con desmielinización del sistema
nervioso central. La pérdida de la mielina hace más lenta e, incluso, interrumpe la transmisión del impulso nervioso, y
ello puede generar en los pacientes debilidad, falta de coordinación, problemas de habla y visión, etc.
Los osoesfingolípidos, glucoesfingolípidos o, simplemente, glucolípidos están formados por la unión de la
ceramida con una o varias unidades glucídicas. Así pues, estos lípidos no contienen ácido fosfórico (no pueden
incluirse en el grupo de los fosfolípidos) y su cabeza polar está constituida por un glúcido conectado al grupo –OH
133
del C-1 de la ceramida. Los osoesfingolípidos se subdividen, a su vez, en tres grupos: cerebrósidos, globósidos y
gangliósidos.
Los cerebrósidos contienen un monosacárido unido a la ceramida, que puede ser glucosa o galactosa. Los
globósidos presentan grupos de cabeza polares formados por disacáridos u oligosacáridos. Ambos osoesfingolípidos
pertenecen al grupo de los glucolípidos neutros, debido a que no tienen carga a pH fisiológico. Los gangliósidos, en
cambio, contienen grupos de cabeza polares formados por oligosacáridos que poseen una o varias unidades de ácido
siálico (ácido N-acetilneuramínico). Este glúcido les aporta una carga neta negativa a pH fisiológico. Hasta ahora, se
han identificado más de 40 gangliósidos. Son abundantes en la hemimembrana E de las células ganglionares del
sistema nervioso central, pero también se hallan en menor cantidad en las membranas del resto de los tejidos
animales.
Los glucolípidos participan en los procesos de señalización celular, en los que, junto a determinadas glucoproteínas,
suponen puntos de reconocimiento para moléculas extracelulares o células adyacentes. La porción glucídica de
determinados glucolípidos y glucoproteínas define los grupos sanguíneos humanos y desempeña también un papel
esencial durante el desarrollo embrionario, pero además se asocia a determinadas situaciones patológicas. Algunos
osoesfingolípidos son puntos de entrada de ciertos patógenos y toxinas bacterianas. Así, el gangliósido G , presente
M1
en las células de la mucosa intestinal, actúa como receptor para la toxina producida por Vibrio cholerae. Cuando esta
penetra en el enterocito, produce un aumento prolongado de la concentración intracelular de AMPc (v. capítulo 13), lo
cual conduce a la hipersecreción de agua y electrólitos responsable de la diarrea acuosa y profusa que caracteriza al
cólera.
Esteroles
Los esteroles son lípidos de membrana presentes en la mayor parte de las células eucariotas. Pertenecen al grupo de
los esteroides, con entre 27 y 29 átomos de carbono organizados en torno al núcleo de esterano o
ciclopentanoperhidrofenantreno. El más común y relevante de los esteroles en la membrana de las células animales es
el colesterol (fig. 3-7). En este, al núcleo de esterano se unen una cadena lateral alifática en el C-17 y un grupo
hidroxilo en el C-3, que actúa de grupo de cabeza polar (mínimo en comparación con el cuerpo apolar de la molécula,
que resulta casi tan largo como un ácido graso de 16 carbonos). En células eucariotas de plantas y hongos predominan
los esteroles estigmasterol y ergosterol, respectivamente.
134
FIGURA 3-7 Estructura esquemática del colesterol, un lípido de naturaleza esteroide habitual en la membrana de las células animales.
(Ilustración de: E. Maldonado.)
Sin embargo, no se han descubierto esteroles en la membrana de las células procariotas, y también están ausentes en
la membrana interna de mitocondrias y cloroplastos, orgánulos semiautónomos que, se piensa, proceden
evolutivamente de organismos procariotas.
Fluidez de la bicapa lipídica
Además de las propiedades de autosellado y autoensamblaje, las bicapas lipídicas tienen otras características que
hacen de ellas una matriz ideal para constituir las membranas celulares. Una de las más importantes, ya señalada en el
modelo de Singer y Nicolson, es su fluidez. La bicapa lipídica es un fluido bidimensional encerrado en la interfaz de
dos medios acuosos, en el que sus moléculas constituyentes se desplazan libremente.
Es posible distinguir cuatro tipos de movimiento distintos de los lípidos de membrana (fig. 3-8): 1) la flexión de las
cadenas hidrocarbonadas; 2) la rotación de los fosfolípidos alrededor de su eje mayor; 3) la difusión lateral, y 4) la
difusión transbicapa, o flip-flop. En las difusiones lateral y transbicapa se produce el intercambio azaroso de posición
entre dos moléculas de lípido. La diferencia entre ambos movimientos es que, mientras que en la difusión lateral las
moléculas de lípido están situadas dentro de la misma hemimembrana, en el flip-flop se produce el traspaso de una
monocapa a otra. A 37 °C, una molécula de lípido individual puede llegar a intercambiar su ubicación con otras
moléculas adyacentes unos 10.000.000 veces/segundo por difusión lateral. En cambio, el movimiento de flip-flop en las
135
mismas condiciones experimentales es extremadamente lento, siendo su frecuencia menor de una vez a la semana.
Esto se debe a que la difusión transversa requiere que las cabezas polares de los fosfolípidos abandonen su entorno
acuoso y se trasladen al interior hidrófobo y no polar de la bicapa en su paso hacia la otra hemimembrana, proceso
que no resulta favorable termodinámicamente.
FIGURA 3-8 Tipos de movimientos de las moléculas de fosfolípido en la bicapa. (Ilustración de: E. Maldonado.)
Agentes que influyen en la fluidez de la membrana
Las membranas necesitan permanecer en estado fluido, y los factores que determinan su estructura y flexibilidad son:
la temperatura y su composición lipídica.
• Temperatura. La fluidez de la membrana disminuye a bajas temperaturas y se eleva con la transmisión de energía
térmica, incrementándose la vibración de sus partículas. Una bicapa pasa de un estado cristalino o gel a un estado
líquido en un punto o temperatura de fusión específico (Tm, del inglés temperature of melting). Para que una
membrana desempeñe su función normal, tiene que hallarse en su estado fluido, es decir, a una temperatura
superior a su Tm correspondiente, pero que tampoco exceda los límites fisiológicos. Por debajo o por encima de
dicho rango característico, el habitual movimiento de las moléculas lipídicas y proteicas quedará perturbado.
• Composición lipídica. El otro agente que modifica el estado de fluidez de la membrana es su composición en
lípidos, siendo de especial relevancia: 1) el tipo de ácidos grasos que constituyen los glicerofosfolípidos y
esfingolípidos, y 2) la presencia de esteroles:
136
○Tipo de ácidos grasos (fig. 3-9). Dos son las características de los ácidos grasos que resultan especialmente
importantes para regular la fluidez de la membrana: la longitud de la cadena hidrocarbonada y el grado de
insaturación. El valor de la Tm es más bajo (es decir, una membrana resulta más difícil de cristalizar) si las
cadenas hidrocarbonadas de los ácidos grasos de sus lípidos son cortas o tienen dobles enlaces en configuración
cis. Una menor longitud de cadena reduce la tendencia de interacción entre las colas hidrocarbonadas, mientras
que los dobles enlaces cis, como se explicó anteriormente, introducen giros intracatenarios de unos 120° que
dificultan el empaquetamiento que supone el paso al estado de gel.
○Esteroles (fig. 3-10). La membrana de una célula animal contiene cantidades de colesterol tales que pueden llegar
a suponer el 50% del número total de lípidos. Las moléculas de colesterol se orientan en la bicapa lipídica con su
grupo hidroxilo hacia la fase acuosa. En esta posición, el anillo esteroide, plano y rígido, inmoviliza los primeros
grupos -CH - de las cadenas hidrocarbonadas vecinas, provocando que la bicapa lipídica sea más rígida en esta
2
región. La presencia de moléculas de colesterol en la membrana de una célula animal presenta un doble efecto.
Por un lado, frena el aumento de fluidez asociado a temperaturas elevadas. Por otro lado, previene la
cristalización derivada de la disminución de la temperatura. Dicho de otro modo, en términos de Tm: el colesterol
ejerce el efecto dual de disminuir la fluidez de la membrana y dificultar su congelación por encima y por debajo
de su punto de fusión, respectivamente.
FIGURA 3-9 Punto de fusión (Tm), según la longitud de la cadena (A) y el grado de insaturación (B) de los ácidos grasos. El valor de
Tm disminuye si las cadenas hidrocarbonadas son cortas y tienen dobles enlaces en configuración cis. Este hecho se entiende
fácilmente con la representación espacial de las moléculas de los fosfolípidos de membrana (a la derecha). Aquellos que tienen grupos
acilo saturados de cadena larga (como los esfingolípidos) encajan bien en la membrana. Por el contrario, aquellos que contienen
ácidos grasos de cadena más corta y, fundamentalmente, dobles enlaces no encajan tan bien en la membrana. Ello se debe a que una
insaturación cis introduce un giro intracatenario que, como se puede observar, dificulta el empaquetamiento. (Ilustración de: E. Maldonado.)
137
FIGURA 3-10 Distribución de las moléculas de colesterol en la bicapa lipídica. (Ilustración de: E. Maldonado.)
Además, los esteroles disminuyen la permeabilidad de las membranas, ya que dificultan el paso a su través de
solutos polares. Presumiblemente, rellenan los huecos transitorios que se forman entre las cadenas hidrocarbonadas en
constante movimiento, a través de las cuales podrían difundir pasivamente pequeñas moléculas hidrosolubles. De
hecho, la membrana luminal de las células epiteliales de la porción distal de la nefrona tiene una cantidad de
colesterol tal que es impermeable al agua, y este hecho es clave para el correcto funcionamiento del riñón y el balance
de líquidos corporales.
Alteración de la fluidez de la membrana y mecanismos de compensación
La fluidez de la membrana celular está sometida a varios sistemas de regulación. Las células son capaces de
contrarrestar los efectos de un cambio abrupto de temperatura mediante la variación de la composición lipídica de la
membrana plasmática. Esta capacidad de mantener la fluidez de la membrana relativamente constante comprende
mecanismos muy diversos: desde la alteración en longitud y grado de insaturación de los ácidos grasos de la bicapa
hasta la incorporación de colesterol en el caso de células animales.
Existe una larga lista de enfermedades en las que se han descrito alteraciones en la fluidez de la membrana de
significado incierto. Entre ellas, cabe destacar entidades tan prevalentes o de tanto impacto social como la obesidad, el
alcoholismo, la hipertensión arterial, la diabetes, la enfermedad de Alzheimer y la esquizofrenia.
La alteración de la fluidez de la membrana del eritrocito conlleva cambios perjudiciales en su estructura y función.
La acantocitosis consiste en la presencia de un tipo de eritrocitos anormales, con proyecciones espinosas, conocidos
como acantocitos o células en espuela (fig. 3-11). Este fenotipo eritrocitario surge como consecuencia de una alteración
en la composición lipídica y una disminución en la fluidez de la membrana. Dado que los eritrocitos requieren cierto
grado de flexibilidad para pasar por los capilares, cualquier descenso en la fluidez y elasticidad de su membrana
aumenta su fragilidad y favorece su destrucción (hemólisis). La acantocitosis puede darse en una gran variedad de
situaciones patológicas. Por ejemplo, algunos pacientes con cirrosis hepática presentan acantocitos, cuya membrana
tiene un contenido de colesterol elevado. El aumento de colesterol se traduce en una rigidez excesiva, y la pérdida de
la capacidad de deformación hace que los acantocitos se destruyan prematuramente.
138
FIGURA 3-11 A. Frotis de sangre periférica en el que es posible distinguir un acantocito (flecha). B. Detalle de una imagen de
microscopía electrónica de barrido en la que se distinguen dos acantocitos. En ambos casos, es fácil distinguirlos de los eritrocitos
normales por sus características proyecciones espinosas. (Por cortesía de: http://quimicaviva.qb.fcen.uba.ar/Actualizaciones/fotos.htm.)
Las neuroacantocitosis constituyen un grupo raro de enfermedades hereditarias que cursa con acantocitosis junto
con una degeneración progresiva del sistema nervioso. El mecanismo por el que las alteraciones genéticas
identificadas en estos trastornos se manifiestan en clínica no es del todo conocido. No obstante, se piensa que
comparten una fisiopatología común. En dos de estas afecciones, la abetalipoproteinemia y la hipolipoproteinemia,
la alteración del metabolismo de las lipoproteínas produce un incremento en las membranas celulares del cociente
esfingolípidos/glicerofosfolípidos. Este hallazgo podría conducir a una disminución de la fluidez de la membrana
eritrocitaria (y la consiguiente transformación acantocítica) por un mecanismo no dependiente del colesterol, ya que
los esfingolípidos, que poseen grupos acilos largos y saturados, tienen una mayor capacidad de empaquetamiento.
Por su parte, esta alteración de la composición lipídica en las membranas de las neuronas podría explicar las
manifestaciones neurológicas que caracterizan a estas enfermedades.
En algunos casos, la alteración de la composición lipídica se extiende también a las membranas intracelulares, lo
cual también puede afectar a su fluidez y permeabilidad. En los pacientes con hepatocarcinoma, se ha descrito un
incremento en la concentración de colesterol en la membrana mitocondrial externa de las células del tumor. Esta
alteración afecta a la fluidez y permeabilidad de la mitocondria, y eso dificulta la acción de los quimioterápicos que
139
inducen apoptosis por vía mitocondrial. La mitocondria es un orgánulo que contiene moléculas promotoras de la
muerte celular programa o apoptosis (v. capítulo 11). No obstante, para que estos factores pongan en marcha los
mecanismos de muerte celular, tienen que formarse poros en su membrana. En este proceso se basa el efecto citotóxico
de algunos fármacos antitumorales. Se piensa que el incremento de los niveles de colesterol, al alterar la fluidez y
permeabilidad de la membrana mitocondrial externa, podría impedir una respuesta adecuada al tratamiento
quimioterápico. De acuerdo con estos resultados, fármacos como las estatinas, que inhiben la síntesis endógena de
colesterol, podrían sensibilizar a las células tumorales frente a los tratamientos de quimioterapia que inducen
apoptosis por vía mitocondrial.
Asimetría de la bicapa lipídica
La asimetría es la otra gran propiedad de la bicapa lipídica: las dos hemimembranas poseen una composición
sustancialmente distinta (fig. 3-12). En la hemimembrana E se encuentran la mayoría de los fosfolípidos que tienen
colina en su grupo de cabeza (fosfatidilcolina y esfingomielina), así como la mayoría de los glucolípidos. Por su parte,
en la hemimembrana P residen las moléculas lipídicas que contienen un grupo amino terminal (cefalina y
fosfatidilserina).
FIGURA 3-12 Distribución asimétrica de los lípidos de la membrana. El símbolo (−) representa la carga neta negativa de la
fosfatidilserina. (Ilustración de: E. Maldonado.)
Es necesario puntualizar que esta desigual distribución no es absoluta. Esto quiere decir, por ejemplo, que la mayor
parte del fosfatidilinositol presente en la membrana se encuentra en la monocapa interna, salvo una pequeña cantidad
localizada en la otra hemimembrana.
La asimetría de la bicapa lipídica se remonta a la síntesis de sus componentes y es necesario mantenerla, ya que un
cambio en la distribución de lípidos tiene notables consecuencias biológicas (fig. 3-13).
140
FIGURA 3-13 Biosíntesis de los componentes lipídicos de la membrana y origen de la asimetría que presenta la bicapa. A la izquierda
se representa el flujo de membrana que tiene lugar entre el retículo endoplasmático (RE) y el aparato de Golgi hasta la superficie
celular. A la derecha se refleja el papel de los translocadores de lípidos en el mantenimiento de dicha asimetría. (Ilustración de: E. Maldonado.)
Los glicerofosfolípidos son sintetizados en la hemimembrana P (en contacto con el citoplasma) del retículo
endoplasmático liso (REL). La distribución equitativa entre las dos monocapas de los lípidos formados se produce por
difusión transversa, pero este proceso es extremadamente lento a temperaturas fisiológicas. Este hecho se resuelve
mediante la catálisis enzimática del movimiento flip-flop, llevada a cabo por una familia de proteínas conocidas como
translocasas. Una translocasa presente tanto en el REL como en la membrana plasmática, denominada escramblasa,
equilibra ambas membranas en pocos minutos mediante la catálisis de la difusión transversal inespecífica de
glicerofosfolípidos. Sin embargo, aún se necesitan más ajustes, como concentrar la fosfatidilserina y la
fosfatidiletanolamina en la hemimembrana P. De esta tarea se encarga la flipasa, otra translocasa que cataliza el
transporte de estos fosfolípidos de la monocapa E a la P en la membrana plasmática.
Por otro lado, los esfingolípidos son sintetizados en la hemimembrana que está en contacto con el lumen del REL y
el aparato de Golgi y, cuando se incorporan en la membrana plasmática, permanecen en dicha monocapa (en contacto,
en este caso, con el medio extracelular). Por lo tanto, no es necesario ningún tipo de translocación.
Los resultados de esta asimetría son varios. En primer lugar, la concentración de la fosfatidilserina en la cara P
ocasiona una marcada diferencia de carga eléctrica entre los dos lados de la bicapa y convierte a la membrana celular
en una especie de condensador eléctrico. Por otro lado, los grupos carbohidrato de los osoesfingolípidos sobresalen de la
superficie de la monocapa externa, donde están vinculados a procesos de reconocimiento celular. Por su parte, las
cefalinas, las fosfatidilserinas y los fosfatidilinositoles son más importantes en la monocapa interna, donde se
encuentran comprometidos en la transducción o transmisión de señales de la membrana plasmática al interior celular
(v. capítulo 13).
En los animales, la localización de la fosfatidilserina determina la viabilidad celular. Cuando una célula entra en
apoptosis, este lípido deja de quedar retenido en la monocapa interna y su exposición al exterior celular es una señal
de aviso para que los macrófagos lleven a cabo la fagocitosis. Esta misma alteración de la asimetría de la membrana es
la que se produce en las plaquetas activadas para que puedan desempeñar su papel en el proceso de la coagulación.
141
La exposición de fosfatidilserina en la monocapa externa es esencial para la activación de la vía terminal de la
coagulación de la sangre. Durante la activación plaquetaria, se piensa que la elevación de la concentración intracelular
de Ca conduce a una mayor activación de la escramblasa frente a la flipasa, de manera que, nuevamente, la
2+
hemimembrana E expone cantidades sobreelevadas de fosfatidilserina. En el síndrome de Scott, un trastorno
hemorrágico heredable, el defecto de la escramblasa se traduce en una deficiente externalización de fosfatidilserina.
142
Balsas lipídicas
Hace unos años se descubrió que, además de la asimetría existente entre las dos monocapas, los lípidos de membrana
ni siquiera se distribuyen de manera homogénea dentro de una misma hoja. Esta afirmación se traduce en la
existencia de unas regiones transitorias, de 50-70 nm de diámetro, conocidas como microdominios o balsas lipídicas
(fig. 3-14), en las que la acumulación de determinados lípidos de membrana retiene proteínas implicadas en la
señalización celular. Las balsas lipídicas se identificaron por primera vez en la hemimembrana E, pero ya se han
detectado también en la monocapa interna.
FIGURA 3-14 Representación de un microdominio o balsa lipídica en la bicapa. GPI, glucosilfosfatidilinositol. (Ilustración de: E. Maldonado.)
Los microdominios situados en la hemimembrana E se caracterizan por el predominio de esfingolípidos y
colesterol. Los esfingolípidos, que contienen normalmente ácidos grasos largos y saturados, pueden forman
agrupaciones compactas y relativamente duraderas mediante fuerzas de Van der Waals. En cambio, los
glicerofosfolípidos, dotados habitualmente de un ácido graso insaturado y otro saturado de menor longitud de
cadena, son incapaces de interaccionar de un modo tan estable y quedan fuera de los microdominios. De esta manera,
los esfingolípidos, asociados al anillo esteroide del colesterol, se empaquetan temporalmente en estos agregados, de
modo que parecen comportarse como una balsa fluida, pero ordenada, que navega a la deriva por un mar lipídico en
desorden.
Asimismo, en estas formaciones quedan «secuestradas» proteínas implicadas en la señalización celular. La clave de
este hecho reside en las desmesuradas ventajas que los microdominios aportan a la hora de asegurar que una célula se
comunique eficazmente con su medio. En muchos procesos de bioseñalización tiene lugar la colisión de proteínas de
membrana, por lo que su presencia en una misma balsa, o en balsas separadas que tiendan a fusionarse, aumenta
143
notablemente la probabilidad de interacción. Los receptores inmunológicos, de neurotransmisión y de los factores de
crecimiento parecen estar localizados principalmente en estos microdominios, así como algunas proteínas implicadas
en el inicio de cascadas de señalización, como receptores de tipo quinasa y proteínas G.
El descubrimiento de tantas intervenciones fisiológicas viene acompañado, como era de esperar, por nuevas
conexiones clínicas. Por ejemplo, se ha visto que el procesamiento patológico de la proteína precursora del amiloide,
implicada en la enfermedad de Alzheimer, podría ocurrir en regiones de la membrana con un alto contenido en
colesterol (como las balsas lipídicas). Además, por la elevada concentración de osoesfingolípidos y glucoproteínas,
también se piensa que las balsas lipídicas podrían servir como sitios de reconocimiento para la entrada de ciertos
patógenos y toxinas bacterianas.
Otro tipo de proteína presente en muchas ocasiones en los microdominios de la hemimembrana P es la caveolina.
Cuando esta proteína reviste internamente la bicapa, promueve la formación de unas vesículas de 50-80 nm de
diámetro denominadas cavéolas (pequeñas cuevas, v. capítulo 5). En el microscopio electrónico, las cavéolas pueden
visualizarse en la membrana de varios tipos celulares como unas invaginaciones con forma de matraz. Las caveolinas
son proteínas de unión al colesterol y se considera que las cavéolas son especializaciones de las balsas lipídicas
caracterizadas por la presencia de caveolina. Se dice que la caveolina es una proteína de andamiaje, que colabora en el
reclutamiento de proteínas de señalización, y ha sido implicada en diversas funciones celulares.
144
El mosaico proteico
Las proteínas, normalmente, suponen un 50% de la masa de la membrana. Si la bicapa lipídica constituye el armazón
básico de la membrana celular, son las proteínas embebidas en la misma las biomoléculas encargadas de conferirle su
funcionalidad. Sin estas, la membrana quedaría reducida a una mera barrera semipermeable de función delimitadora,
la célula estaría a merced de los gradientes electroquímicos y las diferencias funcionales entre un tipo celular y otro
resultarían considerablemente mermadas. La cantidad y el tipo de proteínas de membrana son muy variables, y el
estudio de este perfil en un determinado tipo celular puede aportar información acerca de su papel biológico.
Proteínas de membrana
Una de las propiedades de las proteínas es que poseen un grado de solubilidad muy variable que depende,
fundamentalmente, de la naturaleza polar o apolar de las cadenas laterales de sus aminoácidos. En consecuencia, estas
moléculas ofrecen grandes diferencias de afinidad por el interior hidrófobo de la bicapa lipídica y, por lo tanto,
diferencias en la manera en que se asocian a las membranas biológicas.
El criterio clásico de clasificación de las proteínas de membrana se basa en el tipo de procedimientos empleados
para su aislamiento, así como en el estado de integridad en que queda la membrana tras hacerlo (fig. 3-15). De forma
indirecta, este hecho experimental refleja el grado de interacción proteína-lípido y, por extensión, el modo en que la
proteína se asocia a la membrana. Según dicho criterio, es posible distinguir tres categorías de proteínas de
membrana: integrales, periféricas y ancladas a lípidos.
145
FIGURA 3-15 Criterio clásico de clasificación de las proteínas de membrana. A. Las proteínas intrínsecas pueden ser extraídas con
detergentes, que forman en torno a las mismas unas agrupaciones semejantes a las micelas. B. Las proteínas extrínsecas pueden ser
extraídas con soluciones de baja o alta fuerza iónica o un pH extremo. C. Por poseer propiedades de extracción intermedias entre
estos dos grupos, las proteínas ancladas a lípidos se catalogan aparte. GPI, glucosilfosfatidilinositol. (Ilustración de: E. Maldonado.)
Proteínas integrales o intrínsecas de membrana
Las proteínas integrales de membrana se encuentran íntimamente unidas a la bicapa lipídica. Por lo tanto, son
difíciles de aislar por técnicas estándar de purificación, y para solubilizarlas y extraerlas es necesario utilizar
procedimientos drásticos que destruyan totalmente la estructura de la membrana, como es la aplicación de
detergentes, desnaturalizantes y disolventes orgánicosEste hecho experimental se apoya en la afirmación de que las
proteínas integrales se encuentran embebidas en la membrana plasmática.
Al igual que los lípidos, las proteínas integrales son moléculas anfipáticas. Poseen una o varias porciones
hidrófobas que se sitúan en el interior de la membrana y se asocian a las colas hidrocarbonadas de los fosfolípidos, así
como una o más regiones hidrófilas que se hallan en la interfaz agua-lípido.
Dentro de este grupo de proteínas, unas pocas, denominadas «monotópicas» (fig. 3-16, 4), atraviesan la membrana
parcialmente (y están incrustadas solo en la monocapa interna o la externa). No obstante, la mayoría de ellas son
proteínas transmembrana, que cruzan toda la bicapa. Estas proteínas pueden ser de paso único o múltiple (v. fig. 3-16, 1
y 2), en función de las veces que atraviesen la membrana, y estar constituidas por una o varias cadenas polipeptídicas.
FIGURA 3-16 Proteínas de membrana. 1, proteína integral de paso único con un segmento transmembrana en hélice α; 2, proteína
integral de paso múltiple con varios segmentos transmembrana en hélice α; 3, proteína integral de paso múltiple con varias hebras β
enrolladas (barril β); 4, proteína integral monotópica; 5, proteína anclada a lípido unida por un enlace covalente a un ácido graso de la
bicapa o a un grupo isoprenoide; 6, proteína anclada a lípido unido por un oligosacárido a una molécula de glucosilfosfatidilinositol
(GPI) de la hemimembrana E; y 7, proteína periférica de membrana, unida por fuerzas débiles (electrostáticas o puentes de hidrógeno)
a una proteína integral (o a un lípido de la bicapa). (Ilustración de: E. Maldonado.)
La manera en que una proteína integral se asocia a la bicapa depende de su secuencia de aminoácidos y la
optimización de los puentes de hidrógeno con las moléculas que la rodean (esto es, en el ambiente anfipático de la
membrana). El enlace peptídico es polar, por lo que los grupos -CO- y -NH- de los enlaces peptídicos embebidos en la
membrana (que no pueden interactuar con el medio acuoso) tienden formar puentes de hidrógeno entre sí. El número
de puentes de hidrógeno se maximiza en determinadas conformaciones o motivos estructurales.
146
Un motivo estructural común a muchas proteínas transmembrana son las hélices α de unos 20-30 residuos de
aminoácidos apolares. Estos segmentos o dominios transmembrana, que se asocian firmemente a la bicapa mediante
interacciones hidrófobas (gracias a sus aminoácidos apolares) y se estabilizan mediante puentes de hidrógeno
intracatenarios, anclan las proteínas a la bicapa y permiten que actúen como canales, transportadores o receptores de
membrana.
Otro motivo estructural frecuente es el barril β o barril cerrado, en el que decenas de segmentos transmembrana en
configuración β delimitan un poro o canal que permite un intercambio inespecífico de pequeñas moléculas
hidrosolubles (v. fig. 3-16, 3). Esta organización es la que se observa en las porinas, proteínas abundantes en la
membrana externa de las mitocondrias, los cloroplastos y algunas bacterias. Muchos de los antibacterianos que ejercen
su efecto biológico en el interior celular atraviesan la pared bacteriana por los huecos grandes y no selectivos de sus
porinas. Es más, uno de los mecanismos por los que las bacterias pueden adquirir resistencia a los antibióticos es la
mutación de los genes de las porinas, cuyas nuevas conformaciones dificultan o impiden la entrada del fármaco
antibacteriano.
Proteínas periféricas o extrínsecas de membrana
Las proteínas periféricas de membrana se encuentran débilmente asociadas a la bicapa lipídica, o a las proteínas
integrales. Por lo tanto, pueden extraerse con facilidad mediante procedimientos suaves que rompan dichas fuerzas
sin comprometer la estructura de la membrana, como la exposición a soluciones de muy alta o baja fuerza iónica o de
un pH extremo. A diferencia de las proteínas integrales, las proteínas periféricas no se encuentran embebidas en la
membrana. Más bien, se encuentran adheridas a sus caras externa o interna mediante uniones no covalentes (v. fig. 316, 7). Se localizan sobre todo en la superficie de la hemimembrana P y suelen ser enzimas o proteínas de anclaje de la
membrana al citoesqueleto.
Proteínas de membrana ancladas a lípidos
Es posible distinguir un tercer grupo de proteínas de membrana, las ancladas a lípidos, que, por sus características
intermedias a las dos clases de proteínas de membrana convencionales, son catalogadas aparte. Estas proteínas se
encuentran unidas covalentemente a moléculas de lípido constituyentes de la bicapa. De una forma parecida a las
proteínas intrínsecas, están claramente incluidas en la membrana. Por lo tanto, el tratamiento con agentes suaves de
extracción, válidos para las proteínas extrínsecas, no tiene ningún efecto si no se rompe antes el enlace covalente que
establece la asociación proteína-lípido. Por otro lado, y en consonancia con las proteínas periféricas, el grado de
interacción de estas proteínas con los lípidos es más débil que el de las proteínas integrales con la bicapa, y queda
restringido a una sola hemimembrana, aquella de la que forme parte el lípido.
147
Las proteínas ancladas a lípidos, encontradas tanto en la monocapa interna como en la externa, se asocian a la
membrana celular por medio de varios mecanismos.
Las proteínas localizadas en la hemimembrana P (v. fig. 3-16, 5) se anclan a la bicapa mediante cadenas
hidrocarbonadas de ácidos grasos saturados o grupos isoprenoides. En el primero de los casos, la proteína se traduce
en el citosol y después se une a un ácido graso saturado ya incluido en la bicapa. En el segundo de los casos, la
proteína sufre la adición de un grupo isoprenoide como modificación postraduccional, previa inserción en la bicapa.
Muchas de estas proteínas actúan como enzimas. Tal es el caso de la proteína Ras (codificada por un protooncogén)
cuya mutación puede estar involucrada en la transformación maligna de una célula (v. capítulo 16).
Las proteínas ancladas a lípidos son escasas en la hemimembrana E y se fijan a la bicapa a través de un derivado
glucosilado del fosfatidilinositol: el glucosilfosfatidilinositol (GPI) (v. fig. 3-16, 6). Son traducidas en el retículo
endoplasmático rugoso (RER) en forma de proteínas integrales de paso único y, tras perder su segmento
transmembrana, se unen por un enlace covalente al GPI, sintetizado en la cara luminal del retículo endoplasmático
(cara E). Esto es posible porque, como ya se precisó en el apartado correspondiente a los lípidos de membrana, la
asimetría de la bicapa no es absoluta y el fosfatidilinositol se encuentra mayoritariamente en la monocapa interna,
pero también (tal y como puede comprobarse ahora) en la externa.
Las proteínas de unión a GPI son especialmente frecuentes en las zonas de la membrana implicadas en el tráfico de
sustancias, tales como las balsas lipídicas, donde permanecen agrupadas para desempeñar sus funciones.
La hemoglobinuria paroxística nocturna es una enfermedad poco frecuente en la cual un clon de células
progenitoras hematopoyéticas adquiere la mutación del gen PIGA (phosphatidylinositol glycan anchor biosynthesis, class
A). Este gen está implicado en la síntesis de GPI, de modo que las células sanguíneas que procedan de este clon
aberrante carecerán de proteínas ancladas a GPI en la superficie de su membrana. Se ha detectado la desaparición de
más de 20 proteínas de membrana ancladas a GPI, entre las que se incluyen moléculas de adhesión, enzimas y
receptores implicados en la respuesta inmunitaria y la coagulación sanguínea. Cabe destacar las proteínas DAF (decay
accelerating factor) y MIRL (membrane inhibitor of reactive lysis). Su función es la de proteger a los eritrocitos de la
hemólisis mediada por el sistema del complemento.
Decíamos que las proteínas del complemento eran capaces de destruir patógenos formando poros en su superficie
que bloqueen el autosellado de la membrana. El problema es que, una vez activado, el complemento no distingue
entre las membranas de los patógenos y la de las células sanguíneas. Las proteínas DAF y MIRL impiden que esos
poros se formen en la membrana del eritrocito. Por lo tanto, su déficit favorece que los pacientes presenten crisis
hemolíticas intravasculares secundarias a la activación del complemento, que típicamente se dan durante la noche (el
complemento se activa por la noche porque el pH de la sangre se vuelve más ácido). Por ello, a la mañana siguiente,
estos pacientes presentan crisis o paroxismos de hemoglobinuria (hemoglobina en la orina), que se describe como una
orina teñida del color del refresco de cola. Esta es la manifestación más característica de esta enfermedad (de ahí su
148
nombre), pero no la única ni la más grave. El déficit de otras proteínas ancladas a GPI deriva en anemia, trombosis
venosa, infecciones recurrentes y aparición de neoplasias. La esperanza de vida de los pacientes con hemoglobinuria
paroxística nocturna es inferior al 60% a los 15 años del diagnóstico.
Estudio de la membrana del eritrocito
La membrana plasmática del eritrocito humano es un buen modelo para explicar los distintos grupos de proteínas de
membrana, debido a la abundante información existente. En parte, este hecho se debe a: 1) la facilidad con la que se
pueden obtener muestras de sangre periférica, y 2) lo sencillo que es llegar a preparaciones de membrana purificadas
(conocidas como fantasmas de eritrocito).
En los mamíferos, las células de la línea roja tienen forma de disco bicóncavo de unos 7 μm de diámetro y carecen
de núcleo, mitocondrias y sistema endomembranoso. Esto les permite albergar la mayor cantidad posible de
hemoglobina, pigmento sanguíneo encargado del transporte de oxígeno a los tejidos. Por ello, su membrana
plasmática puede ser purificada sin contaminación con membranas internas. Basta con provocar hemólisis a través de
la exposición a un medio hipotónico y retirar la hemoglobina y otras proteínas citosólicas para obtener estos fantasmas
de eritrocito. Estos fragmentos de membrana se caracterizan por tener unos 10 nm de grosor y una razón
proteína/lípido de 1,14. Se ha descubierto que esta proporción puede extenderse a la mayoría de los tipos celulares,
por lo que se trata de un modelo de estudio que, además de ser fácil de obtener, resulta representativo.
El estudio de las proteínas de la membrana del eritrocito mediante electroforesis (una técnica utilizada para la
separación de proteínas por aplicación de un campo eléctrico; v. capítulo 2) genera un patrón de unas 15 bandas
principales, cada una de las cuales se corresponde con una proteína.
Proteínas integrales de la membrana del eritrocito
La glucoforina (fig. 3-17, A) es una proteína integral de paso único (de 131 aa y 30 kDa). Se orienta en la bicapa de
manera que su extremo hidrófilo carboxi-terminal (C-terminal) se encuentra en la cara citosólica de la membrana,
mientras que el amino-terminal (N-terminal) se halla en la cara extracelular. El segmento externo está muy
glucosilado, con oligosacáridos unidos a oxígeno y nitrógeno que suponen cerca del 60% de la masa total de la
glucoproteína. Los abundantes residuos de ácido siálico le confieren a la superficie celular una gran carga negativa.
Debido a la existencia de estos grupos aniónicos en su superficie, los eritrocitos se repelen, reduciendo de esta forma
la viscosidad de la sangre.
149
FIGURA 3-17 A. Dibujo de la membrana plasmática del eritrocito en el que se representan sus dos proteínas integrales más
abundantes (la glucoforina y la proteína banda 3) asociadas a otras proteínas componentes del citoesqueleto. B. Esquema explicativo
del papel de la proteína banda 3, junto a la anhidrasa carbónica, en el transporte del CO2 procedente de los tejidos periféricos hacia los
pulmones. (Ilustración de: E. Maldonado.)
La proteína banda 3 (v. fig. 3-17, A) es una proteína integral de paso múltiple formada por dos cadenas
polipeptídicas o monómeros (de 929 aa y 100 kDa). En este caso, los dominios N- y C-terminales están orientados
hacia la cara citosólica de la membrana, y su cara externa presenta oligosacáridos unidos a nitrógeno. Esta proteína
lleva a cabo el contratransporte de los iones cloruro y bicarbonato (Cl y HCO ), por lo que también es conocida como
−
3−
intercambiador aniónico (AE, del inglés anion exchanger). Para llevar a cabo esta función, los dímeros de banda 3 se
presentan emparejados en forma de tetrámeros. En los glóbulos rojos, el intercambiador aniónico, junto a la enzima
anhidrasa carbónica, permite maximizar la cantidad de CO que la sangre puede transportar hasta los pulmones. De
2
150
hecho, del total de CO que viaja en sangre, el sistema banda 3-anhidrasa carbónica es responsable de casi un 70% (v.
2
fig. 3-17, B).
Proteínas periféricas de la membrana del eritrocito
Muchas de las proteínas de la membrana eritrocitaria distinguibles en el patrón de bandas generado en la
electroforesis son proteínas periféricas adosadas a la superficie de la hemimembrana P. Interactúan entre sí para
formar una malla o enrejado que recubre la cara citosólica de la bicapa y son las responsables de la estabilidad y las
propiedades viscoelásticas del eritrocito. Entre ellas, cabe destacar la espectrina, la anquirina, la proteína banda 4.1, la
banda 4.2, la aducina, la actina y la tropomiosina.
La más abundante es la espectrina (fig. 3-18, A). Se trata de una proteína fibrilar compuesta por dos tipos distintos
de subunidades, α y β (cada una de aproximadamente 250 kDa). Estas subunidades forman heterodímeros que se
enrollan de forma antiparalela y se disponen formando una doble hélice visible al microscopio electrónico de
transmisión. A su vez, dos de estos dímeros se asocian por sus extremos para formar tetrámeros (αβ) , y son estos los
2
que se organizan como una red (v. fig. 3-18, B). Son las cuerdas de la malla, de una longitud de 200 nm. Su posición se
estabiliza por ambos extremos, donde cinco o seis tetrámeros confluyen en unos complejos supramoleculares
equiparables a los nudos de la red. En estos, las colas de espectrina están unidas entre sí por filamentos cortos de actina
y una molécula de tropomiosina, proteína banda 4.1 y aducina.
FIGURA 3-18 A. Dibujo de la estructura de una molécula de espectrina. Se trata de una proteína heterodimérica, formada por dos
cadenas polipeptídicas (α y β). A la izquierda, se encuentran los residuos fosforilados por los que los dímeros se asocian para formar
tetrámeros. B. Representación del citoesqueleto del eritrocito humano. Está formado por una red de tetrámeros (αβ)2 de espectrina
enlazados por complejos de unión, en los que intervienen algunas proteínas periféricas de la membrana de los eritrocitos. (Ilustración de: E.
Maldonado.)
El resultado es un retículo de citoesqueleto deformable y elástico, que permite a los eritrocitos resistir el estrés
mecánico que supone el paso por los estrechos capilares sanguíneos. Sin embargo, aún queda por anclar el
151
citoesqueleto a la membrana. En este caso, los principales puntos de fijación son las dos proteínas integrales de
membrana estudiadas: la proteína banda 3 y la glucoforina, que se asocian a la espectrina a través de la anquirina y la
proteína banda 4.1, respectivamente. Otras proteínas, como la banda 4.2, que media la unión anquirina-banda 3,
actúan como elementos moduladores. En todas las células eucariotas existe una red de citoesqueleto constituida por
otras proteínas de morfología semejante a las presentes en la membrana del eritrocito, pero cuya disposición y función
no son tan conocidas. De forma general, esta red citosólica recibe el nombre de córtex o corteza celular.
Defectos en las proteínas de la membrana eritrocitaria: membranopatías
congénitas
Las membranopatías congénitas constituyen un grupo de enfermedades genéticas en las que el defecto de alguna de
las proteínas de membrana estudiadas en el eritrocito hace que estos sean más frágiles y se destruyan precozmente. El
resultado es un síndrome anémico del que, por su fisiopatología, se dice que posee características hemolíticas. Las
principales membranopatías congénitas son la esferocitosis y la eliptocitosis hereditarias.
La esferocitosis hereditaria o enfermedad de Minkowski-Chauffard se caracteriza por la presencia de eritrocitos
esféricos o esferocitos (fig. 3-19). Es la membranopatía congénita más frecuente, con una incidencia de 1 caso por cada
2.000 a 10.000 nacimientos. Su patrón de herencia es, generalmente, autosómico dominante. El principal mecanismo
molecular que subyace a la patología es el déficit o alteración de la anquirina, la espectrina α o la espectrina β (3565%), seguido de las proteínas banda 3 o banda 4.2 (15-30%). La transformación esferocítica es el resultado de un fallo
en el anclaje del citoesqueleto a la membrana del eritrocito.
152
FIGURA 3-19 A. Frotis de sangre periférica de un paciente con esferocitosis hereditaria en el que es posible distinguir varios
esferocitos (flechas). B. Imagen de microscopía electrónica de barrido que muestra un par de esferocitos (flechas) junto a eritrocitos
normales. (Por cortesía de http://quimicaviva.qb.fcen.uba.ar/Actualizaciones/fotos.htm.)
Los esferocitos no son tan deformables y elásticos como los eritrocitos normales y son más frágiles desde el punto
de vista mecánico y osmótico. En consecuencia, pueden quedar retenidos en la microcirculación del bazo, donde
acaban sufriendo lisis o fagocitosis por los macrófagos esplénicos. De este hecho fisiopatológico se deduce que el bazo
tiene una función fundamental en la aparición de anemia hemolítica en esta enfermedad. Por ese motivo, la
esplenectomía (extirpación del bazo) constituye el tratamiento de elección en las formas graves de la enfermedad.
Este procedimiento quirúrgico consigue una reducción de la hemólisis que provoca la anemia, a pesar de la
persistencia de la morfología esferocítica y la fragilidad de las células.
La eliptocitosis u ovalocitosis hereditaria se caracteriza por la presencia de eritrocitos elípticos o eliptocitos. Es
una membranopatía menos frecuente que la esferocitosis y se hereda de acuerdo a un patrón autosómico dominante.
Los defectos más habituales son anomalías en la espectrina α, la espectrina β y la proteína banda 4.1. El resultado es
que no se pueden formar tetrámeros de espectrina. Los glóbulos rojos de estos pacientes pueden seguir deformándose
para pasar por los capilares. Sin embargo, pierden la elasticidad que les confiere el citoesqueleto y no pueden
recuperar su morfología normal, transformándose en eliptocitos. Es por eso por lo que hasta el 90% de los pacientes
carecen de manifestaciones clínicas (nótese la diferencia conceptual entre la fluidez de la membrana, su
153
deformabilidad y su elasticidad). En aquellos casos en los que aparece anemia hemolítica, la esplenectomía puede ser
parcialmente eficaz. Una variante asintomática de la eliptocitosis hereditaria es la ovalocitosis del sureste asiático
(mutación polimórfica de la banda 3), que está presente hasta en el 7% de determinadas poblaciones porque confiere
resistencia al paludismo.
Fluidez y asimetría del mosaico proteico
La fluidez y la asimetría son dos propiedades de la bicapa lipídica extensibles al mosaico proteico. En primer lugar,
las proteínas de membrana presentan cierto grado de movilidad.
Algunas proteínas de membrana pueden realizar movimientos de rotación en torno a un eje mayor y difundir
lateralmente a una velocidad muy inferior a la de los lípidos, dado su mayor peso molecular. En cambio, no
experimentan movimiento flip-flop. Además, muestran una orientación asimétrica. Las proteínas integrales
monotópicas y todas las extrínsecas y las ancladas a lípidos se encuentran solo en una de las dos hemimembranas:
aquella en la que ejercen su función. Las proteínas integrales transmembrana, por su parte, están embebidas en la
bicapa, pero dispuestas asimétricamente. Esto quiere decir que, dada una proteína determinada, sus dominios se
encuentran incluidos en la membrana siempre de la misma forma y sus extremos N-terminal y C-terminal están
dirigidos siempre hacia la misma cara celular.
Sin embargo, el asunto no queda ahí, ya que, además de la asimetría observada entre las dos monocapas, el mosaico
proteico ni siquiera se distribuye de manera uniformemente fluida y aleatoria dentro de una misma hoja. En parte,
esta afirmación se relaciona con las balsas lipídicas ya comentadas, pero la existencia de las mismas no es el único
indicio de una restricción de la movilidad proteica. El desplazamiento lateral de muchas proteínas se encuentra
limitado a una o varias áreas específicas de la membrana, donde realizan su función. A estas áreas se las llama
dominios de membrana y dan lugar a la polarización celular. Ejemplos de células polarizadas hay muchos. Suelen
ser tipos celulares altamente especializados, pero tal vez los más significativos sean: 1) las células epiteliales (con sus
superficies apical, basal y lateral); 2) las neuronas (separadas en soma y axón), y 3) el espermatozoide (dividido en tres
dominios correspondientes al acrosoma, la región posterior de la cabeza y la cola). Si los distintos mecanismos
encargados de mantener semejante polarización desaparecieran, la función de estas células se vería seriamente
comprometida.
Son varios los mecanismos responsables de la restricción de la movilidad de las proteínas de membrana. Uno de los
más simples consiste en la formación de agregados de proteínas en complejos grandes que se mueven lentamente
(como los conexones en las células animales). Otro, ya explicado en la membrana del eritrocito, consiste en limitar el
desplazamiento de aquellas proteínas integrales que actúen como puntos de fijación del citoesqueleto a la membrana
(como la banda 3 y la glucoforina).
154
En muchas ocasiones, se establecen auténticas barreras de separación entre dos dominios diferentes. Los dos
mecanismos más extendidos son: el empleo de cinturones de microfilamentos de actina (como es el caso de la
separación del soma y el axón neuronales) y las uniones ocluyentes, barreras herméticas que están presentes en el
perímetro apicolateral de la mayoría de las células epiteliales (v. capítulo 6).
155
La cubierta de glúcidos: estructura y función del glucocáliz
Las membranas biológicas poseen pequeñas fracciones de glúcidos, que pueden llegar a representar un 2-10% de la
masa total. Generalmente, se presentan en forma de oligosacáridos unidos por un enlace covalente a lípidos y
proteínas de la membrana, dando lugar a glucolípidos (como los osoesfingolípidos y el GPI) y glucoproteínas,
respectivamente. Con independencia del número y la longitud de la cadena de monosacáridos, su orientación en la
membrana plasmática es marcadamente asimétrica: están dirigidas hacia el exterior celular y, de esta manera, todas
las células eucariotas se encuentran recubiertas por una envoltura de residuos de azúcar conocida como glucocáliz
(fig. 3-20).
FIGURA 3-20 Esquema simplificado del glucocáliz. (Ilustración de: E. Maldonado.)
Esta cubierta de azúcares contiene, además, glucoproteínas y proteoglucanos que, después de haber sido secretados
al exterior celular, quedan adsorbidos en su superficie. De esta manera, una de las posibles funciones del glucocáliz es
proteger a la célula de agresiones químicas y mecánicas, manteniendo los cuerpos extraños y la superficie de otras
células a la suficiente distancia como para evitar interacciones no deseadas.
Una función importante del glucocáliz es el reconocimiento celular. Los oligosacáridos son moléculas que pueden
adquirir composiciones, longitudes y configuraciones tridimensionales muy diversas, lineales o ramificadas. Esta
variabilidad los convierte en compuestos idóneos para la comunicación celular. El papel que desempeñan en este
sentido se traduce en dos grandes funciones: 1) el reconocimiento y fijación de moléculas libres en el medio
extracelular, y 2) la adhesión específica entre dos células y de una célula con la matriz.
Reconocimiento y fijación de moléculas libres en el medio extracelular
Las cadenas glucídicas expuestas en el glucocáliz son responsables del reconocimiento y la fijación selectivos de
ligandos, y de la incorporación de elementos externos por endocitosis.
156
En la mayoría de los tipos celulares, el glucocáliz forma una fina cubierta solo apreciable con el microscopio
electrónico, pero en algunas células de epitelios absorbentes, como los enterocitos, está muy desarrollado. Hacia la luz
del tubo digestivo, las células del epitelio intestinal poseen numerosas prolongaciones citoplasmáticas denominadas
«microvellosidades» (v. capítulo 6), cubiertas por un glucocáliz de 150 nm de grosor que puede distinguirse con el
microscopio óptico mediante tinciones específicas para hidratos de carbono (como la tinción PAS). El glucocáliz del
enterocito posee enzimas que participan en las últimas etapas de la degradación de polisacáridos y proteínas
(disacaridasas y oligopeptidasas, respectivamente). Además, la célula dispone en su membrana de mecanismos de
transporte para absorber los nutrientes obtenidos tras la digestión.
Sin embargo, las porciones glucídicas de los glucolípidos y las glucoproteínas de la membrana también suponen el
mecanismo de adhesión y entrada utilizado por patógenos intracelulares y toxinas bacterianas. Un conocido ejemplo
es el del virus de la gripe. Este virus expresa en su superficie la hemaglutinina, una glucoproteína que se fija a los
residuos terminales de ácido siálico del glucocáliz de las células de la mucosa respiratoria, a las que infecta
introduciéndose por endocitosis (v. capítulo 5).
Adhesión específica entre dos células y de una célula con la matriz
La exposición de residuos de azúcar en la superficie celular desempeña un papel fundamental en el reconocimiento y
adhesión célula-célula y célula-matriz, efectuadas por glucoproteínas transmembrana (v. capítulo 6). Ciertos
glucolípidos y glucoproteínas del glucocáliz permiten el agrupamiento de células durante el desarrollo embrionario
para generar los tejidos y órganos de un individuo, intervienen en la coagulación de la sangre y tienen propiedades
inmunológicas, ya que contienen muchos antígenos celulares que causan el rechazo de los trasplantes y definen los
grupos sanguíneos.
Otro ejemplo bien conocido del papel del glucocáliz en la adhesión célula-célula es la interacción entre el
espermatozoide y el ovocito en la fecundación. La zona pelúcida es una capa de glucoproteínas que rodea al ovocito y
facilita la unión del espermatozoide y la reacción acrosómica previas a la fusión de sus membranas. La base molecular
de la unión entre los dos gametos reside en una única glucoproteína de la zona pelúcida, la ZP3. Los oligosacáridos
ligados a esta proteína son reconocidos por receptores no identificados presentes en la membrana plasmática del
espermatozoide, y su unión desencadena cambios intracelulares que conducen a la reacción acrosómica. Por lo
mismo, la destrucción de la ZP3 después de la entrada de un solo gameto masculino impide el reconocimiento
específico entre el cigoto y los otros espermatozoides circundantes, lo que impide la polispermia.
Uno de los principales cambios que experimenta una célula tumoral está relacionado con la modificación del
glucocáliz: desaparecen algunos antígenos, que dejan de expresarse, y aparecen otros nuevos. Por lo tanto, pueden
producirse cambios en la expresión de las moléculas implicadas en la adhesión célula-célula y célula-matriz, que le
157
permitan abandonar el tumor en el que se originó y migrar hacia los vasos para invadir otros tejidos. Este fenómeno,
por el que un foco canceroso se propaga a un órgano distinto de aquel en el que se originó, se denomina metástasis, y
constituye un factor de mal pronóstico en los pacientes con cáncer (v. capítulo 16). Además, se piensa que estas
metástasis no aparecen en cualquier región, sino que exhiben preferencia o tropismo por determinados tejidos. Por
ello, las células cancerosas sacan un doble partido de las propiedades del glucocáliz en el reconocimiento celular, ya
que, por un lado, son capaces de ignorar las interacciones que las mantienen retenidas en el tumor primario y crecer
en un segundo foco con células extrañas; pero, por otro lado, las emplean para su diseminación más o menos selectiva
por el organismo.
Lecturas recomendadas
Bevers EM, Comfurius P, Zwaal RF. Lipid translocation across the plasma membrane of mammalian cells. Biochim Biophys Acta.
1999;1439:317–330.
Boon JM, Smith BD. Chemical control of phospholipid distribution across bilayer membranas. Med Res Rev. 2002;22:251–281.
Bretscher MS. Membrane structure: some general principles. Science. 1973;181:622–629.
Edidin M. Lipids on the frontier: a century of cell-membrane bilayers. Nat Rev Mol Cell Biol. 2003;4:414–418.
Gorter E, Grendel F. On bimolecular layers of lipoids on the chromocytes of the blood. J Exp Med. 1925;41(4):439–443.
Le Maire M, Champeil P. Interaction of membrane proteins and lipids with solubilizing detergents. Biochim Biophys Acta. 2003;1612:1–
40.
McConnell HM, Radhakrishnan A. Condensed complexes of cholesterol and phospholipids. Biochim Biophys Acta. 2003;1610:159–173.
Robertson JD. Origin of the unit membrane concept. Protoplasma. 1967;63(1):218–245.
Rodgers W, Glaser M. Distribution of proteins and lipids in the erythrocyte membrane. Biochemistry. 1993;32:12591–12598.
Singer SJ, Nicolson GL. The fluid mosaic model of the structure of cell membranes. Science. 1972;175:720–731.
158
Determinación de la temperatura de fusión de las membranas
biológicas
La temperatura de fusión (Tm, del inglés temperature of melting) de una membrana es aquella a la cual experimenta
una transición de fase gel a líquido y viceversa. Sin embargo, ¿cómo es posible determinar la Tm de una membrana?
Un método muy difundido es la calorimetría diferencial de barrido (DSC, del inglés differential scanning calorimetry).
Mediante esta técnica es posible monitorizar las fluctuaciones del estado físico de la membrana en función de la
temperatura. El procedimiento consiste en colocar una muestra de membrana en un calorímetro (una cámara cerrada
herméticamente) y someterla a un incremento de temperatura dentro de un rango prefijado de valores. Para
determinar la cantidad de calor que absorbe la membrana, se calienta de forma paralela un blanco o muestra de
referencia, que suele corresponderse con el líquido en el que la membrana se encuentra suspendida. Ambas muestras
deben mantenerse en cada momento a la misma temperatura, pero calentar la muestra de membrana exige una
cantidad adicional de calor. Precisamente, dicha cantidad adicional es atribuible a la membrana en suspensión. En
esencia, la técnica de DSC permite monitorizar la absorción diferencial de una muestra de membrana frente a una
referencia y estudiar sus variaciones de fase haciendo un barrido por un intervalo de temperaturas.
Problema
Imagínese que pretende determinar el punto de fusión de una muestra de membrana extraída de una población de
células humanas en cultivo. Para ello, utiliza la técnica de DSC. Los datos que obtiene son procesados por un software
específico y representados en una gráfica (figs. e3-1 y e3-2), donde el eje de ordenadas se corresponde con la absorción
diferencial de calor y el eje de abscisas con la temperatura.
FIGURA E3-1
159
FIGURA E3-2
160
Cuestiones
1. Acerca de esta muestra de membrana, ¿cuál es su valor de Tm correspondiente? ¿Es un valor normal? Razone su
respuesta.
2. Una parte de las células de las que se extrajeron las muestras (población A) fue traspasada a dos medios de cultivo
distintos, enriquecidos con mezclas de ácidos grasos de composición diferente. Empleando de nuevo el método DSC,
se analizaron las muestras de membrana de la población B (curva azul) y C (curva roja) y se obtuvieron los siguientes
resultados (v. fig. e3-2). ¿Qué tipo de ácidos grasos se añadieron a cada medio de cultivo? Razone su respuesta.
3. A continuación, su interés se orienta a la fluidez de la membrana. Divide cada una de las poblaciones celulares de
los apartados a y b en tres grupos. El primer grupo de tres placas será colocado en una cámara a 16 ºC; el segundo
grupo, en un incubador a 37 ºC, y el tercero, en una estufa a 45 ºC. Suponga que todas las poblaciones sobreviven el
choque inicial de temperatura. En el peor de los casos, las células experimentarán un cese inicial de crecimiento y
reajustarán la composición lipídica de sus membranas para adaptarse al ambiente. Apoyándose en supuestos teóricos,
¿en qué casos se registraría un cese inicial de crecimiento? ¿Cuáles serían todas las posibles variaciones esperables en
la composición lipídica de las membranas?
4. Finalmente, se propone estudiar la susceptibilidad de las distintas poblaciones de células a una infección viral. En
su ensayo, dispone de un virus modificado genéticamente, en cuyo genoma se ha introducido la proteína fluorescente
GFP (green fluorescent protein). De esta manera, las células infectadas expresarán GFP y podrán ser identificadas al
microscopio de fluorescencia como células verdes. Para evitar que el factor temperatura interfiera en la capacidad
infectiva del virus, primero incuba una placa de cada grupo a 37 °C durante 24 h. Transcurrido este tiempo, inocula el
medio con la misma dosis del virus. Al final del experimento, encuentra que el porcentaje de células verdes es mayor
en la población C. Adicionalmente, observa que la infectividad del virus y la capacidad de ensamblaje de su progenie
cae drásticamente en las tres poblaciones si, las 24 h previas a la exposición al virus, se añade al medio de cultivo el
fármaco ciclodextrina. Es probable que desconozca la acción farmacológica de la ciclodextrina. Antes de buscarla,
interprete los resultados del experimento anterior e intente explicarlos vinculándolos con las variaciones en la
composición lipídica de las membranas de las tres poblaciones de células. Finalmente, encuentre el efecto biológico de
la ciclodextrina y confirme sus sospechas o continúe cavilando para clarificar la respuesta.
5. Una de las manifestaciones atribuibles al efecto citopático del virus que está utilizando es la formación de sincitios
por fusión de las células infectadas. Curiosamente, al final del experimento encuentra que, en la placa del grupo B, el
número de sincitios es significativamente mayor que en las otras poblaciones. ¿Se le ocurre alguna explicación lógica
para este hallazgo relacionada con la alteración de la composición lipídica de la membrana y sus propiedades?
161
Respuestas
1. La Tm de la muestra de membrana es de aproximadamente 28 °C. Por encima de los 28 °C, el equilibrio entre las
fases gel y líquido se desplazará hacia la derecha (> 50% en estado fluido). Por debajo de dicha temperatura, se
desplazará a la izquierda (< 50% en estado fluido). Una Tm de 28 °C es completamente normal. La temperatura
fisiológica del cuerpo humano y de los incubadores estándar ronda los 37 °C. Este valor se encuentra por encima de la
Tm de la membrana de las células del estudio. Por tanto, existirá una predominancia de la fase líquida respecto al
estado cristalino, situación óptima para el funcionamiento de las membranas biológicas.
2. Población B (curva azul). La curva DSC se encuentra desplazada a la izquierda (dentro de un rango de
temperaturas más bajas) y el valor de Tm ronda los 15 °C. La membrana de esta población de células se encuentra
enriquecida en ácidos grasos insaturados y/o de cadena corta (pe, ácido oleico).Población C (curva roja). La curva DSC
se encuentra desplazada a la derecha (dentro de un rango de temperaturas más altas) y el valor de Tm ronda los 45
°C. La membrana de esta población de células se encuentra enriquecida en ácidos grasos saturados y/o de cadena
larga (p.ej., ácido esteárico).
3. Grupo 1 (cámara a 16 °C). En este grupo, la población B de células se encuentra a una temperatura ligeramente
superior a su valor de Tm (15 °C), por lo que se ve favorecida respecto al resto de las poblaciones, cuya membrana se
encontrará predominantemente en fase gel. El reajuste de la composición de sus membranas se conseguiría, en teoría,
mediante adaptaciones que desciendan su valor de Tm. Entre ellas, cabe destacar la incorporación de ácidos grasos
insaturados y/o de cadena corta y de colesterol, que dificulta su congelación por debajo de cualquier punto fusión
dado.
Grupo 2 (incubador a 37 °C). En este grupo, la población A de células se encuentra a una temperatura superior a su
valor de Tm (28 °C), por lo que se ve favorecida respecto al resto de las poblaciones, cuya membrana se
encontrará con una fluidez excesiva (población B) o predominantemente en fase gel (población C). El reajuste de
la composición de sus membranas se conseguiría, en teoría, mediante adaptaciones que cambien su valor de Tm.
Entre ellas, cabe destacar:
Población C: la Tm debe descender mediante la incorporación de ácidos grasos insaturados y/o de cadena corta y de
colesterol, que dificulta su congelación por debajo de cualquier punto fusión dado.
Población B: la Tm debe subir mediante la incorporación de ácidos grasos saturados y/o de cadena larga y de
colesterol, que disminuye el grado de fluidez de la membrana por encima de cualquier punto de fusión dado (por
ese motivo, se dice que el colesterol tiene un efecto paradójico sobre la fluidez de la membrana).
Grupo 3 (estufa a 45 °C). En este grupo, la población C de células se encuentra justo a su Tm, por lo que se ve
favorecida respecto al resto de las poblaciones, cuya membrana se encontrará en un estado de fluidez excesiva. El
reajuste de la composición de sus membranas se conseguiría, en teoría, mediante adaptaciones que aumenten su
162
valor de Tm. Entre ellas, cabe destacar la incorporación de ácidos grasos saturados y/o de cadena larga y de
colesterol, que disminuye el grado de fluidez de la membrana por encima de cualquier punto de fusión dado.
4. A 37 °C, la membrana de las células de la población C (enriquecida en ácido esteárico) se encuentra
predominantemente en estado de gel o cristalino. En las 24 h preinfección, las células han puesto en marcha los
mecanismos que les permiten descender el valor de Tm de sus membranas, entre ellos, la elevación de la
concentración de colesterol. Por tanto, las membranas de esta población presentarán una alta cantidad de ácidos
grasos saturados y colesterol y una membrana poco o nada fluida (y, desde luego, mucho menos fluida que el resto de
las poblaciones). A partir de aquí, el estudiante debería ser capaz de integrar los conocimientos en el capítulo 3.
Recordemos que muchos patógenos intracelulares y toxinas bacterianas emplean como puntos de entrada y salida
aquellas regiones de membrana caracterizadas por un mayor grado de orden. En este caso, es posible que la escasa o
nula fluidez de la membrana de las células de la población C a 37 °C favorezca la interacción de las proteínas de
adhesión virales y la superficie de las células y el ensamblaje de la progenie viral en el lado citoplasmático de la
membrana. Finalmente, el colesterol debe poseer un papel clave en este proceso, ya que la incubación de las células
con ciclodextrina (un compuesto que extrae el colesterol de la membrana) anula la infectividad del virus y su
capacidad de ensamblaje en las tres poblaciones.
5. La formación de sincitios se da por la fusión de la membrana de las células infectadas, en las que se expresan
proteínas virales que permiten dicho proceso. No obstante, es posible que la dinámica de membranas se vea
favorecida (o incluso posibilitada por su estado de fluidez: cuanto más fluida se encuentre una membrana, la fusión
de las mismas se producirá con una mayor facilidad). Posiblemente, esta explicación permitiría comprender que la
formación de sincitios sea mayor en la población B, aquella que a 37 °C presenta una fluidez exagerada de sus
membranas, ricas en ácidos grasos insaturados y/o de cadena corta.
Preguntas de autoevaluación
1. La contribución de Davson y Danielli al conocimiento de la estructura de la membrana plasmática fue:
a. Establecieron el modelo del mosaico fluido.
b. Establecieron el modelo sándwich, proponiendo la existencia de una bicapa lipídica cubierta por una capa de
proteínas.
c. Propusieron que la membrana estaba formada por una monocapa de fosfolípidos.
d. Desarrollaron la técnica de la criofractura.
e. Ninguna de las anteriores.
Respuesta correcta: b
163
2. Acerca de los esfingolípidos de la membrana celular:
a. Derivan del precursor común ácido fosfatídico.
b. Las esfingomielinas se encuentran implicadas en procesos de reconocimiento celular.
c. La pérdida progresiva de la mielina, propia de la esclerosis múltiple, conduce a la interrupción total o parcial de
la transmisión nerviosa.
d. Tanto los cerebrósidos como los gangliósidos carecen de carga neta a pH fisiológico y, por ello, son conocidos
como glucolípidos neutros.
e. Ninguna de las afirmaciones anteriores es correcta.
Respuesta correcta: c.
3. Acerca de la fluidez de la membrana:
a. Es una propiedad de la membrana que depende solo de la temperatura.
b. La predominancia de lípidos con ácidos grasos insaturados se traduce en valores de Tm altos.
c. En los eritrocitos, la alteración de la fluidez de la membrana puede producir fenotipos patológicos.
d. Las respuestas b y c son ciertas.
e. Ninguna de las afirmaciones anteriores es correcta.
Respuesta correcta: c.
4. Una de las siguientes proposiciones sobre la fluidez de la membrana es falsa:
a. El valor de Tm de una membrana fosfolipídica pura rica en ácido esteárico (CH (CH ) COOH) será mayor que la
3
2 16
de aquella cuyo ácido graso predominante sea el ácido oleico (CH (CH ) CH = CH(CH ) COOH).
3
2 7
2 7
b. Se dice que el colesterol tiene un efecto paradójico en la fluidez de la membrana.
c. El riesgo de anemia hemolítica en pacientes con acantocitosis es alto como consecuencia de una fluidez exagerada
de la membrana de los glóbulos rojos.
d. Una variación patológica de esta propiedad no tendría que afectar solamente a la membrana plasmática, sino que
puede involucrar a las membranas intracelulares.
e. En pacientes con cirrosis avanzada se pueden encontrar eritrocitos con un alto porcentaje de colesterol en sus
membranas.
Respuesta correcta: c.
5. En relación con la asimetría de la membrana, señale la opción falsa:
164
a. La hemimembrana P se caracteriza por la presencia de fosfatidilinositol, fosfatidiletanolamina y fosfatidilserina.
b. Se caracterizada por una distribución absolutamente desigual de los lípidos en la bicapa. Es imposible encontrar,
por ejemplo, fosfatidilinositol en la hemimembra E.
c. Se establece durante la propia síntesis de nuevos componentes de membrana en el RE.
d. Si esta distribución asimétrica se altera en la membrana de una plaqueta, su superficie adquiere propiedades
procoagulantes.
e. La fracción glucídica queda situada fundamentalmente hacia el exterior celular.
Respuesta correcta: b.
6. En relación con la asimetría de la bicapa lipídica, señale la opción verdadera:
a. Es absoluta.
b. Una célula que expone fosfatidilserina en la hemimembrana E es una célula apoptótica.
c. El fosfatidilinositol, la fosfatidilcolina y la fosfatidilserina predominan en la hemimembrana E.
d. La actividad de las translocasas afecta a glicerofosfolípidos y esfingolípidos.
e. Las respuestas b y d son verdaderas.
Respuesta correcta: b.
7. Las balsas lipídicas:
a. Se caracterizan por ser áreas de membrana ricas en triglicéridos y colesterol.
b. Se descubrieron en la hemimembrana E, pero aún no han sido observadas en la monocapa interna.
c. Las cavéolas constituyen un tipo de balsa lipídica característica de neuronas.
d. Muchos receptores de membrana parecen estar retenidos de forma temporal en estos microdominios, por lo que
se asocian a una gran variedad de procesos normales y patológicos.
e. Ninguna de las afirmaciones anteriores es correcta.
Respuesta correcta: d.
8. El criterio clásico de clasificación de las proteínas de membrana se basa en:
a. La severidad del procedimiento de extracción empleado: depende de lo fácil o difícil que resulte su aislamiento.
b. El grosor de banda correspondiente a cada proteína en una electroforesis.
c. Su carga neta a pH fisiológico.
165
d. El número de subunidades que posean: las hay de dos, de tres, etc.
e. Nada de lo anterior.
Respuesta correcta: a.
9. La proteína banda 3:
a. Es un intercambiador iónico que, en concreto, permite la salida unidireccional de bicarbonato del eritrocito,
acoplando a este proceso la entrada del ión sodio.
b. Se trata de una proteína de cotransporte paralelo (simporte) de bicarbonato y cloruro.
c. Es una proteína con dos cadenas polipeptídicas que, en la membrana del eritrocito, se presenta formando
dímeros.
d. Por acción conjunta de la proteína banda 3 y la anhidrasa carbónica, la cantidad de dióxido de carbono que puede
transportar la sangre es menor.
e. No existe ninguna patología en la que se encuentre implicada, por lo que carece de interés clínico.
Respuesta correcta: c.
10. Señale la opción verdadera:
a. El término «dominio de membrana» hace alusión a regiones transitorias de 50-70 nm que se forman en la
membrana como consecuencia de una composición rica en fosfatidilcolina y colesterol.
b. La alteración del glucocáliz de una célula cancerosa es un evento característico en el progreso de un tumor y en el
desarrollo de metástasis.
c. A través de la neuraminidasa, el virus de la gripe es capaz de introducirse en una célula de la mucosa respiratoria
de un mamífero por endocitosis, previa adhesión a algún elemento del glucocáliz.
d. Las respuestas b y c son ciertas.
e. Ninguna de las afirmaciones anteriores es correcta.
Respuesta correcta: b.
166
CAPÍTULO 4
167
Microtransporte a través de la membrana plasmática
Tarek Ajami
Diego Peñafiel
Estefanía Maldonado
Alfonso Calvo
Objetivos de aprendizaje
• Conocer los mecanismos de la difusión simple y el transporte facilitado a través de la membrana plasmática.
• Conocer los fundamentos del transporte activo, sus tipos y el funcionamiento de la bomba Na /K ATPasa.
+
+
• Relacionar la alteración de los mecanismos de transporte con el desarrollo de algunas enfermedades.
• Comprender los fundamentos que determinan la génesis del potencial de membrana en reposo.
• Conocer las distintas fases del potencial de acción y cómo se propaga.
168
Introducción
Como se ha estudiado en el capítulo anterior, la membrana constituye una barrera semipermeable que permite el paso
selectivo de sustancias necesarias para el metabolismo celular. Existe un gran trasiego de sustancias que pasan de un
lado a otro de la membrana, como iones, agua y macromoléculas de diverso tamaño. Algunas sustancias pueden
atravesar la membrana por difusión simple o a través de transportadores específicos, un tipo de transporte que no
implica una deformación visible de la membrana; en este caso, hablamos de procesos de microtransporte. En cambio,
existe otro tipo de transporte que implica una deformación de la membrana plasmática visible al microscopio; todos
estos procesos pertenecerían al macrotransporte. En el presente capítulo, nos ocuparemos de los procesos del
microtransporte, mientras que en el capítulo 5 se analizarán los fenómenos de macrotransporte.
Las moléculas que van a intervenir en el microtransporte se pueden clasificar en:
• Sustancias hidrófobas: aquellas que son liposolubles y repelen el agua.
• Sustancias hidrófilas: aquellas que son hidrosolubles.
Las sustancias liposolubles pueden atravesar la membrana plasmática sin necesidad de que medie un transportador
específico, mientras que las hidrófilas precisan de transportadores, que forman canales por los cuales pueden pasar
dichas sustancias, atravesando así la bicapa lipídica.
El microtransporte a través de la membrana se puede clasificar en dos tipos:
• Transporte pasivo, que no precisa de energía para el transporte y en el que la dirección de este siempre está a
favor del gradiente de concentración.
• Transporte activo, que requiere de energía para intercambiar los solutos, ya que la dirección del transporte va en
contra del gradiente.
169
Transporte pasivo
En este tipo de transporte las sustancias se mueven espontáneamente a través de la membrana, impulsadas por
fuerzas de gradiente de concentración, o gradiente electroquímico. El transporte pasivo se denomina difusión simple
cuando es un movimiento que no implica proteínas especializadas de membrana, sino solo una difusión a través de la
doble capa lipídica. En cambio, lo llamamos difusión facilitada cuando está facilitado por proteínas de membrana
(canales o proteínas transportadoras).
Difusión simple
Como hemos indicado, la difusión simple es el transporte a favor de gradiente desde el lado de la membrana donde
hay una alta concentración de soluto, hacia el lado con una baja concentración, sin necesidad de ningún transportador
en la membrana. Algunas sustancias como los gases (O , N , CO ), las moléculas hidrófobas (benceno) y las sustancias
2
2
2
hidrófilas polares, pero no cargadas (el agua y los alcoholes), presentan liposolubilidad, por lo que pueden pasar
directamente a través de la doble capa lipídica y difundir a través de la membrana. En cambio, las sustancias polares
grandes no cargadas (como la glucosa) y los iones son incapaces de difundir entre las moléculas lipídicas (fig. 4-1). Por
lo tanto, la difusión simple es un proceso relevante para el transporte de moléculas pequeñas y poco polares. La
difusión simple tiende al equilibrio de concentraciones; es decir, una vez que se igualan las concentraciones a ambos
lados de la membrana, la difusión se para. Como se explicará después, el gradiente de concentración es la fuerza
impulsora del transporte. Varios son los factores que afectan a la difusión simple:
• Tamaño del soluto: cuanto más pequeño es el soluto, más fácil será atravesar la membrana y penetrar entre las
moléculas de fosfolípidos.
• Polaridad: debido a la composición lipídica de la membrana plasmática, las moléculas no polares se disuelven
con más rapidez en la fase hidrófoba y, así, pueden atravesar más rápidamente la doble capa de lípidos, mientras
que las moléculas polares son repelidas.
• Liposolubilidad: se mide por el cociente de reparto K , que corresponde al cociente entre la solubilidad del soluto
r
en aceite y su correspondiente solubilidad en agua. Cuanto más liposoluble sea el soluto, mayor será el cociente
de reparto. La permeabilidad de la membrana plasmática a una molécula aumenta paralelamente a su cociente de
reparto (fig. 4-2).
• Gradiente de concentración: el gradiente de concentración mide la diferencia de concentración entre los dos lados
separados por la membrana plasmática. Se refiere a la fuerza impulsora de la difusión, de forma que,
lógicamente, cuanto más grande es el gradiente, mayor es la difusión.
170
• Carga: las sustancias cargadas tienen una mayor dificultad a la hora de penetrar en la fase hidrófoba de la bicapa
lipídica. Por esta razón, en los ácidos y bases débiles, las formas no disociadas difunden con más facilidad.
FIGURA 4-1 Permeabilidad relativa de la membrana plasmática a diferentes moléculas.
FIGURA 4-2 Representación del cociente de reparto de algunas moléculas frente a su permeabilidad. Obsérvese que los solutos que
poseen un similar cociente de reparto no son igualmente permeables debido a la diferencia de tamaño.
La permeabilidad de una sustancia es un parámetro determinado experimentalmente que depende de las
características del soluto, además del espesor y la composición de la membrana. La permeabilidad es directamente
proporcional al cociente de reparto K : cuanto más liposoluble es la sustancia, más fácil es que difunda a través de la
r
membrana. La permeabilidad mide la velocidad a la que una sustancia atraviesa la membrana. En la tabla 4-1 se
muestra la permeabilidad para diferentes solutos.
Tabla 4-1
Permeabilidad (P) de la membrana plasmática para algunos solutos
Sustancia P (m/s)
H2 O
10-4
Urea
10-6
171
Cl–
10-6
K+
10-10
Na+
10-12
Como ya se ha apuntado en el capítulo anterior, la propia composición de la membrana plasmática desempeña
también un papel importante en la permeabilidad. Una alta proporción de colesterol confiere a la membrana una
menor permeabilidad y una mayor coherencia mecánica para que sea una barrera más eficaz. Por ejemplo, la
membrana de las células epiteliales de la rama ascendente del asa de Henle posee una composición con niveles
elevados de colesterol, lo que le confiere una impermeabilidad al agua fisiológicamente relevante en el proceso de
reabsorción renal.
Para comprender completamente el transporte de solutos a través de la membrana, necesitamos entender también
la difusión del agua; de hecho, entre las células, es la sustancia que más difunde entre el exterior y el interior celular.
En el caso del agua, su concentración a ambos lados de la membrana es esencialmente la misma y, al ser una molécula
sin carga, no se ve influida por el potencial de membrana. La difusión del agua a través de la membrana posee un
comportamiento diferente a la difusión simple de solutos, ya que aquella atraviesa la membrana en respuesta a una
diferencia en la concentración de solutos, difundiendo desde el lado de menor concentración de solutos al lado de
mayor concentración. Esta difusión del agua es lo que se conoce como ósmosis, que se define como el movimiento de
agua que se produce cuando hay un cambio de osmolaridad (osmolaridad = número de moles de solutos
total/volumen); es decir, cuando la concentración de solutos cambia a ambos lados de la membrana con el fin de
igualar la concentración en el líquido intra- y extracelular.
En la figura 4-3, se comparan la difusión simple y las ósmosis. Para entender las diferencias entre ambos procesos,
planteemos el siguiente experimento: supongamos que, en un tubo en forma de «U», se separan dos compartimentos
(A y B) mediante una membrana permeable a solutos. Si la concentración inicial de solutos en A es mayor que en B,
estos tenderán a pasar por difusión simple del compartimento A al B para igualar las concentraciones. Imaginemos
ahora que, entre los dos compartimentos, hay una membrana no permeable a solutos. En este caso, el agua pasará del
compartimento B al A, con el fin de igualar las concentraciones de soluto en ambos compartimentos. Por lo tanto,
podemos decir que la dirección del agua, debido al efecto osmótico, va desde el medio con una menor concentración
de solutos al de mayor concentración.
172
FIGURA 4-3 Diferencia entre difusión de solutos y ósmosis. A. En la difusión, los solutos son permeables a la membrana y se mueven
según el gradiente de concentración. B. En la ósmosis, la membrana no es permeable a los solutos y el agua se mueve desde el lado
con menos concentración de solutos al de mayor concentración, hasta igualar las concentraciones a ambos lados. La tendencia del
agua a difundir se contrarresta por la presión de la columna de agua. (Ilustración de: E. Maldonado.)
El movimiento del agua a través de la membrana está relacionado con la osmolaridad. La concentración de solutos
suele ser mayor en el interior celular que en el exterior, por lo que el agua tenderá a introducirse en la célula. Esto se
debe a que las células necesitan tener una gran cantidad de iones y macromoléculas en su interior, y tienden a ser
hipertónicas. La ósmosis tiene gran importancia fisiológica por los siguientes motivos:
• Cuando la concentración extracelular de solutos aumenta (p. ej., debido a una pérdida de agua, convirtiéndose en
una solución hipertónica), el agua difunde al exterior por ósmosis, haciendo que las células se deshidraten y
encojan, lo que altera su función.
• Cuando la concentración extracelular de solutos disminuye (p. ej., debido a dilución, convirtiéndose en una
solución hipotónica), el agua difunde osmóticamente hacia el interior de las células, haciendo que se hinchen y
pudiendo provocar así la rotura de la membrana y, por lo tanto, causando lisis celular (fig. 4-4).
173
FIGURA 4-4 Efecto de la diferencia de osmolaridad entre las células y el líquido extracelular. En soluciones hipertónicas (con mayor
osmolaridad que la que posee el interior celular), el agua sale de la célula por ósmosis y la célula se deshidrata. En soluciones
hipotónicas (con menor osmolaridad que la celular), hay una entrada de agua que hincha la célula y puede provocar lisis. En
soluciones isotónicas (de igual osmolaridad que la celular), no ocurre ninguno de estos efectos. (Ilustración de: E. Maldonado.)
El mecanismo por el cual las células solucionan el problema de la elevada osmolaridad es el bombeo hacia el
exterior de iones inorgánicos mediante transporte activo, reduciendo así la diferencia en la concentración de iones a
ambos lados de la membrana. Esta es la función principal de la bomba Na /K ATPasa, que se explicará más adelante.
+
+
Difusión facilitada
La membrana plasmática contiene proteínas integrales que permiten el paso de sustancias que no lo conseguirían (o lo
harían de modo extremadamente lento) por difusión simple. Las proteínas que se encargan de la difusión facilitada
pueden ser de dos tipos:
• Poros o canales de membrana: son canales cuyo interior es hidrófilo, permitiendo el paso de solutos sin que haya
un cambio de conformación en la proteína.
• Transportador proteico (o permeasas): poseen un lugar donde los solutos se unen a la proteína transportadora
(sin establecer enlaces covalentes), induciendo un cambio de conformación que permite el traslado de aquellos al
otro lado de la membrana.
Canales de membrana
Los canales de membrana (fig. 4-5) permiten el paso de moléculas de pequeño tamaño y carga apropiada. Su apertura
suele estar regulada, es decir, no se trata simplemente de poros a través de los cuales atraviesan indiscriminadamente
las moléculas a favor de gradiente. Se han descrito tres tipos de canales: canales iónicos, acuaporinas y porinas.
174
FIGURA 4-5 Canal de membrana (flecha). Los canales forman poros hidrófilos que permiten el flujo de sustancias que no pueden
atravesar la doble capa por difusión simple. (Ilustración de: E. Maldonado.)
Canales iónicos
Los canales iónicos llevan a cabo un transporte rápido de determinados iones. La estructura proteica del interior del
poro está formada por aminoácidos de cadena lateral hidrófila que permiten el paso selectivo de un soluto. De hecho,
existe una gran variedad de canales especializados en el transporte de determinados iones, como K , Na , Cl o Ca .
+
+
–
2+
Estos canales no siempre están abiertos, sino que son regulados por diferentes mecanismos que permiten o no su
apertura. La regulación de la apertura de los canales iónicos puede provenir de la unión de moléculas extracelulares o
de la activación de determinadas cascadas de señalización intracelulares. Existen muchos mecanismos de regulación
intracelular, entre los que destacan la unión de metabolitos y ligandos intracelulares (p. ej., AMPc), la fosforilación de
los canales o la endocitosis de los canales en vesículas (haciéndolos desaparecer así de la membrana).
Según el tipo de regulación, los canales iónicos se pueden dividir en distintos grupos:
• Canales mecanosensibles: operan por fuerzas mecánicas y abundan en los mecanorreceptores de la piel y en los
cilios de las células ciliadas del oído interno, entre otras localizaciones. El movimiento de los cilios induce un
cambio en el citoesqueleto de la célula, lo cual provoca un efecto de tracción mecánica sobre las compuertas del
canal, que regula la apertura o el cierre del mismo (fig. 4-6).
• Canales quimiosensibles: se regulan mediante la unión de un ligando al canal (que actúa a la vez como un
receptor) y son fundamentales en la transmisión sináptica, donde se denominan «canales ionótropos». Cuando se
une el ligando, los canales quimiosensibles cambian su conformación, haciendo que este se abra o se cierre,
175
controlando así el flujo de un ión específico (fig. 4-7). Por ejemplo, cuando la acetilcolina se une al sitio específico
en los canales de Na de la membrana de la célula postsináptica, estos se abren y permiten la entrada de dicho ión,
+
generando la despolarización de la membrana.
• Canales dependientes de voltaje: son esenciales en la transmisión y propagación de los potenciales de acción en
los axones de neuronas y células musculares. Cuando se produce un cambio en el potencial de membrana, se
altera la carga eléctrica de los aminoácidos de dichos canales, lo que se traduce en un cambio conformacional que
provoca la apertura de los mismos. La regulación de este tipo de canales se explica con más detenimiento en el
apartado «Importancia de los canales iónicos en la generación del potencial de membrana».
• Canales de las uniones de tipo gap: este tipo de estructuras, también conocidas con el nombre de «uniones en
hendidura» o «nexos», están formadas por numerosos canales y están implicadas en la comunicación intercelular,
pues permiten el paso de iones y macromoléculas (de peso molecular < 2.000 Da) entre dos células vecinas. La
estructura de las uniones de tipo gap se explica con mayor detalle en el capítulo 6. Este tipo de canales constituye
la unidad funcional de la sinapsis eléctrica, que es 1.000 veces más rápida que la química. Estas uniones abundan
en el tejido neuronal y en otros tejidos donde se precisa un rápido acoplamiento celular de tipo metabólico y
eléctrico, como en los cardiomiocitos del corazón, donde actúan para coordinar y sincronizar la contracción
muscular y la actividad eléctrica cardíaca.
176
FIGURA 4-6 Canales mecanosensibles. A. Imagen de microscopio electrónico de barrido de dos haces de cilios del oído medio.
(Procedente de Holt JR, Corey DP. Two mechanisms for transducer adaptacion in vertebrate hair cells. Proc Natl Acad Sci,
97(22):11730-5@2000 National Academy of Sciences, USA.) B. Representación esquemática de los cilios. La imagen aumentada
muestra la íntima relación entre los filamentos del citoesqueleto y los canales de membrana. Según la dirección de la oscilación de los
cilios, los filamentos se tensan o se relajan y, en consecuencia, los canales se abren o se cierran. (Ilustración de: E. Maldonado.)
FIGURA 4-7 Canales quimiosensibles. Estructura del canal de sodio regulado por el ligando acetilcolina (Ach). Este canal constituye un
receptor colinérgico nicotínico. La unión del ligando provoca la apertura del canal y el flujo de iones Na+. (Ilustración de: E. Maldonado.)
Muchas enfermedades se asocian a defectos en el funcionamiento de los canales iónicos, como la fibrosis quística
(alteración de canales de Cl ), algunos tipos de epilepsia (alteración de canales de Na y K ), enfermedades
–
+
177
+
cardiovasculares (alteraciones de canales de Ca ) y neuromusculares, como la enfermedad de Lambert-Eatons
+
(presencia de anticuerpos contra canales de Ca presinápticos) o la miastenia gravis (presencia de anticuerpos contra
+
canales de Na regulados por la acetilcolina en la unión neuromuscular).
+
Acuaporinas
A pesar de que la membrana puede tener cierta permeabilidad al agua, permitiendo que esta la atraviese mediante
difusión simple, varios estudios fisiológicos señalaron que, en algunos tejidos (como el túbulo renal, las glándulas
secretoras o los eritrocitos) la permeabilidad al agua es mucho mayor de lo que sería explicable por difusión simple.
Se dedujo, entonces, que tenía que haber canales especializados, selectivos para el paso del agua, que permitieran un
transporte regulable y controlado. Esta idea se comprobó con el descubrimiento, a cargo de Peter Agre y Roderick
Mackinnon (Premios Nobel de Química en 2003), de los canales de agua conocidos como acuaporinas (AQP), donde el
movimiento de agua se rige por el gradiente osmótico. Hoy en día, se sabe que ambos mecanismos (difusión simple a
través de la membrana y flujo a través las AQP), regulan el paso de moléculas de agua en las células (fig. 4-8).
FIGURA 4-8 Canal de agua. Obsérvese cómo las moléculas de agua se trasladan simultáneamente en cadena.
Es importante señalar que los dos mecanismos son diferentes desde el punto de vista biofísico. La difusión simple
es un proceso de movimiento bidireccional con baja capacidad, mientras que los canales de agua poseen una alta
capacidad y especificidad. Un aspecto importante de las AQP es que permiten el paso de agua, pero impiden el paso
de protones. Como se sabe, los protones existen en los fluidos en forma de ión hidronio (H O ); en los riñones, se
3
+
filtran cada día en el glomérulo y se reabsorben 180 l de agua en los conductos renales (de hecho, de no reabsorberse
moriríamos por deshidratación). La reabsorción de agua tiene lugar por medio de AQP, que no permiten el paso de
protones, ya que, si se reabsorbieran también estos, el cuerpo sufriría de acidosis.
178
Hasta hoy, se han identificado 13 acuaporinas (AQP0-AQP12) en diferentes tejidos. Se encuentran principalmente
en el riñón, siendo también abundantes en eritrocitos, epitelio intestinal, células gliales del cerebro, etc. Las AQP
forman un poro central a través del cual pasa la molécula de agua (fig. 4-9). El tipo más abundante de acuaporinas es
la AQP1. Se trata de un complejo tetramérico compuesto por cuatro canales de agua. Cada monómero consta de 6
hélices α transmembrana con una secuencia conservada de aminoácidos en tándem, la cual incluye secuencias
aminoacídicas «asparragina-prolina-alanina» (NPA) (v. fig. 4-9).
FIGURA 4-9 Acuaporinas. A. El dibujo superior demuestra la estructura abierta o lineal de la AQP1; consta de 6 hélices
transmembrana, con un tándem de aminoácidos conservados: el motivo NPA. El dibujo inferior muestra la forma de un canal plegado:
el poro se forma por la unión de los motivos NPA. B. Imagen de inmunohistoquímica para localizar AQP1 (en color marrón) en los
túbulos contorneados proximales del riñón.
Las AQP son canales esenciales para el intercambio de agua, la regulación osmótica del medio interno y la
absorción de agua a nivel intestinal y renal. En el riñón, el órgano encargado de la homeostasis hídrica, se expresan al
menos seis tipos de AQP. La AQP1 es muy abundante en la membrana del túbulo proximal, donde se reabsorbe gran
cantidad de agua filtrada en el glomérulo renal.
179
La AQP2, en cambio, es abundante en la membrana basolateral del conducto colector. Como todas las acuaporinas,
la AQP2 facilita el transporte y la reabsorción de agua; en este caso, lo hace en el último tramo de la nefrona, antes de
ser excretada como orina completa. La captación de dicha cantidad de agua (la denominada «oferta distal») depende
de la presencia (regulable) de los canales de AQP2 en la membrana apical, lo que depende a su vez de la acción de la
hormona antidiurética (ADH, del inglés antidiuretic hormone). La ADH es una hormona producida en los núcleos
supraóptico y paraventricular del hipotálamo. Esta hormona, conocida también como «vasopresina», se libera en la
hipófisis hacia el torrente sanguíneo y es reconocida por receptores presentes en la membrana basolateral de las
células de los conductos colectores, donde regula la absorción de agua procedente del filtrado glomerular. La
membrana apical de estas células es impermeable al agua en ausencia de ADH, pero la membrana basolateral es
siempre permeable. El receptor V2 de la ADH, situado en la membrana basolateral de los conductos colectores, se une
a la hormona y desencadena una respuesta intracelular que implica una elevación citoplasmática de AMPc. Esta
situación activa una cascada de señales intracelulares que dan lugar a la fusión de vesículas en cuya membrana estaba
«secuestrada» la AQP2, con la membrana apical de las células. Una vez que la AQP2 está en la membrana apical, esta
se vuelve permeable al agua y, por efecto osmótico, promueve el paso de agua desde la luz de los conductos
colectores hacia la sangre, lo que resulta en un aumento de la concentración de la orina. Una vez que el efecto de la
hormona ha terminado, las vesículas se vuelven a internalizar por endocitosis y la AQP2 vuelve a ser «secuestrada»
en el interior de la célula, restableciéndose así la impermeabilidad apical de la membrana (fig. 4-10). Cuando existe
una alteración en esa secuencia, se da un cuadro de diabetes insípida. Un tipo de diabetes insípida es la nefrógena,
que, si es congénita, aparece cuando se producen mutaciones en el gen que codifica para el receptor de la hormona
ADH. Esta enfermedad puede ser también adquirida como consecuencia de cualquier otra causa que perjudique la
regulación de AQP2. El cuadro general implica poliuria o exceso de orina muy diluida; de ahí proviene el nombre de
«insípida», a diferencia de la diabetes mellitus, donde la orina es «dulce» debido a la gran eliminación de glucosa.
FIGURA 4-10 Regulación del paso de agua a través de AQP2 en la membrana de las células epiteliales de los conductos colectores
renales mediante la hormona ADH (vasopresina). Esta hormona permite la fusión de vesículas citoplasmáticas en las que se mantenía
«secuestrada» AQP2, con la membrana plasmática, permitiendo así el flujo de agua.
Porinas
180
Las porinas se ubican en la membrana externa de las mitocondrias, los cloroplastos y de muchas bacterias.
Constituyen poros de gran tamaño formados por proteínas que atraviesan varias veces la membrana. El interior de
estos poros está formado por aminoácidos de cadena lateral hidrófila, mientras que la parte externa transmembrana
está constituida por aminoácidos no polares e interacciona con el interior hidrófobo de la membrana. Las porinas son
canales bastante inespecíficos que permiten el paso de solutos hidrófilos de hasta 5.000 Da (por lo tanto, de iones y de
algunas macromoléculas), cuya función en el paso de sustancias a través de la membrana mitocondrial externa se
explica en el capítulo 11.
Difusión facilitada por proteínas transportadoras
Muchas sustancias hidrófilas que no pueden atravesar la doble capa lipídica por difusión simple o por canales, lo
hacen por difusión facilitada (es decir, sin gasto energético) por medio de transportadores proteicos denominados
permeasas. El modelo de funcionamiento de estos transportadores se basa en que la proteína alterna entre dos
conformaciones, de modo que la unión del sustrato induce un cambio de conformación para que la sustancia a
transportar pase de un lado a otro de la membrana (fig. 4-11). El transporte mediante proteínas transportadoras se
caracteriza por lo siguiente:
• Especificidad de sustrato: cada transportador transporta únicamente una molécula o un grupo de moléculas de la
misma categoría (isómeros). El transporte implica la unión del sustrato a un lugar específico del transportador. La
especificidad se determina por el encaje preciso entre el soluto y el sitio específico para la proteína
transportadora.
• Reversibilidad según el gradiente: el transporte es bidireccional, de modo que la dirección se determina
dependiendo del gradiente de concentración a ambos lados de la membrana.
• Saturación: las proteínas que llevan a cabo el transporte se saturan cuando la concentración de solutos llega a un
nivel determinado.
• Inhibición competitiva: algunas sustancias que poseen analogía estructural con el soluto compiten por la unión a
la proteína transportadora.
181
FIGURA 4-11 Representación esquemática de un transportador de membrana. Los transportadores poseen dos conformaciones, una
abierta hacia el exterior celular y otra abierta hacia el interior, permitiendo así el paso de los solutos de un lado a otro de la membrana.
(Ilustración de: E. Maldonado.)
La cinética del transporte es diferente a la de la difusión simple o a la de los canales, ya que no es lineal, sino
hiperbólica (fig. 4-12); es decir, que cuando el número de solutos aumenta, la tasa de transporte lo hace también, hasta
llegar a un límite donde las permeasas se saturan y se mantiene en un nivel máximo y constante de transporte. Se
puede establecer, por lo tanto, una similitud entre las proteínas transportadoras y las enzimas, debido a las
características mencionadas anteriormente. En este sentido, los transportadores catalizan un proceso de transporte de
solutos de un lado a otro de la membrana, donde, primero, el sustrato (S) se une al sitio de unión específico de la
proteína (formando un complejo intermediario) y, finalmente, se libera el sustrato (que equivaldría al producto de la
reacción enzimática):
Como en cualquier reacción enzimática, el transporte se caracteriza por una velocidad máxima (V ) y una constante
máx
(K ), que corresponde a la concentración del sustrato en la que la tasa de la reacción llega a la mitad de su máxima
m
capacidad. La cinética del transporte se ajusta así a la ecuación de Michaelis-Menten:
K es un medidor de la afinidad que presenta el transportador por el sustrato: cuanto más pequeño sea el valor, más
m
afinidad tendrá para unirse a él.
182
FIGURA 4-12 Diferencia entre la cinética de la difusión simple (lineal) y de la difusión facilitada (hiperbólica). En la difusión simple, la
tasa de transporte aumenta en paralelo al aumento de la concentración del soluto, mientras que en la difusión facilitada la tasa llega a
una velocidad máxima.
Se puede establecer una clasificación de las permeasas (válida también para transportadores de tipo activo
indirecto, como se explicará más adelante) en función del modo en que se transportan los solutos (fig. 4-13):
• Transporte de tipo uniporte, que corresponde al transporte de un soluto, como ocurre con el transporte de
glucosa a través de GLUT (del inglés glucose transporter).
• Transporte de tipo acoplado (o cotransporte), donde se produce el transporte simultáneo de dos solutos. Este, a
su vez, puede ser:
○Simporte: los dos solutos se transportan en el mismo sentido. Un ejemplo de simporte es el transporte de
Na /glucosa, que se analizará más adelante.
+
○Antiporte: los dos solutos se transportan en sentidos opuestos. Un ejemplo de antiporte es el transporte de HCO
/Cl , que se produce en el intercambiador aniónico del eritrocito y que ya se estudió en el capítulo 3.
–
183
3–
FIGURA 4-13 Diferencia entre el uniporte y el transporte acoplado. A. El uniporte implica el transporte de una única sustancia. B. El
transporte acoplado implica el movimiento simultáneo de dos solutos; el movimiento puede ser en la misma dirección (simporte) o en
dirección opuesta (antiporte). (Ilustración de: E. Maldonado.)
Los transportadores de glucosa representan una clase paradigmática de transportadores de difusión facilitada por
permeasas. La glucosa es un sustrato metabólico de importancia capital en las células animales que, en gran medida,
se obtiene del exterior celular. Hay dos grandes familias de proteínas encargadas del transporte de glucosa: los
cotransportadores dependientes de Na y las proteínas facilitadoras de tipo uniporte.
+
Los cotransportadores dependientes de sodio (SGLT, del inglés sodium-glucose transporter) son sistemas de
transporte activo indirecto (o secundario) que aprovechan el gradiente de entrada del Na para introducir glucosa del
+
exterior en contra de su gradiente (se estudian con detenimiento en el apartado «Transporte activo indirecto»). Dicho
de otro modo, la incorporación de glucosa en contra de gradiente al interior celular depende de la energía de arrastre
del Na en favor de gradiente. Estos cotransportadores se encuentran en las membranas de las células epiteliales
+
polarizadas del intestino y los túbulos renales.
Las proteínas facilitadoras del uniporte de glucosa se denominan transportadores GLUT y realizan un transporte
pasivo de glucosa. En cuanto al modelo de función, la teoría más aceptada es la del modelo de alternancia de
conformación. El transportador solo tiene capacidad para transportar una molécula de glucosa en cada ciclo, y cada
transportador tiene dos conformaciones: una con el sitio de unión de glucosa expuesto al exterior, y otra con el sitio de
unión expuesto hacia el citosol. La unión de glucosa en el sitio específico provoca un cambio de conformación que
determina su transporte al interior y la liberación de la molécula de glucosa.
Hasta hoy, se han descrito 13 tipos de GLUT que se numeran según el orden cronológico de su descubrimiento.
Cada uno de estos transportadores está codificado por un gen independiente, y cada tipo de GLUT interviene de
modo distinto en el metabolismo de la glucosa. Esta diversidad viene determinada por el patrón de expresión tisular,
el nivel de especificidad del sustrato, la cinética del transporte y la regulación de la expresión en diferentes
condiciones fisiológicas. GLUT1, GLUT3 y GLUT4 tienen alta afinidad por la glucosa. Debido a que la constante de
Michaelis-Menten es menor que la concentración normal de glucosa, estos transportadores siempre funcionan con una
tasa próxima a la máxima velocidad. Así, el transporte de glucosa viene limitado por el nivel de expresión tisular. En
184
contraste, la tasa del transporte de glucosa mediada por GLUT2 (K = 17 mM) aumenta en paralelo con el aumento de
m
los niveles de la glucosa sanguínea (fig. 4-14).
FIGURA 4-14 Tasa de captación de glucosa en función de su concentración extracelular. Tanto GLUT1 como GLUT2 poseen una alta
tasa de transporte en comparación con la difusión simple. GLUT1 posee una mayor velocidad de transporte que GLUT2, pero también
se satura más rápidamente a concentraciones bajas de glucosa. La velocidad de transporte de GLUT2 es menor que la de GLUT1,
pero aumenta gradualmente con el aumento de la concentración de glucosa.
Los transportadores de alta afinidad se ubican en todos los tejidos, pero su expresión es elevada en células con
actividad glucolítica. Por el contrario, GLUT2 (transportador de baja afinidad) se encuentra en tejidos cuya función es
crítica en la homeostasis de la glucosa, como por ejemplo el hígado, las células β pancreáticas, el riñón y el intestino.
Debido a su elevada K , cuando la glucemia (nivel de glucosa en sangre) sube de 5 mM (nivel basal) a 10 mM, la tasa
m
de transporte de glucosa casi se duplica en células que expresan GLUT2, mientras que, en células con GLUT1, la tasa
aumenta ligeramente (v. fig. 4-14). Esto tiene una consecuencia fisiológica de gran importancia, ya que los tejidos que
expresan GLUT2 se encargan de almacenar el exceso de glucosa circulante (como es el caso del hígado) o detectar el
aumento de glucemia (como en las células β pancreáticas, que entonces liberan insulina) para disminuir la cantidad de
glucosa en sangre.
