Biologia-celular-biomedica- -St-Alfonso-20200410-53488-1aguts2
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1 Table of Contents Instrucciones para el acceso en línea Portada Índice de capítulos Página de créditos Dedicatoria Colaboradores Prefacio Agradecimientos Capítulo 1: Introducción a la biología de las células Introducción Organización celular de distintos organismos Organización de agentes subcelulares patógenos Capítulo 2: Cómo se estudian las células. Métodos y técnicas básicas en biología celular Introducción Microscopía óptica convencional Microscopía electrónica Procesamiento de muestras para microscopía óptica y electrónica Tecnología del ADN recombinante y aislamiento de ácidos nucleicos Reacción en cadena de la polimerasa Fingerprint de ADN Secuenciación de ADN Hibridación in situ de ácidos nucleicos Terapia génica Microarrays y microchips para estudios genómicos de expresión a gran escala Transferencia de ADN a células y embriones de mamíferos. Desarrollo de animales transgénicos y knock out 2 Técnicas citogenéticas Producción de anticuerpos policlonales y monoclonales ELISA Citometría de flujo Cultivos celulares Fraccionamiento celular y centrifugación diferencial Capítulo 3: Estructura de la membrana plasmática Introducción Modelos estructurales de la membrana: perspectiva histórica Singer y Nicolson: estructura en mosaico fluido Lípidos de membrana Balsas lipídicas El mosaico proteico La cubierta de glúcidos: estructura y función del glucocáliz Determinación de la temperatura de fusión de las membranas biológicas Cuestiones Respuestas Capítulo 4: Microtransporte a través de la membrana plasmática Introducción Transporte pasivo Transporte activo Importancia de los canales iónicos en la generación del potencial de membrana Ecuación de Nernst Capítulo 5: Macrotransporte a través de la membrana plasmática: endocitosis y exocitosis Introducción Endocitosis 3 Exocitosis Gemación y fusión de vesículas en los procesos de endocitosis y exocitosis Exocitosis y endocitosis en la sinapsis neuronal Mecanismos de infección que dependen del macrotransporte a través de la membrana plasmática Capítulo 6: Especializaciones de la membrana plasmática e interacción de la célula con su entorno Especializaciones de la membrana plasmática Membrana basal Matriz extracelular (MEC) Capítulo 7: El núcleo. Parte I: organización de la cromatina y conservación de la información genética Introducción Envoltura nuclear. Poros nucleares Organización del núcleo en interfase Estructura de la cromatina en interfase. Histonas Eucromatina y heterocromatina Cromosomas Complejidad del ADN humano. Tipos de secuencias en el ADN Proyecto genoma humano Replicación del ADN genómico Estabilidad y reordenamiento del ADN genómico Recombinación homóloga Mutación y reparación del ADN genómico Capítulo 8: El núcleo. Parte II: transcripción y maduración del ARN y estructura del nucléolo Introducción Síntesis del ARN: transcripción El nucléolo: expresión morfológica del proceso de transcripción Maduración del ARN 4 Metabolismo del ARN maduro Capítulo 9: Síntesis y modificación de proteínas Introducción Maquinaria para la síntesis proteica Código genético Proceso de síntesis proteica en los ribosomas Estructura tridimensional, plegamiento y localización de las proteínas Modificaciones postraduccionales y regulación de la función proteica Degradación de proteínas Uso biomédico de proteínas recombinantes Capítulo 10: Sistema de endomembranas celulares: retículo endoplasmático, aparato de Golgi y lisosomas Introducción Retículo endoplasmático rugoso Retículo endoplasmático liso Aparato de Golgi Lisosomas Capítulo 11: Mitocondrias y peroxisomas. Bioenergética y metabolismo oxidativo Estructura y composición de las mitocondrias Genoma mitocondrial Incorporación de proteínas a la mitocondria Metabolismo oxidativo mitocondrial Especies reactivas de oxígeno y defensa antioxidante mitocondrial Patologías relacionadas con la mitocondria Peroxisomas. Estructura y participación en el metabolismo oxidativo Capítulo 12: El citoesqueleto Introducción 5 Microtúbulos Microfilamentos de actina y filamentos gruesos de miosina Filamentos intermedios Capítulo 13: Mecanismos de señalización celular Mecanismos generales de señalización intracelular Tipos de señalización celular mediados por la secreción de moléculas Receptores de señales y señalización intracelular Señalización a través de contactos célula-célula y célula-sustrato Capítulo 14: Ciclo celular y destinos vitales de la célula Introducción Fases del ciclo celular Regulación del ciclo celular: puntos de control Regulación en cada punto de control y consecuencias del avance a la siguiente fase Elementos de retrocontrol del ciclo celular Elementos extrínsecos que influyen en el control del ciclo celular Destinos vitales de la célula y respuestas celulares al estrés Capítulo 15: División celular y muerte programada División celular Muerte celular programada (apoptosis) Capítulo 16: Biología celular del cáncer Introducción Epidemiología y factores de riesgo Características de las células tumorales Tipos de cáncer Inducción del cáncer por carcinógenos y microorganismos Bases genéticas del cáncer 6 Alteraciones epigenéticas Virus oncogénicos Carcinogénesis. Modelo del cáncer de colon Angiogénesis y metástasis Evasión del sistema inmunitario Tratamientos del cáncer Capítulo 17: Bases celulares de la respuesta inmunitaria Propiedades generales del sistema inmunitario. Inmunidad innata y adaptativa Reconocimiento del antígeno Activación linfocitaria Mecanismos efectores Regulación de la respuesta inmunitaria Disfunciones del sistema inmunitario y sus consecuencias Capítulo 18: Las células madre y sus aplicaciones terapéuticas Células madre: definición y clasificación Plasticidad de las células madre Fuentes tisulares de células madre Potencial y limitaciones de las células madre Aplicación clínica de las células madre: presente y futuro Conclusiones Índice alfabético 7 8 Biología celular biomédica Dr. Alfonso Calvo Departamento de Histología y Anatomía Patológica Facultad de Medicina y Programa de Tumores Sólidos, CIMA Universidad de Navarra Pamplona, España 9 10 Índice de capítulos Instrucciones para el acceso en línea Cubierta Portada Página de créditos Dedicatoria Colaboradores Prefacio Agradecimientos Capítulo 1: Introducción a la biología de las células Introducción Organización celular de distintos organismos Organización de agentes subcelulares patógenos Capítulo 2: Cómo se estudian las células. Métodos y técnicas básicas en biología celular 11 Introducción Microscopía óptica