GLUT4 se expresa en el músculo esquelético y los adipocitos. Aunque tiene alta afinidad por la glucosa y funciona
a la máxima velocidad, la regulación de la captación de glucosa por GLUT4 viene dada por los niveles de
transportador presentes en la membrana plasmática, que están regulados por la acción de la insulina. Las células
musculares esqueléticas y los adipocitos responden a la insulina exponiendo el transportador GLUT4 en su membrana
plasmática, aumentando así la captación de la glucosa. Los transportadores GLUT4 se mantienen «secuestrados» en
vesículas del citoplasma celular en ausencia de insulina en sangre (un sistema parecido al de ADH/AQP2). Tras la
liberación de insulina (en situación de hiperglucemia) y su unión a receptores específicos en células de músculo
esquelético y adipocitos, se produce una fusión rápida de las vesículas que contienen GLUT4 con la membrana
plasmática, que expone dichos transportadores para que puedan introducir la glucosa. La importancia de este
fenómeno reside en que, tras la ingesta de alimentos, se reduce la hiperglucemia y la glucosa se almacena en estos
tejidos en forma de glucógeno (en el caso del músculo estriado) o triglicéridos (en el caso del tejido adiposo).
185
La disfunción de GLUT4 se asocia a la diabetes mellitus de tipo 2. A diferencia de la diabetes mellitus de tipo 1,
donde la hiperglucemia se origina normalmente por destrucción autoinmune de las células β del páncreas, con la
consiguiente falta de producción de insulina, en la diabetes mellitus de tipo 2, los niveles de insulina pueden ser
normales o incluso elevados. Este tipo de diabetes se produce porque las células musculares esqueléticas y del tejido
adiposo se vuelven resistentes al efecto de la insulina. En pacientes con este tipo de diabetes, la insulina no es capaz de
estimular la fusión de las vesículas citoplasmáticas que contienen GLUT-4, debido a que los receptores de insulina se
vuelven insensibles, lo que ocasiona hiperglucemia. Los mecanismos por medio de los cuales se desarrolla esta
resistencia no se conocen bien, pero están relacionados con alteraciones en el metabolismo y con una predisposición
genética. De hecho, la diabetes mellitus de tipo 2 se asocia a obesidad y sedentarismo, responsables de la alteración
metabólica que, al menos en gran medida, origina la resistencia a la acción de la insulina. Así, el consumo de una dieta
hipocalórica, junto con una disminución del peso y un aumento del nivel de ejercicio, pueden revertir los niveles
anormales de glucemia en un porcentaje elevado de dichos pacientes, sin necesidad de tomar ninguna medicación. En
este sentido, es interesante conocer que el ejercicio aumenta la expresión de transportadores GLUT4 en el músculo y
favorece la fusión de vesículas que contienen GLUT4 con la membrana plasmática, induciendo así la captación de la
glucosa.
GLUT1 desempeña un importante papel en la captación de glucosa en el cerebro. La glucosa es el nutriente
principal del cerebro y GLUT1 es el único vehículo por el que esta atraviesa la barrera hematoencefálica, ya que dicho
transportador se expresa en el endotelio de los capilares que forman esta barrera. De hecho, algunas mutaciones que
afectan al gen que codifica para GLUT1 perjudican seriamente la captación de glucosa. Tales mutaciones causan un
síndrome, descubierto en 1991, denominado síndrome de la deficiencia de GLUT1. El síndrome se caracteriza por
episodios epilépticos de convulsiones en recién nacidos y retraso mental y del desarrollo. Las manifestaciones clínicas
aparecen ya en la infancia, pues el cerebro en desarrollo tiene una gran demanda de glucosa. El diagnostico de esta
enfermedad se confirma mediante una punción lumbar y el análisis directo de la secuencia del gen GLUT1.
186
Transporte activo
Como ya se ha explicado, los transportadores facilitan el transporte pasivo de las moléculas a través de la bicapa
lipídica. Sin embargo, no siempre podemos contar con que vaya a existir un gradiente que garantice el transporte
pasivo. Es por esto que las células disponen de unas proteínas de membrana capaces de realizar su función en contra
del gradiente electroquímico de la membrana, en un proceso denominado transporte activo. Este transporte es
energéticamente desfavorable (endergónico) y, por ello, siempre va acoplado a reacciones que liberan la energía
requerida por el transportador para llevar a cabo el traslado del sustrato. Entre las distintas reacciones que
proporcionan energía están la hidrólisis de ATP, la oxidación de sustratos en la fosforilación oxidativa o la disipación
de un gradiente iónico que, en definitiva, también es muchas veces fruto de la hidrólisis de ATP, como se verá más
adelante.
El transporte activo es unidireccional (no cambia su sentido), mientras que la difusión pasiva, que depende del
gradiente electroquímico, irá en una dirección u otra (hacia el líquido extra- o intracelular) en función del valor neto
del gradiente. El transporte activo genera y mantiene un gradiente iónico que es la causa de la diferente concentración
iónica, necesaria para la vida, a cada lado de la membrana. Además, permite que la célula incorpore o elimine
sustancias independientemente de la concentración de las mismas; es decir, con independencia de si es o no un
proceso energéticamente favorable.
El transporte activo se puede clasificar en directo o indirecto, en función de la fuente de obtención de la energía que
necesita para ser puesto en funcionamiento. La hidrólisis del ATP está asociada al transporte activo directo, mientras
que la disipación de un gradiente iónico lo está con el transporte activo indirecto.
Transporte activo directo
Como hemos indicado, el transporte activo directo obtiene la energía que necesita de la hidrólisis de ATP. Existen
distintas ATPasas con capacidad para hidrolizar el ATP, que se exponen a continuación.
ATPasa P
La ATPasa P (del inglés phosphorylation) es una proteína integral de membrana que se fosforila reversiblemente por
ATP. Los distintos subtipos de ATPasa P se asemejan mucho en su secuencia de aminoácidos, en especial en aquellos
residuos próximos al aspartato, que es donde resultan fosforiladas. Es sobre este mismo residuo donde se produce la
inhibición de las ATPasas por el vanadato, un agente que inhibe todas las ATPasas de tipo P. Como posibles tipos de
ATPasas P en el ser humano encontramos la Na /K ATPasa, la Ca ATPasa, la H /K ATPasa y la H ATPasa. Todas
+
+
2+
187
+
+
+
ellas, a excepción de la H ATPasa, están formadas por cuatro subunidades, dos α y dos β. Las subunidades α son las
+
que, al ser fosforiladas, modifican su conformación para formar el canal de paso para los iones. A continuación,
comentaremos con mayor detenimiento el funcionamiento de la Na /K ATPasa y la Ca ATPasa.
+
+
2+
La Na /K ATPasa (también llamada «bomba Na /K ATPasa») es un transportador universal y ubicuo del cuerpo
+
+
+
+
humano, aunque su número varía en función del tipo celular. Esta ATPasa es responsable de que se mantengan las
diferencias en las concentraciones intra- y extracelulares de Na y K , lo cual es necesario para mantener el equilibrio
+
+
osmótico, establecer el potencial de membrana, propagar el impulso nervioso en células excitables y poder realizar el
cotransporte de algunos nutrientes junto con el Na (v. apartado «Transporte activo indirecto»). La hidrólisis de ATP
+
capacita el transporte de dos iones K hacia el líquido intracelular y de tres iones Na hacia el líquido extracelular, en
+
+
contra de gradiente. La Na /K ATPasa presenta dos conformaciones: E1 y E2. En la conformación E1, la proteína está
+
+
abierta hacia el interior celular y presenta afinidad por el Na , mientras que, en la conformación E2, donde se
+
encuentra abierta hacia el exterior, presenta gran afinidad por el K . En la figura 4-15 se muestra de un modo
+
secuencial el proceso de expulsión de Na y el de incorporación de K al interior celular en contra de gradiente. En
+
+
primer lugar, la unión de tres iones Na a la proteína en conformación E1 causa la fosforilación de la enzima por ATP,
+
lo que conlleva un cambio de conformación desde E1 hasta E2. En la conformación E2, los iones Na son liberados
+
hacia el líquido extracelular. Entonces, dos iones K se unen a la enzima y activan su desfosforilación, lo que provoca
+
que esta pase de la conformación E2 a la E1, liberándose entonces los iones K en el citoplasma celular.
+
FIGURA 4-15 Modelo del funcionamiento de la Na+ K+ ATPasa. La bomba alterna entre dos conformaciones: E1 y E2. En la
conformación E1, la proteína está abierta hacia el interior celular y presenta afinidad por el Na+, mientras que, en la conformación E2,
donde se encuentra abierta hacia el exterior, presenta gran afinidad por el K+. (Ilustración de: E. Maldonado.)
Esta bomba iónica es de gran importancia para el organismo, ya que un 25% de la energía total del mismo se
invierte en poner en marcha la Na /K ATPasa. Esto es así porque, como ya se ha indicado, resulta imprescindible para
+
+
mantener el potencial de membrana celular, que se ve despolarizado constantemente por otros procesos de transporte.
De no realizar su función adecuadamente, la despolarización celular sería la causa del bloqueo de todos aquellos
mecanismos que dependen del gradiente natural a cada lado de la membrana, cuya existencia se debe a que las
188
concentraciones de Na en el líquido extracelular (frente al líquido intracelular) y de K en el líquido intracelular (frente
+
+
al medio extracelular) son muchísimo mayores.
La actividad de la Na /K ATPasa se puede ver favorecida por determinadas moléculas (como la insulina y las
+
+
catecolaminas) o interrumpida por inhibidores específicos, como la ouabaína (del somalí, «veneno de flecha»). Este
compuesto tiene una función experimental en Fisiología, donde se emplean para calcular la energía que consume una
célula. Otro compuesto que bloquea la Na /K ATPasa es el digital, procedente de la planta Digitalis purpurea. Este
+
+
compuesto es muy tóxico en altas dosis, pero en dosis terapéuticas se ha usado para el tratamiento de arritmias y de
otras alteraciones cardíacas. Actúa inhibiendo la bomba Na /K ATPasa, por lo que se incrementa el Ca intracelular en
+
+
2+
los cardiomiocitos, ya que, al romperse el gradiente natural de Na , no se produce la salida de Ca mediante el
+
2+
intercambiador de transporte activo indirecto Na /Ca (v. apartado «Transporte activo indirecto»). Este compuesto
+
2+
tiene, así, un efecto inótropo positivo; es decir, aumenta la fuerza de contracción del músculo cardíaco. Como efecto
indirecto, inhibe la bomba Na /K ATPasa a nivel neural, provocando una estimulación vagal.
+
+
Otra ATPasa de tipo P es la Ca ATPasa. Esta bomba se encuentra en la membrana celular bombeando Ca hacia el
2+
2+
líquido extracelular, y en las membranas del retículo endoplasmático liso (REL) y sarcoplásmico (un tipo de REL de
las células musculares especializado en almacenar iones Ca ). Esta ATPasa tiene la importante misión de mantener
2+
bajos los niveles citoplasmáticos de Ca . Los niveles intracelulares de este ión deben ser muy bajos (0,1-0,01 μmol/l)
2+
pues, de lo contrario, se uniría a los P libres dando lugar a fosfato de calcio. Una de las funciones de la Ca ATPasa es
2+
i
permitir la adecuada relajación del miocardio a través de la expulsión de Ca citosólico hacia el exterior celular.
2+
Existen hormonas potenciadoras de este transporte, como por ejemplo el calcitriol. Esta es una hormona lipófila de
origen esteroideo que actúa sobre distintos órganos, como el intestino, el riñón, la placenta, las glándulas mamarias,
los folículos pilosos y la piel, aumentando la expresión de la Ca ATPasa.
2+
ATPasa F
La ATPasa F recibe este nombre porque fue identifica como «factor de acoplamiento de energía», es decir, con
capacidad para acoplar la energía liberada por la hidrólisis de ATP al impulso de protones contracorriente. Es un
transportador activo que puede ser revertido, en cuyo caso el acoplamiento de la energía no es el de aquella liberada
por la hidrólisis de ATP, sino el de la liberada como consecuencia del transporte de protones a favor de gradiente.
Cuando se utiliza energía liberada por esta reacción para la formación de ATP a partir de ADP + P , denominamos a
i
esta bomba «ATP sintasa», la cual está presente en la membrana mitocondrial interna (v. capítulo 11). Esta ATPasa
tiene un componente de membrana llamado «F0» que es un poro transmembrana de protones, y un componente F1
que protruye hacia el interior de la mitocondria y posee el sitio de unión al ATP.
189
ATPasa V
La ATPasa V (vacuolar) se encuentra en vacuolas de hongos y plantas superiores y en los lisosomas, endosomas y
complejos de Golgi de las células animales. Acopla la energía del ATP al transporte de protones al interior, mediante
el cual se consigue la acidificación de estos compartimentos celulares, superando incluso hasta dos veces la acidez del
citosol (pasando así de un pH = 7,5 a uno de 3-6). Los endosomas tardíos y los lisosomas son orgánulos que contienen
hidrolasas ácidas (proteasas, nucleasas, lipasas, glucosidasas, fosfatasas, etc.) y que solo son funcionales a pH ácido.
Por ello, requieren una bomba de protones que descienda el pH del interior vesicular.
Transportadores ABC
Los transportadores ABC (de inglés ATP binding cassette) llevan a cabo el transporte de diversas moléculas (con gasto
de ATP), como aminoácidos, péptidos, proteínas, iones metálicos, lípidos, así como sales biliares, medicamentos y
muchos compuestos hidrófobos que no serían capaces de atravesar la bicapa lipídica de otro modo, o lo harían muy
lentamente. Todos los transportadores ABC tienen dos dominios de unión a nucleótidos (NBD, del inglés nucleotidebinding domains) y dos dominios transmembrana. En su mayoría se ubican en la membrana plasmática, pero también
se pueden encontrar en la membrana de orgánulos intracelulares, como el retículo endoplasmático, las mitocondrias y
los lisosomas. Suelen actuar como bombas; sin embargo, gracias a que el NBD se puede acoplar tanto a bombas como
a canales, hay algunos que constituyen canales regulables por la hidrólisis de ATP.
Un tipo de transportador ABC es la familia de proteínas llamadas MDR (del inglés multi-drug resistance), o
transportadores que confieren a las células resistencia frente a múltiples fármacos. Estos transportadores expulsan
xenobióticos, antibióticos y otros tipos de fármacos fuera de la célula. Muchas células tumorales aumentan sus niveles
de MDR para poder defenderse de los fármacos antitumorales con los que se trata a los pacientes, lo que constituye un
fenómeno de resistencia muy importante para la actuación de estos tratamientos. MDR1, también llamada Pglucoproteína 1, está ampliamente distribuida en el epitelio intestinal, los hepatocitos, el epitelio del túbulo
contorneado proximal, la glándula suprarrenal y los capilares del endotelio de las barreras hematoencefálica y
testicular. Esta proteína es una bomba que utiliza ATP para expulsar un amplio espectro de compuestos xenobióticos.
En las células normales, está involucrada en la defensa contra sustancias dañinas. En las células intestinales, regula el
paso de sustancias potencialmente tóxicas. En el riñón, se encarga de la excreción de xenobióticos y de metabolitos
tóxicos y, en las barreras hematoencefálicas y hematotesticular, previene el paso de estas sustancias al encéfalo, o a la
línea germinal, respectivamente. Las células madre (células de vida larga y expuestas, por lo tanto, a sustancias
potencialmente dañinas) suelen poseer una gran expresión de MDR1, actuando así como un mecanismo de defensa.
Las células tumorales que expresan MDR1 son resistentes a algunos fármacos antineoplásicos (como la doxorrubicina
y la vimblastina), constituyendo así un importante factor de resistencia a estos tratamientos. Otro transportador
multifármaco es el MDR2, también conocido como «cMOAT» (transportador canalicular multiespecífico de aniones
190
orgánicos). El MDR2 se expresa en órganos excretores como el riñón y el hígado, donde excreta conjugados que se
obtienen al neutralizar productos tóxicos con sustancias como el ácido glucurónico, el sulfato, el acetato o el glutatión,
de manera que sean más fáciles de excretar.
Otra proteína con importancia clínica y que está estructuralmente relacionada con los transportadores ABC es la
llamada CFTR (regulador de la conductancia transmembrana de la fibrosis quística). El gen CFTR codifica para una
proteína de canal que permite el paso del Cl , el cual posee una función muy importante en la creación de la
–
mucosidad respiratoria, el jugo digestivo y el sudor. Esta proteína posee dos dominios con capacidad de hidrolizar el
ATP, lo que posibilita la actividad del canal. Cuando esta proteína resulta inactivada por mutaciones, se desarrolla
una enfermedad llamada fibrosis quística; en ella, los pacientes no tienen capacidad de expulsar iones Cl . En
–
individuos sanos, algunas células especializadas del organismo secretan iones Cl para diluir las secreciones. Por
–
ejemplo, las células epiteliales de las vías respiratorias liberan este ión hacia la luz, lo cual atrae de modo simultáneo a
iones Na . Esto provoca un efecto osmótico que arrastra agua desde el líquido intersticial hacia la luz, haciendo que las
+
secreciones mucosas estén bien hidratadas. La hidratación de las secreciones es esencial para que estas puedan fluir
hacia el exterior de las vías respiratorias, llevándose consigo bacterias y agentes nocivos (fig. 4-16). En los pacientes
con fibrosis quística, las mutaciones en CFTR pueden afectar de modo diverso a la proteína, pero es frecuente que esta
quede retenida en el retículo endoplasmático sin llegar a la membrana luminal de las células, donde desempeña su
función. Por lo tanto, no se produce la salida del Cl hacia la luz y, como consecuencia, no hay un arrastre de agua,
–
haciendo que las secreciones mucosas sean demasiado espesas y no puedan ser expulsadas por el movimiento de los
cilios, acumulando así sustancias tóxicas y microorganismos (v. fig. 4-16). Esta acumulación estática dificulta la
respiración y favorece la proliferación de bacterias, lo que genera importantes infecciones. Las consecuencias de esta
enfermedad son graves, pudiendo incluso causar la muerte de los pacientes.
FIGURA 4-16 La fibrosis quística se produce por mutaciones en un transportador de Cl–, lo cual provoca, entre otras cosas, un
aumento en el espesor de la mucosidad de las vías respiratorias que dificulta la respiración y causa infecciones. (Ilustración de: A. Calvo.)
191
La ausencia de transporte de Cl también afecta a otros órganos, como el páncreas, acumulándose en él enzimas
–
digestivas y produciéndose un quimo demasiado ácido que, como consecuencia, produce dispepsia; en las glándulas
sudoríparas, la inutilización de los canales produce un sudor con elevada concentración de sal (NaCl); por esta razón,
a los niños que padecen esta enfermedad se les conoce como «niños salados». La enfermedad afecta gravemente a la
calidad de vida de los pacientes, dificultando sobre todo a la capacidad de respirar y causando infecciones
pulmonares recurrentes que pueden requerir un trasplante pulmonar. Se ha reportado que la esperanza de vida se
sitúa en torno a los 25-45 años de vida, dependiendo de los países.
Transporte activo indirecto
El transporte activo indirecto o secundario recibe esta denominación porque traslada el sustrato de un medio a otro
aprovechando la energía liberada al equilibrarse un gradiente electroquímico. La mayoría de las proteínas asocian su
transporte al gradiente de los iones Na e H . Este ha sido previamente generado gracias al transporte activo primario;
+
+
de no existir este, tampoco lo haría el indirecto. Se pueden diferenciar dos tipos: el cotransporte y el contratransporte.
Cotransporte
En el cotransporte, ambos sustratos se desplazan en el mismo sentido. Casi siempre se ven propulsados por un
gradiente de Na generado por la bomba Na /K ATPasa, que actúa como mecanismo propulsor del transporte activo
+
+
+
secundario. Los transportadores Na /glucosa (SGLT, del inglés sodium-glucose transporters) desempeñan un papel
+
esencial en la absorción de glucosa en el tubo digestivo y en la reabsorción de este azúcar por parte del riñón (fig. 417). El SGLT1 se encuentra, esencialmente, en la membrana apical de los enterocitos del intestino y en las células
epiteliales de los túbulos rectos del riñón. En la membrana basolateral del epitelio, la bomba Na /K ATPasa expulsa
+
+
Na fuera de la célula, por lo que se crea un gradiente para la entrada de este ión. En la membrana apical, los
+
transportadores SGLT incorporan glucosa desde la luz, incluso cuando sus concentraciones son mucho menores en la
luz que dentro de las células epiteliales (es decir, en contra de gradiente), aprovechando la energía motriz que
proporciona el gradiente de entrada de Na (v. fig. 4-17). De este modo, los enterocitos son capaces de concentrar la
+
glucosa intracelular, en contra de gradiente, hasta 9.000 veces por encima de la de la luz del intestino. Por lo tanto, el
transporte de Na /glucosa es un cotransporte (de ambas sustancias en la misma dirección) activo y de tipo indirecto, al
+
depender del transporte activo de la bomba Na /K ATPasa, que genera el gradiente de Na . Finalmente, en la
+
+
+
membrana basal, la glucosa difunde pasivamente por medio de transportadores GLUT hacia la sangre, que la que
transportará hacia el resto de células del organismo. Como este tipo de cotransporte hay otros muchos en el
organismo, que transportan aminoácidos y otras moléculas.
192
FIGURA 4-17 Cotransporte de Na+/glucosa. Los transportadores SGLT, situados en la membrana apical, aprovechan el flujo de entrada
del Na+ a favor de gradiente para introducir glucosa en contra de gradiente. La glucosa sale por difusión facilitada a través de los
transportadores GLUT situados en la membrana basolateral.
Contratransporte
Funcionan de acuerdo con los principios de transporte activo indirecto explicados anteriormente, aunque, en este
caso, el transporte de la molécula va en un sentido mientras que el ión que promueve el transporte sigue el opuesto.
Algunos ejemplos de este transporte activo secundario son el transporte de intercambio Na /Ca , en el cual,
+
2+
aprovechando el gradiente de entrada del Na , las células expulsan Ca al espacio extracelular; o el intercambiador de
+
2+
Na /H , que utiliza un mecanismo similar y tiene importancia en la regulación del pH celular (fig. 4-18).
+
+
FIGURA 4-18 Ejemplos de contratransportes (transporte activo de tipo indirecto o secundario): transporte de intercambio de Na+/Ca2+ y
de Na+/H+. (Ilustración de: E. Maldonado.)
193
Importancia de los canales iónicos en la generación del
potencial de membrana
El transporte de iones a través de proteínas de canal es esencial en la generación del potencial de membrana. El
potencial de membrana es la medida del campo eléctrico que existe en el líquido intracelular en contacto con la
membrana de todas las células vivas, y se mide en milivoltios (mV). Se produce por una asimetría en la distribución de
cargas (iones) a ambos lados de la membrana plasmática, de modo que las células en reposo poseen normalmente un
exceso de carga negativa en su interior y un exceso de carga positiva fuera de ellas. El potencial eléctrico que resulta
de esta asimetría de cargas se denomina potencial de membrana en reposo (V ). Para medir el potencial de
m
membrana, se inserta un electrodo en la membrana plasmática hasta el interior de la célula. Después, se coloca otro
electrodo en el líquido extracelular y se mide la diferencia de potencial entre el interior y el exterior de la célula
utilizando un voltímetro (fig. 4-19).
FIGURA 4-19 Medida del potencial de membrana en reposo. (Ilustración de: E. Maldonado.)
Las células en reposo tienen un potencial de membrana negativo porque el interior de la célula presenta un exceso
de carga negativa; no obstante, no todas las células presentan el mismo potencial de membrana en reposo. La tabla 4-2
recoge valores del potencial en reposo de diferentes células.
Tabla 4-2
Valor del potencial de membrana en reposo en distintos tipos celulares
Tipos celulares
Potencial de membrana en reposo (Vm)
Axón gigante de calamar
− 60 mV
Fibras de músculo liso, enterocitos, hepatocitos, hematíes, células tubulares renales, etc. − 60 mV
194
Axones, miocitos esqueléticos
− 80 mV
Miocitos auriculares o ventriculares
− 90 mV
La excitabilidad eléctrica es una propiedad que presentan algunas células, como las nerviosas, las musculares, los
islotes de Langerhans, etc. Estas células se caracterizan por tener canales iónicos (de Na , Ca , K o Cl ) que dependen
+
2+
+
–
del voltaje. Ciertos estímulos son capaces de generar un potencial de acción, que consiste en un cambio del V que
m
siempre es despolarizante; es decir, el potencial de membrana varía de valores negativos a positivos. Tras la
despolarización, se produce un período de repolarización, en el cual el potencial de membrana vuelve otra vez a sus
valores negativos. La duración de todos estos cambios de voltaje producidos durante el potencial de acción
(despolarización y repolarización) es variable, como queda reflejado en la tabla 4-3.
Tabla 4-3
Duración del potencial de acción en distintos tipos celulares
Tipos celulares Duración del potencial de acción (ms)
Axones
1-2
Músculo esquelético
5-10
Músculo liso
50
Nódulo sinoauricular
800
Nódulo auriculoventricular 1.100
Sincitio auricular
150
Sincitio ventricular
250
Haz de His-Purkinje
350
La importancia biológica del potencial de acción en las células del sistema nervioso reside en que actúa
transmitiendo señales eléctricas a lo largo del axón, porque es capaz de propagarse a grandes distancias (incluso
metros) sin experimentar decremento alguno.
Potencial de membrana en reposo (Vm)
La composición química del líquido extracelular (LEC) es diferente a la del líquido intracelular (LIC). La solución
acuosa de sales que forma el LEC tiene, principalmente, NaCl, y en menor proporción, KCl. En cambio, lo más
195
característico del LIC es que posee K como catión principal (tabla 4-4). Los aniones citoplasmáticos son,
+
fundamentalmente, macromoléculas que no pueden salir de la célula (proteinatos y ARN, entre otras).
Tabla 4-4
Distribución de los iones Na , K y Cl en el LIC y el LEC del axón de calamar y la neurona de mamífero
+
+
–
Concentraciones iónicas expresadas en mM
Para comprender el porqué del potencial de membrana debemos tener en cuenta tres aspectos importantes:
• La dirección de la difusión de las sustancias. Como hemos indicado previamente, la difusión va desde donde los
solutos se encuentran más concentrados hacia donde están menos concentrados (gradiente de concentración). El
gradiente de un ión viene dado por la distribución asimétrica de las concentraciones del mismo a ambos lados de
la membrana, y se expresa como el siguiente cociente: [X] /[X] , donde [X] es la concentración del ión.
LEC
LIC
• La electroneutralidad. Para evitar desequilibrios de carga, los iones que se hallan en soluciones se presentan como
pares; es decir, por cada carga de un ión existe un contraión con carga opuesta. El K en el citoplasma actúa como
+
contraión de los aniones atrapados en el LIC, mientras que el Cl es el contraión del Na en el LEC.
–
+
• Debemos tener en cuenta que el potencial (o voltaje) es la tendencia a atraerse entre sí de los iones con cargas
opuestas. La intensidad de la corriente, que se mide en amperios (A), se produce por el movimiento de un ión
hacia otro de carga opuesta.
La membrana plasmática posee canales de fuga de K , lo que hace que sea permeable a este ión, de tal modo que el
+
K difunde del LIC, donde está más concentrado, hacia el LEC. Pero la salida de K no está acompañada con la salida
+
+
de sus contraiones intracelulares, ya que la mayoría de ellos son macromoléculas. Por esta razón, la salida de K deja
+
aniones en el LIC que no están compensados eléctricamente con cationes. Por ello, en el citosol se acumula un exceso
de carga negativa, y en el LEC un exceso de carga positiva. La cantidad de K que sale es osmóticamente inapreciable,
+
pero es relevante desde el punto de vista eléctrico. La membrana plasmática actúa como un dieléctrico, ya que el K
+
que sale de la célula compensa las cargas negativas del LIC. De esta forma, podemos comprender que la membrana
actúa como un excelente condensador cargado con un potencial que se corresponde con el V . En este contexto, se
m
comprende que el V refleja el trabajo espontáneo que hay que realizar para separar dos iones que deberían estar
m
juntos en el LIC. El potencial de membrana se puede calcular utilizando la ecuación de Nernst.
196
Debido a la salida de K de la célula, el LIC queda cargado negativamente, generándose de esta forma un potencial
+
de membrana que tenderá a oponerse a la salida de K . El potencial de membrana neutraliza la tendencia del K a
+
+
difundir a favor de gradiente de concentración. Se trata de un equilibrio electroquímico, es decir, un equilibrio donde
el gradiente químico se equilibra con el potencial eléctrico. El potencial de membrana en el equilibrio electroquímico
se denomina «potencial de equilibrio».
Aunque aproximadamente el 80% del valor del V depende del K , hay otros iones que también participan: Na y Cl .
+
m
+
–
El Na entra en la célula por un doble gradiente: gradiente de concentración y gradiente eléctrico. La entrada de Na en
+
+
la célula tiene un efecto despolarizante, esto es, hace que el potencial de membrana sea menos negativo. La
contribución del Cl al V es pequeña, ya que el Cl que entra en la célula por medio del gradiente de concentración
–
–
m
sale a través de sistemas de contratransporte; de ahí que las variaciones que se puedan producir en la concentración
de Cl del LEC no afecten prácticamente al V . Además, la entrada de Cl en la célula puede ser repelida por el
–
–
m
potencial negativo de membrana, por lo que este anión suele entrar asociado a cationes como el Na . Si aumentara la
+
permeabilidad celular al Cl , se produciría una hiperpolarización (potencial de membrana más negativo de lo
–
habitual).
Como se ha señalado repetidamente a lo largo del presente capítulo, la bomba Na /K ATPasa es la responsable de
+
+
mantener las diferencias de concentración de Na y de K a través de la membrana celular, ya que, a pesar de que la
+
+
célula sea poco permeable al Na , si este ión continúa entrando, se producirían un hinchamiento y lisis celular por un
+
efecto osmótico. Netamente, la bomba Na /K ATPasa saca una carga positiva hacia el LEC (transporta dos iones K
+
+
+
hacia el LIC y tres iones Na hacia el LEC), haciendo que el exterior sea más electropositivo. Esta actividad electrógena
+
de la Na /K ATPasa también contribuye en aproximadamente un 5-10% al valor final del V ; si bien es cierto que no es
+
+
m
la causa del V , sí es imprescindible, ya que se encarga de restablecer las concentraciones de Na y K .
+
m
+
Excitabilidad eléctrica y canales dependientes de voltaje
Las células que son excitables eléctricamente poseen canales iónicos dependientes de voltaje, de ahí que, frente a una
despolarización de la membrana, este tipo de células responda con la generación de un potencial de acción. En
cambio, las células que no son excitables eléctricamente, tras haber sido despolarizadas temporalmente, vuelven a su
potencial de reposo. Los canales iónicos de Na y K dependientes de voltaje son los responsables de que se genere el
+
+
potencial de acción.
En 1991, el fisiólogo Bert Sakman y el biofísico Erwin Neher (ambos alemanes) recibieron el Premio Nobel en
Fisiología o Medicina por el desarrollo de la técnica del patch clamp, que permite medir corrientes iónicas de un solo
canal. Para ello, se utiliza una micropipeta con una punta de aproximadamente 1 μm de diámetro; se presiona y se
realiza una suave succión, de modo que se pueda conseguir bajo la punta de la pipeta una superficie de membrana
197
que esté aislada del medio circundante. Esta superficie de la membrana es lo suficientemente pequeña como para que
tan solo se encuentre en ella un canal o, en su defecto, unos pocos.
La técnica se realiza a un voltaje fijo que se consigue aplicando un pulso despolarizante, de modo que el potencial
de membrana sea constante a pesar de que las propiedades eléctricas de la membrana cambien (fig. 4-20). La
aplicación de esta técnica ha demostrado que, al abrirse un canal de Na , este conduce siempre la misma cantidad de
+
corriente. Por lo tanto, no existen estados en los que un canal se halle parcialmente abierto o cerrado de modo que
conduzca más o menos corriente; en este sentido, sigue la ley del todo o nada: el canal está abierto o cerrado. En el caso
de los canales de Na dependientes de voltaje, al fijar el potencial de membrana en +50 mV, se genera una corriente de
+
1 pA (10 A).
–12
FIGURA 4-20 Técnica del patch clamp. Esta técnica permite medir la corriente iónica que fluye únicamente a través de uno o dos
canales. (Ilustración de: E. Maldonado.)
Los canales de Na dependientes de voltaje (CNaDV) son monómeros proteicos con cuatro dominios separados. En
+
el caso de los canales de K dependientes de voltaje (CKDV) nos hallamos ante proteínas multiméricas (varias
+
subunidades proteicas separadas que se asocian entre sí). Ambos canales poseen un poro central, para que los iones
puedan circular. Cada subunidad (o dominio) está formada por seis hélices α transmembrana (S1-S6). En la región
transmembrana de S4 existen aminoácidos con carga positiva, de tal modo que esta región actuaría como un sensor de
voltaje, ya que, al sustituir experimentalmente los aminoácidos cargados positivamente por otros con carga neutra, el
canal no se abre. Al parecer, los cambios de voltaje que se producen a través de la membrana actuarían sobre los
mencionados aminoácidos de S4, produciendo la apertura o el cierre del canal.
La selectividad iónica del canal depende del tamaño del poro central y del modo en el que interacciona con el ión en
cuestión. La selección de iones con la carga adecuada se produce, principalmente, por atracción electrostática o
repulsión hacia los aminoácidos cargados que forman la apertura del poro. El CNaDV tiene dos compuertas: la
compuerta de activación (m), que se proyecta hacia el LEC, y la compuerta de inactivación (h), en contacto con el
interior celular (fig. 4-21). Mientras se da el potencial de membrana en reposo (consideremos un V de unos −90 mV) la
m
198
compuerta de inactivación está abierta, pero la de activación está cerrada, por lo que el Na no puede entrar en la
+
célula. Cuando el potencial de membrana se hace menos negativo que el potencial de reposo, es decir, cuando el
potencial de membrana tiende a 0 mV, existe un voltaje (aproximadamente entre −70 mV y −50 mV) en el cual se
produce un cambio conformacional de la compuerta de activación, de modo que se abre. A este estado del canal se le
denomina estado activado, y es un estado en el que el ión puede difundir hacia el LIC a través del canal, ya que m y h
están abiertas (fig. 4-22 y v. fig. 4-21).
FIGURA 4-21 Esquema del funcionamiento de los canales de Na+ y K+ dependientes de voltaje. A. Los canales de Na+ dependientes de
voltaje tienen dos compuertas: una de activación (en el lado extracelular), o compuerta m, y otra de inactivación (h). B. Los canales de
K+ dependientes de voltaje tienen una sola compuerta para regular el paso de este ión.
199
FIGURA 4-22 A. Potencial de membrana en función del tiempo durante el potencial de acción. B. Secuencia de acontecimientos que
se producen durante el potencial de acción. 1, potencial de membrana en reposo. Los canales de Na+ y K+ dependientes de voltaje
están cerrados. 2, despolarización. Apertura de los canales de Na+. 3, repolarización. Compuerta de inactivación del canal de Na+
cerrada y compuerta del canal de K+ abierta. 4, hiperpolarización. Antes de llegar de nuevo al potencial en reposo, sigue saliendo K+ y
el valor del potencial de membrana adquiere valores más negativos que los de reposo, hasta que se cierran los canales de K+. (B,
ilustración de: E. Maldonado.)
200
El aumento de voltaje causado por la apertura de la compuerta de activación también causa el cierre de la
compuerta de inactivación. Pero el cambio conformacional que produce el cierre de la compuerta de inactivación es
más lento que el producido por la apertura de la compuerta de activación. En el momento en el que se produce el
cierre de la compuerta de inactivación, el potencial de membrana comienza a recuperarse para alcanzar su valor en
reposo; es decir, la membrana se repolariza. Finalmente, destacaremos que la compuerta de inactivación del canal de
Na dependiente de voltaje no se vuelve a abrir hasta que el potencial de membrana tome valores cercanos al reposo.
+
Cuanto más negativo sea el potencial de reposo, mayor será el porcentaje de canales que tengan la compuerta de
inactivación abierta. Los CNaDV son muy abundantes en los nódulos de Ranvier (v. «Propagación saltatoria» en el
siguiente apartado) de las fibras nerviosas mielinizadas (tabla 4-5).
Tabla 4-5
Densidad de canales de Na dependientes de voltaje en fibras nerviosas mielinizadas y no mielinizadas
+
Fibras nerviosas
N.° de canales/μm2
No mielinizadas
20
Mielinizadas (nódulos de Ranvier) 104
En cuanto al canal de K dependiente de voltaje, tan solo tiene una compuerta que regula la salida de los iones.
+
Cuando el potencial de membrana está en reposo, la compuerta permanece cerrada, pero cuando se da una
despolarización del potencial de membrana, se produce una apertura conformacional de la compuerta, de modo que
los iones K difunden hacia el espacio extracelular a través del canal. La apertura de la compuerta de dichos canales se
+
produce con cierto retraso, y se podría considerar que se abren al mismo tiempo que empiezan a cerrarse las
compuertas de inactivación del canal de Na dependiente de voltaje. Por esta razón, se recupera el potencial de
+
membrana en reposo en poco tiempo, ya que la disminución de entrada de Na en la célula y el aumento de la salida
+
de K se suman para acelerar la repolarización.
+
Canalopatías y sustancias que alteran el funcionamiento de los canales
dependientes de voltaje
Las canalopatías son los trastornos que se producen en los canales iónicos y que, como consecuencia, alteran su
funcionamiento. Numerosas canalopatías se han asociado con enfermedades neurológicas, como es el caso de la ataxia
episódica de tipo I, causada por una mutación en el canal de K . Se trata de una enfermedad autosómica dominante
+
que afecta al cromosoma 12p13. Otra canalopatía es la epilepsia generalizada con convulsiones febriles, asociada a
mutaciones en la subunidad β1 de CNaVD (mutación en el cromosoma 19q13.1).
201
Existen diversas sustancias que alteran el funcionamiento normal de los canales dependientes de voltaje (fig. 4-23).
La tetrodotoxina (TTX), un veneno procedente del pez globo, bloquea la conducción de los impulsos nerviosos a lo
largo de los axones y de las membranas excitables de las fibras nerviosas, originando parálisis respiratoria. La TTX,
que posee un grupo guanidino, se utiliza como sonda, ya que es específica de los canales de sodio dependientes de
voltaje, por lo que bloquea el flujo de este ión. La saxitoxina (STX), que posee dos grupos guanidino, es producida por
algunos dinoflagelados marinos y actúa de la misma forma que la TTX. El grupo guanidino cargado positivamente
interacciona con los carboxilatos (cargados negativamente) de la entrada del canal de sodio desde la parte extracelular
de la membrana. Ambas toxinas actúan como inhibidores competitivos del Na .
+
FIGURA 4-23 Estructura química del grupo guanidino y de las toxinas tetrodotoxina y saxitoxina. Las flechas señalan la ubicación del
grupo guanidino en la estructura química de las toxinas.
Dado que ambas toxinas tienen unas elevadas especificidad y afinidad por el conducto de Na dependiente de
+
voltaje, si previamente son marcadas radiactivamente, se puede cuantificar la densidad de dichos canales en las
membranas excitables.
Potencial de acción
Alan Hodgkin y Andrew Huxley estudiaron cómo se generaban los potenciales de acción, para lo cual emplearon el
axón gigante de calamar. Este axón posee un diámetro que, en algunas especies, puede llegar a 1 mm, unas
dimensiones enormes si las comparamos con el diámetro del axón amielínico de mamífero, que es de
aproximadamente 0,5-1 μm. En 1962, Hodgkin publicó un trabajo donde demostraba que la generación y la
propagación del potencial de acción por un axón al que se sustituyó el axoplasma por una solución salina con Na y K
+
en ausencia de ATP. Dado que, en estas condiciones, se podían generar un millón de potenciales, dedujo que la señal
eléctrica solo requería la integridad de la membrana y la presencia de esos iones. Este trabajo hizo que Hodgkin y
Huxley recibieran el Premio Nobel en Fisiología o Medicina en 1963.
Propagación de señales eléctricas
202
+
Los potenciales de acción se utilizan para transportar señales nerviosas. El potencial de acción es un proceso
electroquímico que consta de una despolarización producida por la entrada de Na y una repolarización causada por
+
la salida de K . El potencial de acción es desencadenado por impulsos que llegan al cono axónico, donde existen gran
+
cantidad de canales dependientes de voltaje. El potencial de acción viaja a lo largo de la membrana desde el punto de
origen; este proceso se denomina propagación.
Como hemos visto al principio del presente capítulo, existen varios factores (gradiente y permeabilidad iónica) que
intervienen en la formación del potencial de membrana en reposo. Esta situación se ve alterada en el momento en el
que se produce una despolarización. Pero no cualquier despolarización es capaz de generar un potencial de acción; si
esta es pequeña (unos 20 mV), el potencial de membrana retorna a sus valores en reposo sin generar un potencial de
acción. Esto es así porque existe un potencial umbral a partir del cual se puede generar el potencial de acción.
Movimiento iónico a través de la membrana axonal durante el potencial de acción
Durante el potencial de membrana en reposo de una célula excitable (v. fig. 4-22, [secuencia 1]).los canales iónicos
dependientes de voltaje se hallan cerrados. En dicho momento, la permeabilidad del K es unas 100 veces mayor que
+
la del Na , ya que el K difunde por los canales de fuga (no confundirlos con los canales dependientes de voltaje).
+
+
Cuando una región de la membrana está ligeramente despolarizada, existe una fracción de canales de Na
+
dependientes de voltaje que se abre, de modo que el Na difunde hacia el LIC (aumenta la conductancia del Na ). Esta
+
+
corriente de Na es despolarizante, por lo que se produciría un circuito de retroalimentación positiva denominado
+
ciclo de Hodgkin (fig. 4-24).
FIGURA 4-24 Esquema que ilustra el ciclo de Hodgkin.
Al comienzo de este apartado, se ha mencionado que una ligera despolarización no es capaz de generar un
potencial de acción. Esto es así porque existe un importante factor que rompe el ciclo despolarizante de Hodgkin: la
difusión de iones K hacia el LEC. Este hecho hace que el potencial de membrana retorne a sus valores de reposo y que
+
no se genere un potencial de acción, pues la despolarización inicial no alcanza el umbral para que así sea.
En la generación del potencial de acción se distinguen las siguientes fases:
• Fase de despolarización. Tras la fase de reposo, cuando la membrana plasmática se despolariza alcanzando un
valor umbral, la salida de K por los canales de fuga es incapaz de compensar la entrada de Na , ya que se ha
+
+
abierto un mayor porcentaje de canales de Na dependientes de voltaje que cuando se da una despolarización
+
203
subumbral. Podemos afirmar que el potencial de acción se produce cuando la tasa de entrada de Na por los
+
canales dependientes de voltaje es mayor a la tasa de salida del K por los canales de fuga. La despolarización
+
alcanza un máximo de unos +40 mV (fig. 4-25; v. también fig. 4-22 [secuencia 2]).
• Fase de repolarización. La repolarización (v. secuencia 3 en fig. 4-22) se produce debido a la inactivación de los
canales de Na dependientes de voltaje y a la apertura de los canales de K dependientes de voltaje. De esta forma,
+
+
se detiene el flujo de Na hacia el LIC y se permite que el K difunda hacia el exterior de la célula, principalmente
+
+
por el canal dependiente de voltaje. Como ya hemos comentado, existe una diferencia en la velocidad de
respuesta de los canales dependientes de voltaje, ya que, cuando la célula se despolariza, los canales de K se
+
abren más lentamente que los de Na , de ahí que primero se dé un aumento de la conductancia del Na
+
+
(despolarización) y luego un aumento de la conductancia de K (repolarizante) (v. figs. 4-22 y 4-25).
+
• Fase de hiperpolarización. La hiperpolarización se produce en la mayoría de las neuronas y se caracteriza por
que el valor del potencial de membrana adquiere valores más negativos que los de reposo (v. figs. 4-22 [secuencia
4] y 4-25). Esto se produce por el aumento de la permeabilidad de los iones K , ya que los canales dependientes de
+
voltaje permanecen todavía abiertos. El potencial de membrana adquiere los valores en reposo conforme se van
cerrando los canales de K dependientes de voltaje. La recuperación del potencial de membrana en reposo no
+
depende del transporte activo de la bomba Na /K ATPasa. De hecho, Hodgkin y Huxley demostraron que, en
+
+
ausencia de ATP, las células podían seguir generando potenciales de acción. La bomba Na /K ATPasa es la
+
+
encargada, no obstante, de restablecer las concentraciones iónicas a cada lado de la membrana, ya que durante la
despolarización entra Na , y durante la repolarización sale K . Así, una fibra nerviosa puede transmitir entre 10 y
+
+
5
50 impulsos antes de que las diferencias de concentración alcancen el punto en el que se interrumpa la
6
conducción del potencial de acción. Una actividad neuronal intensa puede alterar significativamente las
concentraciones de los iones. Podría así ocurrir que la cantidad de K que se acumula fuera de la célula fuera
+
tóxica para ella y para el resto de las neuronas circundantes; de ahí la importancia de los astrocitos que captan el
exceso de K .
+
• Períodos refractarios. Después de un potencial de acción, no se puede generar otro durante algunos
milisegundos, aunque el estímulo sea intenso, porque los canales de Na dependientes de voltaje están
+
inactivados (compuerta h cerrada). A este período de tiempo se le denomina «período refractario absoluto»
(PRA). En el período de hiperpolarización, los canales de Na dependientes de voltaje se vuelven activables, por lo
+
que es posible producir un potencial de acción, aunque el estímulo despolarizante debe tener la suficiente
magnitud como para poder superar las corrientes de K . A este período se le «denomina período refractario
+
relativo» (PRR).
204
FIGURA 4-25 Modificación de la conductancia iónica durante el potencial de acción. Obsérvese que la curva de conductancia del K+
está desplazada hacia la derecha con respecto a la del Na+.
Propagación del potencial de acción a lo largo del axón
La transmisión de señales nerviosas requiere que los fenómenos de despolarización y repolarización ocurran a lo
largo de la membrana neuronal. Cuando un punto de la membrana se despolariza, se produce una difusión pasiva de
la despolarización, esto es, se transmite a regiones adyacentes. Durante este proceso, la onda despolarizante pierde
intensidad, por lo que hace prácticamente imposible que se dé una propagación a largas distancias. De ahí que el
potencial de acción tenga que ser generado punto a punto en la membrana; de esta forma, no pierde intensidad y es
capaz de recorrer grandes distancias.
Cuando una señal despolarizante llega al soma neuronal o a las dendritas, la onda despolarizante difunde
pasivamente hasta el cono axónico. En el cono axónico, la generación de potenciales de acción se ve favorecida, ya que
la densidad de canales de sodio dependientes de voltaje es mayor que en el soma y en las dendritas. Ante un estímulo
despolarizante en zonas donde la densidad de canales de Na es mayor, se producirá una mayor corriente de este ión,
+
que es lo que sucede en el cono axónico y en los nódulos de Ranvier (v. más adelante). El potencial de acción
producido en el cono axónico se propagará a lo largo de la membrana axonal.
Se diferencian dos tipos de propagación del impulso nervioso:
• Propagación punto a punto. Se da en los axones no mielinizados y consiste básicamente en la generación de
sucesivos potenciales de acción desde el cono axónico hasta el botón terminal del axón (fig. 4-26). Dado que el
potencial de acción se está generando continuamente, se produce una propagación sin decremento de la
intensidad. La tabla 4-6 recoge la velocidad de propagación punto a punto de las fibras amielínicas.
• Propagación saltatoria. Se da en axones mielinizados (fig. 4-27; v. también fig. 4-26). La vaina de mielina es un
excelente aislante eléctrico que disminuye el flujo iónico a través de la membrana. La vaina de mielina de las
neuronas del sistema nervioso central está formada por los oligodendrocitos, mientras que la del sistema nervioso
periférico está formada por las células de Schwann. Para formar la vaina de mielina, la membrana de la célula de
Schwann rodea al axón. Después, la célula rota varias veces alrededor del axón, depositando múltiples capas de
205
membrana que contiene mielina. La mielina está compuesta, a partes iguales, por esfingomielina, glucolípidos
(sobre todo cerebrósidos y sulfatósidos) y colesterol. Dado que cada célula de Schwann rodea a un segmento
corto del axón, se requieren muchas células para rodear un axón del sistema nervioso periférico. En la unión entre
dos células de Schwann sucesivas a lo largo del axón, existe una región no aislada de unos 2-3 μm de longitud
denominada nódulo de Ranvier (v. fig. 4-27). Solo en estas zonas de la membrana pueden los iones fluir con
facilidad entre el LEC y el LIC, a través de la membrana del axón.
FIGURA 4-26 Propagación del impulso nervioso «punto a punto» (dibujos del lado izquierdo) y propagación saltatoria (dibujos del lado
derecho). A. En la propagación «punto a punto», la secuencia de eventos 1-5 muestra cómo el cambio de signo (2) en el interior celular
(correspondiente a la despolarización) se transmite de modo continuo de izquierda a derecha. La salida de K+ en el lado izquierdo de 4
y 5 provoca la repolarización de la membrana en dichos puntos. B. En la propagación saltatoria, la despolarización va teniendo lugar
de modo sucesivo, pero entre los nodos de Ranvier «salta» de un nodo a otro. De nuevo, la salida de K+ en los nodos del lado
izquierdo de 4 y 5 repolariza la membrana. (Dibujo modificado de: figs. 3.15 y 3.17, de Becker WM. El mundo de la célula. 6.ª ed. Madrid: Pearson; 2007.)
Tabla 4-6
Velocidad de propagación del potencial de acción en fibras amielínicas
Fibra amielínica Diámetro de la fibra Velocidad de propagación
Humano
0,5-1 μm
1 m/s
Axón gigante de calamar
1.000 μm
25-30 m/s
206
FIGURA 4-27 Estructura de una neurona mielinizada por células de Schwann. Los espacios que quedan entre las vainas de mielina
corresponden a los nódulos de Ranvier. (Ilustración de: E. Maldonado.)
La mielina hace que la capacidad de retener carga disminuya, por lo que permite que una despolarización se
propague más lejos y más rápido (aproximadamente a una velocidad de 100 m/s) de lo que lo haría en un axón no
mielinizado. Pero el potencial de acción debe ser renovado periódicamente para que la despolarización se extienda
por toda la neurona. Esto sucede en los nódulos de Ranvier, al ser el único lugar de la membrana donde se encuentran
los canales de sodio dependientes de voltaje (10 /μm ). Por esta razón, los potenciales de acción «saltan» de nódulo a
4
2
nódulo a lo largo de los axones mielinizados. A este fenómeno se le llama «propagación saltatoria», que es mucho más
rápida que la propagación continua punto a punto. La organización de los nodos de Ranvier evita que los canales
dependientes de voltaje se muevan por toda la membrana axonal.
El potencial de acción se transmite finalmente de una neurona a otra mediante la sinapsis, que se define como un
tipo de comunicación intercelular mediante el cual una neurona es capaz de transmitir un potencial de acción eléctrico
a otra célula. Las neuronas no solo se comunican entre ellas, sino que también lo hacen con las glándulas y las células
musculares a través de la sinapsis. Estructuralmente, podemos diferenciar dos tipos de sinapsis:
• Sinapsis eléctrica: la neurona presináptica está conectada con la neurona postsináptica a través de uniones de
tipo gap o nexo (para conocer con detalle su estructura, v. capítulo 6). Estas uniones permiten que los iones se
muevan directamente de una célula a otra, y en cualquier sentido, de modo que la despolarización se transmite
pasivamente. Se trata, prácticamente, de una transmisión sin retrasos que se halla en lugares del sistema nervioso
donde la velocidad de transmisión es crítica.
• Sinapsis química: en este tipo de sinapsis, las neuronas presináptica y postsináptica no están conectadas
directamente. El espacio que las separa se denomina «brecha» o «hendidura sináptica» y tiene una longitud de
unos 20-50 nm. Pero una señal nerviosa no puede saltar de una neurona a otra como un impulso eléctrico; por
ello, la señal eléctrica (potencial de acción) en la neurona presináptica induce la liberación de una sustancia
química desde el botón terminal denominada neurotransmisor, que difunde por la hendidura sináptica. El
neurotransmisor se une a receptores anclados en la membrana de la neurona postsináptica, donde se convierten
en señales eléctricas mediadas por cambios iónicos. Los procesos de liberación de los neurotransmisores implican
procesos de exocitosis por parte de la neurona presináptica, que se estudian con más profundidad en el capítulo
5.
207
Como ejemplo de una enfermedad donde se produce una alteración en la conducción del impulso nervioso por
alteraciones en la vaina de mielina, podemos citar la esclerosis múltiple (EM). La EM es una enfermedad
desmielinizante del sistema nervioso central, caracterizada por un proceso inflamatorio idiopático que destruye
selectivamente la mielina. Se caracteriza por la presencia de inflamación, desmielinización y gliosis (tejido cicatricial).
Causa lesiones focales en la sustancia blanca, denominadas «placas», en las que se da una desmielinización con
preservación relativa del axón. Si el componente inflamatorio es muy marcado, incluso se puede observar destrucción
axonal (fig. 4-28). La etiología de la EM es desconocida, pero se piensa que es probable que determinados factores de
origen todavía desconocidos induzcan una respuesta inmunitaria mediada por células T autorreactivas (CD4+ o
CD8+) en personas genéticamente predispuestas. Se ha sugerido como posible desencadenante el mimetismo
molecular entre virus responsables de infecciones respiratorias y antígenos mielínicos que activarían linfocitos T.
FIGURA 4-28 Corte histológico del neocórtex de un paciente con esclerosis múltiple. La flecha negra señala una zona de
desmielinización intracortical. La flecha blanca indica un área de desmielinización leucocortical. (Imagen procedente de: Popescu y Lucchinetti. BMC
Neurology 2012;12:11.)
La mayoría de los estudios sobre la etiopatogenia de la EM apoyan la hipótesis de que se trata de una enfermedad
autoinmunitaria mediada por linfocitos T específicos (Th1) frente a antígenos de la mielina. La proteína mielínica
básica (MBP, del inglés myelin basic protein) es un antígeno importante. La activación de los linfocitos B y la respuesta
de anticuerpos es necesaria para el desarrollo de lesiones desmielinizantes. El cuadro clínico de la EM es muy
variable. Las lesiones suelen afectar preferentemente a ciertas zonas del sistema nervioso central, como el nervio y
quiasma ópticos, el tronco cerebral, los pedúnculos cerebelosos y la médula. Esto da lugar a debilidad, alteración
sensitiva, afectación de la visión, disartria (trastorno del habla), ataxia (falta de coordinación del movimiento),
disfunción vesical, alteraciones del estado de ánimo y deterioro cognitivo.
Lecturas recomendadas
Agre P, Kozono D. Aquaporin water channels: molecular mechanisms for human diseases. FEBS Lett. 2003;555(1):72–78.
208
Ashcroft FM. From molecule to maladies. Nature. 2006;440(7083):440–447.
Cano A, Ticus I, Chabrol B. Glucose transporter type 1 (GLUT-1) deficiency. Rev Neurol (Paris). 2008;164(11):896–901: Epub 2008 Apr 3.
Gonen T, Walz T. The aquaporin structure. Quarterly Reviews of Biophysics. 2006;39(4):361–396.
Kristopher T, Kahle J, Simard Marc. Molecular Mechanisms of Ischemic Cerebral Edema: Role of Electroneutral Ion Transport.
Physiology. 2009;24:257–265.
Lehmann-Horn F, Jurkat-Rott K. Voltage-gated channels and hereditary disease. Physiol Rev. 1999;79(4):1317–1372: Cited on PubMed
PMID10508236.
Mouritsen OG, Zuckermann MJ. What’s so special about cholesterol? Lipids. 2004;39(11):1101–1113.
Mueckler MM. The molecular biology of mammalian glucose transporters. Curr Opin Nephrol Hypertens. 1992;1(1):12–20.
Nielsen S, Frøkiær J, Marples D, Kwon T-H, Agre P, Knepper MA. Aquaporins in the kidney: from molecules to medicine. Physiol Rev.
2002;82:205–244.
Nielsen S, Kwon T-H, Mønster B, Christensen, Promeneur D, Frøkiær J, Marples D. Physiology and Pathophysiology of Renal
Aquaporin. J Am Soc Nephrol. 1999;10:647–663.
Perozo E. Gating prokaryotic mechanosensitive channels. Nat Rev Mol Cell Biol. 2006;7:109–119.
Popescu BF, Lucchinetti CF. Meningeal and cortical grey matter pathology in multiple sclerosis. BMC Neurol. 2012;12:11: Cited on
PubMed PMID 22397318.
Thorens B. Glucose transporters in the regulation of intestinal, renal, and liver glucose fluxes. Am J Physiol. 1996;270(4 Pt 1):G541–G553.
209
Ecuación de Nernst
El gradiente electroquímico de un ión determina el flujo a través de un canal que está influido por el gradiente de
voltaje y el gradiente de concentración del ión a través de la membrana. Cuando estos dos gradientes se contrarrestan
mutuamente, el gradiente electroquímico del ión es cero y no existe un flujo neto a través del canal. El gradiente de
voltaje al cual se alcanza el equilibrio electroquímico se denomina «potencial de equilibrio». Se puede calcular
utilizando la ecuación de Nernst:
En el equilibrio electroquímico:
por lo tanto,
Si el ión X fuera el único ión permeable, el potencial de equilibrio de la membrana
de equilibrio de dicho ión
.
∆V = potencial de equilibrio en voltios (potencial interno menos potencial externo).
concentraciones externa e interna del ión (respectivamente).
R = constante de los gases (
).
T = temperatura absoluta (K).
F = constante de Faraday (
).
Z = valencia del ión.
Ln = logaritmo en base e.
Preguntas de autoevaluación
210
coincidiría con el potencial
1. Con respecto al transporte pasivo, señale la opción correcta:
a. Las porinas son canales altamente selectivos de la membrana mitocondrial externa.
b. El agua atraviesa la membrana tanto por difusión simple como por difusión facilitada.
c. Ante un mismo soluto, todas las membranas plasmáticas del organismo muestran un mismo comportamiento de
difusión simple.
d. La difusión simple del K a través de la membrana plasmática es mayor que la del benceno.
+
e. Las soluciones extracelulares hipertónicas provocan hinchamiento celular.
Respuesta correcta: b.
2. Con respecto a los canales iónicos, señale la opción falsa:
a. Los órganos de los sentidos poseen canales mecanosensibles.
b. La unión de acetilcolina al sitio específico en los canales de Na de la membrana de la célula postsináptica es un
+
tipo de regulación de canales quimiosensibles.
c. La regulación de los canales iónicos siempre es a través de sustancias extracelulares.
d. Los canales de las uniones de tipo gap configuran las sinapsis eléctricas.
e. El transporte de iones a través de estos canales tiene lugar de modo pasivo.
Respuesta correcta: c.
3. La diabetes «insípida» se caracteriza por:
a. Alteraciones en la proteína AQP1.
b. Presencia de orina concentrada en exceso.
c. Ausencia de AQP2 en la membrana apical del túbulo colector.
d. Presencia de glucosa en la orina.
e. Hiperactivación de la hormona ADH.
Respuesta correcta: c.
4. Señale la opción falsa con respecto a los transportadores GLUT:
a. Es un ejemplo de transportador de tipo uniporte.
b. Transportan glucosa en contra de gradiente.
c. Su funcionamiento sigue la ecuación de Michaelis-Menten.
211
d. El transportador GLUT4 transporta glucosa en el músculo esquelético.
e. Son un tipo de permeasas.
Respuesta correcta: b.
5. La Na K ATPasa:
+/
+
a. Es inhibida por el vanadato.
b. La hidrólisis de ATP capacita el transporte de dos iones Na hacia el líquido intracelular.
+
c. La ouabaína favorece el funcionamiento de esta ATPasa.
d. Es una ATPasa de tipo vacuolar.
e. Ninguna de las anteriores es cierta.
Respuesta correcta: a.
6. ¿Cuál de las siguientes afirmaciones no es correcta en relación con la fibrosis quística?:
a. Se produce por un defecto en un transportador de Cl , codificado por CFTR.
−
b. Produce un sudor salado en los pacientes con esta enfermedad.
c. La mayoría de mutaciones asociadas a esta enfermedad provocan una retención de la proteína en el retículo
endoplasmático.
d. La esperanza de vida media de estos pacientes no supera los 10 años.
e. El trasplante pulmonar es una opción terapéutica para estos pacientes.
Respuesta correcta: d.
7. Elija la respuesta verdadera en relación con el potencial de membrana en reposo (V ):
m
a. La concentración de K en el LEC es superior a la del LIC.
+
b. La entrada de Na en la célula tiene un efecto repolarizante.
+
c. La bomba Na /K ATPasa hace que el exterior celular sea más electronegativo.
+
+
d. El flujo de iones K a través de la membrana plasmática es el factor que determina, en mayor porcentaje, el valor
+
del potencial de membrana en reposo.
e. Los cambios en la concentración del Cl en el LEC afectan de manera crítica al potencial de membrana en reposo.
–
Respuesta correcta: d.
8. Con respecto a los canales iónicos dependientes de voltaje, elija la respuesta falsa:
212
a. Los canales iónicos dependientes de voltaje tienen aminoácidos cargados positivamente que actúan como
sensores de voltaje.
b. Con la técnica del patch clamp se demostró que los canales iónicos dependientes de voltaje adoptan estados
conformacionales que les permiten estar parcialmente abiertos.
c. En el estado activado del canal de Na dependiente de voltaje, las compuertas «m» y «h» están abiertas.
+
d. La compuerta de inactivación del canal de Na dependiente de voltaje no se vuelve a abrir hasta que el potencial
+
de membrana adquiera valores cercanos al reposo.
e. El canal de K dependiente de voltaje solo tiene una compuerta que regula la salida de iones.
+
Respuesta correcta: b.
9. En relación con el potencial de acción, escoja la respuesta falsa:
a. Para que el potencial de acción se produzca, es necesario que la tasa de entrada de Na a la célula sea superior a la
+
salida de K .
+
b. Durante la fase de repolarización, los canales de Na dependientes de voltaje se inactivan y el K sale de la célula
+
+
principalmente a través del canal de K dependiente de voltaje.
+
c. La difusión de iones K hacia el LEC favorece que se perpetúe el circuito despolarizante, llamado «ciclo de
+
Hodgkin».
d. Durante el período refractario absoluto, los canales de Na dependientes de voltaje se encuentran inactivos. Por
+
esta razón, no se puede generar otro potencial de acción durante este período.
e. Para poder generar un potencial de acción durante el período refractario relativo, el estímulo despolarizante debe
tener una magnitud suficiente, que supere a la corriente de K .
+
Respuesta correcta: c.
10. Señale la respuesta correcta:
a. Durante la propagación «punto a punto» se produce un decremento de la intensidad del potencial de acción.
b. Las células de Schwann forman la vaina de mielina del SNC.
c. El nódulo de Ranvier es la región del axón no aislada por células de Schwann.
d. La propagación continua es más rápida que la saltatoria.
e. La región de la membrana que está envuelta por la vaina de mielina presenta una mayor permeabilidad al flujo
iónico. Por esta razón, la velocidad de propagación es mayor en los axones mielinizados.
Respuesta correcta: c.
213
CAPÍTULO 5
214
Macrotransporte a través de la membrana plasmática:
endocitosis y exocitosis
Álvaro Martín
Diego Peñafiel
Alfonso Calvo
Objetivos de aprendizaje
• Entender los procesos moleculares de macrotransporte a través de la membrana plasmática.
• Conocer cómo tiene lugar la exocitosis, concretamente en la liberación de neurotransmisores en la neurona
presináptica y en el funcionamiento de la sinapsis neuronal.
• Comprender la etiopatogenia de las enfermedades relacionadas con la endocitosis y la exocitosis.
• Conocer los mecanismos por los cuales los microorganismos utilizan los procesos de macrotransporte a través de
la membrana para infectar a las células.
215
Introducción
En el capítulo anterior se han estudiado aquellos mecanismos de transporte a través de la membrana plasmática que
no implican una deformación de la misma. En este capítulo nos ocuparemos de los mecanismos de transporte a una
escala mayor: los que requieren deformación de la membrana y que, por lo tanto, pueden ser observados al
microscopio. Las células pueden incorporar material extracelular mediante procesos de endocitosis o fagocitosis. Estos
procesos implican la pérdida de porciones de membrana que son incorporadas al interior celular mediante la creación
de vesículas, donde queda incluido el contenido extracelular transportado. Estas pérdidas de membrana son
compensadas mediante procesos de exocitosis, donde vesículas generadas en el interior celular se fusionan con la
membrana plasmática, vertiéndose así el contenido de estas al exterior celular. Tanto la incorporación de vesículas
como su fusión con la membrana plasmática implican la actuación de orgánulos citoplasmáticos que participan en un
proceso denominado «tráfico intracelular de vesículas» y que gobiernan el correcto funcionamiento de estos sistemas.
Este transporte demanda un gran gasto de energía en forma de ATP y en él participan numerosas proteínas que
ejercen diferentes funciones. Como detallaremos más adelante, muchos microorganismos patógenos aprovechan esta
vía de transporte para introducirse en la célula e infectarla, por lo que el conocimiento del modo en que tiene lugar
este fenómeno es importante para poder desarrollar estrategias terapéuticas.
216
Endocitosis
El proceso por el cual las células captan e internalizan macromoléculas, partículas grandes e incluso otras células
recibe el nombre de endocitosis. El término fue acuñado en 1963 por Christian de Duve (premio Nobel de Fisiología o
Medicina en 1974). La endocitosis es el primer paso de la ruta que conduce hasta la digestión celular en los lisosomas.
Para captar el material a endocitar, la membrana plasmática se invagina y forma vesículas, cuyo tamaño permite
distinguir los dos tipos de endocitosis. El primero se denomina pinocitosis, y consiste en la ingestión de fluido
extracelular con pequeños solutos, en vesículas con un diámetro de aproximadamente 100 nm (fig. 5-1); el segundo
tipo es la fagocitosis, y en él se ingieren grandes partículas, como microorganismos o restos celulares, en vesículas
mayores. Todos los procesos de endocitosis requieren un consumo de energía en forma de ATP.
FIGURA 5-1 Imágenes de microscopía electrónica que muestran el proceso de endocitosis en vesículas revestidas de clatrina. Las
flechas señalan las vesículas, y las puntas de flecha, el material extracelular. En la imagen central se observa una depresión revestida
en formación, mientras que la imagen derecha corresponde a un estado más avanzado del proceso de endocitosis. (Procedente de: Shieh
JC, Schaar BT, Srinivasan I, Brodsky FM, McConnell SK (2011) Endocytosis Regulates Cell Soma Translocation and the Distribution of Adhesion Proteins in Migrating Neurons.
PLoS ONE 6(3):e 17802)
Pinocitosis
La pinocitosis («bebida celular») es un proceso continuo que se da prácticamente en la totalidad de las células
eucariotas. Mediante la pinocitosis, se incorporan al citoplasma tanto fluido extracelular con moléculas disueltas,
como otras partículas e incluso algunos virus. Se pueden considerar tres tipos de pinocitosis: 1) la mediada por
clatrina, denominada clásicamente «endocitosis mediada por receptor»; 2) la mediada por caveolinas, que tiene lugar
en unas estructuras llamadas «cavéolas», donde hay participación de unas proteínas denominadas caveolinas, pero no
de la clatrina, y 3) la macropinocitosis, no mediada por clatrina ni por caveolinas, donde tiene lugar una
incorporación masiva de fluido extracelular con emisión de amplias protrusiones citoplasmáticas a modo de
lamelipodios. Esta clasificación de la endocitosis es, probablemente, una simplificación de la realidad. La endocitosis
es un campo en el que se está llevando a cabo una intensa investigación y donde se están descubriendo nuevas
variantes de incorporación al interior celular, así como nuevas rutas de tráfico intracelular de las vesículas
incorporadas y nuevas moléculas implicadas en estos procesos.
Endocitosis en vesículas recubiertas por clatrina
217
El tipo más conocido de pinocitosis es la endocitosis en vesículas recubiertas por clatrina (tradicionalmente llamada
endocitosis mediada por receptor). Clásicamente, se diferenció entre endocitosis mediada por receptor (un proceso
altamente específico para algunos sustratos, donde las vesículas de endocitosis eran formadas por la acción de la
clatrina) y la endocitosis no mediada por receptor (fenómeno por el cual se incorporan sustancias de modo continuo e
inespecífico). Sin embargo, cada vez hay más datos que muestran que la endocitosis que se consideraba «no mediada
por receptor» es un proceso altamente regulado para la incorporación de sustancias específicas y con vías
intracelulares propias, lejos, por lo tanto, de ser un proceso inespecífico.
Este proceso de endocitosis mediada por receptor consiste en la unión de macromoléculas a receptores específicos
de membrana que se concentran, al inicio de la endocitosis, en zonas concretas llamadas depresiones revestidas de
clatrina. Los mecanismos moleculares de este tipo de endocitosis son bien conocidos: cuando las moléculas se unen a
sus receptores, los complejos ligando-receptor se concentran en las depresiones y penetran en la célula en vesículas
recubiertas de clatrina. Se han descrito numerosas moléculas que entran en la célula mediante endocitosis mediada
por receptor: hormonas y factores de crecimiento (como insulina, glucagón, GH y EGF), proteínas séricas (como
lipoproteínas de baja densidad [LDL, del inglés low density lipoproteins], transferrina e IgA), virus (como el virus de la
gripe o los adenovirus) y toxinas (como las del cólera o la difteria). El ejemplo más estudiado de endocitosis mediada
por receptor es el de la captación de colesterol extracelular contenido en las LDL.
El colesterol es una molécula esencial para la síntesis de membrana y la formación de ácidos biliares y hormonas
esteroideas. Se transporta en sangre unido a proteínas, formando las LDL (fig. 5-2). Estas lipoproteínas se unen a
receptores de LDL localizados en la membrana de las células que captan colesterol. Los receptores de LDL insertos en
la membrana plasmática tienden a acumularse en las depresiones revestidas de clatrina; de esta forma, se consigue
concentrar el colesterol que se va a endocitar (fig. 5-3). Tras producirse la endocitosis de las vesículas de clatrina (que
posteriormente pierden su revestimiento), se fusionan con un orgánulo denominado «endosoma» (cuya estructura y
función se detallan más adelante), quedando libres las moléculas de LDL en su interior. Posteriormente, el endosoma
se fusionará con un lisosoma, donde se liberarán las moléculas de colesterol, que pasarán entonces al citoplasma (v.
fig. 5-3).
218
FIGURA 5-2 Molécula de LDL. Estas moléculas, de forma esférica, tienen una masa de 3 × 106 Da, presentan un núcleo de ésteres de
colesterol rodeado por una monocapa de fosfolípidos y moléculas de colesterol no esterificadas. La apoproteína B100 se encarga de
organizar la estructura de la partícula y de la unión de la LDL a su receptor en la membrana plasmática celular. (Ilustración de: E. Maldonado.)
FIGURA 5-3 Endocitosis mediada por receptor. El esquema representa la endocitosis de las moléculas de LDL. Tras la internalización
de la vesícula recubierta de clatrina, esta se desprende del recubrimiento y se une al endosoma. En el interior de este orgánulo, el pH
ácido provoca la separación entre las moléculas de LDL y sus receptores, que son devueltos en vesículas a la membrana plasmática.
Por su parte, el contenido del endosoma termina en el lisosoma, en el cual se libera el colesterol, que queda a disposición de la célula
para su utilización. (Ilustración de: E. Maldonado.)
Cuando las células no pueden captar colesterol, este se acumula en la sangre y tiende a formar las llamadas «placas
de ateroma» en las paredes arteriales. El estudio de pacientes afectos de hipercolesterolemia familiar fue un hecho
clave a la hora de dilucidar el mecanismo de endocitosis mediada por receptor. La hipercolesterolemia familiar es
una enfermedad genética, de herencia autosómica, que se caracteriza por que los pacientes que la sufren presentan
unos niveles de colesterol sérico muy elevados. Estas altas concentraciones provocan que el colesterol se deposite en
las arterias desde edades muy tempranas, lo que explica la alta incidencia de infarto de miocardio que sufren dichos
219
pacientes antes de alcanzar los veinte años de edad. Esta enfermedad se produce porque existe una mutación en el
receptor de LDL, que se manifiesta de dos formas distintas: como falta de expresión de la proteína o incapacidad de la
misma para unirse a la molécula de LDL; o bien, como falta de internalización del complejo LDL-receptor por
incapacidad de este último para concentrarse en las depresiones revestidas y ser endocitado (fig. 5-4).
FIGURA 5-4 Las mutaciones en el receptor de las LDL causan hipercolesterolemia familiar, que normalmente ocasiona aterosclerosis.
A. Esquema de los receptores normales de LDL, que se unen a la molécula de LDL y se concentran en las depresiones revestidas de
clatrina para ser endocitados. B. Por su parte, los receptores mutados pueden unir las LDL, pero no se agrupan en las depresiones
revestidas y, por lo tanto, la célula no puede endocitar el colesterol. Esto se traduce en un aumento acusado de los niveles de LDL en
sangre, característico de los pacientes aquejados de hipercolesterolemia familiar. C. Imagen macroscópica de la sección transversal de
una arteria de un paciente con aterosclerosis donde se observa la placa de ateroma en la pared, que obtura parcialmente la luz del
vaso. D. Sección histológica de una arteria con la misma patología, que muestra cómo la placa de ateroma cierra prácticamente la luz
del vaso. (A y B, ilustraciones de: E. Maldonado; C, procedente de: The Lancet, Vol. 370, Issue 9602, p1803-1804; D, procedente de: The Lancet, Vol. 372, Issue 9644, p11261128.)
El mecanismo por el cual se produce la enfermedad es el siguiente: la ausencia de captación de LDL, sobre todo en
los hepatocitos, conlleva un aumento de la producción hepática de colesterol. Dicho aumento se debe a que los bajos
niveles citoplasmáticos de colesterol activan la hidroximetilglutaril-CoA reductasa, enzima limitante en la ruta de
biosíntesis del colesterol. Al ser liberado, los niveles de colesterol en sangre aumentan de cuatro a seis veces por
encima de su valor normal. Las manifestaciones clínicas de la enfermedad incluyen aterosclerosis y la aparición de
xantomas y xantelasmas (depósitos de colesterol en la piel y en los párpados, respectivamente).
El conocimiento de los mecanismos de la hipercolesterolemia familiar se debe a los estudios realizados por los
investigadores Michael Brown y Joseph Goldstein en los años setenta del siglo xx. Gracias a su trabajo, consiguieron
además sentar las bases para el estudio de los procesos de incorporación de macromoléculas por las células. Su
descubrimiento les valió recibir el premio Nobel en Fisiología o Medicina en 1985.
Muchos receptores transmembrana de la membrana plasmática, entre los que se encuentra el receptor de LDL,
presentan «péptidos señal» que dirigen a dichos receptores a las depresiones revestidas. Uno de estos péptidos está
constituido únicamente por cuatro aminoácidos: Y-X-X-ψ, siendo Y tirosina, X cualquier aminoácido polar y ψ un
aminoácido hidrófobo. En el caso del receptor de LDL, esta señal está formada por los aminoácidos Asn-Pro-Val-Tyr.
220
Una vez que las moléculas de LDL se han unido a sus receptores en las depresiones revestidas, estas se invaginan
para formar las vesículas recubiertas de clatrina. La clatrina es una proteína formada por tres subunidades grandes y
tres pequeñas que forman una estructura trirradiada denominada «trisquelión» (fig. 5-5). Los trisqueliones se
ensamblan formando una red de hexágonos y pentágonos a modo de cesto, configurando la depresión revestida.
Cuando se forma la vesícula, se organizan 36 trisqueliones, formando 12 pentágonos y 8 hexágonos.
FIGURA 5-5 Estructura de la molécula de clatrina. A. Modelo molecular de las estructuras primaria y secundaria de un trisquelión de
clatrina. B. Modelo molecular de la organización tridimensional de los trisqueliones para rodear a las vesículas endocitadas, dando
lugar a las vesículas revestidas. La cubierta está formada por 36 trisqueliones organizados en una red de 12 pentágonos y 6
hexágonos. (Procedente de: Stagg et al. Curr Opin Struct Biol 2007;17[2]:221-8.)
Además de la clatrina, en las vesículas revestidas encontramos otras proteínas. De entre ellas, la más importante es
el complejo adaptina, que sirve de puente entre el receptor de transporte (p. ej., el receptor de LDL) y las moléculas de
clatrina (fig. 5-6). La formación de la depresión revestida está facilitada por el ensamblaje progresivo de adaptinas y
trisqueliones de clatrina en la cara citosólica de la membrana. En este proceso son muy importantes las interacciones
laterales entre las moléculas para dar forma a la depresión y a la vesícula revestida.
FIGURA 5-6 Formación de las depresiones y de las vesículas recubiertas de clatrina. La adaptina se une a los trisqueliones de clatrina
y a los receptores de moléculas específicas, favoreciendo de esta forma la concentración de receptores en las depresiones. Para la
separación de la vesícula, se requiere la participación de la dinamina. Cuando la vesícula ya se ha internalizado, la cubierta se separa
rápidamente y sus componentes vuelven a la membrana plasmática, donde formarán una nueva depresión revestida. (Ilustración de: E.
Maldonado.)
221
Para que la vesícula se pueda separar de la membrana plasmática, son necesarias una serie de proteínas que la
estrangulen. La dinamina (v. fig. 5-6), una GTPasa de 100 kDa, es la proteína clave en este proceso, ya que cataliza y
regula la frecuencia de separación de las vesículas. Junto con otras proteínas, la dinamina se ensambla en el cuello de
la vesícula y contribuye a deformar y desestabilizar las membranas, lo que provoca su separación de la membrana
plasmática. Se cree que la dinamina distorsiona la estructura de la bicapa lipídica y que también altera la composición
de los lípidos.
Una vez se ha separado la vesícula, la cubierta de clatrina se desprende inmediatamente. Esta eliminación depende
de una chaperona, la HSP70, que separa las proteínas de la cubierta mediante su actividad ATPasa. La HSP70 es
activada por una proteína unida a la vesícula: la auxilina. Las adaptinas y clatrinas separadas vuelven a la membrana
plasmática para formar nuevas depresiones revestidas. El proceso de endocitosis en vesículas recubiertas por clatrina
se muestra al microscopio electrónico de transmisión en la figura 5-7.
FIGURA 5-7 Imágenes de microscopía electrónica de transmisión que muestran la secuencia de formación de las vesículas
recubiertas. A. En la secuencia de imágenes se puede ver cómo el material de carga se va concentrando en la superficie de la
depresión revestida formando una densa capa. B. Asimismo, se observa la progresiva invaginación de la membrana, debida al
ensamblaje de clatrina. C. Por último, se estrangula el cuello de la vesícula y se fusionan las membranas. D. También se muestra una
vesícula internalizada que aún no ha perdido su cubierta de clatrina. (Procedente de: Perry et al. J Cell Sci 1979;39:257-72.)
Todas las vesículas cargadas de complejos receptor-ligando continúan la ruta endocítica hacia los endosomas. El
endosoma es un orgánulo constituido por túbulos y vesículas delimitadas por una membrana que se extiende desde
la periferia celular, justo debajo de la membrana plasmática (endosoma temprano), hasta localizaciones perinucleares
cercanas al Golgi (endosoma tardío) (fig. 5-8). Estos orgánulos son intermediarios del proceso endocítico y tienen la
función primordial de clasificar las sustancias endocitadas y dirigirlas hacia diferentes rutas intracelulares. Son,
asimismo, orgánulos donde se produce el desacoplamiento ligando-receptor. Aparte de la localización, los endosomas
se diferencian por su contenido interno y por su pH. Estos orgánulos muestran un ambiente ácido gracias a las
bombas de protones (H ) dependientes de ATP (ATPasa-V) que introducen H desde el citosol al lumen. Los
+
+
endosomas tardíos son los que tienen un pH más ácido.
222
FIGURA 5-8 Participación del endosoma en la endocitosis. Las moléculas que se unen a sus receptores en la superficie de la célula
son endocitadas y posteriormente se fusionan con los endosomas tempranos. Aquí los ligandos se disocian de sus receptores gracias
al pH ácido del interior del endosoma; esto se consigue mediante la actividad de una bomba ATPasa de membrana. Los ligandos
continúan su camino hacia el endosoma tardío, donde se unen a vesículas procedentes del Golgi cargadas de enzimas hidrolíticas,
dando lugar así al lisosoma. El tráfico de vesículas entre el Golgi y el endosoma está mediado por vesículas recubiertas de clatrina o
de COP I (para el tráfico retrógrado; v. capítulo 10). CGN, red Cis del Golgi; TGN, red Trans del Golgi. (Ilustración de: E. Maldonado.)
La primera estación de la ruta de endocitosis la constituyen los endosomas tempranos, donde se clasifican las
moléculas para sus destinos posteriores (v. más adelante). La acidez del lumen endosómico favorece que los
receptores liberen sus ligandos. Los receptores pueden entonces ser devueltos a la membrana mediante vesículas de
transporte (vía del reciclaje de los receptores) o continuar la misma ruta de degradación que los ligandos. El contenido
de los endosomas tempranos madura en los endosomas tardíos, situados normalmente en una localización más
interna de la célula que los endosomas tempranos. Las moléculas cuyo destino final es la degradación viajan, por lo
tanto, desde los endosomas tempranos hasta los tardíos. El mecanismo mediante el cual se lleva a cabo el transporte
no está claro. Se cree que fragmentos de los endosomas tempranos migran, acoplados a los microtúbulos, hacia el
interior celular, fusionándose entonces con los endosomas tardíos. Estos fragmentos de endosomas reciben el nombre
de cuerpos multivesiculares, pues su membrana se ha invaginado y ha formado múltiples vesículas internas (fig. 5-9).
Algunos investigadores sugieren que los cuerpos multivesiculares se fusionan entre sí para formar el endosoma
tardío. Otra hipótesis establece que es el mismo endosoma temprano (o parte de él) el que se transforma en tardío,
introduciéndose hacia el interior del citoplasma. Al final, los endosomas tardíos se fusionan con vesículas cargadas de
hidrolasas procedentes del complejo de Golgi y se acidifican hasta un pH < 6, convirtiéndose en lisosomas (v. capítulo
10). El pH ácido activa las enzimas hidrolíticas, comenzando así la digestión celular de las moléculas previamente
endocitadas.
223
FIGURA 5-9 Imagen de microscopía electrónica de transmisión de una neurona de hipocampo de rata donde se aprecian cisternas de
retículo endoplasmático rugoso (RER) y un cuerpo multivesicular (flecha). Obsérvese la presencia de varias vesículas adyacentes al
cuerpo multivesicular. (Procedente de: Atlas of Ultrastructural Neurocytology: http://synapses.clm.utexas.edu.)
Las vesículas endocitadas en la membrana plasmática pueden no finalizar en la ruta degradatoria; así, pueden
dirigirse a un dominio distinto de la membrana, en un proceso denominado transcitosis (explicado más adelante en
este capítulo). Por lo tanto, los receptores que participan en la endocitosis mediada por vesículas de clatrina pueden
seguir una de esas tres rutas (fig. 5-10):
1. Vía del reciclaje.
2. Transcitosis.
3. Vía degradatoria en los lisosomas.
224
FIGURA 5-10 Posibles destinos para los receptores endocitados. La ilustración muestra las distintas vías que pueden seguir los
receptores desde el endosoma temprano en una célula. La vía de reciclaje (1) devuelve a los receptores al mismo dominio de
membrana del que procedían. En el proceso de transcitosis (2), por el contrario, se dirigen a un dominio distinto. Los receptores que no
se reciclan siguen la ruta hacia el endosoma tardío y los lisosomas, donde serán finalmente degradados (3). (Ilustración de: E. Maldonado.)
El receptor de LDL sigue la vía del reciclaje. Cuando la LDL se disocia en el endosoma temprano, los receptores se
incorporan a la membrana plasmática a partir de vesículas de reciclaje que parten del endosoma, aportando
membrana previamente retirada (en el proceso de endocitosis) y receptores.
Otro ejemplo de la vía de reciclaje lo constituye el receptor de transferrina. La transferrina es una globulina sérica
que fija y transporta hierro en la sangre. Cuando el receptor unido a la transferrina alcanza el compartimento
endosómico, la transferrina libera el hierro unido, pero ella permanece unida al receptor. De esta manera, la
apotransferrina (transferrina no unida a hierro) se recicla unida a su receptor, separándose de este cuando entra en
contacto con el pH neutro del espacio extracelular. Así, la transferrina puede volver a la circulación y captar más
hierro, y el hierro ya liberado queda a disposición de la célula para su utilización.
La otra alternativa, aparte de la transcitosis que se comenta más adelante, es la vía de la degradación. Es el caso, por
ejemplo, del receptor de EGF (del inglés epidermal growth factor, factor de crecimiento epidérmico). Estos receptores
solo se acumulan en las depresiones revestidas cuando tienen el EGF unido y no se reciclan, sino que se degradan
junto a su ligando en los lisosomas. Por lo tanto, la unión del EGF activa las vías de señalización intracelulares que
estimulan la proliferación, tras lo cual disminuye el número de receptores de EGF disponibles mediante endocitosis.
Este último proceso se conoce como regulación por disminución del receptor (downregulation) y sirve para reducir la
sensibilidad de la célula al factor de crecimiento. Si no fuera así, las células sufrirían un crecimiento incontrolado que
podría desembocar en la aparición de tumores.
Endocitosis mediada por cavéolas
225
Las células, además de la endocitosis en vesículas recubiertas de clatrina, poseen otros mecanismos de pinocitosis.
Uno de estos mecanismos está mediado por cavéolas (del latín, «pequeñas cavidades»), invaginaciones de membrana
de entre 50 y 100 nm de diámetro. Las cavéolas se demostraron mediante microscopía electrónica en las células
endoteliales, donde forman parte del proceso de transcitosis, aunque se encuentran en la mayoría de los tipos
celulares. Resultan especialmente abundantes en los adipocitos, así como en neumocitos de tipo I y en células
musculares lisas y estriadas.
La membrana de las cavéolas es parecida a la que presentan las balsas lipídicas (lipid rafts), caracterizadas por ser
regiones muy ricas en colesterol, glucoesfingolípidos, esfingomielina y proteínas unidas a membrana (como se explicó
en el capítulo 3); estas regiones de la membrana se caracterizan también por contener receptores de señales celulares.
La principal proteína presente en estas balsas es la caveolina, una proteína integral de membrana que favorece la
formación de cavidades de la membrana en forma de matraz (fig. 5-11). Además de constituir el principal componente
estructural de las cavéolas, las caveolinas actúan como proteínas de andamiaje, capaces de reclutar y concentrar
múltiples moléculas señalizadoras, así como de regular su actividad. Por lo tanto, las cavéolas no están implicadas
exclusivamente en el transporte de macromoléculas, sino también en procesos de transducción de señales.
226
FIGURA 5-11 A. Esquema donde se representa el mecanismo de formación de una cavéola. En un microdominio de la membrana
interna, las moléculas de caveolina forman dímeros, forzando a la membrana a invaginarse y a adoptar la morfología típica de matraz.
B. Imagen de microscopía electrónica en donde se observan numerosas cavéolas en la membrana, interconectadas entre sí, en el
citoplasma celular. (A, ilustración de: E. Maldonado. B, imagen procedente de: http://pcwww.liv.ac.uk/~emunit/images/caveolae2.jpg.)
La caveolina es sintetizada en el retículo endoplasmático rugoso (RER) y los monómeros se oligomerizan en
heptámeros, que son fosforilados para prevenir su ensamblaje prematuro. Los heptámeros se transportan al Golgi,
227
donde se desfosforilan. En la red Trans del Golgi, la membrana que contiene la caveolina se enriquece en colesterol y,
al invaginarse, forma la cavéola que se dirigirá a la membrana plasmática. Tras la fusión de membranas, queda en ella
la región rica en colesterol que contiene la caveolina y que se endocitará para formar una nueva cavéola. Cuando las
cavéolas se invaginan y se separan de la membrana, pueden dirigirse a compartimentos endosómicos o, mediante
transcitosis, migrar hasta otro dominio de la membrana de una célula polarizada. En el proceso de invaginación y
estrangulación de la cavéola también participa la dinamina.
Actualmente, se conocen tres tipos de caveolinas: las caveolinas 1 y 2 se expresan de manera ubicua, mientras que la
caveolina-3 es exclusiva del músculo estriado y cardíaco. La mutación del gen CAV-3, que codifica para la proteína
caveolina-3, está relacionada con diversas patologías musculares. Estudios realizados con ratones knock-out para las
caveolinas 1 y 2 implican también a estas cavéolas en diversas enfermedades humanas.
El gen que codifica para la caveolina-3 se encuentra en el brazo corto del cromosoma 3 (en el locus 3p25) y, como
hemos indicado, se expresa específicamente en el tejido muscular esquelético, tanto estriado como cardíaco. Las
mutaciones identificadas en este gen interfieren con los procesos de oligomerización proteica o de señalización
intracelular, interrumpiendo la formación de cavéolas y provocando distintas enfermedades musculares. Entre ellas,
se encuentra la distrofia muscular congénita de tipo 1C, que se caracteriza por afectar principalmente a la
musculatura de las cinturas escapular y pélvica. Esta enfermedad, de herencia autosómica dominante, cursa con una
expresión muy disminuida de caveolina-3 en el tejido muscular, con la consiguiente pérdida de cavéolas en el
sarcolema. La proteína caveolina-3 mutante forma agregados inestables con la proteína nativa, por lo que ambas
formas son retenidas en el Golgi y destinadas, mediante ubiquitinación, a su degradación en el proteasoma. Las
primeras manifestaciones de la enfermedad aparecen en la primera década de la vida, alrededor de los 5 años de
edad, siendo el desarrollo motor normal hasta ese momento. Entre las manifestaciones clínicas de esta afección se
incluyen debilidad muscular proximal (en las cinturas), mialgias, calambres musculares, seudohipertrofia de las
pantorrillas y signo de Gowers positivo (signo clínico típicamente positivo en las distrofias musculares de la infancia).
Los estudios complementarios demuestran altos niveles de creatina quinasa en el suero de estos pacientes y cambios
distróficos en la biopsia muscular.
Una miopatía más benigna, la enfermedad muscular ondulante (rippling muscle disease), también está causada por
mutaciones del gen CAV-3. Esta patología se caracteriza por contracciones musculares inducidas por el estiramiento,
que se extienden a las fibras musculares vecinas, dando la apariencia de ondas moviéndose sobre el músculo. El
déficit de caveolina-3 también es causa de hiper-CKemia (elevación persistente de la creatina quinasa sérica sin
debilidad muscular) y de enfermedades del corazón, como la miocardiopatía hipertrófica familiar o el síndrome de
QT largo de tipo 9. Asimismo, se ha propuesto que la mutación de CAV-3 puede ser una causa del síndrome de
muerte súbita del lactante.
228
Por otra parte, la endocitosis mediante cavéolas es utilizada por múltiples microorganismos patógenos para infectar
las células; entre ellos encontramos al virus SV40 (simian virus 40), que constituye el paradigma de patógeno que
utiliza las cavéolas para penetrar en las células. Aunque se desconoce si es un agente infeccioso en humanos, su
patrón de infección podría ser similar al que utilizan otros virus infectivos para el hombre. El SV40 se une a su
receptor de membrana (se cree que lo hace a glucolípidos o proteínas de unión a GPI muy numerosas en las cavéolas)
y, tras ser endocitado, se acumula en unas estructuras denominadas caveosomas (endosomas que contienen
caveolina-1 en su membrana). Posteriormente, es transferido al retículo endoplasmático rugoso, donde inicia el ciclo
infectivo. De esta forma, el virus evita la ruta clásica endosoma-lisosoma y no sufre la acción degradativa de las
hidrolasas ácidas.
Por último, las cavéolas parecen desempeñar un papel destacado en la homeostasis del colesterol. Los niveles de
expresión de caveolina-1 se relacionan directamente con los de colesterol celular, pues ambas moléculas se encuentran
en altas concentraciones en las cavéolas. También se ha demostrado que la caveolina-1 transporta moléculas de
colesterol de nueva síntesis desde el retículo endoplasmático a las cavéolas. Una vez en la membrana, este colesterol
se libera y es captado por las lipoproteínas de alta densidad, o HDL (del inglés high density lipoproteins). Estos datos
sugieren que las cavéolas son el principal sitio de intercambio de colesterol entre la membrana plasmática y las
moléculas de HDL, aunque aún no se ha confirmado.
Macropinocitosis
Por su parte, la macropinocitosis es el proceso de endocitosis de fase fluida en grandes vesículas (macropinosomas)
de entre 0,15 y 5,0 μm de diámetro (fig. 5-12). Se basa en la formación de evaginaciones de membrana, a modo de
lamelipodios, basadas a su vez en la polimerización de la actina. El tipo celular en el que más se ha estudiado esta
forma de endocitosis es la célula dendrítica. En su forma inmadura, estas células incorporan múltiples antígenos
disueltos en el fluido extracelular para su ulterior procesamiento y presentación, asociados a moléculas del complejo
principal de histocompatibilidad II (CPH-II). La macropinocitosis sería, en este caso, un proceso constitutivo que no se
observa en las células dendríticas maduras. Por otra parte, hay células en las que se desarrollan estas vesículas en
respuesta a la estimulación con factores de crecimiento; entre ellas, se encuentran macrófagos, linfocitos, fibroblastos y
células epiteliales.
229
FIGURA 5-12 Imagen de microscopía electrónica que muestra la formación de varios macropinosomas en la superficie de una célula.
La formación de macropinosomas se indujo en células en cultivo mediante el tratamiento con ésteres de forbol (TPA). La enzima
peroxidasa de rábano (HRP, del inglés horseradish peroxidase) se añadió también al cultivo celular y, tras ser captada en los
macropinosomas, se reveló su actividad enzimática con diaminobencidina y H2O2, dando lugar al color negro que se observa en la
imagen. Las flechas indican las ondulaciones de membrana. FS, superficie libre de la célula; Mp, macropinosoma. (Reproducida de Grimmer,
S. et al. Jounal of Cell Science 115, 2953-2962 (2002) © The Company of Biologists Ltd.)
Actualmente, se están estudiando otras funciones de la macropinocitosis, como el hecho de que sirvan de puerta de
entrada para microorganismos patógenos, entre los cuales se puede citar el virus del Ébola.
La macropinocitosis se puede inducir en células en cultivo mediante el tratamiento de las células con ésteres de
forbol (v. fig. 5-12), que son agentes que activan la proteína quinasa C (PKC), lo que muestra la implicación de dicha
enzima en el proceso.
Fagocitosis
La fagocitosis («comida celular») es una forma de endocitosis especializada, pues solo la llevan a cabo unas células
denominadas «fagocitos profesionales». En los mamíferos hay tres tipos celulares con capacidad fagocítica: los
macrófagos, los leucocitos polimorfonucleares neutrófilos y las células dendríticas. Su capacidad de fagocitosis
defiende al organismo frente a las infecciones, ingiriendo y eliminando los microorganismos patógenos (fig. 5-13).
Además, los macrófagos desempeñan una función muy importante al digerir los restos de células senescentes o que
han muerto por apoptosis. El ejemplo más claro de esta última función lo encontramos en el bazo, donde los
macrófagos retiran diariamente de la circulación más de 10 eritrocitos viejos.
11
230
FIGURA 5-13 Imagen de microscopía electrónica de transmisión de un neutrófilo que ha fagocitado a la bacteria Bacillus anthracis. La
flecha indica una espora, y la punta de flecha, una bacteria germinada. El recuadro superior muestra con más aumento la espora y la
bacteria germinada. Barra en la imagen: 5 μm; barra en el recuadro: 500 nm. (Procedente de: Mayer-Scholl et al. PlosPathogenes 2005;1[3]:e23.)
El mecanismo de fagocitosis se desencadena por la unión de determinadas moléculas de membrana a receptores
específicos de la célula fagocítica. Esto provoca que la célula emita unas extensiones citoplasmáticas, o seudópodos, que,
gracias a un movimiento basado en la polimerización de actina, van cerrándose progresivamente alrededor del
microorganismo, partícula o célula a eliminar. Las membranas de los seudópodos terminan por confluir y fusionarse
para delimitar la vesícula fagocítica o fagosoma (fig. 5-14). Las moléculas que activan la fagocitosis se denominan
opsoninas; de entre ellas, las más estudiadas son los anticuerpos, que se unen por su fracción variable a la membrana
del patógeno y exponen su fracción constante (Fc) a los receptores Fc de la superficie de macrófagos y neutrófilos. Las
fracciones C3b del complemento, la fibronectina y la fosfatidilserina (un fosfolípido de la cara citosólica de la
membrana plasmática) también actúan como opsoninas. En el caso de la fosfatidilserina, las células que están en
apoptosis pierden la distribución normal de lípidos de membrana y así exponen la fosfatidilserina al exterior celular
(v. capítulo 3), activando la célula fagocítica, que eliminará a la célula apoptótica.
231
FIGURA 5-14 Proceso de fagocitosis por parte de un neutrófilo. La fagocitosis comienza cuando la célula reconoce el material a
endocitar; en este proceso, son clave los anticuerpos, que se unen por su región variable a los antígenos del microorganismo, y por su
región constante (Fc) al receptor Fc del neutrófilo. Una vez fijado, el microorganismo es rodeado por seudópodos del neutrófilo. Los
seudópodos terminan por confluir, fusionando sus membranas. Posteriormente se forma el «fagosoma», al que se unen los lisosomas
para formar el fagolisosoma, donde se producirá la digestión del patógeno. Las enzimas lisosómicas matan y digieren al
microorganismo fagocitado y el material digerido puede ser liberado al exterior celular mediante exocitosis o bien permanecer en el
interior de la célula formando un cuerpo residual. (Ilustración de: E. Maldonado.)
Una vez formado el fagosoma, se unen a él los lisosomas, cuyas enzimas digieren el material ingerido. La vesícula
resultante tras la unión de los lisosomas se denomina fagolisosoma. Si el material no puede ser digerido
completamente, permanecerá en el interior del lisosoma formando un cuerpo residual (fig. 5-15). Antes de que se
produzca la fusión de los lisosomas, hay moléculas de la membrana endocitada que son recicladas en vesículas de
transporte y devueltas a la membrana plasmática. Por otro lado, existen materiales que los macrófagos no pueden
fagocitar completamente, bien por su excesivo tamaño, o por tratarse de partículas inertes (suturas, látex, etc.).
Cuando esto ocurre, se pueden unir un grupo de macrófagos para formar una célula gigante de cuerpo extraño que
envuelva dicho material (fig. 5-16).
FIGURA 5-15 Cuerpo residual (flecha) en el interior de una célula observado al microscopio electrónico de transmisión. El cuerpo
residual es la última estación en la ruta de digestión lisosómica. (Imagen procedente de: SynapseWeb, Harris KM: http://synapses.clm.utexas.edu.)
232
FIGURA 5-16 Corte histológico de mama que muestra una célula gigante de cuerpo extraño con numerosos núcleos en su interior
(flecha) originada como reacción a la silicona (material birrefringente claro que aparece en la imagen). (Procedente de:
http://www.breastpathology.info/BMS%20Trimming.html.)
Tras una fagocitosis de gran intensidad ante una infección bacteriana, aumenta mucho la presión osmótica en el
interior de los fagocitos. Si se supera un determinado umbral de presión, las membranas pueden romperse y se
provoca la autólisis de las células fagocíticas por las propias enzimas hidrolíticas. Los restos de macrófagos y
neutrófilos necrosados forman entonces el pus.