convencional Microscopía electrónica Procesamiento de muestras para microscopía óptica y electrónica Tecnología del ADN recombinante y aislamiento de ácidos nucleicos Reacción en cadena de la polimerasa Fingerprint de ADN Secuenciación de ADN Hibridación in situ de ácidos nucleicos Terapia génica Microarrays y microchips para estudios genómicos de expresión a gran escala Transferencia de ADN a células y embriones de mamíferos. Desarrollo de animales transgénicos y knock out Técnicas citogenéticas Producción de anticuerpos policlonales y monoclonales ELISA Citometría de flujo Cultivos celulares Fraccionamiento celular y centrifugación diferencial Capítulo 3: Estructura de la membrana plasmática Introducción Modelos estructurales de la membrana: perspectiva histórica 12 Singer y Nicolson: estructura en mosaico fluido Lípidos de membrana Balsas lipídicas El mosaico proteico La cubierta de glúcidos: estructura y función del glucocáliz Determinación de la temperatura de fusión de las membranas biológicas Cuestiones Respuestas Capítulo 4: Microtransporte a través de la membrana plasmática Introducción Transporte pasivo Transporte activo Importancia de los canales iónicos en la generación del potencial de membrana Ecuación de Nernst Capítulo 5: Macrotransporte a través de la membrana plasmática: endocitosis y exocitosis Introducción Endocitosis Exocitosis Gemación y fusión de vesículas en los procesos de endocitosis y exocitosis Exocitosis y endocitosis en la sinapsis neuronal Mecanismos de infección que dependen del macrotransporte a través de la membrana plasmática 13 Capítulo 6: Especializaciones de la membrana plasmática e interacción de la célula con su entorno Especializaciones de la membrana plasmática Membrana basal Matriz extracelular (MEC) Capítulo 7: El núcleo. Parte I: organización de la cromatina y conservación de la información genética Introducción Envoltura nuclear. Poros nucleares Organización del núcleo en interfase Estructura de la cromatina en interfase. Histonas Eucromatina y heterocromatina Cromosomas Complejidad del ADN humano. Tipos de secuencias en el ADN Proyecto genoma humano Replicación del ADN genómico Estabilidad y reordenamiento del ADN genómico Recombinación homóloga Mutación y reparación del ADN genómico Capítulo 8: El núcleo. Parte II: transcripción y maduración del ARN y estructura del nucléolo Introducción Síntesis del ARN: transcripción El nucléolo: expresión morfológica del proceso de transcripción 14 Maduración del ARN Metabolismo del ARN maduro Capítulo 9: Síntesis y modificación de proteínas Introducción Maquinaria para la síntesis proteica Código genético Proceso de síntesis proteica en los ribosomas Estructura tridimensional, plegamiento y localización de las proteínas Modificaciones postraduccionales y regulación de la función proteica Degradación de proteínas Uso biomédico de proteínas recombinantes Capítulo 10: Sistema de endomembranas celulares: retículo endoplasmático, aparato de Golgi y lisosomas Introducción Retículo endoplasmático rugoso Retículo endoplasmático liso Aparato de Golgi Lisosomas Capítulo 11: Mitocondrias y peroxisomas. Bioenergética y metabolismo oxidativo Estructura y composición de las mitocondrias Genoma mitocondrial 15 Incorporación de proteínas a la mitocondria Metabolismo oxidativo mitocondrial Especies reactivas de oxígeno y defensa antioxidante mitocondrial Patologías relacionadas con la mitocondria Peroxisomas. Estructura y participación en el metabolismo oxidativo Capítulo 12: El citoesqueleto Introducción Microtúbulos Microfilamentos de actina y filamentos gruesos de miosina Filamentos intermedios Capítulo 13: Mecanismos de señalización celular Mecanismos generales de señalización intracelular Tipos de señalización celular mediados por la secreción de moléculas Receptores de señales y señalización intracelular Señalización a través de contactos célula-célula y célula-sustrato Capítulo 14: Ciclo celular y destinos vitales de la célula Introducción Fases del ciclo celular Regulación del ciclo celular: puntos de control Regulación en cada punto de control y consecuencias del avance a la siguiente fase 16 Elementos de retrocontrol del ciclo celular Elementos extrínsecos que influyen en el control del ciclo celular Destinos vitales de la célula y respuestas celulares al estrés Capítulo 15: División celular y muerte programada División celular Muerte celular programada (apoptosis) Capítulo 16: Biología celular del cáncer Introducción Epidemiología y factores de riesgo Características de las células tumorales Tipos de cáncer Inducción del cáncer por carcinógenos y microorganismos Bases genéticas del cáncer Alteraciones epigenéticas Virus oncogénicos Carcinogénesis. Modelo del cáncer de colon Angiogénesis y metástasis Evasión del sistema inmunitario Tratamientos del cáncer Capítulo 17: Bases celulares de la respuesta inmunitaria 17 Propiedades generales del sistema inmunitario. Inmunidad innata y adaptativa Reconocimiento del antígeno Activación linfocitaria Mecanismos efectores Regulación de la respuesta inmunitaria Disfunciones del sistema inmunitario y sus consecuencias Capítulo 18: Las células madre y sus aplicaciones terapéuticas Células madre: definición y clasificación Plasticidad de las células madre Fuentes tisulares de células madre Potencial y limitaciones de las células madre Aplicación clínica de las células madre: presente y futuro Conclusiones Índice alfabético 18 19 Página de créditos © 2015 Elsevier España, S.L.U. Avda. Josep Tarradellas 20-30, 1.° 08029 Barcelona, España Fotocopiar es un delito (Art. 270 C.P.) Para que existan libros es necesario el trabajo de un importante colectivo (autores, traductores, dibujantes, correctores, impresores, editores…). El principal beneficiario de ese esfuerzo es el lector que aprovecha su contenido. Quien fotocopia un libro, en las circunstancias previstas por la ley, delinque y contribuye a la «no» existencia de nuevas ediciones. Además, a corto plazo, encarece el precio de las ya existentes. Este libro está legalmente protegido por los derechos de propiedad intelectual. Cualquier uso fuera de los límites establecidos por la legislación vigente, sin el consentimiento del editor, es ilegal. Esto se aplica en particular a la reproducción, fotocopia, traducción, grabación o cualquier otro sistema de recuperación y almacenaje de información. ISBN (versión impresa): 978-84-9022-036-8 ISBN (versión electrónica): 978-84-9022-487-8 Depósito legal (versión impresa): B. 17.821-2015 Depósito legal (versión electrónica): B. 17.822-2015 Impreso en España Servicios editoriales: Gea Consultoría