Transcitosis
Como se ha comentado con anterioridad, la transcitosis (también llamada «citopensis») es el transporte intracelular de
moléculas desde un espacio extracelular a otro diferente mediante vesículas de endo- y exocitosis. Este tipo de
transporte tiene lugar, sobre todo, en células epiteliales polarizadas, como el endotelio vascular o los enterocitos de la
mucosa intestinal.
Un ejemplo de transcitosis lo encontramos en el transporte intracelular de la inmunoglobulina A (fig. 5-17). En los
recién nacidos, el sistema inmunitario no está aún desarrollado y las defensas del organismo son escasas. Por este
motivo, el calostro contiene inmunoglobulinas del tipo IgA, que son incorporadas a la circulación del neonato a través
del epitelio intestinal. Cuando la leche materna alcanza el intestino, el pH ácido de la luz favorece la unión de las IgA
con sus receptores en la superficie de los enterocitos. Tras la unión, se forman vesículas recubiertas de clatrina que se
unen con los endosomas tempranos. De los endosomas, parten vesículas de transporte exocíticas que se fusionan con
la membrana basolateral de la célula. El pH neutro del fluido extracelular provoca que la IgA se disocie de su receptor
y pueda pasar a la circulación.
233
FIGURA 5-17 Transcitosis. El dibujo de la izquierda muestra el proceso de transcitosis de las IgA desde la parte basal de células
epiteliales de la glándula mamaria hacia la luz. El de la derecha muestra la transcitosis de la IgA desde la parte apical de la célula
epitelial de enterocitos a la parte basal, donde alcanza los vasos sanguíneos. (Ilustración de: E. Maldonado.)
Pero antes, para que la IgA llegue a la leche materna, es necesario otro proceso de transcitosis. Durante el embarazo,
con el desarrollo de las glándulas mamarias, el tejido conjuntivo que rodea a los lobulillos glandulares es infiltrado
por linfocitos B. Estos linfocitos B se diferencian a células plasmáticas productoras de IgA; las IgA secretadas son
captadas por la parte basal de la membrana plasmática de las células del epitelio glandular, que las exocitan en la
superficie luminal para que formen parte de la secreción láctea (v. fig. 5-17). Este mismo proceso ocurre en otros
epitelios, como el de las glándulas salivales o el epitelio intestinal adulto, ya que las IgA forman parte de las
secreciones de dichos tejidos.
Pero, sin duda, el proceso de transcitosis más importante es el que tiene lugar en el endotelio vascular. Los capilares
sanguíneos y las vénulas poscapilares son los vasos de intercambio de sustancias, y están constituidos solamente por
una capa de células endoteliales. Para que exista un intercambio eficaz de sustancias (nutrientes o moléculas de
desecho) entre los tejidos y la sangre, dichas sustancias han de atravesar la barrera endotelial. El transporte de
macromoléculas en uno y otro sentido se realiza mediante el proceso de citopensis de vesículas revestidas y, sobre
todo, de cavéolas.
234
Exocitosis
La exocitosis constituye el proceso de fusión de vesículas intracelulares con la membrana plasmática para liberar su
contenido al espacio extracelular. Estas vesículas proceden del complejo de Golgi y se encargan de aportar material
proteico y lipídico a la membrana de la célula. En su interior, pueden contener moléculas muy diversas, y el momento
en el que se produce la secreción distingue los dos procesos de exocitosis. La exocitosis constitutiva aporta las
moléculas que forman parte de la matriz extracelular, además de ampliar la superficie de la membrana por la fusión
de las bicapas lipídicas. Por su parte, la exocitosis regulada es propia de células especializadas y, mediante esta vía, se
secretan hormonas, neurotransmisores o enzimas (fig. 5-18).
FIGURA 5-18 Esquema de las dos rutas de exocitosis: constitutiva y regulada. Ambas vías se separan en la red Trans del Golgi. La vía
constitutiva tiene lugar en todas las células de forma continua; la regulada solo ocurre en aquellas células especializadas en la
secreción de neurotransmisores, enzimas u hormonas, y se activa siempre en respuesta a un estímulo extracelular. CGN, red Cis del
Golgi; TGN, red Trans del Golgi.
Exocitosis constitutiva
La exocitosis constitutiva es la ruta de exocitosis por defecto. En las células no polarizadas, o en aquellas encargadas de
formar la matriz extracelular, las vesículas que salen del Golgi se dirigen, sin ninguna señal específica, hacia la
membrana plasmática. Para la fusión de membranas no se necesita una señal extracelular, algo que sí ocurre en la vía
de secreción regulada.
La vía constitutiva es realizada de un modo continuo por la mayor parte de las células. Entre las moléculas que
salen al medio extracelular por esta ruta, se incluyen proteoglucanos y proteínas de la matriz extracelular, elementos
de las membranas basales de los epitelios, receptores celulares de membrana y los constituyentes de la propia
membrana y del glucocáliz.
235
Cuando las vesículas de secreción se unen con la membrana plasmática, su membrana se suma a la de la célula. Esto
provoca un aumento en la superficie total de la membrana, aunque efímero, pues al mismo tiempo se están
internalizando fragmentos de membrana por endocitosis. Existe, por lo tanto, un equilibrio entre los flujos endo- y
exocítico que regula el crecimiento celular. Los mecanismos de control de esta homeostasis de membrana aún no se
conocen.
Exocitosis regulada
Las células especializadas en secretar sustancias cuando reciben el estímulo adecuado son las únicas que presentan
exocitosis regulada. Las sustancias que se secretan son sintetizadas previamente en el retículo endoplasmático,
procesadas en el Golgi y almacenadas en vesículas de secreción.
236
Gemación y fusión de vesículas en los procesos de
endocitosis y exocitosis
La gemación y formación de las vesículas y el tráfico de estas entre los distintos compartimentos celulares que
participan en los procesos de endocitosis y exocitosis requieren la intervención de tres grupos de proteínas: a)
proteínas de recubrimiento de la vesícula; b) proteínas GTPasas monoméricas y proteínas adaptadoras, que regulan el
proceso de gemación y fusión, y c) proteínas transmembrana de la familia SNARE, que sirven para el anclaje
específico entre la vesícula y el compartimento con el que se fusionan. Hay que tener en cuenta, no obstante, que las
proteínas que intervienen son específicas en cada caso, dependiendo del tipo de compartimento dador-aceptor.
Las vesículas que geman de un compartimento celular concreto pueden estar recubiertas por clatrina o por
coatómeros, que pueden ser de dos tipos: COPI y COPII (v. capítulo 10). El recubrimiento de clatrina participa en la
endocitosis, la exocitosis regulada y en el transporte bidireccional entre la zona Trans del Golgi, los endosomas, los
lisosomas y la membrana plasmática. El recubrimiento de COPII participa en el transporte de vesículas desde el
retículo endoplasmático hasta el Cis-Golgi. Las vesículas que contienen COPI viajan a través de los sacos del Golgi y
realizan un transporte retrógrado Golgi-retículo endoplasmático; participan también en la secreción constitutiva. A
diferencia del recubrimiento de clatrina (que se pierde poco después de ocurrir la gemación de la vesícula), los
coatómeros se mantienen en la vesícula durante su desplazamiento por el citoplasma.
En cuanto a las proteínas GTPasas monoméricas, intervienen dos familias: a) las GTPasas reclutadoras del
recubrimiento: ARF (para el recubrimiento de clatrina y COPI) y Sar1 (para el recubrimiento de COPII), y b) familia de
las Rab; ambas familias pertenecen a la superfamilia de las proteínas Ras (v. capítulo 13). Estas proteínas son activas
cuando llevan GTP unido, mientras que su unión a GDP determina su estado inactivo. Para pasar del estado inactivo
al activo se requiere de la actuación de un factor de intercambio de nucleótidos de guanina GEF (guanine nucleotide
exchange factor), que intercambia el GDP por GTP. Al contrario, para que la proteína se inactive se necesita la actividad
de la proteína GAP (GTPase activating protein), que acelera la actividad de las GTPasas para que puedan disociar el
GTP en GDP+Pi. Nos centraremos, a modo de ejemplo, en la formación de vesículas de clatrina en la zona Trans del
Golgi mediante la actividad de ARF. En condiciones basales, antes de que comience el proceso de gemación de las
vesículas, la proteína ARF se encuentra unida a GDP en el citoplasma (fig. 5-19). La actuación del factor GEF
(localizado en la membrana del Golgi) añade GTP a la proteína ARF, produciendo un cambio conformacional que le
permite activarse y anclarse a la membrana. La ARF-GTP recluta y une proteínas adaptadoras que comienzan el
proceso de gemación de la vesícula a la vez que sirven de puente entre las proteínas transmembrana y la clatrina. El
ensamblaje de la clatrina sobre las proteínas adaptadoras es responsable del proceso de gemación y formación de una
vesícula esférica (v. fig. 5-19). Cuando la vesícula ya se ha formado, se induce la actividad GTPasa de ARF mediante
una proteína gap, hidrolizándose GTP en GDP+Pi, lo que conlleva un cambio conformacional que provoca el
desensamblaje de la cubierta. Se piensa que este proceso de gemación y formación de la cubierta de clatrina puede
237
ocurrir también en la endocitosis mediada por receptor que tiene lugar en la membrana plasmática, pero los
componentes moleculares que intervienen no han sido dilucidados. La fusión de la vesícula secretora con la
membrana del orgánulo diana requiere de dos acontecimientos consecutivos. El primero de ellos es el reconocimiento
de la membrana diana con la cual la vesícula se ha de fusionar y el segundo es la fusión en sí misma: la unión de las
membranas y la liberación del contenido de la vesícula al orgánulo diana o al espacio extracelular. Existen dos
familias de proteínas responsables del reconocimiento específico de membranas y de su ulterior unión: las SNARE y
las GTPasas de direccionamiento Rab.
FIGURA 5-19 Participación de las proteínas ARF en la gemación de vesículas recubiertas por clatrina en la zona Trans del Golgi. Antes
del comienzo de la gemación, ARF está unido a GDP en el citosol. Al iniciarse la gemación, el factor GEF intercambia GDP por GTP, y
ARF cambia de conformación y se ancla en la membrana. Esto inicia el proceso de reclutamiento de proteínas adaptadoras y clatrina,
que se asocian y forman la vesícula. Tras la formación, el factor GAP (no mostrado en el dibujo) induce la disociación del GTP en
GDP+Pi y se desensambla el recubrimiento de la vesícula. (Ilustración de: E. Maldonado y A. Calvo.)
Las proteínas SNARE son proteínas transmembrana complementarias, presentes en la membrana de las vesículas
(v-SNARE) y en la membrana diana (t-SNARE; la t proviene del inglés target, diana) (fig. 5-20). En su dominio
citoplasmático presentan una estructura helicoidal que, al interaccionar con la SNARE complementaria, forma
complejos estables que favorecen la unión de las membranas. Por su parte, las proteínas Rab son las encargadas de
regular la frecuencia de anclaje y fusión de vesículas mediante su interacción con las SNARE. Las proteínas Rab son
GTPasas que, unidas a GDP, se encuentran inactivas y libres en el citosol. En su estado Rab-GTP, están unidas a la
membrana de la vesícula o del orgánulo diana. En este estado, la proteína se puede unir a otras (los efectores de Rab)
que van a dirigir la vesícula hacia su membrana diana específica (v. fig. 5-20). El resultado final de la acción de Rab y
sus efectores es concentrar vesículas cerca de la membrana diana y activar las proteínas SNARE para la fusión y la
exocitosis.
238
FIGURA 5-20 Mecanismo propuesto para el trasvase de vesículas de un compartimento celular a otro, donde participan las proteínas
Rab y SNARE. Una proteína GEF cataliza el cambio de Rab-GDP a Rab-GTP. En su forma activa, la proteína se une a la membrana
de la vesícula en formación (este mecanismo es el mismo que para el ensamblaje de la cubierta, omitido en esta imagen). Una vez que
la vesícula llega a la membrana diana, Rab interacciona con las proteínas efectoras de Rab, lo que favorece el anclaje y la interacción
entre las v- y t-SNARE. Tras la fusión de membranas, el GTP se hidroliza a GDP y Rab queda libre, pudiendo ser reutilizada. La forma
libre en el citosol de Rab-GDP se encuentra unida a un inhibidor de la disociación de GDP que impide que este nucleótido se
intercambie antes de llegar a la membrana dadora. (Ilustración de: E. Maldonado.)
Para que dicha fusión se lleve a cabo, las membranas han de estar ancladas mediante las proteínas v- y t-SNARE.
Tras el anclaje, y ante el estímulo adecuado (un incremento del Ca intracelular en la exocitosis regulada), las SNARE
2+
interaccionan más estrechamente entre sí y reducen la distancia entre las membranas a 1,5 nm. A esta distancia, los
lípidos pueden fluir de una membrana a otra, y así se disgregan y se fusionan. Pero, antes de la fusión, es necesario
desplazar las moléculas de agua que se interponen entre las dos bicapas; para ello, se necesita energía, lo que
implicaría reacciones catalizadas por proteínas especializadas en la fusión de membranas. También se cree que el
enrollamiento de las hélices de las SNARE, con la consiguiente liberación de energía, expulsaría las moléculas de
agua.
239
Exocitosis y endocitosis en la sinapsis neuronal
El ejemplo más estudiado de exocitosis regulada es el de la sinapsis neuronal. La sinapsis es un tipo de unión
intercelular mediante el cual una neurona es capaz de transmitir un potencial de acción eléctrico a otra célula (v.
capítulo 4). Existen dos tipos de sinapsis: la química y la eléctrica. Aquí vamos a considerar únicamente la sinapsis
química, cuyo mecanismo de transmisión es indirecto, pues las células están física y eléctricamente separadas. El
espacio que separa la célula presináptica de la postsináptica mide unos 200-300 Å y recibe el nombre de hendidura o
espacio sináptico.
Cuando la neurona presináptica es excitada, sufre un cambio en su potencial eléctrico que provoca la liberación de
los neurotransmisores, moléculas señal responsables de la transmisión nerviosa. Dichos transmisores, que se
almacenan en vesículas exocíticas, determinan el tipo de sinapsis química. Existen neurotransmisores excitadores,
como la acetilcolina (Ach), el glutamato y la serotonina; y otros inhibidores, como el ácido γ-aminobutírico y la
glicina. El carácter excitador o inhibidor viene dado por el receptor al que se unen en la membrana de la neurona
postsináptica y por el efecto que producen en ella. Estos receptores son proteínas transmembrana que actúan como
canales iónicos regulados por el neurotransmisor, y son selectivos para determinados iones. Así, la apertura de
canales de Na permite la entrada de este ión al interior celular, causando un incremento del potencial eléctrico y la
+
despolarización de la membrana. Por su parte, los canales permeables para el K o el Cl inhiben la transmisión
+
–
nerviosa, pues «negativizan» el interior celular, dificultando la despolarización de la membrana. En resumen, la
sinapsis excitadora es aquella en la que una corriente intracelular de Na despolariza la membrana postsináptica; y la
+
inhibidora es aquella en la que la corriente, ya sea de K o de Cl , hiperpolariza la neurona (v. capítulo 4).
+
–
Pero no solo existen estos neurotransmisores. Hay otros, de estructura más compleja y conocidos como
neuropéptidos, que se unen a receptores metabotrópicos. Estos receptores están formados por una proteína de siete
dominios transmembrana unidos a proteínas G (v. capítulo 13), y median vías de señalización más complejas y de
efectos más lentos y duraderos. La activación de estos receptores desencadena una cascada intracelular de segundos
mensajeros que termina produciendo cambios en las neuronas que intervienen en procesos como el aprendizaje y la
memoria.
Mediante estudios realizados con microscopía electrónica, se pudo poner de manifiesto la estructura anatómica de
la sinapsis. Los terminales presinápticos, estructuras terminales del axón, tienen forma redondeada u ovalada. En su
interior podemos distinguir abundantes mitocondrias y unas estructuras esféricas de aproximadamente 50 nm de
diámetro: las vesículas sinápticas. Algunas de estas vesículas se acumulan en regiones especializadas de la membrana
presináptica denominadas «zonas activas». Es aquí donde se produce la fusión de las vesículas y la liberación del
neurotransmisor a la hendidura sináptica (fig. 5-21). Las vesículas sinápticas tienen un proceso especial de síntesis que
merece la pena comentar. Cuando una neurona es estimulada, debe liberar rápidamente vesículas cargadas de
neurotransmisor para transmitir el impulso nervioso. Además, los estímulos pueden ser continuos, lo que conlleva
240
una repetida liberación de vesículas sinápticas. Cabe pensar que, si las vesículas sinápticas, como el resto de las
vesículas de exocitosis, se generan en el Golgi, la excitación nerviosa mantenida no sería posible, pues el transporte de
vesículas a través del axón es un proceso lento. Por ello, se cree que el proceso de síntesis de vesículas sinápticas
implica una serie de acontecimientos que se describen a continuación (v. fig. 5-21).
FIGURA 5-21 A. Imagen de microscopía electrónica de transmisión de una sinapsis axosomática sobre una célula de Purkinje (P). En
el botón presináptico (B) se aprecian varias mitocondrias y múltiples vesículas sinápticas, la mayoría de ellas concentradas en la zona
activa (zona más electrodensa de la membrana presináptica). Entre ambas membranas se encuentra la hendidura sináptica. B.
Sinapsis axodendrítica. Se aprecia el momento justo en el que varias vesículas de neurotransmisor se fusionan con la membrana
presináptica para liberar su contenido a la hendidura sináptica (flechas). A, axón; D, dendrita. C. Esquema que muestra el proceso
molecular propuesto para la formación de vesículas sinápticas. (A y B, procedentes de: SynapseWeb, Harris KM: http://synapses.clm.utexas.edu. C, ilustración
de: E. Maldonado.)
Desde la red Trans del Golgi surgen vesículas que contienen en su membrana proteínas estructurales y
transportadoras propias de las vesículas sinápticas. Estas vesículas son transportadas a lo largo del axón mediante
transporte anterógrado rápido (200-400 μm/día) utilizando los neurotúbulos y neurofilamentos. Cuando han llegado
al terminal presináptico, se fusionan con la membrana plasmática para liberar los componentes de las vesículas
sinápticas, lo que constituye un proceso de exocitosis constitutiva. Posteriormente, estos componentes son
endocitados (mediante vesículas recubiertas de clatrina) y pueden seguir dos vías: formar directamente vesículas
sinápticas, o bien fusionarse con un endosoma, que funcionaría como estación intermedia. Una vez formadas por una
u otra ruta, las vesículas se cargan de neurotransmisor mediante una proteína de contratransporte que intercambia
protones con la molécula de neurotransmisor (Ach, dopamina, GABA u otros), que es sintetizada en el propio
terminal. El transporte del neurotransmisor se lleva a cabo gracias al gradiente de protones creado por bombas de H
+
que se encuentran en la membrana de la vesícula. Aquí resulta clave el papel de las mitocondrias del botón terminal,
pues se encargan de generar el ATP necesario para que se lleve a cabo este proceso.
Tanto en las vesículas sinápticas como en la membrana plasmática presináptica se encuentran las proteínas que
forman el complejo SNARE. La v-SNARE corresponde a la sinaptobrevina, y la t-SNARE a la sintaxina y la SNAP-25
241
(figs. 5-22 y 5-23). Algunas vesículas están ancladas a la membrana gracias a la unión parcial del complejo SNARE;
dichas vesículas se encuentran en un estado de prefusión que permite la liberación rápida del neurotransmisor una
vez llega el potencial de acción.
FIGURA 5-22 Esquema que representa el complejo SNARE de la sinapsis neuronal. La sinaptobrevina (v-SNARE) se encuentra
anclada con la sintaxina y la SNAP-25 (t-SNARE). La sinaptotagmina (con sus dominios C2A y C2B) es una proteína integral de la
membrana vesicular que actúa como sensor de Ca2+. Cuando este se une, se pone en marcha toda la maquinaria que termina por unir
ambas membranas y liberar el neurotransmisor al espacio sináptico. (Ilustración de: E. Maldonado.)
242
FIGURA 5-23 Esquema de la maquinaria exocítica de una vesícula sináptica con la membrana del terminal axónico. 1, la vesícula se
encuentra anclada al citoesqueleto por la sinapsina. La llegada de Ca2+ activa a la calmodulina y esta a la CAM-quinasa, que libera a la
vesícula. 2, la vesícula desciende hasta la membrana plasmática y las SNARE interactúan entre sí. 3, acoplamiento de las SNARE y
fusión de las membranas. 4, el complejo NSF/α-SNAP, utilizando ATP, desensambla el complejo de fusión. 5, la vesícula vuelve al
interior citoplasmático. (Ilustración de: E. Maldonado y A. Calvo.)
Para que la liberación del neurotransmisor se lleve a cabo, la neurona debe ser previamente excitada por un
potencial de acción que la recorra y que llegue hasta el botón presináptico. En este punto, el potencial activa canales
de Ca dependientes de voltaje y se produce un incremento brusco y súbito de la concentración de Ca intracelular. El
2+
2+
proceso de fusión de las vesículas sinápticas se puede dividir en cinco etapas (v. fig. 5-23). En la primera se produce
una aproximación (1) de la vesícula desde una zona más interna del citoplasma, donde está anclada mediante la unión
de la sinapsina al citoesqueleto, hacia la membrana plasmática. Parte del Ca que entra en el terminal se une a la
2+
calmodulina, una proteína que, tras dicha unión, sufre un cambio conformacional que le permite activar a la CAM
quinasa. Esta enzima fosforila a la sinapsina, separándose entonces del citoesqueleto y dejando libre a la vesícula para
que esta pueda ser exocitada.
Por otro lado, el Ca que ha entrado en el botón terminal se une también a la sinaptotagmina, proteína sensora de
2+
calcio unida a la vesícula sináptica. Cuando la sinaptotagmina no está unida a Ca impide la interacción de las v- y t2+
SNARE. La unión al Ca promueve un cambio conformacional que deja libre a las SNARE para que se unan entre sí.
2+
La vesícula, por lo tanto, desciende (2) y las v- y t-SNARE, interactuando entre sí (3), facilitan el anclaje de la vesícula a
la membrana plasmática. El siguiente paso es la fusión de las membranas, proceso en el que parece intervenir la
proteína sinaptofisina (no dibujada en el esquema), que actúa como un poro que, al abrirse, inicia la fusión de las
membranas y la liberación del neurotransmisor. Tras la fusión y liberación del neurotransmisor entra en acción el
complejo formado por las proteínas α-SNAP y el factor sensible a N-etilmaleimida (NSF, del inglés N-ethylmaleimide
sensitive factor), con el objetivo de desensamblar (4) el complejo de fusión y reciclar las SNARE. Este proceso requiere
la energía proporcionada por la actividad ATPasa del NSF. La actividad de este complejo permite separar (5) de
nuevo la vesícula y que la situación vuelva a la inicial (v. fig. 5-23). La incorporación de múltiples vesículas sinápticas
incrementaría la superficie del botón terminal con la consiguiente desestructuración del mismo. Pero esto no ocurre,
gracias a un proceso de endocitosis mediante el cual se recupera la membrana fusionada. Sin embargo, el proceso de
endocitosis es mucho más lento que el de exocitosis, por lo que no se explica que la membrana no se altere, ni tampoco
cómo puede la neurona presináptica descargar múltiples vesículas en un período de tiempo tan corto como el de la
sinapsis (del orden de milisegundos).
La explicación a estos fenómenos se encuentra en la llamada teoría de «kiss and run» («besa y corre»). Esta teoría
defiende que, durante la exocitosis, la membrana de la vesícula sináptica no se fusiona por completo con la membrana
plasmática, sino que se produce un contacto temporal y reversible de ambas membranas. Durante el mismo, se libera
el neurotransmisor, e inmediatamente después, se internaliza la vesícula. Todo ello implica que los procesos de
exocitosis y endocitosis dependen el uno del otro, es decir, que están interconectados. Las vesículas internalizadas por
este proceso se pueden volver a cargar de neurotransmisor mediante el transportador transmembrana que
243
intercambia moléculas de neurotransmisor con protones. De esta manera, las vesículas son recicladas y quedan listas
para volver a liberar su contenido en la misma sinapsis o en la siguiente.
Para terminar de completar el proceso de la sinapsis, cuando el neurotransmisor es exocitado y difunde por la
hendidura sináptica, se une a los receptores situados en la membrana del elemento postsináptico (pudiendo ser otra
neurona o una célula efectora, como una fibra muscular o una célula glandular). Con el fin de ilustrar mejor este
proceso, repasaremos el ejemplo de la unión neuromuscular.
La unión neuromuscular es la sinapsis química que se produce entre una motoneurona y una fibra muscular
esquelética, y es la responsable de la contracción muscular. El neurotransmisor de esta sinapsis es la acetilcolina (Ach),
que es sintetizada a partir de acetil-CoA y colina en el terminal presináptico, en una reacción catalizada por la enzima
colina acetiltransferasa (fig. 5-24). La Ach se incorpora a vesículas de endocitosis mediante un transporte acoplado de
tipo antiporte, por el cual se introduce el neurotransmisor a costa de expulsar protones (H ). Los protones han sido
+
introducidos previamente en las vesículas en contra de gradiente mediante la actividad de una ATPasa de tipo
vacuolar. Tras la despolarización de la motoneurona α, situada en el asta anterior de la médula espinal, el impulso
nervioso recorre todo el axón hasta llegar al botón terminal para que las vesículas cargadas de Ach sean exocitadas.
Cuando la Ach difunde por la hendidura sináptica, se une a su receptor en el sarcolema (membrana plasmática de la
célula muscular). Tras dicha unión, el receptor, que es un canal para el Na , se abre y provoca una entrada de este ión
+
que despolariza la membrana e inicia el proceso de contracción muscular.
FIGURA 5-24 El esquema representa el proceso general de la sinapsis colinérgica en la unión neuromuscular. 1, incorporación,
mediante un cotransporte dependiente de Na+, de colina al botón terminal. Síntesis de acetilcolina (Ach) catalizada por la colina
acetiltransferasa. 2, incorporación de Ach a la vesícula sináptica mediante un antiporte con H+. 3, cuando el Ca2+ penetra en el terminal,
la vesícula sináptica es exocitada y la Ach se libera al espacio sináptico. 4, unión del neurotransmisor a sus receptores en la membrana
de la célula muscular. 5, degradación de la Ach por la acetilcolinesterasa (AchE). (Ilustración de: E. Maldonado.)
Para que el estímulo de la Ach no sea excesivo en intensidad ni en duración, el neurotransmisor debe ser
rápidamente eliminado del espacio sináptico. Esto se consigue mediante la actividad de una enzima, la
acetilcolinesterasa (AchE), presente en la hendidura y encargada de hidrolizar la Ach en acetato y colina, productos
244
sin actividad biológica. Posteriormente, la colina es captada por un transportador de membrana presináptico de tipo
simporte acoplado al transporte de Na , que la reintroduce en el citoplasma del botón terminal para su reciclaje.
+
Por último, en el proceso de eliminación de neurotransmisores del espacio sináptico, muchos de ellos (pero no la
Ach) se reciclan intactos, introduciéndose de nuevo en la neurona presináptica. Ejemplos de estos neurotransmisores
son el GABA, la noradrenalina, la dopamina y la serotonina. Este sistema de transportadores es de tipo simporte y
acopla la incorporación del neurotransmisor a la introducción de Na . Los transportadores de serotonina, dopamina y
+
noradrenalina son inhibidos por la cocaína. Estos transportadores poseen importancia clínica, pues son la diana de
acción de algunos fármacos antidepresivos, conocidos como antidepresivos inhibidores de la recaptación. Estos
pueden ser no selectivos (como los tricíclicos) o selectivos, como los inhibidores selectivos de la recaptación de
serotonina. Su mecanismo de acción se fundamenta en la teoría monoaminérgica de la depresión, que postula que la
génesis de esta enfermedad se encuentra en un déficit de neurotransmisión a nivel cerebral de determinados
transmisores como la noradrenalina, la serotonina y la dopamina. Al administrar estos fármacos, los niveles de dichos
neurotransmisores aumentan en el espacio sináptico. Con ello se favorece la transmisión nerviosa en determinadas
regiones corticales y se produce una mejora de los síntomas depresivos.
Para finalizar, comentaremos brevemente dos patologías que se producen por disfunciones en la sinapsis neuronal.
La AchE de la placa neuromuscular constituye una importante diana terapéutica en el tratamiento de la miastenia
grave (o gravis). Esta es una enfermedad autoinmune que afecta a la placa neuromuscular. En la mayoría de los casos,
está causada por la presencia de autoanticuerpos dirigidos contra el receptor nicotínico de la Ach de la membrana de
la fibra muscular. Estos anticuerpos pueden bloquear o destruir los receptores, disminuyendo su número e
imposibilitando la contracción muscular. Clínicamente, la enfermedad se presenta con fatiga y debilidad fluctuante de
la musculatura esquelética. Los síntomas empeoran con la actividad y mejoran con el reposo. La musculatura más
frecuentemente afectada es la ocular extrínseca, provocando ptosis palpebral (caída del párpado superior) y diplopía
(visión doble); también se afecta la musculatura bulbar, causando disartria (un trastorno del habla) y disfagia
(dificultad para la deglución). Como ya se ha mencionado, el tratamiento de la enfermedad se basa en el empleo de
fármacos anticolinesterásicos como la neostigmina y la piridostigmina. Estos agentes terapéuticos que inhiben la AchE
provocan un aumento de la presencia de la Ach en la unión neuromuscular, con lo que se incrementa la fuerza
muscular. Otros tratamientos se basan en reducir la respuesta inmunitaria anómala con el empleo de
inmunodepresores, plasmaféresis, inmunoglobulina intravenosa o recurriendo a la timectomía.
El otro ejemplo de enfermedad que afecta a la sinapsis es el botulismo. En este caso, se afecta la sinapsis colinérgica
tanto en los ganglios nerviosos periféricos como en la unión neuromuscular. Constituye un síndrome neuroparalítico
causado por la toxina de Clostridium botulinum (toxina botulínica), una bacteria anaerobia ubicua en nuestro medio. La
neurotoxina de esta bacteria está compuesta por dos subunidades: una pesada, que se une al receptor de membrana, y
otra ligera, que se transloca al interior del citoplasma neuronal mediante endocitosis mediada por receptor. En el
interior celular, la toxina se une a la sinaptotagmina II bloqueando la liberación de la Ach y, por lo tanto, la sinapsis.
245
La enfermedad se presenta con debilidad de la musculatura inervada por los pares craneales de forma bilateral y
continúa con afectación simétrica descendente. El tratamiento de la enfermedad se realiza con inmunoglobulinas
antitoxina.
La toxina botulínica (Botox ) se ha hecho famosa por su aplicación en la industria cosmética. Dosis diluidas de esta
®
toxina se emplean para eliminar las arrugas que aparecen en la piel al suprimir la contracción de la musculatura facial.
246
Mecanismos de infección que dependen del macrotransporte a
través de la membrana plasmática
Como se indicó previamente, los microorganismos patógenos han desarrollado estrategias para infectar nuestras
células utilizando las rutas de macrotransporte. Dicha capacidad de infección y de proliferación intracelular supone
una ventaja adaptativa para ellos. En primer lugar, dentro de las células, los microorganismos se aprovechan de estas
para obtener nutrientes y así poder desarrollarse y proliferar. Además, están a salvo de la acción de los anticuerpos y
de los macrófagos, elementos constituyentes del sistema inmunitario. De esta manera, su erradicación resulta más
complicada para el organismo hospedador.
Los patógenos, agentes causantes de enfermedades infecciosas y parasitarias, constituyen un grupo muy
heterogéneo de microorganismos. Probablemente, los más conocidos sean las bacterias y los virus, pero también
podemos encontrar hongos, parásitos e, incluso, estructuras tan simples como las proteínas priónicas. En esta sección
se exponen algunos ejemplos de cómo los patógenos se aprovechan de las rutas de endocitosis y exocitosis para
infectar a las células y, posteriormente, diseminarse por otras estructuras del organismo.
Endocitosis de virus por la célula huésped
La mayoría de los virus penetran en las células mediante endocitosis. Tras esta, los virus siguen la ruta endocítica
pasando por diversos compartimentos endosómicos y, una vez allí, liberan su genoma al citoplasma celular. El
proceso difiere según el tipo de virus. Así, los virus envueltos (aquellos recubiertos de una membrana lipídica)
fusionan su envoltura con la del orgánulo celular, gracias a un proceso catalizado por proteínas. Los virus no
envueltos, por su parte, lisan la membrana de los endosomas o generan en ella un poro para que el genoma lo
atraviese.
El virus de la gripe (como se explicó en el capítulo 1) es un tipo de virus de ARN envuelto, único integrante de la
familia de los ortomixovirus. En su bicapa lipídica hay dos tipos de proteínas integrales de membrana, la
hemaglutinina (HA) y la neuraminidasa (NA). En su cara interna se encuentran las proteínas de la matriz (M1) y de
membrana (M2). La hemaglutinina se une a un residuo de ácido siálico del receptor de la superficie celular epitelial y
estimula la fusión de la envoltura vírica con la membrana celular. Tras la unión con el receptor, el virus sufre un
proceso de endocitosis mediada por receptor y penetra en la célula en una vesícula recubierta de clatrina. A
continuación, pasa por diversos compartimentos hasta llegar al endosoma tardío. En el ambiente ácido del endosoma
(pH
∼ 5), la HA cataliza
ribonucleoproteínas del virus (fig. 5-25). El último paso de la infección consiste en el anclaje de estas
247
ribonucleoproteínas a un complejo de poro nuclear y la internalización del ARN al interior del núcleo para su
expresión y replicación.
FIGURA 5-25 Penetración del virus de la gripe en las células. A través de la hemaglutinina, el virus se une a residuos de ácido siálico
del receptor de membrana. A continuación, el complejo virus-receptor es endocitado en una vesícula recubierta. El virus llega
finalmente al endosoma, cuyo pH ácido activa a la hemaglutinina; así, se fusionan las membranas y el genoma vírico es liberado al
citosol del huésped. La liberación del ARN de su cubierta proteica se produce también gracias al ambiente ácido endosómico. (Ilustración
de: E. Maldonado.)
Cuando el virus ya se ha replicado y ha sintetizado las proteínas de la cápside, abandona la célula por gemación
desde la superficie apical de las células de las vías respiratorias superiores. Así, puede infectar a otras células o
transmitirse a otro huésped.
Mecanismos de infección de las bacterias intracelulares
El caso de las bacterias es distinto. Las bacterias presentan un tamaño mucho mayor que el de los virus, con lo que no
pueden aprovecharse del mecanismo de endocitosis mediada por receptor. Como se vio en el apartado «Fagocitosis»
de este mismo capítulo, las bacterias son fagocitadas por diversos tipos celulares para prevenir y eliminar la infección.
Ahora bien, existen bacterias de vida intracelular que han desarrollado la capacidad de sobrevivir en el ambiente
hostil de los fagocitos; en su interior, pueden permanecer en estado de latencia o incluso proliferar y continuar con el
proceso infeccioso.
Un ejemplo clásico de bacteria intracelular es el Mycobacterium tuberculosis o bacilo de Koch, agente responsable de
la tuberculosis. La tuberculosis es una enfermedad que afecta de forma característica a los pulmones, causando una
lesión típica: el granuloma caseoso. Cuando una persona se expone a la bacteria, esta alcanza las vías respiratorias
inferiores llegando hasta los alvéolos, donde son fagocitadas por los macrófagos alveolares. Para sobrevivir en su
interior, M. tuberculosis inhibe la fusión entre el fagosoma y los lisosomas, impidiendo así que las enzimas ácidas la
ataquen. Además, los bacilos fagocitados forman intermediarios reactivos del nitrógeno a partir del NO y los aniones
superóxido, con lo que evitan su destrucción. Tras la infección, los macrófagos secretan determinadas moléculas que
favorecen la inflamación, atrayendo hacia el foco infeccioso a linfocitos T y células NK. El resultado de todo ello es la
formación del granuloma tuberculoso, una estructura histopatológica formada por un núcleo necrótico de
macrófagos, células epitelioides y células gigantes de Langhans con micobacterias fagocitadas, todo ello rodeado por
248
una pared de linfocitos T, células NK y macrófagos. Las micobacterias pueden quedar, así, en un estado latente que
puede prolongarse durante décadas. Los cambios en el estado inmunológico del paciente portador de los bacilos
pueden reactivar la infección y causar la enfermedad tuberculosa.
Por otra parte, hay bacterias capaces de inducir un proceso de fagocitosis en células que no disponen habitualmente
de esta capacidad. Un ejemplo de estas bacterias lo constituye Listeria monocytogenes, un bacilo grampositivo
intracelular. Listeria es un patógeno ubicuo causante de listeriosis, una rara enfermedad relacionada con el consumo
de alimentos contaminados. Cuando se ingieren dichos alimentos, la bacteria es capaz de sobrevivir a la acción de los
ácidos gástricos, las enzimas digestivas y las sales biliares. De esta forma, alcanza el intestino y se une a los enterocitos
y las células M de las placas de Peyer. Para adherirse a la membrana celular, Listeria utiliza unas proteínas,
denominadas internalinas, que se unen a la cadherina E (proteína de adhesión). Este hecho provoca que la célula
intente formar un complejo de unión movilizando el citoesqueleto de actina (v. capítulo 12); finalmente, la célula se va
extendiendo alrededor de la bacteria y esta termina por ser fagocitada. Este mecanismo de invasión se conoce como
mecanismo de tipo cremallera (fig. 5-26).
FIGURA 5-26 A. Mecanismo de cremallera para la invasión de células no fagocíticas. Algunas bacterias presentan en su superficie
unas proteínas, denominadas «adhesinas», que se unen a receptores en la membrana del huésped. Finalmente, la bacteria queda
engullida en una vacuola endocítica. B. Mecanismo desencadenante de invasión celular. El mecanismo de secreción de tipo III de
algunas bacterias introduce en el citoplasma de la célula a infectar una serie de toxinas que activan a la enzima Rho-GTPasa. Esta
enzima favorece la polimerización del citoesqueleto de actina para crear ondulaciones de membrana y, finalmente, una vacuola que
engulla a la bacteria. (Ilustración de: Diego Peñafiel.)
Posteriormente, la vacuola fagocítica se une a los lisosomas generando un pH ácido en su interior. El bajo pH activa
la listeriolisina O (una toxina) y la fosfolipasa C (una enzima) de la bacteria que lisan la membrana del fagolisosoma,
liberando a aquella al citoplasma. Una característica llamativa de Listeria es su facultad de moverse por el interior
celular gracias a su capacidad para ensamblar la actina. Una proteína de la bacteria, la ActA, induce el ensamblaje de
los filamentos de actina y permite a Listeria desplazarse hacia la membrana de la célula, donde forma una protrusión
que es finalmente fagocitada por una célula vecina (v. capítulo 12). De esta manera, Listeria es capaz de diseminarse
por las células adyacentes. Otras bacterias también utilizan este desplazamiento basado en la actina, como algunas
especies de Shigella y de Rickettsia.
El otro mecanismo de invasión de células sin capacidad fagocítica es el mecanismo desencadenante (v. fig. 5-26).
Este mecanismo comienza cuando la bacteria introduce en el citosol de la célula hospedadora una serie de moléculas a
través de un sistema de secreción de tipo III. Dicho sistema funciona como una especie de jeringa molecular, gracias a
249
la cual, la bacteria, que no se adhiere a la célula hospedadora, inyecta en ella proteínas que favorecen su ingestión. Así
ocurre, por ejemplo, en las especies del género Shigella, una bacteria que causa una enfermedad intestinal conocida
como shigelosis o disentería. El sistema de secreción de tipo III de Shigella inyecta cuatro proteínas que provocan la
ondulación de las membranas de las células epiteliales y los macrófagos, ondulaciones similares a las de los
macropinosomas. Por lo tanto, estas bacterias (y otras como Salmonella) son endocitadas por un mecanismo que
recuerda a la macropinocitosis. Las bacterias, una vez engullidas, pueden replicarse dentro del macropinosoma, como
en el caso de Salmonella, o bien lisarlo y replicarse libremente en el citoplasma celular, como hace Shigella.
Invasión de parásitos intracelulares
Las infecciones parasitarias tienen un mecanismo patogénico radicalmente distinto al expuesto hasta ahora. Si los
virus y las bacterias se aprovechan de la maquinaria y de la energía de la célula a la que van a infectar, los parásitos
emplean su propia energía para invadir las células.
Así lo hace, por ejemplo, Toxoplasma gondii, un parásito intracelular presente en muchos animales, cuyo
hospedador típico es el gato, y que también afecta al ser humano. Este microorganismo posee un complejo apical
denominado «conoide», una estructura de microtúbulos en espiral, clave para la invasión celular. Gracias al conoide,
el parásito se reorienta hacia la célula y, a partir de ahí, empieza a empujar la membrana celular para abrirse camino
hacia el interior. Conforme avanza, va secretando lípidos y proteínas que van a formar una vacuola que termina por
envolver al parásito. De esta forma, Toxoplasma queda alojado en el interior de la célula huésped, pero recubierto por
una membrana propia, que lo aísla y lo protege frente a la digestión celular.
Trypanosoma cruzi es otro parásito que provoca enfermedad en los humanos. En concreto, da lugar a la enfermedad
de Chagas, una patología multiorgánica exclusiva del continente americano. Este parásito interacciona con las
integrinas β1 de la membrana de la célula hospedadora, provocando así un aumento del calcio a nivel local. Este
hecho sirve para atraer lisosomas al citoplasma sobre el que se encuentra el parásito. Los lisosomas se fusionan con la
membrana plasmática y, de esta manera, forman una vacuola en la que entra Trypanosoma. Una vez dentro de ella, el
parásito secreta una enzima y una toxina que provocan la lisis de la membrana vacuolar, quedando así libre en el
citoplasma de la célula huésped, donde se replica.
Lecturas recomendadas
Cohen AW, Hnasko R, Schubert W, Lisanti MP. Role of caveolae and caveolins in health and disease. Physiol Rev. 2004;84(4):1341–1379.
Hansen CG, Nichols BJ. Molecular mechanisms of clathrin-independent endocytosis. J Cell Sci. 2009;122(Pt 11):1713–1721.
250
Henley JR, Cao H, McNiven MA. Participation of dynamin in the biogenesis of cytoplasmic vesicles. FASEB J. 1999;13(Suppl 2):S243–
S247.
Lakadamyali M, Rust MJ, Zhuang X. Endocytosis of influenza viruses. Microbes Infect. 2004;6(10):929–936.
Lledo PM. Exocytosis in excitable cells: a conserved molecular machinery from yeast to neuron. Eur J Endocrinol. 1997;137(1):1–9.
Nichols B. Caveosomes and endocytosis of lipid rafts. J Cell Sci. 2003;116(Pt 23):4707–4714.
Pang ZP, Südhof TC. Cell biology of Ca2+-triggered exocytosis. Curr Opin Cell Biol. 2010;22(4):496–505.
Parkar NS, Akpa BS, Nitsche LC, Wedgewood LE, Place AT, Sverdlov MS, et al. Vesicle formation and endocytosis: function,
machinery, mechanisms, and modeling. Antioxid Redox Signal. 2009;11(6):1301–1312.
Swanson JA, Watts C. Macropinocytosis. Trends Cell Biol. 1995;5(11):424–428.
Tuma PL, Hubbard AL. Transcytosis: crossing cellular barriers. Physiol Rev. 2003;83(3):871–932.
Preguntas de autoevaluación
1. En relación con la endocitosis mediada por receptor, ¿cuál es la respuesta falsa?:
a. La clatrina se une a las vesículas después de su internalización, para dirigirlas al compartimento endosómico.
b. Mientras que los receptores de LDL son reciclados después de su internalización, los receptores de EGF son
degradados.
c. Un trisquelión es una unidad de clatrina, cada una de ellas formada por tres subunidades grandes y tres
pequeñas.
d. La unión entre la clatrina y los receptores de membrana no es directa, pues necesita de proteínas adaptadoras
para ello.
e. Los cuerpos multivesiculares son orgánulos celulares derivados de los endosomas.
Respuesta correcta: a.
2. Señale la opción falsa con respecto a la hipercolesterolemia familiar:
a. Es una enfermedad genética con herencia autosómica.
b. Entre sus manifestaciones clínicas, encontramos depósitos de lípidos en varios tejidos y complicaciones
cardiovasculares, como el infarto.
251
c. El defecto molecular que explica la enfermedad se encuentra en los receptores de membrana para las moléculas
de LDL.
d. La ruta de síntesis hepática de LDL-colesterol es defectuosa en esta patología.
e. La esperanza de vida de los pacientes afectos es actualmente inferior a la de las personas que no padecen la
enfermedad.
Respuesta correcta: d.
3. Señale la respuesta correcta en relación con el proceso de endocitosis mediada por cavéolas:
a. Las cavéolas son estructuras que solo se encuentran en el endotelio vascular y en las células musculares.
b. Las bacterias constituyen el ejemplo típico de microorganismo que utiliza las cavéolas para infectar las células.
c. Las mutaciones en las caveolinas, proteínas principales de las cavéolas, se han relacionado con diversas afecciones
musculares.
d. Las cavéolas intervienen en el proceso de homeostasis del colesterol, pues el colesterol que liberan al espacio
extracelular es captado por las moléculas de LDL.
e. La caveolina es una proteína integral ubicua en la membrana plasmática, pues no se concentra en regiones
concretas de la misma.
Respuesta correcta: c.
4. Señale la opción correcta sobre el proceso de transcitosis:
a. La transcitosis es un proceso unidireccional en el que las moléculas solo se transportan del polo apical al polo
basal de las células.
b. Las células epiteliales son las que más transcitosis presentan.
c. En los estudios con microscopía se observan, fundamentalmente, vesículas recubiertas como mediadoras de la
transcitosis.
d. Su existencia es imprescindible para que las células obtengan sus nutrientes y puedan eliminar los productos de
desecho.
e. Mediante este proceso, las inmunoglobulinas IgA e IgE pueden formar parte de las secreciones externas.
Respuesta correcta: d.
5. ¿Cuál de las siguientes afirmaciones sobre el mecanismo de la exocitosis es falsa?
a. Las vesículas de exocitosis abandonan el Golgi sin un recubrimiento proteico.
252
b. La exocitosis constitutiva sirve para incluir en la membrana receptores y moléculas del glucocáliz, así como
elementos de las membranas basales y de la matriz extracelular.
c. La exocitosis regulada solo la llevan a cabo determinados tipos celulares y en presencia de estímulos concretos,
como potenciales de acción u hormonas.
d. Las proteínas ARF son enzimas con actividad GTPasa que intervienen en la formación de las vesículas de
exocitosis.
e. En el proceso de fusión de membranas, las principales proteínas implicadas son las SNARE y las Rab.
Respuesta correcta: a.
6. Con respecto a la sinapsis neuronal, señale la afirmación correcta:
a. Las vesículas sinápticas cargadas de neurotransmisor se sintetizan en el aparato de Golgi y son transportadas
hasta el terminal presináptico.
b. En la sinapsis, las proteínas SNARE son la sinaptotagmina (v-SNARE) y la sintaxina (t-SNARE).
c. La sinapsina mantiene las vesículas sinápticas ancladas al citoesqueleto.
d. La unión neuromuscular (la sinapsis entre la motoneurona y las fibras musculares estriadas) es un ejemplo de
sinapsis eléctrica.
e. El mecanismo de acción de los antidepresivos tricíclicos consiste en su unión a los receptores postsinápticos como
agonistas, emulando la acción de los neurotransmisores.
Respuesta correcta: c.
7. ¿Cuál de las siguientes afirmaciones sobre la miastenia grave es falsa?
a. Se considera una enfermedad de origen autoinmune.
b. La enzima acetilcolinesterasa es la diana terapéutica de los fármacos clásicos empleados para tratar la
enfermedad.
c. Existen anticuerpos dirigidos contra la acetilcolinesterasa, lo que provoca una disminución muy importante del
neurotransmisor disponible en el espacio sináptico.
d. Es una enfermedad que afecta a la sinapsis neuromuscular.
e. La estructura proteica del receptor postsináptico es normal.
Respuesta correcta: c.
8. En relación con las opsoninas:
253
a. Intervienen en la transcitosis.
b. Favorecen la fagocitosis.
c. Intervienen en la exocitosis constitutiva.
d. Facilitan la adhesión de los virus para que puedan entrar en la célula huésped por endocitosis.
e. Participan en la sinapsis neuronal.
Respuesta correcta: b.
9. Con respecto a la infección de células por parte del virus de la gripe, elija la opción falsa:
a. El virus de la gripe es un tipo de virus envuelto que penetra en las células mediante endocitosis mediada por
receptor.
b. Los receptores celulares para este virus contienen residuos de ácido siálico a los que se une la proteína vírica
hemaglutinina.
c. El material genético del virus debe translocarse al núcleo celular para poder ser replicado utilizando las enzimas
de la célula huésped.
d. Tras la endocitosis del virus, la proteína neuraminidasa cataliza la fusión entre la membrana del virus y la del
endosoma, lo que permite la liberación del ARN al citoplasma celular.
e. La salida de las nuevas partículas víricas sintetizadas y ensambladas en la célula huésped se produce mediante
un proceso de gemación de membrana.
Respuesta correcta: d.
10. ¿Cuál de las siguientes opciones sobre los mecanismos de infección de las bacterias intracelulares es correcta?
a. La mayoría de las bacterias penetran en el interior celular mediante un mecanismo de fagocitosis, aunque algunas
pueden hacerlo mediante un proceso de endocitosis mediada por receptor.
b. Toxoplasma gondii es una bacteria que típicamente utiliza el sistema de cremallera para penetrar en la célula
huésped.
c. Algunas bacterias han desarrollado diversos mecanismos, como el desencadenante, para provocar la muerte de la
célula huésped.
d. Mycobacterium tuberculosis impide su digestión intracelular mediante enzimas que atacan y degradan la
membrana del fagolisosoma.
e. La bacteria Shigella posee un mecanismo de secreción de tipo III para promover su fagocitosis y poder replicarse
en el citoplasma celular tras romper la vacuola fagocítica.
254
Respuesta correcta: e.
255
CAPÍTULO 6
256
Especializaciones de la membrana plasmática e
interacción de la célula con su entorno
M.ª Elena Bodegas
Alfonso Calvo
Objetivos de aprendizaje
• Conocer las especializaciones de la membrana plasmática en los distintos dominios celulares (apical, lateral y
basal).
• Comprender la estructura molecular de las diferentes especializaciones de la membrana plasmática.
• Conocer la estructura de la membrana basal y las fibras de la matriz extracelular, así como la biogénesis del
colágeno.
• Relacionar algunas patologías humanas con alteraciones de origen molecular y/o celular en las especializaciones
de membrana plasmática, en la membrana basal y en la matriz extracelular.
Las células se encuentran normalmente asociadas entre sí o con proteínas de la matriz extracelular (MEC) que las
rodea. La interacción de las células con su entorno es de vital importancia para que desarrollen las funciones que
ejercen en un tejido concreto. De hecho, la mayoría de las células necesitan de estas interacciones para su
supervivencia, ya que, si no se pueden adherir al sustrato o a otras células, terminan muriendo por un proceso
llamado «anoikis» (apoptosis causada por falta de adhesión). Este tipo de interacción célula-célula y célula-MEC es
también esencial en la comunicación y señalización intercelulares. La membrana plasmática desempeña un papel
esencial en estos procesos, desarrollando diferentes estructuras que facilitan la adhesión, el contacto con otras células
o, en general, la interacción con el medio que las rodea. En este capítulo, se describen las especializaciones de la
membrana plasmática y las principales moléculas extracelulares con las que interactúan.
257
Especializaciones de la membrana plasmática
La membrana plasmática puede poseer distintas diferenciaciones (fig. 6-1) en: a) la superficie libre de las células
(aquella que no está en contacto con otras células), como las microvellosidades, los cilios y los flagelos (estas dos últimas
diferenciaciones se explican en el capítulo 12), y b) la superficie de contacto con otras células o con la MEC, que
incluyen las interdigitaciones, los pliegues basales y las estructuras de unión célula-célula y célula-MEC. Estas últimas
pueden clasificarse a su vez, atendiendo a su función, en:
• Uniones de anclaje.
• Uniones ocluyentes.
• Uniones comunicantes.
FIGURA 6-1 Representación de una célula epitelial idealizada en la que se han incluido diferenciaciones en la membrana de la
superficie libre de la célula, estructuras de unión celular y la matriz extracelular sobre la que se asientan las células epiteliales. CA,
cinturones de adhesión; CI, cilios; DE, desmosomas; FB, fibroblastos; HD, hemidesmosomas; ID, interdigitaciones; MB, membrana
basal; MEC, matriz extracelular; MV, microvellosidad; PB, pliegues basales; UC, uniones comunicantes; UO, uniones ocluyentes.
(Ilustración de: A. Calvo.)
258
Microvellosidades
Las microvellosidades son proyecciones digitiformes de la superficie apical de las células epiteliales que sirven para
aumentar la superficie de absorción (fig. 6-2, A). Estas estructuras tienen aproximadamente 1 μm de largo y 0,08 μm
de ancho. En su interior, están estabilizadas por un fascículo de 20-30 filamentos de actina, unidos entre sí por villina
y fimbrina y fijados a la membrana celular por medio de miosina I y calmodulina. Estas diferenciaciones de
membrana están ancladas en la red (o velo) terminal, que contiene espectrina, miosina y filamentos intermedios de
queratina. Las microvellosidades tienen un glucocáliz muy desarrollado, que puede ponerse de manifiesto al
microscopio óptico mediante el uso de tinciones específicas para sacáridos, como el PAS (periodic acid Schiff) (fig. 6-2,
B).
FIGURA 6-2 Microvellosidades. A. Representación esquemática de una microvellosidad donde se muestran las proteínas que
configuran su estructura. B. La tinción de PAS permite observar el glucocáliz (color rosado) de la chapa estriada del intestino; CC,
células caliciformes; ChE, chapa estriada; Ent, enterocitos; MB, membrana basal. C. Imagen al microscopio electrónico de
microvellosidades intestinales; GC, glucocáliz; MV, microvellosidades. (B, ilustración de: A. Calvo; C, procedente de: Burrell MA et al. Atlas de ultraestructura
celular. Pamplona: EUNSA; 2011.)
Las microvellosidades se pueden presentar como estructuras individuales en una amplia variedad de células
epiteliales, pero, en muchos otros casos son muy abundantes, como es el caso de los epitelios del intestino, túbulo
contorneado proximal y plexos coroideos. Al microscopio óptico se suele denominar «chapa estriada» al borde apical
PAS+ del epitelio intestinal y «ribete en cepillo»» en el caso de los túbulos contorneados proximales del riñón.
En el epitelio intestinal, las microvellosidades (fig. 6-2, C) desempeñan un papel esencial en la absorción de
alimentos, al aumentar la superficie de membrana que posee gran cantidad de glucoproteínas transportadoras. En la
membrana de las microvellosidades hay además numerosas enzimas que son responsables de los pasos finales de la
digestión de proteínas y azúcares. Cuando estas proteínas se encuentran alteradas por diversas causas, aparecen
cuadros patológicos tanto por defecto (como la intolerancia a la lactosa) como por exceso de absorción (como la
hemocromatosis). La intolerancia a la lactosa suele comenzar en la infancia, aunque sus primeros síntomas pueden
aparecer en la edad adulta. En pacientes con esta enfermedad se observa, entre otras alteraciones, un déficit
secundario de lactasas (enzimas presentes en la membrana de las microvellosidades de los enterocitos), cuya función
259
es desdoblar la lactosa ingerida en las comidas en sus dos componentes básicos: glucosa y galactosa, que
posteriormente serán absorbidas. Cuando esta enzima se encuentra parcial o totalmente ausente, la lactosa no se
digiere, lo que se traduce en un cuadro diarreico. La hemocromatosis es una enfermedad genética autosómica
recesiva que se caracteriza por una excesiva acumulación de hierro en distintos órganos. Esta patología se caracteriza
por la mutación del gen HFE, que condiciona una sobreexpresión en las microvellosidades intestinales del
transportador DMT-1, cuya función es absorber hierro. Por lo tanto, cuando existe un aumento de esta proteína en la
superficie epitelial (como en el caso de la hemocromatosis), esto se traduce en una absorción excesiva de dicho
mineral. La alta concentración de hierro en estos pacientes hace que se acumule en distintos órganos, como el hígado,
el corazón (dando lugar a un cuadro de miocardiopatía) o la hipófisis (lo cual explica el hipogonadismo
hipogonadotrópico en estos pacientes).
Micropliegues: interdigitaciones y pliegues basales
Los micropliegues son evaginaciones/invaginaciones angostas de la membrana celular en la superficie de contacto con
otras células o con la MEC. Pueden aparecer en las superficies laterales y ser de número escaso (interdigitaciones), lo
que permite reforzar la unión entre las células epiteliales (fig. 6-3, A). También pueden aparecer invaginaciones en la
zona basal de la membrana de la membrana de células epiteliales, denominadas pliegues basales (fig. 6-3, B), como es
el caso de los túbulos contorneados distales del riñón, donde son muy profundas y numerosas. En el citoplasma que
queda comprendido entre los pliegues basales se sitúan numerosas mitocondrias. Esta disposición guarda relación
con la regulación osmótica mediante intercambio iónico que desempeñan estas células, para lo que necesitan una gran
fuente de energía. Las invaginaciones aumentan la superficie de la zona basal de la membrana en la que se encuentran
situadas las proteínas transportadoras de iones.
FIGURA 6-3 Micropliegues. A. Interdigitaciones en células epiteliales; D, desmosomas; Int, interdigitaciones; N1, núcleo de la célula 1;
N2, núcleo de la célula 2. B. Pliegues basales de células epiteliales del túbulo contorneado distal; MT, mitocondrias; PB, pliegues
basales. (A, procedente del: Departamento de Histología y A. P. de la Universidad de Navarra; B, procedente de: Fawcett DW. The Cell. Philadelphia: Saunders Company;
1981.)
Uniones de anclaje celular
260
Las células se adhieren entre sí y con la MEC a través de moléculas de membrana específicas llamadas moléculas de
adhesión celular. Estas moléculas son principalmente proteínas transmembrana que, junto a otras proteínas
asociadas, pueden estar ubicadas en sitios específicos de la membrana plasmática. Las proteínas transmembrana que
participan en la adhesión pertenecen, fundamentalmente, a cuatro familias: cadherinas, integrinas, selectinas y
moléculas de adhesión celular de la superfamilia de las inmunoglobulinas (IgSF-CAM, del inglés immunoglobulin
superfamily-cell adhesion molecules). Estas proteínas transmembrana establecen uniones con proteínas de células vecinas
o de la MEC (en el caso de las integrinas), para ejercer su función adherente. Las proteínas de estas familias pueden
ser monoméricas (IgSF-CAM y selectinas) o aparecer en forma de dímeros; así, las cadherinas forman homodímeros
(dímeros formados por el mismo tipo de proteína), mientras que las integrinas forman heterodímeros (dímeros
constituidos por proteínas diferentes) (tabla 6-1). Asociadas a estas proteínas transmembrana se encuentran gran
cantidad de proteínas, situadas normalmente en el lado citoplasmático, que participan en la estructuración y
estabilización de la unión y en su anclaje al citoesqueleto celular. Cuando una proteína de adhesión de una célula se
une a otra del mismo tipo en la célula vecina, hablamos de uniones homófilas, mientras que, si se une a proteínas (u
otro tipo de moléculas) diferentes, hablamos de uniones heterófilas. Las uniones también pueden ser de tipo estable o
transitorio (v. tabla 6-1).
Tabla 6-1
Tipos de moléculas de adhesión
celular que participan en uniones
de anclaje y tipos de interacciones
que establecen
A continuación, señalaremos las
principales características de las
proteínas de adhesión celular.
Cadherinas
La familia de las cadherinas constituye una familia de proteínas cuya estructura está compuesta por 700-750
aminoácidos. Son proteínas de paso simple y presentan cinco dominios extracelulares, cuatro de los cuales son
homólogos y contienen sitios de unión al Ca (fig. 6-4, A). Las cadherinas forman homodímeros y presentan uniones
2+
homófilas dependientes de Ca . Al grupo de las cadherinas pertenecen más de 40 proteínas diferentes, entre las que
2+
cabe destacar la cadherina E (que se encuentra en las células epiteliales) (fig. 6-4, B) y la cadherina N (presente en
células del tejido nervioso, el cristalino del ojo y las células musculares esqueléticas y cardíacas).
261
FIGURA 6-4 Cadherinas. A. Representación de la estructura de las cadherinas y las proteínas que interactúan con ella en el dominio
citoplasmático. B. Inmunofluorescencia de células epiteliales en cultivo marcadas con anticuerpos anticadherina-E (color rojo). El
marcaje se observa en las membranas celulares. El color azul corresponde a una tinción de contraste de los núcleos celulares. (A,
ilustración de: A. Calvo.)
Las cadherinas se pueden agrupar en lugares concretos de las células para formar estructuras complejas de anclaje
(o adhesión). Estas estructuras son típicas de células epiteliales, aunque también aparecen en otros tipos de tejidos.
Existen dos clases fundamentales de estructuras complejas de anclaje dependientes de cadherinas:
1. La zonula adherens o cinturón de adhesión.
2. La macula adherens o desmosoma.
A continuación, analizaremos la organización básica de cada una de estas estructuras y alguna de las patologías que
se desarrollan cuando se desorganizan o sufren alteraciones.
Zonula adherens o cinturón de adhesión
La zonula adherens consiste en un cinturón celular con función adherente de 0,1-0,5 μm de espesor, situado
normalmente en la zona apical de las membranas laterales celulares, que desempeña un papel esencial en el anclaje de
células epiteliales (fig. 6-5, A). Las cadherinas (llamadas desmocolinas y desmogleínas) constituyen las proteínas
transmembrana de estas estructuras, cuya porción citoplasmática se une a una placa de adhesión que contiene
desmoplaquina, placofilina y placoglobina (catenina γ) (fig. 6-5, B). Un complejo de cateninas α y β unen la placa de
adhesión a filamentos de actina que se extienden por el citoplasma, formando una red de anclaje intracitoplasmática.
La unión por medio de cinturones de adhesión deja un espacio entre las células de 20-40 nm de ancho.
262
FIGURA 6-5 Cinturones de adhesión y desmosomas. A. Representación de los cinturones de adhesión, desmosomas y
hemidesmosomas en células epiteliales. B. Moléculas que intervienen en los cinturones de adhesión. C. Imagen de microscopía
electrónica de un desmosoma. D. Representación de las moléculas que forman parte del desmosoma. (A, B y D, ilustraciones de: A. Calvo.)
Macula adherens o desmosoma
La macula adherens (también denominada desmosoma) es una unión puntiforme con un tamaño de 0,1-0,5 μm que se
sitúa normalmente en las membranas laterales de las células epiteliales, proporcionando anclaje entre ellas (fig. 6-5, C).
También existen este tipo de uniones en los discos intercalares que unen los cardiomiocitos adyacentes en el corazón,
donde cumplen una función importante en el mantenimiento estructural del tejido cardíaco. Las proteínas
transmembrana que forman los desmosomas también son cadherinas (desmocolinas y desmogleínas). En este
sentido, los desmosomas resultan comparables, desde un punto de vista estructural, a los cinturones de adhesión,
pero son de morfología puntiforme y no poseen cateninas α y β (fig. 6-5, D). En este caso, la placa de adhesión del
desmosoma se une directamente a filamentos intermedios, en lugar de a filamentos de actina. En la piel, los
filamentos intermedios son de queratina (tonofilamentos), de desmina en los discos intercalares de los cardiomiocitos
y de vimentina en las meninges que revisten la superficie externa del encéfalo y la médula espinal. Los desmosomas
dejan un espacio célula-célula de 20-40 nm.
Existen diferentes tipos de desmogleínas, que se expresan de modo distinto según los tejidos. Las principales
desmogleínas presentes en la epidermis de la piel (donde los desmosomas son muy abundantes) son las desmogleínas
1 y 3. Dos enfermedades dermatológicas en las que las desmogleínas están implicadas son el pénfigo vulgar y el
pénfigo foliáceo. Se trata de enfermedades caracterizadas por la presencia de ampollas en la superficie cutánea de los
pacientes. El pénfigo vulgar (PV) es una enfermedad que se caracteriza por la aparición, en la superficie de la piel, de
263
ampollas que se rompen con mucha facilidad (fig. 6-6, A). Las lesiones pueden localizarse en la mucosa oral (fig. 6-6,
B), o extenderse a lo largo de la piel de la cara, el cuello, las extremidades y el tronco. Los pacientes refieren prurito y
dolor en las áreas afectadas, y es común sufrir infecciones como consecuencia de la ulceración de las lesiones. El
estudio anatomopatológico del PV muestra una separación entre los queratinocitos de la piel, denominada acantólisis
(fig. 6-6, C). Estas lesiones se localizan, típicamente, por encima de la capa basal de la epidermis. El análisis de las
biopsias por inmunofluorescencia revela un depósito de IgG sobre la superficie de los queratinocitos, ya que es una
enfermedad de tipo autoinmune. Los autoanticuerpos de los pacientes se dirigen frente a desmogleína 3 (que se
expresa principalmente en la capa basal de la piel y las mucosas), frente a desmogleína 1 (que se expresa sobre todo
en las capas superficiales de la piel y, en menor medida, en las mucosas), o frente a ambas. Los autoanticuerpos son
los responsables de la desestructuración de los desmosomas de los queratinocitos (donde son muy abundantes) y de
la aparición de las ampollas. El tratamiento de esta enfermedad es sintomático e incluye el uso de corticoides y otros
inmunodepresores, así como el control del dolor y de las posibles infecciones.
FIGURA 6-6 Lesiones producidas por el pénfigo vulgar. A. Lesiones ampollosas en el brazo de un paciente. B. Lesiones en la mucosa
oral. C. Imagen histológica de la epidermis de un paciente con pénfigo vulgar. Se observa una rotura (acantólisis) de la epidermis por
encima de la capa basal. (Imágenes por cortesía del Dr. Agustín España. Departamento de Dermatología, Clínica Universidad de Navarra.)
El pénfigo foliáceo es también una enfermedad autoinmune donde se observa un depósito de IgG frente a
desmogleína 1. Por lo tanto, las ampollas solo se sitúan en niveles superiores de la epidermis y se rompen fácilmente.
El pronóstico de la enfermedad es mejor que el del PV, y su tratamiento se basa en la aplicación de corticoides
intralesionales o sistémicos.
Integrinas
264
Las integrinas son una familia de proteínas que participan en la adhesión permanente o transitoria célula-MEC y
célula-célula. Son heterodímeros compuestos por dos subunidades diferentes: subunidad α y subunidad β (fig. 6-7,
A). La subunidad α posee sitios de unión para cationes bivalentes (Ca , Mg ). Estas moléculas se unen tanto a
2+
2+
componentes de la MEC como a proteínas del citoesqueleto intracelular por medio de su interacción con proteínas
como la vinculina, la actinina α y la talina, que interactúan generalmente con filamentos de actina, pero también con
filamentos intermedios de queratina. El dominio extracelular de la subunidad β tiene capacidad de unión a la
secuencia tripeptídica RGD (arginina-glicina-ácido aspártico) que se encuentra en proteínas extracelulares (laminina y
fibronectina), las cuales interaccionan con colágeno de tipo IV, heparán sulfato y entactinas. Las integrinas intervienen
de modo muy significativo en la migración de células embrionarias, células del sistema inmunitario o células
tumorales metastásicas.
265
FIGURA 6-7 Integrinas. A. Estructura molecular de las integrinas. B. Representación de un hemidesmosoma y de sus componentes. C.
Esquema de las moléculas que componen las adhesiones focales. (Ilustraciones de: A. Calvo.)
Estas proteínas pueden aparecer como moléculas simples o agruparse para formar estructuras complejas de
adhesión, constituyendo así los hemidesmosomas y las adhesiones focales. Los hemidesmosomas son estructuras
estables de adhesión típicas de células sésiles, mientras que las adhesiones focales, que son características de células
en movimiento, son estructuras en constante proceso de formación y destrucción.
Hemidesmosomas
Los hemidesmosomas (fig. 6-7, B) son estructuras que, atendiendo a su morfología, se asemejarían a la mitad de un
desmosoma situado en la parte basal de las células. Estas estructuras sirven de anclaje entre la célula y la membrana
basal extracelular subyacente (v. más adelante) en la que se asienta la célula. Pero las proteínas que forman parte de
los hemidesmosomas son diferentes a las de los desmosomas, tanto en lo que se refiere a las proteínas transmembrana
de anclaje (que en este caso son integrinas en vez de cadherinas) como a las proteínas de la placa. La integrina que
forma parte de los hemidesmosomas es la integrina α β , y las proteínas de la placa se denominan plaquinas. Otra
6
4
proteína transmembrana del hemidesmosoma es la BPGA2 (del inglés bullous pemphingoid antigen-2). La placa está
conectada por el lado citoplasmático a tonofilamentos (fig. 6-7, B). Los hemidesmosomas aumentan la estabilidad
global de los tejidos epiteliales y permiten su asentamiento en la MEC mediante la unión de los tonofilamentos del
citoesqueleto con los componentes de la membrana basal.
Adhesiones focales
Las células migratorias se unen a la MEC mediante adhesiones focales (fig. 6-7, C), que están constituidas por
agrupaciones de integrinas interconectadas con haces de filamentos de actina por medio de las proteínas talina,
actinina α y vinculina. Estas estructuras son muy dinámicas, formándose y destruyéndose de modo continuo durante
el proceso de migración celular, donde sirven para contactar en puntos concretos con el sustrato. Son abundantes en
los lamelipodios (v. capítulo 12), que utilizan las células para avanzar a través de un sustrato inerte. Las adhesiones
focales no solo cumplen una función en la adhesión, sino que también participan en la señalización intracelular. Así,
la interacción de las integrinas con el sustrato en las adhesiones focales tiene como consecuencia la fosforilación de la
proteína tirosina quinasa de adhesión focal (FAK, del inglés focal adhesion kinase), que promueve la activación de
proteínas involucradas en la migración celular y, además, protege a las células de la anoikis. Las integrinas actúan
como transductores de señales, informando a la célula de las condiciones (principalmente de adhesión) del medio
extracelular. La hiperactivación de FAK se ha asociado con una mayor capacidad de metástasis por parte de las
células tumorales.
266
También hay integrinas que median los contactos célula-célula sin formar parte de ninguna estructura de unión.
Estas interacciones son, normalmente, de tipo transitorio, y se suelen dar en procesos de adhesión de células del
sistema inmunitario. Entre estas integrinas podemos destacar las denominadas «LFA-1», o antígeno de función
linfocitaria 1 (linfocitos), y Mac-1 (su equivalente en macrófagos). Estas integrinas tienen su receptor en moléculas
ICAM y VCAM (v. más adelante) de la superficie de células endoteliales, con lo que refuerzan la interacción
producida por las selectinas (v. «Selectinas», a continuación) en el proceso de extravasación de leucocitos.
La molécula LFA-1, presente en los leucocitos, ha sido objeto de numerosos estudios, dado su papel tan importante
en el reclutamiento de células inflamatorias. Recientemente, se han empezado a utilizar anticuerpos anti-LFA-1 en el
área de los trasplantes de órganos, ya que, al bloquear la unión de estas moléculas con sus receptores (ICAM), se ha
observado una menor tasa de rechazo. Se cree que este fenómeno se produce al impedir la migración de células
inflamatorias hacia el órgano trasplantado. Por otro lado, se ha observado que la unión de LFA-1 con ICAM parece
actuar como señal coestimuladora en la activación de linfocitos; por lo tanto, cuando se bloquee dicha unión será
necesaria una mayor cantidad de antígeno para poder alcanzar un mismo grado de activación linfocitaria.
Selectinas
Las selectinas son moléculas de adhesión dependientes de Ca , con afinidad para unirse a hidratos de carbono
2+
presentes en otras células (fig. 6-8, A). No se encuentran formando estructuras complejas de unión, sino que
intervienen en contactos moleculares no visibles al microscopio que, generalmente, son de tipo temporal. Participan
frecuentemente en las uniones de los leucocitos a las células endoteliales facilitando su salida de los vasos sanguíneos
hacia un foco inflamatorio (fig. 6-8, B).
FIGURA 6-8 Selectinas. A. Dibujo de las selectinas mostrando su interacción con azúcares presentes en glucoproteínas de otras
células. B. Las selectinas intervienen en procesos de adhesión de leucocitos (p. ej., neutrófilos) al endotelio vascular para facilitar la
migración hacia focos inflamatorios. La interacción y extravasación no solo está mediada por selectinas sino también por uniones que
implican a integrinas y a moléculas de tipo IgSF-CAM. (Ilustraciones de: A. Calvo.)
La membrana plasmática de la mayoría de los leucocitos presenta selectina L («L» de leucocitos), que interacciona
con su receptor mediante uniones heterófilas en la membrana plasmática de las células endoteliales que revisten los
vasos sanguíneos. Los receptores para las selectinas son oligosacáridos que forman parte de glucoproteínas (como las
IgSF-CAM) o glucolípidos de la membrana plasmática. Además, las propias células endoteliales poseen también dos
267
tipos de selectinas: selectina P (cuyo nombre deriva de «plaquetas», donde la expresión de esta selectina es
abundante) y selectina E (de endotelio), que interaccionan a su vez con oligosacáridos de la superficie de los
leucocitos.
Las selectinas están involucradas en la inflamación y el cáncer. En procesos inflamatorios, determinados estímulos
(como la histamina y la trombina) estimulan a las células endoteliales para que produzcan selectina P en la superficie
celular. Además, algunas citoquinas (como TNF-α) causan un aumento de expresión de las selectinas E y P en el
endotelio, favoreciendo así la unión de leucocitos. Esto conduce después a una unión más firme, mediada por
integrinas-IgSF-CAM (v. «IgSF-CAM», a continuación), y, finalmente, a la migración de los leucocitos hacia el foco
inflamatorio.
IgSF-CAM
Las moléculas de adhesión de la superfamilia de las inmunoglobulinas IgSF-CAM (fig. 6-9) poseen en su estructura
dominios organizados en forma de lazo, que se asemejan a los que están presentes en las inmunoglobulinas.
Establecen uniones heterófilas (interactuando con integrinas y selectinas) u homófilas (uniéndose entonces a otras
IgSF-CAM) (fig. 6-10). Las IgSF-CAM no tienen sitios de unión para el Ca y median uniones celulares, normalmente
2+
de tipo temporal. Esta superfamilia de proteínas interviene en la adhesión de células del sistema inmunitario. Entre
las IgSF-CAM, podemos destacar las siguientes:
• Moléculas de adhesión intercelular (ICAM) y moléculas de adhesión de las células vasculares (VCAM). Están
presentes en muchos tipos celulares, especialmente en células endoteliales, mediando interacciones con células
sanguíneas que poseen integrinas en su membrana. La interacción es, por lo tanto, heterófila.
• Moléculas de adhesión de las células nerviosas (NCAM). Se encuentran en las neuronas y se unen por interacción
homófila con otras NCAM.
268
FIGURA 6-9 Estructura molecular de la ICAM-1 (molécula de adhesión intercelular perteneciente a la familia de IgSF-CAM). Estas
moléculas de adhesión poseen dominios extracelulares en forma de lazo, parecidos a los de las inmunoglobulinas. (Ilustraciones de: A.
Calvo.)
FIGURA 6-10 Las IgSF-CAM se pueden unir entre sí mediante uniones homófilas o con integrinas mediante uniones heterófilas.
(Ilustraciones de: A. Calvo.)
Uniones ocluyentes (zonula occludens o unión estrecha)
La unión ocluyente (también llamada «unión estrecha») es una zona de contacto con forma de cinturón, de 1 μm de
ancho, que se encuentra casi con exclusividad en los epitelios (fig. 6-11). Este cinturón ocluyente está formado por un
entramado de proteínas que une las membranas de células contiguas, quedando el espacio intercelular ocluido por un
sistema de crestas de cierre anastomosadas y de complejidad variable, como se comprueba, de forma particularmente
llamativa, en las imágenes de criofractura para microscopía electrónica (v. fig. 6-11, C).
269
FIGURA 6-11 Uniones ocluyentes. A. Las uniones ocluyentes (UO) suelen presentarse en células epiteliales para impedir el paso de
sustancias a través del espacio existente entre las membranas de dos células vecinas; CA, cinturones de adhesión; DE, desmosomas.
B. Estas uniones tienen forma de cinturón y están compuestas por un sistema de crestas de cierre formadas por proteínas que unen
las membranas de células contiguas, quedando el espacio intercelular ocluido. C. Las imágenes de criofractura son especialmente
relevantes a la hora de mostrar el sistema de cierre u oclusión de estas estructuras. (A, ilustración de: A. Calvo; B, © 2009 from Physical Biology of the
Cell. by Philips et al. Reproduced by permission of Garland Science/Taylor & Francis Group LLC; C, procedente de: Fawcett DW. The Cell. Philadelphia: Saunders Company; 1981.)
Las uniones estrechas desempeñan dos funciones esenciales:
1. Determinan la polaridad de la membrana de las células epiteliales, al separar el dominio apical del dominio
basolateral, evitando la libre difusión de lípidos y proteínas entre estos dos dominios.
2. Impiden el paso de sustancias entre las células epiteliales (transporte paracelular). No obstante, a veces las células
pueden modificar sus uniones estrechas para permitir el paso de ciertas sustancias, cuando hay tal exceso de estas que
el transporte a través de la membrana no basta para incorporarlas. Así ocurre en el intestino con el exceso de
aminoácidos y azúcares, que pueden incorporarse al organismo mediante un transporte paracelular.
Las crestas de cierre están formadas por hileras entrecruzadas de proteínas transmembrana (fig. 6-11, B),
particularmente ocludinas y claudinas, que se unen de forma directa a proteínas semejantes en la célula contigua. Las
ocludinas y claudinas pertenecen a la familia de las tetraspaninas y, por lo tanto, presentan cuatro dominios
transmembrana, dos bucles externos y dos colas citoplasmáticas cortas. En el lado intracelular, las ocludinas y las
claudinas se encuentran ancladas a diversas proteínas estructurales, como las ZO-1, ZO-2 y ZO-3.
Algunas enfermedades se han asociado a mutaciones en las proteínas de las uniones ocluyentes. La expresión de
claudina 16 es máxima a nivel del epitelio del asa ascendente gruesa de Henle. En condiciones normales, dicha
proteína regula el transporte paracelular del magnesio y de parte del calcio. En pacientes con mutaciones de la
claudina 16 aparece un síndrome poco frecuente que se caracteriza por hipomagnesemia y convulsiones.
270
Uniones comunicantes (o uniones de tipo gap, nexo o hendidura)
Las uniones comunicantes, denominadas también «uniones de tipo nexo», «uniones en hendidura» o «de tipo gap»,
son uniones maculares de tamaños diversos que comunican los citoplasmas de células vecinas, permitiendo el
trasvase directo de iones y macromoléculas (fig. 6-12). La unidad básica de las uniones comunicantes es el conexón.
Los estudios con técnicas de criofractura y contraste negativo muestran que los conexones configuran un enrejado
hexagonal. Cada conexón mide unos 6,5 nm de diámetro y sus centros están equidistantes unos 9 nm. Con contraste
negativo se aprecia que cada conexón está constituido por seis moléculas de conexina (proteínas transmembrana)
alrededor de un conducto central. La disposición crea, por lo tanto, un conducto directo de comunicación (de 1,5-2 nm
de diámetro) entre el citoplasma de las dos células adyacentes. Cada unión de tipo nexo puede contener desde unos
pocos conexones hasta cientos de ellos, que pueden formar placas de unos 0,3 mm de diámetro. El espacio intercelular
está estrechado, alcanzando alrededor de 2-5 nm, y solo es identificable como una hendidura cuando las células se
observan a gran aumento con el microscopio electrónico.
FIGURA 6-12 Uniones comunicantes. A. Las uniones comunicantes, de tipo gap o nexos están formadas por agrupaciones de
conexones. B. Estas estructuras, constituidas por proteínas llamadas «conexinas», se agrupan en forma de hexágono para formar un
canal de 1,5 nm de diámetro, por el cual pueden atravesar iones y moléculas de pequeño tamaño. C. Las imágenes de criofractura
muestran que las uniones de tipo gap pueden contener cientos o miles de conexones. (A y B, ilustraciones de: A. Calvo; C, procedente de: Fawcett
DW. The Cell. Philadelphia: Saunders Company; 1981.)
Estas uniones facilitan el movimiento de moléculas de un tamaño máximo de 1,2 nm de diámetro (como iones
inorgánicos, oligosacáridos, aminoácidos, nucleótidos, vitaminas y AMPc) entre las células. La formación de estas
uniones es Ca independiente, pero la permeabilidad del canal está regulada por el Ca y el pH, de modo que se
2+
2+
reduce al descender el pH o al aumentar la concentración intracelular de Ca . Cuando se produce un daño celular, el
2+
Ca invade la célula en forma masiva e instantánea, por lo que el cierre de estos canales impide que el posible daño se
2+
transmita a células vecinas.
Esta unión es responsable del acoplamiento eléctrico y químico entre células adyacentes, lo cual es particularmente
relevante en la comunicación entre algunas neuronas y entre células musculares cardíacas, que tienen que transmitir
271
la excitación con rapidez y sincronía. Como se explicó en el capítulo 4, las sinapsis eléctricas están formadas por
uniones de tipo gap. Otro de los ejemplos importantes en los que aparecen uniones de tipo gap son los epitelios
ciliados, como el de las vías respiratorias. El movimiento síncrono de los cilios para expulsar la mucosidad de las vías
respiratorias requiere una comunicación rápida de las moléculas de señalización a través de los citoplasmas de células
contiguas, lo que se consigue mediante uniones de tipo gap.
La familia de los genes que codifican para las conexinas posee muchos miembros, los cuales se designan de acuerdo
con su peso molecular. Existen diversas enfermedades que se han asociado a mutaciones de las conexinas. La
conexina 26 forma uniones comunicantes en la cóclea y facilita el reciclaje del ión K . Las mutaciones en la conexina 26
+
podrían ser responsables de más del 20% de los casos de sordera en la infancia. Las dos mutaciones más frecuentes
son la 30delG y 167delT, que se dan en más del 50% de los casos. Las mutaciones del gen de la conexina 50 se asocian
a las cataratas congénitas, que producen ceguera.
Las células óseas (osteoblastos y osteocitos) están conectadas mediante uniones comunicantes y expresan conexina
43 y 45. Las mutaciones en la conexina 43 son responsables de la displasia oculodentodigital (ODD), enfermedad que
se caracteriza por defectos en el desarrollo esquelético que conllevan malformaciones corporales y presencia de ojos y
dientes pequeños. La mutación de la conexina 32 se relaciona con una enfermedad denominada atrofia muscular de
Charcot-Marie-Tooth (CMT). La CMT es una neuropatía que afecta tanto a los nervios motores como a los sensitivos.
Clínicamente, los pacientes con CMT presentan debilidad muscular típicamente distal, atrofia muscular, hipoestesia
(disminución de la sensibilidad) y reflejos osteotendinosos débiles o ausentes. Es muy típico de estos pacientes que la
enfermedad se localice primero en los pies y las piernas, y que se manifieste posteriormente en las extremidades
anteriores. La marcha de los pacientes es característicamente anómala, con pasos grandes que favorecen las caídas.
También es frecuente la asociación con una deformidad ortopédica denominada «pie cavo», debido a la atrofia de la
musculatura del pie.
272
Membrana basal
En el límite entre el epitelio y el tejido conjuntivo subyacente existe una fina capa extracelular de soporte, rica en
proteínas y polisacáridos y de espesor variable (0,5-1,5 μm), denominada tradicionalmente membrana basal. En
ocasiones, la membrana basal es tan gruesa que, en las preparaciones histológicas, se distingue como un
engrosamiento que limita el epitelio del tejido conjuntivo, como ocurre por ejemplo en la membrana de Descemet del
epitelio posterior de la córnea (que mide 10 μm) (fig. 6-13, A). Pero, por lo general, su escaso espesor y su coloración
con eosina impide distinguirla del tejido conjuntivo adyacente y solo se visualiza con claridad mediante tinciones
especiales. La membrana basal se observa bien con tinción de PAS (que tiñe los glúcidos de los proteoglucanos
presentes en dicha membrana) y con la técnica de impregnación argéntica. También se puede detectar mediante
inmunohistoquímica, utilizando anticuerpos específicos para proteínas de la membrana basal, como el colágeno IV
(fig. 6-13, B).
FIGURA 6-13 Membrana basal. A. La membrana de Descemet del epitelio posterior de la córnea es extraordinariamente gruesa
(flecha), llegando a medir 10 µm de grosor. B. Las técnicas inmunohistoquímicas permiten identificar la membrana basal; en este caso,
se han utilizado anticuerpos anticolágeno IV (proteína de la membrana basal) en una sección de riñón. C. Lámina basal y lámina
fibrorreticular. (B, con autorización de Rockland Immunochemicals, Gilbertsville, PA, USA; C, ilustración de: A. Calvo.)
Mediante el examen con el microscopio electrónico se observa que la membrana basal contiene varios componentes
estructurales. Se distingue una capa continua de matriz electrodensa (50-100 nm), denomina lámina basal, que se
divide a su vez en dos zonas:
1. Lámina lúcida o rara: zona poco electrodensa que se sitúa inmediatamente por debajo de las membranas
plasmáticas de las células del epitelio y que mide 40-60 nm de grosor.
2. Lámina densa: situada más externamente, presenta una mayor densidad electrónica. Está formada por filamentos
de 3-4 nm, orientados aleatoriamente.
273
La lámina fibrorreticular queda situada por debajo de la lámina basal y es una capa de fibras reticulares, integrada
por proteínas y polisacáridos. La capacidad de impregnación de sales de plata que posee la membrana basal se debe a
las fibras reticulares presentes en esta capa. En algunas localizaciones, como en los alvéolos pulmonares y en los
glomérulos renales, las membranas basales de los epitelios y endotelios se fusionan para formar parte de las barreras
de difusión respiratoria y de filtración glomerular.
La lámina basal se compone, fundamentalmente, de un fino reticulado de colágeno de tipo IV, glucoproteínas
adhesivas (laminina y entactina) y proteoglucanos (principalmente el perlecano, que contiene heparán sulfato)
sintetizados por las células epiteliales. El colágeno de tipo IV se encuentra exclusivamente en la lámina basal, donde
conforma un enrejado filamentoso de 1,5 nm de espesor que representa la parte central de la lámina densa. Confiere
una gran resistencia a la tracción y proporciona flexibilidad para acomodarse al estiramiento de los tejidos. La
laminina es una glucoproteína adhesiva de gran tamaño cuya estructura se detalla más adelante. Esta proteína fija la
lámina densa a la membrana plasmática de las células epiteliales gracias a su unión con las integrinas. Además, se une
al colágeno IV gracias a la entactina, y también al heparán sulfato del perlecano. La entactina o nidógeno es una
pequeña proteína que se une tanto a la laminina como al colágeno de tipo IV, por lo que parece servir de enlace entre
ambas proteínas. El perlecano es un proteoglucano de gran tamaño con un eje proteico de 600 kDa y con 2-15 cadenas
de glucosaminoglucanos (principalmente el heparán sulfato), que proporciona una fuerte carga negativa a la lámina
densa. La carga negativa contribuye a su función como filtro selectivo, principalmente en los glomérulos renales,
regulando el paso de los iones.
La membrana basal desempeña importantes funciones en los tejidos:
• Actúa como sostén del epitelio, dado que permite la fijación de la parte inferior del epitelio con la MEC
subyacente, en especial con el colágeno.
• Constituye un filtro molecular pasivo, al retener moléculas en función de su tamaño, forma y carga eléctrica.
• Separa y aísla el tejido conjuntivo de los epitelios, nervios y músculos. Por lo tanto, actúa como filtro celular,
permitiendo el paso de ciertas células (entre ellas los glóbulos blancos, involucrados en la defensa contra
microorganismos invasores), mientras que impide que otros tipos celulares del tejido conjuntivo ingresen al
epitelio, o viceversa.
• Ayuda a la regeneración de los tejidos tras una lesión. Cuando se destruyen epitelios, músculo o nervios, si la
membrana basal presente en los mismos persiste, proporciona el soporte sobre el que pueden migrar nuevas
células que reconstruyen el tejido original.
• Influye sobre la diferenciación y la organización celulares, dado que la membrana basal y, en general, los
componentes de la MEC, modifican la forma, el movimiento, el metabolismo y la diferenciación de las células en
cultivo.
274
Bajo ciertas condiciones patológicas, la membrana basal sufre marcadas alteraciones. En la diabetes mellitus,
enfermedad que produce importantes trastornos en el sistema vascular, se comprueba un engrosamiento notable de la
membrana basal de los vasos sanguíneos de pequeño calibre. Aun así, los capilares de los glomérulos renales de las
personas diabéticas filtran más proteínas plasmáticas que los de individuos normales. La causa de este engrosamiento
es un aumento de colágeno de tipo IV y laminina, aunque hay menos heparán sulfato, lo que contribuiría al aumento
de la permeabilidad capilar. La progresión del daño renal comienza con el engrosamiento de la membrana basal e
hipertensión a nivel glomerular. Más tarde comienza la aparición de microalbuminuria (presencia de albúmina en
orina en el rango 30-300 mg/24 h), que refleja el estado de hiperfiltración de la membrana basal glomerular. A medida
que avanza el daño, la albuminuria se convierte en proteinuria; finalmente, puede aparecer un cuadro de hipertensión
sistémica y pérdida de la función renal que puede requerir un trasplante.
Existe una patología hereditaria, denominada síndrome de Alport, en la que la membrana basal de los glomérulos
renales se encuentra también alterada, constituyendo la nefritis hereditaria más frecuente. Se produce por la alteración
de la cadena α5 del colágeno de tipo IV presente en la lámina densa. Se han descrito numerosos tipos de mutaciones
que pueden dar lugar a este cuadro. El síndrome de Alport se da en 1 de cada 10.000 individuos, siendo varones la
mayor parte de los casos, en los cuales la enfermedad es más grave que en las mujeres, al ser una enfermedad ligada
al sexo. La clínica de este síndrome se caracteriza por afectar a distintos órganos. A nivel renal es típica la hematuria
(presencia de sangre en orina); a nivel auditivo puede dar lugar a sordera neurosensorial, afectando específicamente a
los tonos agudos; y a nivel oftalmológico es muy frecuente la asociación con lenticono (proyección cónica en la
superficie del cristalino). El pronóstico de esta enfermedad lo marca el daño renal, ya que es frecuente que la
hematuria progrese a nefritis y acabe en un fallo renal en la adolescencia. El trasplante renal suele acabar por ser
necesario.
El síndrome de Goodpasture es una enfermedad que se basa en la presencia de anticuerpos frente a la cadena α3
del colágeno de tipo IV, típicamente presente en la membrana basal del riñón y del pulmón. Esta enfermedad aparece
con mayor frecuencia en varones y a edades tempranas (normalmente en la adolescencia), y se caracteriza por la
presencia de hematuria, proteinuria y sedimentos patológicos en la orina. Es frecuente que se asocie con hemoptisis
(presencia de sangre en el esputo), indicando una afectación pulmonar que precede al daño renal. Si el cuadro avanza,
da lugar a hemorragias pulmonares que comprometen la vida del paciente y a una glomerulonefritis rápidamente
progresiva que finaliza en un fallo renal. El tratamiento consiste en plasmaféresis y en el uso de corticoides e
inmunodepresores.
275
Matriz extracelular (MEC)
Como se ha venido indicando a lo largo del capítulo, las células establecen relaciones muy estrechas con los
componentes de la matriz extracelular (MEC). En algunos tejidos (como algunos epitelios o el sistema nervioso
central) la MEC es casi inexistente, pero en otros (como el tejido conjuntivo, el cartílago y el hueso) las células están
embebidas en una matriz muy abundante.
La MEC es un complejo de macromoléculas elaborado y secretado por las células hacia el espacio extracelular. Se
compone de una sustancia fundamental hidratada similar a un gel, con fibras incluidas en ella. Además, contiene
agua, sales minerales y otras sustancias de bajo peso molecular, hormonas, proteínas y nutrientes. El agua, las sales y
muchas de las proteínas de la sustancia fundamental provienen del plasma sanguíneo y forman el líquido tisular.
Fibras de la MEC
Las fibras que contiene la MEC están presentes en cantidades variables, según las necesidades estructurales y la
función del tejido en que se ubiquen. Los histólogos clásicos describieron tres tipos de fibras, teniendo en cuenta su
morfología y su reactividad con colorantes histológicos: fibras de colágeno, reticulares y elásticas.
Fibras de colágeno
Las fibras de colágeno (o colágenas) (fig. 6-14) son fibras flexibles con una notable resistencia tensora en sentido
longitudinal, incluso mayor que la del acero inoxidable de diámetro similar. El colágeno incluye una familia de
proteínas muy abundante que constituye alrededor del 20-25% del total de proteínas del organismo humano. En
preparados de tejido fresco no coloreados, el colágeno se observa en forma de hebras incoloras o blancas, brillantes y
de recorrido ligeramente ondulado. Al desnaturalizarse mediante cocción, da lugar a la gelatina, que posee mucho
poder nutritivo por su alto contenido en proteínas. El colágeno es acidófilo debido a la carga positiva de los grupos
laterales, por lo que se tiñe con eosina; también se tiñe de color azul con tinción tricrómica de Masson, y de rojo con el
método de Van Gieson. Las fibras presentan un grosor variable (1-10 µm) y están compuestas por fibrillas (0,2-0,5 µm
de diámetro), que se mantienen unidas en paralelo mediante una matriz amorfa. Con el microscopio electrónico de
transmisión se observa que las fibrillas están compuestas por microfibrillas paralelas de un diámetro aproximado de
50 nm. En ellas, se distingue un rayado transversal característico que se repite cada 67 nm.
276
FIGURA 6-14 Fibras de colágeno. A. Fibras de colágeno de la matriz extracelular observadas al microscopio electrónico de
transmisión. B. Mediante la técnica de contraste negativo, al microscopio electrónico se observa con claridad que las fibras de
colágeno presentan una característica estriación transversal periódica. C. Esquema de la síntesis de las fibras colágenas; RER, retículo
endoplasmático rugoso. (A y B, procedentes de: Burrell MA et al. Atlas de ultraestructura celular. Pamplona: EUNSA; 2011; C, ilustración de: A. Calvo.)
La molécula que forma estas microfibrillas es el tropocolágeno. Cada molécula está compuesta por tres cadenas
polipeptídicas, denominadas «cadenas α», enrolladas helicoidalmente para formar una triple hélice dextrógira,
excepto en los extremos. Las cadenas α poseen alrededor de 1.000 residuos de aminoácidos y una composición poco
común, siendo la glicina (33,5%), la prolina (12%) y la hidroxiprolina (10%) los aminoácidos más abundantes. Algunos
aminoácidos, como la hidroxiprolina y la hidroxilisina, son característicos del colágeno; tienen, además, secuencias
repetidas en las cadenas: Gly-X-Y (siendo X frecuentemente prolina, e Y, frecuentemente hidroxiprolina).
Los enlaces de hidrógeno de la hidroxiprolina conservan juntas las tres cadenas α, y la hidroxilisina permite la
formación de fibrillas por la unión entre sí de moléculas de tropocolágeno. La resistencia de la fibrilla es consecuencia
de los enlaces covalentes que hay entre las moléculas de tropocolágeno de hileras contiguas, y no de las uniones
cabeza-cola entre las moléculas de una hilera. Asociados con la hélice, hay grupos sacáridos que están unidos a
residuos hidroxilisílicos. Debido a la presencia de estos grupos, el colágeno se clasifica con propiedad como una
glucoproteína. Las moléculas de tropocolágeno, de 280 nm de longitud, se disponen una detrás de otra, dejando una
distancia aproximada de 37 nm entre la terminación de una y el comienzo de la siguiente. Las diferentes hileras no
están al mismo nivel, sino desfasadas, produciéndose así las características estriaciones transversales. La posición del
colágeno se repite cada cinco hileras.
En el escorbuto, enfermedad producida por la carencia de vitamina C (o ácido ascórbico), no se forman fibras de
colágeno normales. El ácido ascórbico es un agente reductor necesario para la prolilhidroxilasa y la lisilhidroxilasa,
que catalizan la hidroxilación de la prolina y la lisina. Sin la hidroxilación postraduccional de la prolina y la lisina no
se pueden formar los enlaces de hidrógeno indispensables para formar hélices estables, y las moléculas de
tropocolágeno no pueden agregarse en fibrillas. El trastorno afecta primero a los tejidos conjuntivos con un recambio
elevado de colágeno, como el ligamento periodontal y las encías. Debido a que estas dos estructuras tienen a su cargo
la conservación de los dientes en sus alvéolos, los síntomas de escorbuto incluyen encías con hemorragia y dientes
flojos. Si la deficiencia de vitamina C es prolongada, también se afectan otras partes del cuerpo (piel, articulaciones).
277
En niños, otro síntoma esencial son los defectos en la osteogenia, con tendencia a deformaciones y fracturas. También
puede existir sangrado intraarticular, intraperitoneal, intrapericárdico e, incluso, hemorragias en las glándulas
suprarrenales. El tratamiento de este déficit se basa en la administración de vitamina C, consiguiéndose la
recuperación pocos días después del inicio del tratamiento.
La deficiencia de la enzima lisilhidroxilasa, trastorno genético que se conoce como síndrome de Ehlers-Danlos,
produce un enlace transversal anormal entre moléculas de tropocolágeno. Los individuos afectados por esta anomalía
poseen fibras de colágeno alteradas que dan lugar a articulaciones hipermóviles, dificultad en la curación de las
heridas, baja estatura y piel hiperextensible (fig. 6-15). En muchos casos, la piel de los pacientes se traumatiza con
facilidad y el enfermo está sujeto a luxaciones de las articulaciones afectadas. La biogénesis de las fibras de colágeno
se puede resumir en los siguientes pasos:
1. Síntesis en el RER (a partir de su correspondiente ARNm) de cadenas individuales de preprocolágeno, que son
cadenas α que poseen secuencias adicionales de aminoácidos, conocidas como propéptidos, en los extremos amino y
carboxilo.
2. En el RER, después de la escisión del péptido señal, se dan las siguientes modificaciones:
a. Hidroxilación de algunos residuos de prolina y lisina, mientras los polipéptidos todavía están en la
conformación no helicoidal, por las enzimas hidroxilasa de peptidilprolina e hidroxilasa de peptidilisina.
b. Glucosilación (de tipo O-ligada) de algunos residuos de hidroxilisinas caracterizados por la adición de glucosa
y galactosa.
c. Se alinean entre sí tres moléculas de preprocolágeno y se ensamblan para formar una configuración helicoidal
ajustada, conocida como molécula de procolágeno. Al parecer, los propéptidos tienen la función adicional de
conservar solubles las moléculas de procolágeno y prevenir así su agregación espontánea a fibras de colágeno
dentro de la célula.
d. Formación de enlaces de hidrógeno intra- e intercatenarios que ejercen influencia sobre la forma de la
molécula y estabilizan las interacciones de los polipéptidos.
3. Las moléculas de procolágeno salen del RER mediante vesículas de transferencia recubiertas de coatómeros que las
transportan al aparato de Golgi, donde se modifican otra vez por la adición a las dos posiciones terminales de
oligosacáridos de tipo N-ligados.
4. Las moléculas de procolágeno modificadas se empaquetan en la red del Trans Golgi y se transportan de inmediato
fuera de la célula.
5. A medida que el procolágeno entra en el ambiente extracelular, las procolágeno peptidasas (enzimas asociadas a la
membrana celular) segmentan los propéptidos de los terminales amino y carboxilo. La molécula recién formada es
más corta (280 nm de longitud) y se conoce como molécula de tropocolágeno.