Editorial, s.l. Advertencia 20 La medicina es un área en constante evolución. Aunque deben seguirse unas precauciones de seguridad estándar, a medida que aumenten nuestros conocimientos gracias a la investigación básica y clínica habrá que introducir cambios en los tratamientos y en los fármacos. En consecuencia, se recomienda a los lectores que analicen los últimos datos aportados por los fabricantes sobre cada fármaco para comprobar las dosis recomendadas, la vía y duración de la administración y las contraindicaciones. Es responsabilidad ineludible del médico determinar las dosis y el tratamiento más indicados para cada paciente, en función de su experiencia y del conocimiento de cada caso concreto. Ni los editores ni los directores asumen responsabilidad alguna por los daños que pudieran generarse a personas o propiedades como consecuencia del contenido de esta obra. El Editor 21 22 Dedicatoria A mi hermana Mercedes, joven víctima del cáncer, con la ilusión de que este libro estimule el estudio de la célula normal y patológica A toda mi familia, en especial a mis padres 23 24 Colaboradores José J. Abad, Departamento de Biología Celular y Tisular, Facultad de Medicina, UNAM, Ciudad de México, D.F., México Xabier Agirre, Programa de Tumores Hematológicos, CIMA, Universidad de Navarra, Pamplona, España Jackeline Agorreta, Programa de Tumores Sólidos, CIMA, y Departamento de Histología y Anatomía Patológica, Facultad de Medicina, Universidad de Navarra, Pamplona, España Tarek Ajami, Servicio de Urología, Hospital Clínic i Provincial, Barcelona, España Matías Ávila, Programa de Hepatología, CIMA, Universidad de Navarra, Pamplona, España María S. Aymerich, Programa de Neurociencias, CIMA, y Departamento de Bioquímica y Genética, Facultad de Ciencias, Universidad de Navarra, Pamplona, España Eva Bandrés, Servicio de Inmunología, Complejo Hospitalario de Navarra, Pamplona, España Iosune Baraibar, Servicio de Oncología, Clínica Universidad de Navarra, Pamplona, España Carmen Berasain, Elena Bodegas, Programa de Hepatología, CIMA, Universidad de Navarra, Pamplona, España Departamento de Histología y Anatomía Patológica, Facultad de Medicina, Universidad de Navarra, Pamplona, España Carlos Bravo, Departamento de Histología y Anatomía Patológica, Facultad de Medicina, Universidad de Navarra, Pamplona, España María Ángela Burrell, Departamento de Histología y Anatomía Patológica, Facultad de Medicina, Universidad de Navarra, Pamplona, España Alfonso Calvo, Departamento de Histología y Anatomía Patológica, Facultad de Medicina y Programa de Tumores Sólidos, CIMA, Universidad de Navarra, Pamplona, España Eduardo Castañón, Servicio de Oncología, Clínica Universidad de Navarra, y Programa de Tumores Sólidos, CIMA, Universidad de Navarra, Pamplona, España 25 Raúl Catena, Institute for Molecular Life Sciences, University of Zurich, Zúrich, Suiza Vicente Fresquet, Mariana García, Programa de Tumores Hematológicos, CIMA, Universidad de Navarra, Pamplona, España Departamento de Medicina Celular y Molecular, Facultad de Ciencias Biomédicas, Universidad Austral, Pilar, Argentina Ignacio Gil-Bazo, Servicio de Oncología, Clínica Universidad de Navarra, y Programa de Tumores Sólidos, CIMA, Universidad de Navarra, Pamplona, España María Gutiérrez, Programa de Tumores Hematológicos, CIMA, Universidad de Navarra, Pamplona, España Igor Hernández, Programa de Tumores Sólidos, CIMA, Universidad de Navarra, Pamplona, España Juan José Lasarte, Programa de Hepatología, CIMA, Universidad de Navarra, Pamplona, España Estefanía Maldonado, Departamento de Histología y Anatomía Patológica, Facultad de Medicina, Universidad de Navarra, Pamplona, España Álvaro Martín, Unidad Docente Multiprofesional (UDM) de Pediatría y Áreas Específicas, Hospital Universitario Virgen del Rocío, Sevilla, España Luis Montuenga, Programa de Tumores Sólidos, CIMA, y Departamento de Histología y Anatomía Patológica, Facultad de Medicina, Universidad de Navarra, Pamplona, España Paul Nguewa, Instituto de Salud Tropical (ISTUN), y Departamento de Microbiología y Parasitología, Facultad de Medicina, Universidad de Navarra, Pamplona, España Estanislao Nistal, Programa de Hepatología, CIMA, Universidad de Navarra, Pamplona, España Beatriz Pelacho, Programa de Terapia Celular, CIMA, Universidad de Navarra, Pamplona, España Diego Peñafiel, Servicio de Pediatría y sus Áreas Específicas, Complejo Hospitalario de Navarra, Pamplona, España Rubén Pío, Programa de Tumores Sólidos, CIMA, y Departamento de Bioquímica y Genética, Facultad de Ciencias, Universidad de Navarra, Pamplona, España Felipe Prósper, Programa de Terapia Celular, CIMA, Universidad de Navarra, Pamplona, España 26 Ángela María Suburo, Departamento de Medicina Celular y Molecular, Facultad de Ciencias Biomédicas, Universidad Austral, Pilar, Argentina Ignacio Tuñón, Programa de Tumores Sólidos, CIMA, Universidad de Navarra, Pamplona, España José Luis Vizmanos, Departamento de Bioquímica y Genética, Facultad de Ciencias, Universidad de Navarra, Pamplona, España María Isabel Zudaire, Programa de Tumores Sólidos, CIMA, Universidad de Navarra, Pamplona, España 27 28 Prefacio Presentamos la primera edición de la obra Biología celular biomédica. Este libro reúne una serie de características apropiadas para la enseñanza moderna de la Biología Celular que nos parecían insuficientemente tratadas en otras obras: a) un enfoque marcadamente biomédico; b) una extensión que permite tratar los temas con profundidad, pero sin abrumar al alumno, teniendo en cuenta la duración relativamente breve de esta materia en las carreras universitarias; c) una redacción de fácil lectura, que permite comprender los procesos biológicos, muchas veces complejos; d) la inclusión de algunos temas muy novedosos, como las células madre y la terapia celular, o los tratamientos personalizados contra el cáncer, y e) material didáctico complementario online, con preguntas de autoevaluación. La Biología Celular es una materia cuyos conocimientos avanzan a una rapidez extraordinaria. Esto refleja la importancia de conocer los intrincados procesos que ocurren en las células y cómo sus alteraciones dan lugar a patologías. Según mi experiencia personal de años como profesor de Biología Celular e Histología de alumnos de Medicina, Bioquímica y Biología, la «dimensión patológica» de la célula es uno de los temas que más atrae y motiva a los estudiantes. Por eso hemos insistido en comentar brevemente, a lo largo de los diferentes capítulos del libro, enfermedades que se originan como consecuencia de fallos en orgánulos o estructuras