278
6. Las moléculas de tropocolágeno se autoensamblan espontáneamente en una dirección específica (la cabeza con la
cola) y en una disposición escalonada y regular, formando fibrillas con bandas a una distancia de 67 nm. La formación
y conservación de la estructura fibrilar aumenta por enlaces covalentes formados entre los residuos de lisina e
hidroxilisina de moléculas de tropocolágeno adyacentes. Este proceso es catalizado por la acción de la enzima lisil
oxidasa (enzima que oxida la lisina), que también actúa en el espacio extracelular.
7. La célula controla la disposición ordenada de las fibrillas neoformadas al dirigir las vesículas de secreción hacia un
sitio focalizado de la superficie celular para que se produzca la exocitosis.
8. La polimerización puede continuar para formar fibras más gruesas, de hasta 100 nm.
FIGURA 6-15 El síndrome de Ehlers-Danlos, causado por una deficiencia de la enzima lisilhidroxilasa, afecta a la estructura de las
fibras de colágeno y se caracteriza por dar lugar a una piel hiperextensible y a articulaciones hipermóviles.
En realidad, las fibras de colágeno están constituidas por una familia de proteínas muy relacionadas (aunque
genéticamente diferentes), que comparten ciertas características de organización molecular, pero cuyas cadenas α
difieren en la secuencia y composición de aminoácidos. Las tres cadenas α que componen el tropocolágeno no tienen
por qué ser iguales, lo que constituye la principal diferencia entre los tipos. Inicialmente, se distinguió entre dos tipos
de cadenas: α1 y α2. Después, se identificaron cuatro subtipos de cadenas dentro del tipo α1, por lo que las cadenas se
denominaron α1I, α1II, α1III y α1IV. Más tarde, se distinguieron nuevos subtipos de cadenas α1 (hasta α1XII). Por
último, se descubrieron varios subtipos de cadenas α2 y las cadenas α3. Se han encontrado hasta 27 tipos de cadenas
α, reconocibles por diferencias en la secuencia de aminoácidos y codificadas por su gen correspondiente. Las
diferentes combinaciones entre los distintos tipos de cadenas producen diversas configuraciones de colágeno. Estas
configuraciones originan, al menos, 20 variedades de fibras de colágeno. Estos tipos se clasifican con números
romanos sobre la base cronológica de su descubrimiento, y se localizan en regiones específicas del cuerpo, donde
desempeñan varias funciones.
Los colágenos se pueden dividir en distintas familias, de acuerdo con el tipo de estructura que formen:
279
• Colágenos que forman fibrillas largas: tipos I, II, III, V y XI. Forman fibrillas claramente visibles a microscopio
electrónico.
• Colágenos FACIT (del inglés fibril-associated collagen with interrupted triple helix): tipos IX, XII y XIV. Son
estructuras de poca longitud que unen entre sí las fibrillas de colágeno y otros componentes de la MEC.
• Colágenos de cadena corta: tipos VIII y X.
• Colágenos que forman redes: tipo IV. Forma una red tridimensional en las membranas basales.
• Otros colágenos: tipos VI, VII y XIII.
Fibras reticulares
Aunque hoy en día sabemos que las fibras reticulares son, de hecho, un tipo de fibras de colágeno, muchos histólogos
conservan el término «fibras reticulares» no solo por razones históricas, sino también por conveniencia, al caracterizar
tejidos que poseen grandes cantidades de este tipo de fibras, como los hemopoyéticos y los linfopoyéticos (a excepción
del timo). Las fibras reticulares son teñidas preferentemente por sales argénticas o por la tinción de PAS; de hecho,
contienen un 6-12% de hexosas, mientras que las fibras de colágeno contienen únicamente un 1%. Las fibras
reticulares también se conocen como «fibras argirófilas» o «fibras argentófilas»; este tipo de fibras no forma haces, sino
finas redes de fibras delgadas con un diámetro de 0,5-2 µm.
Fibras elásticas
Las fibras elásticas son, típicamente, más delgadas (0,2-1 µm) que las fibras de colágeno, y se organizan de acuerdo a
un modelo ramificado para formar una red tridimensional. A diferencia de las fibras de colágeno, las fibras elásticas
son sumamente ajustables y pueden estirarse sin romperse hasta una vez y media su longitud en reposo, regresando a
su longitud inicial cuando se libera la fuerza (fig. 6-16). Se encuentran en proporciones variables en la mayoría de los
tejidos conjuntivos, a los que confieren la elasticidad que les permite recuperar su forma cuando sufren deformaciones
fisiológicas normales. Son particularmente abundantes en los órganos sometidos a fuerzas de estiramiento, como los
ligamentos amarillos de la columna vertebral (ligamento flava), las cuerdas vocales, las arterias elásticas, las vías
respiratorias y el parénquima pulmonar, la piel, el cartílago elástico y la vejiga urinaria. Se pueden teñir mediante
coloraciones específicas para elastina, como la resorcina-fucsina o la orceína.
280
FIGURA 6-16 Fibras elásticas. Estas fibras se caracterizan por su capacidad de distensión cuando son sometidas a una fuerza de
estiramiento, y por su capacidad de relajación (volviendo a su longitud inicial) tras cesar dicha fuerza. (Ilustración de: A. Calvo.)
Al microscopio electrónico de transmisión, se observa que las fibras elásticas contienen dos elementos: un centro
amorfo con elastina y una región externa y angosta con microfibrillas. Las microfibrillas poseen un diámetro de 10-12
nm y una periodicidad de 56 nm, y comprenden varias glucoproteínas, algunas de las cuales guardan cierto parecido
químico con el colágeno, mientras que otras difieren notablemente de él. No contienen prolina ni lisina; en cambio,
son ricas en aminoácidos polares y cisteína. La fibrilina es la glucoproteína predominante. Las microfibrillas
desempeñan un papel importante en la organización en fibras de la elastina. Por lo general, las fibras elásticas se
forman en las células del músculo liso, pero, en los tejidos que carecen de estas células, la producción está a cargo de
los fibroblastos. En el interior de estos tipos celulares pueden observarse, en una matriz amorfa, las microfibrillas de
12 nm formando la tropoelastina. Esta matriz se segrega al espacio extracelular y se ensambla en fibrillas, observables
en invaginaciones de la superficie celular. En la elastogénesis, primero se sintetiza el material fibrilar y luego el
amorfo.
La elastina es una proteína no glucosilada de 750 aminoácidos, rica en glicina, lisina, alanina, valina y prolina. A
diferencia del colágeno, la elastina contiene poca hidroxiprolina y carece de hidroxilisina. La presencia de
aminoácidos de desmosina e isodesmosina es exclusiva de las fibras elásticas, formando enlaces cruzados entre las
moléculas de elastina para dar lugar a una red de cadenas enrolladas que son las responsables de su elasticidad.
Los pacientes con síndrome de Marfan, que poseen mutaciones en la proteína fibrilina, tienen miembros largos y
finos y presentan aracnodactilia (dedos largos parecidos a patas de araña), trastornos visuales y aneurisma de la aorta.
La incidencia del síndrome de Marfan es de 1 por cada 10.000 habitantes, siendo un trastorno que se hereda de
manera autosómica dominante. La causa más frecuente de mortalidad en estos pacientes es la patología del sistema
cardiovascular asociada. Es frecuente que los pacientes presenten un prolapso en la válvula mitral que puede dar
lugar a un cuadro de insuficiencia cardíaca. También es usual que la base de la aorta se dilate, formando un
aneurisma que puede provocar una insuficiencia aórtica, así como una rotura que pone en riesgo la vida de estos
pacientes.
281
La alteración de las moléculas de elastina puede provocar un cuadro muy raro denominado cutis laxa o elastólisis.
No se sabe a ciencia cierta cuál es la causa subyacente a este síndrome, aunque se cree que puede deberse a una
disminución en la concentración de los inhibidores de elastasas, a un aumento descontrolado de la actividad de las
elastasas per se, o a alteraciones en los genes encargados de la síntesis de elastina.
La clínica de esta patología cursa con una piel que no es capaz de recuperar su posición natural cuando se la estira,
confiriendo un aspecto arrugado a todo el cuerpo. Es frecuente la aparición en la cara de piel «péndula», lo que
produce un efecto envejecedor en los pacientes que lo padecen.
Sustancia fundamental
La sustancia fundamental ocupa el espacio que hay entre las células y las fibras. Es una sustancia viscosa que posee un
alto contenido en agua y que disminuye con la edad, compuesta por glucosaminoglucanos (GAG), proteoglucanos
(PG) y glucoproteínas de adhesión.
Glucosaminoglucanos
Los GAG son polisacáridos de cadenas largas, inflexibles, sin ramificaciones, compuestos por unidades repetidas de
disacáridos (70-200 residuos). El primer azúcar del disacárido suele ser un aminoglucano (N-acetil-glucosamina o Nacetil-galactosamina); el segundo suele ser un ácido urónico (ácido glucurónico o idurónico). Los GAG tienen un
carácter acido debido a la presencia de grupos laterales hidroxilo, carboxilo y sulfato unidos a las unidades de
disacáridos. Por ello, se tiñen con colorantes básicos, además de teñirse con PAS y azul alcián.
En la mayoría de los casos, los GAG están sulfatados (SO o SO ), por lo que, junto a la presencia de grupos
42–
3–
hidroxilo y ácido o carboxilo (COO ), hace que la carga neta de estas moléculas sea muy negativa, atrayendo así iones
–
Na . La alta concentración de Na atrae, a su vez, líquido extracelular, proporcionando turgencia y favoreciendo la
+
+
resistencia a fuerzas de compresión. A medida que estas moléculas están más próximas entre sí, su carga negativa las
repele, lo que favorece que tengan una textura resbaladiza, como demuestran el humor vítreo del ojo y el líquido
sinovial. La presencia de tipos específicos de GAG en diferentes tejidos confiere atributos especiales a la matriz
extracelular.
El hialuronato es el único GAG no sulfatado; puede tener hasta 25.000 unidades repetidas de disacáridos, con una
longitud de 2,5 µm, y es de gran importancia para la formación de agregados de proteoglucanos. A la vez que en el
tejido conjuntivo laxo, se encuentra en el líquido sinovial de las articulaciones, el humor vítreo del ojo, el cordón
umbilical y el cartílago.
282
Una de sus propiedades más importantes es su elevada viscosidad en solución acuosa, lo que contribuye a la
consistencia de gel propia de la sustancia fundamental. Su estado de gel no supone barrera alguna para la difusión de
metabolitos a través de su fase acuosa, pero probablemente represente un impedimento significativo para la
diseminación de las bacterias que pudieran penetrar en los tejidos. Es interesante señalar que algunas especies
bacterianas con mayor capacidad invasiva han contrarrestado esta propiedad mediante la capacidad para sintetizar la
enzima hialuronidasa, que despolimeriza el hialuronato de la sustancia fundamental.
Otros GAG son el condroitín sulfato (abundante en el cartílago, aunque también se encuentra en los vasos
sanguíneos, el hueso, la córnea y la gelatina de Wharton), el dermatán sulfato (presente en las válvulas cardíacas, la
piel y los vasos sanguíneos), el queratán sulfato (en la cornea y el cartílago de los discos intervertebrales) y el heparán
sulfato (en los vasos sanguíneos, en pulmón y la lámina basal).
Proteoglucanos
Los proteoglucanos (PG) son complejos macromoleculares de GAG (generalmente, condroitín sulfato y queratán
sulfato) unidos covalentemente a un núcleo proteico de longitud variable (fig. 6-17). Esta unión no suele ser directa,
sino mediada por trisacáridos. El contenido en hidratos de carbono puede alcanzar hasta el 95%, en los PG a
diferencia de las glucoproteínas, que contienen como máximo el 60%. Por lo tanto, los PG tienen más características de
polisacáridos que de proteínas. Los centros proteicos de los PG se sintetizan en el RER, donde tiene lugar una
glucosilación ligada a N (v. capítulo 10), mientras que la mayor parte de los hidratos de carbono se integran en el
Golgi mediante glucosilación ligada a O; los grupos GAG se unen de manera covalente a la proteína en el aparato de
Golgi. En este último, también se produce la sulfatación, catalizada por sulfotransferasas, y la epimerización
(reordenamiento de diversos grupos alrededor de átomos de carbono de las unidades de azúcar).
FIGURA 6-17 Agregado de proteoglucanos asociados a una molécula de hialuronato. Los proteoglucanos poseen un eje proteico sobre
el que se disponen perpendicularmente glucosaminoglucanos (GAG), como el queratán sulfato o el condroitín sulfato. (Ilustración de: A.
Calvo.)
283
Los PG se caracterizan por su diversidad molecular y se pueden localizar en gránulos citoplasmáticos de células
(como los gránulos de la heparina de los mastocitos), en la superficie de las células (sindecano), en las láminas basales
(perlecano) o en la matriz extracelular (agrecano). Muchos PG, en especial el agrecano (una macromolécula que se
encuentra en el cartílago y el tejido conjuntivo), se unen al hialuronato.
Los PG tienen múltiples funciones, como por ejemplo la resistencia a la compresión. Debido a su elevada viscosidad
y a su localización estratégica en los espacios intercelulares, estas sustancias actúan como barrera frente a la
penetración de bacterias y de otros microorganismos invasores o frente al movimiento de células metastásicas.
Además, conjuntamente con la lámina basal, forman filtros moleculares con poros de tamaños y distribuciones de
carga variable, que seleccionan y retardan el paso de macromoléculas. Algunos PG, como el sindecano, en lugar de
liberarse hacia la matriz extracelular, permanecen unidos a la membrana de la célula. Las proteínas centrales de los
sindecanos son de tipo transmembrana y se unen a los filamentos de actina del citoesqueleto. La parte extracelular de
la molécula se fija a componentes de la MEC, contribuyendo así al anclaje celular a la matriz. Además, los sindecanos
de los fibroblastos funcionan como correceptores, ya que se unen el factor de crecimiento de fibroblastos (FGF, del
inglés fibroblast growth factor) y lo presentan a receptores de la membrana celular.
Glucoproteínas adhesivas
La capacidad de las células para adherirse a componentes de la MEC está mediada, en gran parte, por glucoproteínas
adhesivas. Estas glucoproteínas tienen varios dominios responsables de la unión a proteínas de la superficie celular
(integrinas), fibras de colágeno y proteoglucanos. De esta forma, las glucoproteínas de adhesión conectan los diversos
componentes de los tejidos entre sí.
La fibronectina (fig. 6-18, A), la más abundante, es un dímero grande (440 kDa) compuesto por dos subunidades
polipeptídicas similares, unidas entre sí en sus extremos carboxilo mediante enlaces disulfuro. Cada brazo de esta
macromolécula en forma de «U» tiene sitios de unión para diversos componentes extracelulares (colágeno, heparán
sulfato, ácido hialurónico, hialuronato, etc.) y para integrinas de la membrana celular. Como ya se ha indicado, la
secuencia de aminoácidos RGD de la fibronectina se une a las integrinas de la membrana plasmática de muchos tipos
celulares. La fibronectina es producida por fibroblastos, miofibroblastos, condrocitos, células de Schwann, astrocitos, y
células epiteliales y endoteliales. También se ha encontrado en los gránulos de las plaquetas, en la sangre y en los
líquidos corporales.
284
FIGURA 6-18 Estructura molecular de la fibronectina (A) y la laminina (B). Estas dos proteínas de la matriz extracelular participan en
procesos de adhesión. (A y B, ilustraciones de: A. Calvo.)
La fibronectina es una glucoproteína multifuncional que existe bajo tres grandes formas: a) plasmática, que se
encuentra en forma dimérica, es soluble en el plasma sanguíneo y favorece la coagulación y la fagocitosis; b) de la
superficie celular, que reviste la superficie de los tipos celulares que la producen, y c) fibronectina de la MEC, que
forma fibrillas insolubles.
285
La laminina (fig. 6-18, B) es una proteína producida por la mayoría de las células epiteliales y endoteliales. Se
localiza únicamente en la lámina basal y en las láminas externas de células musculares, células de Schwann y
adipocitos. Es una glucoproteína sulfatada muy grande (850 kDa) compuesta por tres cadenas polipeptídicas unidas
entre sí por puentes disulfuro, en forma de cruz latina. La cadena α se dispone de modo lineal en el brazo largo de la
cruz; las cadenas β y γ rodean la cadena α en el brazo largo y configuran los brazos cortos de la cruz. La laminina
tiene sitios de unión para el heparán sulfato, el colágeno de tipo IV, la entactina y las integrinas. Los múltiples
ligandos para la laminina hacen de ella una de las principales moléculas extracelulares de unión entre las células y la
MEC.
Existe una distrofia muscular congénita causada por el déficit de la cadena α2 de la laminina, que se hereda de
manera autosómica recesiva. Esta enfermedad tiene una baja incidencia (0,7 por cada 100.000 habitantes) y la
sintomatología se puede observar desde el nacimiento, con una hipotonía grave generalizada. Los niños que nacen
con esta enfermedad no pueden caminar solos debido a una extrema debilidad y a la falta de tono muscular; incluso
se describen cuadros de insuficiencia respiratoria, al fallar también la musculatura que permite la respiración. No
existe tratamiento específico para esta enfermedad, aunque la fisioterapia y el apoyo ventilatorio han aumentado la
esperanza de vida de estos pacientes. Experimentos en animales aplicando terapia génica han conseguido la expresión
de la molécula deficitaria; sin embargo, estos ensayos aún no han sido aplicados en humanos.
Otras glucoproteínas adhesivas son la entactina y tenascina. La entactina es una glucoproteína que se une a la
laminina y al colágeno de tipo IV, y es sintetizada por las células epiteliales. La tenascina es una glucoproteína
grande, compuesta por seis cadenas polipeptídicas (210 kDa cada una), unidas entre sí por enlaces disulfuro. Esta
macromolécula tiene sitios de unión para los sindecanos transmembrana y la fibronectina. La distribución de la
tenascina suele limitarse al tejido embrionario (mesenquimatoso y nervioso), donde marca vías migratorias para
células específicas y el crecimiento de los axones; también es producida por células metastásicas, para favorecer la
migración.
Lecturas recomendadas
Assimakopoulos SF, Papageorgiou I, Charonis A. Enterocytes’ tight junctions: From molecules to diseases. World J Gastrointest
Pathophysiol. 2011;2(6):123–137.
Franke WW. Discovering the molecular components of intercellular junctions —a historical view. Cold Spring Harb Perspect Biol.
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Mooseker MS. Organization, chemistry, and assembly of the cytoskeletal apparatus of the intestinal brush border. Annu Rev Cell Biol.
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normal and pathological tissues: potential therapeutic consequences. Microcirculation. 2008;15(4):283–296.
Wiradjaja F, DiTommaso T, Smyth I. Basement membranes in development and disease. Birth Defects Res C Embryo Today. 2010;90(1):8–
31.
Preguntas de autoevaluación
1. Indique cuál de las siguientes afirmaciones es verdadera con respecto a las microvellosidades:
a. Son proyecciones digitiformes de la superficie lateral de las células epiteliales.
b. Sirven para aumentar la superficie de absorción.
c. Tienen más o menos 1 μm de ancho y 0,08 μm de largo.
d. No poseen un glucocáliz muy pronunciado.
e. Las microvellosidades del intestino no pueden observarse al microscopio electrónico.
Respuesta correcta: b.
2. Los pliegues basales son abundantes en:
a. Intestino.
b. Túbulo contorneado distal del riñón.
c. Ovocitos.
d. Células secretoras exocrinas del páncreas.
e. Células secretoras endocrinas del páncreas.
287
Respuesta correcta: b.
3. La respuesta falsa con respecto a las cadherinas es:
a. Son moléculas que dependen del Ca para ejercer sus funciones de adhesión.
2+
b. Establecen uniones heterófilas.
c. Forman parte de los desmosomas.
d. Son responsables de establecer uniones célula-célula.
e. Las desmogleínas son un tipo de cadherinas.
Respuesta correcta: b.
4. Las moléculas de adhesión que intervienen en la unión de los leucocitos a las células endoteliales en el marco de
su salida de los vasos sanguíneos son:
a. Ocludinas.
b. Conexinas.
c. Cadherinas.
d. Selectinas.
e. Claudinas.
Respuesta correcta: d.
5. ¿Cuál de las siguientes estructuras no forma parte de los contactos que sirven para la unión mecánica de las
células?:
a. Cinturones de adhesión.
b. Desmosomas.
c. Hemidesmosomas.
d. Uniones tipo nexo.
e. Todos los anteriores tienen funciones mecánicas.
Respuesta correcta: d.
6. Las uniones tipo nexo (o gap) no permiten el paso entre dos células de:
a. Ca .
2+
b. H O.
2
288
c. Proteínas.
d. Aminoácidos.
e. AMPc.
Respuesta correcta: c.
7. Indique cuál de las siguientes afirmaciones es incorrecta:
a. La membrana basal es el soporte de todos los epitelios y está constituida por componentes derivados
exclusivamente del tejido conjuntivo subyacente.
b. La membrana basal es un indicador de polaridad de las células epiteliales y filtra las sustancias que se
intercambian entre los tejidos epitelial y conjuntivo.
c. Entre los componentes típicos de la membrana basal, son importantes las glucoproteínas, responsables de la
positividad del PAS.
d. La membrana basal contiene fibras de colágeno de tipo IV y proteínas adhesivas que interactúan con las
integrinas presentes en la membrana plasmática basal de la célula epitelial.
e. La lámina lúcida de la membrana basal está constituida por finos filamentos y su visualización solo es posible con
microscopio electrónico.
Respuesta correcta: a.
8. ¿Cuál de las siguientes frases no se refiere al pénfigo vulgar?:
a. Produce acantólisis.
b. Es una enfermedad autoinmunitaria en la que se producen autoanticuerpos contra desmogleínas.
c. Origina lesiones ampollosas.
d. Causa lesiones en las fibras elásticas, lo que hace que la piel sea demasiado extensible.
e. Los pacientes con pénfigo sufren infecciones frecuentemente.
Respuesta correcta: d.
9. La molécula de tropocolágeno acaba de formarse en:
a. El retículo endoplasmático rugoso (RER).
b. El retículo endoplasmático liso (REL).
c. El aparato de Golgi.
d. Las vesículas de secreción.
289
e. El medio extracelular.
Respuesta correcta: e.
10. Los pacientes con síndrome de Marfan tienen miembros largos y finos con aracnodactilia. La enfermedad es
causada por defectos moleculares de la:
a. Fibrilina.
b. Elastina.
c. Fibras de colágeno de tipo I.
d. Fibras de colágeno de tipo IV.
e. Fibras reticulares.
Respuesta correcta: a.
11. Indique cuál de las siguientes afirmaciones acerca de la sustancia fundamental es incorrecta:
a. Ocupa el espacio que hay entre las células y las fibras.
b. Es una sustancia viscosa, clara y resbaladiza al tacto que posee un alto contenido en agua.
c. En los preparados histológicos de rutina, se extrae durante la fijación y la deshidratación del tejido.
d. Permite la difusión del oxígeno y los nutrientes entre la microvasculatura y los componentes celulares del tejido.
e. Está compuesta de glucosaminoglucanos, proteoglucanos, glucoproteínas de adherencia y fibras.
Respuesta correcta: e.
290
CAPÍTULO 7
291
El núcleo. Parte I: organización de la cromatina y
conservación de la información genética
José Luis Vizmanos
Objetivos de aprendizaje
• Conocer el núcleo como estructura celular organizada que interacciona con el resto de la célula, y en la que
reside el genoma principal de los organismos eucariotas.
• Comprender la relación entre la estructura del núcleo y la información genética.
• Conocer la estructura del material genético dentro del núcleo eucariota y su análisis a nivel citológico.
• Relacionar la estructura y el número de los cromosomas con las alteraciones genéticas causantes de
enfermedad.
• Conocer la estructura básica del genoma nuclear eucariota, su replicación y los mecanismos que generan
variabilidad genética a nivel molecular.
292
Introducción
El núcleo es la estructura celular que contiene la mayor parte del material genético y en el que se llevan a cabo los
procesos de replicación y transcripción. Este material genético es común en todas las células de un mismo organismo,
que se diferenciarán y llevarán a cabo funciones distintas dependiendo de cómo utilicen esta información.
La morfología del núcleo (fig. 7-1) de todas las células eucariotas es similar y consta fundamentalmente de una
masa amorfa encerrada en una envoltura nuclear que la separa del citoplasma. Esta masa amorfa está formada por
fibras de ADN y proteínas que dan lugar a la cromatina (y que en determinadas fases del ciclo celular se condensan
para la formación de los cromosomas), uno o más nucléolos (estructuras más densas en las cuales se producen la
síntesis del ARN ribosómico), el nucleoplasma o matriz líquida y una matriz nuclear compuesta por una red de fibras
de proteínas que conforman el armazón estructural del núcleo (v. fig. 7-1).
FIGURA 7-1 A. Esquema del núcleo celular y sus diferentes componentes. B. Imagen de microscopía electrónica de un núcleo celular.
Se observan la membrana nuclear (MB), el nucléolo (NL), la eucromatina (EU) y la heterocromatina (HET). C. Imagen de la envoltura
nuclear. La flecha negra indica la lámina nuclear, y la flecha roja, un poro. (A, ilustración de: I. Baraibar; B, procedente de: Vázquez JJ, Díaz del Corral JL.
Citología Práctica. Pamplona: EUNSA; 1991; C, procedente de: Trump BF, Jones R, eds. Diagnostic Electron Microscopy. New York: John Wiley & Sons; 1980.)
La presencia de envoltura nuclear como barrera separadora entre el núcleo y el citoplasma es una de las diferencias
más importantes entre las células eucariotas y procariotas. Sin embargo, esta envoltura no es completamente
impermeable sino que permite el paso de ciertos componentes de manera selectiva. La envoltura nuclear está formada
por dos membranas paralelas (interna y externa) que se fusionan en algunos lugares para formar poros de
293
comunicación citoplasma-núcleo recubiertos de complejos proteicos. Estos poros permiten el intercambio controlado
de moléculas (como ciertas proteínas y ARN), lo que es vital para el mantenimiento de la composición interna del
núcleo y la regulación de la expresión del material genético.
294
Envoltura nuclear. Poros nucleares
La membrana nuclear externa se encuentra recubierta por ribosomas y fusionada al retículo endoplasmático rugoso,
de manera que el interior de este y el espacio intermembrana de la envoltura nuclear se encuentran unidos. Por el
contrario, la membrana nuclear interna está unida a la lámina nuclear, constituida por unas proteínas denominadas
láminas, que se asocian constituyendo una red de filamentos polipeptídicos. La lámina nuclear sirve de soporte
mecánico y de lugar de unión a las fibras de cromatina periféricas. Existen diversos tipos de proteínas que configuran
la lámina nuclear, pero todas ellas son proteínas fibrosas muy relacionadas con las proteínas de los filamentos
intermedios del citoesqueleto. Inicialmente forman dímeros que, unidos entre sí, originan filamentos que se unen a la
membrana nuclear interna y que, hacia el interior de la matriz, sirven como punto de unión a las fibras de cromatina.
Parece que la organización laminar, además de cumplir con la función de soporte estructural del núcleo, sería esencial
para la replicación del material genético y la regulación de su expresión. Las proteínas de la lámina nuclear sufren
fosforilación durante la prometafase, lo que ocasiona su desensamblaje, y ocasiona la ruptura de la envoltura nuclear
durante la mitosis. En la telofase, las láminas se desfosforilan y constituyen de nuevo filamentos, de tal manera que la
envoltura nuclear se estructurará de nuevo.
Se ha comprobado que mutaciones en los genes que codifican determinados polipéptidos que forman la lámina
nuclear son los responsables de algunas enfermedades genéticas. Por ejemplo, la distrofia muscular de EmeryDreifuss (autosómica dominante) surge por mutaciones en el gen que codifica para la lámina A y C; se caracteriza por
cambios en determinados músculos del esqueleto, así como por contracturas tempranas en cuello, codos, tendones de
Aquiles, y defectos de conducción cardíaca. Las mutaciones en este gen también son responsables de ciertas
cardiomiopatías idiopáticas familiares y de algunas lipodistrofias familiares parciales. La progeria de HutchinsonGilford está asociada a mutaciones en heterocigosis surgidas de novo en el gen de la lámina A. Esta enfermedad es
muy rara y se caracteriza por una senilidad precoz. La clínica suele aparecer durante el primer año de vida y el 90%
de los pacientes mueren por graves trastornos cardiovasculares alrededor de los 13 años. Sin embargo, en algunos
pacientes el fenotipo surge más tarde y muestran una mayor esperanza de vida.
Como se ha señalado, la envoltura nuclear no aísla por completo el citoplasma del núcleo. Así, los poros nucleares
son indispensables para que los productos de la expresión de la información genética salgan del núcleo al citoplasma.
Los procesos de replicación y transcripción se producen dentro del núcleo, mientras que la síntesis de proteínas se
lleva a cabo en el citoplasma. Ambos procesos necesitan de productos sintetizados en el otro lado. La traducción o
síntesis de proteínas necesita de moléculas como los ARN ribosómicos, ARN de transferencia y ARN mensajeros (v.
capítulos 8 y 9) que se sintetizan en el núcleo; mientras que la replicación y la transcripción necesitan de proteínas
sintetizadas en el citoplasma. Además, a través de estos poros también se realiza el intercambio de otras moléculas
como lípidos y carbohidratos. Una célula puede tener alrededor de 2.000 poros de este tipo, aunque el número de
poros no es estático y suele guardar relación con la actividad funcional de la célula. Así, en células en las que hay
295
mucha actividad de síntesis proteica (como por ejemplo los ovocitos o los hepatocitos) hay muchos más poros
nucleares que en células sin actividad sintética (como linfocitos inactivos o espermatozoides). De esta manera,
dependiendo de la necesidad de síntesis de proteínas, las células pueden modificar el número de poros nucleares para
hacer frente a estas nuevas situaciones fisiológicas.
Los poros nucleares se encuentran recubiertos por un complejo proteico denominado complejo del poro nuclear
(NPC, del inglés nuclear pore complex), probablemente uno de los mayores complejos proteicos celulares (con un
tamaño cercano a 30 veces el de un ribosoma). Este complejo se encarga de controlar que las moléculas que atraviesan
estos poros sean las adecuadas (fig. 7-2), mientras que permite la difusión pasiva de iones y moléculas muy pequeñas
(de menos de 9 nm de diámetro). Otras moléculas como proteínas, ARN y ribonucleoproteínas mayores de 9 nm
necesitan ser transportadas de manera activa mediante un mecanismo dependiente de energía y mediado por señales.
FIGURA 7-2 A. Complejo del poro nuclear (NPC, del inglés nuclear pore complex) y sus partes principales. B. Imagen de criofractura
de la membrana nuclear, donde se observan con claridad numerosos poros nucleares. Flecha, poro nuclear; MB-I, membrana nuclear
interna; MB-E, membrana nuclear externa. (A, ilustración de: I. Baraibar; B, imagen procedente de: Fawcett DW. The Cell. Philadelphia: Saunders; 1981.)
El NPC está formado por más de 50 proteínas diferentes llamadas nucleoporinas (Nup). Aproximadamente la
mitad presentan dominios tipo hélice α y láminas β, mientras que la otra mitad carecen de una estructura secundaria
296
ordenada y presentan repeticiones Phe-Gly (FG). En vertebrados, se muestra como una masa molecular de
∼1
con una estructura cilíndrica de simetría octogonal en el eje de transporte. Tiene unos 145 nm de diámetro y unos 80
nm de largo a través de la membrana, lo que a nivel celular son dimensiones importantes.
Dependiendo del tamaño de las moléculas, el paso a través de este complejo del poro se lleva a cabo por dos
mecanismos principales. Las moléculas pequeñas y las proteínas de masa inferior a los 50 kDa pasan libremente en
ambas direcciones mediante difusión pasiva. Sin embargo, la mayor parte de las proteínas y los ARN no pueden
atravesar los poros y necesitan ser reconocidas y transportadas de manera selectiva y activa en una determinada
dirección. Para ello, es necesario que el canal central sufra una serie de cambios en su conformación.
Las proteínas que se translocan al núcleo deben tener una señal de localización nuclear (NLS, del inglés nuclear
localization signal). La primera señal de localización nuclear fue caracterizada en 1984 en experimentos donde se utilizó
el antígeno T del virus del simio SV40. El antígeno T es una proteína de 94 KDa codificada por el virus y necesaria para
la replicación del ADN vírico, por lo que debe entrar en el núcleo. La NLS se identificó al observar que una mutación
en Lys-128 (lisina sustituida por treonina o asparragina) impedía que el antígeno se introdujera en el núcleo.
Posteriormente, se identificó la secuencia de siete aminoácidos Pro-Lys-Lys-Lys-Arg-Lys-Val (aminoácidos 126-132)
responsable del transporte del antígeno T. De hecho, al crear quimeras fusionando proteínas que normalmente no se
hallan en el núcleo (β-galactosidasa, piruvato quinasa) con la secuencia de la señal de localización nuclear, se consigue
que estas proteínas se acumulen en el núcleo.
En el caso de la proteína nucleoplasmina (proteína que participa en el ensamblaje de la cromatina), la NLS consta de
dos partes: Lys-Arg separada por diez aminoácidos de otra secuencia Lys-Lys-Lys-Lys. La secuencia de diez
aminoácidos que se halla en medio no interviene en el transporte hacia el núcleo. Este tipo de señales bipartitas son
más frecuentes que las señales únicas, en las que todos los aminoácidos implicados en el transporte se disponen uno
detrás de otro.
El transporte requiere de la actividad de la proteína Ran, proteína perteneciente a la familia de las GTPasas, que
aporta la energía necesaria para el transporte (fig. 7-3). La proteína Ran está tanto en el citoplasma como en el núcleo y
se necesita tanto para la importación como para la exportación de proteínas. Ran actúa como un interruptor
molecular, en función de si está unida a GTP o a GDP; la unión a uno u otro nucleótido depende de la actuación de: a)
la proteína citosólica activadora de GTPasa (GAP, del inglés GTPase activating protein) que provoca la hidrólisis de
GPT, y transforma así a Ran-GPT en Ran-GDP; b) de un factor nuclear intercambiador de guanina (GEF, del inglés
guanine exchange factor), que desempeña un papel opuesto, transformando Ran-GDP en Ran-GTP. El sistema Ran-GAP
se localiza en el citoplasma, mientras que el sistema Ran-GEF se sitúa en el núcleo, de tal modo que el Ran-GDP es
abundante en el citoplasma y Ran-GTP en el núcleo. La existencia del gradiente de Ran-GTP (de mayor concentración
en el núcleo) y Ran-GDP (de mayor concentración en el citoplasma) determina la direccionalidad del transporte.
297
FIGURA 7-3 Modelo molecular que explica la presencia de Ran-GDP y Ran-GTP en el citoplasma y el núcleo, respectivamente. La
GTPasa GAP hidroliza el GTP unido a Ran en el citoplasma, dando lugar a Ran-GDP + Pi. El intercambiador de nucleótidos GEF
añade GPT a Ran en el interior nuclear, separándose así el GDP-Ran. (Ilustración de: A. Calvo.)
El transporte ocurre del siguiente modo (fig. 7-4): las proteínas que van a ser transportadas al interior del núcleo
deben unirse en el citoplasma a unas proteínas transportadoras, las importinas, que reconocen las NLS de las
proteínas a transportar. El complejo de unión proteico así formado interacciona con proteínas del poro nuclear, las
cuales permiten su paso al interior del núcleo. Una vez en el núcleo, Ran-GTP se une a la importina (que a su vez
lleva unida la proteína de transporte), lo cual favorece la disociación del complejo, liberándose así la proteína de
transporte. Tras la liberación, el complejo Ran-GTP-Importina interacciona con las proteínas del poro situadas en el
interior nuclear y se produce su expulsión hacia el citoplasma. Allí, la proteína activadora citoplasmática GAP
favorece la hidrólisis de GTP hacia GDP, lo que promueve la separación del complejo. Ahora queda en el citoplasma
la importina separada de Ran-GDP y el ciclo puede comenzar de nuevo (v. fig. 7-4).
298
FIGURA 7-4 Modelo molecular que explica el transporte de proteínas desde el citoplasma hasta el núcleo (parte izquierda del dibujo) y
desde el núcleo hasta el citoplasma (parte derecha). El transporte hacia ambos lados requiere que las proteínas a transportar tengan
señales específicas y sean reconocidas por importinas (en el caso de transporte citoplasma-núcleo) o por exportinas (en el caso de
transporte núcleo-citoplasma). La energía que requiere el transporte está proporcionada por el sistema Ran-GTP/Ran-GDP. (Ilustración de:
A. Calvo.)
De la misma manera, las proteínas que salen del núcleo hacia el citoplasma se unen a proteínas denominadas
exportinas también a través de secuencias de aminoácidos específicas o señales de exportación nuclear (NES, del
inglés nuclear export signals). En este caso, el Ran-GTP presente en el núcleo favorece la unión de la exportina a la
proteína de transporte, en vez de fomentar su disociación. Una vez en el citoplasma, la hidrólisis de GTP hacia GDP
causa la liberación de la carga, y separa esta de Ran-GDP (v. fig. 7-4).
La mayor parte de las proteínas transportadas a través del NPC lo hacen hacia el interior del núcleo, ya que son
sintetizadas en el citoplasma. En el caso de los ARN el proceso es el inverso, ya que su síntesis tiene lugar en el núcleo
pero su salida es vital para que se lleve a cabo la traducción de proteínas en el citoplasma. Esta salida también
requiere de un transporte activo y selectivo en el que de nuevo interviene Ran. Para su transporte, los ARN deben
formar complejos de ribonucleoproteína (RNP) para su reconocimiento. Estos complejos son distintos para cada uno
de los tipos de ARN y están formados por múltiples proteínas. El proceso de transporte del ARN se explica con más
detalle en el capítulo 8.
La alteración de diversos componentes del NPC se ha asociado tanto a cáncer como a enfermedades autoinmunes.
Un ejemplo de ello es NUP98, cuyo gen localizado en el cromosoma 11 se ha encontrado implicado en varias
translocaciones cromosómicas somáticas relacionadas con el desarrollo de mielodisplasias y de leucemia mieloide
aguda. Estas translocaciones tienen como resultado la formación de proteínas quiméricas que contienen parte de
NUP98 y parte de otra proteína. El potencial oncogénico de estas proteínas quimera podría deberse a la presencia en
su extremo aminoterminal de repeticiones FG, capaces de reclutar factores de transcripción y alterar la regulación de
la expresión de diversos genes. Se han encontrado alteraciones semejantes en el gen que codifica para NUP214 en el
cromosoma 9 en otras mielodisplasias, leucemias mieloides agudas y en más del 5% de las leucemias agudas
linfoblásticas T.
299
La autoinmunidad frente a diversos componentes del NPC parece que podría ser importante en el diagnóstico y la
etiología de varias enfermedades autoinmunitarias. La cirrosis biliar primaria es una enfermedad crónica del hígado
en la que se produce una inflamación y destrucción de los conductos biliares intrahepáticos. Esto, a su vez, produce
un cuadro de colestasis crónica que desemboca en cirrosis. La etiología de esta enfermedad se desconoce, aunque
parece tener una naturaleza autoinmune. Los pacientes con cirrosis biliar primaria generan frecuentemente
autoanticuerpos frente a NUP62, NUP180 y la proteína gp210, una glucoproteína que también forma parte del NPC.
Por ello, han sido utilizados como marcadores diagnósticos de esta enfermedad.
300
Organización del núcleo en interfase
Inicialmente se pensó que el material genético se distribuía de manera aleatoria y desorganizada en el núcleo
eucariota. Pero, de la misma manera que el citoplasma, el núcleo también presenta una estructura organizada y, en
cierto modo, compartimentalizada.
Dentro del núcleo en interfase, las moléculas de ADN (que como veremos más adelante formarán los cromosomas)
parecen ocupar determinadas zonas no solapantes y no aleatorias denominadas territorios cromosómicos. Estos se
encuentran separados entre sí por regiones no cromatínicas en las que se sitúan determinadas enzimas y proteínas
implicadas en la expresión del genoma. Los territorios, además, son bastante estáticos dentro de un determinado
núcleo. Parece que los cromosomas más ricos en genes tenderían a ocupar regiones nucleares centrales; mientras que
los cromosomas con menos genes estarían localizados hacia las zonas de la membrana nuclear donde existe una
menor actividad de la expresión génica. La posición de los genes activos dentro de un determinado territorio es tema
de debate. Inicialmente se pensó en que estos genes estarían localizados preferentemente en la superficie de los
territorios, accesibles a la maquinaria transcripcional. Sin embargo, experimentos recientes muestran que los
transcritos de ARN también se generan dentro de los territorios, y los análisis microscópicos detallados muestran que
cada uno de ellos está recorrido por varios canales que los unirían a las regiones no cromatínicas. Esto podría permitir
el acceso de la maquinaria transcripcional al interior de los territorios (fig. 7-5).
FIGURA 7-5 Modelos de estructura de la organización del núcleo en territorios cromosómicos. (Ilustración de: I. Baraibar.)
La localización estática de los cromosomas descondensados dentro del núcleo y la posición relativa de cada uno de
ellos ha llevado a postular que esta sería una de las razones por lo que las translocaciones cromosómicas (intercambio
de segmentos entre dos o más cromosomas) afectan de manera recurrente a algunos de ellos, ya que su posición
relativa haría que estuvieran físicamente muy cerca. Estas translocaciones cromosómicas son causa de algunos tipos
de cáncer. Ejemplos conocidos son la translocación que implica los cromosomas 9 y 22 (lo que da lugar al cromosoma
Philadelphia) causa de la leucemia mieloide crónica o la que implica a los cromosomas 15 y 17 en la leucemia
promielocítica aguda.
301
Además, en el núcleo existe una subestructura compleja o matriz nuclear formada por una red de proteínas y ARN
a la cual se unen las fibras de cromatina a través de unas secuencias de ADN conocidas como regiones de unión a la
matriz o MAR (matrix attachment regions). Esta matriz ayudaría al mantenimiento de la forma del núcleo.
Dentro del núcleo, con el microscopio electrónico se puede diferenciar una zona más densa denominada nucléolo,
donde se sintetiza y procesa el ARN ribosómico (ARNr) (v. capítulo 8). Los genes del ARNr se encuentran agrupados
en los brazos cortos de los cromosomas humanos 13, 14, 15, 21 y 22, que lógicamente se situarán en esa zona nucleolar
donde se transcribe el ARNr.
En el núcleo también se pueden diferenciar los cuerpos de Cajal, donde se produce la síntesis de las
ribonucleoproteínas nucleares pequeñas (snRNP, del inglés small nuclear ribonucleoprotein) y los cuerpos PML, con
apariencia de anillo, donde se localizaría la proteína de la leucemia promielocítica (PML, del inglés promyelocytic
leukemia). Los pacientes con este tipo de leucemia presentan una aberración cromosómica formada por la translocación
entre los cromosomas 15 y 17, antes mencionada. Esta alteración conduce a la fusión de parte de los genes PML y
RARA (codificante del receptor del ácido retinoico). La proteína de fusión formada como consecuencia de esta
translocación no es capaz de dar lugar a estos cuerpos PML de manera normal. El tratamiento con ácido retinoico en
este tipo de pacientes restaura la capacidad de formación de estos cuerpos, permitiendo la localización correcta de la
proteína PML.
Otros dominios descritos hasta la fecha incluyen las fibrillas de pericromatina, donde se localizan las moléculas de
ARN naciente, los cuerpos de rotura, lugares de poliadenilación y rotura del ARN, y los conjuntos granulares de
intercromatina, involucrados en el splicing, ayuste o corte y empalme del ARN.
302
Estructura de la cromatina en interfase. Histonas
En total, la longitud completa de los más de 3.000 millones de nucleótidos que conforman las cadenas de ADN nuclear
ocupan una longitud de aproximadamente un metro dividido en 23 fragmentos de longitud variable en el caso de la
especie humana. Esto es así para el genoma haploide, pero cada célula somática tiene dos copias, por lo que se estima
que el genoma diploide puede tener unos dos metros de longitud (en 46 fragmentos) empaquetados en una estructura
como el núcleo, cuyo diámetro es alrededor de 5 μm. Este enorme empaquetamiento, que además no debe impedir al
genoma nuclear realizar sus funciones, se lleva a cabo mediante la unión de las moléculas de ADN con varios tipos de
proteínas, formando la cromatina.
A lo largo del ciclo celular, cada uno de los fragmentos de ADN, junto con las proteínas que intervienen en su
empaquetamiento, llevan a cabo distintos procesos de condensación y descondensación con cambios en su grosor y
longitud. Los cromosomas son las estructuras que se observan cuando esta condensación es máxima, pero
representan un estado muy poco frecuente, ya que se observan brevemente durante un determinado momento de la
división celular. En interfase, la etapa más larga del ciclo celular, los cromosomas no son fácilmente visibles ya que se
encuentran más dispersos y descondensados. Su estructura la veremos posteriormente.
De esta manera, los cromosomas en sus distintos estados de condensación más o menos visibles no son más que el
reflejo del empaquetamiento del ADN que hemos señalado anteriormente. Existen varios niveles de
empaquetamiento del ADN (figs. 7-6, 7-7 y 7-8). En el nivel más básico (nivel 1), la doble hélice de ADN (unas 146 pb)
se enrolla alrededor de un core u octámero de histonas (llamadas H2A, H2B, H3 y H4) en una superhélice levógira
(1,75 vueltas) y dará lugar a una estructura conocida como nucleosoma (v. fig. 7-6). Entre dos nucleosomas
consecutivos existe una distancia de unas 50-70 pb, lo que hace que, con el microscopio electrónico, esta estructura
tenga una apariencia de cuentas de collar (v. fig. 7-8). Las histonas son proteínas básicas (cargadas positivamente)
cuya secuencia está muy conservada en la escala evolutiva. Tienen entre 102 y 135 aminoácidos. Como se ha indicado,
las histonas H2A, H2B, H3 y H4 se asocian entre sí para formar un octámero. Dos moléculas de H3 junto con dos de
H4 forman un tetrámero y dos dímeros H2A-H2B forman otro tetrámero. Ambos tetrámeros se asocian entre sí
formando el núcleo proteico alrededor del cual se enrolla el ADN. En el caso de los espermatozoides, las histonas son
sustituidas por otras proteínas básicas, las protaminas, que permiten un mayor empaquetamiento.
303
FIGURA 7-6 Estructura del nucleosoma. (Ilustración de: I. Baraibar.)
FIGURA 7-7 Niveles de empaquetamiento de ADN genómico nuclear de eucariotas para formar los cromosomas. (Ilustración de: I. Baraibar.)
FIGURA 7-8 Imagen de microscopía electrónica de la fibra de 11 nm (A) y de 30 nm (B) del ADN extendida sobre una superficie. (A y B,
procedentes de: Olins, D. E. & Olins, A. L. Chromatin history: our view from the bridge. Nature Reviews Molecular Cell Biology.)
304
En conjunto, esta estructura de nucleosomas unidos entre sí, o estructura en cuentas de collar, da lugar a una fibra
de cromatina de 11 nm de diámetro (v. figs. 7-7 y 7-8). En esta estructura, unos 200 pb ocupan 11 nm, lo que significa
una reducción de la longitud de unas seis veces. La asociación con las histonas forma el nucleosoma y tiene
importancia en la regulación de la expresión génica, como se verá más adelante y en el capítulo 8.
En condiciones fisiológicas, esta fibra de 11 nm se vuelve a enrollar dando lugar a una fibra de cromatina de 30 nm
(nivel 2), en una estructura en solenoide que contiene unos seis nucleosomas por vuelta (v. figs. 7-7 y 7-8). En este
momento el grado de empaquetamiento del ADN es de 40 veces. La estructura en solenoide queda estabilizada por la
quinta histona, la H1 o histona de unión, que separa los núcleos de los nucleosomas adyacentes. Esta histona presenta
una secuencia menos conservada evolutivamente.
A su vez, la fibra de cromatina de 30 nm sufre durante la interfase distintos grados de empaquetamiento hasta la
mitosis o división celular (nivel 3), en el que este es máximo, y que permite la observación de los cromosomas por
empaquetamiento de cada una de las moléculas de ADN. En este empaquetamiento, la fibra de 30 nm forma asas
unidas por su base a una estructura proteica de andamiaje (scaffold, en inglés). Esta estructura está formada por
proteínas no histonas como la Sc1 (idéntica a la topoisomerasa II) y la Sc2, también conocidas como condensinas. Las
asas de cromatina se unen a este andamio mediante unas secuencias ricas en A y T llamadas SAR (del inglés scaffold
attachment region), que se cree pueden tener un cierto papel en la replicación. Esto da lugar a una fibra de 300 nm de
diámetro con un empaquetamiento total de unas 2.000 veces. Durante la mitosis se vuelve a condensar la fibra de 300
nm para constituir una fibra de 600-700 nm (o cromátida) en la que el empaquetamiento máximo final es de 10.000
veces.
La cromatina, por lo tanto, está compuesta tanto por ADN como por proteínas de tipo histona y no histona, entre las
cuales hay proteínas estructurales que se encargan del mantenimiento de la estructura del empaquetamiento, pero
también otras relacionadas con las funciones del material genético (como la replicación y transcripción).
La formación de los nucleosomas tiene una gran importancia en la expresión del genoma. A veces, es necesario que
estos se muevan o que la unión ADN-histonas se afloje para que determinadas regiones de ADN queden accesibles
para la compleja maquinaria de transcripción. Por ello, la interacción entre las histonas y el ADN debe ser dinámica.
La estabilidad de la interacción entre el octámero de las histonas y el ADN está afectada por la acción de los llamados
complejos remodeladores nucleosómicos, que provocan cambios como el deslizamiento del octámero a lo largo del
ADN, la transferencia del octámero a otra molécula de ADN y el remodelado del nucleosoma para permitir un mayor
acceso al ADN. Los cambios estructurales exactos de este proceso todavía no se conocen.
Las modificaciones químicas que pueden sufrir las histonas cumplen un papel muy importante en este remodelado.
Las histonas que forman el octámero central del nucleosoma tienen una cola aminoterminal sin estructura definida,
aunque accesible dentro del cromosoma intacto, que pueden sufrir diversas modificaciones químicas. Las lisinas de
estas colas pueden estar acetiladas o metiladas y las serinas pueden estar fosforiladas. Se ha propuesto que todas estas
305
modificaciones químicas constituirían un verdadero código de histonas que puede ser leído por las proteínas que
participan en la expresión del material genético y en la división celular. La acetilación de las histonas está asociada
con activación transcripcional, es decir, al acetilarse una lisina, disminuye la carga positiva de la histona, lo que
reduce su afinidad por el ADN (cargado negativamente) y abre la cromatina; por lo tanto esto permite una más fácil
transcripción (fig. 7-9). En consecuencia, los nucleosomas acetilados se asocian con regiones genómicas activas
transcripcionalmente, mientras que su desacetilación está relacionada con zonas de transcripción reprimida. Con
respecto a la metilación de las colas de histonas, esta se puede asociar tanto con cromatina activa como reprimida,
dependiendo de dónde tenga lugar la metilación y a qué modificación dé lugar. Por último, la fosforilación de la cola
aminoterminal de la histona H3 es máxima en la cromatina de los cromosomas mitóticos.
FIGURA 7-9 La acetilación de histonas relaja la cromatina y facilita la transcripción, mientras que la desacetilación promueve una
cromatina más compacta. (Ilustración de: I. Baraibar.)
Las modificaciones químicas de las colas de histonas son dinámicas y están mediadas por enzimas específicas. Por
ejemplo, las acetiltransferasas de histonas (HAT, del inglés histone acetyl transferase) catalizan la acetilación de las
lisinas mientras que las desacetilasas de histonas (HDAC, del inglés histone deacetylase) tienen el efecto contrario. Hay
varios tipos de HAT dependiendo de la histona o incluso de la lisina modificada.
Los efectos de estas modificaciones químicas se producen a través de distintos mecanismos. En general, la
acetilación y metilación reducen la carga positiva de las colas de histonas y disminuyen la afinidad de estas por la
306
cadena de ADN, de carga negativa. Además, parece que estas modificaciones químicas crean sitios de unión a otras
proteínas con bromodominios y cromodominios (dominios proteicos específicos que median estas interacciones). Las
proteínas con bromodominios interaccionan con las histonas acetiladas, mientras que las proteínas con
cromodominios lo hacen con las colas metiladas. Ambos tipos de proteínas participan en complejos que llevan a cabo
estas modificaciones químicas y en otros complejos importantes para la regulación de la transcripción (v. capítulo 8) y
la formación de heterocromatina.
La replicación del ADN nuclear requiere la duplicación de la propia doble hélice (que se tratará en el apartado
«Replicación del ADN genómico»), así como también la síntesis acoplada de nuevas histonas y la formación con
rapidez de los nucleosomas. Además, para la duplicación del ADN se requiere la desorganización parcial de estas
estructuras. Esto hace que el ensamblado del nucleosoma sea un proceso dinámico, complejo y que debe llevarse a
cabo de manera muy ordenada.
Dada la importancia de la modificación de las histonas sobre la funcionalidad de la cromatina, es interesante tener
en cuenta el destino de las histonas antiguas y las recién sintetizadas en el reensamblaje de los antiguos nucleosomas y
en la formación de los nuevos. Si todas las histonas nuevas formaran parte de los nuevos nucleosomas, la duplicación
del material genético borraría por completo las modificaciones químicas de los nucleosomas antiguos en una de las
moléculas hijas. En realidad, podemos encontrar histonas antiguas en ambas moléculas de cromatina aunque no en
una mezcla uniforme. Los tetrámeros H3-H4 y los dímeros H2A-H2B están compuestos todos por histonas nuevas o
todos por histonas antiguas. Conforme pasa la horquilla replicativa, los nucleosomas se desorganizan, pero mientras
los tetrámeros H3-H4 se mantienen unidos a cualquiera de las moléculas de ADN hijas, los dímeros H2A-H2B se
liberan y se reparten. Esto permite la propagación de la modificación de las histonas, ya que la presencia de histonas
modificadas en ambas hebras hijas permite reclutar la maquinaria enzimática que añada las modificaciones químicas
necesarias en los nucleosomas adyacentes.
307
Eucromatina y heterocromatina
La cromatina, como hemos visto, es la estructura visible que resulta del empaquetamiento de las moléculas de ADN
junto con determinadas proteínas. Su estructura no es uniforme a lo largo de las moléculas de ADN. La observación
con el microscopio óptico y el electrónico pone de manifiesto que algunas partes permanecen condensadas durante la
interfase y se tiñen profundamente (heterocromatina) mientras que otras se encuentran descondensadas y no se tiñen
tan fuertemente (eucromatina).
La eucromatina, que se encuentra dispersa por el núcleo, es la porción mayoritaria durante la interfase, y solo se
condensa durante los procesos de división celular para formar los cromosomas. Por el contrario, la heterocromatina se
encuentra más frecuentemente cerca de la membrana nuclear, está altamente condensada y se tiñe fuertemente con
colorantes de ADN, como el de Feulgen, durante la mayor parte de la interfase. La idea general es que los genes que
se están transcribiendo de manera activa se localizan en la eucromatina, mientras que en la heterocromatina se
encontraría el ADN que no se transcribe. Esta heterocromatina también se replicaría de manera más tardía.
Generalmente, las secuencias que forman parte de la heterocromatina son secuencias repetitivas del genoma que se
encuentran alrededor de los centrómeros (centros cinéticos de los cromosomas que veremos más adelante), las
regiones subteloméricas o próximas a los extremos, los brazos cortos en los cromosomas de tipo acrocéntrico, las
regiones no expresadas del cromosoma Y en varones y determinadas regiones cortas dispersas por distintos
cromosomas.
Existen dos tipos de heterocromatina: constitutiva y facultativa. La heterocromatina constitutiva estaría formada
por aquellos segmentos de ADN que, siempre y en todos los tipos celulares, se encuentran en la forma condensada,
mientras que la heterocromatina facultativa sería más variable, ya que en algunos tipos celulares formaría parte de la
heterocromatina y en otros no. La cantidad de heterocromatina y eucromatina suele guardar relación con la actividad
celular. Una gran cantidad de eucromatina es un rasgo morfológico que indica gran actividad transcripcional de la
célula; en cambio, una célula con núcleo muy heterocromático indica que tiene poca actividad transcripcional. Esta no
es una situación estática, pudiendo variar la cantidad de cada tipo de cromatina en función del estado funcional de la
célula.
En las células de hembras de mamíferos (con dos cromosomas X) se puede observar al microscopio una región
heterocromática normalmente situada junto a la membrana nuclear, llamada corpúsculo de Barr (fig. 7-10). Esta
cromatina (llamada también cromatina sexual) corresponde a una porción de uno de los cromosomas X que está
inactivado por un alto grado de empaquetamiento. En los mamíferos, los cromosomas sexuales son diferentes en
cuanto a su contenido génico, ya que el cromosoma X es muy grande y posee más de 1.000 genes, mientras que el Y
contiene menos de 100. Para compensar la dosis génica entre machos y hembras, las células recurren a la inactivación
transcripcional de uno de los cromosomas X, mediante heterocromatización del mismo. Esta inactivación tiene lugar
al inicio del desarrollo embrionario (en hembras), condensándose uno de los cromosomas al azar. Es decir, en una
308
célula se puede inactivar el cromosoma X que procede del padre (Xp), mientras que en otra célula puede hacerlo el
que procede de la madre (Xm). Las células que inactivaron uno de los dos cromosomas X mantienen dicho
cromosoma inactivado en la descendencia (tras la división celular). Se forman así clones celulares con el cromosoma
Xp inactivo (procedente de una célula inicial embrionaria donde se inactivó este cromosoma X), junto con otros clones
donde se inactivó el Xm (cuya célula de origen sufrió esta inactivación) (v. fig. 7-10). En el individuo adulto coexisten
ambos clones celulares, por lo que los tejidos son en realidad mosaicos con ambos grupos de células y comprenden
mezclas de clones celulares en los que se ha inactivado el Xp y clones celulares en los que se ha inactivado el Xm. La
heterocromatización se mantiene en las células somáticas, pero revierte en las células germinales, de tal modo que
todos los ovocitos haploides contienen un cromosoma X activo.
FIGURA 7-10 Inactivación del cromosoma X. A. Imagen microscópica del corpúsculo de Barr en el núcleo de una célula femenina (con
dos cromosomas X). Las células con la composición cromosómica X e Y no poseen corpúsculo de Barr. Este corpúsculo es un reflejo
morfológico del empaquetamiento de la cromatina que tiene lugar para reducir la dosis génica del cromosoma X. B. Durante el
desarrollo embrionario se produce la condensación (reflejada en el dibujo con unos círculos unidos) al azar del cromosoma X paterno
(Xp) o materno (Xm), que se mantiene en células hijas de modo clonal. (B, ilustración de: A. Calvo.)
Es interesante conocer que, en individuos con genotipo X0 (con síndrome de Turner, como se verá más adelante),
no se inactiva el cromosoma X remanente. En individuos XXY (con síndrome de Klinefelter) hay inactivado un
309
cromosoma X, y en individuos XXXY, se inactivan dos, de tal modo que se mantiene una dosis única del cromosoma
X.
El fenómeno de la inactivación del cromosoma X está implicado en la aparición de ciertas enfermedades con
herencia ligada al sexo. Por ejemplo, una mutación en un gen del cromosoma X resulta en acromatopsia (daltonismo),
la incapacidad de distinguir colores. La enfermedad se debe a un alelo recesivo del gen (X ). Todos los varones que
d
poseen esa mutación (genotipo X Y) presentan la alteración fenotípica. La mayoría de las mujeres portadoras de la
d
mutación (genotipo X X ) tienen visión normal, pero pueden ver las imágenes con peor resolución. Esto se debe al
N
d
fenómeno de inactivación de cromosoma X junto al mosaicismo en los conos de la retina, donde la mitad de los conos
tienen inactivado el cromosoma X con alelo normal, y la otra mitad tienen inactivado el cromosoma X con alelo
mutado.
Los mecanismos de inactivación no están del todo claros, pero se sabe que dependen del locus XIC (del inglés Xinactivation center), localizado en el cromosoma X. La transcripción de este locus produce un ARN llamado XIST, que
no se traduce a proteína, pero gobierna de algún modo la inactivación del cromosoma a partir del cual se transcribe,
aunque aproximadamente un 10% del cromosoma permanece activo, sin condensar.
310
Cromosomas
Como se ha señalado en el apartado «Estructura de la cromatina en interfase», los cromosomas son la consecuencia
del empaquetamiento del ADN nuclear junto con diversas proteínas en su grado de condensación máximo, en el que
la fibra de cromatina de 300 nm se enrolla en espiral. Esta condensación permite su observación con el microscopio
óptico en las fases del ciclo celular que tienen que ver con la división, y facilita el reparto de material genético.
Cada especie eucariota posee un número característico de cromosomas (número n), consecuencia cada uno de ellos
del empaquetamiento de distintas moléculas largas y lineares de ADN. No parece que haya una relación directa entre
la complejidad de un organismo y su número de cromosomas.
En la mayor parte de las células hay dos conjuntos (o juegos) completos de cromosomas (células diploides o con 2n
cromosomas). Uno de ellos se hereda del padre y el otro de la madre a través de sus gametos que, por lo tanto,
contienen uno solo de estos conjuntos y la mitad de cromosomas (células haploides o con n cromosomas). Cada
cromosoma de un conjunto tiene su correspondiente en el otro conjunto (constituyendo un par homólogo) que son
iguales en estructura y tamaño y que contienen los mismos genes y lugares genéticos (o loci, plural del latín locus)
aunque en distintas formas denominadas alelos (con diferencias en su secuencia de nucleótidos). De esta manera
poseen la información para el mismo conjunto de características hereditarias (fig. 7-11). En el caso de la especie
humana tenemos 46 cromosomas (2n) y cada uno de los juegos cromosómicos está compuesto de 23 cromosomas (n).
De estas parejas, 22 de ellas están formadas por cromosomas estrictamente homólogos en cuanto a tamaño, forma e
información genética (son los autosomas que se numeran del 1 al 22), mientras que la pareja formada por los
cromosomas sexuales X e Y, aunque se comportan como homólogos en la división celular, no tienen el mismo
tamaño, forma ni contienen exactamente la misma información genética. Como se ha señalado previamente, las
mujeres son el sexo homogamético (dos cromosomas X), y los varones, el heterogamético (XY).
311
FIGURA 7-11 Esquema de la estructura y partes fundamentales de los cromosomas. (Ilustración de: I. Baraibar.)
El mayor grado de condensación de los cromosomas se observa en la metafase de la división celular o mitosis. En
ese momento pueden observarse fácilmente al microscopio óptico los distintos cromosomas y sus diferentes partes. El
cromosoma metafásico se observa tras la replicación del ADN, que ha tenido lugar en la interfase como preparación a
la división celular, y que deberá repartir exactamente la misma cantidad de este en las dos células hijas
(genéticamente idénticas a la célula de la que provienen). Por ello, cada molécula de ADN se ha duplicado y ambas
copias se mantienen unidas por el centrómero o constricción primaria (v. fig. 7-11). Cada una de esas copias es una
cromátida. Las dos cromátidas que forman un cromosoma metafásico (cromátidas hermanas; v. fig. 7-11) son, si no se
han producido errores en la replicación, de secuencia idéntica y serán repartidas en las células hijas al final de la
división celular. Ambas cromátidas hermanas se mantienen unidas a través de unas proteínas denominadas
cohesinas.
El centrómero divide a cada una de las cromátidas en dos brazos que, dependiendo de su posición, pueden ser
iguales o distintos en longitud. Por convenio, cuando el cromosoma se coloca en posición vertical siempre se coloca
hacia arriba el brazo pequeño (brazo p, del francés petit) y hacia abajo el brazo grande (brazo q, simplemente la
siguiente letra del abecedario). Los extremos de las cromátidas se denominan telómeros.
En función de la posición del centrómero, los cromosomas se clasifican en cuatro tipos básicos: metacéntricos,
cuando el centrómero se localiza aproximadamente en el centro, dividiendo al cromosoma en dos brazos de la misma
longitud; submetacéntricos, cuando el centrómero queda algo desplazado hacia un lado dividiendo al cromosoma en
un brazo largo y otro corto; acrocéntricos, cuando el centrómero se encuentra cerca de un extremo haciendo que el
brazo p sea muy pequeño; y telocéntricos, cuando el centrómero se encuentra en el extremo haciendo que el brazo p
312
sea prácticamente inexistente (no aparecen en humanos con genotipo normal). De esta manera, los distintos
cromosomas pueden diferenciarse en función de su tamaño, posición del centrómero y tinción con distintas técnicas.
El centrómero, o constricción primaria, es el centro cinético del cromosoma y es absolutamente esencial para que se
pueda llevar a cabo el reparto o segregación de material genético durante la división. Los cromosomas que, por
diversas causas, carecen de centrómero (acéntricos) no pueden unirse a las fibras del huso acromático y no pueden
ser transportados hacia lo que será el futuro núcleo de las células hijas. Al final de la profase de la mitosis, a cada lado
del centrómero, se une a ambas cromátidas hermanas un gran complejo proteico denominado cinetocoro. Los
microtúbulos del huso se unen a ambos cinetocoros que, en la anafase, promueven que cada una de las cromátidas
hermanas migren hacia polos opuestos tras la degradación de las cohesinas por modificaciones químicas, generando
dos cromosomas independientes e idénticos en ambas células hijas.
Los centrómeros están formados por secuencias de ADN específicas. En organismos como la levadura estas son
relativamente cortas, de unos 110 pares de bases (pb), e intercambiables entre los cromosomas sin efectos evidentes.
Sin embargo en los mamíferos, los centrómeros están formados por cientos de kilobases (Kb) de ADN repetitivo que, a
veces, son específicos de cromosoma. Un ADN de este tipo es el ADN satélite α (v. más adelante el apartado
«Complejidad del ADN humano. Tipos de secuencias en el ADN») que es una repetición en tándem de una unidad de
171 pb.
Por su parte, los telómeros están formados por estructuras especializadas de ADN y proteínas. Sus funciones son
variadas. Por un lado mantienen la integridad estructural del cromosoma, ya que si se pierden los cromosomas
tienden a fusionarse entre sí o degradarse. Además, también ayudan a establecer la arquitectura tridimensional del
núcleo y probablemente a posicionar cada cromosoma en su sitio. Finalmente, como veremos más adelante, aseguran
que la replicación del ADN sea completa.
Las secuencias que forman los telómeros son cadenas largas de una determinada secuencia variable entre especies,
aunque relativamente bien conservada en la evolución. En humanos esta secuencia es TTAGGG, que se encuentra
repetida en tándem hasta una longitud variable de entre 3 y 20 Kb, precedida por entre 100 y 300 Kb de otro tipo de
repeticiones cuya función exacta se desconoce.
Métodos de estudio de los cromosomas. Nomenclatura
Algunas patologías humanas están relacionadas con alteraciones tanto en el número como en la estructura de los
cromosomas. Del análisis a nivel cromosómico se encarga la citogenética.
Los cromosomas se observan en las células en división, un estado que no puede identificarse fácilmente en las
células obtenidas directamente del cuerpo humano. Actualmente, las fuentes más frecuentes de células para este tipo
313
de análisis son la médula ósea (en la que se pueden observar bastantes células en división), sangre periférica (más fácil
de obtener) y, en algunos casos, fibroblastos de la piel o células del fluido amniótico o tejido coriónico.
Para el análisis citogenético (fig. 7-12), es necesario cultivar las células nucleadas de estos tejidos estimuladas con
fitohemaglutinina durante un determinado período de tiempo para lograr su entrada en división celular.
Posteriormente, el tratamiento con colchicina disgrega las fibras del huso acromático aumentando el índice mitótico
(proporción de células en mitosis), lo que incapacita a las células para abandonar la división celular. Esto hace que se
acumulen en metafase. Tras el tratamiento de las suspensiones celulares con medio hipotónico y posterior fijación, por
medio del microscopio óptico seremos capaces de observar los cromosomas y analizarlos realizando el cariotipo.
FIGURA 7-12 Etapas para la realización de un cariotipo.
Aunque ahora nos parezca sorprendente, hasta 1956 no se determinó que el número de cromosomas de la especie
humana era 46. Poco más tarde se identificaron las primeras patologías relacionadas con alteraciones en ese número,
como los síndromes de Down, Turner y Klinefelter.
Hasta la década de los setenta del siglo pasado, los cromosomas únicamente podían ser identificados en base a su
longitud y posición del centrómero. Posteriormente, la introducción de técnicas de tinción específica permitió
identificar de manera inequívoca cada uno de ellos y analizar posibles alteraciones en su estructura, en lo que se
conoce como técnicas de bandeo cromosómico. En estas técnicas los cromosomas se desnaturalizan o digieren
enzimáticamente y posteriormente se añaden compuestos que tiñen específicamente el ADN, provocando que los
cromosomas mitóticos se tiñan de bandas claras y oscuras alternativamente en distintos niveles de resolución (400, 550
y 850 bandas por juego haploide).
Mediante el método de las bandas Q (de quinacrina), los cromosomas se tiñen con un colorante fluorescente que se
une preferentemente a las zonas ricas en A y T. Las bandas así obtenidas son similares a las del método de bandas G
(de Giemsa), el más utilizado (v. figs. 7-12 y 7-13). Con este método se somete a las preparaciones a una digestión
suave con tripsina y, posteriormente, se añade Giemsa. Esta tinción puede observarse con la ayuda del microscopio
óptico. Las bandas G oscuras se relacionan con regiones que se replican más tarde en la fase S y se encuentran en la
cromatina más densa. Las bandas R son básicamente el reverso de las bandas G, para lo cual es necesario
desnaturalizarlas mediante calor suave en solución salina antes de tratar con Giemsa. Este tratamiento desnaturaliza
314
preferentemente las zonas ricas en AT, por lo que las bandas R son claras con quinacrina. Las bandas C se obtienen al
teñir con Giemsa tras una desnaturalización con hidróxido de bario y marcan básicamente la heterocromatina
constitutiva, principalmente los centrómeros. Las bandas T identifican un subgrupo de bandas R concentradas en los
telómeros y se obtiene tras tinción con Giemsa de cromosomas fuertemente desnaturalizados por calor.
FIGURA 7-13 Cariotipo humano y grupos de cromosomas (A-G). (Imagen por cortesía del Departamento de Genética de la Universidad de Navarra.)
En la actualidad, tras la fijación, se aplican cualquiera de estas técnicas de tinción (la más frecuente es la de bandas
G), tras la cual los cromosomas de un núcleo se fotografían, se recortan (mediante técnicas digitales con ayuda de
programas informáticos específicos) y se ordenan para obtener el cariotipo (v. figs. 7-12 y 7-13). Su análisis visual
permite comprobar la integridad del número y estructura de los cromosomas. El patrón de bandas de los cromosomas
se puede representar mediante un ideograma específico para cada uno de los cromosomas (fig. 7-14).
En el cariotipo, los cromosomas se ordenan en parejas de cromosomas homólogos. Estos cromosomas son
metafásicos, por lo que recordaremos que cada uno de ellos tiene a su vez dos cromátidas resultado de la replicación
del ADN en la fase S. Generalmente, estas cromátidas se encuentran unidas y no se distinguen con el microscopio
óptico. La base de los criterios internacionales para la ordenación de los cromosomas humanos (International System for
Human Cytogenetic Nomenclature [ISCN]) se estableció en París en 1971 y tiene en cuenta la longitud, posición del
centrómero y tinción diferencial en bandas. Los autosomas se dividen en grupos, desde el A hasta el G (v. fig. 7-13),
mientras que los cromosomas sexuales forman un grupo aparte.
La tinción de bandas hace que, dentro de cada uno de los brazos p y q de los cromosomas, se puedan observar
alternativamente regiones claras y oscuras (v. figs. 7-13 y 7-14) que se numeran de manera consecutiva p1, p2, etc.
Dentro de cada región, y dependiendo del nivel de resolución, se observan bandas numeradas como p11 (uno-uno,
nunca once), p12 (uno-dos, no doce), etc., subbandas (p11.1, p11.2) y sub-subbandas (p11.21, p11.22). Para esta
numeración siempre se empieza desde la posición proximal (cercana al centrómero) hacia la posición distal (hacia el
telómero).
315
FIGURA 7-14 Ideogramas que muestran la tinción diferencial de bandas G de los cromosomas humanos.
Según el ISCN, para la descripción de un cariotipo primero se especifica el número total de cromosomas, seguido de
la composición de cromosomas sexuales y después las posibles alteraciones. Todos estos datos irán separados por
comas sin espacios. Por ejemplo, el cariotipo de un varón normal sería 46,XY y el de una mujer normal, 46,XX. En los
individuos mosaicos, o con dos o más constituciones cromosómicas distintas, cada una de ellas vendría separada por
una barra (/). Las ganancias o pérdidas de cromosomas completos se indican con el signo + o – antes del cromosoma
implicado (47,XY,+21 sería el cariotipo correspondiente a un varón con trisomía 21 o síndrome de Down). Las
alteraciones estructurales presentan una descripción algo más compleja en la que debe quedar clara la región
cromosómica que se encuentra implicada. Esta nomenclatura internacional permite definir con exactitud todas las
alteraciones cromosómicas que pueden observarse.
Además de las técnicas convencionales de análisis citogenético por tinción de bandas (citogenética convencional)
en la actualidad se dispone de otras técnicas de análisis englobadas bajo el nombre de citogenética molecular, que
permiten el estudio de determinadas alteraciones de manera más específica y sensible.
En la citogenética molecular se combinan las técnicas clásicas de obtención y ordenación de cromosomas con la
hibridación específica de ciertas zonas de estos con sondas de ADN más o menos largas. La base de todas ellas es la
técnica de FISH (del inglés fluorescence in situ hybridization) en la cual la preparación de los cromosomas se seca, se
desnaturaliza y posteriormente se hibrida con sondas específicas marcadas con fluorocromos (v. capítulo 3). Esta
hibridación posteriormente se analiza con un microscopio de fluorescencia que, utilizando diversos filtros, es capaz de
detectar en un mismo ensayo la hibridación con las sondas diferencialmente marcadas. Generalmente, la técnica se
realiza sobre cromosomas en metafase (FISH en metafase) pero en algunos casos es complicado obtener células en
división (p. ej., en células incluidas en parafina), por lo que también se puede realizar en interfase (FISH en interfase
o sobre núcleos) (fig. 7-15).
316
FIGURA 7-15 Análisis mediante FISH de células en metafase (A) e interfase (B). En este caso se utilizaron dos sondas flanqueantes al
gen PDGFRA (situado en 4q12), una marcada con un fluorocromo verde y la otra con un fluorocromo rojo. El patrón observado muestra
colocalización de las señales verdes y rojas, indicando que ninguno de los alelos de este gen se encuentra fragmentado. (Imágenes por
cortesía del Departamento de Genética de la Universidad de Navarra.)
Una variante de la técnica de FISH se basa en el empleo de un conjunto de sondas que son específicas de un
determinado cromosoma. El resultado es lo que se conoce como pintado (painting) cromosómico. La combinación de
distintos fluorocromos y sondas de pintado es la base del SKY (spectral karyotyping) o cariotipo espectral en el que se
pueden visualizar de distinto color los 24 cromosomas diferentes humanos. Este análisis es muy útil cuando las
alteraciones son múltiples y prácticamente imposibles de caracterizar mediante el cariotipo convencional; sin
embargo, se requiere un equipo complejo que hace que su coste sea elevado para los análisis de rutina. Otra variante
es la CGH (del inglés comparative genomic hybridization) o hibridación genómica comparada (v. capítulo 3). En esta
técnica se hibridan todos los cromosomas con el conjunto de sondas para cada uno de ellos marcadas en dos colores
simultáneamente. Esto permite detectar ganancias y/o pérdidas de material a nivel genómico global y se utiliza
mucho en la búsqueda de regiones cromosómicas perdidas o amplificadas en tumores o en otro tipo de enfermedades.
Aberraciones cromosómicas y enfermedades humanas
Muchas de las alteraciones en la estructura o el número de los cromosomas (aberraciones cromosómicas o
cromosomopatías) pueden ser observadas mediante la realización de un cariotipo convencional y las técnicas de
tinción de bandas. Sin embargo, este análisis requiere de personal altamente especializado y, a pesar de dar una
excelente visión del estado general del genoma, no es capaz de detectar (en el mejor de los casos) alteraciones que
afecten a menos de 4 Mb. Este nivel de detección ha sido considerablemente reducido con las técnicas de citogenética
molecular.
Las cromosomopatías pueden clasificarse en dos tipos. Las alteraciones cromosómicas constitucionales están
presentes en todas las células de un organismo y han podido aparecer bien en el cigoto o en alguna fase muy
temprana del desarrollo. Generalmente, son consecuencia de alteraciones presentes en alguno de los gametos o de
algún error durante la fertilización. Estas alteraciones estarán presentes en la línea germinal del individuo y, por ello,
317
podrán ser transmitidas a la descendencia a través de los gametos. Por el contrario las alteraciones cromosómicas
somáticas están presentes únicamente en algunos tejidos o células del individuo. Como resultado de ello, el individuo
será un mosaico ya que contendrá células de constituciones genéticas distintas, aunque todas ellas derivadas de un
mismo cigoto.
Además, las aberraciones cromosómicas pueden ser numéricas o estructurales. Las primeras son consecuencia de
una alteración en el número de cromosomas, mientras que en las segundas se observa un cambio en la estructura de
alguno de ellos. Algunos ejemplos de alteraciones estructurales son duplicaciones (repeticiones de segmentos
cromosómicos), deleciones (pérdida de segmentos), inversiones (cambio en la orientación), inserciones y
translocaciones (o intercambio de segmentos entre cromosomas distintos). Algunas de estas alteraciones son
frecuentes en distintos tipos de cáncer.
Las alteraciones cromosómicas numéricas pueden ser de dos tipos. En la aneuploidía aparecen uno o más
cromosomas de más o de menos, pero sin llegar al número haploide completo con respecto al número normal
diploide (individuo disómico, 2n). Las aneuploidías presentan distintos grados de severidad en los fenotipos que
provocan en la especie humana, siendo más graves en general cuando afectan a un autosoma que a un cromosoma
sexual, y las pérdidas resultan más graves que las ganancias. La ausencia completa de un par cromosómico
(nulisomía, 2n-2) es incompatible con la vida. Cuando falta uno de los dos cromosomas de un par se denomina
monosomía (2n-1); cuando tenemos tres copias de un cromosoma, trisomía (2n + 1); si hay cuatro copias, tetrasomía
(2n + 2), y si hay cinco, pentasomía (2n + 3), etc.
En el cáncer aparecen frecuentemente células aneuploides, pero de manera constitucional solo se observan algunas
de todas las posibles en humanos. Por ejemplo, solo hay tres trisomías de autosomas viables en humanos, las que
afectan a los cromosomas 13, 18 y 21. La trisomía 21 (47,XX,+21 o 47,XY,+21) o síndrome de Down es la causa más
frecuente de retraso mental congénito con una prevalencia de uno por cada 650 nacidos vivos y fue la primera
patología descrita con causas cromosómicas en 1959. Los individuos con esta enfermedad tienen una apariencia
característica: estatura baja, alteraciones cardíacas y un retraso mental variable. Los individuos mosaicos con
poblaciones celulares normales son clínicamente más leves. No todos los individuos con síndrome de Down presentan
trisomía 21 pura, sino que hay casos en los cuales la causa es una alteración estructural (translocación robertsoniana)
que implica a los cromosomas 14 y 21. En estos casos se presenta recurrencia familiar. La trisomía 13 (47,XX,+13 o
47,XY,+13) es la causa del síndrome de Patau, con una prevalencia de uno cada 10.000 nacidos vivos, de los que el
90% fallecen en el primer año de vida. La mayoría de los afectados son varones que presentan malformaciones en
múltiples órganos, polidactilia y microftalmía. La trisomía 18 (47,XX,+18 o 47,XY,+18) es la causa del síndrome de
Edwards. Su prevalencia es de uno cada 6.000 nacidos vivos y afecta más frecuentemente a mujeres. De nuevo, muy
pocos casos sobreviven al primer año de vida y es la cromosomopatía que suele observarse en abortos espontáneos.
Los afectados también presentan malformaciones en múltiples órganos. La causa más frecuente de estas trisomías es
la no disyunción (segregación) de los cromosomas en la meiosis que da lugar a los gametos.
318
Las aneuploidías que afectan a cromosomas sexuales son mejor toleradas. La monosomía X (45,X o 45,X0) o
síndrome de Turner es la única monosomía viable en humanos. Los afectados son fenotípicamente mujeres, ya que
carecen del cromosoma Y. Clínicamente se caracteriza por amenorrea primaria, ausencia de cambios puberales
femeninos y estatura anormalmente baja. Su frecuencia es de 1 cada 5.000 niñas nacidas vivas. Este síndrome no suele
asociarse a retraso mental ni parece relacionado con la edad materna. Existen individuos mosaicos 46,XX/45,X con esta
enfermedad. El síndrome de Klinefelter (47,XXY) es una aneuploidía relativamente frecuente en varones (1 cada
1.000 nacidos vivos) y se caracteriza clínicamente por hipogonadismo y ginecomastia. También existen individuos
mosaicos e individuos con tres o cuatro cromosomas X; en estos últimos casos el fenotipo clínico es más grave.
La euploidía es el otro tipo de aberración cromosómica numérica y se produce por alteración en el número de
juegos haploides. Estas alteraciones genéticas, cuando son constitucionales, son letales en la especie humana. Sin
embargo pueden aparecer en células somáticas y se observan, por ejemplo, en células tumorales. Las más frecuentes
serían las triploidías (3n, 69 cromosomas) y las tetraploidías (4n, 92 cromosomas).
319
Complejidad del ADN humano. Tipos de secuencias en el ADN
El genoma es el conjunto de material genético de un organismo. La palabra proviene de gen, que actualmente se
define como el conjunto de secuencias de ADN de todo tipo (estructurales y reguladoras) necesarias para codificar un
producto génico, sea este un ARN maduro o cualquier otro tipo de proteína funcional. Así, el genoma humano es el
conjunto de moléculas de ADN que se encuentran dentro de todas y cada una de las células del cuerpo humano.
Todas las células poseen el mismo genoma (salvo los gametos, que tienen la mitad), pero la expresión diferencial de
unos genes u otros (v. capítulo 8) hará que cada una cumpla distintas funciones dentro de un organismo. De esta
manera, el genoma contiene toda la información necesaria para que el cigoto se convierta en un ser humano adulto.
El genoma humano se encuentra localizado en el núcleo y, en una pequeña proporción, en las mitocondrias (v.
capítulo 11). El genoma humano nuclear haploide tiene un tamaño de aproximadamente 3.200 millones de
nucleótidos (megabases, Mb). En las células somáticas o diploides, la cantidad contenida en el núcleo es el doble, ya
que proviene del cigoto formado por la unión de dos células (los gametos) de genomas haploides en la fecundación.
La estructura de este genoma es bastante compleja (fig. 7-16) aunque una primera clasificación sencilla nos
permitiría dividirlo en dos partes. Una primera parte (aproximadamente el 30%) estaría constituida por todas aquellas
secuencias que forman parte de los genes y se relacionan con ellos (englobando aquí los exones, intrones, las regiones
no traducidas que contienen secuencias reguladoras, etc.). Una segunda parte (70%) estaría formada por el ADN que
se encuentra entre los genes, el denominado ADN extragénico, que no codificaría ninguna proteína ni contendría
ningún elemento funcional. Del 30% correspondiente a genes y secuencias relacionadas, solo el 5% sería codificante
(exones); esto es, solo el 1,5-2% del genoma humano codificaría proteínas. Desde esta perspectiva, la mayor parte del
genoma nuclear correspondería a ADN extragénico y, en principio, no funcional. Sin embargo, los últimos resultados
obtenidos por el proyecto ENCODE (ENCyclopedia Of DNA Elements) en septiembre de 2012 indican que
probablemente esto no es así. Según sus resultados, la mayor parte del ADN humano se transcribiría en moléculas de
ARN funcionales. Este hecho, de confirmarse, cambiaría radicalmente la visión que se tiene del genoma como una
pequeña parte de secuencia codificante en una mayoría de secuencia no activa biológicamente. Estos nuevos datos
indicarían que, en realidad, el genoma nuclear contendría pocas secuencias realmente sin función.
320
FIGURA 7-16 Tipos de secuencias presentes en el genoma nuclear humano.
Un gen típico estaría formado por un segmento de ADN que codifica para un producto funcional. Su estructura
básica consistiría en una secuencia transcrita (que codifica el producto) y en secuencias accesorias reguladoras (que
harán que ese producto se sintetice en el momento y lugar preciso). La secuencia transcrita generalmente no es
continua, ya que está compuesta por segmentos codificantes o exones interrumpidos por segmentos no codificantes
o intrones (fig. 7-17). A pesar de que esto parece a simple vista un derroche de secuencia y un aumento innecesario de
la complejidad, confiere un enorme potencial y flexibilidad al genoma eucariota, ya que un mismo gen será capaz de
codificar varios productos distintos y relacionados (v. capítulo 8). Las secuencias reguladoras se encuentran
flanqueando la secuencia transcrita tanto a izquierda como a derecha. Las más importantes son las secuencias
promotoras, que son zonas de unión a distintos factores de transcripción (proteínas cuya unión hará que se active o
desactive la expresión de un determinado gen) generales o específicos de tejido o tipo celular. Otros elementos
reguladores son los potenciadores, silenciadores, etc.
FIGURA 7-17 Estructura de un gen de eucariotas. (Ilustración de: I. Baraibar.)
Los datos obtenidos tras la secuenciación del genoma humano indican que una de sus características es la
heterogeneidad, aunque se pueden dar varios datos promedio. Frente a las primeras especulaciones que indicaban
que había alrededor de 100.000 genes, actualmente este valor se estima que estaría entre 20.000 y 40.000 (sin tener en
cuenta los datos del Proyecto ENCODE mencionado anteriormente). La densidad media de genes sería de uno cada
100 Kb, aunque hay una gran variabilidad, con regiones ricas en genes y regiones pobres en genes. Esto hace que en
cada millón de pares de bases nos podemos encontrar una media de 10 genes. El tamaño promedio de cada gen sería
de 20-30 Kb con una media de siete a ocho exones por gen, aunque también existe una gran variabilidad en ambos
aspectos. El tamaño medio por exón sería de unos 150 pb, siendo el tamaño de los intrones enormemente variable.
Esto nos daría un ARNm medio de entre 1,8 y 2,2 Kb, con una porción codificante de aproximadamente 1,4 Kb.
El contenido del genoma humano en G + C es de aproximadamente el 41%, menor al teóricamente esperado del
50%. Esta proporción de bases no se distribuye de manera homogénea, ya que existen regiones en las cuales la
densidad de G + C es mayor y en las que se concentran un mayor número de genes. Este hecho era conocido antes de
la publicación de la secuencia del genoma humano y dio lugar al modelo de isocoros en la organización de los
genomas eucariotas. Según este modelo, los genomas de vertebrados y plantas son en realidad mosaicos de segmentos
de ADN de, al menos, 300 Kb de secuencia uniforme dentro de cada segmento pero distinta del resto de los
321
segmentos. Así, los primeros experimentos de fraccionamiento del genoma humano y centrifugación diferencial en
gradientes de densidad (separación en base a su composición) permitieron comprobar la existencia de cinco isocoros o
fracciones según su contenido en G + C: L1 y L2 (L, de low, o bajo contenido en G + C) y H1, H2 y H3 (H, de high, o
alto contenido en G + C). Por ejemplo, el isocoro H3 ocupa la menor proporción (inferior al 10%) pero contendría hasta
el 25% de todos los genes. En realidad, el modelo de isocoros es una excesiva simplificación de la estructura del
genoma humano, pero ejemplifica su heterogeneidad.
La perspectiva tradicional indica que la mayor parte del ADN extragénico está formado por secuencias repetitivas
(repetidas muchas veces en el genoma) mientras que el ADN correspondiente a genes y secuencias relacionadas es de
secuencia única o de bajo número de copias (secuencias que se encuentran repetidas en el genoma una o muy pocas
veces). Entre estas últimas se encuentran las familias de genes. Las familias de genes son grupos de genes con una
secuencia idéntica o similar que pueden estar agrupados en determinadas regiones cromosómicas o dispersos por
todo el genoma. Estas familias parecen haberse formado debido a procesos de duplicación del material genético
ancestral y posterior divergencia mediante mutación. Entre ellas, las familias génicas clásicas están formadas por
copias idénticas o casi idénticas que codifican para el mismo producto y que la célula requiere en gran cantidad. Este
es el caso de los genes de las histonas o de los diversos ARNr o ARNt.
Las familias multigénicas, por el contrario, están formadas por copias similares (pero no idénticas) que codifican
para productos relacionados que pueden tener funciones distintas o expresarse en distintas fases del desarrollo, como
la familia de las globinas. Entre las distintas copias puede haber copias funcionales, fragmentos de genes, genes
truncados y seudogenes. Los seudogenes son copias similares a los genes funcionales pero inactivas, generalmente
por acumulación de mutaciones, y que pueden considerarse reliquias evolutivas de copias funcionales. Algunos
seudogenes se transcriben, aunque no dan lugar a la proteína final. Se calcula que en el genoma humano puede haber
unos 20.000 seudogenes formados a partir de la duplicación de unos 2.500 genes.
Más del 50% del genoma humano está formado por ADN repetitivo. Dado que, en su mayor parte, es no
codificante, tradicionalmente a esta fracción del genoma se le ha considerado ADN basura o chatarra (en inglés junk).
Esta definición es probablemente errónea, dados los últimos resultados de proyectos como ENCODE. El ADN
repetitivo se puede dividir en dos categorías: las repeticiones dispersas (a lo largo del genoma) y las repeticiones en
tándem (seguidas una detrás de la otra) (fig. 7-18).
322
FIGURA 7-18 Esquema de los diversos tipos de secuencias repetidas en el genoma humano. (Ilustración de: I. Baraibar.)
El ADN no codificante repetido en tándem se puede clasificar en función del tamaño originado por la repetición.
Gran parte de este genoma (unas 250 Mb) es ADN satélite (llamado así porque al separar el ADN genómico por
centrifugación en gradiente de densidad aparece como bandas «satélites» de la banda principal). Este ADN satélite
está formado por la repetición miles de veces de determinadas secuencias, dando lugar a secuencias repetidas de entre
100 Kb a varias megabases. Hay varias clases de ADN satélite; por ejemplo, en el satélite 1 la secuencia repetida es de
42 nucleótidos, en el satélite 2 de diez y en el satélite 3 de cinco. Los satélites α, β y γ (con unidades repetidas de 171,
68 y 220 nucleótidos, respectivamente) son componentes importantes de los centrómeros de los cromosomas
humanos.
Otros dos tipos de ADN no codificante repetido en tándem son los minisatélites y los microsatélites. El ADN
minisatélite está formado por secuencias de seis a 25 nucleótidos repetidas en tándem para formar unidades de entre
100 nucleótidos y 20 Kb. Un ejemplo de este tipo de ADN es el que forman los telómeros (o extremos de los
cromosomas). Además, algunas de estas repeticiones son polimórficas (presentan distintos tamaños o formas en la
población) y forman los marcadores VNTR (variable number of tandem repeats) utilizados en genética forense y en
técnicas de identificación individual (v. capítulo 3). El ADN microsatélite, por su parte, está formado por secuencias
de dos a cuatro nucleótidos que forman bloques de tamaño inferior a 150 nucleótidos. Un ejemplo son las repeticiones
tipo (CA) , siendo n un número variable. De nuevo, su elevado polimorfismo y la frecuencia de este tipo de secuencias
n
en el genoma han hecho que sean muy utilizados en genética forense y en identificación individual como marcadores
STR (short tandem repeats).
El ADN no codificante repetido de manera dispersa es el resultado de la copia de una determinada secuencia en
distintas partes del genoma. Esta copia puede aparecer miles de veces a lo largo del genoma y en total constituye
prácticamente el 45% de todo el genoma humano. De nuevo, puede clasificarse en función del tamaño de la secuencia
repetida. Entre este tipo de secuencias destacan los SINE (short interspersed nuclear elements, o elementos nucleares
dispersos cortos) que son unidades de 100-500 nucleótidos, repetidas miles de veces. El principal SINE es la familia de
elementos Alu específica de primates (secuencia de 250 a 280 pb con 1.500.000 copias, lo que le hace ser la secuencia
más repetida del genoma humano con una copia cada 3 o 4 Kb). Estos elementos actúan como un retrotransposón,
pudiendo copiarse e insertarse en otras regiones del genoma, aunque no de manera autónoma. Otras secuencias
323
repetidas dispersas son los LINE (long interspersed nuclear elements, o elementos nucleares dispersos largos) que son
secuencias con un tamaño de varias Kb que pueden transponerse de manera autónoma, ya que codifican para una
transcriptasa inversa y una endonucleasa. Los LINE se agrupan en distintas familias: LINE1 (L1), LINE2 y LINE3. En
conjunto suponen alrededor del 20% del genoma humano aunque L1 es el más importante, con el 17% del genoma y
más de 500.000 copias. Las proteínas codificadas por este elemento son utilizadas para la retrotransposición de los
SINE y, además, parece que los L1 también pueden modificar la transcripción de los genes en los que se encuentran.
Otros elementos repetidos dispersos son los transposones LTR y los transposones ADN. Los transposones LTR son
secuencias semejantes a las de los genomas de retrovirus que se han ido integrando en el genoma humano en el curso
de la evolución y que se encuentran flanqueadas por repeticiones largas directas (LTR, del inglés long terminal direct
repeats) y que pueden ser elementos autónomos y no autónomos. En total hay unas 450.000 copias que ocupan algo
más del 8% del genoma. Los elementos autónomos se denominan HERV (human endogenous retroviral sequences) y
constituyen casi un 5% del genoma humano. Los elementos no autónomos son copias truncadas de estas secuencias.
Por último, aproximadamente un 3% del genoma humano está formado por transposones ADN, con alrededor de
300.000 copias. Estos elementos son semejantes a los transposones bacterianos y consisten básicamente en una
secuencia con repeticiones terminales invertidas y un segmento interno que codifica para una enzima denominada
transposasa. Generalmente, el gen de la transposasa aparece mutado, por lo que muchos de los transposones
presentes en el genoma humano no pueden codificar una enzima activa. Sin embargo, la transposasa codificada por
algunos de ellos puede actuar sobre las copias inactivas. Este tipo de secuencias se agrupan en distintas familias entre
las que destacan las MER1 y MER2 y los elementos mariner, responsables de algunas reordenaciones cromosómicas
importantes en patología humana.
Tanto los retrotransposones como los transposones son capaces de moverse creando copias por el genoma. Sin
embargo, afortunadamente, esto sucede con una frecuencia muy baja, ya que se calcula que solo uno de cada 100-200
nacimientos nuevos lleva una inserción nueva de un elemento Alu o L1. Lógicamente, los efectos de este movimiento
dependerán de la zona del genoma en la que se produzca la inserción. Los efectos patogénicos pueden deberse a la
rotura de genes por su interrupción, a alteraciones en su expresión (por inserción de elementos en los elementos
reguladores) o a recombinaciones ilegítimas entre segmentos repetidos.
324
Proyecto genoma humano
Con la descripción de la estructura del ADN como una doble hélice, por J. D. Watson y F. H. C. Crick (1953), comienza
a desarrollarse la genética molecular, que desembocaría en el desarrollo de la tecnología del ADN recombinante en la
década de los setenta. Sin embargo, la obtención en el laboratorio de la secuencia (el orden y posición de los distintos
nucleótidos) de un segmento de ADN (secuenciación) fue uno de los grandes retos que no se resolvió hasta 1977, año
en el cual se publicaron los métodos enzimáticos (de Sanger) y químicos (de Maxam y Gilbert). La automatización de
este proceso en la década de los noventa permitió obtener secuencias a gran escala que permitieron definitivamente el
reto de la secuenciación de grandes genomas completos como el humano, de más de 3.000 millones de nucleótidos (el
haploide). Solo 50 años más tarde de la descripción de la doble hélice, el 14 de abril de 2003, se publicó la secuencia
preliminar del genoma humano, cuyos datos se hicieron de libre acceso. Este hecho ha sido considerado como el
comienzo de la era genómica.
Las técnicas de secuenciación habían permitido a finales de la década de los ochenta conocer la secuencia de la
mayor parte de los genes humanos cuya alteración era la causa de las enfermedades monogénicas más frecuentes.
Esto resultó fundamental para conocer la naturaleza molecular de estas enfermedades, diagnosticarlas y, en último
término, desarrollar terapias efectivas frente a algunas de ellas. Sin embargo, este esfuerzo resultaba enorme. En
muchos casos, varios grupos de investigación trabajaban simultáneamente en la caracterización de un gen que,
finalmente, era publicado por solo uno de ellos. Además, los esfuerzos de la investigación en genética comenzaban a
encaminarse al conocimiento de las causas de las enfermedades multifactoriales, en cuyo desarrollo intervienen tanto
efectos ambientales como una combinación de distintas mutaciones o polimorfismos (variantes de secuencia con una
frecuencia superior al 1% de los alelos de la población). Esto hacía que su identificación fuera muy complicada con la
estrategia de análisis clásica. Esta preocupación, junto con el interés del Departamento de Energía de EE. UU. en la
investigación de los efectos de la radiación sobre el genoma, cristalizó en la puesta en marcha del Proyecto Genoma
Humano (PGH) en 1990. Este fue uno de los proyectos más ambiciosos de investigación en biomedicina de
colaboración internacional llevados a cabo hasta entonces. Su objetivo era, en último término, conocer la secuencia del
genoma nuclear humano en 15 años. La secuencia del genoma humano mitocondrial (ADNmt, v. capítulo 11) se
conocía desde 1981. La obtención de la secuencia del genoma nuclear no era un trabajo sencillo en aquel momento, ya
que la tecnología existente no permitía obtener más que los datos de unos pocos cientos de nucleótidos al día a un
investigador experimentado. Sin embargo, se alcanzó antes de lo esperado, debido al desarrollo de tecnologías de
secuenciación automática y a la competencia en EE. UU. de la empresa privada Celera Genomics.
Para conseguir tal información era necesario cumplir previamente varios objetivos parciales, que posteriormente
(conforme avanzó el Proyecto) serían revisados. Así, en el desarrollo del PGH se pueden establecer dos fases. La
primera, llevada a cabo hasta 1998, se centró en la construcción de distintos tipos de mapas del genoma. Esto es, en la
construcción de diferentes «bocetos» por medio de distintas herramientas, que permitieran posteriormente localizar
325
en el genoma la posición de los distintos fragmentos de secuencia que se iban a ir obteniendo para reconstruir la
secuencia global como si fuera un puzle. Las reacciones de secuenciación llevadas a cabo en el laboratorio permitían
obtener fragmentos de secuencia inferiores a 1.000 nucleótidos, por lo que era necesario empalmar cientos y miles de
ellos para reconstruir los distintos cromosomas y, finalmente, el genoma nuclear completo. Durante la segunda fase,
llevada a cabo desde 1998, se realizó la secuenciación propiamente dicha. Para entonces, la tecnología se había
desarrollado lo suficiente como para afrontar este reto con garantías.
De manera simultánea, el PGH desarrolló proyectos de secuenciación de los genomas de otros organismos modelo.
Esto se realizó con dos objetivos fundamentales. En primer lugar se necesitaba comprobar que las estrategias
experimentales funcionaban con genomas más pequeños. Pero más importante y a más largo plazo, la secuencia
obtenida de los genomas de estos organismos permitiría conocer la función de una gran cantidad de secuencias que
fueran homólogas en nuestro genoma.
Uno de los aspectos más importantes del PGH fue el programa Ethical, Legal and Social Implications (ELSI), al que se
dedicó una parte importante del presupuesto inicial. Desde un primer momento quedaron patentes las consecuencias
que la información obtenida por este proyecto iba a tener en las vidas de todos. Cuestiones como el diagnóstico de
enfermedades que no tienen tratamiento, la posible generalización de una mentalidad eugenésica de discriminación
por razones genéticas, el diagnóstico prenatal de alteraciones genéticas que confieran predisposición al desarrollo de
enfermedades en la edad adulta, la confidencialidad de los datos genéticos y su posible uso con fines laborales, de
inmigración o simplemente de seguros médicos, son y serán temas frecuentes de debate en la sociedad, con
importantes implicaciones en nuestras vidas.