celulares. Pensamos que este enfoque puede aumentar el entusiasmo por el estudio de esta materia por parte de los alumnos a los que va dirigida esta obra: estudiantes de Medicina, Biología, Bioquímica, Biotecnología, Farmacia, Enfermería, Nutrición, Veterinaria y otras carreras con enfoque biomédico. En los últimos años hemos asistido, además, a la eclosión del apasionante mundo de las células madre, la terapia celular, la regeneración y bioingeniería de tejidos, y al posible desarrollo de órganos en el laboratorio. Estos campos abren unas perspectivas nunca antes soñadas sobre la posibilidad de tratar, de modo totalmente novedoso, numerosas enfermedades que hasta el momento no tienen curación. Pero este reto solo se conseguirá si somos capaces de comprender de un modo mucho más profundo cómo funcionan las células y cómo se pueden controlar sus procesos de proliferación, diferenciación y muerte celular. Queremos lanzar a nuestros alumnos el reto de que muchos de ellos sean los protagonistas de estos descubrimientos. De hecho, nos gustaría que nuestra obra reflejara la importancia de la investigación para hacer avances significativos en biomedicina y poder contribuir así a solucionar las enfermedades que afligen a la humanidad. En este libro han contribuido un grupo de profesores e investigadores con experiencia docente, expertos en diversos campos relacionados, directa o indirectamente, con la Biología Celular. También han contribuido algunos alumnos de últimos cursos de Medicina, cuyo papel ha sido esencial para asegurar que la materia explicada sea comprensible para los estudiantes. 29 Todos los autores tenemos un sincero deseo de que este libro sea una herramienta útil para el estudio de la Biología Celular, particularmente en el ámbito de la biomedicina. Agradeceríamos que cualquier error que podamos haber cometido o sugerencia acerca de cómo mejorar esta obra se nos haga llegar por e-mail o correo ordinario a: Dr. Alfonso Calvo [email protected] Departamento de Histología y Anatomía Patológica Facultad de Medicina (C/ Irunlarrea, 1); y Programa de Tumores Sólidos (C/ Pío XII, 55), CIMA Universidad de Navarra Pamplona, 31008. España 30 31 Agradecimientos Son innumerables las personas a las que deberíamos agradecer su contribución a este libro. En primer lugar damos las gracias a todos los miembros actuales y pasados del Departamento de Histología y Anatomía Patológica de la Universidad de Navarra, por su apoyo constante y por permitirnos usar muchas de las imágenes de microscopía que aparecen en el libro. Queremos expresar también nuestra gratitud a los Dres. Luis Miguel Pastor (Universidad de Murcia), Luis Santamaría (Universidad Autónoma de Madrid), Agustín España (Universidad de Navarra), Miguel Idoate (Universidad de Navarra) y a la Editorial EUNSA (en especial a Esperanza Melero), por haber donado algunas de las fotos que ilustran la obra; a Cristina Calvo, Alberto Calvo y Fernando Calvo por su excelente trabajo de edición; a los alumnos de la Facultad de Medicina de la Universidad de Navarra por inspirar la idea de llevar a cabo este libro; a la Editorial Elsevier (en especial a Silvia Serra y Jorge García) por creer en nuestro proyecto. Queremos agradecer de modo especial el trabajo de los doctorandos/as y personal técnico que han contribuido a nuestra investigación y que pueden haber sufrido en algún momento nuestra falta de dedicación por habernos consagrado a esta obra. Agradecemos también a todas las personas que hayan colaborado de un modo u otro a la redacción y edición de este libro. 32 CAPÍTULO 1 33 Introducción a la biología de las células Alfonso Calvo Objetivos de aprendizaje • Conocer las características generales de las células eucariotas. • Definir los rasgos propios de las células procariotas, comparándolos con los de las células eucariotas. • Conocer los elementos básicos de organización de agentes subcelulares, como virus, viroides y priones. 34 Introducción La Biología Celular estudia las células desde una perspectiva integradora, esto es, considerando aspectos morfológicos, bioquímicos, genéticos y funcionales. Así, en la génesis de esta ciencia, han confluido a lo largo de la historia otras muchas disciplinas, cada una con su propia metodología de investigación y aproximación al estudio celular, que han contribuido a nuestro conocimiento actual de la célula. Las investigaciones sobre la célula vienen ligadas históricamente a la invención y desarrollo de los microscopios, que tuvo lugar a partir del siglo xvi. En el siglo xvii, Robert Hooke (1635-1703) fue el primero en acuñar el término «célula», observando al microscopio finas láminas de corcho en las que describió las celdillas que componían su estructura. Estas observaciones fueron publicadas en su libro Micrographia (1665). Antony Van Leeuwenhoek (16321723) fabricó microscopios muy simples pero muy precisos, con los que describió la presencia de células sanguíneas, protozoos, espermatozoides y bacterias, a los que denominó animáculos. En 1837-1839, Schleiden y Schwann definieron la teoría celular, y establecieron que todos los organismos estaban formados por células, siendo estas, por lo tanto, las unidades estructurales, funcionales y reproductivas de los seres vivos. En 1885, el patólogo Virchow completó la teoría celular, al afirmar que «todas las células provienen de otra célula». El posterior desarrollo de microscopios más precisos y de técnicas de tinción de las preparaciones permitió conocer la estructura microscópica de los diferentes tejidos. En este aspecto, merece la pena destacar los trabajos de Camilo Golgi (1843-1926) y Santiago Ramón y Cajal (1852-1934), quienes utilizaron tinciones de sales de plata, oro y osmio que permitieron extender la teoría celular al sistema nervioso. En 1906 ambos obtuvieron el premio Nobel de Medicina. En 1930 se fabricó el primer microscopio electrónico, con el que se consiguieron ver orgánulos celulares, lo que supuso un avance tremendo en el conocimiento de las células. Poco después se desarrollaron las técnicas de fraccionamiento celular y centrifugación diferencial, que permitieron aislar orgánulos de acuerdo a su velocidad de sedimentación en la centrifugación; esto posibilitó su estudio funcional. De 1940 en adelante se pusieron en marcha las técnicas de cultivos celulares, esenciales también para el estudio funcional de las células. En 1953, Watson y Crick propusieron la estructura en doble hélice del ADN, basándose en experimentos fundamentalmente cristalográficos. Con este descubrimiento nació la genética moderna y se sentaron las bases moleculares de las enfermedades genéticas. En la segunda mitad del siglo xx la investigación biológica creció exponencialmente: se realizaron numerosos avances científicos y se desarrollaron muchas técnicas con las que se consiguió un conocimiento muy profundo de la estructura y función de las células. Un hito histórico destacable es el proyecto Genoma Humano, que se gestó en la etapa final del siglo xx y consistió en la secuenciación completa del genoma humano (que fue publicada en el año 2003). Esto se consiguió en un tiempo récord gracias al desarrollo de potentes técnicas de secuenciación y 35 bioinformáticas. Con los datos del genoma humano completo se pueden estudiar de un modo muy amplio y preciso las alteraciones genéticas que originan muchas de las enfermedades humanas, así como la regulación génica que gobierna la fisiología celular. 36 Organización celular de distintos organismos Los organismos vivos se caracterizan por su capacidad de crecer, responder a estímulos, interactuar con su microambiente externo, evolucionar y reproducirse autónomamente gracias a una compleja organización celular en la que tienen lugar los procesos metabólicos. Aunque los organismos vivos pueden ser unicelulares (bacterias, levaduras, protozoos y ciertas algas) o multicelulares (plantas, animales y algunas algas y hongos), se pueden clasificar, básicamente, en dos tipos, atendiendo a su organización celular: procariotas y eucariotas. Aunque el objeto de estudio del presente libro es la célula eucariota humana, conviene conocer el esquema de organización básica de los organismos procariotas, así como de otros organismos eucariotas causantes de infecciones en humanos. Analizaremos también brevemente la organización de agentes subcelulares (virus, viroides y priones) que también pueden causar importantes patologías humanas. Organización de las células eucariotas La estructura celular interna básica de las células eucariotas está bastante conservada en los distintos organismos. Su característica fundamental es la presencia de núcleo, que es la parte esencial de la célula, pues contiene el material genético. El ADN posee la información necesaria para sintetizar las proteínas requeridas para la estructura y el funcionamiento normal de la célula. A diferencia de los procariotas, que contienen solamente un cromosoma circular, los núcleos eucariotas tienen múltiples cromosomas lineales, cada uno de los cuales puede ser replicado, condensado y separado de su copia (su cromátida hermana) antes de la división celular. Las células eucariotas animales poseen distintos orgánulos celulares, citoesqueleto, ribosomas de un tamaño de 80 S y centrosomas, y realizan procesos de tráfico intracelular de vesículas (como la endocitosis, la exocitosis, etc.). La división celular tiene lugar por mecanismos complejos que ocurren durante la mitosis (o meiosis, en el caso de las células germinales). En el caso de organismos vegetales, las células están rodeadas por una pared de celulosa y contienen cloroplastos (para la realización de la fotosíntesis) y grandes vacuolas, pero carecen de centrosomas y lisosomas. La figura 1-1 muestra un esquema de la organización de las células eucariotas humanas, con la indicación del capítulo de este libro en el que se hará referencia a cada una de dichas estructuras. A continuación hablaremos brevemente de la organización biológica de protozoos y hongos (células eucariotas), por ser algunos de ellos agentes patógenos en humanos. El conocimiento de la estructura de estos agentes patógenos y sus mecanismos de infección es de gran importancia para desarrollar terapias eficaces contra estas patologías. 37 FIGURA 1-1 Esquema general de la organización de la célula eucariota. En las principales estructuras celulares se indica el capítulo de este libro donde se estudia dicha estructura. Protozoos El término «protozoo» se refiere a una familia de organismos unicelulares con organización estructural de célula eucariota, que incluye miles de especies. La mayoría de las especies de protozoos se reproducen asexualmente por fisión binaria, mientras que otros son capaces de llevar a cabo reproducción sexual. Algunas especies son parásitas y pueden infectar a las células sanguíneas, los aparatos urogenital y digestivo y otros tejidos. Como ejemplo general, comentaremos brevemente la estructura y el ciclo biológico del género Plasmodium (fig. 1-2). Este género incluye un grupo de protozoos que causa la malaria en humanos (una enfermedad que ocasiona cientos de miles de muertes al año, predominantemente en las áreas tropicales). P. falciparum es la especie que transmite la forma más frecuente y grave de malaria. La transmisión a humanos ocurre por una picadura del mosquito Anopheles, dentro del cual tiene lugar la reproducción sexual de los protozoos. Los plasmodios, que se han replicado dentro del tubo digestivo del mosquito, viajan a sus glándulas salivales, donde pasan al humano tras una picadura. Entonces, los plasmodios (que en esta fase se llaman esporozoítos) se instalan en el hígado, donde se replican de modo asexual. Los parásitos permanecen en el hígado en forma de esquizonte, hasta que se liberan (en forma de merozoítos) al torrente sanguíneo, e invaden los eritrocitos. Dentro de cada eritrocito infectado, los parásitos (llamados ahora «trofozoítos») se nutren de la hemoglobina y, en un momento dado, se replican, lo que causa lisis celular. Los picos de fiebre alta y los escalofríos típicamente asociados a la malaria son causados por los productos tóxicos de la hemólisis. 38 FIGURA 1-2 Imagen de un frotis de sangre donde se observa un plasmodio (flecha) entre los eritrocitos. (Procedente de: http://dpd.cdc.gov.) Hongos Los hongos son eucariotas de metabolismo heterótrofo que constituyen organismos unicelulares o pluricelulares, con reproducción asexual y sexual. Los hongos unicelulares son redondeados y se denominan levaduras. La mayoría de los hongos son pluricelulares y están formados por células cilíndricas alargadas dispuestas linealmente para constituir filamentos, denominados «hifas». Las hifas pueden crecer hasta formar micelios, visibles macroscópicamente. La organización de estos organismos es la de una típica célula eucariota, pero con la peculiaridad de estar rodeada por una pared de polisacáridos fibrilares (como la quitina) y estructuras amorfas de glucanos y mananos (que contienen los principales antígenos de la pared). La pared forma un exoesqueleto rígido que posee una función protectora, pero no permite la endocitosis. Las enfermedades causadas por hongos se denominan micosis. Hay ciertas especies de hongos que son muy importantes desde el punto de vista clínico, porque constituyen patógenos oportunistas que causan enfermedades en pacientes inmunodeprimidos (como los géneros Candida y Aspergillus). Los tratamientos incluyen anfotericina B y antifúngicos imidazólicos. 