Otros objetivos importantes planteados en el transcurso del PGH fueron el desarrollo de la bioinformática, la
enseñanza y entrenamiento en genómica, la distribución inmediata y gratuita de los datos que se fueran obteniendo
(prácticamente a tiempo real a través de Internet), el estudio de la variación del genoma humano (a través de
proyectos anejos como el Proyecto Diversidad del Genoma Humano o el Proyecto HapMap o de mapas de haplotipos) y,
sobre todo, el desarrollo de la genómica funcional para la identificación de todos los genes y para determinar la
función de cada uno de ellos. Este último objetivo es uno de los grandes retos de la investigación biomédica de este
siglo.
El desarrollo de las herramientas bioinformáticas para la recolección, distribución y análisis de los datos obtenidos
fue (y sigue siendo), junto con el desarrollo de las tecnologías de secuenciación automática a gran escala, fundamental
para el PGH. La comunicación entre los distintos centros implicados en el proyecto y el resto de investigadores es
básicamente electrónica, a través de Internet. Para ello, fue necesaria la creación de grandes bases de datos que
pudieran recolectar los resultados de los distintos centros y distribuirlos en tiempo real; pero también era necesario el
desarrollo de programas informáticos que fueran capaces de analizar tal cantidad y complejidad de datos.
326
El PGH ha sido un proyecto de investigación de cooperación internacional, a pesar de que en un primer momento
fue impulsado desde el Departamento de Energía de EE. UU., que en 1986 lideró la Iniciativa del Genoma Humano. En
1988 se unieron a esta iniciativa los National Institutes of Health (NIH) de EE. UU. para crear la Office for Human
Genome Research y más tarde el National Human Genome Research Institute (NHGRI). De manera casi simultánea,
Reino Unido y Francia comenzaron a desarrollar sus propios proyectos Genoma, que fueron seguidos rápidamente
por Alemania y Japón. Para coordinar la labor de todos los centros implicados se creó la Human Genome Organization
(HUGO). Finalmente, el International Human Genome Sequencing Consortium quedó integrado por 20 centros. Doce de
estos centros estaban situados en EE. UU., tres en Alemania, dos en Japón y uno en el Reino Unido, Francia y China.
En total, EE. UU. obtuvo casi la mitad de la secuencia, un tercio se obtuvo en el Reino Unido en un solo centro (el
Wellcome Trust Sanger Institute), mientras que en Japón se obtuvo un 10%. Francia, Alemania y China contribuyeron
con el 2,5, el 1,5 y el 1%, respectivamente.
327
Replicación del ADN genómico
La replicación, o copia del material genético, en una célula eucariota se lleva a cabo durante la interfase, período
comprendido entre dos divisiones celulares consecutivas. La interfase se subdivide a su vez en tres fases, G1 (gap 1), S
(síntesis) y G2 (gap 2). Durante las tres hay una intensa actividad metabólica, pero es en la fase S donde tiene lugar la
duplicación de los componentes celulares, incluida la cromatina. Hacia el final de la fase G2, el volumen celular
prácticamente se multiplica por dos y la célula es capaz de entrar en división. El ciclo celular y su control se explican
en detalle en el capítulo 14.
Una vez duplicado, el nuevo ADN formado debe ser capaz de empaquetarse en los distintos niveles señalados
anteriormente. Por ello, la replicación debe ser un proceso íntimamente ligado a la síntesis de las histonas, cuyo
número prácticamente se duplica en poco tiempo. Durante la replicación, el empaquetamiento de la molécula que está
siendo copiada se altera muy poco, ya que únicamente quedan afectados de manera simultánea unos pocos
nucleosomas y el reensamblaje de la cromatina se produce prácticamente de manera simultánea a la copia. Además, es
importante mantener la memoria acerca del estado funcional de las distintas partes de la cromatina, como las
modificaciones químicas de las histonas que se han señalado anteriormente.
El proceso de replicación es esencial desde el punto de vista biológico y debe realizarse con precisión (para
conservar la información genética transmitida entre células y organismos), pero también con una cierta permisividad
(que permita su variación y la creación de formas nuevas para que actúe la evolución). En la especie humana, donde el
genoma nuclear haploide tiene unos 3.000 millones de nucleótidos, un error de 1 entre un millón provocaría que en
cada ciclo de replicación surgieran 3.000 errores, algo inaceptable.
La replicación del ADN, como otros procesos en los cuales están implicados los ácidos nucleicos, está íntimamente
ligada a la complementariedad de las bases nitrogenadas. En este sentido, en la publicación donde se proponía el
modelo de la doble hélice para la estructura del ADN, Watson y Crick ya lo sugirieron: «[…] No se nos escapa que el
emparejamiento específico que postulamos sugiere por sí mismo un posible mecanismo de copia para el material
genético…» .
1
En 1958 Mathew Meselson y Franklin Stahl propusieron el modelo de replicación semiconservativa en procariotas,
que se comprobó que era universal y aplicable también a eucariotas. Este modelo llevó a desechar los modelos de
replicación conservativa y dispersiva y consistía básicamente en que, conforme la doble hélice se desenrollaba (como
si fuera una cremallera), cada nucleótido a lo largo de las dos hebras tendría afinidad por su nucleótido
complementario. Si a lo largo de las dos hebras los nucleótidos se unieran covalentemente entre sí, el resultado sería la
producción de dos dobles cadenas idénticas. Cada una de ellas estaría formada por una hebra vieja y otra de nueva
síntesis. En el modelo conservativo la réplica sería semejante pero, al final, una de las dobles hélices estaría formada
por la reasociación de las dos hebras viejas y la otra por la asociación de las dos hebras nuevas. El modelo dispersivo
328
es más complicado y supondría que cada una de las hebras estaría formada por segmentos nuevos y viejos, lo que
implicaría su corte en algunas de las etapas del proceso (fig. 7-19).
FIGURA 7-19 Modelos de replicación del ADN. Se ha demostrado que el modelo correcto es el de replicación semiconservativa.
(Ilustración de: I. Baraibar.)
La replicación debe empezar en determinados puntos u orígenes de replicación. En el caso de procariotas y en
genomas circulares hay uno o muy pocos orígenes de este tipo. Sin embargo, en organismos más complejos y con
genomas muy grandes y fragmentados en múltiples segmentos (como los eucariotas), los orígenes de replicación
deben ser cientos o miles para que el proceso tenga lugar en un período de tiempo razonable. La replicación comienza
en cada uno de estos orígenes aunque no de manera simultánea.
En cada origen de replicación se forma lo que se conoce como burbuja de replicación. Unas enzimas helicasas se
encargan de abrir la doble hélice y permiten la unión de las ADN polimerasas en un proceso muy regulado (ya que
cada origen solo puede servir como tal una vez por cada ciclo de replicación) por complejos proteicos como el ORC
(origin recognition complex). La apertura de la doble hélice y la formación de la burbuja de replicación hacen que, en los
genomas circulares (procariotas), se genere una tensión en ambos extremos de esta por superenrollamiento. Las
topoisomerasas de ADN se encargan de relajar esta tensión. Por cada burbuja de replicación van a formarse dos
horquillas de replicación, una a cada lado, que se irán abriendo en direcciones contrarias y en las cuales se producen
los mismos hechos, por lo que solo nos fijaremos en lo que ocurre en uno de los lados.
Las burbujas de replicación son estructuras estabilizadas por diversas proteínas de unión a ADN monocatenario
(SSBP, del inglés single-stranded binding proteins), como la RPA (replication protein A). Posteriormente se produce la
unión (en cada horquilla o lado) de una primasa o ARN polimerasa ADN dependiente, que sintetiza un pequeño
fragmento de ARN complementario a la secuencia de ese punto de inicio y que servirá de cebador (primer) necesario
para la acción de la ADN polimerasa. Existen varios tipos de ADN polimerasas tanto en procariotas como en
eucariotas, cada una de ellas con distintas funciones, pero en general todas ellas presentan una actividad 3’ →
5’exonucleasa que permite la corrección de los errores del proceso. Ninguna de las ADN polimerasas de procariotas o
eucariotas son capaces de comenzar la síntesis de novo de una cadena de ADN, sino que solo son capaces de elongar
cadenas de ácido nucleico (en este caso son capaces de elongar en forma de ADN el pequeño fragmento de ARN
329
sintetizado por la primasa). El cebador tiene entre 5 y 15 nucleótidos de longitud en procariotas. En eucariotas la
actividad primasa se encuentra en una de las subunidades de la ADN polimerasa α, que sintetizará un ADN iniciador
compuesto por unos 10 nucleótidos de ARN y un fragmento de ADN de unos 20 a 30 nucleótidos.
La reacción propia de síntesis o elongación de la cadena de cebador tiene lugar siempre en dirección 5’ a 3’; esto es,
el nuevo desoxinucleótido se añade al extremo 3’ de la hebra en crecimiento (donde radica el grupo OH libre del
anterior) por el grupo fosfato unido a su carbono en 5’. De esta manera se forma un enlace fosfodiéster con liberación
de dos grupos fosfato del desoxinucleótido (dNTP).
Ambas hebras son copiadas de manera simultánea en cada uno de los lados de la burbuja de replicación. Sin
embargo, debemos recordar en este punto la naturaleza antiparalela de ambas. Así, la hebra que se encuentra en
a→hebra
5’seráconductora,
cop iad a en líder
d irección
o guía
5’→
(leading
3’. Esta
dirección 3’
strand) y su síntesis se realiza de manera continua. Sin embargo, la otra hebra molde se encuentra en sentido 5’
por lo que debería ser copiada en dirección 3’
→3
→
ión,5’por
. Laslopolim
que, para
erasaslano s
síntesis de la hebra complementaria a esta, se sintetizan varios cebadores a pequeñas distancias que se elongan cada
uno de ellos en dirección 5’
→ 3’. Esto resu lta en
semidiscontinua
en dirección
u na síntesis
3’
→ 5’d e es
denominada hebra retrasada (lagging strand). Los fragmentos resultantes de la síntesis semidiscontinua de la hebra
retrasada se denominan fragmentos de Okazaki y son de menor tamaño en eucariotas (100-150 nucleótidos) que en
procariotas (1.000-2.000 nucleótidos). Cada hebra líder necesita un solo cebador, pero en la hebra retrasada se requiere
un cebador nuevo por cada fragmento de Okazaki. Esto supone un total de cientos o miles en el caso de eucariotas, ya
que una horquilla de replicación puede participar en la replicación de millones de pares de bases. Todo el proceso en
procariotas queda esquematizado en la figura 7-20.
FIGURA 7-20 Proceso de replicación en procariotas. Para simplificar el esquema (por mayor claridad), se han dibujado separadas las
ADN polimerasas III que van replicando tanto la hebra conductora como la retrasada. En realidad, las dos unidades de ADN polimerasa
III están interconectadas entre sí (formando una estructura dimérica), por lo que actúan juntas en el proceso de replicación del ADN.
(Ilustración de: I. Baraibar.)
330
El avance de la horquilla de replicación es en una única dirección, por lo que se propone que, para la síntesis
continua y semidiscontinua de ambas hebras de manera simultánea, es necesaria la formación de un bucle de esta
última sobre el complejo enzimático encargado de la síntesis. La síntesis principal de ambas hebras la realiza la ADN
polimerasa III en el caso de procariotas y la ADN polimerasa δ en el caso de eucariotas. Una vez finalizada esta,
deben eliminarse los segmentos de ARN de los cebadores, rellenar los huecos dejados (por la ADN polimerasa I en
procariotas y la ADN polimerasa δ en eucariotas) y unir los diversos fragmentos entre sí por medio de ADN ligasa.
El hecho de que para iniciar toda síntesis de ADN sea necesario un cebador de ARN crea un problema importante
en la replicación de los extremos de las moléculas de ADN lineales, como el caso de nuestros cromosomas, a
diferencia de lo que ocurre en el material genético de procariotas y algunos virus (fig. 7-21). Una vez eliminado el
cebador de ARN situado en el extremo 5’ de la cadena retrasada surge un problema importante. De manera normal, el
hueco generado sería rellenado por una ADN polimerasa que añadiría un nuevo nucleótido al OH terminal en 3’. Sin
embargo, en el extremo del cromosoma no existe esa posibilidad. Esto supone que, en cada ronda de replicación, cada
cromosoma o cadena lineal de ADN se acortaría en una longitud igual a la del cebador de ARN, lo que sería letal en
las células que se dividen un gran número de veces.
FIGURA 7-21 El problema de la replicación en los extremos. (Ilustración de: I. Baraibar.)
Para evitar esta situación, los extremos de los cromosomas eucariotas (los telómeros) presentan una estructura
especial. Los telómeros están formados por la repetición múltiple de una pequeña secuencia en los extremos 3’ de una
de las hebras de la doble hélice que hace que esta sea algo más larga que la hebra antiparalela. En humanos, esta
repetición es del hexanucleótido 5’-TTAGGG-3’. La telomerasa es la enzima encargada de mantener estas
repeticiones, y su actividad permite evitar el proceso de acortamiento progresivo de los extremos de los cromosomas.
Esta enzima es una ribonucleoproteína en cuya estructura molecular hay un pequeño fragmento de ARN que sirve de
guía y molde para la síntesis de estas repeticiones.
Las secuencias de los telómeros están bastante conservadas en la evolución, lo que refleja una función muy crítica.
De hecho, el acortamiento de los telómeros se ha asociado con los procesos de envejecimiento celular. En la mayoría
de las células somáticas, la telomerasa presenta una actividad muy baja o inexistente, haciendo que en cada división
331
celular los cromosomas se acorten, hasta llegar a un límite a partir del cual la célula pierde su capacidad de división.
Esto hace que el acortamiento de los cromosomas sea similar a un reloj biológico que controla el número de divisiones
hasta que acontece la muerte celular. Se ha observado que en determinadas células neoplásicas la actividad telomerasa
es mayor, lo que haría posible su inmortalización. Esto abre esperanzas para pensar en esta enzima como una posible
diana terapéutica antitumoral o frente a procesos de envejecimiento.
332
Estabilidad y reordenamiento del ADN genómico
Normalmente, se tiene la visión del genoma como algo estático; no en vano tiene que servir de nexo de unión entre
descendientes y progenitores. Sin embargo, la molécula de ADN es una molécula química muy flexible que permite la
existencia de variación en los distintos nucleótidos. Estos cambios pueden suceder de manera lenta, base de la
evolución y de la generación de nuevas especies, pero también pueden suceder de manera rápida dentro incluso de la
vida de un organismo.
Algunos de los cambios que puede sufrir el genoma ocurren a nivel de un único nucleótido, en lo que se conoce
como mutaciones puntuales. Estos cambios no tienen por qué ser perjudiciales, dependiendo del nucleótido que esté
afectado. De hecho, se calcula que en el genoma humano hay un cambio de este tipo cada 500-1.000 nucleótidos,
dando lugar a los denominados SNP (single nucleotide polymorphism, o polimorfismos de un solo nucléotido). Sin
embargo, otros son el resultado de mecanismos que afectan a segmentos importantes.
Uno de estos mecanismos es la duplicación de ciertas regiones del genoma. Este mecanismo es muy importante
desde el punto de vista evolutivo, ya que las nuevas copias pueden evolucionar como genes nuevos que posean
funciones diversas, como propuso Susumo Ohno en 1971. Este puede ser el caso de los genes de las globinas. En el
genoma existen también elementos genéticos transponibles o transposones (v. el apartado «Complejidad del ADN
humano. Tipos de secuencias en el ADN»), que son segmentos que pueden moverse por el genoma insertándose en
diversas posiciones de uno o varios cromosomas distintos. A pesar de que fueron descritos hace más de 50 años, su
naturaleza tardó en ser aceptada por la comunidad científica. Este tipo de segmentos existen en múltiples organismos,
desde bacterias hasta humanos (en los que, como hemos visto en el apartado ya mencionado anteriormente hay
millones de copias y ocupan una parte importante del genoma). Algunas de estas copias han mutado a lo largo de la
evolución, de tal manera que han perdido la capacidad de moverse, pero otras no. Su movimiento a lo largo del
genoma puede interrumpir genes y generar daños en los cromosomas por roturas de la doble cadena, causando
alteraciones variables. Se han descrito casos de hemofilia causados por la inserción de transposones en genes
codificantes de proteínas relacionadas con la coagulación, y se calcula que una de cada 500 mutaciones causantes de
enfermedad puede ser consecuencia de la inserción de algún elemento transponible. Estos transposones pueden
moverse tanto por escisión de su lugar original y posterior inserción en otro lugar del genoma (en un mecanismo de
«corte e inserción») como, en el caso de los retrotransposones, mediante la creación de una copia a ARN intermediario
que, tras su nueva copia a ADN (por una retrotranscriptasa o transcriptasa reversa), se insertará en el genoma (en un
mecanismo de «copia e inserción»).
Hay diversas opiniones sobre el papel real de los elementos transponibles en el genoma, dada su frecuencia.
Algunos investigadores los consideran simples parásitos genéticos sin una función beneficiosa, cuya única misión
sería replicarse y propagarse, formando parte de lo que se conoce como ADN «basura». Sin embargo, otras opiniones
333
les atribuyen un importante papel evolutivo que puede estar implicado en la formación de nuevos genes, la
especiación e incluso en la defensa frente a enfermedades infecciosas.
334
Recombinación homóloga
Como se verá en el capítulo 15, durante la meiosis se produce un intercambio de material genético entre los diferentes
cromosomas homólogos. Este proceso es muy importante, ya que hace que cada uno de los organismos originados por
medio de la reproducción sexual sea genéticamente único, al tener una combinación de alelos difícilmente repetible.
Cada uno de los nuevos cromosomas que se originan en la meiosis es una combinación de material genético del
cromosoma paterno y del cromosoma materno de la célula originaria, como consecuencia del intercambio de
segmentos de ADN entre regiones homólogas o recombinación homóloga.
El primer paso para que se pueda producir este intercambio será la alineación de ambas moléculas en sus regiones
homólogas. Estas regiones corresponden a los mismos genes y loci, aunque su secuencia no es absolutamente idéntica
(existen diversos alelos o formas en la población). Esta alineación es facilitada por la formación del complejo
sinaptonémico (una estructura proteica) que mantiene unidos los cromosomas homólogos desde la profase I de la
meiosis.
Los primeros modelos que explicaban este intercambio de material genético desde el punto de vista molecular
surgieron entre 1960 y 1970 y proponían que las dos dobles hélices alineadas (correspondientes cada una de ellas a
una de las cromátidas de ambos cromosomas homólogos) sufrían un corte en la misma posición en una de las dos
hebras que componen cada una. Ambas hebras de ADN podían entonces intercambiarse libremente y fusionarse con
su homóloga (fig. 7-22) dando lugar a una estructura entrecruzada. La migración hacia cualquiera de los lados de este
entrecruzamiento formaría moléculas heterodúplex o híbridas (que no emparejan completamente, dado que ambas
moléculas no presentan una secuencia totalmente idéntica). Esto origina una estructura cruciforme dinámica o
estructura de Holliday (por ser el primero que la propuso) cuya rotación y posterior corte dará lugar a la existencia o
no de recombinación o intercambio real de parte de las cromátidas parentales, en función de en qué dirección se
produzca este corte. Así, se puede producir el intercambio de un segmento de una única hebra (entrecruzamiento sin
recombinación) o el intercambio de un segmento completo de la molécula bicatenaria (entrecruzamiento con
recombinación).
335
FIGURA 7-22 Modelo de Holliday y Whitehouse de recombinación homóloga. En la figura se muestran dos moléculas homólogas. Las
cadenas antiparalelas están indicadas por letras mayúsculas y minúsculas. (a) A, a, B y b son distintos alelos para los genes A y B. (b)
En cada una de las dobles hélices se rompe una de las hebras y esta invade la otra doble hélice (c). En (d) y (e) se observa la
formación de enlaces covalentes entrecruzando las dos moléculas hasta desplazarse el punto de intersección (f). En (g), (h) e (i) se
muestra la rotación de un segmento de las dos dobles hélices entrecruzadas hasta los segundos cortes alternativos (j-l, arriba o abajo).
(Ilustración de: I. Baraibar.)
Sin embargo, es bastante improbable que para iniciar este proceso ambas moléculas homólogas de ADN sufran un
corte en exactamente la misma posición. Así, Meselson y Radding propusieron otro modelo de generación de las
moléculas heterodúplex por el cual sería suficiente que solo una de las dos hebras sufriera este corte. El extremo libre
generado podría ser capaz de invadir la molécula homóloga, dando lugar a la estructura de Holliday.
Actualmente, diversos estudios han mostrado que, en realidad, la recombinación se inicia mediante la aparición de
una rotura completa de una de las dos dobles hélices homólogas con generación de una rotura bicatenaria (DSB, del
inglés double-strand break). Este modelo además explicaría el fenómeno de conversión génica observado en hongos,
levaduras y otros eucariotas, y por el cual uno de los alelos parece que se convierte en otro tras la recombinación
meiótica. Se ha comprobado cómo este tipo de roturas se producen de manera más o menos frecuente en la célula,
pero en la meiosis su tasa de aparición es entre 100 y 1.000 veces superior.
De acuerdo a esto, la recombinación se iniciaría no con un corte en una de las dos cadenas polinucleótidas de una
de las dos dobles hélices implicadas, sino con un corte completo de una de las dos moléculas de ADN implicadas.
Posteriormente se produciría un acortamiento de una de las dos cadenas polinucleótidas en ambos trozos dando lugar
a extremos protuberantes en 3’. Una de esas cadenas sería entonces capaz de invadir la molécula de ADN homóloga
de manera semejante al modelo de Meselson-Radding, emparejándose con la cadena complementaria antiparalela y se
extendería (utilizando la anterior como molde) por medio de una ADN polimerasa (fig. 7-23). Esto formaría una
estructura semejante a la propuesta por Holliday, cuyo entrecruzamiento iría migrando conforme se produjera esta
síntesis. La otra molécula con extremos protuberantes también sufre esta síntesis, tomando como molde la cadena
polinucleótida desplazada por la anterior.
336
FIGURA 7-23 Modelo de recombinación homóloga a través de la creación de roturas bicatenarias. (Ilustración de: I. Baraibar.)
Es importante tener en cuenta que, en este modelo, la extensión de las cadenas polinucleótidas de la molécula rota
que ha iniciado el proceso se realiza tomando como molde las regiones equivalentes de la doble cadena no cortada.
Así, los segmentos de las cadenas polinucleótidas eliminadas tras el corte para la generación de los extremos 3’
protuberantes han sido sustituidos por copias de la molécula de ADN homóloga no cortada, explicando el proceso de
conversión génica. Tras la ligación de las cadenas polinucleótidas rotas, el resultado es la formación de dos
estructuras de Holliday cuya resolución conjunta tendrá diversas consecuencias. Si ambas estructuras se resuelven en
el mismo plano, no se producirá recombinación o intercambio de segmentos completos de las dobles hélices. Sin
embargo, si se resuelven en planos distintos, el resultado será la aparición de moléculas de ADN en las cuales existe
un fragmento completo de la molécula homóloga, esto es, recombinación.
337
Mutación y reparación del ADN genómico
Tradicionalmente se considera a una mutación como un cambio de la secuencia de nucleótidos en una región
determinada del genoma (mutaciones génicas), aunque también las aberraciones cromosómicas pueden considerarse
mutaciones cromosómicas. En realidad, la mutación es un fallo en la fidelidad del almacenamiento de la información,
ya que hay un cambio de la información guardada. La mutación puede ocurrir de manera espontánea o inducida por
diversos factores externos y puede transmitirse a la descendencia o no, dependiendo del momento del desarrollo y el
tipo celular que la sufra.
Aunque la mutación se asocia rápidamente a algo perjudicial (a enfermedad) es la base de la evolución y de la
variabilidad interindividual. Además, gran parte de nuestro conocimiento acerca de la función de determinados
productos génicos se ha conseguido a través de la existencia de mutaciones. Sabemos qué hacen porque vemos lo que
falta o está alterado cuando esos genes están mutados. Si la mutación tiene un efecto pernicioso tenderá a eliminarse
de la población mediante la selección natural a lo largo de sucesivas generaciones. Si tiene un efecto ventajoso, podrá
alcanzar una frecuencia del 100% en la población (se podrá fijar). Si es neutra, su permanencia en la población será un
proceso de puro azar. Cuando una mutación neutral alcanza una frecuencia mayor al 1% del conjunto de alelos
presentes en la población, se habla de polimorfismo. Esto indica que en la población habría múltiples formas (alelos)
de ese gen.
Existen varias clasificaciones de las mutaciones dependiendo de sus efectos sobre la secuencia de ADN, sobre el gen
de manera global, sobre las células a las que afecta, sobre el fenotipo del organismo y, finalmente, también se pueden
clasificar según su origen. Así, teniendo en cuenta la secuencia de ADN, las mutaciones pueden ser sustituciones o
cambios de un nucleótido por otro (denominándose transiciones cuando el cambio es de una purina por purina o
pirimidina por pirimidina, o transversiones cuando el cambio es de purina por pirimidina o viceversa), inserciones
de uno o varios nucleótidos, deleciones de uno o varios nucleótidos o inversiones, cuando un determinado
fragmento cambia 180° de orientación. Teniendo en cuenta los efectos sobre el gen (o sobre la proteína que codifica),
las mutaciones pueden ser silenciosas o sinónimas (sense, en inglés), cuando no provocan cambios en el aminoácido
codificado, con cambio de sentido (missense, en inglés), cuando sí provocan un cambio en el aminoácido codificado
(que podría ser conservadora o no dependiendo de si el aminoácido sustituido tiene propiedades fisicoquímicas
semejantes o no) o sin sentido (nonsense, en inglés), cuando dan lugar a un codón de parada que provoca la
terminación prematura de la traducción dando lugar a una proteína truncada. Este último efecto también puede ser el
inverso si la mutación convierte un codón de parada en un codón codificante que provocaría la terminación retrasada
de la traducción. Por último, las inserciones y deleciones pueden desencadenar mutaciones con cambio de fase
(frameshift, en inglés), en las cuales se produce un corrimiento del marco de lectura.
Según las células a las que afecta, las mutaciones pueden ser somáticas o germinales. Las mutaciones somáticas
afectan a determinadas células de un organismo, por lo que, salvo que estas den lugar a los gametos, no se transmiten
338
a los descendientes (no son heredables). Sin embargo, sí poseerán la mutación las células que provienen de ellas por
mitosis. Cuanto más precozmente se produzca la mutación en el desarrollo, mayor será el número de células del
organismo que tendrá ese cambio. Por el contrario, las mutaciones germinales (o de la línea germinal) se producen en
células que producirán gametos. Esto hará que estas mutaciones sí puedan transmitirse a la descendencia, dando
lugar a organismos que tendrán dicha mutación en todas sus células.
Teniendo en cuenta los efectos fenotípicos sobre el organismo, tendremos que las mutaciones letales son aquellas
que provocan la muerte prematura del organismo y las mutaciones condicionales son aquellas cuyos efectos
únicamente pueden observarse en ciertas condiciones. Por otro lado, las mutaciones con pérdida de función
producen la ausencia completa o parcial de la función normal del producto del gen, mientras que las mutaciones con
ganancia de función dan lugar a una activación constitutiva de la proteína, a la aparición de características nuevas o a
la funcionalidad del producto génico en tejidos y momentos inadecuados.
Las mutaciones se deben a factores internos del propio organismo o a causas externas. Las mutaciones espontáneas
surgen de manera natural sin que haya factores físico-químicos que las condicionen, mientras que las mutaciones
inducidas son causadas por factores físicos o químicos externos. Así, existen tres causas principales de la aparición de
las mutaciones. Por un lado, durante la replicación se pueden incorporar a la cadena naciente nucleótidos erróneos. En
principio, las polimerasas tienen capacidad correctora y estos errores se presentan en frecuencias bajas, entre 10 a 10
–9
–11
mutaciones por nucleótido incorporado en cada división celular en el hombre. Por otro lado, existen multitud de
compuestos químicos y algunos agentes físicos (como las radiaciones) que son capaces de aumentar
considerablemente la frecuencia de aparición de estos cambios.
Para mantener en la medida de lo posible la integridad y fidelidad en la transmisión de información existen
diversos sistemas de reparación que minimizan estos cambios. Podemos diferenciar distintas vías de reparación del
ADN que comparten ciertas características. Por un lado, la mayoría de ellas necesitan la presencia de las dos cadenas
de nucleótidos, ya que el reemplazamiento de uno de ellos requiere una cadena molde que indique la secuencia
correcta. Además, estas vías son, en muchos casos, redundantes. Esto significa que algunos de los daños que puede
sufrir el ADN pueden ser corregidos por más de una vía, lo que asegura su reparación final. Además de las distintas
vías de reparación, existen también sistemas de detoxificación que se encargan de eliminar moléculas que pueden
dañar el ADN, antes de que esto ocurra.
Los sistemas más simples de reparación son los que se encargan de revertir directamente la lesión, como ciertas
enzimas desmetilantes como la O -alquilguanina alquitransferasa (metilguanina metiltransferasa, MGMT) o ciertas
6
fotoliasas de procariotas y algunos eucariotas, que se encargan de reparar los dímeros de pirimidina formados por la
luz ultravioleta.
Las vías más complejas se clasifican en tres tipos principales:
339
1. Las que se encargan de reparar desemparejamientos entre nucleótidos (reparación de bases desapareadas o
mismatch repair).
2. Las que lo hacen a través de una escisión de bases nitrogenadas (BER, del inglés base escision repair) o escisión de
nucleótidos (NER, del inglés nucleotide escision repair).
3. Las que reparan roturas bicatenarias o DSB.
Los desemparejamientos entre nucleótidos se pueden originar por varios mecanismos, como la tautomería de las
bases nitrogenadas (en la cual la forma infrecuente imina de la C empareja con la A, o la forma infrecuente enol de la
T empareja con la G), los errores inherentes a la actividad polimerasa, las mutaciones de inserción o deleción por
deslizamiento de cadena o la desaminación espontánea (p. ej., las citosinas metiladas en las islas CpG se desaminan a
timina). Estas alteraciones se corrigen por la vía de reparación de bases desapareadas, formada por varias proteínas
que reconocen la formación de los bucles originados en la molécula y que cortan la sección distorsionada de la cadena
recién sintetizada. Actúan facilitando su rellenado con nucleótidos nuevos que son añadidos por una polimerasa que
utiliza la cadena original como molde. Para ello, es importante que el sistema reconozca de manera efectiva cuál es la
cadena vieja correcta y cuál es la nueva donde se ha producido el error. En E. coli esto se realiza mediante el retardo en
la metilación de secuencias específicas tras la síntesis. La cadena vieja estará metilada mientras que la nueva no.
La presencia de bases nitrogenadas anormales, consecuencia generalmente de agentes mutágenos y radiaciones, es
reparada básicamente a través de las reparaciones por escisión de bases y por escisión de nucleótidos. La reparación
por escisión de bases (fig. 7-24) es un proceso de corrección de los daños sufridos en las bases nitrogenadas por
agentes químicos que las alteran, o porque han sido hidrolizadas (se calcula que el genoma humano sufre una
hidrólisis lenta de unas 10.000 purinas al día que generan los denominados «sitios apurínicos»). En este sistema
primero hay un reconocimiento de la base alterada por ADN-glucosilasa específicas a los distintos tipos de daño.
Esto crea sitios AP (apurínicos o apirimidínicos) en los que actúa una AP endonucleasa, que elimina el azúcar dañado
creando una distorsión estructural. Posteriormente el hueco es rellenado por una ADN polimerasa (I en procariotas y
β en eucariotas). Una ADN ligasa sellará el último enlace, restaurándose así la secuencia intacta.
340
FIGURA 7-24 Proceso de reparación del ADN mediante el mecanismo de escisión de bases. (Ilustración de: I. Baraibar.)
La reparación por escisión de nucleótidos es un proceso de corrección de daños más generales que distorsionan la
estructura en doble hélice (como los dímeros de pirimidina). Este proceso es muy importante, ya que puede reparar
muchos tipos de daños diferentes. Primero, un complejo enzimático examina al ADN en busca de distorsiones
estructurales. Cuando se encuentra una, se separan las dos cadenas de la región dañada para posteriormente cortar el
esqueleto azúcar-fosfato de la cadena dañada a ambos lados de la lesión. Uno de los cortes se hace entre tres y nueve
nucleótidos en dirección 3’ del daño y el otro entre 16 y 25 nucleótidos en dirección 5’. Como en el caso anterior,
posteriormente, la ADN polimerasa rellena el hueco dejado y la ADN ligasa sella el último enlace. Se han asociado
mutaciones en varias de las proteínas relacionadas con esta vía de reparación en el síndrome de Cockayne o el
Xeroderma pigmentosum, donde los pacientes presentan fotosensibilidad e inestabilidad cromosómica y aumento del
riesgo de desarrollar cáncer de piel (v. capítulo 16).
Las roturas bicatenarias de ADN (DSB, v. el apartado «Recombinación homóloga») son roturas necesarias para los
procesos de recombinación genética en la meiosis y para la reorganización V(D)J de los genes de las inmunoglobulinas
y de los receptores de células T. También aparecen durante la replicación y pueden ser causadas por radiaciones
ionizantes y metabolitos celulares. Estas roturas se reparan por dos mecanismos: a) por recombinación homóloga, y b)
por fusión no homóloga de extremos.
El mecanismo de recombinación homóloga ya ha sido tratado en el apartado «Recombinación homóloga». La
fusión no homóloga de extremos (NHEJ, del inglés non-homologous end joining) tiene un mecanismo similar pero sin
341
recombinación, ya que en este caso no existe una doble cadena homóloga, sino que simplemente se fusionan los
extremos libres que habrían sido previamente procesados por una nucleasa. Este es el mecanismo responsable de la
reorganización de los segmentos V(D)J de los genes de las inmunoglobulinas en linfocitos y parece que en estas
células es un mecanismo de reparación muy importante. Mutaciones en una de las proteínas responsables de este
proceso provocan la inmunodeficiencia combinada severa (SCID, del inglés severe combined immunodeficiency),
también conocida como el síndrome del niño burbuja, al ser los enfermos extremadamente vulnerables a infecciones,
por tener una forma muy severa de inmunodeficiencia que hace que deban vivir en ambientes estériles.
Cuando una determinada región del genoma ha sufrido daños muy considerables que no pueden ser reparados por
las vías anteriormente señaladas, la célula puede entrar en un proceso de muerte programada (apoptosis, v. capítulo
15) o se puede intentar replicar esa región, aun cuando el resultado sean moléculas de ADN mutadas. Organismos
como E. coli eligen la segunda opción, poniendo en marcha mecanismos de emergencia que evitan las zonas muy
dañadas. Uno de estos mecanismos es la reparación SOS. Mediante este mecanismo se crea un complejo proteico que
es capaz de hacer que la polimerasa III (en procariotas) copie la zona dañada del genoma, incluso cuando esa copia
contenga gran cantidad de errores. Esta es una manera de supervivencia bacteriana bajo condiciones adversas, aunque
el precio es una elevada tasa de mutación. Este mecanismo no evita las mutaciones, simplemente permite la
replicación de regiones muy dañadas. En eucariotas parece que también hay polimerasas capaces de saltarse las
lesiones.
Lecturas recomendadas
Alabert C, Groth A. Chromatin replication and epigenome maintenance. Nat Rev Mol Cell Biol. 2012;13(3):153–167.
Alberts B. ADN replication and recombination. Nature. 2003;421(6921):431–435.
Bártová E, Krejcí J, Harnicarová A, Galiová G, Kozubek S. Histone modifications and nuclear architecture: a review. J Histochem
Cytochem. 2008;56(8):711–721.
Branco MR, Pombo A. Chromosome organization: new facts, new models. Trends Cell Biol. 2007;17(3):127–134.
Campos EI, Reinberg D. Histones: annotating chromatin. Annu Rev Genet. 2009;43:559–599.
Dupont JM. Arquitectura de la cromatina en el núcleo en interfase. Atlas Genet Cytogenet Oncol Haematol 2006. Disponible en:
http://AtlasGeneticsOncology.org/Educ/ArchitectChromatinSpID30016SS.html.
Fedorova E, Zink D. Nuclear architecture and gene regulation. Biochim Biophys Acta. 2008;1783(11):2174–2184.
Ferguson-Smith MA. Cytogenetics and the evolution of medical genetics. Genet Med. 2008;10(8):553–559.
342
International Human Genome Sequencing Consortium. Finishing the euchromatic sequence of the human genome. Nature.
2004;431(7011):931–945.
Lander ES. Initial impact of the sequencing of the human genome. Nature. 2011;470(7333):187–197.
Mattei MG, Luciani J. Heterocromatina, del cromosoma a la proteína. Atlas Genet Cytogenet Oncol Haematol 2003. Disponible en:
http://AtlasGeneticsOncology.org/Educ/HeterochromID30058SS.html.
Moss B, ed. Nucleic acid structure and function. Scitable by Nature Education. Nature. 2011. Disponible en:
http://www.nature.com/scitable/topic/nucleic-acid-structure-and-function-9.
O’Connor C, ed. Chromosomes and Cytogenetics. Scitable by Nature Education. Nature. 2011. Disponible en:
http://www.nature.com/scitable/topic/chromosomes-and-cytogenetics-7.
Online Mendelian Inheritance in Man, OMIM®. McKusick-Nathans Institute of Genetic Medicine. Baltimore, MD: Johns Hopkins
University; 2012. Disponible en: http://omim.org/.
Prak ET, Kazazian Jr HH. Mobile elements and the human genome. Nat Rev Genet. 2000;1(2):134–144.
Ridgway P, Maison C, Almouzni G. Cromatina. Atlas Genet Cytogenet Oncol Haematol 2002. Disponible en:
http://AtlasGeneticsOncology.org/Educ/CromatinaSpID30017SS.html.
Wente SR, Rout MP. The nuclear pore complex and nuclear transport. Cold Spring Harb Perspect Biol. 2010;2(10): a000562.
Actividad práctica 1
Las enfermedades que aparecen citadas en este capítulo tienen un origen genético. Algunas de ellas son heredables
(afectan a la línea germinal), mientras que otras están causadas por mutaciones somáticas en algún gen.
La base de datos Online Mendelian Inheritance in Man (OMIM ; http://omim.org) es el catálogo de genes y
®
®
enfermedades genéticas humanas más importante. Contiene información sobre todas las enfermedades conocidas de
base genética y más de 12.000 genes, siempre centrándose en la relación entre genotipo y fenotipo. Se actualiza de
manera diaria y todos los registros contienen múltiples enlaces a otras bases de datos, herramientas de análisis y
referencias bibliográficas.
Esta base de datos se comenzó a construir a comienzos de la década de los sesenta por el Dr. Victor A. McKusick
(http://en.wikipedia.org/wiki/Victor_A._McKusick) como un catálogo de caracteres mendelianos y enfermedades
denominado «MIM» (Mendelian Inheritance in Man). Entre 1966 y 1998 se publicaron 20 ediciones en libro de este
catálogo. La versión online se creó en 1985 mediante una colaboración entre la National Library of Medicine (NLM) de
EE. UU. y la William H. Welch Medical Library de la Facultad de Medicina de la Johns Hopkins University
343
(Baltimore, MD, EE. UU.). Desde 1987 está disponible en Internet y desde 1995 al verano de 2011 estuvo alojada en la
web del National Center for Biotechnology Information (NCBI). Actualmente, OMIM es responsabilidad del
McKusick-Nathans Institute of Genetic Medicine de la Facultad de Medicina de la Johns Hopkins University y, desde
julio de 2011, cuenta con su propia web independiente del NCBI (http://omim.org).
OMIM es una base de datos diseñada para su utilización por personal médico y personal relacionado con las
ciencias biomédicas; básicamente investigadores y estudiantes de estas áreas. Aunque es gratuita y abierta su consulta
al público en general, no pretende responder a criterios diagnósticos ni de otra índole personal. En su versión actual
está directamente unida al traductor de Google (parte superior de la página) por lo que permite ver los registros en el
idioma que deseemos (teniendo en cuenta que las traducciones de Google son automáticas).
Puede buscar la información sobre las enfermedades que se citan. Después conteste a las siguientes cuestiones:
1. Al buscar una de estas enfermedades encuentra uno o varios registros distintos. ¿Por qué?
2. Cada registro OMIM presenta un número precedido por un símbolo (asterisco *, número #, más +, porcentaje %,
careta ^). Estos símbolos tienen un significado. ¿Cuál es?
3. ¿Qué tipo de información puede obtener de cada una de estas enfermedades?
Actividad práctica 2
Imagine que crea en el laboratorio un fragmento de ADN que codifica para el antígeno T (Tag) y la placoglobina
(proteína del desmosoma), según el siguiente dibujo:
Dicho ADN va a generar una «proteína de fusión» que incluye tanto el antígeno T como la placoglobina. Este ADN
lo microinyecta en el núcleo de células en cultivo para hacer experimentos de localización celular. Tras un tiempo de
la microinyección, realiza la técnica de inmunofluorescencia con anticuerpos anti-antígeno T (o antiplacoglobina).
¿Dónde es más probable que encuentre el marcaje inmunofluorescente, en el núcleo, en los desmosomas, o en ambas
localizaciones por igual? Razone su respuesta.
Preguntas de autoevaluación
344
1. La envoltura nuclear es:
a. Una estructura rígida e impermeable que protege al material genético alojado en el núcleo.
b. Una estructura rígida y bastante impermeable, que únicamente permite la salida de ARN del núcleo para que se
lleve a cabo la traducción.
c. Una estructura flexible que permite el intercambio controlado de ciertas moléculas entre el citoplasma y el núcleo.
d. Una estructura flexible que permite el paso de cualquier molécula entre el citoplasma y el núcleo.
e. Una estructura flexible que únicamente permite el paso de moléculas del citoplasma hacia el núcleo.
Respuesta correcta: c.
2. Señale cuál de las siguientes afirmaciones es cierta en cuanto a la organización del núcleo en interfase en
eucariotas y la expresión génica:
a. El núcleo en interfase es una mezcla desorganizada de cromatina en la que la posición de los distintos genes no
tiene relación con su expresión.
b. El núcleo en interfase es una mezcla desorganizada de cromatina, sin embargo, la posición de los genes en él está
relacionada con su expresión.
c. El núcleo en interfase es una estructura altamente organizada en la que la posición de los genes en posiciones
cercanas a los dominios intercromosómicos es importante para su expresión.
d. El núcleo en interfase es una estructura bastante desorganizada en la que la posición de los genes en posiciones
cercanas a los dominios intercromosómicos es importante para su expresión.
e. Ninguna de las afirmaciones anteriores es cierta.
Respuesta correcta: c.
3. Indique cuál de las siguientes características no es propia de la heterocromatina humana:
a. Existen dos tipos de heterocromatina, la facultativa y la constitutiva.
b. La heterocromatina se observa más densa en interfase que la eucromatina.
c. La heterocromatina es minoritaria frente a la eucromatina en el núcleo de una célula somática humana.
d. Se cree que la heterocromatina es transcripcionalmente activa.
e. La heterocromatina se replica más tarde que la eucromatina.
Respuesta correcta: d.
4. En cuanto al componente proteico de los cromosomas humanos:
345
a. Existen dos tipos: las histonas y las proteínas no histonas.
b. Las proteínas no histonas tienen un papel exclusivamente estructural.
c. Las histonas son proteínas de carácter ácido poco conservadas en la escala evolutiva.
d. Las histonas carecen de papel estructural, su papel es solo funcional y regulador.
e. Las proteínas histonas son de ocho tipos distintos y forman un octámero.
Respuesta correcta: a.
5. En relación con el empaquetamiento del ADN para formar los cromosomas en eucariotas, señale cuál de los
siguientes conceptos es el correspondiente al «enrollamiento de la doble hélice de ADN alrededor del octámero
de histonas en una superhélice levógira»:
a. Nucleoide.
b. Nucleosoma.
c. Solenoide.
d. Estructura en «cuentas de collar».
e. Cromatina.
Respuesta correcta: b.
6. Las estructuras de los cromosomas responsables del reparto del material genético entre las células hijas en la
división celular son:
a. Los brazos q.
b. Los telómeros.
c. Los centrómeros.
d. Los dos brazos p y q.
e. Las cromátidas hermanas.
Respuesta correcta: c.
7. En la especie humana:
a. Hay 23 pares de cromosomas, de los que un par son cromosomas sexuales y el resto son autosomas.
b. Hay 22 pares de cromosomas, de los que un par son cromosomas sexuales y el resto son autosomas.
c. Hay 46 pares de cromosomas, de los que un par son cromosomas sexuales y el resto son autosomas.
346
d. Hay 44 pares de cromosomas, de los que un par son cromosomas sexuales y el resto son autosomas.
e. Ninguna de las afirmaciones anteriores es correcta.
Respuesta correcta: a.
8. Los cromosomas homólogos son:
a. Un par de cromosomas de la misma longitud y posición del centrómero, contienen los mismos loci, aunque
pueden contener distintos alelos para cada gen.
b. Un par de cromosomas de la misma longitud y posición del centrómero, contienen los mismos loci y deben tener
los mismos alelos para cada gen.
c. El conjunto de cromosomas que proviene de cada uno de los progenitores.
d. Los cromosomas sexuales por un lado y los autosomas por otro.
e. Lo mismo que las cromátidas hermanas, pero en una fase distinta del ciclo celular.
Respuesta correcta: a.
9. Las bandas que aparecen tras la tinción con diferentes compuestos químicos de los cromosomas metafásicos:
a. Permiten clasificar los cromosomas.
b. Están asociadas a diferentes características funcionales de las regiones que tiñen.
c. No son siempre las mismas, ya que dependen del estado funcional del cromosoma.
d. La a y b son ciertas.
e. La b y c son ciertas.
Respuesta correcta: d.
10. El análisis citogenético permite la observación de:
a. Alteraciones en la estructura de los cromosomas de un individuo.
b. Mutaciones en la secuencia de ADN.
c. Alteraciones en el número de cromosomas de un individuo.
d. La a y b son ciertas.
e. La a y c son ciertas.
Respuesta correcta: e.
347
11. Cuando un organismo presenta uno o varios cromosomas de más con respecto al número habitual de su especie
pero sin llegar a un juego haploide completo se dice que presenta una:
a. Poliploidía.
b. Euploidía
c. Aneuploidía
d. Triploidía.
e. Trisomía.
Respuesta correcta: c.
12. ¿Cuál es la diferencia principal entre el ADN de tipo microsatélite y el ADN minisatélite?
a. Su posición en el cromosoma.
b. Su capacidad de codificar o no para un producto.
c. El tamaño de la unidad que se repite.
d. El primero es ADN repetitivo, el segundo no.
e. Ninguna de las anteriores respuestas es correcta.
Respuesta correcta: c.
13. Los sistemas de reparación del ADN son sistemas:
a. Que previenen y reparan las mutaciones y daños al ADN y que están presentes en procariotas y eucariotas.
b. Que previenen y reparan las mutaciones y daños al ADN y que solo están presentes en procariotas, ya que los
eucariotas no los necesitan.
c. Que previenen y reparan las mutaciones y daños al ADN y que solo están presentes en eucariotas, ya que en
procariotas no importan tanto y la existencia de muchas mutaciones facilita su evolución.
d. Que previenen y reparan las mutaciones y daños al ADN del nucleoide de procariotas.
e. Que previenen y reparan las mutaciones y daños únicamente a las secuencias que forman parte de los genes y
que están presentes en procariotas y eucariotas.
Respuesta correcta: a.
348
1
Watson JD, Crick FHC. Molecular Structure of Nucleic Acids: A Structure for Deoxyribose Nucleic Acid. Nature 1953;171:737-8.
349
CAPÍTULO 8
350
El núcleo. Parte II: transcripción y maduración del
ARN y estructura del nucléolo
María S. Aymerich
Mariana García
Ángela M. Suburo
Rubén Pío
Objetivos de aprendizaje
• Conocer las etapas de síntesis y maduración del ARN.
• Entender los mecanismos de regulación de la transcripción.
• Conocer la morfología y la función del nucléolo.
• Comprender la relevancia biológica del proceso de corte y empalme de exones.
• Relacionar ciertas situaciones patológicas con el incorrecto funcionamiento de los procesos de síntesis y
maduración del ARN.
351
Introducción
Las células contienen en su genoma las instrucciones necesarias para la síntesis de las biomoléculas que determinarán
su tamaño, forma y función. Estas instrucciones están contenidas en unidades de información denominadas genes. Un
gen se define como un segmento de ADN que contiene la información necesaria para la síntesis de una molécula
biológicamente activa. Esta información está escrita en forma de secuencia de nucleótidos y mediante el proceso de
transcripción es transmitida a una molécula de ARN. En algunos casos, este ARN es el producto final del gen; en
otros muchos casos, la información contenida en la secuencia del ARN se utiliza para la síntesis de una cadena
polipeptídica, en un proceso conocido como traducción (v. capítulo 9). Este flujo de información génica, junto con la
replicación del ADN, se conoce como el dogma central de la biología molecular (fig. 8-1). En esta cadena de procesos,
el ARN ejerce de «mensajero» entre la información original (secuencia del ADN) y el producto final (secuencia de
aminoácidos de una proteína). Además, antes de la traducción, se produce la maduración del ARN, mediante la cual
se modifican algunas de sus bases, se eliminan nucleótidos y se adicionan secuencias no presentes en el ADN de
origen.
FIGURA 8-1 Los procesos asociados al flujo de la información génica, junto con el proceso de replicación del ADN, constituyen «el
dogma central de la biología molecular». Este modelo fue propuesto en 1958 por Francis Crick y explica cómo la célula es capaz de
descodificar la información contenida en los genes y sintetizar las proteínas funcionalmente activas. (Ilustración de: I. Baraibar.)
352
En este capítulo se describen las características básicas de los procesos de transcripción y maduración del ARN.
También se destaca la importancia del nucléolo como expresión morfológica del proceso de transcripción del ARN
ribosómico y se presentan ejemplos de la importancia del metabolismo del ARN, tanto en situaciones fisiológicas
como patológicas.
353
Síntesis del ARN: transcripción
Todas las células del organismo comparten un mismo genoma, en el que están codificadas todas las instrucciones para
su desarrollo, diferenciación y funcionamiento. Sin embargo, una determinada célula, en un momento concreto, solo
utiliza una pequeña fracción de los aproximadamente 25.000 genes del genoma humano. El proceso mediante el cual
la célula transforma la información de un gen en un elemento funcional se denomina expresión génica. El primer
paso en la expresión de un gen es la síntesis de una molécula de ARN. Este proceso se conoce como transcripción y
tiene lugar solo en las regiones del ADN que contienen genes. Esto contrasta con la replicación, un proceso en el que
interviene la secuencia completa del ADN. Las funciones que debe desempeñar una célula, así como las condiciones
ambientales en las que se encuentra, van a determinar qué genes se expresan en un momento dado; por ello, la
transcripción de un gen está sometida a un estricto control (fig. 8-2). Este control se lleva a cabo a través de secuencias
reguladoras, denominadas promotores, que se localizan al comienzo del gen (v. fig. 8-2).
FIGURA 8-2 A. La diferenciación celular se asocia con una transcripción selectiva de genes. Algunos de los genes del genoma se
expresan en todas las células del organismo (genes constitutivos) (gen A). Otros genes son inducibles, por lo que solamente se
expresan en determinados tipos celulares y sus concentraciones son variables (genes B-D). En algunos casos, la expresión de un gen
es específica de un único tipo celular (gen C). B. El proceso de transcripción de un gen se inicia en su región promotora, situada en el
extremo 5’ de la hebra codificante y en el extremo 3’ de la hebra molde. La región promotora permite el control de la expresión génica.
(Ilustración de: I. Baraibar.)
La ARN polimerasa es la principal enzima implicada en la transcripción. Esta enzima cataliza la síntesis de una
molécula de ARN de cadena simple a partir un gen, constituido por un segmento de ADN de cadena doble. Cada una
de las hebras del ADN cumple un papel diferente en la transcripción. La ARN polimerasa utiliza una de ellas como
molde, de tal manera que la secuencia de nucleótidos del ARN sintetizado es complementaria a la secuencia de
354
nucleótidos de la hebra molde del ADN, también conocida como hebra no codificante o antisentido (fig. 8-3). La otra
hebra del ADN se denomina hebra no molde, codificante o sentido. La secuencia de bases del transcrito de ARN es
idéntica a la secuencia de la hebra sentido (v. fig. 8-3), con la diferencia de que el ARN contiene uracilos en lugar de
timinas y grupos hidroxilo en el carbono 2’ de las pentosas. Esta última característica hace que las moléculas de ARN
se hidrolicen más fácilmente que las moléculas de ADN. Las cadenas de ARN de hebra sencilla tienden a plegarse
sobre sí mismas, dando lugar a una diversidad estructural mucho mayor que la observada en el ADN y, por lo tanto, a
una mayor diversidad funcional. Entre las funciones desempeñadas por las moléculas de ARN destacan las
relacionadas con la transmisión de la información génica entre el ADN y las proteínas. En ella intervienen distintos
tipos de ARN, siendo los tres principales:
• ARN mensajero (ARNm): transporta la información contenida en el ADN desde el núcleo hasta los ribosomas, los
orgánulos celulares donde se produce la síntesis de las cadenas polipeptídicas (las proteínas).
• ARN ribosómico (ARNr): es el tipo de ARN más abundante. Forma parte de la estructura de los ribosomas.
• ARN de transferencia (ARNt): transporta los aminoácidos necesarios para la síntesis de las proteínas en los
ribosomas.
FIGURA 8-3 Las hebras de ADN tienen distinta función en la transcripción. La síntesis de la molécula de ARN se lleva a cabo utilizando
como molde la hebra antisentido, a partir de la cual se sintetiza su secuencia complementaria. Esto da lugar a una molécula de ARN
idéntica a la hebra codificante o sentido (con nucleótidos de uracilo en lugar de nucleótidos de timina).
Existen, además, otras muchas moléculas de ARN y complejos ARN-proteína con diversas funciones reguladoras y
catalíticas: ribonucleoproteínas heterogéneas nucleares (hnRNP, del inglés heterogeneous nuclear ribonucleoproteins),
ribonucleoproteínas pequeñas nucleares (snRNP, del inglés small nuclear ribonucleoproteins) y micro-ARN, entre otros.
La ARN polimerasa
La ARN polimerasa es la enzima responsable de la síntesis del ARN. La reacción catalizada por esta enzima es la
siguiente:
(NMP) representa una cadena de ARN con «n» nucleósidos monofosfato (NMP). La ARN polimerasa añade nuevos
n
nucleósidos trifosfato (NTP) en el extremo 3’ del polímero en formación. Los nucleótidos se incorporan como NMP,
liberándose pirofosfato (PP ).
i
355
El mecanismo molecular de la transcripción es similar al de la replicación. Sin embargo, existen importantes
diferencias entre ambos procesos, así como entre las polimerasas que intervienen en ellos (tabla 8-1).
Tabla 8-1
Similitudes y diferencias entre la
replicación y la transcripción
dNTP, desoxirribonucleósidos trifosfato; NTP,
ribonucleósidos trifosfato.
En las células eucariotas existen varias
isoenzimas de la ARN polimerasa, que difieren
entre sí en el tipo de ARN que sintetizan y en su localización nuclear (tabla 8-2). La estructura de estas enzimas es
compleja: están compuestas por numerosas subunidades que necesitan unirse a diversas proteínas, denominadas
factores de transcripción, para formar un complejo activo que permita el inicio de la transcripción.
Tabla 8-2
Tipos principales de ARN polimerasas en eucariotas
ARN polimerasa Tipos de ARN sintetizados Localización
I
ARNr 28 S, 18 S y 5.8 S
Nucléolo
II
ARNm
Nucleoplasma
III
ARNt, ARNr 5 S
Nucleoplasma
Fases de la transcripción
Al igual que en la replicación, el proceso de transcripción se puede dividir en tres fases: iniciación, elongación y
terminación.
Iniciación
El proceso de transcripción se inicia con la unión de la ARN polimerasa al promotor, una secuencia específica del gen
que se encuentra en la posición 3’ de la hebra molde y en la 5’ de la hebra codificante (v. fig. 8-2). La región promotora
se extiende desde decenas o cientos de bases antes del sitio de iniciación de la transcripción, hasta unas pocas bases
356
más allá de este punto de inicio. La secuencia del promotor de un gen va a determinar su nivel de expresión basal, así
como su regulación. Aunque los promotores son muy variados, existen secuencias consenso que se repiten
frecuentemente entre los distintos genes. Algunas de estas secuencias están presentes en un gran número de ellos,
mientras que otras son específicas de determinados grupos de genes.
En el inicio de la transcripción están implicadas diversas proteínas. Para que la ARN polimerasa se una al promotor
es necesaria la presencia de los llamados factores de transcripción basales (fig. 8-4). Estos factores van a reclutar y
situar a la ARN polimerasa en el inicio del gen. La unión ADN-factor de transcripción se consigue mediante la
interacción específica entre residuos de aminoácidos del factor de transcripción y la zona exterior de la doble hebra
del ADN. Estos factores suelen formar dímeros (homo- o heterodímeros) y la mayoría de ellos se agrupan en familias
de proteínas en función de las estructuras supersecundarias que presentan: «hélice-vuelta-hélice», «hélice-lazohélice», «cremallera de leucina» o «dedos de zinc». Además, estas proteínas tienen dominios adicionales que
interaccionan con otras proteínas, entre ellas la ARN polimerasa. Junto con los factores de transcripción basales,
actúan otros muchos factores de transcripción que regulan de manera más específica la expresión de cada gen. El
papel de estos factores en el control del inicio de la transcripción se abordará en el siguiente apartado del tema.
Cuando estos factores sitúan correctamente a la ARN polimerasa sobre el promotor, el ADN se desenrolla y la
polimerasa sufre cambios conformacionales y químicos (fosforilación) que inducen el inicio de la transcripción.
FIGURA 8-4 Formación del complejo de inicio de la transcripción sobre un gen. El factor TBP reconoce una secuencia consenso
denominada «caja TATA» (presente en un gran número de genes eucariotas) y recluta diversos factores de transcripción basales
(TFII), que a su vez reclutan a la enzima ARN polimerasa II y la sitúan en el punto de inicio de la transcripción. Los factores de
transcripción basales también modifican conformacionalmente a la enzima e inducen su fosforilación, lo que permite el inicio de la
síntesis del ARN. A fin de simplificar la imagen, se ha omitido una de las dos hebras del ADN, aunque la ARN polimerasa se une a las
dos.
Elongación
La mayor parte de los factores de transcripción basales se liberan al comienzo de la fase de elongación y son
sustituidos por los factores de elongación. El complejo de transcripción avanza en dirección 5’
→ 3’pr
topoisomerasas que van desenrollando las hebras de ADN (fig. 8-5). Durante la elongación, el grupo hidroxilo en el
extremo 3’ del ARN en formación reacciona con un fosfato del ribonucleósido trifosfato entrante, formándose un
nuevo enlace fosfodiéster. La velocidad de elongación es de aproximadamente 20-50 bases por segundo y la enzima
tiene una tasa de error relativamente alta (un nucleótido mal incorporado por cada 10 -10 nucleótidos) debido a la
4
ausencia de actividad correctora.
357
5
FIGURA 8-5 Representación esquemática de la fase de elongación de la transcripción.
Terminación
La síntesis del ARN finaliza cuando la ARN polimerasa reconoce ciertas secuencias del ADN que se sitúan en el
extremo 3’ de los genes. El mecanismo de terminación se ha estudiado intensamente en procariotas, donde se conocen
secuencias y factores que participan en la parada de la elongación y en la liberación de la maquinaria de transcripción.
Sin embargo, en eucariotas los detalles del proceso son hasta el momento poco conocidos.
Regulación de la transcripción
La capacidad de las células para diferenciarse y responder a los estímulos externos requiere de una regulación muy
precisa de la expresión génica. El conjunto de los genes expresados en una célula en un determinado momento se
conoce como transcriptoma. A diferencia del genoma, el transcriptoma es variable y dependiente del contexto celular
en el instante de su determinación. En relación con la expresión, se distinguen dos tipos de genes:
• Genes constitutivos o «domésticos» (del inglés housekeeping): son aquellos que se expresan de manera rutinaria,
ya que dan lugar a productos que se requieren para llevar a cabo funciones celulares básicas. Entre este tipo de
genes se encuentran aquellos que codifican los ARNr, los ARNt o los ARNm de proteínas esenciales (como las
proteínas ribosómicas o las histonas).
• Genes inducibles: son aquellos que solo se expresan en algunos tipos celulares o en determinadas circunstancias.
Por ejemplo, la hemoglobina se expresa específicamente en eritrocitos, o diversas citoquinas se expresan en
células del sistema inmunitario solo tras su activación.
Existen varios niveles de regulación en la expresión de un gen. En primer lugar, la compactación de la cromatina en
el núcleo limita el acceso de la maquinaria de transcripción. En una célula en interfase, la cromatina se encuentra en
dos disposiciones distintas: la heterocromatina y la eucromatina. Cada célula, al diferenciarse, genera un patrón
específico de heterocromatina y eucromatina. La heterocromatina está empaquetada tan densamente que es
transcripcionalmente inactiva. La eucromatina es una forma menos condensada que permite una actividad
transcripcional. Los genes activos se sitúan en las zonas menos compactas de la eucromatina (denominadas «regiones
358
hipersensibles», por ser más susceptibles a la acción de DNasas). El grado de compactación de la cromatina no es algo
estable, sino que está sometido a un proceso conocido como remodelación de la cromatina. Entre los agentes que
controlan la compactación de la cromatina están:
• Factores de remodelación de la cromatina: son complejos enzimáticos que relajan la cromatina desplazando a los
nucleosomas. Uno de los más conocidos es el complejo multiproteico SWI/SNF (switch/sucrose nonfermentable),
inicialmente descrito en levaduras, que es capaz de desestabilizar las interacciones entre el ADN y las histonas.
• Histona-acetiltransferasas (HAT): estas enzimas acetilan residuos de lisina en los extremos amino de las histonas.
La adición del grupo acetilo elimina la carga positiva de las cadenas laterales de las lisinas, reduciendo su
afinidad por el ADN y haciendo que la cromatina se relaje (fig. 8-6). Además, los residuos de lisina acetilados
interaccionan con otras proteínas que regulan la transcripción. Existen también histona-desacetilasas (HDAC)
que catalizan la desacetilación de histonas, favoreciendo de este modo la compactación del ADN genómico y, por
lo tanto, el silenciamiento de los genes.
FIGURA 8-6 Acetilación y desacetilación de histonas en el control de la expresión génica. La acetilación de grupos amino en ciertas
lisinas de las histonas relaja la compactación de la cromatina, lo que favorece la transcripción de los genes localizados en esta región
del genoma. HAT, histona-acetiltransferasas; HDAC, histona-desacetilasas. (Ilustración de: A. Calvo.)
La pérdida de compactación de la cromatina es solo el primer requisito para que un gen pueda ser transcrito.
Existen muchos otros elementos que controlan el destino final del producto génico (cuadro 8-1). De todos ellos, uno de
los más estrictamente regulados es la unión de la ARN polimerasa para el inicio de la síntesis del transcrito primario.
Cuadro 8-1
Puntos de control en la expresión de un gen y de su proteína
• Condensación de la cromatina.
• Síntesis del transcrito primario (ARN inmaduro).
• Modificaciones postranscripcionales del ARN inmaduro.
359
• Estabilidad del ARN.
• Síntesis proteica (traducción).
• Modificaciones postraduccionales.
• Transporte y localización de la proteína.
• Degradación de la proteína.
Las secuencias consenso de la región promotora, localizada en la porción inicial del propio gen, son reconocidas por
los factores de transcripción de la fase de iniciación, lo que determina la unión de la ARN polimerasa y el inicio de la
transcripción (v. fig. 8-4). Los genes constitutivos contienen promotores que están siempre activos en cualquier tipo
celular. En estos genes, existen secuencias consenso en la región promotora que permiten una transcripción constante,
ya que a ellas se unen factores de transcripción basales que siempre están presentes en la célula. Los genes inducibles
contienen sistemas más específicos para el control de su expresión. En la regulación de estos genes participan regiones
más o menos cercanas al promotor, que poseen la capacidad de unir factores de transcripción que controlan el
reclutamiento de la ARN polimerasa. Si los factores de transcripción facilitan este reclutamiento actuarán como
activadores de la transcripción, mientras que si dificultan la incorporación de la ARN polimerasa actuarán como
represores. La presencia de un patrón concreto de factores de transcripción, condicionada por el tipo celular y las
condiciones ambientales, determinará la expresión de un gen regulable (fig. 8-7). Algunos de estos factores regulan la
transcripción de grupos concretos de genes, permitiendo una respuesta celular coordinada (v. fig. 8-7).
FIGURA 8-7 A. Regulación de la expresión de un gen inducible a través de la unión de diversos factores de transcripción en regiones
cercanas al lugar de unión de la ARN polimerasa. Estas regiones se conocen como potenciadoras (en inglés, enhancers) y a ellas se
unen los activadores de la transcripción. En algunos casos, también existen factores represores que bloquean el inicio de la
transcripción. B. Estrategia celular para la respuesta coordinada ante un daño en el material genético mediante la inducción de la
transcripción de genes por parte del factor de transcripción p53. (Ilustración de: I. Baraibar.)
La importancia fisiológica de la regulación de la expresión génica se manifiesta en la implicación de factores de
transcripción en diversas patologías. Comentaremos brevemente su importancia en el desarrollo del cáncer. La
transformación de una célula normal en una célula cancerosa tiene lugar a través de la acumulación de alteraciones en
360
su genoma que le confieren capacidades funcionales propias de las células malignas: insensibilidad a factores
inhibidores del crecimiento, autosuficiencia en factores de crecimiento, inmortalidad, inhibición de la muerte celular
programada, capacidad angiogénica y capacidad de migrar e invadir tejidos alejados del punto de origen del tumor
(v. capítulo 16). Los genes alterados a lo largo del proceso de carcinogénesis se pueden clasificar en dos grandes
grupos: los oncogenes y los genes supresores tumorales. Los oncogenes son genes cuyo producto génico contribuye al
proceso de carcinogénesis. Los genes supresores, por el contrario, dan lugar a moléculas, principalmente proteínas,
que impiden el desarrollo tumoral. Son muchos los oncogenes y genes supresores que se han asociado al desarrollo
del cáncer. Aunque algunos oncogenes provienen de virus oncogénicos, otros muchos se originan a partir de genes
propios de la célula. Estos genes, denominados protooncogenes, sufren mutaciones o sobreexpresiones que alteran su
regulación y, por lo tanto, su patrón normal de expresión. Diversos factores de transcripción forman parte de esta
categoría de genes. Un ejemplo muy conocido es el protooncogén cMyc. Este gen da lugar a una proteína cuya función
es la de actuar como factor de transcripción para genes implicados en la proliferación celular. En casi todas las células
humanas, cMyc está silenciado, ya que únicamente las células en división expresan este factor de transcripción. Sin
embargo, se ha observado que el gen cMyc está mutado o amplificado en diversos tipos de tumores. Esto hace que
cMyc no pueda ser regulado correctamente y que los niveles de su proteína sean anormalmente altos. En esta
situación la proteína cMyc actúa como un oncogén, ya que activa de forma continua la transcripción de genes
implicados en la proliferación celular, haciendo que la célula afectada se divida de manera incontrolada.
El ejemplo opuesto lo tenemos en p53 (v. capítulos 14 y 16). La proteína p53 es un factor de transcripción que regula
la expresión de genes que inhiben el ciclo celular e inducen la muerte por apoptosis (v. fig. 8-7). Por lo tanto, p53 se
comporta como un gen supresor tumoral con capacidad para impedir el crecimiento de las células tumorales. En la
mayoría de los tumores humanos, el gen p53 se encuentra inactivado (bien por mutación o bien por pérdidas de
material cromosómico). En esta situación, la célula tumoral crece de manera descontrolada, ya que no es capaz de
iniciar la transcripción de genes relacionados con el control del ciclo celular y la apoptosis.
Otra alteración frecuentemente asociada a la aparición del cáncer es la metilación aberrante del ADN. En regiones
concretas del genoma, algunos nucleótidos contienen 5-metilcitosina como base nitrogenada. La metilación de
citosinas es quizás la modificación epigenética más frecuente en nuestro genoma. Las modificaciones epigenéticas se
definen como cambios químicos reversibles que, por lo tanto, no afectan a la secuencia original del ADN. Los cambios
epigenéticos pueden ser muy variados (acetilaciones, metilaciones, fosforilaciones, etc.) y afectan de manera
importante a la transcripción de genes. En el caso de la metilación de citosinas, la adición del grupo metilo es
catalizada por las ADN metiltransferasas. La metilación se produce en zonas ricas en dinucleótidos CG, conocidas
como islas CpG. Si la metilación de citosinas tiene lugar en la región promotora de un gen, se impide su transcripción,
debido a que la metilcitosina es reconocida por factores que reclutan histona desacetilasas y factores remodeladores
que compactan la cromatina y la inactivan transcripcionalmente. Una de las alteraciones más importantes en el cáncer
es la hipermetilación específica de determinados promotores. Los genes afectados por esta metilación pertenecen a la
361
categoría de genes supresores tumorales. A modo de ejemplo, es frecuente encontrar tumores en los cuales existe una
hipermetilación del promotor del gen de p16 (v. capítulo 14), lo que impide el inicio de su transcripción y la
consiguiente síntesis de la proteína, cuya función es la regulación del ciclo celular (fig. 8-8). En la actualidad se está
evaluando la eficacia terapéutica de inhibidores de las ADN metiltransferasas en el tratamiento del cáncer. El objetivo
es impedir la hipermetilación anormal de genes supresores, lo que permitirá nuevamente su expresión y su función
inhibidora del crecimiento tumoral. La decitabina, un análogo de la citidina, es un agente desmetilante aprobado para
el tratamiento del síndrome mielodisplásico.
FIGURA 8-8 La hipermetilación del promotor de p16 en células tumorales inhibe su transcripción. Esto, a su vez, permite a la célula
tumoral crecer de manera descontrolada, ya que la ausencia de la proteína p16 impide el bloqueo del ciclo celular. (Ilustración de: I. Baraibar.)
Inhibidores de la transcripción
Existen moléculas capaces de inhibir el proceso de transcripción. Algunas de ellas actúan de manera preferente sobre
la maquinaria transcripcional de procariotas y se usan en clínica para el tratamiento de infecciones. Por ejemplo, la
rifampicina inhibe la síntesis del ARN al unirse específicamente a una de las subunidades de la ARN polimerasa
bacteriana. La rifampicina se utiliza en el tratamiento de diversas infecciones, como por ejemplo la tuberculosis o la
lepra, causadas por bacterias del género Mycobacterium. Debido a las diferencias estructurales entre las polimerasas
procariotas y eucariotas, la rifampicina apenas tiene efectos tóxicos en el hombre. Sin embargo, otros inhibidores,
como la actinomicina D, actúan tanto sobre células procariotas como sobre células eucariotas. La actinomicina D se
intercala en el ADN e impide el proceso de elongación. El hongo Amanita phalloides ha desarrollado un mecanismo de
defensa basado en la producción de la toxina α-amanitina (fig. 8-9). La α-amanitina es un octapéptido cíclico que
inhibe a la ARN polimerasa II (y en menor medida a la III) impidiendo la elongación del ARN en eucariotas. Esta
toxina es muy dañina, ya que la actividad de la ARN polimerasa II es esencial para las células. Tras su ingestión, se
producen trastornos gastrointestinales pasajeros. Sin embargo, al cabo de los días, órganos vitales como el hígado o el
riñón no pueden reponer sus proteínas y pierden su función, causando el coma y la muerte.
362
FIGURA 8-9 Diversos hongos del genero Amanita, como A. phalloides, producen una molécula tóxica denominada α-amanitina, un
potente inhibidor de la transcripción de los ARNm en eucariotas.
363
El nucléolo: expresión morfológica del proceso de
transcripción
Estructura y función
El 80% del ARN que se sintetiza en una célula en interfase es ARN ribosómico (ARNr). Este ARN se produce
fundamentalmente en los nucléolos, estructuras nucleares complejas, altamente ordenadas y formadas a partir de
regiones de ADN en las que se transcriben múltiples copias de un ARNr inmaduro (45 S), que posteriormente será
procesado para dar lugar a los ARNr 28 S, 18 S y 5.8 S. A continuación, estos ARNr se ensamblarán con diversas
proteínas para constituir las subunidades ribosómicas. Sin embargo, la formación de los ribosomas no es la única
función del nucléolo. Esta estructura nuclear también interviene en el ensamblaje de ribonucleoproteínas (RNP) no
ribosómicas, en la edición del ARNm, en la progresión del ciclo celular y en las vías de señalización relacionadas con
el estrés celular. Entre las RNP no ribosómicas formadas en el nucléolo están, por ejemplo, la partícula de
reconocimiento de la señal (SRP), que dirige la síntesis de proteínas hacia el retículo endoplasmático rugoso (v.
capítulo 10) y la telomerasa, que cataliza el alargamiento de los telómeros en cada división celular (v. capítulo 14). Se
podría decir que el nucléolo es la expresión morfológica de la síntesis y procesamiento de RNP, tanto ribosómicas
como no ribosómicas.
Los nucléolos son visibles al microscopio óptico (fig. 8-10) y su número y tamaño suelen guardar relación con la
actividad celular. Muchas células presentan uno o dos nucléolos; sin embargo, las células inactivas no lo suelen tener,
mientras que las células que requieren una síntesis proteica elevada (embrionarias, tumorales, neuronales, etc.)
pueden tener múltiples nucléolos. Cuando las células se dividen, los nucléolos presentes en la interfase desaparecen
en la profase y reaparecen en forma de cuerpos prenucleolares en la telofase. Este comportamiento se denomina ciclo
del nucléolo.
364
FIGURA 8-10 A. Imagen de un nucléolo (flecha) en una neurona, observado al microscopio óptico. B. Imagen de microscopía
electrónica de un nucléolo (flecha). C. Imagen de microscopía electrónica donde se pueden distinguir el componente granular (GC, del
inglés granular component), el centro fibrilar (asterisco) y el componente fibrilar denso (flecha). D. Imagen a mayor aumento que
muestra las partes del nucléolo. (A y B, imágenes procedentes de: Departamento de Histología de la Universidad de Navarra; C y D, procedentes de: Hernandez-Verdun
D et al. Wiley Interdiscip Rev ARN 2010;1:415-31.)
A nivel ultraestructural, el nucléolo aparece como una estructura sin membrana, normalmente de forma esférica,
que posee zonas electrolúcidas y electrodensas (v. fig. 8-10). Las zonas más electrolúcidas corresponden a la parte
amorfa (o nucleoloplasma). Las zonas electrodensas (parte densa o nucleolonema) presentan tres compartimentos o
subdominios: el componente fibrilar denso (CFD), el centro fibrilar (CF) y el componente granular (CG). El CFD es
homogéneamente electrodenso y está compuesto por fibrillas altamente empaquetadas. El CFD se suele situar
alrededor del CF, que es algo menos electrodenso. El CG se compone de gránulos de unos 10-20 nm de diámetro,
intercalados entre los componentes fibrilares (v. más adelante fig. 8-22). Estos subdominios de la parte densa del
nucléolo reflejan distintas etapas de la biogénesis de los ribosomas. En el CF tiene lugar la transcripción del pre-ARNr
45 S, mientras que en las otras zonas se produce su maduración y la formación de las RNP. Cada nucléolo puede
contener múltiples CF rodeados por el CFD. En algunas células no se observa el CF, por lo que se piensa que en estos
casos la síntesis del pre-ARNr se realiza en el CFD. La estructura de los nucléolos, al igual que ocurría con su número
y tamaño, puede verse también condicionada por la actividad celular. En los linfocitos humanos maduros, donde la
actividad transcripcional es baja, existe un único CF. Sin embargo, tras ser estimulados, la producción de ribosomas se
acelera, el nucléolo se agranda y aparecen numerosos CF pequeños, rodeados por un CFD.
Morfológicamente también se puede observar la existencia de cromatina en disposición perinucleolar y/o
intranucleolar. Esta cromatina se denomina cromatina asociada al nucléolo y en algunas células se encuentra en la
periferia del nucléolo cubriéndolo parcialmente a modo de capuchón. Este compartimento perinucleolar aparece
habitualmente en células tumorales y se ha asociado con la iniciación o la progresión del tumor. Los dominios de
cromatina asociada al nucléolo contienen regiones cromosómicas inactivas (siendo ricos en ADN de tipo satélite) y
365
genes codificantes pertenecientes a las familias de proteínas «dedo de zinc», receptores olfatorios y defensina, entre
otros.
Regiones organizadoras de los nucléolos y transcripción del ARNr
En las células en interfase, el ADN ribosómico (ADNr) se agrupa en una zona del núcleo junto con enzimas que van a
participar en los procesos de transcripción y procesamiento del pre-ARNr 45 S, formando así el nucléolo. Los genes
ribosómicos están repetidos múltiples veces, en tándem, en regiones específicas del ADN denominadas regiones
organizadoras nucleolares (NOR, del inglés nucleolar organizer regions). En el genoma humano existen unas 400 NOR
distribuidas a lo largo de los cromosomas acrocéntricos (cromosomas 13, 14, 15, 21 y 22). Cada gen ribosómico es una
unidad de transcripción que contiene los ARNr 18 S, 5.8 S y 28 S, junto con regiones espaciadoras; todas estas
secuencias conjuntamente conforman el pre-ARNr 45 S. Las NOR se localizan en los CF de los nucléolos y contienen
proteínas fuertemente argirófilas que se pueden visualizar con tinciones de plata, por lo que a estos dominios también
se les llama Ag-NOR. Cuando las células entran en mitosis, las NOR quedan situadas en la región satélite de los
cromosomas acrocéntricos, y pueden identificarse mediante estas tinciones.
La transcripción del ARNr policistrónico está a cargo de la ARN polimerasa I (v. tabla 8-2), que se localiza en los CF
de los nucléolos junto con factores de transcripción específicos (como el upstream binding factor, UBF). En 1960, Oscar
Miller fue capaz de aislar las porciones fibrilares del nucléolo de ovocitos y observarlas al microscopio electrónico de
transmisión. Lo que se encontró fueron múltiples estructuras en forma de «árbol de Navidad», cada una de las cuales
correspondía a una unidad de transcripción del ADNr. La interpretación molecular de estas estructuras se explica en
la figura 8-11.
FIGURA 8-11 Transcripción del ADN ribosómico en forma de estructuras de «árbol de Navidad». El «tronco» del árbol corresponde al
ADNr, en el que se han unido numerosas ARN polimerasas I, cada una de las cuales está en un proceso secuencial de transcripción.
Las «ramas» corresponden al pre-ARNr 45 S en distintas fases de síntesis: cerca del inicio de la transcripción las «ramas» son más
cortas, mientras que las de mayor longitud corresponden al pre-ARN ya sintetizado, al que se le van uniendo proteínas que participan
en su maduración, dando lugar a la RNP 45S. El ensamblaje de los componentes que participan en la maduración del pre-ARNr es
cotranscripcional. (Imagen de microscopía procedente de: Miller O. J Cell Biol 1981;91:15-27. Ilustración de: A. Calvo.)
366
Los ribosomas también contienen ARNr 5 S. La transcripción de este ARNr sigue un proceso independiente al de 45
S, ya que es codificado por genes presentes en el cromosoma 1, tiene lugar fuera del nucléolo y su transcripción está a
cargo de la ARN polimerasa III (v. tabla 8-2). Al igual que ocurría con el pre-ARNr 45 S, existen múltiples copias del
gen que codifica el ARNr de 5 S situadas en tándem. El ARNr 5 S es un ARN pequeño (120 nucleótidos) con una masa
molecular de 40 kDa. Tiene una estructura secundaria muy conservada y se caracteriza por formar una partícula
prerribosómica con la proteína L5. Esta partícula es transportada hasta el nucléolo, donde se ensambla con el resto de
componentes de la subunidad mayor del ribosoma.
Otros cuerpos nucleares
En el núcleo podemos distinguir, aparte del nucléolo, otros dominios o cuerpos nucleares relacionados con los
procesos de transcripción y procesamiento del ARN (fig. 8-12). Entre ellos se encuentran: a) unas zonas de pequeño
tamaño conocidas como partículas nucleares (speckles, en inglés), que participan en el corte y empalme del ARNm; b)
los cuerpos de Cajal, involucrados en procesos relacionados con el metabolismo del ARN, tales como la biogénesis,
maduración y reciclaje de snRNP, el procesamiento del ARNm de las histonas y el mantenimiento de los telómeros, y
c) los cuerpos nucleares de la leucemia promielocítica aguda (PML-NB, del inglés promyelocytic leukemia nuclear
bodies). Una misma proteína puede estar asociada con más de un cuerpo nuclear, pudiendo ser transportada desde
uno a otro subdominio. Este tráfico es particularmente intenso entre el nucléolo y el resto de partículas nucleares.
FIGURA 8-12 Los cuerpos nucleares incluyen el nucléolo, los cuerpos de Cajal y los cuerpos nucleares de la leucemia promielocítica
aguda (PML-NBs). (Por cortesía de Dr. Graham Dellaire, Dept. of Pathology Dalhousie University, Halifax, Canada.)
367
Maduración del ARN
El ARN sintetizado en la transcripción se conoce como ARN primario, transcrito primario o pre-ARN. Los ARN
primarios de las células eucariotas sufren una serie de transformaciones, denominadas modificaciones
postranscripcionales, que los convierten en su forma madura (cuadro 8-2). Este proceso de maduración del ARN tiene
lugar en el núcleo y se solapa con el proceso de transcripción, de tal manera que el extremo 5’ del ARN transcrito
puede estar siendo modificado cuando su extremo 3’ todavía no se ha sintetizado.
Cuadro 8-2
Modificaciones postranscripcionales del ARN primario
• Eliminación de fragmentos de la cadena de ARN.
• Adición de nuevos nucleótidos.
• Modificaciones covalentes de bases nitrogenadas.
Maduración del ARN mensajero
En células eucariotas, los genes dan lugar a proteínas mucho más pequeñas de lo que cabría esperar por la longitud de
su secuencia de nucleótidos. Esto se debe a que contienen regiones que no son utilizadas para la síntesis de la
proteína. Estas regiones se denominan intrones y se eliminan durante la maduración del ARNm mediante un proceso
conocido como corte y empalme o ayuste; aunque también es muy frecuente el uso del término anglosajón splicing.
Los segmentos de ARN que permanecen en el ARN maduro se denominan exones (fig. 8-13). El splicing del ARN tiene
lugar en el núcleo de la célula de manera simultánea a la transcripción. Además, el ARNm sufre también
modificaciones en sus dos extremos: la adición de la caperuza 5’ y la adición de una cola poli(A) en el extremo 3’.
368
FIGURA 8-13 Proceso de splicing del ARN. Durante el proceso de splicing se elimina una parte de la secuencia del transcrito primario
(intrón). Los segmentos de secuencia que permanecen en el ARN maduro se denominan exones. Como se observa en la
electronografía, este proceso tiene lugar de manera simultánea a la transcripción. La molécula de ADN entra por la parte superior de la
imagen y sale por la inferior. El asterisco indica el punto de inicio de la transcripción. Las flechas señalan bucles en los que se está
dando el splicing. La flecha más grande (inferior) señala un ARN completamente transcrito que ya se ha separado del ADN. Tamaño de
la barra: 200 nm. (Imagen procedente de: Proudfoot N. Trends Biochem Sci 2000;25:290-3. Ilustración de: I. Baraibar.)
Splicing del ARN mensajero
El splicing es el proceso de eliminación de intrones de un ARN inmaduro. Este proceso se lleva a cabo mediante el
corte de los intrones y el posterior empalme de los exones (v. fig. 8-13). El splicing reduce notablemente el tamaño del
ARN maduro, que puede pasar a ser varias veces más pequeño que el transcrito primario. El tamaño y número de
intrones y exones es muy variado. Hay genes con decenas de intrones y exones, mientras que otros solo contienen
unos pocos. Hay incluso genes sin intrones, como los que codifican para las histonas. Respecto al tamaño, existen
intrones de 50 a 20.000 nucleótidos y exones de 100 a 1.000 nucleótidos (aunque en la mayoría de los casos no superan
los 250 nucleótidos).
En función del tipo de intrón, los mecanismos de splicing son distintos (fig. 8-14). Además, la distribución de los
tipos de intrones difiere entre los distintos tipos de ARN (cuadro 8-3).
FIGURA 8-14 Esquema de los cuatro posibles mecanismos de splicing. En los intrones del grupo I, el proceso se inicia con una
molécula de guanosina que actúa de nucleófilo, atacando al sitio de corte 5’. En el caso del grupo II y del splicing mediado por el
espliceosoma, una adenosina del propio intrón lleva a cabo el ataque sobre el extremo 5’ del intrón. (Ilustración de: I. Baraibar.)
Cuadro 8-3
Tipos de intrones y moléculas de ARN en los que se localizan
• Grupo I: en el ARNr, el ARNt y el ARNm.
• Grupo II: en el ARNm mitocondrial.
369
• Intrones cuya eliminación está mediada por el espliceosoma: en el ARNm nuclear.
• Intrones cuya eliminación está mediada por endonucleasas: en el ARNt.
Los intrones del grupo I y del grupo II son un ejemplo de autocatálisis. Para la eliminación del intrón no se requiere
la participación de ningún factor proteico, sino que el propio ARN actúa como catalizador del proceso. Los ARN con
capacidad catalítica se denominan ribozimas. La existencia de este tipo de moléculas en los seres vivos ha dado lugar
a teorías sobre el origen de la vida que postulan que las primeras biomoléculas fueron cadenas de ARN, con
capacidad de actuar como catalizadores de su propia replicación. La división de funciones entre el ADN
(almacenamiento de la información genética) y las proteínas (catálisis) se habría producido en una etapa posterior de
la evolución.
Los intrones más comunes y característicos de las células eucariotas (tercer tipo) son aquellos que requieren de la
participación de complejos ARN-proteína denominados ribonucleoproteínas nucleares pequeñas (snRNP). Existen
cinco tipos de ARN nucleares pequeños que forman parte de las snRNP: U1, U2, U4, U5 y U6. Cada uno de ellos se
asocia a un complejo de proteínas para dar lugar al espliceosoma, que cataliza la eliminación de intrones con gasto de
energía en forma de ATP. Estos intrones, típicos de los ARNm, parecen haber evolucionado a partir de los intrones del
grupo II y contienen secuencias consenso que determinan el reconocimiento, por parte del espliceosoma, de las zonas
de unión exón-intrón (fig. 8-15).
FIGURA 8-15 Secuencia consenso de nucleótidos para el ensamblaje del espliceosoma y la eliminación de los intrones de los ARNm
eucariotas.
El cuarto tipo de intrones está restringido a ciertos ARNt. El proceso de splicing requiere de una endonucleasa que
corta los enlaces fosfodiéster en ambos extremos del intrón. La unión de exones se lleva a cabo con consumo de ATP
mediante un mecanismo similar al que utilizan las ligasas de ADN.
La formación del espliceosoma es un proceso complejo; los ARN nucleares pequeños se sintetizan en el núcleo y se
exportan al citoplasma, donde se ensamblan con proteínas para dar lugar a las snRNP. Las snRNP se transportan al
núcleo y se acumulan en los cuerpos de Cajal, que son especialmente abundantes en células en proliferación o en
células metabólicamente muy activas, como las neuronas. Como hemos indicado previamente, estas estructuras
participan en el empaquetamiento, maduración y reciclaje de las snRNP. Una vez ensambladas en los espliceosomas,
las snRNP se desplazan a los lugares transcripcionalmente activos. La proteína de supervivencia de motoneuronas
(SMN, del inglés survival motor neuron protein) es un componente esencial en la maduración de las snRNP que se
localiza tanto en el citoplasma como en los cuerpos de Cajal. En el citoplasma, la SMN forma parte del complejo
proteico y actúa como chaperona en el ensamblaje de las snRNP. A su vez, el complejo proteico acompaña a las
snRNP hasta los cuerpos de Cajal en el núcleo, donde podría contribuir a su maduración.
370
La atrofia muscular espinal abarca un conjunto de enfermedades neurodegenerativas que afectan específicamente a
las motoneuronas del asta anterior de la médula espinal, generando atrofia y debilidad muscular. La forma más
común de la enfermedad está causada por mutaciones que afectan al gen de la SMN, dando lugar a una alteración del
proceso de biogénesis de las snRNP. En la actualidad, se desconoce el mecanismo por el cual una mutación en la
SMN, que causa un defecto general en el splicing, se manifiesta principalmente en una degeneración de las
motoneuronas.
Importancia clínica del correcto reconocimiento de las secuencias de splicing
La secuencia de nucleótidos en la región de unión entre exones e intrones determina el correcto funcionamiento de la
maquinaria de splicing de la célula. Si la secuencia consenso en este punto se ve alterada, el ARN no se procesa
adecuadamente y su producto, normalmente una proteína, será defectuoso. En algunas ocasiones, esto puede
conducir a ciertas patologías. De hecho, se estima que el 15% de las enfermedades genéticas se deben a mutaciones
que afectan a puntos de splicing entre intrones y exones. Esto ocurre, por ejemplo, en algunos tipos de talasemia. Las
talasemias son enfermedades genéticas causadas por la síntesis inadecuada de la hemoglobina, lo que provoca anemia
en los individuos que la padecen. Se distinguen dos tipos de talasemias en función de la cadena de hemoglobina
afectada: α-talasemias y β-talasemias. Las α-talasemias suelen producirse por pérdidas completas de material genético
en la región de la α-globina. Las β-talasemias suelen estar asociadas a mutaciones que afectan a la regulación de la
transcripción del gen de la β-globina o al procesamiento de su ARN. En concreto, algunas β-talasemias están
asociadas a cambios en las regiones consenso de los sitios de unión exon-intrón, lo que provoca procesamientos
anormales del ARN (fig. 8-16).
FIGURA 8-16 Una mutación en un único nucleótido del primer intrón del gen de la cadena β de la hemoglobina puede afectar al patrón
de splicing de su ARN, causando una β-talasemia. En la figura se muestra el caso de un paciente en el que la mutación (G → A)
origina un nuevo sitio de splicing 3’ (ya que se genera una nueva secuencia consenso AG). Esto provoca un procesamiento anormal
del ARN que resulta en la síntesis de una proteína defectuosa.
Las alteraciones en el splicing también están implicadas en el desarrollo del cáncer. Si la maquinaria de splicing no
funciona de manera adecuada, se pueden sintetizar transcritos extraños que darán lugar a proteínas no funcionales o
con funciones potencialmente peligrosas para la célula. En diversos tipos de cáncer existen cambios en la selección de
371
los lugares de splicing en genes relacionados con la susceptibilidad a padecer cáncer o con la progresión tumoral. Las
alteraciones en el splicing pueden conllevar la síntesis de proteínas con funciones protumorales. Alternativamente,
pueden hacer desaparecer proteínas con capacidad supresora tumoral. Por ejemplo, existen mutaciones somáticas que
afectan al splicing del ARN del gen NF1, un gen supresor tumoral frecuentemente alterado en neuroblastomas.
El estudio del splicing anormal en cáncer podría tener importantes repercusiones en el manejo clínico de esta
patología. En primer lugar, el conocimiento de los eventos de splicing específicos de tumores se podría utilizar para el
desarrollo de biomarcadores de diagnóstico o pronóstico basados en la identificación de las variantes, ARN o
proteína, propias del tumor. Al mismo tiempo, también podría servir para el desarrollo de nuevas estrategias
terapéuticas, tales como la inmunoterapia con anticuerpos capaces de reconocer proteínas específicas del tumor.
Splicing alternativo del ARN mensajero
Algunos transcritos de ARN pueden tener distintos patrones de corte y empalme, de tal manera que un único ARN
inmaduro puede dar lugar a varios ARN maduros. Este fenómeno, denominado splicing alternativo, se puede
producir de modos muy variados (fig. 8-17). El splicing alternativo es un fenómeno muy frecuente que se da en más de
la mitad de los genes humanos.
FIGURA 8-17 A. Mediante splicing alternativo, un único pre-ARNm puede dar lugar a varios ARN maduros, cada uno de los cuales
producirá una proteína con características distintas. En el ejemplo, el splicing alternativo de los exones 2 y 3 de un ARN primario da
lugar a cuatro moléculas de ARN distintas, que a su vez producen cuatro proteínas distintas. B. Tipos principales de splicing
alternativo. (Ilustración de: I. Baraibar.)
372
La importancia fisiológica del splicing alternativo es evidente. Como la secuencia del ARN maduro determina la
secuencia de aminoácidos de la proteína final, el splicing alternativo permite la síntesis de distintas proteínas a partir
de un único gen. De hecho, este proceso tiene una gran influencia en la diversidad proteica de los organismos
superiores, ya que permite maximizar la capacidad codificante del genoma. Por ejemplo, a partir de un único gen, el
splicing alternativo permite variar las características de una proteína a lo largo de las distintas fases del desarrollo o
entre distintos tejidos (fig. 8-18). Aunque ya se han identificado muchos de los factores implicados en el proceso de
splicing alternativo, todavía no se conocen con precisión los mecanismos de selección de los lugares de corte
alternativos.
FIGURA 8-18 La síntesis de α-tropomiosinas es un claro ejemplo de la diversidad proteica generada mediante splicing alternativo. Las
α-tropomiosinas son proteínas esenciales para la contracción del músculo. Cada tipo muscular contiene un tipo distinto de αtropomiosina, pero todos ellos se obtienen a partir de un único gen, que da lugar a un único transcrito primario. Este transcrito primario
es procesado de manera distinta mediante splicing alternativo, y origina proteínas con las características apropiadas para cada tejido.
(Adaptado de: Nadal-Ginard B, et al. Adv. Enzyme Regul 1991;31:261-86. Ilustración de: I. Baraibar.)
Para ilustrar la importancia del splicing alternativo, explicaremos brevemente la determinación sexual en la
Drosophila melanogaster, una mosca utilizada frecuentemente en estudios genéticos que han ayudado a descubrir
importantes genes en humanos.
El regulador fundamental de la determinación sexual en esta mosca es la proteína Sxl (sex lethal). La proteína Sxl se
expresa en las moscas hembras, reprimiendo eventos de splicing que permitirían el desarrollo de los caracteres
masculinos. Sxl se puede clasificar funcionalmente como una proteína de unión al ARN. Las dianas moleculares de
esta proteína son muy variadas, aunque aquí únicamente veremos dos ejemplos (fig. 8-19). Sxl puede unirse al
transcrito primario del gen Tra (transformer). En ausencia de Sxl, la maduración de Tra da lugar a un ARN que codifica
para una proteína Tra sin actividad, ya que contiene un codón de terminación prematuro. Sin embargo, en las moscas
hembra, la proteína Sxl se une a un intrón de Tra, modificando la unión de la maquinaria de splicing. De esta manera,
se produce un splicing que elimina el codón de terminación prematuro. Esto permite sintetizar una proteína Tra
completa y activa. La proteína Tra es capaz de regular varios genes, activando patrones de splicing específicamente
femeninos.
373
FIGURA 8-19 Regulación por splicing alternativo de dos genes fundamentales en la determinación sexual de la mosca Drosophila
melanogaster: Transformer (Tra) y Male-specific lethal 2 (Msl2). La unión de la proteína Sxl al ARN de estos dos genes afecta a su
splicing. La función de las isoformas proteicas originadas a partir de estos ARN determinará los caracteres sexuales del insecto. Sxl se
expresa únicamente en las moscas hembra. (Ilustración de: I. Baraibar.)
Otra diana de Sxl es Msl2 (male-specific lethal 2). Msl2 es una proteína importante para el desarrollo sexual de la
mosca, ya que regula el nivel de expresión de los genes del cromosoma sexual X. Nuevamente, Sxl es capaz de
modificar el splicing de Msl2. En las moscas hembra, Sxl está presente y es capaz de unirse al primer exón del
transcrito primario de Msl2, bloqueando la unión de factores importantes para el splicing. En este caso, la maquinaria
de splicing es incapaz de eliminar el intrón 1 del gen, lo que hace que la célula lo retenga en el ARN maduro. Como
consecuencia de esto, en las moscas hembra, la proteína Msl2 contiene una secuencia adicional de aminoácidos, lo que
modifica su actividad (v. fig. 8-19).
Adición de la caperuza 5’
Durante el proceso de maduración, el extremo 5’ del ARN mensajero se modifica por la adición de un residuo de 7metilguanosina a través de un enlace 5’,5’-trifosfato (fig. 8-20). También es frecuente que se metilen los grupos 2’-OH
de los dos nucleótidos adyacentes. Esta estructura, denominada caperuza 5’, aumenta la estabilidad del ARN, ya que
no es reconocida por las ARNasas celulares. Además, la caperuza 5’ también está implicada en el transporte del
ARNm al citoplasma y en la unión al ribosoma.
374
FIGURA 8-20 A. Estructura de la caperuza 5’ del ARNm maduro. A menudo, los nucleótidos adyacentes a la 7-metilguanosina están
metilados en la posición 2’-OH. B. Adición de la cola poli(A) al ARNm inmaduro.
Adición de la cola poli(A)
La mayoría de los ARNm maduros contienen un extremo 3’ con una secuencia de 80-250 residuos de adenilato
denominada cola poli(A). La secuencia de esta cola no está presente en el gen, sino que es añadida al transcrito de
ARN mediante la acción de una endonucleasa y el complejo enzimático de la poliadenilato polimerasa, que se
encarga de añadir los nucleótidos de adenina sin necesidad de un molde (v. fig. 8-20). Esta estructura protege al
ARNm de la degradación y participa en su transporte al citoplasma.
Algunos genes contienen más de una secuencia consenso de poliadenilación, lo que permite generar distintos
polipéptidos mediante la elección de una u otra de las regiones. Un ejemplo de este sistema de control es el
procesamiento diferencial del transcrito del gen de la calcitonina. El transcrito primario tiene dos sitios de
poliadenilación; uno se utiliza predominantemente en el tiroides y el otro en el cerebro. Además, mediante splicing
alternativo, en el cerebro se elimina un intrón que en la glándula tiroides se conserva. Esto da lugar a dos hormonas
375
distintas a partir del mismo gen: la calcitonina en el tiroides y el CGRP (o péptido relacionado con la calcitonina) en el
cerebro.
Maduración del ARN ribosómico y síntesis de los ribosomas
Los transcritos primarios de ARNr también necesitan ser sometidos a diversas modificaciones químicas para dar lugar
a los ARNr maduros. Este proceso tiene lugar en el nucléolo. Los transcritos de 45 S son cortados, empalmados y
modificados por las ribonucleoproteínas nucleolares pequeñas (snoRNP, del inglés small nucleolar ribonucleoproteins). Los
ARN nucleolares pequeños de las snoRNP se aparean con el transcrito primario por complementariedad de bases. Las
snoRNP se sitúan principalmente en el CFD, mientras que en el CG, que rodea a los CF y a los CFD, se encuentran
diversas partículas ribosómicas en distintas etapas de maduración.
El ensamblaje y la actividad de los componentes que modifican el ARN prerribosómico es cotranscripcional (v. fig.