39 Candida albicans es una especie de hongo unicelular (levadura) que puede vivir de modo comensal en la piel y en las mucosas de individuos sanos, pero cuando se dan las condiciones externas adecuadas de humedad, ambiente cálido e inmunodepresión, provoca infecciones con distinto grado de sintomatología. La candidiasis mucocutánea puede afectar a las manos, pies, genitales, axilas y cavidad orofaríngea, generando lesiones eritematosas, picor, pápulas y pústulas. Si la inmunodepresión es muy severa, esta levadura es capaz de entrar en el torrente sanguíneo (en cuyo caso, la infección se denomina candidemia), y puede afectar así a órganos como los ojos (con riesgo de sufrir ceguera) y riñones (oliguria y fallo renal). Entre los síntomas sistémicos se incluyen coagulación intravascular, fiebre, shock y, potencialmente, la muerte. Entre los hongos filamentosos hay algunos que causan micosis cutáneas, subcutáneas o sistémicas. El género Aspergillus (fig. 1-3) está constituido por especies oportunistas que dan lugar a micosis sistémicas (la infección pulmonar es la localización más frecuente). Este hongo puede provocar asma aspergilar, bronquitis, otitis o fungemias de pronóstico muy grave. FIGURA 1-3 Fotografía microscópica del género patógeno Aspergillus. Otro hongo que mencionaremos es Saccharomyces cerevisiae, una levadura utilizada industrialmente para la fabricación de pan y cerveza que constituye, además, un modelo de estudio ampliamente utilizado en biología celular y molecular. Estas levaduras se pueden cultivar con facilidad en el laboratorio y se han empleado durante años para estudiar muchos aspectos relacionados con la replicación del ADN, la transcripción y la traducción proteicas, y el ciclo y la división celulares. Organización de las células procariotas Los procariotas son organismos unicelulares de reproducción asexual, sin núcleo y, normalmente, sin orgánulos rodeados de membrana. Son organismos de distribución ubicua en la naturaleza, lo que demuestra su grado de adaptación al medio y su diversidad de metabolismos, que pueden ser de tipo autótrofo o heterótrofo. En la tabla 1-1 se muestran las diferencias estructurales y funcionales entre los organismos eucariotas y los procariotas. Los 40 procariotas se pueden clasificar en dos grandes grupos (llamados «dominios»): bacterias y archaea (antiguamente denominados «arqueobacterias»). Este último grupo incluye organismos extremófilos (con capacidad de sobrevivir en ambientes adversos) que no tienen gran relevancia médica, por lo que nos centraremos únicamente en las bacterias. Tabla 1-1 Resumen de las diferencias entre células eucariotas y procariotas Eucariotas Procariotas 10-100 μm 0,2-2 μm Localización del genoma Dentro del núcleo, recubierto por la envoltura nuclear En el citoplasma, sin envoltura nuclear Estructura del genoma Lineal, segmentado en cromosomas, asociados a histonas Un solo cromosoma circular; sin histonas Citoesqueleto Presente Ausente Pared celular En células animales, inexistente; en plantas, celulosa; en algunos hongos, quitina; en levaduras, glucanos y mananos Peptidoglucano y otras estructuras Movilidad Cilios y flagelos en algunas células animales Flagelos rotatorios de locomoción División celular Mitosis o meiosis Fisión binaria Ribosomas 80 S en el citoplasma 70 S Orgánulos cubiertos de membrana Núcleo, mitocondrias, retículo endoplasmático, aparato de Golgi, endosomas, vacuolas; cloroplastos (en plantas Ninguno. Algunas bacterias poseen mesosomas (orgánulos fotosintéticas) primitivos) Tamaño de la célula (diámetro promedio) Bacterias Las bacterias (fig. 1-4) son procariotas recubiertos por una pared que les confiere protección frente al medio externo. En función de la estructura de la pared, las bacterias se clasifican en dos grandes grupos: grampositivas y gramnegativas, dependiendo de la coloración frente a la tinción de Gram. Algunas bacterias pueden ser clasificadas como ácido-alcohol resistentes (tinción de Ziehl-Neelsen); son bacterias de alto contenido en ácido micólico y sus paredes son muy hidrófobas. Un ejemplo es Mycobacterium tuberculosis, agente causal de la tuberculosis. 41 FIGURA 1-4 Esquema de la organización celular de las bacterias. A. Organización general con sus estructuras principales. B. Esquema de la estructura de la pared de bacterias grampositivas. C. Pared de bacterias gramnegativas. Las bacterias presentan una gran diversidad de formas y agrupaciones, características de cada especie y, por lo tanto, con interés taxonómico. Las más frecuentes son los cocos (esféricos), los bacilos (bastoncillos) y los espirilos (en forma de sacacorchos). Metabólicamente son organismos extraordinariamente diversos; los hay aerobios estrictos, anaerobios estrictos y otras situaciones intermedias. Dependiendo del tipo, podrán fermentar, respirar, fotosintetizar e, incluso, obtener energía de la oxidación de compuestos inorgánicos. Algunas bacterias son muy plásticas y, dependiendo de las condiciones, utilizarán un sistema u otro para obtener energía. Los procariotas carecen de orgánulos de membrana, aunque algunos pueden poseer pseudo-orgánulos (mesosomas) donde se acumulan compuestos orgánicos o inorgánicos. Los ácidos nucleicos de los procariotas no 42 están rodeados por una membrana nuclear, de tal modo que el ADN, los ribosomas, las enzimas y los metabolitos se distribuyen a lo largo del citoplasma. El típico genoma bacteriano consiste en una molécula de doble cadena de ADN circular (cromosoma bacteriano), no unido a histonas. Las bacterias pueden tener también varias cadenas de material genético extracromosómico, llamadas plásmidos. Estas secuencias circulares de ADN son mucho más pequeñas que el cromosoma y codifican para genes que les confieren algunas ventajas para la supervivencia, como, por ejemplo, la capacidad de resistencia frente a antibióticos, la adaptación a determinados medios o la capacidad de ser más virulentas. Entre otras características típicas de los procariotas podemos decir que la traducción de proteínas tiene lugar en ribosomas de un tamaño de 70 S y la membrana celular carece de colesterol y esteroides. La estructura y la composición de la pared bacteriana difieren entre las bacterias grampositivas y gramnegativas. El componente esencial de la pared es el peptidoglucano, que proporciona rigidez y