8-11) y tiene lugar en varios pasos (fig. 8-21). En las primeras etapas del procesamiento se producen modificaciones
químicas que consisten en la metilación de ribosas, para dar lugar a 2’-O-metilribosas, y en el reemplazo de algunos
residuos de uridina por seudouridina (ψ). Existen dos clases principales de snoARN: a) los snoARN con cajas C/D, y
b) los ARN nucleolares pequeños con cajas H/ACA. Los snoARN C/D participan en la metilación-2’-O del pre-ARN y
se unen a la proteína fibrilarina. Esta proteína, que aparece concentrada en el CFD, es la enzima que cataliza la
metilación de ribosas. Los ARN nucleolares pequeños H/ACA se asocian a proteínas diferentes, como la disquerina,
que cataliza la isomerización del residuo de uridina. Se considera que estas modificaciones facilitan el plegamiento y
aumentan la estabilidad del ARNr. Además, los ARN nucleolares pequeños U3 y U14 (de clase C/D), junto con snR10
y snR30 (de clase H/ACA), intervienen en el procesamiento del ARNr 18 S. Los ARN nucleolares pequeños maduran
en los cuerpos de Cajal, desde donde migran al nucléolo para llevar a cabo estas funciones. La disquerina, aparte de la
función ya mencionada, también interviene en la actividad de la telomerasa, y determinadas mutaciones en el gen que
codifica para esta proteína causan la disqueratosis congénita, una enfermedad genética rara que cursa con
alteraciones de la médula ósea y trastornos cutáneos.
FIGURA 8-21 Maduración de los ARN ribosómicos 28 S, 5.8 S y 18 S a partir de un único gen. (Ilustración de: I. Baraibar.)
376
La maduración final de los ARNr y su ensamblado con las proteínas ribosómicas ocurre principalmente en el CG
del nucléolo (fig. 8-22). Un procesamiento endo- y exonucleolítico libera los ARNr del precursor policistrónico. Los
ARNr 5.8 S y 28 S se unen al ARN 5 S (sintetizado fuera del nucléolo) y a unas 49 proteínas para formar la subunidad
60 S; por otro lado, el ARNr 18 S, junto con unas 33 proteínas, forman la subunidad 40 S. Ambas subunidades son
exportadas por separado hacia el citoplasma, donde se unirán en el momento de la traducción proteica (v. capítulo 9).
Los genes que codifican las proteínas ribosómicas se encuentran dispersos en el genoma, pero poseen promotores
característicos y todos ellos incluyen una secuencia consenso de pirimidinas en el extremo 5’. Los ARNm de estas
proteínas son de vida media relativamente corta, lo que obliga a su transcripción continua. Las proteínas ribosómicas
llegan al núcleo en cantidades supraestequiométricas, y el exceso es ubiquitinado y degradado a través del
proteasoma.
FIGURA 8-22 Transcripción y procesamiento de los ARNr y ensamblaje de los ribosomas. Se destacan los tres subdominios del
nucléolo. (Ilustración de: I. Baraibar y A. Calvo.)
Algunas patologías se han relacionado con alteraciones del nucléolo y del procesamiento del ARNr, incluidas
determinadas situaciones de estrés, infecciones víricas, enfermedades neurodegenerativas (como el síndrome de
Werner), la disqueratosis congénita o el cáncer (como la leucemia aguda promielocítica). La composición proteica del
nucléolo es variable y se modifica rápidamente bajo condiciones de estrés (daño del ADN, alteraciones en la nutrición,
hipoxia, choque térmico, etc.). Diversas infecciones víricas afectan a la morfología nucleolar y a la producción de
ribosomas, modificando tanto la cantidad de ribosomas que producen las células infectadas como el proceso de
traducción proteica. También se alteran las vías de procesamiento, con la acumulación de intermediarios que
normalmente no se encuentran en el nucléolo; así, se reduce el nivel de metilación del ARNr y se redistribuye la
fibrilarina fuera del nucléolo.
Las proteínas nucleolina y nucleofosmina, localizadas en el nucléolo, contribuyen a la intensa coloración del
nucléolo en la interfase. Ambas proteínas aumentan anormalmente su expresión en las células cancerosas, lo que
explica que las alteraciones nucleares y nucleolares sean utilizadas por los patólogos para el diagnóstico del cáncer. En
377
algunas líneas tumorales, la relación CF/CFD aumenta, junto con la producción de ARNr y la acumulación de material
prerribosómico.
Maduración del ARN de transferencia
Las células contienen unos 40-50 tipos de ARNt que se transcriben a partir de genes repartidos a lo largo de todo el
genoma. En general, todos los ARNt maduros proceden de precursores más largos que sufren degradaciones en
ambos extremos por acción de diversas nucleasas. En el procesamiento del ARNt participan algunas ribozimas, como
la ARNasa P que elimina secuencias de ARN del extremo 5’. También se pueden dar eliminaciones de intrones por
acción de determinadas endonucleasas. Además, se añade el trinucleótido CCA en el extremo 3’. Esta estructura es
esencial para la traducción, ya que es el lugar de unión del aminoácido entrante. La adición del trinucleótido es
llevada a cabo por la ARNt nucleotidiltransferasa (fig. 8-23).
FIGURA 8-23 Etapas en la maduración del ARN de transferencia. (Ilustración de: I. Baraibar.)
378
El ARNt también se caracteriza por una alta frecuencia de modificaciones en sus bases nitrogenadas. Se conocen
más de 60 tipos de bases modificadas en los ARNt: por procesos de metilación, desaminación o reducción, entre otros.
379
Metabolismo del ARN maduro
Transporte del ARN del núcleo al citoplasma
Los ARN maduros llevan a cabo sus funciones en el citosol. Por ello, tras el proceso de maduración, el ARN activo
debe ser transportado fuera del núcleo. En general, los ARN forman complejos de ribonucleoproteínas y son
trasladados al citoplasma a través de los poros nucleares. Uno de los mecanismos más conocidos es el transporte
dependiente de la proteína Ran-GTPasa (fig. 8-24).
FIGURA 8-24 Transporte de moléculas de ARN del núcleo al citoplasma mediante el sistema de transporte dependiente de Ran. Los
ARN unidos a proteínas en complejos ribonucleoproteicos se unen a la exportina y a Ran-GTP para atravesar los poros nucleares. Una
vez en el citoplasma, se induce la actividad GTPasa de Ran, generándose Ran-GDP, lo que provoca la liberación de la
ribonucleoproteína. Este mecanismo es muy utilizado en el transporte de los ARN al citoplasma, aunque no es el único. (Ilustración de: I.
Baraibar.)
Estabilidad y degradación del ARN
Las moléculas de ARN tienen vidas medias relativamente cortas, en claro contraste con la gran estabilidad del ADN.
Esto es reflejo de sus distintas funciones en la célula. Mientras que el ADN debe almacenar y transmitir la información
del genoma, una molécula de ARN tiene funciones más concretas en el tiempo, y tras su eliminación puede ser
nuevamente reemplazada si vuelve a ser necesaria. Esto explica también la importancia de la actividad correctora
durante el proceso de replicación del ADN y la existencia de complejos sistemas de detección y reparación de daños
en la doble hebra. Ninguno de estos procesos tiene lugar en el ARN. De hecho, las células disponen de sistemas de
reconocimiento para la degradación inmediata de las moléculas de ARN defectuosas. La eliminación de las moléculas
de ARN tiene lugar en el citoplasma y es llevada a cabo por ribonucleasas. Estas enzimas catalizan la hidrólisis del
ARN y liberan nucleótidos que pueden ser reutilizados para la síntesis de nuevos ácidos nucleicos.
Existen grandes diferencias de estabilidad entre las moléculas de ARN. Esto es especialmente patente en los ARNm.
La vida media de algunos ARNm puede ser de unos pocos minutos, mientras que la de otros puede sobrepasar los
días. Diversos factores afectan a la estabilidad del ARN, muchos de los cuales todavía son poco conocidos.
Los micro-ARN y su importancia en la fisiología humana
380
Uno de los más recientes avances en el conocimiento del control de la expresión génica ha sido el descubrimiento los
micro-ARN. Los micro-ARN son pequeñas moléculas de ARN de 18-24 nucleótidos capaces de unirse por
complementariedad de bases a los ARN mensajeros. Cuando un micro-ARN se une a su ARNm diana induce su
degradación o bloquea su traducción a proteína. Los primeros micro-ARN fueron descritos en C. elegans, un gusano
muy utilizado en investigación biomédica. Estos micro-ARN son fundamentales para el desarrollo normal del animal.
Desde principios del siglo xxi el estudio de los micro-ARN en la fisiología y patología humana ha crecido de manera
exponencial. Los micro-ARN se transcriben por la ARN polimerasa II o la III en forma de largos precursores que, a
través de una serie de procesamientos postranscripcionales (tanto nucleares como citoplasmáticos), dan lugar a los
micro-ARN maduros. Se estima que en el genoma humano existen aproximadamente 1.000 micro-ARN distintos.
Dependiendo de su secuencia, cada uno de ellos tendrá unas dianas de ARNm concretas. Se calcula que
aproximadamente el 30% de los ARNm están controlados por micro-ARN. Las implicaciones fisiológicas de estas
pequeñas moléculas están solo empezando a vislumbrarse. Existen trabajos que demuestran su participación en
procesos como el crecimiento celular, la diferenciación, la consolidación de la memoria, la apoptosis o la respuesta
inmunitaria. También se han encontrado alteraciones en la función de los micro-ARN en diversas situaciones
patológicas. En concreto, multitud de micro-ARN presentan una expresión alterada en cáncer. Algunos de ellos tienen
un papel oncogénico, mientras que otros actúan como genes supresores tumorales. El descubrimiento de este nuevo
sistema de regulación de la expresión génica y su implicación en el desarrollo de enfermedades ha abierto nuevas
perspectivas para el diseño de tratamientos y sistemas diagnósticos.
Lecturas recomendadas
Boisvert FM, Van Koningsbruggen S, Navascués J, Lamond AI. The multifunctional nucleolus. Nat Rev Mol Cell Biol. 2007 Jul;8:574–585.
Cook A, Bono F, Jinek M, Conti E. Structural biology of nucleocytoplasmic transport. Annu Rev Biochem. 2007;76:647–671.
Esteller M. Non-coding RNAs in human disease. Nat Rev Genet. 2011;12:861–874.
Fedor MJ, Williamson JR. The catalytic diversity of RNAs. Nat Rev Mol Cell Biol. 2005;6:399–412.
Li B, Carey M, Workman JL. The role of chromatin during transcription. Cell. 2007;128:707–719.
Nizami Z, Deryusheva S, Gall JG. The Cajal body and histone locus body. Cold Spring Harb Perspect Biol. 2010;2:a000653.
Pajares MJ, Ezponda T, Catena R, Calvo A, Pio R, Montuenga LM. Alternative splicing: an emerging topic in molecular and clinical
oncology. Lancet Oncol. 2007;8:349–357.
Portela A, Esteller M. Epigenetic modifications and human disease. Nat Biotechnol. 2010;28:1057–1068.
Salz HK. Sex determination in insects: a binary decision based on alternative splicing. Curr Opin Genet Dev. 2011;21:395–400.
381
Venters BJ, Pugh BF. How eukaryotic genes are transcribed. Crit Rev Biochem Mol Biol. 2009;44:117–141.
Preguntas de autoevaluación
1. Respecto al transcrito primario, es cierto que:
a. Contiene tanto intrones como exones.
b. Se sintetiza en el citoplasma.
c. Toda su secuencia es codificante.
d. Contiene bases modificadas.
e. Es un ácido nucleico de doble hebra.
Respuesta correcta: a.
2. La ARN polimerasa:
a. Tiene actividad correctora de pruebas.
b. Necesita un cebador para poder iniciar el proceso de polimerización.
c. Sintetiza una molécula de ARN complementaria a la hebra molde.
d. Incorpora desoxinucleósidos trifosfato a la molécula de ARN.
e. Sintetiza la molécula de ARN en dirección 3’
→ 5’.
Respuesta correcta: c.
3. El promotor de un gen es:
a. Una secuencia de ARN que regula su plegamiento.
b. Una secuencia de ADN que se encuentra en la región 3’ del gen.
c. Una secuencia codificante.
d. Una región del ADN que regula su expresión.
e. Un conjunto de factores de inicio de la transcripción.
Respuesta correcta: d.
4. Los factores de transcripción son:
382
a. Enzimas con actividad endonucleasa que participan en la fase de elongación de la transcripción.
b. Secuencias consenso en el promotor de un gen.
c. Proteínas que forman parte del espliceosoma y participan en el splicing.
d. Enzimas que intervienen en la remodelación de la cromatina.
e. Proteínas que se unen al ADN y regulan la expresión de un gen a nivel de su transcripción.
Respuesta correcta: e.
5. Para que se produzca la transcripción es necesario que:
a. Los factores de transcripción recluten a la ARN polimerasa.
b. La cromatina esté en forma de heterocromatina.
c. Las histonas estén desacetiladas.
d. El promotor esté hipermetilado.
e. Se haya producido el proceso de corte y empalme.
Respuesta correcta: a.
6. ¿Cuál de estos ARNr no se transcribe en el nucléolo?:
a. 28 S.
b. 18 S.
c. 5.8 S.
d. 5 S.
e. Todos los ARNr se transcriben en el nucléolo.
Respuesta correcta: d.
7. Indique cuál de los siguientes procesos tiene lugar en la maduración del ARN:
a. Corrección de los nucleótidos incorporados erróneamente.
b. Eliminación de secuencias no codificantes.
c. Hipermetilación de islas CpG.
d. Unión a factores de transcripción.
e. Incorporación de la 7-metilguanosina en el extremo 3’.
383
Respuesta correcta: b.
8. Los complejos snRNP son importantes en el proceso de corte y empalme de los intrones:
a. Del grupo I.
b. Del grupo II.
c. Cuya eliminación está mediada por el espliceosoma.
d. Cuya eliminación está mediada por endonucleasas.
e. Todos ellos.
Respuesta correcta: c.
9. Son elementos importantes en la maduración del ARN ribosómico:
a. Las snoRNP.
b. Los factores de transcripción basales.
c. Los micro-ARN.
d. El complejo multiproteico SWI/SNF.
e. Las ADN metiltransferasas.
Respuesta correcta: a.
10. En una célula cancerosa, la expresión de un gen supresor tumoral puede verse comprometida por:
a. La pérdida de material genético en su región cromosómica.
b. La hipermetilación de su promotor.
c. La sobreexpresión de un micro-ARN que se une al ARNm del gen supresor.
d. La aparición de mutaciones en regiones consenso de splicing.
e. Todas ellas.
Respuesta correcta: e.
384
CAPÍTULO 9
385
Síntesis y modificación de proteínas
Igor Hernández
Alfonso Calvo
Objetivos de aprendizaje
• Entender cómo se transfiere la información genética almacenada en el ADN a una secuencia de aminoácidos
para constituir una proteína funcional.
• Conocer los aspectos moleculares de la síntesis proteica y los elementos fundamentales para llevarla a cabo.
• Comprender la importancia de las modificaciones postraduccionales en la funcionalidad de las proteínas.
• Conocer algunas enfermedades que se producen por alteración de procesos de síntesis o modificación
postraduccional de las proteínas.
386
Introducción
En capítulos anteriores se ha explicado cómo el ADN almacena y conserva la información genética, y cómo el ARN
transmite esa información desde el núcleo hasta la maquinaria citoplasmática, donde se traduce a una secuencia de
aminoácidos que constituyen las proteínas, que son las que ejecutan propiamente las funciones celulares. Los
mecanismos de síntesis (traducción proteica) y las modificaciones postraduccionales que sufren las proteínas en los
organismos eucariotas son algo distintos a los de los procariotas. Ya que el objeto del presente libro es el estudio de la
célula eucariota humana, obviaremos en este capítulo lo referente a organismos procariotas.
Las proteínas son un conjunto ordenado y secuencial de aminoácidos que forman una cadena polipeptídica y se
organizan tridimensionalmente en el espacio. Todas las proteínas, tanto las de células procariotas como las de
eucariotas, están construidas a partir del mismo conjunto de 20 aminoácidos (fig. 9-1). Las células pueden producir
proteínas con propiedades y actividades diferentes uniendo los mismos 20 aminoácidos y dando lugar así a multitud
de combinaciones y secuencias distintas. De esta manera, se pueden fabricar polipéptidos tan diversos como enzimas,
hormonas, anticuerpos, proteínas estructurales del citoesqueleto, etc.
FIGURA 9-1 Estructura de los 20 aminoácidos. Los aminoácidos situados dentro del recuadro azul corresponden a aminoácidos no
polares; los del recuadro verde, a polares; los del recuadro naranja, a básicos, y los del recuadro violeta, a ácidos. Los nombres de los
aminoácidos se muestran en los tres códigos comúnmente aceptados: nombre completo, código de tres letras y código de una letra.
(Ilustración de: E. Maldonado.)
387
Todos los aminoácidos tienen una estructura característica: contienen un grupo carboxilo y un grupo amino unidos
al mismo átomo de carbono (fig. 9-2). Este átomo de carbono se denomina α y establece enlaces con un hidrógeno y
una cadena lateral (o grupo R), que es lo que diferencia a cada uno de los aminoácidos, confiriéndoles sus
propiedades físico-químicas características. Para formar una proteína, los aminoácidos se unen entre sí formando un
enlace amida sustituido, denominado enlace peptídico (v. fig. 9-2). Estos enlaces permiten la libre rotación de los
átomos que unen, lo cual confiere a las cadenas polipeptídicas una gran flexibilidad tridimensional.
FIGURA 9-2 A. Estructura genérica de un aminoácido. B. Formación de un enlace peptídico entre dos aminoácidos.
388
Maquinaria para la síntesis proteica
Para construir la cadena de aminoácidos que es propia de cada proteína se necesitan principalmente tres elementos: el
ARN mensajero (ARNm), los ribosomas y distintos ARN de transferencia (ARNt) que transportan cada uno de los
aminoácidos que se van a ir incorporando a la proteína, según tiene lugar su proceso de síntesis. Los ribosomas se
unen a un ARNm para «leer» su información genética e incorporar secuencialmente ARNt cargados (cada uno de
ellos) con un aminoácido específico, a partir de los cuales se construye la proteína. Normalmente, varios ribosomas
«leen» de modo secuencial la información genética contenida en un mismo ARNm, lo cual resulta en un proceso
altamente eficaz de traducción (fig. 9-3). Al microscopio electrónico de transmisión se puede observar este conjunto de
ribosomas en proceso de traducción de un mismo ARNm, formando lo que se conoce como polirribosomas o
polisomas. El número de ribosomas unidos a cada ARNm depende de la longitud del ARNm; en un ARNm de unos
300 nm aparecerían unos 10 ribosomas. Para la traducción de las proteínas los ribosomas recorren el ARNm en
sentido 5’
→
codones)
3’. Por se
cada
incorpora
tres nucleótid
un aminoácido
os qu e recor
al polipéptido en formación. Una vez que ha terminado el proceso de síntesis, los ribosomas se separan del ARNm y
la proteína recién sintetizada queda libre.
FIGURA 9-3 Estructura de los ribosomas y polirribosomas. A. Esquema de la estructura y subunidades de un ribosoma de 80 S. B.
Representación de un polirribosoma (o polisoma) donde se muestran diferentes ribosomas en proceso de traducción de un mismo
ARNm. C. Imagen de microscopía electrónica de polisomas. La flecha negra indica polisomas en una cisterna de RER; las flechas rojas
indican polisomas libres en el citoplasma. (Ilustraciones de: E. Maldonado; C, procedente de: Vázquez JJ, López Díez del Corral J. Citología Práctica. Pamplona:
Eunsa; 1981.)
ARN mensajero
El ARNm contiene, como hemos indicado, la información genética acerca de la secuencia de aminoácidos que se va a
incorporar a la proteína; es decir, es el molde a partir del cual se sintetiza cada proteína. Consiste en una secuencia
monocatenaria en cuyo extremo 5’ hay un nucleótido guanina metilado a modo de caperuza y en cuyo extremo 3’
existe una cadena de adeninas denominada cola poli-A (v. capítulo 8). No toda la secuencia del ARNm es utilizada
389
como patrón para la síntesis de la proteína, sino que esta queda delimitada por la porción comprendida entre el
triplete de nucleótidos que constituye el codón de iniciación y el triplete que constituye el codón de parada.
Ribosomas
Los ribosomas, unidades estructurales donde se lleva a cabo el proceso de traducción, son ribonucleoproteínas
formadas por varios ARN ribosómicos (ARNr) asociados a un conjunto de proteínas (v. fig. 9-3). Los ribosomas de
células eucariotas poseen una velocidad de sedimentación de 80 S, y están formados por dos subunidades: la
subunidad pequeña (o menor) posee una velocidad de sedimentación de 40 S y contiene un único ARNr de 18 S y
unas 30 proteínas; la subunidad grande (o mayor) posee una velocidad de sedimentación de 60 S y contiene 3 ARNr
(de 28 S, 5,8 S y 5 S) y alrededor de 45 proteínas. Los ribosomas de procariotas tienen una velocidad de sedimentación
de 70 S. La subunidad mayor, de 50 S, contiene una molécula de ARNr de 23 S y otra de 5 S, junto a 34 proteínas. La
subunidad menor posee un ARNr de 16 S y 21 proteínas. Como se analizó en el capítulo 8, la síntesis de los distintos
ARNr y el ensamblaje de las ribonucleoproteínas que forman el ribosoma tienen lugar en el nucléolo. Cada una de las
subunidades formadas en el nucléolo (mayor y menor) sale de forma separada del núcleo y es exportada al
citoplasma; las subunidades se unirán entonces entre sí y con el ARNm cuando tenga lugar la traducción de las
proteínas.
Los ribosomas se pueden encontrar libres en el citoplasma o adosados al lado citoplasmático de la membrana del
retículo endoplasmático rugoso (RER), ya que muchas proteínas son sintetizadas y a la vez incorporadas al interior de
este orgánulo. Como se estudia en el apartado «Transporte y localización de las proteínas», el hecho de que una
proteína se sintetice en el citoplasma o en el RER determinará su localización final en la célula. También existen
ribosomas en las mitocondrias, ya que estos orgánulos pueden realizar su propia síntesis de proteínas (v. capítulo 11).
Pero en este caso, los ribosomas son diferentes a los citoplasmáticos, ya que poseen una velocidad de sedimentación
de 55-60 S, con una subunidad mayor de 35 S (que contiene un ARNr de 16 S semejante al de los ribosomas de
procariotas, y otro de 4 S) y una subunidad menor de 25 S (con un ARNr de 12 S). Los ribosomas mitocondriales son
parecidos a los de los organismos procariotas no solo en cuanto a su estructura, sino también en lo referente a su
sensiblidad a antibióticos y fármacos inhibidores de la traducción (v. capítulo 11).
ARN de transferencia
Los ARNt son las moléculas encargadas de suministrar los aminoácidos necesarios para construir las proteínas (v.
capítulo 8). Los ARNt son ARN relativamente pequeños (4 S), formados por una sola hebra de ARN plegada sobre sí
misma en una estructura tridimensional que se suele representar en forma de hoja de trébol (fig. 9-4). Los ARNt tienen
entre 73 y 93 nucleótidos y están organizados en cuatro brazos, de los cuales dos son críticos para su función: por una
390
parte el brazo que se une al aminoácido, en el extremo 3’ del ARNt, que termina siempre con la secuencia
trinucleotídica CCA. El aminoácido queda unido por un enlace éster de su grupo carboxilo al grupo hidroxilo 2’ o 3’
del residuo adenosina (A) terminal del brazo del aminoácido. Por otra parte, el brazo del anticodón (situado en el
extremo opuesto al brazo que se une al aminoácido) posee la secuencia trinucleotídica específica complementaria a un
codón en el ARNm, que determina el aminoácido que se debe unir al ARNt. Cada anticodón (y por lo tanto cada
ARNt) es específico para un aminoácido, aunque como se verá más adelante, algunos aminoácidos son reconocidos y
unidos por dos o más ARNt. Otro de los brazos del ARNt se encarga de la unión del ARNt al ribosoma y se denomina
lazo T, debido a que contiene la base T (ribotimina), que forma parte de la secuencia: T-ψ-C; la base designada como ψ
es una base poco común, cuya denominación es la de seudouridina. Finalmente, hay un brazo del ARNt que reconoce
la enzima aminoacil-ARNt sintetasa (v. más adelante), denominado lazo D, que contiene dos bases D
(dihidrouridina).
FIGURA 9-4 Esquema de la estructura y partes de los ARNt. D, dihidrouridina; Gm, metilguanosina; I, inosina; mI, metilinosina; T,
ribotimina; ψ, pseudouridina.
391
Código genético
Una vez descritos los elementos necesarios para llevar a cabo las síntesis de las proteínas, surge una importante
pregunta: ¿de qué modo se traduce la información genética contenida en el lenguaje de 4 «letras» de los nucleótidos
ACG y T (U al ser ARN) de los ácidos nucleicos al lenguaje de 20 «letras» de los aminoácidos de las proteínas? La
respuesta está en combinaciones diferentes de los cuatro nucleótidos. Las cuatro letras del ARNm en grupos de dos
solo pueden dar 16 combinaciones (4 ), que es un número insuficiente para abarcar todos los aminoácidos (20); por lo
2
tanto, la respuesta tiene que estar en la agrupación de las 4 letras en grupos de tres, con un resultado de 64
combinaciones posibles (4 ). Las agrupaciones de tres nucleótidos en el ARNm se conocen como codones. La secuencia
3
de cada codón es complementaria a la de un anticodón presente en un determinado ARNt, que a su vez se asocia con
un aminoácido específico. El ARNm es «leído» por la maquinaria de traducción como una secuencia de codones. Cada
codón determinará la incorporación de un aminoácido a la proteína, de tal manera que la secuencia de codones del
ARNm se traducirá en una secuencia de aminoácidos que compondrán la proteína. Este código de información es lo
que se conoce como código genético (fig. 9-5).
FIGURA 9-5 Tabla del código genético. Los tripletes del codón del ARNm indican qué aminoácido se incorporará a la proteína en
proceso de traducción; algunos codones indican parada y finalización de la traducción.
Como se puede observar, existen más codones disponibles que aminoácidos posibles. Este hecho confiere al código
genético una característica fundamental, a la que se denomina degeneración, lo que significa que un aminoácido
determinado puede ser codificado por más de un codón. Es importante subrayar que degenerado no significa
imperfecto: el código genético no es ambiguo, porque ningún codón codifica más de un aminoácido. Cuando un
aminoácido tiene varios codones que pueden codificarlo, la diferencia entre los codones se encuentra normalmente en
la tercera base. Las dos primeras letras de cada codón son, por lo tanto, determinantes primarios de la especificidad.
Las reglas que rigen la especificidad en la unión de un codón del ARNm y del anticodón en un ARNt fueron
establecidas por Francis Crick y se exponen a continuación:
392
• Las primeras dos bases de un codón forman enlaces fuertes con sus pares correspondientes, las dos últimas bases
del anticodón.
• Cuando la primera base del anticodón es C o A, la fijación a la tercera base del codón es específica y solo se
reconoce un codón por parte de dicho ARNt. Cuando, en cambio, la primera base del anticodón es U o G, la
fijación a la tercera base del codón es menos específica, pudiendo reconocerse dos codones por parte del ARNt.
Por último, cuando la inosina (un tipo de nucleósido modificado presente en el ARNt) es la primera base del
anticodón, la unión con el tercer nucleótido del codón es muy débil y el ARNt puede reconocer hasta tres
codones.
• Cuando un aminoácido es codificado por varios codones diferentes, los codones que difieren en cualquiera de las
dos primeras bases requieren ARNt diferentes.
Teniendo en cuenta los enunciados anteriores, se requiere un mínimo de 32 ARNt para traducir los 61 codones del
código genético. Los tres codones restantes no son reconocidos por ningún ARNt y se les conoce como codones de
terminación, ya que señalan el final de la síntesis de la cadena proteica.
393
Proceso de síntesis proteica en los ribosomas
Una vez descritos los elementos esenciales que se requieren para la síntesis de proteínas y los mecanismos necesarios
para «leer» la información genética contenida en el ARNm, procederemos a explicar el proceso de traducción que
tiene lugar en el ribosoma. Cabe destacar que, aunque los ribosomas, el ARNm y los ARNt son tres elementos claves
para esta función, la traducción implica también la participación de un conjunto de factores proteicos que son
esenciales para que tenga lugar el proceso, denominados «factores de iniciación, elongación y terminación».
Para que pueda realizarse la síntesis proteica, primeramente cada ARNt debe acoplarse con su aminoácido
correspondiente. Los pasos de este proceso son los siguientes (fig. 9-6, A):
• Activación de un aminoácido mediante su unión a AMP, formándose un intermediario aminoacil-AMP; esta
reacción requiere de ATP.
• Unión del aminoacil-AMP al ARNt en la secuencia terminal CCA del brazo de unión al aminoácido, liberándose
el AMP y formándose un aminoacil-ARNt.
FIGURA 9-6 Cada uno de los ARNt lleva unido un aminoácido específico. A. El proceso de unión tiene lugar primeramente por la
formación de un aminoacil-AMP (1) y posteriormente por la formación de un aminoacil-ARNt (2), reacciones que implican la actuación
de aminoacil-ARNt sintetasas, con el correspondiente consumo de energía. B. Se representa como ejemplo la aminoacil-ARNt
sintetasa específica para histidina y su actividad para unir la histidina a su ARNt correspondiente.
Ambas reacciones son catalizadas por una enzima aminoacil-ARNt sintetasa específica para cada uno de los
aminoácidos, la cual reconoce a su aminoácido correspondiente. Esto es posible porque cada una de estas enzimas
posee un centro activo en el que encaja solamente un aminoácido determinado; es decir, existen (al menos) 20
aminoacil-ARNt sintetasas distintas para reconocer a cada uno de los 20 aminoácidos (v. ejemplo en la figura 9-6, B).
Una vez que los aminoácidos están unidos a su ARNt correspondiente, la subunidad menor del ribosoma se anclará al
ARNm que se va a traducir para que, tras la unión de la subunidad mayor, puedan entrar en un sitio preciso del
ribosoma los distintos ARNt cuya secuencia anticodón sea complementaria a la del codón del ARNm en ese sitio del
394
ribosoma (v. proceso en detalle más adelante). Por su parte, la subunidad mayor del ribosoma será la encargada de
catalizar la formación de los enlaces peptídicos en el polipéptido emergente.
Ambas subunidades poseen unos dominios internos que permiten alojar a los ARNt a lo largo de las diferentes
fases de la síntesis proteica (fig. 9-7, A). El sitio A hace referencia al sitio de unión del aminoacil-ARNt que entra
inicialmente en el ribosoma. El sitio P es el lugar que ocupa el aminoacil-ARNt una vez que se ha unido a la cadena
polipeptídica en crecimiento (peptidil-ARNt). El sitio E corresponde al lugar de salida (exit) del ARNt que ha
transferido la cadena polipeptídica en formación y se dispone a abandonar el ribosoma. El proceso de traducción se
puede dividir en tres pasos muy definidos:
FIGURA 9-7 A. Sitios de la subunidad ribosómica menor: E (Exit), P (Peptidyl), A (Aminoacyl). B. Factores de iniciación que se unen
tanto al ARNt como a la subunidad menor del ribosoma y al ARNm para comenzar el proceso de traducción. (Ilustración de: E. Maldonado.)
Iniciación
Durante esta fase, la subunidad menor del ribosoma se une al ARNm (figs. 9-7, B y 9-8, fase 1). La traducción en
células eucariotas siempre comienza por el codón AUG, que codifica para la metionina (Met). El ARNt iniciador (que
lleva unido el aminoácido Met) se une a la subunidad menor del ribosoma en el sitio P ayudado por el factor de
iniciación eIF2 (eukayotic iniciation factor 2) unido a un GTP. Por su parte, la subunidad menor se asocia a los factores
eIF1, eIF1A, eIF3 y eIF5. El ARNm también necesita unirse a varios factores: eIF4E, eIF4G (ambos asociados a la región
5’), eIF4A, eIF4B y PABP (poly A binding protein; proteína de unión a la cola poli-A). La unión de esta última proteína
permite que la región 3’ del ARNm (que contiene la cola poli-A) se repliegue y quede junto a la región 5’.
395
FIGURA 9-8 Inicio del proceso de traducción. La subunidad menor del ribosoma se une al ARNt iniciador (que lleva el aminoácido
metionina, Met) (1) y se desplaza por el ARNm (2) hasta que reconoce el codón de iniciación AUG, complementario al anticodón en el
ARNt (3); la unión implica el acoplamiento de la subunidad mayor (4). (Ilustración de: E. Maldonado.)
Tras la unión, el complejo de preiniciación formado por la subunidad menor del ribosoma y los factores
nombrados, se desplaza por el ARNm (por la región 5’ UTR, del inglés 5’ untranslated region, que no se traduce) hasta
que el codón de iniciación AUG es localizado sobre el sitio P del ribosoma (v. fig. 9-8, fases 2, 3); este proceso necesita
un gasto energético en forma de ATP. Cuando el codón de iniciación es reconocido por el anticodón, el factor eIF5
provoca la hidrólisis del GTP presente en el factor eIF2. Entonces, los factores de iniciación (incluyendo el eIF2, que
ahora está unido a GDP) se liberan y un nuevo factor denominado eI5B-GTP (no mostrado en el dibujo), mediante la
hidrólisis del GTP, permite el anclaje de la subunidad mayor (fig. 9-8, fase 4). De esta manera, la maquinaria para la
síntesis proteica queda preparada para la siguiente fase (v. fig. 9-8).
396
Elongación
El segundo ARNt que entra en el ribosoma (p. ej., fenilalanina, Phe) precisa de la ayuda de dos factores proteicos de
elongación (eukaryotic elongation factors) (eEF1A unido a GTP y eEF1B) para colocarse en el sitio A del ribosoma (fig. 99, fase 5). La correcta colocación de este aminoacil-ARNt en el sitio A produce un cambio de conformación que induce
la hidrólisis del GTP del eEF1A, lo cual provoca la liberación de este factor (que ahora está unido a GDP). La energía
liberada en la hidrólisis del GTP orienta el aminoácido unido al ARNt hacia el sitio P, donde se sitúa el primer
aminoácido que se incorporó a la cadena (Met). La orientación de ambos aminoácidos en el ribosoma permite la
formación del enlace peptídico mediante la actividad peptidil-transferasa que posee un ARNr perteneciente a la
subunidad mayor del ribosoma, que funciona como una ribozima (v. capítulo 8). La cadena polipeptídica formada por
sus dos primeros aminoácidos queda anclada al ARNt colocado en el sitio A (v. fig. 9-9, fase 6). Tras la formación del
primer enlace peptídico, el ribosoma se desplaza en sentido 5’
→ 3’d el
aminoácidos (Met y Phe) queda ahora situado en el sitio P y el ARNt que llevaba inicialmente Met se sitúa en el sitio
de salida (E). De este modo, el siguiente codón disponible del ARNm queda localizado en el sitio A. Estos
desplazamientos reciben el nombre de «translocación» y requieren energía, que es suministrada por la hidrólisis de un
GTP unido al factor eEF2. Este factor se une al ribosoma una vez que ha tenido lugar la catálisis del enlace peptídico y,
además de proporcionar la energía necesaria para la translocación, también contribuye a la misma por medio de
cambios conformacionales coordinados con el ribosoma. Cuando ha finalizado la translocación, se desprenden del
ribosoma el factor eEF2 y el ARNt del sitio E, dejando al ribosoma preparado para una nueva ronda de elongación.
397
FIGURA 9-9 Elongación del proceso de traducción. Se produce la entrada de un nuevo ARNt con un segundo aminoácido (en este
caso fenilalanina [Phe]) en el sitio A y se establece un enlace peptídico por el que se une el aminoácido metionina (Met) a la Phe en el
sitio A (5, 6). Posteriormente, el ribosoma se desplaza en sentido 5´→ 3´ y el ARNt con el dipéptido queda en el sitio P, mientras que el
ARNt que inicialmente llevaba Met queda en el sitio E (de salida). Se produce la entrada de un nuevo aminoácido (alanina [Ala]) en el
sitio A. El proceso se repite con la incorporación de nuevos aminoácidos, completándose la generación de la cadena polipeptídica (7,
8). (Ilustración de: E. Maldonado.)
Terminación
Conforme avanza la elongación, quedan disponibles en el sitio A nuevos codones del ARNm y se añaden nuevos
aminoácidos a la cadena polipeptídica en formación (fig. 9-9, fases 7 y 8) hasta que un codón de parada (UAA, UAG,
UGA) alcanza el sitio A (fig. 9-10, fase 9). Las secuencias de parada en eucariotas son reconocidas por un dominio
específico del factor de terminación eRF3 (eukaryotic release factor 3), que forma un complejo con otro factor de
398
terminación, eRF1. Una vez que este complejo proteico se une al ribosoma, se produce un cambio de conformación en
dicho complejo que permite al factor eRF1 hidrolizar la proteína recién sintetizada y liberarla de su unión con el ARNt
(v. fig. 9-10, fases 10 y 11). Posteriormente, la proteína recién formada y el factor de terminación se desprenden del
ribosoma, terminando así la traduccion. Una vez concluida la síntesis, todavía el ARNt y el ARNm permanecen
unidos al ribosoma. Será necesaria la actuación de un complejo proteico formado por varios factores para su escisión,
aunque el mecanismo exacto por el cual tiene lugar este proceso no se conoce.
FIGURA 9-10 Terminación del proceso de traducción. La aparición de uno de los codones de parada en el sitio A determina la unión de
factores de terminación (9, 10), que favorecerán la liberación del polipéptido (11) y el desensamblaje del ribosoma (12). (Ilustración de: E.
Maldonado.)
La traducción proteica puede ser interrumpida mediante el uso de determinados compuestos químicos, como la
puromicina, cuya estructura es parecida a la de un ARNt unido a un aminoácido. La cicloheximida es otro compuesto
que impide la traducción proteica, ya que inhibe la actividad peptidil-transferasa de los ribosomas 80 S y se utiliza
frecuentemente en experimentos bioquímicos para estudiar procesos celulares en los que se quiere analizar la
ausencia de traducción.
399
La síntesis de proteínas es un proceso vital de todo organismo vivo, por lo que resulta lógica la escasez de
enfermedades relacionadas con la disfunción de la maquinaria encargada de la síntesis proteica, ya que este defecto
resultaría letal. Cualquier alteración significativa en sus componentes suele llevar a la muerte casi inmediata del
individuo, antes incluso de que este rebase la fase embrionaria del desarrollo. No obstante, hay algunas enfermedades
que se asocian con fallos estructurales de proteínas que participan en la traducción. Un ejemplo de este tipo de
patologías es la anemia de Diamond-Blackfan, enfermedad congénita autosómica dominante que se manifiesta
durante el período neonatal. Los individuos afectados sufren una aplasia eritroide (deformación de los eritrocitos que
lleva a una rápida degradación). La mitad de los pacientes sufren síntomas adicionales que incluyen malformaciones
craneofaciales, urogenitales, anomalías en las extremidades y defectos cardíacos, entre otros. Aunque esta patología se
ha asociado a diversas alteraciones moleculares, en la mayor parte de los casos se debe a una mutación en el gen
RPS19, que codifica diversas isoformas de una pequeña proteína ribosómica de entre 88 y 144 aminoácidos que se
integra en la subunidad pequeña del ribosoma. No obstante, no se ha determinado todavía el mecanismo por el que
esta alteración interfiere en el desarrollo normal del linaje eritropoyético y en el resto de las malformaciones descritas
anteriormente.
400
Estructura tridimensional, plegamiento y localización de las
proteínas
Niveles estructurales de las proteínas
La síntesis de la cadena polipeptídica es solo el primer paso para conseguir una proteína funcional. Las proteínas
tienen que plegarse para adquirir una conformación tridimensional propia, que viene determinada por la secuencia de
aminoácidos y por la interacción con otras cadenas polipeptídicas. Además, muchas proteínas necesitan otras
modificaciones posteriores (llamadas modificaciones postraduccionales) para llegar a ser totalmente funcionales,
como son su unión a carbohidratos o lípidos, la adición de determinados grupos químicos (fosfato, GTP, etc.) o sufrir
fenómenos de proteólisis. En cualquier proteína se pueden distinguir tres (o en ocasiones cuatro) niveles de
organización dentro de su estructura (fig. 9-11).
FIGURA 9-11 Estructura primaria y secundaria de las proteínas. La secuencia de aminoácidos propiamente dicha determina la
estructura primaria; las interacciones entre aminoácidos en posiciones contiguas de la cadena polipeptídica dan lugar a la estructura
secundaria, formando hélices α o láminas β. Las estructuras terciaria y cuaternaria se forman a partir de la estructura secundaria (no se
representan en el dibujo). (Ilustración de: E. Maldonado.)
Estructuras primaria y secundaria
La secuencia de aminoácidos propiamente dicha se denomina estructura primaria de la proteína. Las interacciones
entre aminoácidos en posiciones contiguas de la cadena polipeptídica (a través de puentes de hidrógeno) conforman
lo que se denomina la estructura secundaria. Los dos tipos de disposición más frecuentes que se establecen a partir de
dichas interacciones son las hélices α y las láminas β (v. fig. 9-11). En una hélice α, una misma cadena polipeptídica
gira sobre sí misma, dando lugar a una estructura helicoidal. En cambio, las láminas β son cadenas polipeptídicas
agrupadas en un mismo plano y paralelas entre sí, que conforman una estructura plana.
401
Estructura terciaria
La posición tridimensional final que adquiere la proteína, resultado de las interacciones entre las estructuras
secundarias, da lugar a la estructura terciaria. Hay varias estructuras terciarias posibles, que pueden estar formadas
solo por hélices α, solo por láminas β o por combinaciones de ambas. En los dos primeros tipos se forman muchas de
las proteínas de tipo fibroso, mientras que el tercer tipo da lugar a proteínas globulares. Las proteínas fibrosas son
resistentes e insolubles en agua y suelen realizar funciones estructurales. Las proteínas globulares suelen ser solubles
en agua e intervienen en múltiples funciones.
Aunque la conformación final de cada proteína es específica, ciertas combinaciones de hélices α y láminas β se
empaquetan formando unidades comunes a diversas proteínas, cada una de las cuales se denomina dominio proteico.
Las hélices α y láminas β quedan conectadas por «regiones en asa» que protruyen hacia la superficie del dominio. Las
regiones en asa, de longitud variable y superficie irregular, a menudo forman lugares por donde la proteína se une a
otras moléculas. Los dominios son las unidades básicas a partir de las cuales se construyen las proteínas, y existen
numerosas familias de dominios. Mientras que las proteínas más pequeñas pueden presentar un solo dominio, las de
mayor tamaño y complejidad presentan varios, normalmente conectados por cadenas polipeptídicas de longitud
relativamente variable.
Estructura cuaternaria
Finalmente, los polipéptidos individuales se pueden asociar entre sí, constituyendo subunidades de moléculas
mayores, a veces denominadas agregados moleculares o complejos proteicos, en los cuales las distintas subunidades
están unidas entre sí por un elevado número de débiles interacciones no covalentes. Esto corresponde a la estructura
cuaternaria de las proteínas. Un ejemplo de proteína con estructura cuaternaria es la hemoglobina, formada por dos
cadenas polipeptídicas α y dos β.
Plegamiento
Como hemos indicado, a partir de la secuencia de aminoácidos, las cadenas polipeptídicas se pliegan
espontáneamente adoptando una conformación particular para cada proteína. Esto es debido a que los esqueletos de
los diferentes aminoácidos (los grupos R), a modo de cadenas laterales del eje proteico principal, se asocian entre sí y
con las moléculas de H O circundantes, formando enlaces no covalentes débiles. Uno de los factores importantes que
2
condiciona el plegamiento de una proteína es la distribución de sus cadenas polares y no polares. Las cadenas
laterales hidrófobas, muy abundantes, tienden a agruparse en el interior de la molécula, lo cual les permite evitar el
contacto con el entorno acuoso. Por el contrario, las cadenas polares tienden a disponerse cerca de la parte externa de
402
la molécula proteica, donde pueden interactuar con el H O y con otras moléculas polares. De esta manera, se forma un
2
esqueleto fundamental de plegamiento que sirve de base para los ajustes finos posteriores. El plegamiento inicial se
forma rápidamente y de modo espontáneo, de tal manera que los elementos principales (hélices α y láminas β) se
disponen de una forma cercana al plegamiento correcto de la proteína. A este respecto cabe destacar la formación de
puentes disulfuro, que se establecen entre los aminoácidos cisteína de la cadena polipeptídica, ya que es sumamente
importante para el plegamiento y la estabilidad de muchas proteínas. Esta modificación tiene lugar en el RER (donde
hay un ambiente oxidante) y es catalizada por la proteína disulfuro isomerasa (v. capítulo 10).
En el proceso de ajuste fino del plegamiento (un proceso relativamente lento), se pueden producir plegamientos
incorrectos que induzcan una agregación anómala de las proteínas. Para impedir los fenómenos de alteración en el
plegamiento y la consiguiente agregación, la célula utiliza una familia de proteínas denominadas chaperonas. La
función de estas proteínas consiste en ayudar a las proteínas recién sintetizadas a plegarse y ensamblarse en
estructuras estables y activas. Las chaperonas se unen a las regiones hidrófobas expuestas de la proteína en fase de
plegamiento y modifican zonas erróneamente plegadas. Además, estabilizan las proteínas que deben ser
transportadas en forma parcialmente plegada desde el citoplasma a determinados orgánulos (como las mitocondrias)
(v. capítulo 11). La actividad de las chaperonas es indispensable para asegurar un control de calidad de las proteínas
celulares y para mantener la homeostasis proteica. Las chaperonas se identificaron inicialmente como una familia de
proteínas cuya expresión aumentaba al someter a la célula a determinadas condiciones de estrés (como un aumento de
temperatura), por lo que muchas de ellas se llaman proteínas de choque térmico (heat shock proteins, Hsp). Las
estrategias de plegamiento que adopta la maquinaria de chaperonas del organismo se pueden dividir en dos:
• Plegamiento cotraduccional. En eucariotas, un complejo asociado al ribosoma (RAC, del inglés ribosome-associated
complex), formado entre otras proteínas por las chaperonas Hsp40 y 70, se une a la subunidad mayor del ribosoma
con anterioridad a la salida del polipéptido. Desde esta posición, las chaperonas interactúan con los segmentos
enriquecidos en residuos hidrófobos, tan pronto como salen del ribosoma. Conforme un complejo RAC se une a
una primera zona hidrófoba de la proteína que está en fase de síntesis, otro complejo RAC se asocia con la
subunidad mayor y se dispone a unirse a la siguiente porción hidrófoba que surja del ribosoma. De esta manera
se evita una agregación prematura del polipéptido y se permiten su elongación hasta que haya suficiente
información estructural que posibilite un plegamiento adecuado.
• Plegamiento postraduccional. Solo el 20% de las proteínas se pliegan satisfactoriamente durante su síntesis. Si la
proteína necesita rondas de plegamiento adicionales, queda unida a la chaperona Hsp70, que es el organizador
central de la red de plegamiento. Junto con la Hsp90, la Hsp70 se une a las regiones hidrófobas de la proteína en
sucesivas rondas de acoplamiento y desacoplamiento (con consumo de energía en forma de ATP) que permiten
que la proteína intente diferentes plegados hasta alcanzar el conformacionalmente adecuado. Pero existe un
conjunto de proteínas (generalmente las más voluminosas) con patrones de plegamiento muy complejos, debido
a que es necesaria la interacción de dominios proteicos muy alejados entre sí. En estos casos, la proteína Hsp70
403
conduce a estos polipéptidos al sistema chaperonina TRiC/CCT (fig. 9-12). Este sistema consiste en un complejo
multiproteico en forma de barril, en cuyo interior es introducida la proteína en fase de plegamiento, aislándola así
de otras proteínas que pudieran interferir en este proceso, lo que permite que sus dominios puedan interaccionar
libremente, sin peligro de formar agregados, hasta alcanzar la configuración adecuada.
FIGURA 9-12 La proteína Hsp70 es clave en el proceso de plegamiento de las proteínas (con gasto de ATP, omitido en el dibujo). El
plegamiento puede requerir la incorporación de la proteína al complejo multiproteico de la chaperonina (también con gasto de ATP),
para mantenerla aislada del resto de proteínas. (Ilustración de: E. Maldonado.)
Existen chaperonas en la mayoría de los compartimentos celulares, lo cual facilita el transporte de las proteínas a
sus localizaciones funcionales y garantiza un adecuado plegamiento para la consecución de sus actividades. El
incorrecto plegamiento de las proteínas en el RER da lugar a una respuesta de estrés denominada unfolded protein
response (v. capítulo 10).
Un plegamiento erróneo de las proteínas puede dar lugar a diversas patologías. Según se explicó en el capítulo 1,
las encefalopatías espongiformes se deben a un plegamiento defectuoso de la proteína priónica. Los resultados
experimentales indican que la acción patógena de los priones consiste en inducir en las formas sanas de la proteína un
plegamiento alterado mediante un mecanismo todavía desconocido. Este proceso tiene lugar en una reacción en
cadena que acaba por formar agregados proteicos que alteran el funcionamiento normal de las células, causando la
muerte celular.
La proteína priónica normal, denominada PrP tiene 209 aminoácidos, un peso molecular de 36 kDa y una
c
estructura secundaria formada principalmente por α-hélices (fig. 9-13). Su función exacta no se conoce, aunque se
piensa que podría estar implicada en mecanismos de establecimiento de la memoria a largo plazo y de comunicación
intercelular. La forma infecciosa y patógena de la proteína, denominada PrP , aunque posee la misma secuencia de
Sc
aminoácidos que la versión normal, adquiere un plegamiento defectuoso (por causas desconocidas) que genera un
cambio en su estructura secundaria, con un elevado porcentaje de láminas β. El contacto de la proteína PrP con la
Sc
proteína PrP induce un cambio de conformación en la proteína PrP , que provoca que se convierta en patológica
c
c
(PrP ). Las proteínas defectuosas se agregan en una estructura altamente ordenada que precipita en forma de placas.
Sc
El acúmulo de dichas placas provoca la muerte neuronal causando síntomas degenerativos, que incluyen
convulsiones, demencia, ataxia y cambios de comportamiento y personalidad. A pesar de todo lo que se ha avanzado
404
en el estudio de la enfermedad, quedan todavía muchos aspectos por investigar; entre otros, el mecanismo molecular
por el que se desarrolla la neurodegeneración y el mecanismo por el que la proteína priónica PrP consigue cambiar la
Sc
configuración de la proteína sana.
FIGURA 9-13 Esquema de la estructura de plegamiento del prión normal (PrPC), que posee un 43% de su estructura en forma de
hélices α. En cambio, la estructura del prión anormal (PrPsc) posee un plegamiento diferente, con una alta proporción de plegamiento
en láminas β. (Ilustración de: E. Maldonado.)
Transporte y localización de las proteínas
Todas las proteínas empiezan a ser sintetizadas en el citosol, excepto las que son producidas en los ribosomas de las
mitocondrias y de los plastos (en plantas). Su destino final depende de la presencia de una secuencia señal de
aminoácidos, que dirige a las proteínas hacia determinadas localizaciones celulares. Muchas proteínas no presentan
señales de clasificación y, en consecuencia, permanecen en el citosol de modo permanente. En aquellas que presentan
estas señales, se pueden diferenciar dos tipos de secuencias señalizadoras:
• Péptido señal: es una región continua de la secuencia de aminoácidos (entre 15-60 residuos de largo,
normalmente).
• Región señal: la señal está formada por una región estérica de la proteína que incluye varios péptidos señales
que, situados en una disposición tridimensional característica cuando se pliega la proteína, constituyen la región
señal. Los aminoácidos que pertenecen a la región señal pueden estar bastante distantes en la secuencia
polipeptídica, y la región señal solo se forma tras el plegamiento de la proteína madura.
Para determinar las distintas localizaciones celulares se utilizan diferentes tipos de péptido/región señal. Todas las
secuencias señalizadoras de proteínas que tienen el mismo destino son funcionalmente intercambiables, aunque sus
secuencias de aminoácidos pueden variar mucho. Se necesitan péptidos/regiones señales para aquellas proteínas que
405
se vayan a incorporar al interior del núcleo (v. capítulo 7), de las mitocondrias y peroxisomas (v. capítulo 11) y del
RER (v. capítulo 10). Las proteínas cuyo destino final es el núcleo, las mitocondrias o los peroxisomas se incorporan a
estos orgánulos una vez que se ha completado la síntesis proteica en el citosol. La translocación a estos orgánulos es,
por lo tanto, de tipo postraduccional. En cambio, muchas proteínas comienzan su síntesis en el citosol pero, tras
quedar expuesto un péptido señal en el polipéptido naciente durante la traducción proteica, son incorporadas al RER.
Esto implica una parada temporal de la síntesis proteica que continúa más tarde, cuando el ribosoma ha quedado
fijado a la membrana del RER y el polipéptido continúa su traducción, a la vez que se introduce en el interior del RER.
En este caso, la translocación es de tipo cotraduccional, ya que tiene lugar al mismo tiempo que se lleva a cabo la
síntesis de la proteína.
De entre las proteínas que pasan por el RER, la mayoría de ellas serán conducidas (por medio de vesículas) al
aparato de Golgi y, posteriormente, quedarán ancladas a la membrana plasmática o saldrán hacia el exterior celular.
Algunas proteínas permanecen en el RER o en el aparato de Golgi, para lo cual necesitan tener péptidos/regiones
señales específicas que las mantengan en dichos orgánulos, para no continuar así por la vía secretora (v. capítulos 9 y
10).
406
Modificaciones postraduccionales y regulación de la función
proteica
Las proteínas pueden requerir para su correcto funcionamiento la presencia de factores reguladores de carácter
externo, como cofactores, otros complejos proteicos o factores físico-químicos del medio (p. ej., un pH determinado).
Además de estos factores, pueden tener lugar cambios en la propia estructura de la proteína que regulan su actividad
y que se conocen con el nombre de modificaciones postraduccionales. La importancia de estas modificaciones reside
en el hecho de que modifican de modo muy importante la funcionalidad de la proteína, pudiendo cambiar su afinidad
por un sustrato u otras proteínas, activar o inactivar su función catalítica, alterar su localización celular o provocar su
degradación. Se han descrito numerosas formas de modificación postraduccional; a continuación, se describen
aquellas modificaciones más frecuentes y mejor caracterizadas.
Adición de grupos funcionales
Fosforilación/desfosforilación
Consiste en añadir o retirar un grupo fosfato (PO ) a proteínas que contienen serina, tirosina, treonina o histidina,
4
uniendo el fosfato a un grupo hidroxilo de estos residuos. La adición de un grupo fosfato está catalizada por proteínas
quinasas (fig. 9-14) y la eliminación de dicho grupo, por fosfatasas. Por medio de la fosforilación se pueden activar o
inactivar enzimas y modular su capacidad de interacción con otras proteínas. Esta modificación es especialmente
relevante en proteínas que intervienen en fenómenos de señalización celular (v. capítulos 13 y 14).
407
FIGURA 9-14 Ejemplos de modificaciones postraduccionales. A. Fosforilación/desfosforilación de una proteína en un residuo tirosina.
B. Proceso de miristoilación (una de las clases de acilación). (B, ilustración de: E. Maldonado.)
Acetilación/desacetilación
Esta modificación consiste en añadir un grupo acetilo sobre residuos lisina o serina aminoterminales de una proteína.
Las enzimas acetiltransferasas y desacetilasas son las encargadas de catalizar estas reacciones. La
acetilación/desacetilación tiene una gran importancia en las histonas (proteínas que empaquetan el ADN), ya que
regulan su interacción con el ADN y, por lo tanto, el grado de compactación de la cromatina (v. capítulo 7). Esta
modificación también regula la actividad de factores de transcripción, importinas nucleares y la α-tubulina.
Metilación/desmetilación
Mediante reacciones de metilación se añade uno o más grupos metilo a un residuo de lisina o arginina en una cadena
polipeptídica. La reacción química que la lleva a cabo es una metiltransferasa, mientras que la reacción opuesta está
catalizada por una amina oxidasa desmetilasa. La función tal vez más conocida es la que ejerce sobre la modulación
de la expresión génica, a través de la metilación de histonas (v. capítulo 7), aunque también desempeña un papel
importante asegurando la estabilidad de ciertas proteínas.
408
Acilaciones
Es un tipo de modificación por la cual se añade una molécula de carácter lipídico a la proteína, lo que le permite
anclarse a la membrana plasmática por el lado citosólico. Ejemplos de este tipo de modificación son la miristoilación
sobre residuos de lisina o glicina, y la farsenilación o palmitoilación sobre residuos de cisteína (v. fig. 9-14).
Glucosilación
Es uno de los mecanismos de modificación postraduccional más frecuentes y consiste en la adición de un
oligosacárido, o bien sobre el grupo amino de un residuo de asparragina (N-glucosilación, que tiene lugar en el RER),
o sobre el grupo hidroxilo de una serina o una treonina (O-glucosilación, que ocurre en el aparato de Golgi). La
glucosilación se da, por lo tanto, en proteínas que se traducen en el RER y pasan al aparato de Golgi, y desempeña un
papel importante en la estabilidad proteica, en la hidratación de secreciones celulares y en el reconocimiento y
adhesión célula-célula y célula-sustrato (v. capítulos 6 y 10).
Adición de péptidos
A este proceso se le denomina ubiquitinación y se lleva a cabo por medio de una pequeña cadena polipeptídica de 76
aminoácidos denominada «ubiquitina», presente en todas las células eucariotas y que está muy conservada a lo largo
de la evolución. Esta pequeña proteína se une covalentemente a los residuos de lisina de las proteínas, regulando su
actividad de múltiples maneras. La adición de ubiquitina requiere la actividad de una enzima denominada ubiquitina
ligasa. Esta reacción es reversible, y la ubiquitina se puede sustraer de la proteína por la acción de una enzima
denominada «isopeptidasa desubiquitinilante». Una proteína puede ser mono- o poliubiquitinada en una o más
lisinas. La ubiquitinación cambia las propiedades funcionales de la proteína, los sustratos o complejos proteicos con
los que puede interactuar, o incluso la posibilidad de que sea degradada. Generalmente, la poliubiquitinación de una
proteína lleva a su degradación (v. más adelante).
La monoubiquitinación puede influir en la actividad de algunas proteínas celulares. Un tipo similar de modificación
es la adición de SUMO (small ubiquitin-related modifier) o SUMO-ilación, que actúa como marcador de localización y
regulación de algunas proteínas.
Cambio en la naturaleza química de los aminoácidos
La hidroxilación es un tipo de modificación postraduccional donde se añade un grupo hidroxilo al anillo de una
prolina. Esta reacción está catalizada por una prolilhidroxilasa y es de carácter reversible. Es una modificación
409
presente en las moléculas de colágeno que permite dar a las fibras colágenas la consistencia estructural necesaria para
servir de soporte estructural de los tejidos de sostén (v. capítulo 6).
Proteólisis
Por medio de esta modificación, una proteína se escinde en uno o más fragmentos. Generalmente, la escisión suele
producirse de tal manera que se separan dominios completos de la proteína que poseen por sí mismos una identidad
funcional. Esta es una modificación postraduccional de gran importancia por su amplio abanico regulador, ya que
permite la activación de dominios inactivos en la proteína completa (o viceversa), la interacción de estos con
complejos moleculares en localizaciones lejanas a la original y la liberación de péptidos señalizadores (mediante
peptidasas señal). La fragmentación proteica tiene lugar mediante proteólisis, que consiste en la rotura de enlaces
peptídicos en una reacción catalizada por enzimas específicas denominadas proteasas. Existen numerosos tipos de
proteasas que se suelen clasificar en función del agente que cataliza la ruptura del enlace peptídico. Así, se pueden
distinguir proteasas de serina, treonina, cisteína, aspartato, glutámico y metaloproteasas.
Un ejemplo de proteína que debe ser proteolizada para ser funcional es la insulina (fig. 9-15). Esta hormona se
sintetiza como un precursor polipeptídico (preproinsulina) que debe ser fragmentado dos veces. La primera
fragmentación elimina el péptido señal aminoterminal responsable de que la preproinsulina pase al RER para ser
traducida. Además, en el RER se forman tres puentes disulfuros que pliegan la estructura de la molécula. Se forma así
la proinsulina, que es fragmentada de nuevo en el aparato de Golgi y en los gránulos de secreción para dar lugar a dos
cadenas polipeptídicas unidas por puentes disulfuro (insulina madura, de 51 aminoácidos; v. capítulo 10) más el
péptido C de 31 aminoácidos (que era el fragmento conector y que sufre también proteólisis).
FIGURA 9-15 Fragmentación de la insulina. Primeramente, se elimina de la preproinsulina la secuencia señal; en una segunda
proteólisis se forman la proteína madura, que contiene dos cadenas (A y B) unidas por puentes disulfuro, y el polipéptido C (que
corresponde al fragmento conector, que sufre a su vez proteólisis).
Otras proteínas activadas por proteólisis son las enzimas digestivas (que se producen en forma de zimógenos
precursores inactivos), proteínas que participan en la coagulación sanguínea, y proteínas de la familia de las caspasas
(que necesitan proteolizarse para participar en los procesos de apoptosis, como se describe en el capitulo 15).
410
Las alteraciones celulares que conllevan anomalías en la modificación postraduccional y en la adecuada regulación
y función de las proteínas dan lugar a diferentes patologías, entre las que se puede destacar el Alzheimer. La
enfermedad de Alzheimer es una patología neurodegenerativa que se manifiesta en un deterioro cognitivo y
trastornos conductuales. Se caracteriza en su forma típica por una pérdida progresiva de la memoria y de otras
capacidades mentales, a medida que diferentes zonas del cerebro se atrofian por muerte neuronal. Las causas de esta
enfermedad no han sido completamente esclarecidas, aunque existen varias hipótesis que apuntan a defectos en las
modificaciones postraduccionales de dos proteínas: la proteína precursora de amiloide (APP, del inglés amyloid protein
precursor) y la proteína asociada a microtúbulos tau.
La APP es una proteína presente en la membrana plasmática de las neuronas, indispensable para su crecimiento y
supervivencia. Esta proteína puede ser proteolizada por hasta tres enzimas distintas denominadas α, β y γ secretasas.
Existen dos procesamientos posibles de la proteína (fig. 9-16). En el primero interviene la α-secretasa, que libera el
fragmento extracelular al exterior (conocido como sAPPα), el cual posee propiedades neuroprotectoras. En cambio, la
APP puede ser proteolizada secuencialmente por las β- y γ-secretasas, generando así un pequeño péptido de 42
aminoácidos (llamado Aβ ), que es responsable de la formación de las placas amiloides. Estos péptidos se agregan
42
rápidamente entre sí y se depositan sobre la matriz extracelular del tejido nervioso, dando lugar a formaciones
microscópicamente densas conocidas como placas seniles (responsables de muchas de las alteraciones asociadas al
Alzheimer), que pueden crecer continuamente por agregación de nuevos fragmentos Aβ .
42
FIGURA 9-16 Fragmentación de la proteína precursora de amiloide (APP, del inglés amiloid protein precursor). En un primer tipo de
proteólisis interviene la α-secretasa, que libera el fragmento extracelular sAPPα. En cambio, la APP puede ser proteolizada
secuencialmente por la β y la γ secretasas, generando así un pequeño péptido de 42 aminoácidos (llamado Aβ42), que es responsable
de la formación de las placas amiloides del Alzheimer.
La proteína tau es una proteína que, tras ser fosforilada, se une a las moléculas de tubulina que forman los
microtúbulos de las neuronas y los estabiliza, posibilitando así el transporte de vesículas a través de dichos
microtúbulos (v. capítulo 12). Por causas que se desconocen, la proteína tau sufre una hiperfosforilación aberrante
411
durante el desarrollo del Alzheimer, lo que lleva a su separación de la tubulina y a la agregación de las unidades
hiperfosforiladas, formando los llamados ovillos neurofibrilares y provocando la desintegración del sistema de
transporte de la neurona.
Aunque no se sabe con certeza cuál de los defectos en estas dos proteínas puede originar la enfermedad (o cuál es
más decisivo), parece claro que ambos fenómenos provocan la muerte de las neuronas por apoptosis y disparan la
respuesta inflamatoria en el tejido circundante, lo que derivará en daños tisulares de mayor envergadura.
412
Degradación de proteínas
Las proteínas tienen una tasa de recambio cuya velocidad depende de su naturaleza y función, por lo que, además de
sintetizarse, deben destruirse. La vida media de las proteínas es muy variable (desde minutos, hasta días); además, si
las proteínas tienen algún defecto en el plegamiento o están dañadas en su estructura, son reconocidas como
defectuosas y degradadas. Existen dos mecanismos principales degradación, que se exponen a continuación.
Degradación no selectiva
Es la llevada a cabo por las hidrolasas presentes en los lisosomas. Los lisosomas reciclan los constituyentes celulares
(incluidas las proteínas) al fusionarse con vacuolas autofágicas rodeadas de membrana proporcionada por el retículo,
que contienen pequeñas áreas de citoplasma u orgánulos (v. capítulo 10).
Degradación selectiva
Requiere que las proteínas sean marcadas por medio de una modificación postraduccional que se ha comentado con
anterioridad, la poliubiquitinación. Aquellas proteínas que no se pliegan correctamente, o que tienen errores
estructurales, son reconocidas por las chaperonas celulares, activándose entonces el mecanismo de poliubiquitinación.
La ubiquitina se une a la proteína diana mediante la actuación de tres enzimas distintas: a) la enzima activadora de
ubiquitina (E1); b) la enzima conjugadora de ubiquitina (E2), y c) la enzima con actividad ligasa E3. La ubiquitina se
activa primeramente mediante su unión a E1, en un proceso que requiere la hidrólisis de ATP. Posteriormente, se
conjuga con E2 y entonces el complejo E2-ubiquitina se une a E3. El complejo ubiquitina-E2/E3 se une a la proteína
diana, donde la enzima E3 transfiere el grupo ubiquitina a la proteína diana (fig. 9-17). Tras la primera ubiquitinación,
la enzima E2 queda libre y otra enzima E2 unida a ubiquitina entra en su lugar, produciéndose de nuevo la
transferencia de ubiquitina a la proteína diana (mediante la actividad de E3). El proceso se repite varias veces hasta
que se obtiene una proteína diana poliubiquitinada. En una fase posterior, la proteína poliubiquitinada (que queda así
marcada para su degradación) se desprende de E3 y es reconocida por un complejo multiproteico de degradación
denominado proteasoma, que tritura las proteínas en un proceso que requiere energía en forma de ATP. El
proteasoma posee varios tipos de actividades peptidasa que le permiten destruir cualquier proteína. El proceso de
degradación mediante el sistema ubiquitina/proteasoma es importante también para regular el funcionamiento de
algunas actividades celulares. Un ejemplo representativo es la destrucción de las ciclinas durante el ciclo celular. Cada
una de las ciclinas se expresa cíclicamente en una fase concreta del ciclo celular para, después de unirse a su
correspondiente Cdk, favorecer el paso hacia la siguiente fase del ciclo. Tras la actuación de los complejos Cdk-ciclina
es necesario inactivar el sistema, lo que se consigue mediante proteólisis de las ciclinas en el sistema
413
ubiquitina/proteasoma (v. capítulo 14). Muchos tumores presentan una actividad del proteasoma mayor que la de las
células normales, por lo que se han desarrollado inhibidores del proteasoma para el tratamiento del cáncer. Este es el
caso de bortezomib, un inhibidor que se utiliza actualmente para el tratamiento del mieloma múltiple, un tipo de
tumor de células plasmáticas en la médula ósea donde se producen grandes cantidades de inmunoglobulinas y se
genera un importante estrés celular. Uno de los principales efectos de este fármaco es impedir la degradación en el
proteasoma de un factor llamado IkB, cuyo papel es inactivar al factor NF-kB (factor de estrés que promueve el
crecimiento tumoral).
FIGURA 9-17 Degradación de proteínas por el complejo ubiquitina/proteasoma. La ubiquitina se une primeramente a la enzima
activadora E1 (con gasto de ATP), que la transfiere a la enzima conjugadora de ubiquitina E2; la enzima con actividad ligasa E3 se une
tanto al complejo ubiquitina-E2 como a la proteína diana. La poliubiquitinación secuencial, llevada a cabo por la cooperación de las
enzimas E2/E3, marca la proteína para ser reconocida por el complejo multiproteico del proteasoma, donde la proteína diana es
degradada. (Ilustración de: A. Calvo.)
414
Uso biomédico de proteínas recombinantes
Muchas patologías implican alteración, carencia o insuficiencia de algún tipo de proteína. En algunas enfermedades es
posible suministrar al paciente la proteína de la que carece, utilizando la tecnología del ADN recombinante (v.
capítulo 2). Los avances experimentados en el campo de la biología molecular y el conocimiento preciso de la síntesis
y modificación de las proteínas han hecho posible que se puedan sintetizar numerosas proteínas recombinantes,
algunas de las cuales se utilizan ya en clínica, mientras que otras todavía están en fase de ensayo clínico.
Para fabricar proteínas recombinantes es necesario primeramente clonar el gen de interés (habitualmente a través de
la amplificación por PCR), incluirlo en un elemento génico capaz de expresar dicho gen (denominado vector) y,
finalmente, introducir dicho elemento génico en un organismo (como bacterias o células eucariotas) que sea capaz de
expresar el gen y sintetizar la proteína en grandes cantidades. El cultivo a gran escala de estos organismos
proporciona una abundante cantidad de la proteína de interés, que tiene que ser aislada y purificada posteriormente
para poder ser utilizada en clínica.
Varios son los aspectos a tener en cuenta a la hora de generar una proteína recombinante. Se pueden utilizar
diversos organismos que actúan como hospedadores y productores de la proteína objeto de estudio: fagos, bacterias,
levaduras, plantas, hongos y células de insectos o de mamíferos. Cada uno de estos hospedadores y sistemas de
expresión tiene sus ventajas e inconvenientes para producir proteínas humanas. La utilización de células de
organismos distintos a los humanos puede tener consecuencias funcionales, como cambios en la conformación, en las
modificaciones postraduccionales o en la antigenicidad de las proteínas. Adicionalmente, el tipo de organismo influye
en la manera de purificar la proteína y en las sustancias de carácter tóxico que puedan encontrarse como elementos
traza en el proceso de purificación, que pueden condicionar su uso en humanos. Estos son algunos de los aspectos que
habría que considerar para algunos de los organismos más usados en la producción de proteínas:
• Bacterias: no realizan splicing (corte y empalme del ARN) ni tienen lugar muchas de las modificaciones
postraduccionales necesarias para la función de las proteínas humanas (en particular, la glucosilación). El uso de
bacterias ha sido el modo tradicional de obtener grandes cantidades de proteínas para su purificación, por lo que
hay mucha experiencia técnica al respecto.
• Levaduras: sí realizan glucosilación, pero las cadenas glucídicas son distintas a las de las células humanas.
• Células de insectos: ofrecen la ventaja de que el vector se puede introducir en la célula mediante baculovirus, que
infectan específicamente células de insectos. Se obtienen también proteínas glucosiladas, pero distintas a las
humanas. Muchas veces se buscan mutantes que sean capaces de glucosilar las proteínas de forma parecida a los
humanos.
• Células de mamíferos: el problema de la glucosilación estaría solucionado. El inconveniente principal de utilizar
células de mamíferos es que suelen ser cultivos lentos y de bajo rendimiento.
415
Un ejemplo de proteína recombinante utilizada en clínica es la insulina. Esta hormona, responsable de la captación
de glucosa por parte de los tejidos (en concreto, el músculo esquelético y el tejido adiposo) para normalizar la
glucemia, no se produce en pacientes con diabetes mellitus de tipo I, ya que en esta enfermedad hay una destrucción
autoinmune de las células β del páncreas. Hasta los años sesenta del pasado siglo, el único tipo de insulina disponible
para el tratamiento de la diabetes era la purificada a partir de páncreas de animales. Poco más tarde, Herbert Boyer
consiguió elaborar por primera vez insulina mediante ingeniería genética (tecnología del ADN recombinante) en
bacterias. Desde ese momento se han mejorado mucho las técnicas de síntesis y la oferta de insulina recombinante.
Otras proteínas recombinantes utilizadas actualmente en clínica son factores de coagulación (para el tratamiento de la
hemofilia), eritropoyetina (anemia), glucocerebrosidasa (enfermedad de Gaucher), hormona del crecimiento
(enanismo) e interferón α (tratamiento de enfermedad crónica granulomatosa o determinadas neoplasias).
Lecturas recomendadas
Ciechanover A. Proteolysis: from the Iysosome to ubiquitin and proteasome. Nat Rev Mol Cell Biol. 2005;6:79–86.
Citron M. Alzheimer’s disease: strategies for disease modification. Nature Reviews in Drug Discovery. 2010;9:387–398.
Kupfer L, Hinrichs W, Groschup MH. Prion Protein Misfolding. Curr Mol Med. 2009;9:826–835.
Mathews CK, Van Holde KE, Ahern KG. Bioquímica. 3.ª ed. Madrid: Addison Wesley; 2002.
Ramakrishnan V. Ribosome Structure and the Mechanism of Traslation. Cell. 2002;108:557–572.
Seet BT, Dikic I, Zhou MM, Pawson T. Reading proteins modifications with interaction domains. Nat Rev Mol Cell Biol. 2006;7:473–483.
Sims RJ, Reinberg D. Is there a code embedded in proteins that is based on post-translational modifications? Nat Rev Mol Cell Biol. 2008;9:1–6.
Steitz TA. A structural understanding of the dynamic ribosome machine. Nat Rev Mol Cell Biol. 2008;9:242–253.
Ulrich-Hartl F, Hayer-Hartl M. Converging concepts of protein folding in vitro and in vivo. Nat Struct Mol Biol. 2009;16(69):574–581.
Ye Y, Rape M. Building ubiquitin chains: E2 enzymes at work. Nat Rev Mol Cell Biol. 2009;10:755–764.
Preguntas de autoevaluación
1. Para formar el enlace peptídico que une dos aminoácidos:
a. Se unen las dos cadenas laterales de los aminoácidos.
b. Se une el grupo amino de un aminoácido con el grupo carboxilo del otro.
416
c. Se une el grupo amino de un aminoácido con la cadena lateral del otro.
d. Se unen los dos grupos carboxilos de los aminoácidos entre sí.
e. Se unen los dos grupos aminos de los aminoácidos entre sí.
Respuesta correcta: b.
2. Señale la opción verdadera:
a. La cola poli-A se añade en el extremo 5’ del ARNm.
b. La subunidad mayor del ribosoma de eucariotas contiene un único ARN ribosómico.
c. La subunidad menor del ribosoma de eucariotas contiene dos ARN ribosómicos.
d. El brazo dihidrouridina del ARNt es el encargado de anclar el aminoácido.
e. Todas las anteriores son falsas.
Respuesta correcta: e.
3. Respecto al código genético:
a. Existen más codones disponibles que aminoácidos posibles.
b. Existen más aminoácidos posibles que codones disponibles.
c. El número de codones disponibles es exactamente igual al de aminoácidos posibles.
d. El número de aminoácidos disponibles es igual al de todos los codones disponibles, excepto los codones de
parada.
e. Todas las anteriores son falsas.
Respuesta correcta: a.
4. Señale la opción verdadera:
a. El ARNt que transporta el aminoácido que se va a añadir a la cadena polipeptídica en síntesis se sitúa en el sitio P
del ribosoma.
b. El ARNt despojado de la cadena polipeptídica se sitúa en el sitio E del ribosoma.
c. La hidrólisis del GTP que transporta el factor eEF1A se produce una vez que el nuevo aminoácido se ha unido a
la cadena polipeptídica en síntesis.
d. La translocación del ribosoma que permite liberar el sitio A durante el proceso de elongación de la síntesis
proteica no necesita consumo de energía.
417
e. Todas las anteriores son verdaderas.
Respuesta correcta: b.
5. Respecto al plegamiento de proteínas:
a. Las cadenas laterales polares tienden a agruparse en el interior de la molécula.
b. Dos de los esquemas más frecuentes en la estructura cuaternaria de las proteínas son las hélices α y las láminas β.
c. En el plegamiento cotraduccional la proteína Hsp70 conduce a los polipéptidos en proceso de plegamiento al
sistema chaperonina TRiC/CCT.
d. La chaperona Hsp70 desempeña un papel fundamental en todos los tipos de plegamiento.
e. Todas las anteriores son verdaderas.
Respuesta correcta: d.
6. La proteína Prp tiene:
sc
a. Un alto porcentaje de plegamiento en forma de hélice α.
b. Un alto porcentaje de plegamiento en forma de lámina β.
c. Un porcentaje similar entre hélices α y láminas β.
d. No posee hélices α ni láminas β.
e. Un plegamiento similar a la proteína Prp .
c
Respuesta correcta: c.
7. Señale el aminoácido que no puede experimentar una fosforilación:
a. Serina.
b. Tirosina.
c. Glutamina.
d. Treonina.
e. Histidina.
Respuesta correcta: c.
8. Señale el aminoácido que puede ser objeto de todas las siguientes modificaciones postraduccionales: acetilación,
metilación, acilación y ubiquitinación.
a. Serina.
418
b. Lisina.
c. Tirosina.
d. Arginina.
e. Triptófano.
Respuesta correcta: b.
9. Señale el enunciado verdadero:
a. El péptido Aβ es el responsable de la formación de las placas amiloides y es generado por la acción de las α y β
42
secretasas.
b. El péptido Aβ es el responsable de la formación de las placas amiloides y es generado por la acción de las α y γ
42
secretasas.
c. El péptido Aβ es el responsable de la formación de las placas amiloides y es generado por la acción de las β y γ
42
secretasas.
d. El péptido Aβ es el responsable de la formación de las placas amiloides y es generado tras la metilación de la
42
proteína precursora amiloide.
e. El péptido Aβ no es responsable de la formación de las placas amiloides.
42
Respuesta correcta: c.
10. La proteína tau está asociada al desarrollo del Alzheimer porque:
a. Está mutada en esta enfermedad, por lo que no tiene actividad.
b. Está hiperactivada en esta enfermedad.
c. Está hiperfosforilada, lo que provoca agregación proteica.
d. Está hiperglucosilada, lo que provoca un plegamiento anormal.
e. Tiene alterada la secuencia señal, por lo que, en vez de localizarse en el citoplasma, se localiza en el núcleo.
Respuesta correcta: c.
419
CAPÍTULO 10
420
Sistema de endomembranas celulares: retículo
endoplasmático, aparato de Golgi y lisosomas
María Ángela Burrell
Alfonso Calvo
Objetivos de aprendizaje
• Tener una visión general de las vías de transporte de macromoléculas en la célula eucariota.
• Conocer la estructura y la función del retículo endoplasmático, el aparato de Golgi y los lisosomas.
• Ser capaz de describir las rutas biosintéticas de las proteínas y las vías de transporte hacia su destino celular
concreto.
• Conocer algunos tipos celulares representativos que muestran un especial desarrollo de los distintos elementos
de la vía biosintética-secretora.
• Conocer ejemplos de enfermedades cuyo origen está en alteraciones en los distintos compartimentos del sistema
de endomembranas.
421
Introducción
Las células eucariotas, a diferencia de las procariotas, poseen una serie de membranas internas que definen unos
compartimentos membranosos con una morfología y función determinadas. Esta red de compartimentos requiere un
complejo sistema de transporte que hace posible el movimiento de moléculas de unos a otros. Estos compartimentos
membranosos (u orgánulos) son el retículo endoplasmático (o endoplásmico), con sus componentes rugoso y liso, el
aparato de Golgi y los lisosomas. Las funciones de estos orgánulos (a excepción del retículo endoplasmático liso
[REL]) están relacionadas con la síntesis, procesamiento, tráfico y localización de una gran parte de las proteínas
celulares. El REL, por su parte, juega un papel clave en la síntesis de lípidos, por lo que provee de elementos de
membrana al resto de los compartimentos celulares.
422
Retículo endoplasmático rugoso
Estructura y composición
El retículo endoplasmático rugoso (RER) es una red interconectada de sáculos (o cisternas) aplanados y túbulos
membranosos con ribosomas adheridos a su superficie (fig. 10-1). Estos sáculos se conectan con la envoltura nuclear y
también con el REL. En cortes de microscopía electrónica los sáculos aparecen como «perfiles» (cuyo interior
denominamos «luz»), que presentan normalmente un grosor aproximado de 20 a 30 nm, aunque en ocasiones pueden
aparecer muy dilatados (p. ej., en las células plasmáticas). Claude, Porter y Fulham realizaron en 1945 las primeras
descripciones del RER al microscopio electrónico, que fueron completadas posteriormente por Sjöstrand, Palade y
Porter, quienes, además, relacionaron este orgánulo con la síntesis de proteínas.
FIGURA 10-1 Morfología del RER. A. Representación esquemática del RER. B. Electronografía en la que el RER aparece cortado en
distintas orientaciones: perpendicularmente (flecha gruesa) y tangencialmente (flecha fina). (A, ilustración de E. Maldonado y A. Calvo; B, imagen por
cortesía de: Departamento de Histología y A.P. Universidad de Navarra.)
El RER está presente en todas las células nucleadas (exceptuando los espermatozoides) y está especialmente
desarrollado en células con una elevada síntesis proteica. En una célula pancreática exocrina, el RER puede llegar a
constituir hasta el 20% del volumen celular. Las células con abundante RER presentan la propiedad llamada basofilia
citoplasmática, que consiste en la apetencia por los colorantes básicos que presentan ciertas áreas del citoplasma
celular. La basofilia citoplasmática se corresponde con zonas de abundancia del ARN de los ribosomas libres en el
citosol o presentes en el RER. De acuerdo con la disposición de ese componente basófilo, se distinguen tres tipos de
basofilia (fig. 10-2):
• Basofilia difusa, cuando prácticamente todo el citoplasma es basófilo. Es frecuente observar una zona no basófila,
que corresponde al aparato de Golgi y se suele denominar «zona Golgi negativa». Un ejemplo de basofilia difusa
es la que presentan las células plasmáticas.
• Basofilia basal: en este caso, la basofilia se presenta en la zona basal de la célula; esta disposición es muy común en
células epiteliales secretoras que poseen gran cantidad de RER en el citoplasma basal. Ejemplos de este tipo de
basofilia los encontramos en células epiteliales del páncreas exocrino y en células epiteliales de las glándulas
salivales.
423
• Basofilia en grumos: el componente basófilo aparece en grumos o paquetes, que corresponden a zonas de acúmulo
de RER o ribosomas libres. Esta basofilia es típica de hepatocitos y neuronas (las zonas basófilas en este último
tipo celular corresponden a los grumos o cuerpos de Nissl).
FIGURA 10-2 Basofilia citoplasmática. Dibujos esquemáticos que muestran cómo se observaría la basofilia en microscopía óptica
(dibujos de la izquierda) y electrónica (dibujos centrales). En la parte derecha se muestran imágenes de microscopía óptica
representativas de cada uno de los tipos de basofilia. A. Basofilia difusa en células plasmáticas (tinción de verde metilo pironina). B.
Basofilia basal en acinos pancreáticos (tinción de hematoxilina-eosina). C. Basofilia en grumos en hepatocitos (tinción de hematoxilinaeosina). (Ilustración de: E. Maldonado y A. Calvo.)
Los estudios funcionales de los años sesenta del siglo pasado demostraron que el RER estaba involucrado en la
síntesis y distribución de proteínas. Mediante el uso de aminoácidos radiactivos y técnicas de autorradiografía en
células acinares pancreáticas, se comprobó que los aminoácidos añadidos a las células se incorporaban a proteínas
primeramente en el RER. Tiempos de incubación mayores revelaban que las proteínas se habían desplazado al aparato
de Golgi, posteriormente a vesículas de secreción y, finalmente, eran secretadas al exterior celular. Por lo tanto, estos
experimentos mostraron la presencia de una ruta sintética y secretora de proteínas que pasaban del RER al Golgi y
luego a la membrana plasmática y al exterior celular.
Experimentos de fraccionamiento celular y centrifugación diferencial (v. capítulo 2) lograron aislar fragmentos del
retículo endoplasmático que, tras la centrifugación, se encuentran en la fracción microsómica (fig. 10-3). Cuando las
células se rompen durante el proceso de centrifugación, el retículo se fragmenta en vesículas de pequeño tamaño (de
aproximadamente 100 nm de diámetro) denominadas microsomas. Los microsomas constituyen un instrumento muy
útil para los estudios bioquímicos y funcionales del RER y han permitido conocer muchos aspectos de sus funciones.
Los microsomas incluyen fragmentos tanto de RER como de REL, pero ambos tipos de microsomas pueden separarse
mediante una centrifugación en gradiente de sacarosa.
424
FIGURA 10-3 A. Obtención de la fracción microsómica mediante fraccionamiento celular y centrifugación diferencial. B.
Representación de cómo las cisternas del RER se fragmentan tras el fraccionamiento celular y se forman los microsomas rugosos.
(Ilustración de: E. Maldonado y A. Calvo.)
La membrana del RER presenta la típica estructura trilaminar de las membranas celulares y su grosor es de unos 5-6
nm, es decir, algo menor que la que presenta la membrana plasmática. Posee algunas diferencias en composición con
las otras membranas celulares, pues contiene un mayor porcentaje de lípidos y una serie de proteínas exclusivas de
este orgánulo. Entre estas últimas cabe señalar las proteínas que permiten la unión de los ribosomas y la translocación
de las proteínas hacia su luz. Además, el interior del RER posee toda una serie de proteínas propias de este orgánulo,
como enzimas relacionadas con la glucosilación de proteínas, peptidasas, isomerasa de puentes disulfuro y
chaperonas (binding protein [BiP], calnexina y calreticulina).
Traducción de proteínas en el RER
Las proteínas celulares pueden traducirse completamente en ribosomas libres presentes en el citosol o comenzar su
traducción en ribosomas citosólicos pero continuarla en el RER. Esta diferencia marca el destino de las proteínas, ya
que aquellas cuya síntesis pasa por el RER irán destinadas a permanecer en este mismo orgánulo, en el aparato de
Golgi, en los lisosomas o en la membrana plasmática, o bien serán secretadas al exterior celular. En cambio, las
proteínas que sean traducidas completamente en el citosol podrán permanecer en el citosol o ser incorporadas
posteriormente al núcleo, mitocondrias o peroxisomas. Como la incorporación de estas proteínas a sus orgánulos
diana tiene lugar una vez que la proteína ha sido completamente traducida, se habla de una importación
postraduccional. En cambio, los ribosomas que se adhieren a la membrana del RER sintetizan las proteínas a la vez
que estas se van incorporando al RER, por lo que se habla de una importación cotraduccional.
Las proteínas que van a ser traducidas en el RER presentan un péptido señal de 16 a 30 residuos situado en la
región N-terminal, producto de la traducción de un conjunto de codones señal presentes en el ARNm que codifica
425
para estas proteínas. La teoría sobre cómo tiene lugar el proceso de traducción e incorporación simultánea de las
proteínas al RER fue elaborada en los años setenta del siglo pasado y se denominó «hipótesis de la señal»; ha sido
verificada y completada con muchos otros experimentos posteriores. La existencia de señales peptídicas en las
proteínas, responsables de su incorporación a compartimentos celulares específicos, se comprobó también en el caso
del núcleo, las mitocondrias, los cloroplastos y los peroxisomas.
¿Cómo tiene lugar la traducción e incorporación simultánea de proteínas en el RER? Se pueden distinguir varias
etapas secuenciales (fig. 10-4):
Paso 1: la traducción comienza en ribosomas libres. Cuando en el extremo N-terminal de la proteína en formación
aparece el péptido señal que indica que la proteína debe ser traducida en el RER, ese péptido es reconocido por
la partícula reconocedora de la señal (PRS). La PRS está formada por una molécula de ARN y seis proteínas, y
consta de varios dominios (de unión al péptido señal, de parada de la traducción, de unión al ribosoma y de
unión a GTP).
Paso 2: la unión de la PRS al ribosoma provoca una parada en la traducción y causa un cambio de conformación en
PRS que le permite ser reconocida y unirse a su receptor en la membrana del RER. El complejo ribosoma/PRS y
su receptor interactúan entonces con un translocador, un complejo proteico que permitirá el paso de la proteína
en formación hacia la luz del RER.
Paso 3: el translocador se abre y continúa la síntesis proteica, pero el péptido señal queda anclado en la región
interna del translocador mediante interacciones proteicas, por lo que no pasa al interior del RER. La proteína en
síntesis va atravesando el translocador y penetrando hacia el interior del RER. Se produce la hidrólisis de GTP y,
como consecuencia, cambios conformacionales que hacen que se libere la PRS.
Paso 4: una peptidasa señal, que está asociada a la cara interna de la membrana, corta el péptido señal de la proteína
que se está incorporando al RER.
Paso 5: se continúa la traducción de la proteína, que quedará en la luz del RER.
FIGURA 10-4 Síntesis e importación cotraduccional de proteínas en el RER. PRS, partícula reconocedora de la señal. (Ilustración de: E.
Maldonado y A. Calvo.)
426
Localización y orientación de las proteínas en el RER
Este mecanismo de incorporación que acabamos de explicar no es en realidad un mecanismo común a todas las
proteínas que se traducen en el RER, ya que las proteínas que quedan situadas en la membrana de este orgánulo
poseen señales hidrófobas que les permiten anclarse a la bicapa lipídica (fig. 10-5). En efecto, algunas proteínas
poseen, además del péptido señal en el dominio N-terminal, una secuencia de parada de la transferencia en una
región interna de la proteína. Esta secuencia consiste en un grupo de aminoácidos de naturaleza hidrófoba
(constituido por unos 20-25 aminoácidos) que impide que la proteína continúe translocándose hacia la luz del RER. En
este caso, la proteína continúa traduciéndose, pero la región proteica que queda por detrás de la secuencia de parada
de la transferencia quedará orientada hacia el lado citoplasmático. Por lo tanto, una vez que finalice la traducción se
obtendrá una proteína anclada a la membrana del RER con su extremo N-terminal orientado hacia la luz y su extremo
carboxilo (C-terminal) hacia el citoplasma (v. fig. 10-5).
FIGURA 10-5 Proceso de síntesis e inserción en la membrana del RER de una proteína de paso único en la que el extremo carboxilo
terminal queda orientado hacia el lado citoplasmático. (Ilustración de: E. Maldonado y A. Calvo.)
Pero hay proteínas que se orientan en la membrana de otra manera, con el extremo N-terminal hacia el citosol o los
dos extremos hacia el mismo lado, o incluso hay proteínas que atraviesan varias veces la membrana del RER. Para
conseguir estas orientaciones se precisan diversas estrategias consistentes en una o varias secuencias de inicio de la
translocación y de parada de la transferencia. Algunas proteínas tienen la secuencia señal de inicio situada en una
zona interna de la proteína, en vez de en su dominio N-terminal. En este caso, el ribosoma que la traduce solo se
incorporará al RER cuando aparezca esta señal, lo cual va a determinar que el extremo N-terminal quede en el lado
citoplasmático cuando comienza su translocación a través de la membrana del RER. La traducción de la proteína
continúa de tal manera que su extremo carboxilo queda situado en el lado luminal del RER (fig. 10-6). En este caso no
hay una escisión de la secuencia señal por parte de la peptidasa señal, quedando así la proteína embebida en la
membrana con la señal hidrófoba inmersa en la misma. Las secuencias internas de las proteínas pueden disponerse de
tal modo que dirijan la translocación orientando el extremo N-terminal hacia el lado citoplasmático o hacia el lado
luminal del RER, lo que permitirá una conformación diferente de la proteína en la membrana. Mediante la redirección
de las secuencias señales de inicio de la translocación y secuencias de parada, las proteínas se pueden orientar además
con los dos extremos (N- y C-) terminales hacia el mismo compartimento (ya sea el luminal o el citosólico). La
427
presencia de varias secuencias señal de inicio de la translocación y varias secuencias de parada de transferencia
permite la existencia de proteínas que atraviesan múltiples veces la membrana del RER (fig. 10-7).
FIGURA 10-6 Proceso de síntesis e inserción en la membrana del RER de una proteína de paso único en la que el extremo N-terminal
queda orientado hacia el lado citoplasmático. (Ilustración de: E. Maldonado y A. Calvo.)
FIGURA 10-7 Tipos de orientaciones de las proteínas en la membrana del RER y ejemplos de proteínas de cada tipo. (Ilustración de: E.
Maldonado y A. Calvo.)
Modificaciones postraduccionales
Las proteínas traducidas en el RER deben adquirir su conformación final para que sean perfectamente funcionales.
Esta conformación implica un correcto plegamiento de la proteína y una serie de modificaciones postraduccionales en
el interior del RER (glucosilación, fragmentación y formación de enlaces disulfuro). De las proteínas celulares, solo
aquellas que pasen por el RER estarán glucosiladas, lo cual no quiere decir que todas las proteínas que se traduzcan
en este orgánulo vayan a sufrir glucosilación (aunque sí la mayoría). La glucosilación es un proceso que comienza en
el RER y finaliza en el aparato de Golgi. Ambos orgánulos poseen enzimas capaces de transferir azúcares a las
proteínas, o de eliminar algunos de ellos para dar lugar a cadenas de oligosacáridos específicos para cada proteína. La
glucosilación es una modificación importante, ya que algunas proteínas requieren ser glucosiladas para poderse
plegar correctamente en el RER; además, la glucosilación impide la agregación de las proteínas.
428
Todas las proteínas glucosiladas en el RER (fig. 10-8) sufren inicialmente una transferencia en bloque de un
oligosacárido de 14 residuos: 3 de glucosa, 9 de manosa y 2 de N-acetilglucosamina, catalizada por una transferasa de
oligosacáridos. El oligosacárido se ha formado previamente en el lado citosólico de la membrana del RER mediante la
actividad de diversas enzimas que construyen la cadena de azúcares sobre un lípido de membrana llamado dolicoldifosfato. Una vez que se ha construido el oligosacárido de 14 azúcares, se produce una translocación de la cadena
glucídica desde el lado citoplasmático hasta el lado luminal del RER. La transferencia del oligosacárido a la proteína
tiene lugar sobre un aminoácido asparragina (Asn) que se encuentre en una secuencia Asn-X-Ser/Thr (donde X puede
corresponder a cualquier aminoácido; Ser: serina; Thr: treonina). Tras la transferencia del oligosacárido se produce un
procesamiento, que consiste en la eliminación de algunos azúcares: primero un residuo de glucosa, luego otros dos de
glucosa y uno de manosa, catalizados por glucosidasas y manosidasas, respectivamente. Posteriormente este
oligosacárido será modificado en el aparato de Golgi.
FIGURA 10-8 Glucosilación de proteínas en el RER. Un oligosacárido de 14 residuos de azúcares se transfiere en bloque a la proteína
naciente. Tras la transferencia se produce la eliminación de algunos residuos. (Ilustración de: E. Maldonado y A. Calvo.)
La correcta formación de una estructura tridimensional (o correcto plegamiento) por parte de las proteínas es un
fenómeno de gran importancia, para el que el RER cuenta con la participación de:
• Enzimas, como la isomerasa de puentes disulfuro.
• Chaperonas como la BiP, la calnexina (proteína de membrana) y la calreticulina (soluble), dependientes de Ca ;
2+
son lectinas que se unen a proteínas incompletamente plegadas, reteniéndolas en el RER.
La formación de puentes disulfuro (S-S) contribuye a la adquisición de la correcta estructura de la proteína. En las
proteínas de la luz del RER se forman enlaces disulfuro por la pérdida de dos electrones de grupos SH de cisteínas.
Los electrones se transfieren desde la proteína a un enlace disulfuro de la enzima isomerasa de puentes disulfuro
(PDI) y esta, a su vez, los transfiere a la proteína Ero1. La formación de puentes disulfuro es importante para el
correcto plegamiento de las proteínas y la adquisición de una adecuada conformación tridimensional. Esta
modificación proteica tiene lugar en el RER debido al ambiente oxidante que promueve la formación de uniones S-S, a
diferencia del ambiente reductor que caracteriza al citosol.
429
El plegamiento de proteínas en el RER es un proceso complejo no del todo conocido. En él, las chaperonas y
enzimas de procesamiento proteico actúan como sensores capaces de detectar proteínas mal plegadas para expulsarlas
al citosol, con el fin de que puedan ser degradadas. La chaperona BiP (también llamada «HSP-70», o heat shock protein70) se une a la proteína naciente en el interior del RER para favorecer su correcto plegamiento (fig. 10-9). Tras la
eliminación de las dos primeras moléculas de glucosa del oligosacárido, las proteínas del RER se unen a calreticulina,
que favorece el plegamiento y elimina el tercer residuo de glucosa. Entonces, la proteína es reconocida por «sensores
de plegamiento», tras cuya interacción puede ocurrir lo siguiente: a) que esté correctamente plegada y continúe su
ruta normal; b) que esté incorrectamente plegada y sea reglucosilada para volver a ser reconocida por la calreticulina e
intentar de nuevo el plegamiento, o c) que la falta de plegamiento no se pueda resolver y sea enviada fuera del RER
(mediante retrotranslocación) para que sea destruida. Este proceso implica su desglucosilación mediante una Nglucanasa, ubiquitinación y proteólisis en el proteasoma (fig. 10-10).
FIGURA 10-9 Participación de distintas proteínas (BiP, calnexina, calreticulina y PDI) en el plegamiento de una proteína recién
sintetizada en el RER. (Ilustración de: E. Maldonado y A. Calvo.)
FIGURA 10-10 Degradación en el proteasoma de proteínas plegadas incorrectamente en el RER. (Ilustración de: E. Maldonado y A. Calvo.)
En condiciones de estrés celular, provocado por hipertermia, hipoxia o ayuno (entre otros), se produce la
acumulación de proteínas mal plegadas en el RER. En esta situación se desencadena una respuesta celular
denominada unfolded protein response (UPR), o respuesta ante proteínas mal plegadas, que implica el aumento de la
transcripción de genes que codifican para chaperonas del RER y para proteínas implicadas en la retrotranslocación al
430
citosol, y finalmente la degradación de las proteínas mal plegadas. En este proceso, la chaperona BiP actúa como
sensor del estado general del plegamiento proteico, induciendo la UPR.
Hay evidencias de que el estrés en el RER está implicado en algunas enfermedades neurodegenerativas como el
Alzheimer, el Parkinson, el cáncer, la obesidad y la diabetes. Estas enfermedades se asocian al mal plegamiento de
proteínas, y en ocasiones se pueden observar los acúmulos de proteínas mal plegadas, bien en la luz del RER
(formando los denominados «cuerpos de Russell») o bien en el citosol, como un material amorfo denso sin membrana
limitante, denominado «agresoma».
Algunas proteínas del RER sufren también otro tipo de modificaciones que consisten en la unión a glucolípidos de
membrana. Estos glucolípidos contienen fosfatidilinositol, por lo que las uniones se llaman anclajes de
glucofosfatidilinositol (GPI, del inglés, glycoposphatidyl inositol). Los GPI contienen los dos ácidos grasos embebidos en
la membrana del RER, inositol (junto con otros azúcares) y etanolamina. La transferencia de la proteína al GPI forma
una unión que deja a dicha proteína anclada a la membrana por este tipo de glucolípido.
Determinadas proteínas traducidas en el RER permanecen en este orgánulo (proteínas residentes), bien en la
membrana o en la luz, ya que presentan secuencias señal específicas que son reconocidas por receptores. El resto
deben ser transportadas hacia los distintos componentes del sistema de endomembranas y hacia la membrana
plasmática, lo que implica su paso por el aparato de Golgi. Para ello, a partir del RER se forman unas estructuras
tubulovesiculares lisas (elementos de transición) que se fusionarán con las cisternas de la cara Cis del aparato de
Golgi, donde continúa su proceso de maduración, como se verá más adelante.
431
Retículo endoplasmático liso
El REL está constituido por un conjunto de estructuras membranosas, esencialmente tubulares, sin ribosomas
adosados, y se diferencia del RER tanto en su morfología y composición, como en su función (fig. 10-11). Aunque
existen diferencias morfológicas y funcionales entre ambos retículos, se encuentran interconectados entre sí, formando
una estructura o compartimento en contigüidad de membrana. Entre las características del REL que le diferencian del
RER podemos citar:
• No presenta ribosomas.
• Los elementos membranosos son fundamentalmente túbulos (no sáculos).
• Posee una composición distinta de la membrana (con diferencias en sus proteínas y con mayor porcentaje de
lípidos).
• Sus funciones están relacionadas principalmente con la síntesis de lípidos y derivados lipídicos.
• Es abundante solo en células especializadas (hepatocitos, células secretoras de hormonas esteroideas, células
musculares, etc.).
432
FIGURA 10-11 A. Dibujo esquemático de la estructura del REL y su relación con el RER. B. Electronografía en la que aparece el REL
muy desarrollado en un hepatocito. Flecha: REL. M, mitocondria. (B, reproducida a partir de: Burrell MA et al. Atlas de ultraestructura celular. Pamplona:
EUNSA; 2011.)
El REL ejerce numerosas funciones en la célula, fundamentalmente relacionadas con la síntesis de lípidos, que sirve
para incrementar o reponer los elementos de membrana de distintos orgánulos y de la membrana plasmática. Se
resumen a continuación sus funciones.
Funciones
Síntesis de lípidos y derivados lipídicos
433
En todas las células debe llevarse a cabo la síntesis de fosfolípidos y colesterol para renovar las membranas celulares,
función que lleva a cabo este orgánulo. Además, hay células especializadas del organismo en las cuales el REL es muy
abundante; en estas células tiene lugar la síntesis de determinados lípidos o derivados lipídicos.
La síntesis lipídica se desarrolla en varias fases (fig. 10-12). En la primera, que tiene lugar en el citoplasma, dos
ácidos grasos unidos a coenzima A (CoA) se unen al glicerol 3-fosfato, formando el ácido fosfatídico, que se inserta
entonces en la membrana del REL. Posteriormente, una fosfatasa convierte el ácido fosfatídico en diacilglicerol (DAG).
En una tercera fase se produce la unión de los diferentes grupos de cabeza polares al DAG, formándose así la
fosfatidilcolina, fosfatidiletanolamina y fosfatidilserina. El fosfatidilinositol se genera a partir del ácido fosfatídico, en
vez de hacerlo a partir del DAG. En el REL también se sintetizan el colesterol y la ceramida, que van a ser
componentes de las membranas, junto con los glicerofosfolípidos. La ceramida dará lugar a glucolípidos y a la
esfingomielina en el aparato de Golgi (v. capítulo 3), donde se completará la formación de estos lípidos de membrana.
Tanto el colesterol como la esfingomielina formarán parte de las balsas lipídicas o rafts, descritas en el capítulo 3.
FIGURA 10-12 Síntesis de fosfolípidos en el REL. Las aciltransferasas (1) forman ácido fosfatídico, cuyas dos cadenas
hidrocarbonadas quedan ancladas a la membrana. Una fosfatasa (2) convierte el ácido fosfatídico en diacilglicerol. La fosfotransferasa
de colina (3) transfiere la cabeza polar (en este caso, la fosforilcolina). Una escramblasa (4) cataliza el paso del fosfolípido de una
hemimembrana a la otra. CMP: citidina monofosfato colina; CTD: citidina difosfato colina. (Ilustración de: E. Maldonado y A. Calvo.)
La síntesis de lípidos tiene lugar en la hemimembrana citosólica del retículo endoplasmático, de tal modo que la
adición de moléculas lipídicas solo tendría lugar en ese lado de la membrana. Para redistribuir los lípidos en ambas
hemimembranas y establecer la asimetría que la caracteriza en cuanto a su composición (v. capítulo 3) se necesita de la
actuación de unas enzimas llamadas escramblasas, que catalizan el paso, energéticamente desfavorable, de los grupos
polares de los lípidos de un lado al otro de la membrana (v. capítulo 3). Los lípidos sintetizados en el REL serán
distribuidos mediante transporte vesicular a los distintos compartimentos membranosos (RER, aparato de Golgi,
lisosomas) y a la membrana plasmática. Para su transporte a mitocondrias y peroxisomas se requieren proteínas
citosólicas intercambiadoras de fosfolípidos.
Por su función en la síntesis de lípidos, el REL contribuye también de modo muy importante en la formación de
lipoproteínas, ácidos biliares y hormonas esteroideas. Los enterocitos contienen RER y REL que contribuyen a la
formación de quilomicrones, formados por triglicéridos, fosfoglicéridos, colesterol y proteínas. En el hígado también
se sintetizan lipoproteínas (LDL, VLDL, HDL y VHDL, que se vierten posteriormente al torrente sanguíneo) y ácidos
434
biliares, que se forman a partir de colesterol (y se vierten a los canalículos biliares). La síntesis de hormonas
esteroideas tiene lugar en células endocrinas especializadas, y se desarrolla en pasos sucesivos que implican la acción
de enzimas mitocondriales y del REL a partir de colesterol. Se forman así hormonas como la testosterona, el estradiol,
el cortisol, la aldosterona, etc.
Detoxificación de sustancias liposolubles
El REL tiene un importante papel en la degradación de sustancias tóxicas liposolubles, como algunos fármacos,
alcohol, pesticidas y carcinógenos, además de compuestos dañinos producidos por el propio metabolismo. Todas
estas sustancias son convertidas en productos hidrosolubles, más fácilmente eliminables por el organismo. En los
hepatocitos, cuando hay altas dosis de estas sustancias tóxicas, se observa un REL muy desarrollado con presencia de
enzimas detoxificantes (como la familia de los citocromos P450, que están anclados en el lado citosólico de la
membrana del REL). Las enzimas del citocromo P450 se agrupan en 27 familias de genes y se designan mediante las
letras CYP, seguidas por un número del 1 al 10. La actividad de estas enzimas incluye oxidación, hidrólisis o
reducción de las sustancias que tienen que ser modificadas químicamente para reducir su toxicidad. Otras enzimas
citoplasmáticas actúan conjugando estas sustancias con determinados grupos químicos (glucurónico, sulfato, acetilo,
etc.), que facilitan la excreción de las mismas.
Participación en el metabolismo del glucógeno
El REL aparece frecuentemente cercano a los depósitos de glucógeno de algunos tipos celulares, particularmente de
los hepatocitos. Estas células poseen una importante función en el acúmulo de glucosa en forma de glucógeno. En el
lado citosólico de la membrana del REL se encuentra la glucosa 6-fosfatasa, una enzima que hidroliza la glucosa-6fosfato, produciendo glucosa libre, que puede así pasar al torrente sanguíneo y ser utilizada por los tejidos ante una
situación de falta de glucosa.
Almacenamiento de Ca
2+
Como se explicó en el capítulo 4, el REL posee bombas Ca ATPasas que introducen Ca en su interior en contra de
2+
2+
gradiente, con el fin de que los niveles citoplasmáticos de este ión permanezcan bajos; por lo tanto, el REL actúa como
reservorio intracelular de Ca . El aumento de los niveles de Ca citoplasmático desencadena la activación de cascadas
2+
2+
de señalización que pueden tener diferentes consecuencias, dependiendo del tipo celular (v. capítulo 13), por lo que
actúa como un segundo mensajero en la señalización intracelular. En las fibras musculares esqueléticas existe un REL
435
especial, denominado «retículo sarcoplásmico», que forma una envuelta alrededor de las miofibrillas. Constituye un
almacén de Ca que se libera con la llegada del impulso nervioso y desencadena la contracción muscular (v. capítulo
2+
12).
436
Aparato de Golgi
Estructura y propiedades
El aparato de Golgi fue descubierto por Camillo Golgi en 1898 cuando estudiaba las neuronas de Purkinje del cerebelo
con una tinción específica para neuronas (con sales de osmio y rubidio). Observó alrededor del núcleo unas
estructuras intensamente teñidas que denominó «aparato reticular interno»; en 1914 Cajal confirmó su existencia en
otros tipos celulares y describió su relación con la secreción. El aparato de Golgi está constituido por un conjunto de
estructuras membranosas, fundamentalmente sáculos aplanados y apilados en disposición paralela (fig. 10-13).
También aparecen vesículas alrededor de los sáculos, especialmente junto a los extremos, además de elementos
membranosos tubulares. Todos estos elementos se agrupan en unidades denominadas dictiosomas, cuyo número y
distribución son variables según el tipo celular (p. ej., un hepatocito puede tener hasta 50 dictiosomas). El aparato de
Golgi está muy desarrollado en células productoras de glucoproteínas y proteoglucanos, como las células de los
acinos pancreáticos, células caliciformes, hepatocitos, neuronas, etc.
FIGURA 10-13 Imagen de microscopía electrónica del aparato de Golgi donde se pueden observar varias cisternas del dictiosoma.
(Procedente de: Electron Microscopy Service, University of Yale, USA.)
El aparato de Golgi presenta polaridad, lo que indica que existen dos zonas con morfología y composición bien
distinta, denominadas cara Cis (o de formación) y cara Trans (o de maduración) (fig. 10-14). En el aparato de Golgi
tiene lugar la maduración de las proteínas, que ocurre mediante cambios sucesivos que se producen desde la cara Cis
hasta la cara Trans. La maduración proteica, por lo tanto, está polarizada hacia la cara Trans del Golgi. Por ello, el
aparato de Golgi presenta una clara compartimentación funcional y morfológica, de manera que en él se pueden
distinguir cinco compartimentos (v. fig. 10-14):
• Red del Cis Golgi (CGN, del inglés Cis Golgi Network).
437
• Cisternas Cis.
• Cisternas mediales.
• Cisternas Trans.
• Red del Trans Golgi (TGN, del inglés Trans Golgi Network).
FIGURA 10-14 Representación esquemática del aparato de Golgi en la que se observan los distintos compartimentos,
correspondientes a la zona CGN (Cis Golgi Network), Cis, medial, Trans y TGN (Trans Golgi Network). Los distintos compartimentos
poseen enzimas que modifican a las glucoproteínas según avanzan de la zona Cis a la Trans. En la parte de la derecha se representan
algunos cambios que pueden sufrir las glucoproteínas; la altura a la que ocurren estos cambios corresponde aproximadamente con los
compartimentos en los que hay mayor cantidad de las enzimas responsables de dichos cambios. GlcNAC: N-acetilglucosamina.
(Ilustración de: A. Calvo.)
Los dos compartimentos extremos (CGN y TGN) no están formados por verdaderas cisternas, sino por una red
irregular de túbulos y vesículas (de ahí el término en inglés network). Cada compartimento posee un grupo específico
de enzimas responsables de la maduración secuencial de las proteínas. Así, en la región CGN y en la zona Cis se
encuentran enzimas que transfieren grupos fosfato y que eliminan residuos de manosa, respectivamente. En las
cisternas mediales se añade N-acetilglucosamina; en las Trans, galactosa y ácido siálico, mientras que en la zona TGN
se encuentran enzimas que transfieren grupos sulfato a algunas proteínas.
Funciones
En el aparato de Golgi las proteínas y lípidos sintetizados en el RE continúan su maduración. Los cambios más
importantes que sufren son la glucosilación, las fragmentaciones y la sulfatación.
Glucosilación
Las transferasas de azúcares llevan a cabo la glucosilación de proteínas y lípidos, dando lugar a la formación de
glucoproteínas, proteoglucanos y glucolípidos. Los radicales glucídicos se añaden siempre hacia el interior de las
cisternas del Golgi. Se dan también procesos de desglucosilación, en los que se eliminan, por ejemplo, grupos manosa.
438
En cuanto a las proteínas anteriormente glucosiladas en el RER (donde tenía lugar la N-glucosilación), en el aparato
de Golgi se eliminan algunos de sus radicales glucídicos y se añaden otros, dando lugar a glucoproteínas que
contienen N-oligosacáridos que se pueden clasificar en tres grandes grupos: a) ricos en manosa; b) complejos, y c)
híbridos, que vienen a ser oligosacáridos intermedios entre los grupos anteriores. Los oligosacáridos ricos en manosa
contienen manosa y N-acetilglucosamina. Los complejos poseen manosa, N-acetilglucosamina, galactosa y ácido
siálico (o neuramínico) (pueden contener también fucosa).
Aparte de la modificación de los oligosacáridos de las N-glucoproteínas, el aparato de Golgi también es responsable
de la O-glucosilación (que tiene lugar de modo exclusivo en este orgánulo). En este tipo de glucosilación se unen
azúcares a un grupo OH de los aminoácidos serina, treonina y, en el caso del colágeno, hidroxilisina. La Oglucosilación da lugar a cadenas cortas de azúcares (unos 10, por término medio), que se añaden de modo secuencial
(no en bloque, como en el caso de la N-glucosilación). Además, en la O-glucosilación no se añade ni glucosa ni
manosa. Las proteínas O-glucosiladas pueden formar parte de las mucinas, abundantes en las células secretoras de
mucosustancias; también el colágeno tiene azúcares O-ligados (en este caso la unión tiene lugar entre la hidroxilisina y
la galactosa). Los proteoglucanos son estructuras de alto contenido proteico a las que se unen largas cadenas de
azúcares (v. capítulo 6) que se llaman «glucosaminoglucanos» y se añaden en el aparato de Golgi. Los azúcares que
forman parte de estas cadenas son: N-acetilglucosamina, N-acetilgalactosamina, galactosa, manosa, ácido siálico, ácido
glucurónico y ácido idurónico, entre otros; muchos de ellos están, además, sulfatados.
La adición de ácido siálico tiene lugar en las cisternas Trans del aparato de Golgi. El ácido siálico proporciona una
carga negativa a las proteínas, lo cual tiene importancia en algunas interacciones célula-célula o en la infección de
microorganismos. Por ejemplo, las células metastásicas poseen una gran cantidad de glucoproteínas con ácido siálico,
lo cual puede facilitar su salida de los tejidos hacia el torrente sanguíneo. El virus de la gripe se une al ácido siálico de
la superficie de eritrocitos y células de las vías respiratorias, permitiendo así su entrada en las células.
Algunas proteínas sufren sulfatación en sus tirosinas, reacción que es catalizada por una sulfotransferasa en la zona
TGN del Golgi. La sulfatación parece estar relacionada con la estabilidad de las interacciones proteína-proteína. Entre
las proteínas que sufren sulfatación están determinadas moléculas de adhesión, proteínas de matriz extracelular o los
receptores asociados a proteínas G. El proceso de glucosilación de proteínas y lípidos está alterado en algunas
situaciones patológicas, como el cáncer. Se ha comprobado que las células tumorales producen glucoproteínas y
glucolípidos con oligosacáridos distintos a los de las células normales, lo cual facilita su adhesión y migración a través
de determinados tejidos y, por lo tanto, el proceso de metástasis.
Marcaje de enzimas lisosómicas
439
Las enzimas de tipo hidrolasa ácida que van a ser responsables de la digestión celular llevada a cabo por los lisosomas
son clasificadas mediante una ruta especial, que las dirigirá hacia este orgánulo. Los lisosomas primarios se forman a
partir de vesículas revestidas de clatrina que se originan en la zona TGN del Golgi. El proceso comienza en la zona
CGN, que contiene enzimas que añaden grupos fosfato sobre el carbono 6 de manosas terminales en las proteínas de
tipo hidrolasa que van a ir destinadas a lisosomas. La manosa-6-fosfato (M6P) constituye, por lo tanto, un marcaje de
aquellas proteínas cuyo destino es el lisosoma. Todas estas proteínas poseen N-glucosilación y la adición del fosfato
tiene lugar mediante la acción de la enzima N-acetilglucosamina fosfotransferasa, que transfiere un grupo fosfato a la
manosa de las enzimas lisosómicas a partir de una molécula de N-acetilglucosamina-UDP. Las hidrolasas lisosómicas
marcadas son reconocidas por receptores de M6P presentes en TGN. De esta manera, se formarán vesículas revestidas
de clatrina que salen del TGN y se fusionan con el endosoma tardío. La alteración de este sistema de clasificación
produce consecuencias graves para la célula, ya que estas enzimas no son destinadas al lisosoma, sino que siguen la
ruta secretora y son secretadas al exterior celular, como ocurre en la mucolipidosis de tipo II (v. más adelante).
Reciclaje de membranas
El aparato de Golgi es un compartimento muy dinámico que debe estar en continuo equilibrio, puesto que recibe
continuamente aportaciones de elementos membranosos procedentes de la endocitosis, y a su vez libera vesículas de
la vía secretora, cuya membrana pasa a formar parte de la membrana plasmática. Por lo tanto, es un orgánulo
responsable de la adecuada distribución de membrana entre los distintos elementos membranosos de la célula.
Distribución adecuada de las distintas macromoléculas
Como hemos mencionado anteriormente, el aparato de Golgi es un compartimento clasificador, a partir del cual
emergen vesículas con diferentes destinos celulares. La figura 10-15 muestra el recorrido de varias macromoléculas
desde el inicio de su síntesis en el RER hasta su destino final. Las proteínas pueden dirigirse hacia la membrana
plasmática y permanecer en ella (si son proteínas ancladas en la membrana), ser expulsadas hacia el exterior (si son
solubles), permanecer como proteínas residentes en el aparato de Golgi o ir destinadas a los lisosomas.
440
FIGURA 10-15 Esquema que muestra el tráfico de varias macromoléculas a través del Golgi. Las proteínas pueden dirigirse al exterior
celular, quedar ancladas en la membrana plasmática, permanecer residentes en el Golgi o ir destinadas a lisosomas. Los distintos tipos
de proteínas corresponden a: rosa: proteína residente del Golgi; morada: proteína secretada; amarilla: enzima lisosómica. Las enzimas
lisosomales se marcan en el Cis Golgi reticular (mediante adición de manosa-6-fosfato), lo cual se representa en color verde.
Fragmentación y condensación
La fragmentación y condensación de proteínas secretadas es otra de las funciones que tiene lugar tanto en el aparato
de Golgi como en las vesículas de secreción. Algunas hormonas y neurotransmisores son sintetizados en forma
inactiva, y deben sufrir fragmentaciones para ser funcionales. La fragmentación tiene lugar en aminoácidos cargados
positivamente (Lys-Lys, Lys-Arg, Arg-Arg, Arg-Lys). En el aparato de Golgi y en las vesículas de secreción
inmaduras, estas proteínas son procesadas mediante enzimas que eliminan parte de la proteína, dejando libre la forma
activa. Algunos polipéptidos cortos secretados, como las encefalinas, tienen que sintetizarse como moléculas más
largas para poder seguir la ruta secretora, tras lo cual son proteolizadas y dan lugar a los péptidos funcionales. El
tráfico de sustancias secretadas desde el RER hasta la membrana plasmática implica una condensación progresiva en
su proceso de maduración (hasta 200 veces), como es el caso de los gránulos de zimógeno de los acinos pancreáticos,
que se condensan antes de ser liberados al exterior celular. En este proceso intervienen bombas de H situadas en la
+
membrana de las vesículas de secreción.
441
La síntesis y secreción de la insulina (fig. 10-16) ilustra las modificaciones postraduccionales y la secreción regulada
en las células β del páncreas. La traducción del ARNm de la insulina tiene lugar en el RER y genera una cadena
polipeptídica precursora llamada «pre-proinsulina». Posteriormente, este precursor pierde el péptido señal por
proteólisis, generando así la proinsulina, cuya estructura final de plegamiento se consigue mediante la formación de
puentes disulfuro (v. capítulo 8). La proinsulina pasa entonces al aparato de Golgi y desde ahí a gránulos de secreción
inmaduros. Finalmente es procesada mediante una serie de proteasas (prohormona convertasa 1/3, carboxipeptidasa
E) para dar lugar a la insulina madura y al péptido C. Los gránulos de secreción que contienen la insulina madura son
exocitados cuando las células β activan una cascada de señalización intracelular en respuesta a la glucemia elevada y a
otros estímulos.
FIGURA 10-16 Tránsito de la insulina a través de la ruta secretora. A. Representación esquemática de los diferentes orgánulos
implicados. B. Electronografía de una célula β del páncreas. E, exocitosis; G, Golgi; Im-G, gránulos inmaduros de secreción; L,
lisosoma; M, mitocondria; N, núcleo; RER, retículo endoplasmático rugoso; SG, gránulos maduros de secreción; TGN, Trans Golgi
Network. (Procedente de: LeRoith D et al. Diabetes Mellitus: A Fundamental and Clinical Text. Philadelphia: Lippincott Williams & Wilkins; 2004.)
Tráfico vesicular y formación de vesículas de secreción
La regulación del tráfico intracelular de vesículas en las vías endocítica y exocítica requiere de la actuación de una
serie de proteínas de revestimiento (coating proteins), que seleccionan las zonas de membrana que formarán las
vesículas. El revestimiento tiene, al menos, dos funciones: a) proveer la fuerza mecánica para deformar la membrana,
y b) capturar en esas zonas los receptores específicos. Para este propósito se pueden formar dos tipos de vesículas
(cuya estructura se explicó en el capítulo 5) (fig. 10-17):
• Vesículas revestidas de clatrina: participan en la formación de vesículas en el aparato de Golgi que irán
destinadas a lisosomas, en la endocitosis mediada por receptor y en la exocitosis regulada.
• Vesículas revestidas de coatómeros (COPI y COPII): su revestimiento está formado por un gran complejo
proteico, el coatómero, compuesto por las subunidades proteicas COPI y COPII (del inglés coating protein). Estas
proteínas de recubrimiento median el transporte del RER al aparato de Golgi (COPII), el que se desarrolla entre
442
cisternas del Golgi y de recuperación a RER (COPI), y el del TGN hacia la membrana plasmática (secreción
constitutiva) (COPI).
FIGURA 10-17 Esquema de los recubrimientos de las vesículas que intercambian material entre el RER, el Golgi y la membrana
plasmática. (Ilustración de: E. Maldonado y A. Calvo.)
Se pueden distinguir cuatro vías de comunicación mediante vesículas entre diferentes compartimentos celulares:
• Transporte del RER al aparato de Golgi: las proteínas presentes en el RER que deben pasar al aparato de Golgi
son empaquetadas en vesículas revestidas de COPII, que se forman en regiones especializadas del RER, sin
ribosomas, denominadas exit sites (lugares de salida). Solo abandonan el RER las proteínas correctamente
plegadas y ensambladas, ya que hay chaperonas que retienen a las proteínas mal plegadas. Estas vesículas se
fusionan formando agregados tubulovesiculares que se desplazan hacia el Golgi, en un movimiento dependiente
de microtúbulos.
• Vía de retorno del aparato de Golgi al RER: las proteínas residentes del RER que hayan pasado al aparato de
Golgi para ser modificadas, vuelven mediante vesículas recubiertas de COPI. En concreto, las proteínas solubles
residentes del RER (como BiP o isomerasa de puentes disulfuro) presentan una pequeña señal carboxilo terminal
que consiste en una secuencia de aminoácidos Lys-Asp-Glu-Leu (o KDEL). Las proteínas de membrana del RER
poseen también secuencias específicas, que contienen dos residuos de lisina (KKXX), que las devuelven a través
de la vía de reciclado. Estas proteínas son reconocidas por receptores presentes en la membrana de los agregados
tubulovesiculares y del aparato de Golgi, en zonas que forman vesículas revestidas de COPI y son devueltas al
RER.
• Transporte a través del Golgi: como hemos indicado, las proteínas procedentes del RER son incorporadas al
aparato de Golgi por su cara Cis y van madurando en su recorrido hacia la cara Trans. El movimiento preciso que
siguen las proteínas a través del Golgi es todavía objeto de debate. Existen dos posibles modelos teóricos, aunque
en realidad, está prácticamente aceptado que lo que se da es una mezcla de ambos (fig. 10-18): a) transporte
443
vesicular, en el que las cisternas son estáticas, con proteínas residentes características, y b) maduración o
progresión de las cisternas, en el que estas van madurando, por lo que debe haber un transporte vesicular
retrógrado de las proteínas residentes de cada compartimento.
• Transporte del Golgi a la membrana plasmática: este proceso repone la membrana perdida por endocitosis y
sirve a la vez para verter al exterior celular moléculas de secreción y sustancias que formarán parte de la matriz
extracelular (v. capítulo 5). Existen dos grandes vías secretoras: a) la vía secretora constitutiva, que se da en todas
las células y supone una constante exocitosis de vesículas que contienen proteínas y lípidos de la membrana
plasmática, así como proteoglucanos y glucoproteínas de la matriz extracelular, y b) la vía secretora regulada, que
tiene lugar solo en células especializadas en secreción. En ella las moléculas son secretadas en respuesta a un
estímulo y pueden ser hormonas, enzimas o neurotransmisores.
FIGURA 10-18 Modelos de maduración del aparato de Golgi. (Ilustración de: E. Maldonado y A. Calvo.)
444
Lisosomas
Estructura, características y tipos
Los lisosomas fueron descubiertos por Christian De Duve cuando estudiaba muestras de hígado mediante la técnica
de fraccionamiento celular y centrifugación diferencial. Detectaba actividad fosfatasa ácida en una fracción con
propiedades intermedias entre la fracción mitocondrial y la microsómica, y concluyó que en ella debía existir un
orgánulo con membrana que contenía esa actividad fosfatasa ácida. Paralelamente, Novikov observó al microscopio
electrónico de transmisión orgánulos esféricos de aproximadamente 0,5 μm de diámetro, con membrana simple y
contenido denso a los electrones, que denominó «cuerpos densos pericanaliculares» y que identificó como los
orgánulos descritos por De Duve. Posteriormente, cuando se comprobó su función de digestión intracelular de
sustancias, se les denominó «lisosomas». Los lisosomas están presentes en la mayoría de las células animales
nucleadas. Son especialmente abundantes en células con función fagocítica: leucocitos polimorfonucleares,
macrófagos, osteoclastos, etc.
Los lisosomas contienen hasta 40 tipos de enzimas hidrolíticas o hidrolasas ácidas (nucleasas, proteasas,
glucosidasas, lipasas, etc.), que son capaces de digerir de manera controlada los distintos tipos de macromoléculas. Su
diámetro puede ser variable, siendo por lo general de 0,2 a 0,5 μm. El pH en su interior es ácido (en torno a 5), lo que
es óptimo para la actuación de las hidrolasas. No todos los lisosomas contienen todas las enzimas capaces de digerir
cualquier macromolécula de la célula, pero todos ellos contienen al menos la fosfatasa ácida, que se considera un
marcador universal de lisosomas. La membrana de este orgánulo tiene características peculiares: por un lado presenta
bombas de protones, cuya actividad genera el pH ácido al introducir iones H en contra de gradiente. Además
+
contiene gran número de proteínas transportadoras para translocar al citosol los productos de la digestión de las
distintas macromoléculas (aminoácidos, azúcares y nucleótidos), y proteínas de membrana glucosiladas de manera
inusual, lo que parece protegerlas de la acción de las propias hidrolasas. Si se digiriera la membrana o se rompiera por
cualquier causa, quedarían libres en el citoplasma las hidrolasas, que podrían digerir los componentes celulares y
causar la muerte celular. Esto es, de hecho, lo que ocurre en algunas patologías que comentaremos más adelante.
La clasificación clásica distingue entre dos tipos de lisosomas: primarios y secundarios. Los primarios son orgánulos
esféricos, de pequeño tamaño (alrededor de 0,5 μm), contenido homogéneo denso y pH no muy ácido. Se trata de
vesículas desprendidas del aparato de Golgi cargadas de enzimas hidrolíticas que todavía no han digerido, por lo que
en la actualidad se les tiende a denominar «vesículas hidrolíticas del Golgi».
Los lisosomas secundarios (fig. 10-19) son aquellos que están digiriendo o ya han digerido los diferentes sustratos
celulares. Estos lisosomas son el resultado de la fusión de los lisosomas primarios con los endosomas tardíos, con un
pH ácido, donde se concentran los sustratos que han sido incorporados mediante endocitosis. La fusión de ambos
445
orgánulos da lugar a un compartimento con un pH ácido, enzimas hidrolíticas y sustratos para la digestión. Los
lisosomas secundarios son de mayor tamaño y más irregulares que los primarios y poseen contenido heterogéneo.
Presentan una gran variabilidad morfológica, dependiendo del tipo celular y del tipo de material digerido. La
digestión incompleta de las sustancias puede generar lisosomas (generalmente grandes y con forma irregular) con
material de residuo en su interior, llamados cuerpos residuales o gránulos de lipofuscina (v. fig. 10-19) (también se
denominan «pigmento de envejecimiento», típico de las neuronas y del músculo cardíaco).
FIGURA 10-19 Electronografía de un lisosoma secundario junto a un REL muy desarrollado. (Reproducida a partir de: Vázquez J, López J. Citología
práctica. Pamplona: EUNSA; 1991.)
Como hemos comentado, los lisosomas primarios se forman por gemación en la zona TGN del Golgi. Las hidrolasas
lisosómicas marcadas con las M6P añadidas a N-oligosacáridos son reconocidas por receptores de M6P presentes en
TGN. De esta manera, se formarán vesículas revestidas de clatrina que salen del TGN y se fusionan con el endosoma
tardío (fig. 10-20). El endosoma tardío proviene del endosoma temprano (v. capítulo 5), donde se habían ido
acumulando diversos sustratos procedentes de la endocitosis. El pH del endosoma tardío favorece la disociación de la
hidrolasa ácida de su receptor de membrana, lo que, a su vez, posibilita que el receptor retorne a la zona TGN del
Golgi mediante gemación de vesículas recubiertas de retrómeros, para comenzar de nuevo el proceso. En el endosoma
tardío tiene lugar, por su parte, la disociación de los grupos fosfato que constituían el marcaje de las enzimas
lisosómicas. Una vez que las enzimas están libres de su grupo fosfato, pueden actuar, digiriendo sus sustratos
específicos.
446
FIGURA 10-20 Esquema de la formación de los lisosomas y del transporte de nuevas hidrolasas al lisosoma. (Illustración de: E. Maldonado y A.
Calvo.)
Tipos de digestión celular
Los lisosomas llevan a cabo la digestión intracelular controlada de macromoléculas, pero algunos tipos celulares
pueden realizar una digestión extracelular mediante exocitosis de sus lisosomas. Por ejemplo, el acrosoma del
espermatozoide es un lisosoma especial que hace posible la fecundación; el contacto con la zona pelúcida del ovocito
induce la reacción acrosómica, que lleva consigo la liberación de varias enzimas hidrolíticas que facilitan el paso del
espermatozoide a través de la zona pelúcida y su posterior fusión con el ovocito. La fusión del acrosoma con la
membrana plasmática en el espermatozoide causa la liberación de las enzimas capaces de digerir la zona pelúcida.
Otro ejemplo de digestión extracelular es la llevada a cabo por los osteoclastos, células residentes en el hueso cuya
misión es la remodelación ósea. La exocitosis de los lisosomas de los osteoclastos libera enzimas al espacio
extracelular que son capaces de digerir los componentes orgánicos de la matriz ósea.
La digestión intracelular de sustratos mediada por lisosomas puede ser de dos tipos: a) heterofagia, cuando los
sustratos que se digieren provienen del exterior celular mediante endocitosis o fagocitosis, y b) autofagia, cuando las
células digieren sus propios componentes celulares.
La autofagia consiste básicamente en un proceso de autodigestión mediante el cual las células fagocitan sus propias
estructuras. Esto beneficia en diversos aspectos a las células. En primer lugar es un mecanismo protector que implica
un reciclaje dinámico de sus estructuras, gracias al cual tienen lugar la renovación y la homeostasis celular. Se
eliminan así componentes celulares alterados, hipertrofiados o invadidos por agentes infecciosos. Además supone un
mecanismo de supervivencia celular en situaciones de inanición o estrés. Existe un tipo especial de autofagia
(denominada crinofagia) en el cual la célula digiere sus propios gránulos de secreción. La autofagia está controlada
447
genéticamente por la familia de genes Atg (autophagy-related genes). Se pueden distinguir tres tipos de autofagia en
función de su forma de realización (fig. 10-21):
• Macroautofagia: en este tipo de autofagia a gran escala, una membrana (probablemente derivada del RE) engloba
una porción de citoplasma, que incluye material soluble y orgánulos (fig. 10-22). El elemento membranoso
formado (autofagosoma) se fusiona con un lisosoma, formándose un autolisosoma en el que se llevará a cabo la
digestión.
• Microautofagia: en este caso, pequeñas porciones de citoplasma son captadas por invaginaciones de la membrana
del lisosoma, donde tiene lugar la digestión de las sustancias.
• Autofagia mediada por chaperonas: algunas proteínas citosólicas presentan una secuencia de tipo KFERQ. Son
reconocidas por la chaperona Hsc70 y otras cochaperonas, y translocadas al lisosoma mediante la proteína
transmembrana del lisosoma Lamp-2A.
FIGURA 10-21 Esquema que muestra los distintos tipos de autofagia: macroautofagia, microautofagia y autofagia mediada por
chaperonas.
FIGURA 10-22 Imagen de un autofagosoma producido por la degradación de mitocondrias en una célula oxíntico-péptica. (Reproducida a
partir de: Burrell MA et al. Atlas de ultraestructura celular. Pamplona: EUNSA; 2011.)
La autofagia es un proceso inducido por el estrés celular y por diversas patologías. En situaciones de falta de
alimento se activan los procesos de autofagia, principalmente en el hígado, páncreas, músculo esquelético y riñón. La
448
insulina (hormona reguladora de la glucemia) bloquea los procesos de autofagia. También se activa para eliminar
orgánulos hipertrofiados; por ejemplo, la administración de fenobarbital en ratas provoca un gran aumento del REL
en hepatocitos, con el fin de eliminar dicha sustancia tóxica. Posteriormente, el retículo se elimina por un proceso de
autofagia. De esta forma se previene el acúmulo de proteínas, lípidos y orgánulos dañados.
Las alteraciones en la autofagia se han relacionado con diversas patologías hepáticas y neurodegenerativas, con el
envejecimiento, el cáncer y el síndrome metabólico. Numerosos estudios están analizando la contribución de la
autofagia en estas enfermedades, en las que parece que puede jugar un papel crítico para su desarrollo. Actualmente
hay muchas evidencias referentes al papel que desempeña la autofagia en el control del envejecimiento, habiéndose
demostrado la importancia de varias proteínas relacionadas con este proceso en la longevidad de algunas especies.
El papel de la autofagia en el cáncer no está del todo claro. Podría actuar como mecanismo de resistencia frente a la
apoptosis, por lo que proporcionaría una ventaja a las células tumorales. Por otro lado, se ha demostrado la presencia
de fármacos inductores de muerte por autofagia en células tumorales que son resistentes a la muerte inducida por
apoptosis. La temozolomida (que se utiliza para el tratamiento de los pacientes con glioblastoma) y algunos
inhibidores de las moléculas de señalización intracelular de la vía de mTOR (mammalian Target of Rapamycin), PI3K y
AKT causan muerte celular por autofagia. Por ejemplo, la rapamicina y sus derivados inhiben la acción de la proteína
mTOR, relacionada con síntesis de proteínas, metabolismo y supervivencia celular, e inducen muerte por autofagia.
Existe actualmente una intensa investigación sobre la autofagia, ya que parece que este mecanismo puede estar
involucrado de modo significativo en numerosas patologías humanas.
Patologías relacionadas con disfunciones de los lisosomas
Existen distintas patologías relacionadas con alteraciones de la actividad de los lisosomas. Estas enfermedades se
pueden clasificar básicamente en dos grupos (dependiendo del origen de la alteración) que se exponen a continuación.
Por ruptura de los lisosomas
Existen algunos productos químicos (vitamina A y algunas hormonas) que alteran la estabilidad de la membrana de
los lisosomas, pudiendo producirse una liberación anormal de las hidrolasas.
En otros casos la función normal de los lisosomas se ve alterada al verse obligados a captar grandes cantidades de
alguna sustancia (cristales de urato en la gota, partículas de sílice en la silicosis) que las células no son capaces de
digerir, provocando la lisis lisosómica. Profundizaremos algo más en la enfermedad de la silicosis, que puede servir
como ejemplo para mostrar este tipo de patologías. Se trata de una enfermedad que se agrupa bajo el término de
neumoconiosis o enfermedades pulmonares por inhalación de polvo inorgánico. Es típica de los mineros y de otras
449
profesiones donde puede haber inhalación de sílice. Se desencadena como consecuencia del depósito de estas
partículas en el parénquima pulmonar, donde los intentos de aclaramiento bronquial por parte de los fagocitos
resultan ser insuficientes. Los cristales de sílice, que no pueden ser digeridos por los fagocitos, rompen las membranas
del lisosoma y causan la muerte de los fagocitos. Esto provoca inflamación crónica y reclutamiento de células del
sistema inmunitario, en un intento por eliminar estas partículas. La presencia de células inflamatorias de modo
crónico libera sustancias oxidantes, factores de crecimiento y citoquinas, que conducen a una citotoxicidad y a fibrosis
pulmonar. Así, aumenta el riesgo de padecer infecciones (como la tuberculosis) y el cáncer. De hecho, en modelos
animales a los que se les administra una sola dosis de sílice de un determinado tamaño, acaban produciéndose
lesiones neoplásicas.
Enfermedades causadas por acumulación o almacenamiento
Son enfermedades hereditarias, de baja incidencia, en las que faltan una o más enzimas lisosómicas para la
degradación de macromoléculas, con la consiguiente acumulación progresiva del sustrato correspondiente. Las
manifestaciones clínicas de estas enfermedades dependen de la enzima afectada; normalmente dan lugar a cuadros
neurodegenerativos, organomegalia, y anomalías cutáneas, oculares y óseas. Existe un gran número de enfermedades
de este tipo (tabla 10-1); nos centraremos en el estudio de tres de ellas: las enfermedades de Fabry, Gaucher y la
mucolipidosis tipo II.
Tabla 10-1
Ejemplos de trastornos causados por almacenamiento lisosómico
Enfermedad de Fabry
Está causada por un déficit de la
enzima α-galactosidasa A. Se origina
por un defecto genético localizado en
el cromosoma X, lo que explica su
mayor incidencia en varones. Debido
a que la función de esta enzima es la
eliminación de un compuesto de
carácter lipídico (la
globotriaosilceramida GL-3), su
déficit conducirá a una progresiva
acumulación de esta sustancia en las
células, lo que ocurre de modo
importante en los vasos sanguíneos,
hígado, corazón, piel y cerebro (fig.
10-23). Entre las manifestaciones
clínicas son característicos el ardor en
450
las palmas de las manos, la disminución de la sudoración, la intolerancia al calor y al ejercicio, la aparición de
angioqueratomas (manchas rojas en la piel, que cuando se dan sobre el ombligo o la rodilla tienen valor diagnóstico),
el fallo renal y la opacidad de la córnea, entre otras. Esta enfermedad no tiene cura, pero un diagnóstico temprano
permite moderar los daños gracias a la aplicación de un tratamiento que consiste en la administración de la enzima y
el control de los síntomas. Su elevado coste, sin embargo, impide a muchos pacientes un tratamiento adecuado.
FIGURA 10-23 Electronografía de una célula epitelial renal de un paciente con enfermedad de Fabry, donde se observan los depósitos
de glucolípidos sin digerir en los lisosomas (flecha). (Reproducida a partir de: Abe A et al. J Clin Invest 2000;105(11):1563-71.)
Enfermedad de Gaucher
Es la enfermedad por acumulación en los lisosomas más común. Es una lipidosis con tres presentaciones clínicas que
difieren en severidad y grado de afectación del sistema nervioso. El déficit de glucocerebrosidasa explica su
patogenia, puesto que no pueden ser degradados los glucocerebrósidos a glucosa y ceramida.
La variante I es menos severa; no afecta al sistema nervioso, pero se aprecian lesiones óseas, esplenomegalia y
hepatomegalia. Tiene una distribución característica, ya que afecta fundamentalmente a la población judía (1/2.500
individuos). Por otro lado, las variantes II y III, aunque menos frecuentes, se manifiestan tanto en la población judía
como en la no judía. La primera cursa con una importante afectación del sistema nervioso central que aparece en la
infancia, cuya evolución puede causar la muerte en edad temprana; y la variante III (con una afectación intermedia)
da lugar a síntomas neurológicos como la demencia y la espasticidad hacia los 10 años de edad. El tratamiento
enzimático sustitutivo y el control de síntomas mejoran las condición de los pacientes; al igual que en la enfermedad
de Fabry, el elevado coste representa un serio problema para estos enfermos.
451
Mucolipidosis tipo II
Conocida en inglés como I-cell disease (inclusion-cell disease), es una enfermedad poco común en la que los lisosomas
están desprovistos de todas las enzimas hidrolíticas, debido a la falta de la enzima fosfotransferasa de N-acetil
glucosamina, que cataliza el primer paso en el marcaje de las enzimas lisosómicas con M6P. La alteración funcional de
esta enzima impide que las enzimas lisosómicas alcancen su destino, por lo que, en vez de dirigirse a los lisosomas,
continúan la ruta de secreción y aparecen en el exterior celular. En estos pacientes hay una presencia en el suero de las
hidrolasas lisosómicas, lo que permite un fácil diagnóstico. Cursa con malformaciones, retraso en el crecimiento, falta
de tono muscular y fallecimiento, muy frecuentemente antes de cumplir los 5 años de edad.
Lecturas recomendadas
Bonifacino JS, Glick BS. The mechanisms of vesicle budding and fusion. Cell. 2004;116:153–166.
Farquhar MG, Palade GE. The Golgi apparatus: 100 years of progress and controversy. Trends Cell Biol. 1998;8:2–10.
Futerman AH, Van Meer G. The cell biology of lysosomal storage disorders. Nat Rev Mol Cell Biol. 2004;5:554–565.
Kaushik S, Cuervo AM. Chaperone-mediated autophagy: a unique way to enter the lysosome world. Trends Cell Biol. 2012;22(8):407–
417.
Mazzarello P, Garbarino C, Calligaro A. How Camillo Golgi became “the Golgi”. FEBS Lett. 2009;583:3732–3733.
Mellman I, Nelson WJ. Coordinated protein sorting, targeting and distribution in polarized cells. Nat Rev Mol Cell Biol. 2008;9:833–845.
Mizushima N, Komatsu M. Autophagy: renovation of cells and tissues. Cell. 2011;147:728–741.
Rothman JE, Wieland FT. Protein sorting by transport vesicles. Science. 1996;272:227–234.
Scales SJ, Gomez M, Kreis TE. Coat proteins regulating membrane traffic. Int Rev Cytol. 2000;195:67–144.
Walter P, Ron D. The unfolded protein response: From stress pathway to homeostatic regulation. Science. 2011;334:1081–1086.
Preguntas de autoevaluación
1. ¿De los siguientes tipos celulares, cuáles poseen la vía secretora regulada?:
a. Todas las células epiteliales.
452
b. Las células secretoras de hormonas.
c. Todas las células excepto las células secretoras de hormonas.
d. Todas las células.
e. Ninguna de las opciones es correcta.
Respuesta correcta: b.
2. De los siguientes tipos celulares, ¿cuál presenta basofilia en grumos?:
a. Células del páncreas.
b. Espermatozoides.
c. Hepatocitos.
d. Células plasmáticas.
e. Células epiteliales.
Respuesta correcta: c.
3. La fosfatasa ácida es una enzima que está típicamente presente en:
a. Las cisternas Cis del aparato de Golgi.
b. Los lisosomas.
c. El RER.
d. Las cisternas Trans del aparato de Golgi.
e. El REL.
Respuesta correcta: b.
4. La enfermedad de Gaucher se debe a la ausencia de:
a. α-galactosidasa A.
b. Todas las enzimas lisosómicas.
c. Glucosa-fosforilasa.
d. Glucocerebrosidasa.
e. Ninguna de las anteriores.
Respuesta correcta: d.
453
5. ¿Cómo se llama el gran complejo proteico citosólico especializado en degradación de proteínas?:
a. Lisosoma.
b. Autofagosoma.
c. Proteasoma.
d. Microsoma.
e. Ninguna de las opciones es correcta.
Respuesta correcta: c.
6. De las siguientes proteínas, ¿cuál de ellas no es una chaperona?:
a. Binding protein (BiP).
b. Hsc70.
c. Isomerasa de puentes disulfuro (PDI).
d. Calnexina.
e. Calreticulina.
Respuesta correcta: c.
7. De los siguientes tipos celulares, ¿en cuál está especialmente desarrollado el REL?:
a. Neuronas.
b. Células secretoras de hormonas esteroideas.
c. Células secretoras de proteínas.
d. Osteoclastos.
e. Espermatozoides.
Respuesta correcta: b.
8. ¿Qué tipo de vesículas participa en el transporte desde el RER al Golgi?:
a. Revestidas de clatrina.
b. Revestidas de COPI.
c. Revestidas de COPII.
d. Cavéolas.
454
e. Vesículas lisas.
Respuesta correcta: c.
9. ¿Qué señal contienen las proteínas solubles residentes en el RER?:
a. Manosa 6-fosfato.
b. Glucosa 6-fosfato.
c. KFERQ.
d. KDEL.
e. Ninguna de estas opciones es correcta.
Respuesta correcta: d.
10. La proteína mTOR está involucrada en:
a. Autofagia.
b. Síntesis de lípidos.
c. Translocación de hidratos de carbono al RER.
d. Plegamiento de proteínas en el RER.
e. Ninguna de las anteriores.
Respuesta correcta: a.
455
CAPÍTULO 11
456
Mitocondrias y peroxisomas. Bioenergética y
metabolismo oxidativo
Matías Ávila
Carmen Berasain
Objetivos de aprendizaje
• Conocer los aspectos fundamentales de la estructura y de la función mitocondrial.
• Describir la estructura, la expresión y la transmisión del material genético mitocondrial.
• Identificar y describir los procesos esenciales del metabolismo oxidativo mitocondrial, del papel de la mitocondria
en la generación de especies reactivas de oxígeno y de su implicación en la apoptosis.
• Conocer las características básicas de la estructura, la regulación y la función de los peroxisomas.
• Describir los mecanismos responsables de las principales patologías asociadas a las alteraciones mitocondriales
y peroxisómicas.
457
Estructura y composición de las mitocondrias
Las mitocondrias son orgánulos celulares de forma generalmente oval y de tamaño variable según su origen y estado
metabólico, aunque típicamente miden 2 μm de longitud y 0,5 μm de diámetro, aproximadamente el tamaño de una
bacteria. Las mitocondrias no solamente desempeñan un papel esencial en el metabolismo oxidativo y la generación
de energía en forma de ATP, sino que también participan en una serie de procesos fundamentales como son la
señalización celular, la diferenciación y apoptosis, y el control del crecimiento de la célula. El número de mitocondrias
por célula varía según el tipo celular; así, algunas células poseen una sola mitocondria mientras que otras contienen
varios miles.
Estos orgánulos citoplasmáticos están delimitados por una doble membrana lipídica: una fina membrana externa y
una membrana interna muy amplia que presenta unas invaginaciones o plegamientos denominados crestas (fig. 11-1).
La membrana externa presenta una relación fosfolípido/proteína similar a la membrana plasmática (1:1 en peso). Esta
membrana contiene unas proteínas integrales denominadas porinas, las cuales forman canales que permiten la libre
difusión de moléculas de hasta 10 kDa, por lo que la composición del medio que ocupa el espacio entre las dos
membranas (espacio intermembrana) es muy similar a la del citoplasma. Las proteínas de mayor tamaño pueden
entrar también en las mitocondrias siempre que presenten una secuencia señal en su extremo N-terminal. Como se
comentará más adelante, esta secuencia es reconocida por un complejo multiproteico denominado translocasa,
asociado a la superficie de la mitocondria, que media el transporte activo de proteínas de gran tamaño al interior del
orgánulo. La membrana mitocondrial externa puede asociarse a la membrana del retículo endoplasmático, formando
unas estructuras que permiten la transmisión de señales mediada por iones Ca y la transferencia de lípidos entre
2+
ambos compartimentos.
458
FIGURA 11-1 A. Estructura de la mitocondria. B. Imagen de una mitocondria al microscopio electrónico de transmisión. (B, reproducida a
partir de Don W. Fawcett. The Cell. Philadelphia: Saunders, 1981.)
La membrana mitocondrial interna presenta una alta relación proteína/fosfolípido (más de 3:1 en peso), y solo es
permeable a O , CO y H O. Esta membrana es rica en un fosfolípido poco común, la cardiolipina, que además de en la
2
2
2
mitocondria se encuentra también en las membranas plasmáticas bacterianas. La cardiolipina contiene cuatro ácidos
grasos en vez de dos, lo que hace que este fosfolípido contribuya a la impermeabilidad de la membrana interna.
Además de las proteínas de la cadena respiratoria, la membrana mitocondrial interna contiene numerosos
transportadores encargados de regular el paso de metabolitos (como el ATP, el ADP y el piruvato) e iones (como el
Ca ). Asociados a la membrana interna se encuentran también sistemas de transporte de proteínas al interior de la
2+
mitocondria, como el complejo de la translocasa situado en esta membrana. Esta permeabilidad tan controlada
permite la generación de gradientes iónicos esenciales para la compartimentalización de las funciones metabólicas
entre el citosol y la mitocondria. La presencia de las crestas anteriormente mencionadas incrementa significativamente
la superficie de la membrana interna. De esta manera, en las mitocondrias de los hepatocitos, por ejemplo, la
superficie de la membrana interna es cinco veces mayor que la de la membrana externa. El número de crestas varía
con la actividad respiratoria de cada tipo particular de célula, debido a que las proteínas implicadas en el transporte
de electrones y la fosforilación oxidativa están unidas a la membrana mitocondrial interna. Así, las mitocondrias de
células que tienen mayor demanda de ATP, como las células del músculo cardíaco, contienen más crestas que las
mitocondrias de los hepatocitos, células con una menor velocidad de respiración.
El compartimento interno mitocondrial que queda delimitado por la membrana interna se denomina matriz (v. fig.
11-1), y contiene una sustancia tipo gel (<50% de agua) muy rica en proteína (66% del total de la proteína de la
mitocondria). Entre estas proteínas destacan las enzimas solubles del metabolismo oxidativo, como las del ciclo del
459
ácido cítrico o ciclo de Krebs. También hay metabolitos (como el piruvato y el citrato), cofactores nucleotídicos e iones
inorgánicos. La matriz mitocondrial también contiene su propio material genético, así como la maquinaria para
sintetizar sus propios ARN (ARNm, ARNt y ARNr) y proteínas, como se describe a continuación.
460
Genoma mitocondrial
El ADN mitocondrial (ADNmt) presenta una serie de características específicas. El ADNmt humano es una molécula
circular cerrada de 16.569 pares de bases cuya secuencia es totalmente conocida. Una mitocondria puede contener de 2
a 10 copias de su ADN, de tal forma que una célula puede contener entre 1.000 y 10.000 copias de ADNmt,
dependiendo del tejido o de las condiciones fisiológicas (poliplasmia). A diferencia del ADN nuclear, el ADNmt no se
encuentra asociado a histonas, lo que unido a su proximidad a los centros de producción de radicales libres de
oxígeno podría explicar su alta tasa de mutación, 10 veces superior a la del ADN nuclear. En una misma célula
pueden coexistir mitocondrias con el ADN normal junto a mitocondrias con el ADN mutado (heteroplasmia) (fig. 112). El ADNmt codifica 37 genes: 13 correspondientes a subunidades de los complejos respiratorios I, III, IV y V; 22
correspondientes a ARNt (para los 20 aminoácidos más un gen extra para el ARNt de la leucina y otro para el de la
serina), y dos ARNr (ARNr 12S y 16S). No todas las proteínas necesarias para la función y la biosíntesis mitocondrial
son codificadas por el ADNmt; por ejemplo, la mayoría de los polipéptidos de los complejos respiratorios son
codificados por el genoma nuclear y posteriormente importados a la mitocondria (tabla 11-1).
FIGURA 11-2 Heteroplasmia y segregación mitótica.
Tabla 11-1
Componentes del sistema
mitocondrial de la fosforilación
oxidativa
La organización genética del
ADNmt es muy compacta. En
humanos carece de intrones y ambas
cadenas están casi completamente
ocupadas por genes; contiene muy poco ADN repetitivo y no hay ninguna región 5’ y 3’ que no se traduzca (fig. 11-3).
461
La cadena pesada (H) codifica para doce polipéptidos, los dos ARNr y 14 ARNt, mientras que la cadena ligera (L)
codifica solamente para un polipéptido y ocho ARNt. El origen de replicación de la cadena H está dentro de una
región conocida como bucle D, que también contiene los promotores para las cadenas H y L. Desde estos promotores
se dirige la síntesis de dos precursores de ARN de gran tamaño, que posteriormente son procesados a moléculas de
ARN individuales. Muchos de los genes que codifican para polipéptidos carecen de un codón de terminación
completo, y terminan en una T o TA después del último codón con sentido. El agregado de una cola de poli(A) al
extremo 3’ del ARNm proporciona un codón de terminación UAA que detiene la traducción.
FIGURA 11-3 Estructura del ADNmt. pb, pares de bases.
El código genético mitocondrial es más flexible o relajado que el nuclear, de tal forma que muchas moléculas de
ARNt reconocen tripletes con cualquiera de los tres nucleótidos en la tercera posición del codón. Como consecuencia
de ello, la síntesis de proteínas mitocondriales solo requiere 22 moléculas de ARNt. Además, el código mitocondrial
presenta excepciones a la universalidad del código genético, y hay cuatro codones o tripletes que codifican para
aminoácidos diferentes en el núcleo y en la mitocondria. Por ejemplo, el codón de terminación UGA es leído como
triptófano en las mitocondrias (fig. 11-4). Otra particularidad y similitud con los procariotas es que la síntesis proteica
en los ribosomas mitocondriales se inicia con N-formil-metionina. Estos ribosomas, al igual que los bacterianos, son
sensibles a antibióticos como el cloranfenicol y la estreptomicina, lo cual representa la principal causa de toxicidad de
estos antibióticos, y a diferencia de los ribosomas citosólicos, son resistentes a la cicloheximida (tabla 11-2).
462
FIGURA 11-4 Código genético mitocondrial. N indica el código genético dependiente del núcleo. M indica el código genético
mitocondrial.
Tabla 11-2
Sensibilidad a antibióticos de los ribosomas mitocondriales
Ribosoma de mitocondrias y bacterias Ribosoma citosólico
Cloranfenicol
Inhibe
No inhibe
Estreptomicina Inhibe
No inhibe
Cicloheximida
Inhibe
No inhibe
Las mitocondrias se replican por fisión binaria, de manera similar a como lo hacen las bacterias, pero a diferencia
de estas, las mitocondrias también pueden experimentar procesos de fusión con otras mitocondrias. La regulación de
esta división no es igual en todas las células eucariotas. En eucariotas unicelulares la división está ligada al ciclo
celular, mientras que en eucariotas superiores la replicación de las mitocondrias está asociada principalmente a la
demanda energética. Cuando la demanda energética disminuye, las mitocondrias pueden ser destruidas o
permanecer inactivas. El ADNmt no se replica de manera ordenada y regulada como el ADN nuclear, sino que tiene
la capacidad de replicarse durante todo el ciclo celular sin coordinarse con la replicación del material genético del
núcleo. La replicación del ADNmt la realiza una ADN polimerasa específica denominada ADN polimerasa γ.
Durante la división celular las mitocondrias sufren una segregación mitótica y se distribuyen al azar entre las
células hijas. De esta forma, una célula con heteroplasmia puede dar lugar a células con fenotipos diferentes. Al estar
contenidos en un orgánulo citoplasmático, los genes mitocondriales no se heredan de la misma manera que los genes
nucleares, sino que lo hacen exclusivamente por vía materna (presentando, por lo tanto, un patrón no mendeliano).
Tanto el espermatozoide como el óvulo poseen mitocondrias; sin embargo, el contenido de ADNmt del óvulo es muy
superior al del espermatozoide. Además, tras la fertilización, las mitocondrias paternas que penetran en el óvulo son
eliminadas.
463
Incorporación de proteínas a la mitocondria
Se ha estimado que las mitocondrias contienen entre 1.000 y 2.000 tipos diferentes de proteínas, dependiendo de su
tejido de origen. Como se ha mencionado anteriormente, el ADNmt solamente codifica para 13 de estas proteínas, por
lo que la mayoría de las proteínas presentes en la mitocondria son codificadas por el genoma nuclear, sintetizándose
en los ribosomas citosólicos, y debiendo ser importadas posteriormente a la mitocondria. Esto sugiere la existencia de
mecanismos específicos que coordinen el transporte y la acumulación de proteínas desde el citosol a la mitocondria de
manera regulada, para garantizar el correcto funcionamiento de la maquinaria mitocondrial. Estos mecanismos deben
ser capaces también de mediar el transporte de las proteínas a diferentes compartimentos dentro de la propia
mitocondria: la membrana externa, el espacio intermembrana, la membrana interna y la matriz mitocondrial.
Las proteínas que deben ser transportadas a las mitocondrias poseen unas secuencias señal que permiten su
reconocimiento por receptores presentes en la superficie de estos orgánulos y su posterior transporte por la
translocasa de la membrana externa (TOM, del inglés translocase of the outer membrane), o por una de las dos
translocasas de la membrana interna (TIM, del inglés translocase of the inner membrane) (fig. 11-5). Todas las proteínas
que se localizarán en la matriz mitocondrial, así como algunas de las dirigidas al espacio intermembrana y a la
membrana interna, poseen en el extremo N-terminal secuencias de entre 15 y 40 residuos de aminoácidos básicos e
hidroxilados capaces de formar hélices anfipáticas. Por otra parte, aproximadamente el 30% de las proteínas dirigidas
a la mitocondria no presentan estos motivos estructurales en el extremo N-terminal, y la información que permite su
localización mitocondrial está contenida en su secuencia interna. Entre estas proteínas se encuentran algunas de la
membrana interna y del espacio intermembrana, así como todas las localizadas en la membrana externa. Las señales
de localización mitocondrial de estas proteínas son de naturaleza más heterogénea y aún no se han caracterizado
completamente. A pesar de esta heterogeneidad, todas las proteínas que son dirigidas a la mitocondria son capaces de
interaccionar con el complejo TOM. Este complejo reconoce a las proteínas en el citoplasma, facilita su disociación de
factores citosólicos a los que puedan estar unidas, contribuye a su desplegamiento y transfiere los polipéptidos a
través de poros en la membrana, mediando también la inserción en la misma de aquellas proteínas cuyo destino es la
membrana mitocondrial externa. Todas estas funciones son realizadas por diferentes componentes del complejo TOM,
que comprende tanto diferentes subunidades con capacidad receptora (Tom70, Tom20 y Tom22) como elementos
estructurales de los poros (Tom5, Tom6, Tom7 y Tom40). Tanto la estructura como la función del complejo TOM están
muy conservadas en la escala evolutiva.
464
FIGURA 11-5 Sistemas de transporte de proteínas a la mitocondria. ME, membrana externa; MI, membrana interna; MPP, peptidasa de
matriz mitocondrial; TIM, translocasas de la membrana interna; TOM, translocasa de la membrana externa.
El denominado complejo TIM23 es el responsable del transporte de todas las proteínas de la matriz mitocondrial y
de aquellas que residen en la membrana interna de la mitocondria. Para funcionar, este complejo requiere energía, que
deriva de dos fuentes distintas: el potencial de la membrana y el ATP. Los componentes del complejo TIM23 pueden
dividirse en dos grupos que operan de manera secuencial y cooperativa. Por una parte, se identifican las subunidades
que se encuentran embebidas en la membrana, las cuales actúan de receptores y componentes estructurales del canal
(Tim17, Tim21, Tim23 y Tim50). Estas subunidades, además de ser responsables de reconocer las señales de
importación, intervienen en los pasos iniciales del transporte a través de la membrana interna, empleando para ello
energía derivada del potencial de membrana. El segundo grupo de componentes del complejo TIM23 (Tim14, Tim16,
Tim44, mtHsp70 y Mge1) lleva a cabo la translocación a la matriz mitocondrial en un proceso dependiente de ATP.
Una vez en la matriz mitocondrial, las secuencias N-terminales de las proteínas transportadas son eliminadas por una
proteasa, denominada peptidasa de matriz mitocondrial. Por otra parte, dado que las proteínas son transportadas a la
mitocondria en una conformación desplegada, necesitan recuperar su estructura nativa para realizar su función. Esto
se consigue mediante la acción de una serie de chaperonas esenciales para el correcto funcionamiento de la
mitocondria, como son Hsp70 y Hsp60/Hsp10.
Existe una condición fisiológica en la que la mitocondria libera proteínas hacia el citoplasma; es el caso de la muerte
celular programada (fig. 11-6). La activación de la denominada vía intrínseca de la apoptosis (v. capítulo 15) resulta
en la permeabilización de la membrana mitocondrial externa y la liberación de proteínas proapoptóticas, tales como el
citocromo c (que, como veremos más adelante, participa en la formación del apoptosoma), Smac/Diablo, el factor
inductor de apoptosis (AIF) o la endonucleasa G. Estas proteínas, en último término, activan las caspasas efectoras (p.
465
ej., caspasa 3), las cuales provocan la fragmentación de numerosos sustratos e inducen una secuencia de cambios
morfológicos en la célula que van desde la fragmentación del ADN y la condensación nuclear, hasta la exposición de
la fosfatidilserina y de moléculas de adhesión en la superficie celular. Todo ello tiene como consecuencia la muerte
celular por apoptosis.
FIGURA 11-6 La mitocondria en el proceso de apoptosis. AIF, factor inductor de apoptosis; IAP, inhibidor de la proteína apoptótica;
TNF, factor de necrosis tumoral; Cit c, citocromo c.
Las caspasas efectoras se pueden activar por dos vías diferentes. La vía extrínseca, que implica la activación de
receptores de muerte, como los miembros de la familia del receptor del factor de necrosis tumoral (TNF) y el receptor
FAS, lleva a la activación de una cascada de caspasas iniciada por la caspasa 8. Como hemos señalado más arriba, la
mitocondria desempeña un papel central en la vía intrínseca de la apoptosis. La formación de los poros en la
membrana externa de la mitocondria y la liberación de las proteínas proapoptóticas (es decir, el destino celular —
supervivencia o muerte—), dependen del balance entre los miembros proapoptóticos y antiapoptóticos de la familia
de proteínas Bcl-2 (del inglés B-cell lymphoma 2) presentes en la membrana mitocondrial. Las proteínas antiapoptóticas
de esta familia comparten de dos a cuatro dominios de homología (BH1-4) e incluyen los miembros BCL-2, BCL-XL,
Mcl1, BCL-W y A1. Estas proteínas realizan su función secuestrando e inhibiendo a los miembros proapoptóticos, que
se dividen en dos grupos: las proteínas multidominio BAX y BAK (que son capaces de producir los poros e inducir la
apoptosis) y las proteínas BAD, BIM, BID, BIK, HRK, NOXA y PUMA (que poseen solo el dominio BH3 [BH3-only] y
una función proapoptótica reguladora no efectora). Entre estas proteínas, BID se activa mediante proteólisis mediada
por la caspasa 8, de tal forma que sirve de conexión entre las vías de apoptosis extrínseca e intrínseca (v. capítulo 15).
En respuesta a diferentes señales de estrés o tras la activación de p53 como consecuencia de un daño sobre el ADN,
se induce la expresión de los genes proapoptóticos BH3-only. Estas proteínas inhibirán a las proteínas antiapoptóticas
y, como consecuencia, se activarán las proteínas BAX y BAK, y se producirá la pérdida de la integridad mitocondrial y
la liberación del citocromo c al citoplasma. En el citoplasma, el citocromo c formará el complejo del apoptosoma junto
a APAF1 y la caspasa 9. En presencia de ATP se producirá la activación de la caspasa 9 y la subsiguiente activación de
las caspasas efectoras y la muerte celular.
466
467
Metabolismo oxidativo mitocondrial
Como se ha comentado anteriormente, entre las funciones fundamentales de la mitocondria se encuentran la
producción de ATP y la regulación del metabolismo celular. La fosforilación oxidativa es el proceso en el que se
genera energía química en forma de ATP como resultado de la transferencia de electrones del NADH o el FADH
2
formados durante la glucólisis, el ciclo de Krebs y la oxidación de los ácidos grasos, al O (fig. 11-7). El ciclo de Krebs,
2
también conocido como ciclo del ácido cítrico o ciclo de los ácidos tricarboxílicos, tiene lugar en la matriz
mitocondrial, y es una ruta común en el metabolismo de todos los sustratos energéticos, incluidas las grasas, los
azúcares y las proteínas. El ciclo de Krebs lo constituye una secuencia cerrada de nueve reacciones cuyo producto
inicial y final es el oxaloacetato (v. fig. 11-7). El primer paso de este ciclo consiste en la condensación del oxaloacetato
con la acetil-coenzima A (acetil-CoA) para formar el citrato, reacción que es catalizada por la enzima citrato sintasa.
En cada vuelta del ciclo se consume un grupo acetilo del acetil-CoA que se oxida a dos moléculas de CO , y se generan
2
tres moléculas de NADH, una de FADH y un GTP. El acetil-CoA es un producto común a varias vías catabólicas que
2
puede provenir de la glucólisis mediante la descarboxilación oxidativa del piruvato catalizada por el complejo de la
piruvato deshidrogenasa. Como veremos más adelante, el acetil-CoA también puede obtenerse en la oxidación de los
ácidos grasos (β-oxidación), así como del catabolismo de los aminoácidos. En el siguiente paso del ciclo, el citrato es
isomerizado a isocitrato por la enzima aconitasa. A continuación, la isocitrato deshidrogenasa y la α-cetoglutarato
deshidrogenasa, secuencialmente, catalizan la descarboxilación oxidativa del isocitrato y del α-cetoglutarato
respectivamente, reacciones en las que se generan dos moléculas de NADH y se produce finalmente succinil-CoA.
Ambas reacciones son fuertemente exergónicas, sobre todo la catalizada por la isocitrato deshidrogenasa, lo cual
determina la irreversibilidad del ciclo. La succinil-CoA es una molécula rica en energía que, a su vez, es metabolizada
por la enzima succinil-CoA-sintetasa. En esta reacción, la energía del enlace tioéster de la succinil-CoA se conserva al
formarse GTP a partir de GDP y fosfato inorgánico; se regenera entonces el CoA y se produce succinato. A partir del
succinato se llegará finalmente al oxaloacetato en tres reacciones. En primer lugar, la succinato deshidrogenasa oxida
el succinato a fumarato, formándose FADH . Es interesante mencionar que, a diferencia de las demás enzimas del ciclo
2
de Krebs, la succinato deshidrogenasa no se encuentra de forma soluble en la matriz mitocondrial, sino que está fijada
a la membrana mitocondrial interna, actuando de nexo de unión entre este ciclo y la fosforilación oxidativa, como se
verá más adelante. El fumarato es convertido en malato por la enzima fumarasa, y el malato pasa a oxaloacetato por
acción de la malato deshidrogenasa, en una reacción en que se genera NADH, completándose así el ciclo de los ácidos
tricarboxílicos. Como se mencionó anteriormente, el NADH y el FADH formados en este ciclo serán empleados
2
posteriormente en la cadena de transporte electrónico, regenerándose así NAD y FAD de manera acoplada al
+
consumo de oxígeno, lo cual implica que el ciclo de Krebs es un proceso obligatoriamente aeróbico. Es importante
destacar que el ciclo de Krebs cumple también una importante función en procesos biosintéticos; así, el oxaloacetato y
el α-cetoglutarato son importantes precursores en la síntesis de aminoácidos, el citrato participa en la síntesis de
468
ácidos grasos y esteroides, y el succinato es esencial para la síntesis de porfirinas. El ciclo también puede recibir
nuevos componentes que se incorporan en diferentes puntos contribuyendo a mantener su funcionamiento. Las
reacciones que proporcionan estos componentes se denominan reacciones anapleróticas, y un ejemplo de ellas es la
catalizada por la enzima piruvato carboxilasa, que genera oxaloacetato a partir de piruvato y CO , consumiendo ATP.
2
FIGURA 11-7 Ciclo de Krebs. CPT, carnitina palmitoiltransferasa.
Dada la importancia clave de este ciclo en el metabolismo celular, su regulación es esencial. En presencia de
adecuadas concentraciones de sus componentes, sustratos y cofactores podríamos decir que el ciclo funciona de forma
autónoma. Sin embargo, se pueden identificar puntos de control que garantizan la direccionalidad del mismo
(reacciones irreversibles), así como pasos sensibles a la carga energética de la célula (el cociente ATP/ADP), y
reacciones que requieren el posterior acoplamiento del ciclo a la fosforilación oxidativa en la que se regeneran el NAD
+
y el FAD a partir de NADH y FADH . Así, por ejemplo, la piruvato deshidrogenasa, punto de control estratégico en el
2
que la glucólisis se une al ciclo de Krebs, es inhibida alostéricamente por el ATP, al igual que le ocurre a la citrato
sintasa. Por otra parte, tanto la isocitrato deshidrogenasa como la succinato deshidrogenasa se inhiben cuando los
niveles de NADH aumentan. También hay mecanismos para activar el ciclo cuando el cociente ATP/ADP disminuye,
como, por ejemplo, la activación alostérica de la isocitrato deshidrogenasa por el ADP.
Como ya se ha comentado, otro origen metabólico del NADH y el FADH (que serán empleados en la fosforilación
2
oxidativa) es el catabolismo de los ácidos grasos en el proceso conocido como β-oxidación (fig. 11-8). Con la excepción
de los ácidos grasos de cadena muy larga (>20 átomos de carbono) que se metabolizan en los peroxisomas, esta ruta
tiene lugar en la matriz mitocondrial. Si bien los ácidos grasos de cadena corta y media pueden atravesar la membrana
mitocondrial por difusión pasiva, los ácidos grasos de cadena larga (principales componentes de los triglicéridos
almacenados en el tejido adiposo y de las grasas de la dieta) deben ser transportados al interior mitocondrial por un
sistema específico, como veremos a continuación. El primer paso en el catabolismo de los ácidos grasos implica su
activación mediante la unión al CoA, formándose la acil-CoA por la acción de la acil-CoA sintetasa de ácido graso, o
tioquinasa, localizada en la superficie exterior de la membrana mitocondrial externa. Si bien la acil-CoA representa la
forma activada de los ácidos grasos para su catabolismo, el tamaño y la polaridad de la CoA no le permite atravesar la
membrana mitocondrial interna. Aquí interviene un complejo sistema de transporte que comienza con la transferencia
469
del ácido graso de la acil-CoA a una molécula de menor tamaño (la carnitina) mediante la carnitina
palmitoiltransferasa I (CPT-I), también localizada en la membrana mitocondrial externa. La molécula de acilcarnitina
es transportada a la matriz mitocondrial por una translocasa, o transportador acilcarnitina, localizado en la membrana
mitocondrial interna. En el interior de la mitocondria la acilcarnitina es convertida nuevamente a acil-CoA por la
acción de la carnitina palmitoiltransferasa II (CPT-II), localizada también en la membrana mitocondrial interna.
Finalmente, la carnitina que se ha intercambiado por la CoA es devuelta al espacio intermembrana por la misma
translocasa, en lo que se conoce como un mecanismo de antitransporte, en el que la carnitina y el derivado
acilcarnitina se mueven en sentido contrario a través de la membrana mitocondrial interna.
FIGURA 11-8 La β-oxidación de los ácidos grasos.
Una vez en la matriz mitocondrial, los ácidos grasos serán oxidados en una serie de cuatro reacciones que implican
la oxidación del carbono β a una cetona, proceso que da nombre a esta ruta metabólica. Tras la oxidación, se produce
la ruptura enzimática del enlace entre los carbonos α y β por una tiolasa, de manera que en cada ciclo se produce un
mol de acetil-CoA, FADH y NADH, junto a un acil-CoA con dos átomos de carbono menos. El ciclo continúa hasta
2
que todo el ácido graso ha sido convertido en acetil-CoA, que a su vez puede incorporarse al ciclo de Krebs, mientras
que el FADH y el NADH se emplean directamente en la fosforilación oxidativa para la síntesis de ATP.
2
En la fosforilación oxidativa interviene una serie de transportadores electrónicos formados por grandes complejos
enzimáticos que están localizados en la membrana mitocondrial interna. Desde el punto de vista cuantitativo y en
comparación con la glucólisis y el ciclo de Krebs, la fosforilación oxidativa es la principal fuente de ATP en
organismos aeróbicos. Así, en la oxidación de una molécula de glucosa hasta CO y H O, la fosforilación oxidativa
2
genera 26 de las 36 moléculas de ATP producidas.
470
2
A grandes rasgos, en la fosforilación oxidativa se pueden distinguir dos partes: en la primera se acopla el flujo de
electrones desde el NADH y el FADH hacia el O a través de complejos proteicos localizados en la membrana
2
2
mitocondrial interna con el bombeo de protones hacia el espacio intermembrana. Este bombeo de protones da lugar a
un gradiente eléctrico transmembrana que genera una fuerza protón-motriz. En la segunda parte de la fosforilación
oxidativa, el complejo enzimático de la ATP sintasa aprovecha la energía del gradiente de protones que vuelven a la
matriz mitocondrial para catalizar la síntesis de ATP a partir de ADP y Pi.
Desde el NADH al O , la cadena de transporte electrónico (cadena respiratoria), comprende tres bombas de
2
protones: el complejo de la NADH deshidrogenasa (complejo I), la citocromo c reductasa (complejo III) y la citocromo
c oxidasa (complejo IV). El FADH es generado en el ciclo de Krebs en la oxidación del succinato a fumarato, reacción
2
catalizada por la succinato deshidrogenasa. Esta enzima forma parte del complejo II (asociado también a la membrana
mitocondrial interna), presenta FAD como grupo prostético y transfiere los electrones directamente al complejo III,
pero, a diferencia de la NADH deshidrogenasa (complejo I), no bombea protones (fig. 11-9). Hay otras dos enzimas, la
glicerol fosfato deshidrogenasa y la acil-CoA deshidrogenasa de ácidos grasos (ruta de la β-oxidación), que también
transfieren sus electrones a la cadena de transporte desde el FADH (evadiendo así el complejo I) y que tampoco
2
bombean protones. Los electrones se trasladan de un complejo al siguiente mediante unas moléculas transportadoras
especiales. El primero de estos transportadores es la coenzima Q, que actúa entre la NADH deshidrogenasa (complejo
I) y la citocromo c reductasa (complejo III). La coenzima Q, también llamada ubiquinona, es una quinona hidrófoba
que difunde rápidamente por el interior de la membrana mitocondrial interna, y que puede encontrarse en distintos
estados de oxidación. En las quinonas, las reacciones de transferencia de electrones están acopladas a la unión y
liberación de protones, siendo esta una propiedad clave para el transporte de protones a través de membranas. En el
estado oxidado (Q), la coenzima Q presenta dos grupos ceto. La adición de un protón y un electrón genera la forma
semiquinona (QH•), y la adición de un segundo protón y electrón da lugar al ubiquinol (QH ). La semiquinona puede
2
perder un protón, dando lugar al radical aniónico de la semiquinona (Q• ) (fig. 11-10). El segundo transportador es el
–
citocromo c, una pequeña proteína hidrófila de 13 kDa dotada de un grupo prostético hemo cuyo átomo de hierro se
oxida (Fe ) o reduce (Fe ) alternativamente durante su participación en la cadena de transporte electrónico. El
3+
2+
citocromo c transfiere electrones del complejo III (citocromo c reductasa) al complejo IV (citocromo c oxidasa).
FIGURA 11-9 Cadena de transporte electrónico mitocondrial.
471
FIGURA 11-10 Estados de oxidación de las quinonas.
El primer paso de la cadena de transporte electrónico en los mamíferos es catalizado, por lo tanto, por la NADH
deshidrogenasa. Esta enzima es parte del complejo I, el más grande de la cadena respiratoria (está formado por 46
subunidades diferentes, siete de las cuales están codificadas por el genoma mitocondrial). El complejo I posee como
cofactores una molécula de mononucleótido de flavina (FMN) y una molécula de fosfopantoteína, así como ocho
centros sulfoférricos binucleares (Fe S ) y tetranucleares (Fe S ) diferentes. Los grupos sulfoférricos se anclan a las
2
2
4
4
cadenas polipeptídicas por grupos tiol de restos de cisteína. Los electrones son transferidos desde el NADH al FMN, y
de este a los centros sulfoférricos hasta la coenzima Q. Este proceso lleva acoplado el bombeo de cuatro protones
desde la matriz mitocondrial hasta el espacio intermembrana. El mecanismo que coordina la transferencia de
electrones y la translocación de protones a nivel del complejo I no está todavía claro en sus detalles moleculares.
Como se mencionó anteriormente, existe una segunda ruta de acceso a la cadena respiratoria a partir de
deshidrogenasas dependientes de FAD, cuyo representante más importante es la succinato deshidrogenasa o
complejo II (v. fig. 11-9). En este caso los electrones del FADH son también transferidos a través de varios centros
2
sulfoférricos a la coenzima Q, que es, por lo tanto, el transportador de electrones común de los complejos I y II a la
citocromo c reductasa o complejo III (fig. 11-11).
FIGURA 11-11 El complejo III y el ciclo Q. M, membrana; MI, membrana interna.
472
La segunda bomba de protones de la cadena respiratoria es la citocromo c reductasa, la cual toma los electrones de
la coenzima Q y los transfiere al citocromo c soluble en el espacio intermembrana. Esta reacción está asociada al
bombeo de cuatro protones desde la matriz mitocondrial al espacio intermembrana. La citocromo c reductasa es un
homodímero formado por 11 subunidades diferentes; entre ellas destacan una proteína sulfoférrica con un centro
Fe S , conocida como proteína Rieske, y los citocromos c y b. Este último posee dos grupos hemos y está codificado
2
2
1
por el genoma mitocondrial. El mecanismo que media la transferencia de electrones desde la coenzima Q hasta el
citocromo c y el transporte de protones a través de la membrana se denomina ciclo Q, en el que dos electrones se
transfieren al citocromo c y cuatro protones se translocan al espacio intermembrana. Dos moléculas QH se unen de
2
manera consecutiva al complejo, cediendo cada una dos protones y dos electrones. Los protones se liberarán al
espacio intermembrana, y los electrones se desplazarán por el complejo a diferentes destinos. Uno de ellos pasa
primero al centro Fe S y después al citocromo c , desde donde se transfiere a una molécula de citocromo c oxidado. El
2
2
1
citocromo c que ha captado este electrón difunde en el espacio intermembrana hacia el complejo IV. El segundo
electrón viaja por los dos grupos hemo del citocromo b hasta una molécula de coenzima Q oxidada (Q) que se reduce
a un anión semiquinona (Q• ). Este anión radical incorpora entonces dos protones del lado de la matriz, dando lugar a
–
QH y contribuyendo a la generación del gradiente de protones (v. fig. 11-11). En el ciclo Q, por lo tanto, se oxidan dos
2
moléculas de QH para formar Q, y posteriormente una molécula Q se reduce a QH . Este proceso tan complejo
2
2
permite la transferencia de electrones desde un transportador de dos electrones (QH ) a un transportador de un
2
electrón (el citocromo c).
El complejo IV transfiere cuatro electrones desde el citocromo c al O , el aceptor final que es reducido a H O en un
2
2
proceso acoplado a la translocación de protones a través de la membrana interna (fig. 11-12). Este complejo está
formado por 13 subunidades con una masa total de 200 kDa, siendo las tres de mayor tamaño las que están
codificadas por el genoma mitocondrial. La subunidad I, la más grande, contiene dos grupos hemo (a y a ) unidos de
3
manera no covalente y un átomo de cobre (Cu ), que junto al hemo a forma un centro binuclear implicado en la
B
3
transferencia de electrones desde el hemo a hasta el O . La subunidad II posee un dominio orientado hacia el espacio
2
intermembrana, donde se une el citocromo c reducido y contiene dos átomos de cobre (Cu ). Los centros de cobre
A
alternan entre las formas reducidas (Cu ) y oxidadas (Cu ), según acepten o donen electrones.
+
2+
473
FIGURA 11-12 Complejo IV del sistema de transporte electrónico mitocondrial.
Los electrones del citocromo c reducido son transferidos al átomo de cobre Cu de la subunidad II, y de aquí al
A
hemo a de la subunidad I. Posteriormente, y todavía dentro de la subunidad I, los electrones se transfieren al centro
binuclear constituido por el Cu y el hemo a , donde tiene lugar la transferencia final de estos electrones a la molécula
B
3
de oxígeno. Inicialmente dos electrones son transferidos al O para formar un derivado peróxido (O ). La adición de
2
–2
dos electrones más y dos protones rompe el puente peróxido, y la reacción con otros dos protones permite la
liberación de dos moléculas de H O, restaurándose la enzima en su forma inicial completamente oxidada (v. fig. 112
12). Los cuatro protones implicados en esta reacción son tomados exclusivamente de la matriz mitocondrial,
contribuyendo así directamente al gradiente de protones. Además de estos cuatro protones implicados en la
formación de dos moléculas de H O, se sabe que el complejo IV también bombea al espacio intermembrana otros
2
cuatro protones a través de dos canales presentes en la subunidad I.
Como hemos comentado con anterioridad, la energía liberada durante la transferencia de electrones al O a lo largo
2
de la cadena de transporte electrónico se emplea para translocar protones a través de la membrana interna
mitocondrial. Esto hace que el espacio intermembrana sea más ácido que la matriz, y que la cara externa de la
membrana interna posea más carga positiva, mientras que la cara interna es más negativa. De esta manera se establece
474
un gradiente de carga y de protones (gradiente electroquímico), y el retorno de estos protones a la matriz para igualar
su distribución aportará la energía requerida para la síntesis de ATP. El transporte electrónico y la síntesis de ATP
están estrechamente acoplados, de manera que los electrones solo fluyen a lo largo de la cadena respiratoria si a la vez
el ADP se convierte en ATP.
La síntesis de ATP se lleva a cabo por el complejo V, un gran complejo proteico de más de 500 kDa formado por
dos grandes dominios: F y F (fig. 11-13). El dominio F está compuesto por cinco subunidades diferentes (α β γδɛ),
1
O
1
3
3
dos de ellas codificadas por el genoma mitocondrial, y se encuentra orientado hacia el espacio de la matriz. La
subunidad β de este dominio presenta sitios de unión para ADP y ATP, y posee la actividad catalítica ATP sintasa. El
domino F es una estructura integral de membrana que contiene el conducto de protones del complejo. F está
O
O
formado por 10 subunidades c insertadas en la membrana formando un anillo, y una subunidad a en la periferia del
anillo. Los dominios F y F están conectados mediante un tallo central compuesto por subunidades de F (γɛ) y una
1
O
1
columna externa formada por una subunidad a, dos subunidades b y la subunidad δ. Se puede considerar que la
enzima está compuesta por una parte móvil que gira, el anillo c y el tallo γɛ, así como una parte estacionaria
compuesta por el resto de la molécula. El paso de protones tiene lugar a nivel del dominio F gracias a la interacción
O
de la subunidad a con las subunidades c. En este proceso se induce la rotación del anillo c, que en su movimiento
arrastra a la subunidad γ. La rotación de la subunidad γ, localizada en el centro del hexámero α β , provoca cambios
3
3
de conformación en las subunidades β que facilitan la conversión del ADP y el Pi en ATP, además de la liberación del
ATP sintetizado.
FIGURA 11-13 Estructura de la ATP sintasa. OSCP, proteína que confiere sensibilidad a la oligomicina.
475
Como hemos visto, la síntesis de ATP tiene lugar en la matriz mitocondrial; sin embargo, la utilización de esta
molécula, así como la formación del ADP, ocurren principalmente en compartimentos celulares biosintéticamente
activos, como el citoplasma. No obstante, debido a su carga negativa, los nucleótidos no pueden cruzar libremente la
membrana mitocondrial interna. Esta situación se resuelve con la participación de un sistema de transporte específico
a cargo de la ATP-ADP translocasa. Este transportador es una proteína de 30 kDa muy abundante (15% del contenido
proteico de la membrana mitocondrial interna), que contiene un único centro de unión para nucleótidos orientado
alternativamente hacia la matriz o el espacio intermembrana. La ATP-ADP translocasa realiza el transporte de
nucleótidos de manera acoplada; así se exporta una molécula de ATP de la matriz y se importa una molécula de ADP
desde el espacio intermembrana. El ATP puede fluir hacia el citosol por los poros de porina de la membrana
mitocondrial externa. A pesar de que ambos nucleótidos se unen con igual afinidad a la translocasa, el transporte de
ATP hacia el exterior y del ADP al interior de la matriz se ve favorecido. Esto se explica por la diferencia de carga
entre el ATP (4 ) y el ADP (3 ), de manera que el intercambio de un ATP por un ADP resulta en el movimiento neto de
–
–
una carga negativa fuera de la matriz, lo cual equivale a la importación de un protón. El potencial de membrana
establecido durante la transferencia de electrones es positivo en la superficie externa de la membrana mitocondrial
interna, lo cual favorece la salida del ATP, que tiene mayor carga negativa que el ADP. El intercambio ATP/ADP es,
por lo tanto, energéticamente costoso, hasta el punto de que una cuarta parte del rendimiento energético de la cadena
respiratoria se consume para regenerar el potencial de membrana perdido en este intercambio. El fosfato necesario
para la síntesis de ATP es también transportado desde el citoplasma. Este proceso también depende energéticamente
del gradiente osmótico de protones.
476
Especies reactivas de oxígeno y defensa antioxidante
mitocondrial
La mayoría de las reacciones de oxidación que ocurren en el metabolismo celular resultan en la transferencia de
electrones a aceptores como el NAD y el FAD , los cuales son, como hemos visto anteriormente, oxidados en la cadena
+
+
de transporte electrónico en la mitocondria. El aceptor final de estos electrones es la molécula de oxígeno, que es
reducida de manera secuencial por la citocromo c oxidasa. Si bien la transferencia de cuatro electrones a una molécula
de O da lugar a productos inocuos (dos moléculas de H O), la propia estructura del O permite la generación de
2
2
2
formas parcialmente reducidas que pueden resultar peligrosas para la célula, conocidas colectivamente como
radicales libres de oxígeno. La transferencia de un electrón al O resulta en la producción del anión superóxido (O ), y
2
–2
la adición de un electrón más genera peróxido de hidrógeno (H O ). El peróxido de hidrógeno no es un radical libre per
2
2
se, pero en presencia de Fe o Cu puede convertirse, mediante las reacciones de Fenton o de Haber-Weiss, en el radical
2+
+
hidroxilo (OH•), que es indudablemente el más peligroso por su capacidad de generar otros radicales tóxicos. Si bien
la citocromo c oxidasa es particularmente eficiente para no liberar intermediarios parcialmente reducidos al retener
fuertemente al O entre los iones Fe y Cu del centro binuclear, pequeñas cantidades de radicales libres se liberan
2
inevitablemente durante las reacciones de transferencia de electrones. Uno de los puntos en la cadena de transporte
electrónico donde se producen radicales libres con mayor facilidad es a partir de la semiquinona generada durante la
reducción de la ubiquinona por los complejos I y II. Esta semiquinona puede transferir un electrón al O para formar
2
O.
–2
Las especies reactivas de oxígeno pueden causar daño a la mayoría de las macromoléculas que forman las células.
Por ejemplo, los fosfolípidos de las membranas pueden sufrir los denominados procesos de peroxidación lipídica, una
reacción en cadena en la que los ácidos grasos poliinsaturados son atacados por el radical OH•, generándose
peróxidos lipídicos. Esta lesión de las membranas altera su permeabilidad causando, por ejemplo, graves alteraciones
en la distribución de iones y, por lo tanto, en la función celular. Por otra parte, ciertos aminoácidos constituyentes de
las proteínas (como la metionina, la cisteína, la prolina, la histidina y la arginina) son también susceptibles de ser
atacados por estos radicales de oxígeno. Estas reacciones pueden llevar a la fragmentación y formación de agregados
proteicos que igualmente suponen un riesgo para la viabilidad celular. La consecuencia más grave de la formación de
especies reactivas de oxígeno es, sin embargo, su capacidad de dañar el material genético tanto nuclear como
mitocondrial. Los radicales OH• pueden producir roturas de las cadenas de ADN y mutaciones, siendo el ADNmt
más susceptible que el ADN genómico a este tipo de lesión. Esto se debe a que el ADNmt está más próximo que el
ADN genómico al lugar de producción de radicales libres, pero también a que carece de la protección conferida por
las histonas, y a la ausencia de la maquinaria de reparación del ADN que se encuentra en el núcleo. Como veremos
más adelante, las lesiones del ADNmt pueden resultar en la disminución de la capacidad de producción de ATP, y
dar lugar así a las denominadas enfermedades mitocondriales.
477
Para contrarrestar los efectos nocivos de los radicales libres de oxígeno las células poseen una serie de estrategias de
defensa. La más importante es la enzima superóxido dismutasa, de la que existen dos isoenzimas intracelulares: una
mitocondrial dependiente de manganeso y otra citosólica dependiente de cobre y zinc (cationes presentes en sus
centros activos). La forma oxidada de la enzima se reduce por el O formando O (fig. 11-14). Seguidamente, la forma
–2
2
reducida de la enzima reacciona con un segundo O y dos protones para producir H O y regenerar la forma oxidada
–2
2
2
de la enzima (v. fig. 11-14). A su vez, el H O producido por la superóxido dismutasa es eliminado por otra enzima
2
2
llamada catalasa. La catalasa es una proteína que contiene un grupo hemo y que, como veremos más adelante, se
localiza preferentemente en los peroxisomas, aunque también está presente en la mitocondria y el citoplasma. La
catalasa convierte el H O en O y H O. Finalmente, el H O y los peróxidos lipídicos pueden ser también neutralizados
2
2
2
2
2
2
por la glutatión peroxidasa. Esta proteína es una selenoenzima, localizada tanto en el citoplasma como en las
mitocondrias, que emplea el grupo sulfhidrilo del glutatión (GSH) como donante de hidrógeno. En el proceso de
reducción de los peróxidos, el GSH se oxida a su forma disulfuro (GSSG). Otra enzima, la glutatión reductasa,
regenera la forma reducida del GSH, empleando NADPH producido a partir de la glucosa en la ruta de las pentosas
fosfato.
FIGURA 11-14 Mecanismo de la superóxido dismutasa.
478
Patologías relacionadas con la mitocondria
Se consideran enfermedades mitocondriales aquellas en las que la afectación de la función mitocondrial,
principalmente la capacidad respiratoria y de síntesis de ATP, es la primera causa de la patología. Las enfermedades
mitocondriales pueden ser causadas por mutaciones en el ADNmt, adquiridas o heredadas, o en genes nucleares que
codifican componentes de la mitocondria. Una idea de la incidencia de este tipo de enfermedades la da la estimación
de que aproximadamente 1 de cada 4.000 niños en EE. UU. desarrollará una enfermedad mitocondrial hacia los 10
años de edad. Como se ha indicado previamente, el ADNmt puede experimentar mutaciones con más facilidad que el
ADN genómico. Como también mencionamos, la herencia del ADNmt es diferente a la del ADN nuclear. Mientras
que en el ADN nuclear cada copia del genoma proviene de uno de los progenitores, el ADNmt es heredado
exclusivamente de la madre. Cada mitocondria contiene varias copias de ADNmt, y durante la división celular las
moléculas de ADNmt se separan al azar entre las mitocondrias hijas y, posteriormente, entre las células hijas. Cuando
no hay mutaciones en el ADNmt todas las células tendrán el mismo ADNmt; es decir, estas células son
homoplásmicas. Sin embargo, en las células pueden aparecer moléculas de ADNmt mutadas que coexisten con
ADNmt normal, dando lugar a la situación conocida como heteroplasmia. A lo largo de diferentes divisiones
celulares la segregación al azar del ADNmt normal y mutado entre mitocondrias y células hijas puede dar lugar a
distintas situaciones: homoplasmia para el ADNmt normal, heteroplasmia y homoplasmia para el ADNmt mutado (v.
fig. 11-2). La manifestación clínica de la enfermedad mitocondrial y el grado de afectación patológica dependerá, por
lo tanto, del porcentaje de ADNmt defectuoso presente en la célula. Esto significa que las enfermedades
mitocondriales se manifiestan cuando el defecto en la capacidad de producir ATP debido a la presencia de ADNmt
mutado no puede ser compensado por las moléculas de ADNmt normal presentes en la mitocondria; es decir, cuando
se cruza el umbral mínimo de producción de energía para mantener la función celular. Todos estos hechos explican
que las enfermedades mitocondriales se manifiesten principalmente en los órganos con mayor requerimiento
energético y que, como veremos más adelante, constituyan un grupo muy heterogéneo de patologías.
Las enfermedades mitocondriales se producen en su mayoría por mutaciones puntuales en el ADNmt que son
heredadas por vía materna. Sin embargo, en algunos casos se detectan otro tipo de aberraciones, como deleciones o
duplicaciones, que no son heredadas por vía materna, y se piensa que aparecen en fases tempranas del desarrollo
embrionario. Por otra parte, cada vez se describen más enfermedades mitocondriales que obedecen a una herencia
mendeliana, lo que indica que su origen radica en mutaciones del ADN nuclear. Estas mutaciones pueden afectar a
proteínas implicadas en la biogénesis mitocondrial, cuya alteración acaba produciendo también aberraciones en el
ADNmt. También pueden sufrir mutaciones genes nucleares que codifican subunidades de los complejos
respiratorios, afectando a su función o a su entrada en la mitocondria. En estos casos se produciría un déficit en la
respiración mitocondrial sin afectar al ADNmt.
479
Las consecuencias patológicas de las enfermedades mitocondriales pueden ser muy diversas. La distribución del
ADNmt defectivo puede variar de un órgano a otro, y cada mutación puede interaccionar de manera distinta con el
fondo genético de cada individuo. Así, la mutación que en una persona produce una enfermedad hepática, en otra
puede afectar al cerebro. Las enfermedades mitocondriales son más severas cuando las mitocondrias defectivas se
acumulan en las células del sistema nervioso central, el músculo, el corazón, los islotes pancreáticos, el hígado o los
riñones; es decir, aquellos tejidos que emplean más energía que otros. La gravedad de la afectación se ve condicionada
por el tipo de mutación y el grado de heteroplasmia.
Para su estudio, las enfermedades mitocondriales se pueden clasificar en dos grandes grupos: aquellas producidas
por mutaciones presentes en el ADNmt (mutaciones puntuales y deleciones) o enfermedades que se originan por
alteraciones del ADN nuclear (mutaciones de genes nucleares que controlan el genoma mitocondrial o mutaciones de
genes nucleares que participan directamente en la respiración). Entre las enfermedades debidas a mutaciones
puntuales del ADNmt encontramos la neuropatía óptica hereditaria de Leber (LHON), caracterizada por la pérdida
total de la visión, siendo la primera enfermedad que fue asociada a una mutación en el ADNmt heredada por vía
materna. Se han descrito tres mutaciones (producidas en los nucleótidos 3460, 11778 y 14484) que, sin necesidad de
otras alteraciones, desencadenan la enfermedad, pero los mecanismos detallados de su patología se desconocen. Otro
ejemplo de enfermedad asociada a mutaciones puntuales, en este caso en el gen del ARNt (nucleótidos 8344 y 8356),
Lys
es la epilepsia mioclónica con fibras rojas rotas (MERRF). La presencia de un ARNt mutado produce defectos en la
Lys
síntesis de proteínas mitocondriales, lo cual se refleja en un déficit de la actividad de los complejos respiratorios. La
MERRF se caracteriza por la aparición de convulsiones generalizadas y la degeneración del tejido muscular, que
presenta «fibras rojas rotas» y acúmulos de mitocondrias; estas aparecen teñidas de color rojo púrpura con el
tricrómico de Gomori, y representan una respuesta proliferativa compensatoria (fig. 11-15). Los pacientes pueden
presentar demencia, sordera, neuropatía y miocardiopatía, entre otras manifestaciones clínicas. En personas jóvenes se
requiere la presencia de más del 95% del ADNmt mutado para que se desarrolle un fenotipo. El síndrome de
encefalomiopatía mitocondrial con acidosis láctica (MELAS) se caracteriza por la aparición de accidentes
cerebrovasculares, demencia y convulsiones. El MELAS también se ha asociado a mutaciones en genes que codifican
ARNt, aunque la mutación más común ocurre en el nucleótido 3243, en la región 3’ del gen del ARNr 16S.
480
FIGURA 11-15 «Fibras rojas rotas»: técnica de Gomori. Los depósitos anormales de mitocondrias aparecen de color rojo en el
subsarcolema y en el espacio intermiofibrilar (flecha). (Procedente de Smeitink J, van den Heuvel L, DiMauro S. The genetics and pathology of oxidative
phosphorylation. Nat Rev Genet 2001;2:342-52.)
Las deleciones del ADNmt se sospecha que ocurren durante el proceso de replicación. En general, en un paciente
se detecta un solo tipo de deleción, aunque existen familias en las que se encuentran deleciones múltiples. La
magnitud de las deleciones es variable, pero puede alcanzar a la mitad del ADNmt. La deleción más común, presente
hasta en un 50% de los casos, afecta a una región de 4.997 nucleótidos, que incluye entre otros genes una subunidad
de la ATPasa. Todas las deleciones producen una disminución del material genético mitocondrial, que incluye,
además de subunidades de la ATPasa, varios ARNt, genes que codifican componentes de la cadena respiratoria y, en
algunos casos, genes de los ARNr. Estas alteraciones resultan en una capacidad reducida para responder a las
necesidades energéticas de las células. Además, se ha observado que el porcentaje de moléculas de ADNmt que
presentan deleciones aumenta con la edad, lo que se ha atribuido a la mayor velocidad de replicación de las moléculas
de ADN mutadas, las cuales son más pequeñas. Se han descrito más de 100 deleciones diferentes, y sus
manifestaciones clínicas son distintas en niños y adultos. En los niños la enfermedad es más progresiva y
multiorgánica, mientras que en adultos suelen ser alteraciones neuromusculares que progresan más despacio.
Existen también enfermedades producidas por alteraciones de genes nucleares implicados en el control del
genoma mitocondrial. Un ejemplo de este tipo de enfermedades son las que se asocian a una reducción del número de
copias del ADNmt. Se han descrito tres fenotipos para esta clase de enfermedad: la hepatopatía infantil mortal, la
miopatía congénita y la miopatía infantil. Esta alteración en el número de copias del ADNmt presenta un patrón de
herencia mendeliana autosómica recesiva y, como era de esperar, las células afectadas presentan una reducción en la
actividad de la cadena respiratoria. Aunque no se puede descartar la implicación de otros genes nucleares, se ha
descrito que el defecto puede residir en una alteración del factor de transcripción mitocondrial (mtTFA), el cual es
necesario para regular el número de copias del ADNmt en la embriogénesis.
Finalmente, se han descrito cuadros clínicos con herencia mendeliana en los que hay una profunda afectación de la
actividad respiratoria mitocondrial y, sin embargo, no hay alteraciones en el ADNmt. La enfermedad mejor
481
caracterizada es el síndrome de Leigh, la patología mitocondrial más frecuente en niños. Estos pacientes presentan
una encefalopatía necrosante, con profundas alteraciones neurológicas y respiratorias. Aunque en algunos casos
pueden presentarse mutaciones en el ADNmt, la forma más frecuente presenta una reducción de la actividad de la
citocromo c oxidasa sin que existan mutaciones en los genes nucleares que codifican esta enzima. Parece que la
mutación se encuentra en un gen nuclear cuyo producto está implicado en el ensamblaje del complejo citocromo c
oxidasa.
Actualmente no se dispone de tratamientos específicos para las enfermedades mitocondriales. La administración de
vitaminas, como las del complejo B, coenzima Q, L-carnitina, o antioxidantes como la vitamina E, vitamina C o el
ácido lipoico, pueden ayudar a reducir los síntomas, y a retrasar o a prevenir la progresión de la enfermedad.
482
Peroxisomas. Estructura y participación en el metabolismo
oxidativo
Los peroxisomas son orgánulos intracelulares que se localizan en el citoplasma de las células eucarióticas y están
definidos por una membrana lipídica que contiene una matriz formada por proteínas solubles (fig. 11-16). Son
abundantes en órganos del cuerpo humano como el hígado, el riñón y los pulmones.
FIGURA 11-16 Micrografía electrónica de un peroxisoma de hepatocito. (Reproducida a partir de Don W. Fawcett. The Cell. Philadelphia: Saunders, 1981.)