estabiliza la estructura de la misma. En la pared de las bacterias grampositivas hay una capa gruesa de peptidoglucano, mientras que en las bacterias gramnegativas constituye una capa fina, separada de la membrana plasmática por el espacio periplasmático y recubierta exteriormente por otra membrana que contiene lipopolisacáridos. El lipopolisacárido es conocido como endotoxina, ya que produce fiebre, activación de la cascada del complemento, elevación de los niveles de citoquinas, etc. Algunas bacterias poseen por encima de estas estructuras un glucocáliz (cápsula), formado normalmente por polisacáridos; puede estar presente tanto en bacterias gramnegativas como en grampositivas. La cápsula protege a la bacteria de la desecación y de la fagocitosis y le permite adherirse a determinados sustratos o tejidos. Las bacterias pueden tener también uno o múltiples flagelos que utilizan principalmente para la locomoción. Para la adherencia pueden presentar, además, unas proyecciones proteicas denominadas «fimbrias». Los pili (pilus en singular) tienen una estructura similar a las fimbrias, aunque son más largos y gruesos; están especializados en la conjugación bacteriana para transferir material genético de una bacteria a otra. Algunas especies (la mayoría de las cuales son bacilos grampositivos) son capaces de formar endosporas en condiciones adversas, que constituyen una forma muy resistente frente a agentes químicos o físicos. Las endosporas pueden sobrevivir en estas condiciones latentes durante cientos de años, y pueden germinar de nuevo, retornando a su estado normal cuando se exponen a condiciones favorables. Existen innumerables ejemplos de bacterias patógenas; de entre ellas, nos referiremos a algunas que serán citadas posteriormente en capítulos de este libro. Helicobacter pylori es una especie acidófila, de forma helicoidal, gramnegativa, que coloniza la mucosa gástrica en humanos. Esta bacteria se adapta bien a ambientes muy ácidos, característicos del estómago. H. pylori produce una infección crónica que puede permanecer asintomática o dar lugar a úlceras que incluso perforan el estómago, además de aumentar el riesgo de sufrir cáncer gástrico y linfoma de tipo MALT (v. capítulo 16). En el pasado, cuando se desconocía que la úlcera gástrica podía ser causada por este microorganismo, esta patología tenía un tratamiento difícil. Actualmente, una adecuada combinación de antibióticos e inhibidores de la bomba de protones constituye un tratamiento rápido y eficaz. 43 Otro ejemplo que consideraremos es Vibrio cholerae, un bacilo curvo, gramnegativo, flagelado, anaerobio facultativo y agente causante de las epidemias de cólera. V. cholerae (y otras especies de Vibrio) se transmite mediante la ingesta de alimentos contaminados. Al igual que otras bacterias patógenas del tubo gastrointestinal, V. cholerae evade el sistema inmune del huésped (incluidos la lisozima, el ácido gástrico, las células fagocíticas, etc.) y se adhiere a las células epiteliales del intestino. La subunidad B de la toxina colérica se une a los gangliósidos en la superficie de la célula, mientras que la subunidad A penetra en el citosol. Esto conlleva el inicio de una cascada de señalización intracelular que aumenta los niveles de AMPc (v. capítulo 13), lo cual altera el balance normal de electrólitos: los niveles de Na y + Cl aumentan en la luz intestinal, y entonces arrastran agua hacia la luz por ósmosis, provocando diarrea y vómitos. − Salmonella es un género de bacterias gramnegativas, en forma de bacilos flagelados, anaerobios facultativos, que incluye varias especies y serotipos patógenos para los humanos. S. enterica serovariedad typhi causa la fiebre tifoidea, que provoca diarreas, dolores abdominales, vómitos y náuseas. S. enterica serovariedad enteritidis, es el agente causal de la gastroenteritis típicamente asociada a la intoxicación alimentaria debida a la ingesta de huevos, pollo o carne no bien cocidos. Una vez ingerida, S. enteritidis (al igual que otras serovariedades de Salmonella) es capaz de evadir la respuesta inmune del huésped, adherirse a la mucosa (v. capítulo 5) e invadir las células epiteliales, o ser fagocitada por macrófagos. Como muchas otras bacterias gramnegativas, Salmonella tiene lipopolisacáridos abundantes en su membrana externa, que desencadenan una respuesta inmunológica potente y muchos de los síntomas asociados a la salmonelosis. La bacteria Escherichia coli es un bacilo gramnegativo, anaerobio facultativo, que se encuentra en el intestino (y otros órganos) normalmente en forma de simbionte, como parte de la microbiota intestinal normal. Algunas cepas son, no obstante, altamente patógenas, y causan infecciones intestinales, urinarias, etc. (v. capítulo 9). Esta bacteria tiene gran importancia en investigación biomédica. E. coli es la bacteria más utilizada en ingeniería genética para la obtención de compuestos de interés biológico o terapéutico. Muchas proteínas recombinantes se producen en E. coli modificadas genéticamente. Esta bacteria se ha empleado para el estudio de numerosos procesos biológicos como la replicación o la transcripción del ADN. Las variantes genéticas mutantes nos han permitido, además, conocer aspectos clave de la resistencia de las bacterias frente a los antibióticos. Finalmente hablaremos de los micoplasmas, bacterias que carecen de pared celular, por lo que son resistentes a penicilinas y a otros antimicrobianos que actúan sobre esta estructura. En humanos, los micoplasmas pueden colonizar superficies mucosas de las vías respiratorias (como Mycoplasma pneumoniae) y el aparato urogenital (Mycoplasma hominis). M. pneumoniae entra en cuerpo por inhalación provocando infecciones en las vías respiratorias. Tras un período largo de incubación de 2 a 3 semanas, comienzan los síntomas, que incluyen dolor de cabeza, tos y fiebre. Algunos pacientes pueden presentar bronquitis o neumonía. Los micoplasmas son células muy pequeñas (de unos 200 nm). La especie Mycoplasma genitalium tiene solamente 482 genes, y recientemente se ha descubierto que 100 de estos genes podrían no ser esenciales para su supervivencia. El 44 instituto Venter (EE. UU.) ha conseguido sintetizar en el laboratorio un micoplasma con solo 382 genes absolutamente necesarios para que este microorganismo pueda cultivarse in vitro y replicarse. Este microorganismo se ha conseguido eliminando (uno a uno) genes de M. genitalium que no se requieren para la vida. El microorganismo resultante se ha llamado Mycoplasma laboratorium. La simplicidad de los micoplasmas, junto a la capacidad de ser modificados genéticamente de modo relativamente sencillo, les convierte en «herramientas biológicas» idóneas para la generación artificial de nuevos organismos útiles para el hombre. 