Estos orgánulos, generados a partir del retículo endoplasmático, pueden observarse por medio del microscopio
electrónico o mediante técnicas citoquímicas específicas, como la diaminobencidina y H O , que reaccionan con la
2
2
catalasa (una enzima que abunda en su interior y que se considera un marcador universal de peroxisomas). Similares
a los lisosomas, los peroxisomas son pequeñas estructuras esféricas, que también adoptan formas elongadas o
pequeñas redes tubulares frecuentemente asociadas a gotas de grasa. Poseen un diámetro variable de entre 0,3 y 1,5
μm. Morfológicamente también conviene destacar que dentro del peroxisoma se halla el denominado cristaloide, que
corresponde normalmente a precipitados cristalinos de la enzima urato oxidasa.
Los peroxisomas desempeñan funciones esenciales en el metabolismo lipídico, y participan tanto en reacciones
catabólicas (oxidación de ácidos grasos de cadena larga) como anabólicas (síntesis de plasmalógenos y ácidos biliares).
Los peroxisomas no contienen material genético y, por lo tanto, los más de 50 tipos diferentes de proteínas que se
localizan en su interior son codificados en el núcleo, traducidos en el retículo endoplasmático y posteriormente
importados al peroxisoma por sistemas de transporte específico. El transporte de proteínas a los peroxisomas
presenta algunas diferencias importantes con los sistemas de transporte mitocondrial anteriormente descritos. En
primer lugar, las proteínas que serán transportadas a los peroxisomas generalmente poseen una secuencia señal en su
extremo C-terminal, que les permite ser reconocidas y formar complejos con receptores solubles en el citoplasma.
483
Estos receptores dirigirán a los complejos hacia la superficie del peroxisoma, donde interaccionan con proteínas de
anclaje y la maquinaria de transporte, siendo translocadas a la matriz de este orgánulo en un proceso dependiente de
ATP. Este sistema tiene la particularidad de que es capaz de transportar proteínas completamente plegadas, incluso
complejos oligoméricos, al interior del peroxisoma.
Los mecanismos por los que los metabolitos y cofactores enzimáticos circulan entre el citoplasma y la matriz de los
peroxisomas no son del todo conocidos, en parte por la dificultad de aislar estos orgánulos manteniendo sus
propiedades intactas. Se ha propuesto que la membrana del peroxisoma presenta una permeabilidad selectiva a las
moléculas pequeñas. Por ejemplo, metabolitos pequeños como el urato pueden atravesarla libremente por canales,
mientras que otros metabolitos más voluminosos, como los nucleótidos de adenina o los ácidos grasos esterificados
con CoA, poseen transportadores específicos. Sin embargo, aún no se han identificado transportadores para los
cofactores, que desempeñan un papel esencial en el metabolismo oxidativo de los peroxisomas, como el NADH y el
NADPH, por lo que se ha sugerido que existe un pool de estos cofactores que es específico de los peroxisomas.
Una de las funciones metabólicas fundamentales de los peroxisomas son las reacciones de β-oxidación. Estas
reacciones, como vimos anteriormente, también ocurren en las mitocondrias, las cuales son capaces de oxidar ácidos
grasos de cadena larga e intermedia provenientes de la dieta. Sin embargo, los ácidos grasos de cadena muy larga
solamente se oxidan en los peroxisomas. En contraste con la mitocondria, el sistema de β-oxidación de los
peroxisomas no es capaz de degradar completamente los ácidos grasos, al carecer de la cadena de transporte
electrónico y del ciclo de Krebs. Por lo tanto, para su completa oxidación a CO y H O, productos de la β-oxidación
2
2
peroxisómica como el acetil-CoA, propionil-CoA y ésteres acil-CoA de cadena media deben ser transportados a la
mitocondria. En cambio, los peroxisomas son capaces de oxidar compuestos más complejos que los oxidados en la
mitocondria, como ácidos grasos dicarboxílicos de cadena larga, leucotrienos, prostaglandinas, precursores de ácidos
biliares y determinados ácidos grasos mono- y poliinsaturados. Por lo tanto la β-oxidación en los peroxisomas
cataboliza una serie de ácidos grasos y derivados que no pueden ser procesados en la mitocondria, desempeñando así
un papel esencial en la destoxificación de compuestos cuya acumulación puede ser lesiva para la célula.
Como se mencionó previamente, los peroxisomas también pueden participar en procesos biosintéticos complejos,
como la producción de plasmalógenos. Los plasmalógenos son fosfolípidos con un sustituyente éter alquílico sobre el
carbono 1 del glicerol, y cuyas cabezas polares más comunes son la etanolamina y la colina. Estos lípidos son muy
abundantes en determinados tejidos como el cardiovascular, el nervioso o las células del sistema inmunitario. Aunque
su función no es completamente conocida, se ha propuesto que estos lípidos podrían actuar como protectores frente a
las especies reactivas de oxígeno y como moduladores de las propiedades físicas de las membranas, al mismo tiempo
que participan en mecanismos de señalización celular. Los primeros pasos de su síntesis tienen lugar en los
peroxisomas, en donde la dihidroxiacetona fosfato (DHAP) es primero esterificada en el carbono 1 con un acil-CoA de
cadena larga mediante la acción de la DHAP aciltransferasa (una proteína integral de la membrana del peroxisoma).
Posteriormente el grupo acilo es reemplazado por un alcohol de cadena larga, que proviene del citosol, en una
484
reacción catalizada por la alquil-DHAP sintasa presente en el peroxisoma. El tercer paso en la síntesis de los
plasmalógenos es catalizado por una acil/alquil-DHAP reductasa, que se localiza en la membrana de los peroxisomas
y del retículo endoplasmático, orgánulo donde tienen lugar el resto de los pasos de la síntesis de estos lípidos
complejos.
En las mitocondrias, el primer paso en la β-oxidación de los ácidos grasos es catalizado por acil-CoA
deshidrogenasas dependientes de FAD, las cuales donan los electrones generados en la oxidación a la cadena
respiratoria. Sin embargo, la ausencia de cadena respiratoria en los peroxisomas hace que estos electrones producidos
por las deshidrogenasas dependientes de FAD presentes en estos orgánulos sean transferidos directamente al O ,
2
produciéndose H O . La β-oxidación en los peroxisomas es, por lo tanto, menos eficiente que en las mitocondrias en
2
2
términos de producción de ATP. Sin embargo, en los peroxisomas la energía química liberada en las reacciones de
oxidación se disipa en forma de calor, contribuyendo así a la termogénesis.
Se ha estimado que aproximadamente el 35% de todo el H O producido en el hígado de rata proviene de la
2
2
actividad de las oxidasas peroxisómicas, las cuales son también responsables de un 20% del consumo de O . Este
2
ambiente es proclive a la formación de especies reactivas de oxígeno, como el radical OH• o el anión superóxido, O ,
–2
por lo que los peroxisomas están dotados de eficientes sistemas antioxidantes. El más importante es la catalasa,
enzima mencionada con anterioridad que es capaz de eliminar el H O de manera muy eficiente convirtiéndolo en H O
2
2
2
y O . Además, esta enzima también puede metabolizar otros sustratos como el etanol, metanol, fenol y nitritos gracias
2
a su actividad peroxidasa, en una reacción en la que también se consume H O . Otras enzimas antioxidantes presentes
2
2
en los peroxisomas son las ya mencionadas glutatión peroxidasa y superóxido dismutasa, así como la peroxirredoxina
(esta última con capacidad también de eliminar el H O ).
2
2
Una característica de los peroxisomas es que pueden adaptarse rápidamente a estímulos metabólicos y ambientales
modificando con rapidez su número y tamaño. Los lípidos son potentes inductores de la proliferación de los
peroxisomas. En mamíferos este efecto es mediado por el receptor activador de la proliferación de los peroxisomas α
(PPARα), un receptor nuclear activado por ligandos de naturaleza lipídica que regula la expresión de genes asociados
al metabolismo lipídico, incluidos los genes peroxisómicos. La reducción selectiva del número de peroxisomas se lleva
a cabo mediante un proceso de autofagia altamente coordinado denominado pexofagia. Este proceso y los genes
implicados en él se han caracterizado con detalle en eucariotas unicelulares, aunque ya se dispone de evidencias que
muestran su existencia e importancia en mamíferos.
Mutaciones en genes implicados en la biogénesis de los peroxisomas pueden causar un amplio espectro de cuadros
clínicos severos englobados en el llamado síndrome de Zellweger. Los pacientes afectados por esta enfermedad,
también conocida como síndrome cerebrohepatorrenal, presentan retraso mental, sordera, visión defectuosa,
hepatomegalia y quistes renales, entre otras anomalías, y su muerte se produce en el primer año de vida. Esta
afectación multiorgánica es reflejo de la presencia de peroxisomas defectuosos en todas las células del organismo, en
485
las cuales se ve comprometida la capacidad de llevar a cabo la β-oxidación de ácidos grasos de cadena muy larga y de
sintetizar plasmalógenos. Los genes cuyas mutaciones se han asociado a este síndrome pertenecen a la familia de las
peroxinas (PEX), que codifican proteínas implicadas en el ensamblaje de peroxisomas funcionales. El defecto más
común se observa en el gen PEX1, deficiente en alrededor del 80% de los pacientes, que está implicado en el proceso
de transporte de proteínas de la matriz peroxisómica desde el citoplasma al orgánulo. Las enfermedades asociadas a
defectos en la biogénesis de los peroxisomas fueron el primer caso descrito de malformaciones congénitas resultantes
de un error metabólico, ilustrando así la importancia de las rutas metabólicas en el desarrollo.
La enfermedad peroxisómica más frecuente es la adrenoleucodistrofia, enfermedad genética con herencia ligada al
cromosoma X que produce una desmielinización intensa y la muerte prematura en niños. Esta afección ocasiona la
acumulación de ácidos grasos de cadena muy larga en el sistema nervioso, en las glándulas suprarrenales y en los
testículos. El gen responsable de la enfermedad es ABCD1, que se localiza en una región denominada Xq28 y codifica
para la proteína ALDP, un transportador dotado de un dominio de unión al ATP (ATP-binding cassette) localizado en
la membrana de los peroxisomas. La deficiencia en ALDP asociada a mutaciones puntuales impide la β-oxidación de
los ácidos grasos de cadena muy larga facilitando su acumulación en el plasma y los tejidos.
Lecturas recomendadas
Brenner D, Mak TW. Mitochondrial cell death effectors. Curr Opin Cell Biol. 2009;21(6):871–877.
Brites P, Waterham HR, Wanders RJ. Functions and biosynthesis of plasmalogens in health and disease. Biochim Biophys Acta.
2004;1636(2-3):219–231.
Hock MB, Kralli A. Transcriptional control of mitochondrial biogenesis and function. Annu Rev Physiol. 2009;71:177–203.
Koopman WJ, Willems PH, Smeitink JA. Monogenic mitochondrial disorders. N Engl J Med. 2012;366(12):1132–1141.
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Preguntas de autoevaluación
1. Una característica importante de la membrana mitocondrial externa es:
a. Es impermeable al agua y a la glucosa en condiciones normales.
b. La proporción proteína/lípido es mayor que la de la membrana mitocondrial interna.
c. La proporción proteína/lípido de la membrana es menor que la de la membrana plasmática.
d. Tiene mayor cantidad de enzimas que la membrana mitocondrial interna.
e. Contiene una proteína formadora de canales denominada porina.
Respuesta correcta: e.
2. Señale cuál de las siguientes afirmaciones sobre la síntesis y el transporte de las proteínas mitocondriales es
correcta:
a. El 90% de las proteínas mitocondriales se sintetizan en la matriz mitocondrial.
b. El transporte de las proteínas a la matriz mitocondrial consume energía derivada del potencial de la membrana y
el ATP.
c. Todas las proteínas que serán transportadas al interior de la mitocondria contienen una señal de localización en el
extremo N-terminal.
d. Los ribosomas mitocondriales son iguales a los citosólicos en su estructura y función.
e. La mayoría de los polipéptidos de los complejos respiratorios son codificados por el genoma mitocondrial.
Respuesta correcta: b.
3. Respecto al genoma mitocondrial, indique cuál de las siguientes afirmaciones es falsa:
a. La tasa de mutación del ADNmt es muy superior a la del ADN genómico.
b. Cada mitocondria posee una única molécula de ADN.
c. El ADNmt humano contiene 16.569 pares de bases y codifica 37 genes.
d. Las dos cadenas del ADNmt están casi completamente ocupadas por genes.
487
e. El ADNmt se hereda exclusivamente de la madre.
Respuesta correcta: b.
4. Respecto al ciclo de Krebs, ¿cuál de las siguientes afirmaciones es correcta?:
a. Las enzimas que participan en este ciclo se encuentran localizadas en la membrana interna de la mitocondria.
b. Este ciclo solamente está implicado en procesos catabólicos.
c. En este ciclo se producen NADH y FADH , que serán empleados posteriormente en la cadena de transporte
2
electrónico mitocondrial.
d. Los intermediarios del ciclo de Krebs son utilizados en las denominadas reacciones anapleróticas para la síntesis
de macromoléculas.
e. Ninguna de las afirmaciones anteriores es correcta.
Respuesta correcta: c.
5. ¿Cuál de las siguientes afirmaciones sobre la β-oxidación de ácidos grasos es correcta?:
a. Es un proceso citosólico de síntesis.
b. A diferencia del ciclo de Krebs, no genera FADH .
2
c. Se lleva a cabo en la matriz mitocondrial.
d. Es un proceso de síntesis peroxisómico.
e. Ninguna es correcta.
Respuesta correcta: c.
6. Señale cuál de estas afirmaciones es falsa:
a. El balance entre la supervivencia y la muerte celular depende del tipo de proteínas BCL-2 que se expresan en la
membrana de la mitocondria.
b. Durante la apoptosis la mitocondria importa todas las proteínas celulares.
c. Las proteínas BAX y BAK participan en la apertura de poros en la membrana externa de la mitocondria.
d. La liberación de citocromo c por la mitocondria es parte fundamental de la vía intrínseca de la apoptosis.
e. La muerte celular por apoptosis depende de la activación de caspasas efectoras.
Respuesta correcta: b.
7. Señale cuál de estas afirmaciones sobre los peroxisomas es falsa:
488
a. Los peroxisomas son orgánulos generados a partir del retículo endoplasmático.
b. Los peroxisomas participan en la oxidación de ácidos grasos de cadena larga y en la síntesis de plasmalógenos.
c. El contenido de peroxisomas en una célula no varía en ninguna circunstancia.
d. La ausencia de cadena respiratoria en los peroxisomas hace que los electrones producidos en la β-oxidación de
los ácidos grasos sean transferidos al O , produciéndose abundante H O .
2
2
2
e. Los peroxisomas desempeñan un papel esencial en el metabolismo de la glucosa.
Respuesta correcta: c.
8. En relación con las patologías mitocondriales, señale qué afirmación no es correcta:
a. Las enfermedades mitocondriales afectan principalmente a los órganos con mayor requerimiento energético.
b. La heteroplasmia consiste en la presencia de mitocondrias normales y mutadas en una misma célula.
c. El reparto de mitocondrias en las células hijas se realiza al azar durante la segregación mitótica.
d. Las enfermedades mitocondriales pueden reflejar la presencia de mutaciones tanto en el ADNmt como en el
ADN genómico.
e. Todas las enfermedades mitocondriales se transmiten según una herencia mendeliana.
Respuesta correcta: e.
9. Señale cuál de las siguientes afirmaciones sobre la cadena transportadora de electrones de la mitocondria es
verdadera:
a. Los electrones que se transportan por la cadena transportadora de electrones van siempre unidos al H .
+
b. El ATP sintetizado en la matriz mitocondrial difunde pasivamente al citosol para ser utilizado en diferentes
reacciones metabólicas.
c. El complejo de citocromos de la mitocondria se inicia en el citocromo a y termina en el c.
d. El FADH producido en el ciclo de Krebs se convierte en FAD y cede los electrones del H, que entran en la cadena
2
transportadora de electrones.
e. La energía liberada durante la transferencia de electrones al oxígeno se emplea directamente para la síntesis de
ATP.
Respuesta correcta: d.
10. Señale cuál de las siguientes afirmaciones no es correcta:
489
a. La tasa de mutación del ADNmt es más elevada que la del ADN genómico, al estar expuesto a un mayor estrés
oxidativo.
b. La tasa de mutación del ADNmt es más elevada que la del ADN genómico debido a la ausencia de un sistema de
reparación del ADN.
c. La tasa de mutación del ADNmt es más elevada que la del ADN genómico debido a la ausencia de proteínas
empaquetadoras como las histonas.
d. La tasa de mutación del ADNmt es más elevada que la del ADN genómico debido a la ausencia de factores de
transcripción en la mitocondria.
e. Todas las afirmaciones anteriores son correctas.
Respuesta correcta: d.
490
CAPÍTULO 12
491
El citoesqueleto
Alfonso Calvo
José J. Abad
Luis Montuenga
Objetivos de aprendizaje
• Conocer la estructura de los microtúbulos, microfilamentos y filamentos intermedios del citoesqueleto.
• Comprender el dinamismo de los microtúbulos y los microfilamentos.
• Entender el papel de las proteínas asociadas a microtúbulos y microfilamentos en la regulación de sus funciones
y en su dinamismo o estabilidad.
• Relacionar algunas patologías humanas con alteraciones en la estructura del citoesqueleto.
492
Introducción
El citoesqueleto está constituido por una red de polímeros proteicos que proporcionan soporte estructural a la célula,
posicionan los orgánulos en el citoplasma y están implicados en funciones tan importantes como el movimiento y la
división celular, o el transporte de vesículas. Como se verá más adelante, el citoesqueleto posee un alto dinamismo, ya
que los polímeros que lo componen están en constante proceso de formación y destrucción. Los principales elementos
del citoesqueleto son tres:
1. Microtúbulos.
2. Microfilamentos.
3. Filamentos intermedios.
Cada uno de estos tres tipos de estructuras tiene una composición específica, así como una distribución en el
citoplasma y una función determinadas. Los microtúbulos están compuestos principalmente por la proteína tubulina
y forman cilindros de 25 nm de diámetro. La actina (junto con otras proteínas asociadas) constituye los
microfilamentos, que poseen un diámetro de 7 nm. Los filamentos intermedios, cuyo diámetro es de 8-12 nm, pueden
estar formados por una gran variedad de proteínas, específicas de cada tipo celular. La presencia de citoesqueleto es
un rasgo típico de las células eucariotas, ya que no se encuentra en organismos procariotas.
493
Microtúbulos
Estructura de los microtúbulos. Tubulogénesis in vitro e inestabilidad dinámica
Los microtúbulos son largas estructuras cilíndricas huecas cuyo diámetro exterior mide 25 nm, siendo su diámetro
interior de unos 14 nm. La pared del microtúbulo está formada por 13 protofilamentos compuestos por heterodímeros
de dos proteínas: la α- y la β-tubulina (fig. 12-1). Los microtúbulos se ensamblan mediante adición longitudinal y
reversible de estos heterodímeros. Los procesos de polimerización y despolimerización se pueden estudiar in vitro, en
microtúbulos aislados de la célula. Si se añade α- y β-tubulina monomérica en concentraciones suficientes, GTP y Mg
+2
y se trabaja con una temperatura adecuada (fisiológica), se consigue una polimerización espontánea de los
microtúbulos. Estos experimentos (llamados de tubulogénesis in vitro) han sido muy importantes para entender cómo
funciona la dinámica de los microtúbulos.
FIGURA 12-1 A. Inmunofluorescencia para detectar tubulina en células en cultivo. B. Estructura de un microtúbulo. El dibujo muestra la
pared del microtúbulo, que contiene 13 unidades de tubulina (alternando la α- y la β-tubulina). (B, ilustración de: A. Calvo.)
En las primeras fases de la polimerización, el ensamblaje se produce por adición de heterodímeros de α-/β-tubulina
libre en el medio, que da lugar a oligómeros que constituyen un núcleo inicial de formación del microtúbulo. Este
proceso se le llama nucleación (fig. 12-2). Posteriormente, la unión de nuevos heterodímeros de α-/β-tubulina a ambos
lados del núcleo provoca la elongación. El proceso de nucleación es relativamente lento comparado con el de
elongación, que tiene lugar a gran velocidad. Finalmente se llega a un estado de equilibrio, en el que el microtúbulo
se mantiene con una longitud más o menos constante porque la concentración de tubulina libre en el medio
disminuye, hasta llegar a ser un factor limitante para la reacción de polimerización. Esta es una fase de meseta, en la
que las tasas de adición y eliminación de tubulina en el microtúbulo son semejantes. En efecto, las unidades de α- y βtubulina también se pueden desprender de los microtúbulos, por lo que estos se encuentran en un constante proceso
de formación/destrucción. Los experimentos in vitro han demostrado que el crecimiento de un microtúbulo tiene lugar
preferentemente por uno de los extremos (al que se denomina extremo «más»), mientras que al otro extremo se le
denomina extremo «menos». Por ello se dice que los microtúbulos presentan polaridad. En el extremo (–) de los
microtúbulos queda situada la α-tubulina, mientras que en el extremo (+) se sitúa la β-tubulina (fig. 12-3).
494
FIGURA 12-2 Proceso de tubulogénesis in vitro, en el que se muestran las fases de nucleación, elongación y equilibrio.
FIGURA 12-3 Dinámica de polimerización/despolimerización de los microtúbulos. A. Los dímeros de α-/β-tubulina-GTP se añaden en el
extremo (+), pero la β-tubulina-GTP pasa a β-tubulina-GDP, que es más inestable. B. La formación de un casquete de tubulina-GTP
protege el extremo (+), favoreciendo su rápida polimerización. Si la concentración de tubulina-GTP disminuye, se pierde el casquete y
se produce una abrupta destrucción del microtúbulo. C. Intercambio rotatorio (treadmilling) en los microtúbulos. (Ilustraciones de: A. Calvo.)
La polaridad se explica molecularmente porque la concentración necesaria para que las moléculas de tubulina se
adhieran al polímero es diferente a ambos lados del microtúbulo. En el extremo (+) la concentración crítica para que
tenga lugar la adición al microtúbulo es menor que la concentración del extremo (–); es decir, que se necesita menos
concentración de tubulina libre en el extremo (+) para que se produzca la polimerización, por lo que este extremo
crece con más facilidad que el (–) en condiciones limitantes. Se sabe que para que tenga lugar la polimerización, el
heterodímero de α-/β-tubulina tiene que estar unido a GTP (tanto la subunidad α como la β). La incorporación de
heterodímeros tiene lugar de modo polar, es decir, en el extremo (+) del microtúbulo. Según se van añadiendo los
heterodímeros, el GTP de la β-tubulina (pero no el de la α-tubulina) se disocia a GPD + Pi, poco después de la adición.
Cuando la β-tubulina contiene GTP es estable, pero cuando está unida a GDP pierde estabilidad y tiende a
desprenderse, lo que favorece la despolimerización. Si se da una situación en la cual la concentración crítica de
tubulina libre es mayor que la necesaria para que se produzca la polimerización en el extremo (+), pero menor que la
necesaria para que haya polimerización en el extremo (–), el microtúbulo crecerá por el extremo (+), pero perderá
unidades por el extremo (–). A este fenómeno se le llama intercambio rotatorio (treadmilling en inglés), porque las
moléculas de tubulina que se añaden en el extremo (+) se pierden posteriormente por el extremo (–) (v. fig. 12-3).
Aparte del fenómeno de intercambio rotatorio, los experimentos in vitro han mostrado otro comportamiento de los
microtúbulos aislados: el extremo (+) de los microtúbulos alterna entre fases de rápido crecimiento y fases de
495
acortamiento súbito. La interpretación de este fenómeno no está del todo clara, pero se sugirió el modelo de
inestabilidad dinámica para intentar explicarlo (v. fig. 12-3). En este modelo, la concentración de α-/β-tubulina-GTP
libre en el medio es fundamental para explicar el comportamiento inestable de los microtúbulos. En los experimentos
in vitro, cuando en el medio se encuentran concentraciones elevadas de GTP-tubulina, estas se añaden con gran
rapidez por el lado (+) del microtúbulo, formando un «casquete» de GTP-tubulina que protege de la degradación y
favorece la adición de nuevas moléculas de GTP-tubulina. En cambio, si la concentración de GTP-tubulina disminuye
en el medio, la velocidad de hidrólisis del GTP (que da lugar a GDP-tubulina + Pi) es mayor que la velocidad de
incorporación de GTP-tubulina, por lo que desaparece el «casquete» protector; de este modo, el extremo (+) se vuelve
inestable y sufre entonces una destrucción brusca (y, por lo tanto, una despolimerización). Así, un mismo microtúbulo
puede alternar entre fases de polimerización y fases de despolimerización. La fase de despolimerización brusca se
llama «catástrofe» del microtúbulo, y la vuelta al crecimiento, «rescate».
Tubulogénesis in vivo. Funciones de los microtúbulos en la célula
Los procesos de crecimiento/acortamiento de los microtúbulos ocurren también en la célula, pero no espontáneamente
sino mediante un control altamente regulado. El comportamiento dinámico de los microtúbulos en la célula
(especialmente durante la mitosis) es mucho más rápido que el que tiene lugar experimentalmente en microtúbulos
aislados in vitro. La génesis de nuevos microtúbulos en el citoplasma celular depende de los centros organizadores de
microtúbulos (MTOC, del inglés microtubules organizing centers) (fig. 12-4), regiones muy características de las células
que actúan como lugares de nucleación de los microtúbulos. Los MTOC incluyen estructuras celulares como los
centríolos y los cuerpos basales de cilios y flagelos (v. más adelante).
496
FIGURA 12-4 Los centros organizadores de microtúbulos (MTOC) organizan la polimerización de los microtúbulos en el interior celular.
(Ilustración de: A. Calvo.)
En los MTOC se encuentra un tipo de tubulina especial, la γ-tubulina, cuya presencia es esencial para la
tubulogénesis en el citoplasma celular. El extremo (–) del microtúbulo se sitúa junto al MTOC, mientras que el
extremo (+) se va alejando radialmente del MTOC, hacia la periferia celular, al ir incorporando nuevas unidades de
tubulina, lo que alarga el microtúbulo por el extremo (+). De modo similar a la tubulogénesis in vitro, la disociación de
GTP en GDP + Pi en la β-tubulina debilita la estabilidad de microtúbulo, que tiende entonces a despolimerizarse. Esto
da lugar al fenómeno de la inestabilidad dinámica, que también ocurre in vivo. Mediante técnicas de videomicroscopía
se puede observar que los microtúbulos de la célula alternan también entre fases de crecimiento y decrecimiento
rápido, al igual que ocurría in vitro. Pero, a diferencia de lo que acontece con los microtúbulos aislados, la célula posee
un conjunto de proteínas estabilizadoras que impiden que la polimerización/despolimerización tenga lugar solo en
función de las concentraciones disponibles de GTP-tubulina libre en el medio. Por ejemplo, en los axones de las
neuronas, en los axonemas de cilios y flagelos, o en los centríolos (v. «Agrupaciones complejas de microtúbulos») los
microtúbulos son altamente estables y forman estructuras celulares muy perdurables.
Los microtúbulos participan en numerosas actividades celulares y su correcto funcionamiento es crítico para el
mantenimiento de la fisiología celular. Las principales funciones de los microtúbulos celulares son:
• Contribuyen al establecimiento de la forma particular de cada tipo de célula.
• Participan en el movimiento celular.
• Permiten el transporte de vesículas y orgánulos a lo largo de citoplasma y el mantenimiento de orgánulos en
determinadas localizaciones celulares.
497
• Participan en los procesos de endocitosis y exocitosis.
• Tienen un papel esencial en el movimiento de los cromosomas y cromátidas durante la mitosis y la meiosis.
• Constituyen los centríolos celulares.
• Forman el axonema de cilios y flagelos.
Agentes y fármacos que modifican la formación de microtúbulos
Algunos compuestos modifican la estabilidad de los microtúbulos, variando su proceso normal de
polimerización/despolimerización. Muchos de estos compuestos se descubrieron mediante análisis de productos
naturales para un posible uso terapéutico. El taxol es una sustancia extraída de la corteza del tejo (Taxus baccata) que
aumenta la estabilidad de los microtúbulos, haciendo que se vuelvan demasiado rígidos e impidiendo que
desarrollen sus funciones adecuadamente. Se ha comprobado que el taxol inhibe la despolimerización de los
microtúbulos, impidiendo así su dinamismo durante la mitosis, lo que conduce a las células a la muerte por apoptosis.
Esta propiedad se ha aprovechado para tratar diversos tipos de cáncer (como, p. ej., el de mama, ovario, pulmón o los
sarcomas), ya que las células tumorales poseen una alta capacidad de división. Actualmente se han desarrollado
variantes del taxol, mediante modificaciones químicas, que poseen mayor actividad antitumoral (p. ej., paclitaxel,
docetaxel). Los taxanos (nombre genérico que reciben el taxol y sus derivados) pueden producir efectos secundarios
negativos como la neurotoxicidad, probablemente por la afectación del transporte vesicular de las neuronas, que
depende en gran parte de los microtúbulos.
La colchicina, agente que se extrae de la planta Colchicum autumnale, impide la polimerización de los microtúbulos,
al unirse a las unidades de tubulina libres en el citoplasma y evitar así que se incorporen al microtúbulo. Este
compuesto detiene la mitosis en metafase (en la que los cromosomas poseen un grado máximo de compactación), y es
un agente muy empleado en el diagnóstico citogenético de enfermedades, ya que se utiliza para preparar el cariotipo
celular (v. capítulo 7). La colchicina se emplea poco para el tratamiento del cáncer (está indicada, p. ej., para el
tratamiento de algunos tumores cutáneos), ya que parece tener un rango de acción muy limitado; se ha utilizado para
el tratamiento de la gota y otras enfermedades que cursan con procesos inflamatorios, como la enfermedad de Behçet
(una patología caracterizada por inflamación de los vasos sanguíneos). El efecto antiinflamatorio de la colchicina se
debe a su capacidad de evitar el reclutamiento de leucocitos al sitio de inflamación, ya que la alteración de la dinámica
de los microtúbulos afecta también a la forma y a la capacidad de movimiento de las células. En estas enfermedades se
produce un infiltrado leucocitario en el sitio de inflamación, por lo que la inhibición de la migración de estas células
reduce el proceso inflamatorio, mejorando así la sintomatología de los pacientes.
Algunos alcaloides extraídos de plantas herbáceas del género Vinca, como la vincristina o la vinblastina, poseen
una acción similar a la colchicina, ya que su afinidad por los sitios de unión del GTP en las tubulinas impide el
498
dinamismo normal de los microtúbulos. Estas sustancias se introdujeron en la práctica clínica hace más de 40 años
para el tratamiento de neoplasias hematológicas. Posteriormente, algunos derivados de estas moléculas se han
empleado contra tumores sólidos. También se ha descrito neurotoxicidad asociada al uso de alcaloides derivados de la
vinca.
Proteínas asociadas a los microtúbulos
Las proteínas asociadas a los microtúbulos (MAP, del inglés microtubule associated proteins) tienen la capacidad de
unirse a estos y modificar sus condiciones normales de polimerización/despolimerización; de asociarlos en haces,
redes, etc.; o de permitir el movimiento de orgánulos. Existen dos tipos de MAP:
1. Motoras: son proteínas que consumen energía para desplazarse a lo largo de los microtúbulos con el fin de llevar
vesículas u orgánulos a distintos lugares del citoplasma.
2. No motoras: desarrollan funciones estructurales, como la formación de haces y redes, la estabilización de
microtúbulos, etc.
Las MAP motoras pertenecen a la familia de las quinesinas y dineínas. Los microtúbulos establemente
polimerizados constituyen auténticos rieles sobre los cuales se pueden desplazar vesículas y orgánulos celulares con
la ayuda de MAP motoras (fig. 12-5). Los movimientos de vesículas han sido muy estudiados en neuronas. Las
vesículas se generan en el soma celular y son desplazadas hasta las terminales nerviosas (lugar donde actúan),
debiendo recorrer a veces muy largas distancias, incluso centímetros.
FIGURA 12-5 La dineína y la quinesina permiten el movimiento de vesículas a través de los microtúbulos. La quinesina las transporta
desde el extremo (–) al (+), y la dineína en sentido opuesto. (Ilustración de: A. Calvo.)
Las quinesinas son una familia de proteínas motoras, identificadas por primera vez en el axón gigante del calamar,
que se desplazan desde el extremo (–) hasta el extremo (+) de los microtúbulos. En el caso de neuronas, este
499
movimiento tiene lugar desde el soma hacia el terminal nervioso. Las quinesinas son polipéptidos que se asocian entre
sí para formar una estructura en forma de horquilla, con un tallo y dos prolongaciones a modo de «pies». Utilizando
la energía proporcionada por la hidrólisis de ATP, un «pie» de la molécula experimenta un cambio conformacional y
se desplaza hacia delante, contactando con el microtúbulo unos nanómetros más allá de donde estaba situado,
mientras que el otro «pie» queda libre. Este segundo «pie» realiza el mismo movimiento momentos después, dejando
al primero libre, de tal modo que la molécula se mueve como si estuviera andando sobre el microtúbulo.
La dineína comprende también una familia de proteínas constituidas por varios polipéptidos, con capacidad de
moverse desde el extremo (+) al extremo (–) de los microtúbulos; es decir, en sentido opuesto al movimiento de la
quinesina. Al igual que las quinesinas, las dineínas pueden desplazar vesículas y orgánulos a través de los
microtúbulos.
En el segundo grupo de MAP, sin función motora, se incluyen proteínas que participan en el mantenimiento
estructural de grupos de microtúbulos, o en su desestructuración y disociación. Existen numerosas proteínas
pertenecientes a este grupo de MAP, muchas de las cuales se han identificado también en neuronas. Una de estas
proteínas es tau (τ), una MAP de bajo peso molecular que se asocia a los microtúbulos de los axones neuronales,
confiriéndoles estabilidad y permitiendo que se agrupen en haces paralelos. La proteína τ está muy involucrada en el
desarrollo de diversas enfermedades, llamadas taupatías, entre las que se encuentra la enfermedad de Alzheimer. Por
razones desconocidas, esta proteína puede sufrir hiperfosforilación anormal que favorece su agregación, formándose
entonces placas neuríticas u ovillos de degeneración neurofibrilar, característicos de esta enfermedad. La formación
de estos agregados interfiere con el mecanismo de transporte neuronal de vesículas, lo que provoca la muerte de la
neurona por apoptosis. Las áreas donde hay más degeneración neuronal son el hipocampo y las zonas adyacentes del
lóbulo temporal, ambas de gran importancia en la función de la memoria. El Alzheimer no es la única enfermedad en
la que se han encontrado ovillos de degeneración neurofibrilar: se han descrito también en la parálisis supranuclear
progresiva o en la demencia frontotemporal.
Agrupaciones complejas de microtúbulos
Los microtúbulos se pueden agrupar entre sí para formar estructuras complejas, especializadas en la realización de
determinadas funciones celulares. Los microtúbulos se agrupan para ello en parejas o tríos adosados en paralelo
denominados dobletes o tripletes, respectivamente (fig. 12-6), que se asocian entre sí posteriormente para formar
estructuras celulares más complejas como los centríolos, cilios y flagelos.
500
FIGURA 12-6 A. Los microtúbulos se pueden agrupar formando dobletes y tripletes. B. Estructura de un centríolo. C. Imagen de un
centríolo observado al microscopio electrónico. (C, reproducida a partir de: Burrell MA et al. Atlas de ultraestructura celular. 2.ª ed. Navarra: EUNSA; 2011; A,
ilustración de: A. Calvo.)
Centríolos
Estructura
El centríolo (v. fig. 12-6) está formado por nueve tripletes de microtúbulos dispuestos en una estructura cilíndrica,
que recuerda a un barril hueco. Se caracteriza por tener una estructura de tipo 9 + 0; es decir, que su pared está
3
formada por nueve tripletes de microtúbulos periféricos y no posee microtúbulos en la parte central. Los microtúbulos
de cada triplete se denominan A (correspondiente a un cilindro completo de 13 protofilamentos), B y C (cilindros
contiguos al A, pero incompletos, ya que constan solo de 10 protofilamentos). Cada triplete se une al triplete contiguo
mediante una serie de proyecciones proteicas constituidas por una proteína asociada llamada nexina, que forma como
peldaños de una escalera que recorren toda la longitud del microtúbulo A de cada triplete y lo unen al microtúbulo C
del triplete vecino.
Las células en interfase poseen un par de centríolos (en posición perpendicular uno con respecto al otro) localizados
normalmente en una parte central de la célula, por lo que a estas estructuras se les llama centrosomas. A la pareja de
centríolos se le denomina también diplosoma. En células en mitosis los centríolos se han duplicado y cada una de las
501
parejas aparece como una estructura radial (correspondiente a microtúbulos que emergen de los centríolos) situada en
cada uno de los polos de la célula; estas estructuras reciben el nombre de astrosferas.
Rodeando a los centríolos se encuentra el material pericentriolar, que contiene γ-tubulina, encargada de nuclear
los microtúbulos durante su crecimiento. Los microtúbulos se generan en el material pericentriolar y crecen alejándose
hacia el citoplasma. El extremo (–) del microtúbulo corresponde, por lo tanto, a la zona que está junto al material
pericentriolar, y el (+), al extremo que crece hacia el citoplasma.
Papel de los centríolos en la organización del huso mitótico
Los centríolos organizan los microtúbulos que van a formar el huso mitótico, el cual permite el desplazamiento de los
cromosomas y las cromátidas durante la división celular. Para ello, al igual que los cromosomas, los centríolos se
duplican en la etapa S de la interfase. Al inicio de la profase los centríolos inician la formación de los microtúbulos
mitóticos y se destruyen los microtúbulos interfásicos. Esta es una fase de un alto dinamismo, donde se forman y se
destruyen microtúbulos a gran velocidad. La formación del huso mitótico implica la estabilización de microtúbulos
que emergen de los centrosomas, los cuales se pueden clasificar en tres tipos:
1. Microtúbulos cinetocóricos: se unen por su extremo (+) al cinetocoro de los cromosomas, lo cual estabiliza los
microtúbulos.
2. Microtúbulos polares: emergen de los centrosomas pero no contactan con los cromosomas, sino que se estabilizan al
contactar con otros microtúbulos antiparalelos que crecen a partir del centrosoma del polo opuesto.
3. Microtúbulos astrales (o del áster): parten del centrosoma y se extienden hacia la periferia celular, en dirección
opuesta al centro del huso.
Durante la metafase, los microtúbulos sitúan a los cromosomas condensados en la placa metafásica, y en la anafase
las cromátidas hermanas se separan, desplazándose hacia los polos opuestos del huso. El movimiento de las
cromátidas hacia los polos depende de la dinámica de polimerización/despolimerización de los microtúbulos en la
anafase. Se pueden distinguir dos etapas en la anafase: anafase A y anafase B, en las que intervienen distintos tipos de
microtúbulos y proteínas asociadas a los microtúbulos para llevar a cabo la migración de las cromátidas (fig. 12-7). En
la anafase A (o anafase temprana), los microtúbulos cinetocóricos se van acortando, arrastrando tras de sí a la
cromátida a la que estaban unidos. Esto ocurre porque hay una eliminación progresiva de unidades de tubulina del
extremo (+) que estaban ancladas en el cinetocoro. Al mismo tiempo, se produce una actividad de proteínas motoras
unidas al cinetocoro, que avanzan hacia el centrosoma al cual se dirige la cromátida, a la vez que se van perdiendo
unidades de tubulina, lo que conlleva el acortamiento de microtúbulos y el arrastre de la cromátida hacia el polo (v.
fig. 12-7).
502
FIGURA 12-7 La dinámica de microtúbulos desempeña un papel esencial durante los movimientos de los cromosomas y las
cromátidas en la mitosis. A. En la anafase A las cromátidas se mueven hacia los polos; en la anafase B se produce una separación de
los polos. B. La despolimerización de los microtúbulos en los cinetocoros de las cromátidas y la acción de las proteínas motoras
permiten que las cromátidas migren hacia los polos. C. La polimerización de los microtúbulos, junto con su separación (por las
proteínas motoras), provoca el alejamiento de los polos en la anafase B. (Ilustraciones de: A. Calvo y C. Bravo.)
En la anafase B (o anafase tardía) los polos del huso se separan entre sí. En este proceso participan los microtúbulos
polares antiparalelos, que contactan entre sí por medio de proteínas motoras, formando como peldaños de una
escalera. Las proteínas motoras desplazan los microtúbulos polares antiparalelos en sentidos opuestos, causando la
separación de los polos. La adición de unidades de tubulina en los extremos (+) de estos microtúbulos, junto con la
actuación de las proteínas motoras, permite un alargamiento de los microtúbulos y la separación progresiva de los
polos (v. fig. 12-7). El otro tipo de microtúbulos del huso (los del áster) también participa en el alejamiento de los
polos: las proteínas motoras ancladas en el córtex celular se unen al extremo (+) de los microtúbulos y los desplazan
hacia la periferia celular; a la vez, se eliminan unidades de tubulina de este extremo. El efecto resultante es un arrastre
de los polos del huso hacia el córtex celular, alejándose entre sí.
Cilios
Los cilios son proyecciones celulares cilíndricas de unos 0,25 μm de ancho y aproximadamente 5 μm de longitud,
situados en la superficie libre de las células; están formados por un eje de nueve dobletes de microtúbulos periféricos
que quedan rodeando a dos microtúbulos centrales. Esta estructura se denomina axonema, y está rodeada por la
membrana plasmática. Existen dos tipos de cilios, que se diferencian por la estructura del axonema y por la función
que desempeñan: a) los cilios móviles (figs. 12-8 y 12-9), y b) los cilios inmóviles, también llamados cilios primarios.
Tradicionalmente, los cilios con un axonema cuya estructura interna de microtúbulos es como la descrita, es decir, de
tipo 9 + 2 (nueve dobletes de microtúbulos periféricos y dos centrales), se llaman también «móviles», mientras que los
2
del tipo 9 + 0 (sin el par central de microtúbulos) se llaman «inmóviles» o «cilios primarios». Los cilios inmóviles 9 + 0
2
2
503
se encuentran normalmente como cilios únicos (un cilio por cada célula) y actúan como antenas que recogen señales
extracelulares para transmitirlas al interior celular. De todos modos, esta clasificación tiene sus excepciones; por
ejemplo, hay cilios del tipo 9 + 0 en el nódulo primitivo del embrión que tienen una motilidad giratoria. También hay
2
cilios inmóviles del tipo 9 + 2 que carecen de brazos de dineína (proteína motora del cilio), y que pueden ser
2
encontrados en órganos sensores como el oído interno y el epitelio olfatorio.
FIGURA 12-8 Estructura de un cilio móvil. Las secciones transversales al nivel del tallo y del cuerpo basal muestran su diferente
estructura interna. (Ilustración de: A. Calvo.)
504
FIGURA 12-9 A. Imagen de microscopía electrónica de transmisión de un corte transversal del tallo de un cilio donde se observa la
estructura característica 92 + 2 del axonema. B. Imagen de microscopía electrónica de transmisión de un corte longitudinal de cilios. Se
aprecian el tallo (T), el cuerpo basal (CB) y las raíces (R). (Procedentes de: Vázquez J, López J. Citología práctica. Navarra: EUNSA, 1991.)
Los cilios con función motora se encuentran habitualmente dispuestos en grandes grupos en la superficie apical de
las células de algunos epitelios, como el traqueal y bronquial, donde participan en el desplazamiento del moco para
arrastrar material particulado, bacterias, etc. (que han entrado con el aire inspirado) hacia la parte más alta del tracto
505
respiratorio. Otras células que presentan cilios móviles son las células epiteliales de las trompas uterinas (trompas de
Falopio).
Estructura y función motora de los cilios móviles
Estructura
En los cilios motores se pueden diferenciar tres partes (v. fig. 12-8):
Tallo
Es la parte más larga del cilio y se extiende hacia el exterior celular. Posee un axonema de tipo 9 + 2, rodeado por
2
membrana plasmática. Cada doblete de la pared del axonema está formado por un microtúbulo completo A y otro
incompleto B. Los microtúbulos del par central, denominados singletes, no están unidos entre sí y son ambos
completos (tienen, por lo tanto, 13 protofilamentos cada uno).
Los dobletes adyacentes de la pared del microtúbulo están conectados por nexina, de modo semejante a lo que
ocurría en el centríolo. Desde los nueve dobletes del axonema parten hacia el centro unas estructuras proteicas
llamadas espinas o brazos radiales. Además, de cada microtúbulo A de los dobletes periféricos se extienden dos
brazos de dineína (uno externo y otro interno) hacia el microtúbulo B del doblete contiguo, en el sentido de las agujas
del reloj (v. fig. 12-9). La dineína es la proteína responsable de generar el movimiento ciliar utilizando la energía que le
proporciona la hidrólisis de ATP, ya que tiene capacidad ATPasa.
Cuerpo basal
Se localiza en la base del tallo ciliar y corresponde al centríolo que organizó el axonema del cilio. Su estructura es 9 + 0
3
(idéntica a la del centríolo).
Raíces ciliares
Son estructuras fibrosas, no formadas por microtúbulos, que se extienden hacia el citoplasma para dar sujeción al cilio.
Estas raíces contienen actina y al microscopio electrónico poseen un patrón estriado.
506
Función
Los cilios motores tienen un tipo de movimiento llamado «batido ciliar», que es extraordinariamente rápido: unos 30
batidos por segundo. El movimiento se puede resumir en dos fases: en una primera fase se produce un golpe fuerte y
rápido que curva el cilio, lo que implica un gasto energético y constituye un golpe efectivo; en una segunda fase (más
lenta), se produce un movimiento hacia su postura vertical sin gasto de energía, llamado golpe de recuperación (fig.
12-10). Para que las células ciliadas (p. ej., las del epitelio respiratorio) realicen su función correctamente es
fundamental que todos los cilios batan de modo coordinado (al mismo tiempo y en el mismo sentido). Esto se
consigue mediante un acoplamiento eléctrico de las células que componen el epitelio, que permite el flujo directo de
iones y pequeños mensajeros intracelulares, a través de uniones gap (v. capítulo 6). Entre las muchas alteraciones que
produce el tabaco en el aparato respiratorio se encuentra la disminución del movimiento ciliar, lo que impide que se
desplacen el moco, el polvo, los microorganismos, etc. El humo del tabaco daña las células epiteliales disminuyendo el
movimiento de los cilios, por lo que facilita la aparición de infecciones y otras patologías respiratorias.
FIGURA 12-10 Esquema del movimiento de cilios y flagelos.
Estructura y función sensora de los cilios primarios (inmóviles)
Como hemos indicado, además de las células ciliadas, hay otras muchas células del organismo que tienen un solo cilio
inmóvil. El axonema de este cilio, llamado cilio primario, posee normalmente una estructura 9 + 0 (fig. 12-11) y está
2
especializado en el control de las respuestas sensoriales de la célula. Las proteínas estructurales del cilio no son
propiamente las responsables de la señalización, sino otras proteínas especializadas en estas funciones. Así, la
membrana plasmática que forma los cilios primarios es rica en receptores de canal: policistinas, receptores asociados a
proteínas G, receptores de la familia hedgehog y receptores de tipo tirosina quinasa (v. capítulo 13); estos receptores
pueden unirse a diferentes tipos de ligandos. Aunque los mecanismos de transmisión intracelular de señales
mediados por los cilios primarios no son bien conocidos, se piensa que tienen lugar a través de segundos mensajeros
que provocan cambios en la fisiología celular. Las señales olfatorias dependen del correcto funcionamiento de los
507
cilios inmóviles de neuronas modificadas del epitelio olfatorio. Las ciliopatías en este epitelio pueden causar anosmia
(ausencia o disminución de la capacidad olfativa), como ocurre, por ejemplo, en los pacientes con síndrome de BardetBiedl. Este síndrome se caracteriza por degeneración retiniana, anosmia, retraso mental, presencia de riñones
poliquísticos, hipertensión e hipercolesterolemia, lo que lleva a la muerte prematura de los pacientes. Esta
enfermedad se ha asociado a mutaciones en una familia de proteínas denominadas BBS1 (del inglés, Bardet-Biedl
Syndrome), cuya función se relaciona con la transmisión de señales intracelulares a través de los cilios. Los ratones
knock out para algunos genes BBS también poseen anosmia.
FIGURA 12-11 Cilios primarios o inmóviles. A. Imagen de microscopía de fluorescencia de células renales en cultivo. Las flechas
indican el cilio primario de cada una de las células (en verde intenso, el tallo ciliar; en rojo, el cuerpo basal; el color azul revela la
presencia de los núcleos celulares). B. Imagen de microscopía electrónica de transmisión de un corte longitudinal de un cilio primario
(también se observan microvellosidades, de una longitud mucho menor que la del cilio). C. Representación de un cilio primario y
comparación de su estructura con la de un cilio móvil. (C, ilustración de: A. Calvo.)
Los cilios situados en las células del nódulo primitivo del embrión en fase de gastrulación (días 13 al 19 del
desarrollo) parecen tener un papel determinante en la distribución asimétrica de órganos unilaterales como el
corazón, el estómago, el hígado o el bazo (fig. 12-12). Un paso crucial en el desarrollo embrionario es la determinación
de la bilateralidad, proceso extremadamente complejo en el que se piensa que los cilios de las células del nódulo
primitivo juegan un papel importante. Si se traza una línea vertical que atraviesa el axonema de un cilio móvil, se
observa que existe una diferencia entre el lado derecho y el izquierdo, ya que los brazos de dineína quedan situados
hacia la derecha (v. fig. 12-12). Se piensa que los cilios motores de las células del nódulo primitivo del embrión
generan un movimiento en el sentido izquierda- derecha, arrastrando fluido hacia las células situadas en el borde
derecho del nódulo. Estas células poseen cilios primarios que captan el aumento de flujo e incrementan la
concentración de calcio intracelular. En cambio, las células del lado izquierdo no reciben ese flujo y los niveles de
calcio permanecen bajos. Esta diferencia en la señalización determinaría una expresión diferencial de genes a un lado
y a otro del embrión, lo que conduciría a la correcta colocación de los órganos unilaterales.
508
FIGURA 12-12 El correcto funcionamiento de los cilios primarios parece desempeñar un papel esencial en la determinación de la
posición de órganos unilaterales durante el desarrollo embrionario. A. Dibujo del nódulo primitivo del embrión. B. La posición de la
dineína en el doblete de microtúbulos permite diferenciar entre un lado «derecho» y otro «izquierdo». C. Modelo para explicar la
diferente señalización intracelular que reciben las células en el lado derecho e izquierdo del nódulo primitivo, lo cual podría determinar
el posicionamiento de los órganos unilaterales.
Si este sistema de control falla, se pueden producir alteraciones en la lateralidad de estos órganos, dando lugar al
llamado situs inversus, caracterizado por la presencia de órganos como el corazón, el estómago, el hígado o el bazo en
el lado opuesto en el que están en una persona normal (fig. 12-13).
FIGURA 12-13 Incorrecta disposición de órganos como el corazón, el estómago, el bazo y el hígado en pacientes con situs inversus.
Flagelos
Los flagelos son estructuras con función motora característicos de los espermatozoides, que permiten su
desplazamiento a través del tracto genital femenino. Los espermatozoides están formados por la cabeza (que contiene
el material genético) y la cola, en la que se distinguen tres partes: la pieza intermedia (con mitocondrias que
proporcionan el ATP necesario para el movimiento), la pieza principal y la pieza final. El eje motor del
espermatozoide contiene un axonema de estructura 9 + 2 que recorre toda la cola. Rodeando al axonema en la pieza
2
509
intermedia y principal se encuentran las fibras densas: complejos proteicos que proporcionan soporte, manteniendo
así intacta la estructura del espermatozoide durante los movimientos ondulantes que permiten su desplazamiento (v.
fig. 12-10).
La alteración morfológica de los flagelos puede ocasionar enfermedades reproductivas debidas a la falta de
motilidad espermática. La astenospermia (también llamada astenozoospermia) se caracteriza por una pérdida o
disminución de la motilidad del 50% o más en los espermatozoides del semen. Esta patología puede tener diversas
causas, una de las cuales consiste en las anomalías estructurales del axonema del espermatozoide.
Ciliogénesis
La formación de cilios se denomina ciliogénesis y se inicia con la multiplicación de los centríolos y la migración hacia
la membrana plasmática. Los centríolos se disponen de modo perpendicular a la misma y constituyen así el cuerpo
basal, que actúa como centro de nucleación de tubulinas. Los microtúbulos A y B del cuerpo basal crecen hacia la
periferia celular formando el axonema del tallo ciliar (que queda rodeado de membrana plasmática), mientras que el
microtúbulo C del cuerpo basal no crece. En células epiteliales ciliadas el proceso de ciliogénesis puede ir precedido
de una invaginación de la membrana plasmática apical, por la que se forma una hendidura de ciliogénesis, alrededor
de la cual se alinearían los cuerpos basales que darán lugar a múltiples cilios (fig. 12-14). En una fase posterior, la
membrana se situaría en su posición normal, una vez que los cilios se han formado mediante elongación de los
cuerpos basales. En otros casos se forma una verdadera vacuola citoplasmática (vacuola ciliar), alrededor de la cual
tiene lugar el proceso de ciliogénesis, que posteriormente se dirige a la membrana plasmática apical y se fusiona con
ella, quedando los cilios hacia el exterior celular.
FIGURA 12-14 Proceso de ciliogénesis. La formación de cilios en células ciliadas implica la migración de los centríolos, que se sitúan
perpendicularmente a la membrana plasmática. La nucleación de microtúbulos por parte del centríolo da lugar a la formación del
axonema del cilio. En la imagen, los números corresponden a cilios en fases sucesivas de crecimiento. (C, reproducida a partir de: Don W.
Fawcett. The Cell. Philadelphia: Saunders Company, 1981.)
510
Algunas patologías relacionadas con disfunciones en los cilios
Además de las ciliopatías a las que nos hemos referido previamente, nos detenemos ahora en algunas otras
enfermedades que se asocian a fallos en la función ciliar. La disquinesia ciliar primaria (PCD, del inglés primary
ciliary dyskinesia) es una enfermedad genética autosómica recesiva de escasa incidencia, que se origina por alteraciones
en la estructura del axonema de cilios y flagelos. Esta patología puede provocar bronquitis y sinusitis crónica, otitis e
infertilidad, como consecuencia de alteraciones en la estructura de los cilios del epitelio del tracto respiratorio, oído,
trompa de Falopio, y los espermatozoides. La falta de motilidad de los cilios del aparato respiratorio resulta en un
defectuoso desplazamiento del moco, lo que impide la expulsión de microorganismos y, por lo tanto, facilita las
infecciones crónicas. La causa más frecuente de PCD es la presencia de mutaciones en el gen de la dineína (proteína
motora del axonema). No obstante, se han descrito otras causas, como la ausencia de las espinas radiales o del par
central de microtúbulos, o incluso una completa aplasia ciliar (es decir, ausencia total de cilios). En el 50% de los
pacientes con disquinesia ciliar se puede encontrar también situs inversus. Cuando la sintomatología afecta al aparato
respiratorio y al reproductor, y aparece situs inversus se conoce como síndrome (o tríada) de Kartagener.
En el riñón, los cilios primarios están situados en la parte apical de las células epiteliales de los túbulos renales. En
un principio se pensó que estos cilios no tenían una función importante en la fisiología renal, pero estudios posteriores
demostraron que su alteración puede dar lugar a la aparición de enfermedades como el riñón poliquístico. En
situación normal, el arrastre del fluido que circula por los túbulos renales curva los cilios primarios, originándose una
señalización intracelular cuya respuesta es la correcta absorción de iones y H O por parte de la célula. En el cilio se
2
localizan las policistinas (codificadas por los genes PDK), proteínas que se relacionan con la función mecanosensorial
del cilio renal y con la señalización intracelular. La alteración de la estructura del cilio primario o las mutaciones en las
policistinas dan lugar a una disfunción en la señalización intracelular, que causa una proliferación celular anormal y
la formación de quistes renales llenos de fluido (fig. 12-15). El riñón poliquístico es una de las enfermedades
hereditarias más frecuentes que causa alteración renal progresiva, lo cual origina insuficiencia renal crónica y puede
requerir, en una fase más avanzada, diálisis y trasplante renal.
511
FIGURA 12-15 Imagen de un riñón poliquístico, cuyo desarrollo se asocia a defectos en los cilios primarios de los túbulos renales.
(Procedente de http://www.shef.ac.uk/bms/research/robson/research.)
512
Microfilamentos de actina y filamentos gruesos de miosina
Estructura de los microfilamentos e inestabilidad dinámica
Los microfilamentos (filamentos finos o delgados) tienen un diámetro de 7 nm y están constituidos por polímeros de
actina que forman una doble cadena helicoidal. La actina puede ser de tipo α, que se encuentra exclusivamente en
células musculares; β, localizada en el citoplasma de la mayoría de los tipos celulares no musculares (principalmente
en la periferia celular); y γ, cuya localización suele coincidir con la de la actina β. En células no musculares existe una
compleja red de microfilamentos en la zona del citoplasma cercana a la membrana plasmática, dando lugar a lo que se
denomina córtex celular, que proporciona una cierta rigidez estructural, aunque a la vez permite deformaciones de la
membrana plasmática mediante contracción de los microfilamentos. En las células musculares esqueléticas, la actina
es muy abundante y se distribuye por todo el citoplasma de modo altamente ordenado formando parte de los
sarcómeros (v. más adelante).
Las funciones de los microfilamentos son las siguientes:
• Son responsables de la contracción del sarcómero de las células musculares esqueléticas. También participan en la
contracción de las fibras de músculo liso, aunque en este caso la unidad motora no es un sarcómero organizado.
• Intervienen en el mantenimiento de la forma de cada tipo celular.
• Participan en los movimientos de las células.
• Forman el anillo contráctil en la citocinesis, permitiendo que las células hijas se separen en la fase final de la
división celular.
• Facilitan el anclaje de células vecinas, ya que forman una red intracelular que se une a las zónulas ocluyentes y a
las adherentes.
• Forman el sostén de microvellosidades y estereocilios.
• Participan en el desplazamiento intracelular de vesículas, de forma similar a como lo hacen los microtúbulos.
Para que se lleven a cabo estas funciones, los filamentos de actina interaccionan con proteínas de la familia de la
miosina, cuya propiedad más relevante es la capacidad motora (utilizando la energía proporcionada por la hidrólisis
de ATP) para desplazar los filamentos de actina.
A diferencia de los microtúbulos —formados por heterodímeros—, los microfilamentos están constituidos por
monómeros de actina. Las unidades aisladas de actina se denominan actina G (globular), mientras que la actina en
forma de filamento se conoce como actina F (filamentosa). Al igual que ocurre con la tubulina, la actina puede
513
polimerizarse o despolimerizarse experimentalmente in vitro (fig. 12-16). La polimerización depende de la
concentración de esta proteína en el medio de cultivo y el crecimiento se frena cuando la concentración de actina en el
medio es limitante, de modo que no se pueden incorporar más unidades al polímero.
FIGURA 12-16 Esquema de la estructura de un filamento fino de actina en el que se muestra su dinámica de polimerización y
despolimerización. La actina-ATP se une al filamento por el extremo (+) (llamado «protuberante»), pasando posteriormente a
transformarse en actina-ADP, que es menos estable. La actina-ADP tiende a desprenderse del microfilamento en el extremo (–),
también llamado «puntiagudo».
Los monómeros de actina no son esféricos, sino que se puede distinguir una zona o extremo puntiagudo y un
extremo protuberante. La polimerización ocurre de modo que las moléculas quedan orientadas siempre en el mismo
sentido, estableciéndose (al igual que ocurría con los microtúbulos) una polaridad en el filamento. El crecimiento del
microfilamento se produce fundamentalmente por el extremo protuberante (extremo «más»), mientras que decrece
por el extremo puntiagudo (extremo «menos») (v. fig. 12-16).
La interpretación molecular que explica por qué los microfilamentos crecen por el extremo (+) y decrecen por el (–)
en condiciones experimentales in vitro es semejante a la de los microtúbulos. Las unidades de actina unidas a ATP se
incorporan por el extremo protuberante. Pero tras una lenta hidrólisis del ATP en ADP + Pi, la molécula se vuelve
menos estable y tiende a desprenderse del microfilamento. El crecimiento o decrecimiento depende entonces de la
concentración de actina G disponible en el medio. Los microfilamentos sufren también el fenómeno del intercambio
rotatorio, que es más frecuente que el observado en los microtúbulos. Poseen, además, fluctuaciones en longitud,
creciendo y decreciendo por el extremo (+), pero estos cambios son más lentos y menos importantes que los
observados en microtúbulos, por lo que la inestabilidad dinámica es inferior. Lógicamente, la dinámica de los
microfilamentos observada in vitro no tiene lugar de modo incontrolado en la célula, ya que existen numerosos tipos
de proteínas que regulan la estabilidad y asociación de los microfilamentos en haces o redes.
Las células agrupan los polímeros de microfilamentos para formar haces paralelos o perpendiculares, o intrincadas
redes que proporcionan el soporte estructural necesario para el desarrollo de funciones concretas, como, por ejemplo,
mantener la forma de las microvellosidades, promover el movimiento celular por medio de lamelipodios y filopodios,
o anclarse firmemente a un sustrato (mediante fibras de estrés). La polimerización/despolimerización de la actina
también controla la densidad del citoplasma. Si la polimerización da lugar a la formación de redes o mallas densas, se
514
favorece que el citoplasma adquiera mayor consistencia, y se dice que se encuentra en estado gel. El estado opuesto se
llama sol, en el que el citoplasma carece de dichas redes y es más fluido.
Proteínas unidoras de actina
Como se ha mencionado antes, el comportamiento dinámico de los microfilamentos está fuertemente regulado por la
célula mediante la actividad de proteínas de diversa naturaleza que reciben el nombre genérico de proteínas unidoras
de actina (ABP, del inglés actin-binding proteins) (fig. 12-17). El correcto funcionamiento de estas proteínas es esencial
para el mantenimiento de la estructura del citoesqueleto y para que tengan lugar procesos como la endocitosis, la
motilidad, la polaridad celular, etc. Entre estas proteínas se pueden destacar:
• ADF (actin depolymerizing factor)/cofilina: familia de proteínas que se unen a la ADP-actina G y a la actina F.
Estas proteínas favorecen la tasa de disociación de la ADP-actina G en los extremos (–), induciendo la
despolimerización de los microfilamentos. Esto origina complejos ADF/cofilina-ADP-actina G libres en el citosol,
que no se pueden incorporar de nuevo al microfilamento, ya que la actina está «secuestrada». Para revertir esta
situación es necesaria la actividad de la proteína profilina, que estimula el intercambio de ADP por ATP en la
actina G, desprendiéndose así del complejo ADF/cofilina y quedando libre para su incorporación al
microfilamento por el extremo (+). La ADF/cofilina puede, además, unirse a lo largo de los microfilamentos y
fragmentarlos, dando lugar a otros de menor tamaño (v. fig. 12-17).
• Gelsolina: es también una proteína fragmentadora de microfilamentos que actúa en presencia de Ca . La
+2
gelsolina se une, además, a los extremos (+) de los polímeros de actina, impidiendo así que crezcan (v. fig. 12-17).
Se encuentra abundantemente expresada en células con gran motilidad (como los macrófagos) y también en
organismos unicelulares como las amebas.
• Los filamentos de actina se pueden ramificar formando estructuras en forma de árbol. El complejo proteico
Arp2/3, formado por varias proteínas, participa en la nucleación de la actina y en la ramificación de los
microfilamentos. La unión de Apr2/3 a la actina favorece el inicio de su polimerización en otra dirección y, por lo
tanto, su ramificación (v. fig. 12-17).
• Las proteínas Rho, Rac y cdc42 pertenecen a la familia de las llamadas proteínas G pequeñas y poseen la
capacidad de unir nucleótidos de guanina. La estimulación de cada una de estas proteínas parece ser importante
en la formación de haces de actina con diferentes características. Así, Rho puede contribuir a la formación de
fibras de estrés, Rac favorece la formación de lamelipodios, y cdc42 de filopodios. Estas proteínas son
importantes, además, para que la célula se mueva correctamente y parecen ser muy relevantes en la invasión de
las células tumorales.
515
• Filamina es una proteína que entrecruza los filamentos de actina formando redes ortogonales y participa en el
anclaje de la actina a la membrana plasmática (v. fig. 12-17). En ausencia de filamina, el citoplasma tiende a
permanecer en estado sol.
• WASp (del inglés Wiskott-Aldrich Syndrome protein) promueve la polimerización de la actina en filamentos (v. fig.
12-17). La proteína WASp activa a Arp2/3 para que pueda comenzar la nucleación de los microfilamentos.
Algunas mutaciones en WASp son letales, mientras que otras afectan a la funcionalidad de distintos tipos
celulares. Las mutaciones que dan lugar al síndrome de Wiskott-Aldrich afectan fundamentalmente al sistema
hematopoyético. Este síndrome, de incidencia poco frecuente, cursa con eccema, trombocitopenia, deficiencias en
el sistema inmunitario y diarreas sanguinolentas. Su tratamiento puede requerir transfusión de plaquetas o
incluso trasplante de médula ósea.
• Cortactina: esta proteína se une al complejo Arp2/3 y lo activa; además promueve la polimerización y estabilidad
de los microtúbulos, especialmente en la corteza celular. Se ha descrito un aumento de su expresión en distintos
tipos de cáncer y células malignas metastásicas con alta capacidad de motilidad e invasión.
• Fimbrina y villina: se sitúan en las microvellosidades y organizan los filamentos en haces paralelos (v. fig. 12-17),
como se ha descrito en el capítulo 6.
• Actinina α: fija filamentos de actina para la formación de haces contráctiles del sarcómero muscular (como se verá
más adelante).
• CapZ: actúa taponando el extremo (+) de los microfilamentos situados en el sarcómero. Es una de las proteínas
tipo capping (encapsuladoras, casquete o tapa) que se unen a los extremos de los microfilamentos para estabilizar
su elongación.
• Miosina II: participa en el deslizamiento de los filamentos delgados en la contracción del sarcómero.
• Miosinas I y V: proteínas motoras que son responsables del arrastre de microfilamentos en células no musculares
y del movimiento de vesículas y orgánulos a través de los filamentos de actina.
• Espectrina: esta proteína se asocia con los filamentos de actina para formar una red de sostén que ayuda a
mantener la forma del eritrocito (v. capítulo 3).
• Timosina: se une a las unidades de actina G impidiendo su polimerización espontánea, por lo que promueve que
la actina permanezca en su forma monomérica (v. fig. 12-17).
516
FIGURA 12-17 Esquema de diferentes modos en los que se pueden organizar los microfilamentos tras interactuar con proteínas que
modifican la polimerización/despolimerización de actina.
Agentes que modifican la polimerización/despolimerización de los
microfilamentos
Algunos fármacos y agentes tóxicos son capaces de alterar la dinámica normal de los microfilamentos. La faloidina es
una toxina aislada del hongo venenoso Amanita phalloides, que actúa estabilizando anormalmente los microfilamentos
de actina, impidiendo así su normal dinámica de formación/destrucción. Sin embargo, la potente toxicidad de A.
phalloides no se debe a la faloidina, ya que esta casi no es absorbida por el intestino, y solamente causa gastroenteritis.
La toxicidad de A. phalloides, como se comentó en el capítulo 8, se debe fundamentalmente a la toxina α-amanitina,
que inhibe la actividad de la ARN polimerasa II y causa fallos hepáticos, renales y encefalopatía. La citocalasina D,
una micotoxina de tipo alcaloide, bloquea la polimerización de los microfilamentos al unirse sus extremos (+).
Utilización de la actina de la célula huésped por microorganismos
Determinados microorganismos pueden aprovecharse de la actina celular del huésped para moverse en el citoplasma
e invadir otras células vecinas. Es el caso de la bacteria Lysteria monocytogenes, que causa listeriosis. Esta enfermedad
es una zoonosis bacteriana poco frecuente pero muy grave, que puede ocasionar la muerte hasta en el 40% de las
personas de riesgo infectadas (ancianos y niños). La infección se puede originar por ingestión de alimentos poco
517
tratados como leche, verduras, quesos, etc. Lysteria es un bacilo que se une a la cadherina E de las células del epitelio
del tubo digestivo, se incorpora en una vesícula de endocitosis y posteriormente queda libre en el citoplasma. La
bacteria es capaz entonces de polimerizar la actina G utilizando los complejos Arp2/3 para formar un haz de actina
(llamado cola de cometa) que permite a la bacteria recorrer el citoplasma. El bacilo se coloca perpendicularmente a la
membrana plasmática y las colas de actina hacen protruir esta membrana hacia la célula huésped contigua, facilitando
así su invasión. De este modo, Lysteria puede introducirse en una célula vecina, quedando rodeada por una doble
membrana que digerirá posteriormente (fig. 12-18).
FIGURA 12-18 Utilización del mecanismo de polimerización de la actina por microorganismos para infectar a la célula huésped. A.
Imagen de microscopía de fluorescencia de las colas de actina (flechas) formadas por Lysteria monocytogenes, que se desplaza por el
citoplasma celular. La bacteria aparece en esta imagen de color rojo, la actina en verde y los núcleos celulares en color azul. B.
Esquema de la formación de colas de actina por Lysteria monocytogenes e invasión de una célula vecina. C. Pedestales de actina
formados por la bacteria Escherichia coli. (a): microscopía electrónica de barrido; (b y c): microscopía electrónica de transmisión que
muestra dos cepas distintas; (d): esquema del proceso de formación del pedestal. (A, procedente de: http://www.ibmc.up.pt/research/researchgroups/molecular-microbiology; C, procedente de: Campellone KG. FEBS J 2010;277:2390-2402.)
Otra bacteria capaz de manipular la polimerización de actina en la célula huésped para infectar es Escherichia coli,
una enterobacteria que causa infecciones intestinales. La interacción de la bacteria con proteínas de la membrana
apical de los enterocitos activa una cascada de señalización intracelular que favorece la formación de actina F en
posición perpendicular a la membrana apical, deformándola y constituyendo lo que se conoce como «pedestal», cuya
formación parece facilitar la movilidad de la bacteria a lo largo de la membrana y evitar la fagocitosis (v. fig. 12-18).
Aparte de las bacterias citadas, hay otras muchas que perturban la dinámica normal de los microfilamentos para
infectar a sus células huésped y moverse a través del citoplasma.
La miosina. Formación de filamentos gruesos
518
La miosina es una proteína ubicua, encontrada abundantemente en las células musculares lisas y estriadas, que
interactúa con la actina para realizar diferentes funciones motoras, incluidas la contracción muscular, el transporte de
vesículas a través del citoplasma, etc. El genoma humano contiene 40 genes de miosina distintos. Como característica
general, las diferentes miosinas poseen tres dominios diferentes: a) un dominio globular (cabeza) con capacidad
motora; b) una zona intermedia o cuello, y c) una cola, cuya estructura varía en los diferentes tipos de miosina. El
primer tipo de miosina que se descubrió fue la miosina II, que se aisló del músculo esquelético. La miosina II está
formada por dos proteínas idénticas enroscadas entre sí; por lo tanto, en la molécula de miosina II se distinguen dos
cabezas globulares (dominios motores) y dos polipéptidos idénticos alargados entrecruzados entre sí de forma
helicoidal para formar la cola de la molécula (fig. 12-19). Las cabezas de la miosina II incluyen el extremo N-terminal
de la proteína, mientras que en la cola queda situado el extremo C-terminal.
FIGURA 12-19 A. Representación de las moléculas de miosina I, II y V. B. Imagen de microscopía electrónica de transmisión que
muestra la interacción actina-miosina in vitro. Las moléculas de actina-miosina se unen de forma polarizada dando lugar a una hilera
de puntas de flecha. (B, prodecente de: Waller GS, et al. J Biol Chem 1995;270:15348-52.)
La propiedad fundamental de la miosina es la capacidad de utilizar energía (ATP) mediante su actividad ATPasa
localizada en la cabeza globular. La hidrólisis de ATP genera la energía suficiente para provocar un cambio
conformacional en la proteína; si la miosina está unida a la actina se produce entonces un desplazamiento de los
filamentos de actina, que es el fundamento de la contracción del músculo liso y estriado. La interacción entre la
miosina y la actina se ha estudiado experimentalmente. Las cabezas globulares se pueden separar de las colas
mediante tratamiento enzimático con papaína, comprobándose así que solo las cabezas tienen actividad ATPasa,
esencial para la actividad motora de esta proteína. Si estas cabezas motoras se añaden in vitro junto a actina F y se
observan al microscopio electrónico, se puede ver que la miosina se une espontáneamente a la actina formando unas
estructuras de disposición regular que recuerdan a una hilera de puntas de flechas, todas situadas en la misma
dirección (v. fig. 12-19). La punta de la flecha queda situada hacia el extremo (–) del filamento de actina, mientras que
519
el extremo «barbado» (el de crecimiento) queda hacia el (+). Por lo tanto, existe también una polaridad en la
interacción de estos filamentos, lo cual es importante, como se verá más adelante, para la contracción muscular.
En el músculo estriado, las moléculas de miosina II se asocian entre sí para formar un filamento grueso de 15 nm de
espesor y 1,6 μm de longitud, que incluye 300-400 moléculas entrelazadas entre sí longitudinalmente. Las moléculas
de miosina se agrupan de modo escalonado y dejando las cabezas globulares hacia el exterior del filamento. Cada
filamento grueso posee por tanto un ramillete de moléculas de miosina con las cabezas hacia un extremo del filamento
y otro ramillete antiparalelo orientado hacia el otro extremo (fig. 12-20).
FIGURA 12-20 A. Electronografía del sarcómero. B. La contracción muscular implica una reducción de la longitud de los sarcómeros
de las fibras musculares, mediante un acercamiento de los filamentos de actina hacia el centro del sarcómero. (A, modificada de: Ottenheijm et
al. Respir Res 2008;9:12.)
Aparte de la miosina II, se ha estudiado la estructura y función de otros miembros de la familia de las miosinas,
como la miosina I o la V. La miosina I se dispone en forma sencilla, con una sola cola y una sola cabeza (v. fig. 12-19).
Este tipo de miosina no forma filamentos complejos, sino que cada molécula individual puede interaccionar con un
filamento de actina y moverse a través de él (con gasto de ATP) para transportar vesículas hacia el lado (+) del
filamento. La miosina I también forma parte de las proteínas que componen las microvellosidades (v. capítulo 6),
donde su actividad motora puede arrastrar los filamentos de actina, provocando el movimiento de la microvellosidad.
La miosina V posee dos cabezas y dos colas, pero el enrollamiento de las colas es solo parcial. Esta proteína
contribuye también al desplazamiento de vesículas y orgánulos en el citoplasma celular; por ejemplo, intervienen en
la transferencia de gránulos de melanina desde el melanocito al queratinocito. En la enfermedad de Griscelli se
produce una despigmentación de la piel debida a una mutación en la miosina V, que impide la transferencia de
melanina a los queratinocitos.
Estructura del sarcómero en el músculo esquelético y contracción muscular
La contracción muscular es la función mejor conocida y más representativa de la interacción entre los filamentos de
actina y miosina. Las células musculares esqueléticas, cardíacas y lisas basan su mecanismo de contracción en esta
interacción molecular. El músculo esquelético es de tipo estriado y es responsable del movimiento voluntario. La
actina y la miosina son proteínas muy abundantes en este tipo de músculo, donde (como vamos a ver), se disponen de
520
modo altamente organizado, permitiendo así la contracción eficaz del mismo. Los músculos esqueléticos están
formados por fibras musculares: células multinucleadas que contienen en el citoplasma numerosas miofibrillas.
Estas están constituidas a su vez por unidades repetitivas de sarcómeros, que son las estructuras motoras del músculo
basadas en filamentos de actina y miosina. Los sarcómeros contienen un entramado altamente organizado de
filamentos finos de actina y filamentos gruesos de miosina (v. más adelante), aparte de un conjunto de proteínas que
contribuyen al mantenimiento de la organización estructural del sarcómero. Al microscopio electrónico se puede
observar que las miofibrillas del músculo esquelético presentan un patrón de bandas claras y oscuras. Las bandas
oscuras se denominan A (de anisotrópicas con luz polarizada), mientras que las claras se llaman I (de isotrópicas) (v.
fig. 12-20). En las bandas claras (I) existe en realidad una zona oscura situada en posición central, a la que se denomina
disco o línea Z. El sarcómero se define como la unidad comprendida entre dos discos Z, lo que corresponde
aproximadamente a 2,5 μm de longitud en situación de relajación. La contracción muscular implica una reducción de
la longitud del sarcómero de aproximadamente 0,4 μm. En la banda oscura (A), también se puede observar una zona
algo más clara situada en el centro, llamada zona H.
En las bandas A se sitúan los filamentos gruesos de miosina. Los microfilamentos de actina se disponen paralelos a
los de miosina, rodeándolos en las zonas periféricas, donde se sitúan las cabezas de miosina, lo cual permite la
interacción entre ambos filamentos. Estos filamentos están formados por actina F junto a una multitud de proteínas
que se asocian al filamento. La tropomiosina, que se enrolla como un fino cordón sobre el polímero de actina y el
complejo de la troponina (que se engarza entre los huecos de la hélice de actina) juegan un papel clave en la
contracción del sarcómero (v. más adelante).
Durante la contracción muscular, las bandas A no varían de longitud, a diferencia de las bandas I, que se acortan
cuando la actina se desplaza sobre la miosina. La contracción se produce porque los filamentos de miosina, utilizando
la energía proporcionada por la hidrólisis de ATP, arrastran a los filamentos de actina, acortando así la distancia entre
dos discos Z consecutivos (v. fig. 12-20). Este proceso, que tiene lugar a la vez en todos los sarcómeros de la
miofibrilla, tiene como resultado la contracción de la fibra muscular; la contracción simultánea de las diferentes fibras
musculares da lugar a la contracción del músculo entero.
La interacción entre la miosina y la actina es el evento molecular clave en el proceso de contracción. El arrastre de
los filamentos de actina implica que las cabezas de miosina (que contactan con los filamentos de actina) ejercen un
movimiento de tipo bisagra por el cual desplazan a estos filamentos. Como hemos indicado, el proceso de empuje
requiere el gasto de ATP, que se hidroliza por la actividad ATPasa de la cabeza de miosina y tiene lugar en una serie
de pasos cíclicos que se detallan a continuación (fig. 12-21):
1. Inicialmente, la cabeza de miosina contacta débilmente con la actina. En este estado, la miosina lleva unidas ADP +
Pi. En una etapa posterior, se pierde el Pi (paso 1), quedando la miosina más fuertemente unida al filamento de actina
(estado de «pregolpe»). Esta modificación da lugar a un cambio conformacional en la miosina, que libera el ADP y
521
provoca el movimiento de tipo bisagra (paso 2) que desplaza al microfilamento 10 nm hacia el centro del sarcómero
(estado de «posgolpe»), con lo que tiene lugar la contracción muscular.
2. Entonces el ATP se une a la cabeza de la miosina, lo que provoca otro cambio en la conformación de la miosina que
hace que se libere de la actina (paso 3). El ATP se disocia entonces en ADP y Pi (paso 4) y la energía obtenida de esta
disociación hace que la miosina contacte de nuevo con la actina en una posición distinta a la original (paso 5) y
comience otro ciclo.
FIGURA 12-21 A. Modelo del ciclo del ATP en la contracción muscular. Los diferentes pasos están explicados en el texto. B. La
contracción muscular implica la unión de Ca+2 a TnC, de tal modo que la tropomiosina no impida la interacción actina-miosina. C.
Representación de un filamento longitudinal de actina que muestra su interacción con la tropomiosina y la troponina. (A, J. Spudich, Nature
[1994] 372:515-518 McMillan Magazines, Ltd.; B, W.M. Becker et al. The World of the Cell 4. ª Ed. San Francisco, CA, Addison Wesley Longman 2000 © Addison Wesley Longman
Inc.; C, Modificado de Mathews C, Van Holde K, Ahem K. Bioquímica, 3.ª ed. Madrid: Addison Wesley; 2002.)
Este proceso se repite varias veces durante la contracción en cada una de las moléculas que componen el filamento
grueso de miosina, hasta que la unidad sarcomérica disminuye de tamaño.
Regulación de la contracción muscular por el Ca+2
El proceso de contracción muscular depende de las concentraciones intracelulares de Ca citoplasmático en la célula
+2
muscular. En situación de reposo, la miosina no contacta directamente con la actina porque la tropomiosina está
impidiendo estéricamente la interacción (v. fig. 12-21). Para que la tropomiosina se desplace, permitiendo el contacto
actina-miosina, la porción TnC del complejo proteico de la troponina debe unirse al Ca (v. fig. 12-21). Esta unión
+2
provoca un arrastre de la tropomiosina, que permite que la cabeza de miosina se una a la actina. En estado de
relajación, las concentraciones de Ca en el citoplasma son bajas (
+2
522
∼10
mM), por lo que la tropomiosina bloquea los
−4
sitios de unión de la actina-miosina. Pero durante la contracción se elevan los niveles de Ca citoplasmático (> 10
+2
−3
mM); la miosina interactúa con la actina y se produce el desplazamiento de los filamentos. Por lo tanto, la
concentración de Ca en el citoplasma es un factor clave para la contracción y debe estar altamente regulada en la
+2
célula. En condiciones de reposo, el Ca permanece secuestrado en el retículo sarcoplásmico (el nombre que recibe el
+2
retículo endoplasmático liso de la fibra muscular) y se libera cuando este catión es necesario para ejercer funciones de
señalización que inicien la contracción.
La contracción del músculo esquelético tiene lugar cuando el sistema nervioso envía una señal que se transmitirá
mediante el potencial de acción hasta el lugar en el que la neurona contacta con el músculo, denominado unión
neuromuscular (fig. 12-22). Los terminales axónicos vierten el neurotransmisor acetilcolina en la unión
neuromuscular, que es reconocida por receptores específicos en la membrana muscular (llamada sarcolema). Esta
unión hace que se abran los canales de Na , provocando la despolarización de la membrana (paso 1), que se propaga
+
rápidamente a toda la célula a través de unas invaginaciones de la membrana a las que se denomina túbulos T
(transversales con respecto a la orientación de las microfibrillas) (paso 2). En paralelo a cada túbulo T se sitúan dos
túbulos de retículo sarcoplásmico, formando las llamadas tríadas del sarcómero. La despolarización de la membrana
en los túbulos T, que están en estrecho contacto con el retículo sarcoplásmico, provocan la apertura de los canales de
Ca de la membrana del retículo, y la liberación de este catión hacia el citosol (paso 3). Como se ha comentado antes,
+2
esto permite la interacción actina-miosina y ocasiona la contracción muscular (pasos 4-7). Una vez finalizada la
contracción, los iones Ca retornan al interior del retículo sarcoplásmico gracias a la actividad de una bomba ATPasa
+2
que lo transporta en contra de gradiente, con gasto de ATP (paso 8).
FIGURA 12-22 Acontecimientos que tienen lugar desde que se produce la liberación de acetilcolina (Ach) en la unión neuromuscular
hasta que la miosina arrastra a la actina en la contracción muscular. Los diferentes pasos están explicados en el texto.
Interacción entre actina y miosina en células no esqueléticas
523
En el músculo cardíaco también existe estriación y un sistema de sarcómeros, aunque posee diferencias histológicas y
funcionales con respecto al músculo esquelético. En el músculo cardíaco el núcleo de la célula está situado en posición
central, a diferencia de los núcleos periféricos de la fibra muscular esquelética. Además, existen unas estructuras
llamadas discos intercalares: complejos especializados de unión entre células cardíacas vecinas. Por lo tanto, las fibras
musculares cardíacas corresponden a células individuales, mientras que las del músculo esquelético provienen de la
fusión de varias células, y dan lugar a fibras multinucleadas. La contracción en el músculo cardíaco tiene lugar de
modo involuntario y está regulada por un sistema de marcapasos. Los discos intercalares permiten el acoplamiento
eléctrico entre las células musculares, lo que da lugar a una contracción muy sincronizada. Las fibras del nódulo
sinoauricular, las del nódulo auriculoventricular y las de la red de Purkinje (células musculares cardíacas
especializadas que se sitúan entre las fibras cardíacas) se encargan de transmitir los impulsos eléctricos que estimulan
la contracción. El funcionamiento básico de la contracción del músculo cardíaco es semejante al descrito para el
músculo esquelético y también está regulado por el Ca .
+2
El músculo liso no posee estriación; se encuentra en las vísceras y los vasos sanguíneos y está formado por células
fusiformes unidas entre sí por contactos de unión. Estas células pueden sintetizar matriz extracelular y poseen
capacidad contráctil, pero la contracción es rítmica, involuntaria y más lenta que la de las fibras estriadas. A diferencia
de las células musculares estriadas, no presentan estructuras sarcoméricas. La capacidad contráctil es debida a un
conjunto de haces de microfilamentos de actina, filamentos gruesos de miosina (de tipo II) y filamentos intermedios
de tipo vimentina y desmina (v. más adelante) anclados en unas estructuras llamadascuerpos densos, que se
encuentran en diferentes puntos del citoplasma celular, junto a la membrana (fig. 12-23). Los cuerpos densos
contienen como componente mayoritario α-actinina, proteína con capacidad de unir actina. Los cuerpos densos y los
filamentos de actina forman redes interconectadas entre sí que recorren la célula de lado a lado. Mediante
interacciones actina-miosina, las redes de microfilamentos se estrechan provocando la contracción celular. Las células
musculares lisas están conectadas entre sí mediante uniones de tipo gap (v. capítulo 6), lo que permite una contracción
coordinada.
FIGURA 12-23 Esquema de la contracción muscular en células de músculo liso.
524
En el proceso de contracción se encuentran algunas diferencias con respecto a las fibras estriadas (fig. 12-24). La
contracción de las células musculares lisas depende también de la elevación de los niveles de Ca citoplasmático, pero
+2
en este caso el Ca proviene mayoritariamente del exterior celular, más que del retículo sarcoplásmico. La elevación
+2
del Ca se produce como consecuencia de una estimulación nerviosa u hormonal de la célula muscular. Estas células
+2
no contienen troponina (pero sí tropomiosina), por lo que utilizan un sistema de activación de la contracción distinto
al de las fibras estriadas. La quinasa de las cadenas ligeras de miosina (MLCK, del inglés myosin light chain kinase)
posee un papel semejante en estas células al de la troponina en la célula muscular estriada (v. fig. 12-24). Cuando se
elevan los niveles de Ca se produce una unión entre el Ca y la proteína calmodulina, formando el complejo Ca +2
+2
+2
calmodulina, que activa a su vez a la MLCK. Esta proteína quinasa se encarga de fosforilar la cadena ligera de la
miosina (MLC, del inglés myosin Light chain), favoreciendo el ensamblaje de los filamentos de miosina y permitiendo
que interactúe de modo directo con la actina y se produzca la secuencia de acontecimientos explicada para las fibras
musculares estriadas para que tenga lugar la contracción (v. fig. 12-24). Cuando disminuye la concentración de Ca en
+2
el citoplasma, la MLCK se inactiva y una fosfatasa elimina el fosfato de las cadenas ligeras de la miosina. Esto provoca
relajación muscular, ya que la miosina no fosforilada no puede interactuar con la actina.
FIGURA 12-24 A. Señalización intracelular que regula la contracción muscular en células de músculo liso. La proteína MLCK fosforila a
las MLC, lo cual permite la interacción de la miosina con la actina. B. En las células de músculo liso, las moléculas de miosina II se
agrupan de modo antiparalelo formando filamentos (normalmente de 15-20 unidades), que, tras ser fosforilados, conectan con los
filamentos de actina y causan su desplazamiento. MLC, cadena ligera de la miosina (myosin light chain); MLCK, quinasa de la cadena
ligera de la miosina (myosin light chain kinase); REL, retículo endoplasmático liso. (Ilustración de: A. Calvo.)
En células no musculares también existe una interacción entre moléculas de actina y miosina que es fundamental
para el regular los cambios de forma celular, el movimiento, la citocinesis, el transporte de vesículas y la posición de
los orgánulos en el citoplasma, etc. El entramado de microfilamentos es menos desarrollado que el de las células
525
musculares lisas, pero la dinámica de unión actina-miosina y su regulación por el sistema Ca -calmodulina y MLCK
+2
es parecido.
Migración celular basada en interacciones actina-miosina y movimiento
ameboide
Las interacciones actina-miosina son necesarias para el movimiento de las células y, por lo tanto, para la migración
celular durante el desarrollo embrionario, la metástasis, los movimientos de diapédesis de los leucocitos, etc. Para ello,
las células emiten prolongaciones citoplasmáticas llamadas lamelipodios y filopodios. Los lamelipodios forman
láminas extensas, mientras que los filopodios consisten en prolongaciones puntiagudas. La migración celular en un
sustrato conlleva los siguientes procesos (fig. 12-25):
1. Las células se fijan al sustrato mediante fibras de estrés (v. capítulo 6), donde los filamentos de actina quedan
conectados a moléculas transmembrana de integrina, que son las moléculas que contactan directamente con el
sustrato. El primer paso en el movimiento celular implica la creación del lamelipodio o filopodio en la zona hacia la
que se dirige la célula. Para ello, los filamentos de actina crecen en dirección a la membrana plasmática que está en
proceso de extensión (en el sentido del movimiento) mediante la incorporación de actina G. Los extremos (+) de los
filamentos se sitúan junto a la membrana, de tal modo que la adición de unidades de actina sobre el filamento empuja
la membrana para crear el filopodio o lamelipodio. A medida que la membrana se expande hacia adelante, la miosina
arrastra los filamentos de actina hacia la parte trasera de la célula, a la vez que se van incorporando los monómeros de
actina G en la parte delantera.
2. Posteriormente tiene lugar una unión de lamelipodio o filopodio al sustrato, para lo cual se deben crear nuevas
estructuras de unión. A la vez, las fibras de estrés de la parte trasera de la célula se deben desestructurar, para que se
permita el avance; para ello, la miosina arrastra filamentos de actina situados en la zona trasera de la célula hacia la
zona delantera, retrayéndose entonces el citoplasma y permitiendo el avance del cuerpo celular. En estos movimientos
se produce una actividad motora de la miosina sobre la actina, de modo semejante a lo que ocurre en la contracción
muscular.
3. Por último, tiene lugar la desunión de la célula por la parte trasera durante el avance. Las interacciones de actinamiosina hacen que el cuerpo celular se desplace hacia delante, y las uniones de fijación al sustrato que quedan en la
zona trasera de la célula se desprenden para que se complete el movimiento. Este último proceso requiere la
separación de integrinas del sustrato.
526
FIGURA 12-25 A. Movimiento secuencial de células sobre un sustrato mediante la emisión de lamelipodios y filopodios. B. La
formación del lamelipodio (y filopodio) implica una adición de monómeros de actina en los filamentos de actina de la zona de avance, a
la vez que la miosina desplaza el filamento hacia la parte trasera de la célula y se crean estructuras de unión al sustrato en la zona
delantera.
El movimiento ameboide es un tipo de movimiento que está restringido a algunas células, como, por ejemplo, los
leucocitos y las amebas, e implica la formación de seudópodos (proyecciones celulares temporales con forma de dedo
de guante, utilizadas también en la fagocitosis). La formación de seudópodos tiene lugar mediante un mecanismo
diferente al explicado para los movimientos a través de filopodios y lamelipodios, ya que se basa en principios de
gelificación-solificación del citoplasma (es decir, transición desde una forma gel rígida a una sol más fluida). Cuando
una célula avanza con este tipo de movimiento, el citoplasma fluye hacia adelante y se gelifica en la punta del
seudópodo. Por la parte de atrás, donde estaba inicialmente gelificado, el avance requiere una licuación del gel, para
permitir el desplazamiento de la parte trasera de la célula hacia adelante. Estos cambios están mediados por la
proteína gelsolina. Los cambios de gelificación, como se explicó anteriormente, implican modificaciones en la
polimerización-despolimerización de los microfilamentos de actina.
Algunas patologías relacionadas con anomalías estructurales de los
microfilamentos
La contracción muscular puede alterarse por numerosas causas, algunas de las cuales tienen su origen en defectos
estructurales originados como consecuencia de mutaciones en proteínas sarcoméricas, mientras que otras se producen
por alteraciones en los neurotransmisores, en las mitocondrias que proporcionan ATP a las fibras, etc. Nos
centraremos en comentar brevemente las distrofias musculares de Duchenne y Becker, ejemplos de enfermedades
causadas por desestructuración del sarcómero. Las distrofias musculares son un conjunto de patologías congénitas
caracterizadas por debilidad, atrofia muscular y cambios degenerativos en el músculo. La distrofia muscular de
Duchenne es una enfermedad genética recesiva ligada al cromosoma X, que se produce por mutaciones en el gen de
la distrofina, una proteína responsable de la estabilización del sarcómero que une los filamentos de actina al
527
sarcoplasma. Los varones con una mutación en dicho gen sufren la enfermedad, mientras que las mujeres pueden ser
portadoras, pero no desarrollan normalmente sintomatología. Como en el resto de enfermedades ligadas al sexo, solo
las mujeres con las dos copias del cromosoma X inactivadas (cosa que es muy infrecuente) desarrollarían la
enfermedad. El resultado de la mutación en la distrofina es que el sarcómero muscular queda parcialmente
desorganizado y los músculos degeneran y pierden fuerza de modo progresivo. Los síntomas aparecen en la infancia
y progresan con la edad, pudiendo ocasionar una pérdida de movilidad y deformaciones en el esqueleto. Los
pacientes pueden mostrar cardiomiopatía por afectación de la estructura del miocardio y dificultades respiratorias,
que incluso pueden ocasionar la muerte. Además del efecto mecánico, la ausencia de distrofina altera el metabolismo
de la célula muscular, al modificarse una serie de cascadas de señalización intracelular y aumentar el estrés oxidativo
en la célula, por mecanismos que todavía no son bien conocidos. Todos estos acontecimientos terminan por causar la
muerte de fibras musculares, que son reemplazadas por tejido conjuntivo y adiposo. Esta enfermedad no tiene cura y
el tratamiento es sintomático: antiinflamatorios, actividad física suave, uso de aparatos ortopédicos, etc.
La distrofia muscular de Becker también se produce por mutaciones en el gen de la distrofina, pero en esta
enfermedad hay una cierta cantidad de proteína funcional, a diferencia de lo que ocurre en la distrofia muscular de
Duchenne. Por lo tanto, las manifestaciones clínicas son menos severas.
528
Filamentos intermedios
Estructura y ensamblaje
Los filamentos intermedios poseen un diámetro de 8-12 nm (un grosor intermedio entre los microfilamentos de actina
y los microtúbulos) y constituyen polímeros de gran estabilidad estructural que participan en el mantenimiento del
citoesqueleto y en la resistencia frente a tensiones mecánicas. Los filamentos intermedios tienen una serie de
características morfofuncionales que los diferencian de los microtúbulos y microfilamentos:
• A diferencia de los microtúbulos (constituidos por tubulina) y microfilamentos (que son polímeros de actina), los
filamentos intermedios están formados por proteínas diversas que dan lugar a los diferentes grupos de
filamentos.
• Las proteínas que constituyen los filamentos intermedios son filamentosas y no globulares.
• No presentan polaridad; es decir, no poseen extremos (+) ni (–), ni tienen una dinámica de polimerizacióndespolimerización como la de los microtúbulos o microfilamentos.
• No precisan de ATP o GTP para su polimerización.
• No poseen función motora, sino principalmente estructural.
Se han identificado más de 50 proteínas distintas que pueden formar parte de los filamentos intermedios, las cuales
se han agrupado en seis clases, dependiendo de su secuencia de aminoácidos y de su estructura proteica, así como de
su expresión en diferentes tipos celulares. Algunos filamentos intermedios son específicos de las células epiteliales
(citoqueratinas, pertenecientes a las clases I y II), mientras que otros se expresan en células de origen mesenquimal
(como la vimentina o la desmina, incluidas en la clase III). La proteína ácida neurofibrilar glial es característica de las
células gliales del sistema nervioso (perteneciente también a la clase III), mientras que otros filamentos intermedios
son típicos de neuronas (neurofilamentos, clase IV). Los filamentos que componen las láminas nucleares (formados
por las láminas A, B y C y presentes en casi todos los tipos celulares) constituyen la clase V y la nestina (que se
expresa en el sistema nervioso en desarrollo) pertenece a la clase VI.
A pesar de que existen diferencias en peso molecular y en secuencia de aminoácidos, las distintas proteínas de los
filamentos intermedios poseen una organización estructural similar. Los monómeros (unidades básicas) de estos
filamentos son proteínas filamentosas con un rango de peso molecular comprendido entre 40 y 210 kDa, con un largo
dominio central en hélice α formado aproximadamente por 310 aminoácidos, flanqueado por un dominio NH y otro
2
COOH (fig. 12-26). Estas unidades monoméricas se asocian entre sí en sucesivos grados de complejidad hasta formar
el filamento. El punto de partida es la formación de dímeros (generalmente homodímeros), con dos unidades
529
proteicas del mismo tipo enrolladas una sobre la otra a modo de cuerda, quedando sus extremos NH y COOH2–
terminales en el mismo extremo. En el caso de las queratinas, en cambio, se forma un heterodímero de un filamento
de tipo I y otro de tipo II (queratinas ácidas y queratinas básicas).
FIGURA 12-26 Asociación de las proteínas que constituyen los filamentos intermedios. (Ilustración de: A. Calvo.)
Posteriormente, dos homodímeros se asocian entre sí de modo antiparalelo (con sus extremos NH y COOH en
2
lados opuestos) y desplazados ligeramente uno del otro, dando lugar a un tetrámero. Los tetrámeros se unen entre sí
por sus extremos para formar una estructura que se llama protofilamento. La unión de ocho protofilamentos es lo que
constituye propiamente el filamento intermedio de 8-12 nm que puede visualizarse al microscopio electrónico. El
ensamblaje y desensamblaje de los filamentos intermedios está regulado por fosforilación; así, la adición de fosfato en
los filamentos de las láminas nucleares por el complejo Cdk1-ciclina B provoca la desestructuración de estos
filamentos.
Los filamentos intermedios forman una amplia red en el citoplasma que se extiende desde la zona perinuclear
(donde son más abundantes) hacia la periferia. Estos filamentos ayudan a fijar el núcleo celular en la posición
característica en la que se encuentra en cada tipo de célula. Las redes de filamentos intermedios están interconectadas
con los microtúbulos, microfilamentos y proteínas de la membrana plasmática (como las integrinas) y de la membrana
nuclear. Un tipo de filamento de queratina de las células epiteliales (denominado tonofilamento) se ancla a
desmosomas y hemidesmosomas. La plectina es un ejemplo de proteína que se une a las integrinas presentes en los
hemidesmosomas y a los filamentos intermedios, lo que permite el agarre de dichos filamentos a la membrana
plasmática. La plectina se expresa abundantemente en células de epitelios (fundamentalmente en la piel) y células
musculares y nerviosas.
Papel de los filamentos intermedios en el diagnóstico diferencial
Como se ha mencionado con anterioridad, los diferentes tipos celulares presentan una distribución característica de
filamentos intermedios. Las queratinas (también llamadas citoqueratinas [CK]), típicamente expresadas en células
530
epiteliales, constituyen una familia de filamentos intermedios que incluye más de 20 miembros, cuyos pesos
moleculares varían entre 40 y 70 kDa. Se clasifican en dos grandes grupos: ácidas (o de tipo I, con menor peso
molecular) y básicas (de tipo II, con mayor peso molecular). Cada tipo de epitelio contiene un patrón específico de
CK; por ejemplo, los epitelios simples, como el del tubo digestivo, presentan citoqueratinas de tipo 7, 8, 18 y 19. En
cambio, los epitelios queratinizados, como el de la epidermis, expresan las citoqueratinas 1, 2, 4-6, 9-11 y 16. Incluso
los d
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