45 Organización de agentes subcelulares patógenos Virus Estructura y replicación Los virus son agentes infecciosos que consisten básicamente en un genoma empaquetado por una cubierta proteica, sin capacidad de replicarse independientemente (fig. 1-5). Son parásitos intracelulares obligados, lo que significa que deben entrar en una célula huésped y aprovecharse de sus enzimas y sustratos para poder replicarse. Aunque los virus pueden tener una gran variedad de formas y estructuras, así como estrategias de replicación y capacidad de invadir diferentes células huésped, hay unos rasgos básicos característicos de todos ellos. Su cubierta, llamada «cápside», está formada por unidades (fundamentalmente de naturaleza proteica) denominadas «capsómeros». Por encima, algunos pueden presentar una envoltura lipoproteica (membrana que adquieren de la célula en la que se replicaron). Sus genomas pueden consistir en ADN o ARN, que pueden ser de cadena doble o simple, lineal o circular, segmentado o no. Para simplificar, vamos a dividir los virus en tres clases de acuerdo al tipo de ácido nucleico y modelo de replicación: 1) virus de ADN; 2) virus de ARN, y 3) virus que requieren transcriptasa inversa. 1. Los virus de ADN pueden ser de cadena doble (bicatenarios [ADNbc]) o simple (monocatenarios [ADNmc]). Se replican mediante una ADN polimerasa codificada bien por el genoma vírico, o bien por el de la célula huésped. Los poxvirus (como el virus de la viruela) son virus de ADNbc que se replican en el citoplasma de la célula en vez de en el núcleo y, por lo tanto, deben codificar su propia ARN polimerasa dependiente de ADN. Otros virus de ADNbc son los adenovirus (que provocan infecciones de las vías respiratorias y el sistema gastrointestinal, entre otras patologías), los herpesvirus (que causan el herpes labial y, algunos de ellos, tumores) y los papovavirus (causantes de papilomas) (v. capítulo 16). La familia de los parvovirus (que provocan artritis y eritema) es un buen ejemplo de virus con genoma de ADNmc. 2. Los virus de ARN (o ribovirus) también pueden ser bicatenarios o monocatenarios, dependiendo de las especies, y deben producir una polimerasa dependiente de ARN (conocida como replicasa) para replicar sus genomas. Los virus monocatenarios pueden tener polaridad positiva cuando son inmediatamente traducidos por la célula huésped, al igual que cualquier otro ARNm (dirección 5′-3′). Otros, en cambio, presentan polaridad negativa contraria a la del ARNm (por lo tanto, antisentido) y no pueden ser traducidos directamente a proteínas: el ARN debe convertirse primeramente en positivo para ser traducido. Algunos ejemplos de virus ARNmc(+) son los picornavirus (causantes del resfriado común y de la poliomielitis) y los togavirus (causantes, p. ej., de la rubéola). Virus ARNmc(−) se encuentran, por ejemplo, en las familias de ortomixovirus (agente causal de la gripe), paramixovirus (responsables de enfermedades como el sarampión y las paperas) y rabdovirus (que incluye el virus de la rabia y de la estomatitis vesicular). La mayoría de los virus ARNbc pertenecen a la familia de los reovirus y tienen un genoma segmentado. 46 3. El tercer tipo incluye virus que codifican para la enzima transcriptasa inversa, con la que sintetizan ADN a partir de un molde de ARN. El genoma vírico puede consistir en ADN, como en los hepadnavirus (que incluyen los virus que causan la hepatitis B), o en ARN, en el caso de la familia de retrovirus, en cuyo grupo está el virus del VIH (causante del sida); en ambos casos se requiere la transcriptasa inversa para completar su ciclo de multiplicación. FIGURA 1-5 Estructura de algunos virus. A. Representación de un adenovirus. B. Esquema de un bacteriófago. C. Imagen de microscopía electrónica de un adenovirus. (C, procedente de: http://www.med.upenn.edu/gtp/morphology_gallery.shtml.) Las cápsides víricas son típicamente icosaédricas (tienen 20 caras, cada una de las cuales equivale a un triángulo equilátero) o cilíndricas (formadas por proteínas en disposición helicoidal). Algunas cápsides de bacteriófagos (virus que infectan bacterias) pueden ser más complejas (v. fig. 1-5). Una vez traducidas por la maquinaria enzimática del huésped, los capsómeros se autoensamblan alrededor del genoma vírico. Hay ciertos virus que poseen una envoltura lipídica por encima de la cápside. Esta envoltura procede de la célula huésped en donde se replicó, por lo que contiene no solo proteínas víricas (fundamentales para facilitar la futura invasión celular), sino además los propios componentes de la membrana de la célula huésped. De entre los numerosos virus que causan patologías en humanos, comentaremos brevemente algunos aspectos del virus del papiloma humano, de la gripe y del sida. Virus del papiloma humano El virus del papiloma humano (HPV, del inglés human papilomavirus) es un virus sin envoltura, con una cápside icosaédrica y genoma de ADN circular de doble cadena. Las partículas víricas infecciosas no codifican su propia polimerasa, sino que la replicación del genoma vírico se lleva a cabo por la polimerasa de las células del hospedador (fig. 1-6). Tras la entrada del ADN en la célula, se produce la transcripción del ARN y la traducción de proteínas víricas, que genera viriones (partículas víricas completas listas para infectar a otra célula). El ADN vírico queda en el 47 núcleo en forma de episoma (sin integrarse en el genoma del hospedador) y se replica durante los ciclos de replicación de la célula, lo que mantiene de modo crónico la infección. En general, el HPV infecta células de epitelio escamoso — por ejemplo, las de la piel (epitelio escamoso queratinizado)— y del aparato genital (epitelio escamoso mucoso). Un rasgo típico de la infección por papilomavirus es la presencia de verrugas o papilomas, que están esencialmente formadas por células escamosas que crecen en forma de tumor benigno. La transmisión del HPV ocurre típicamente a través de contacto directo con la piel de los genitales. Las células infectadas desarrollan vacuolas citoplasmáticas (pasando a llamarse entonces coilocitos), que constituyen un signo distintivo para la detección de esta infección. Aunque las verrugas causadas por el HPV son benignas, la incorporación del genoma vírico dentro de la célula huésped se asocia con progresión a carcinomas. En estas células, la presencia del genoma vírico conduce a una expresión de dos proteínas víricas (E6 y E7), que inactivan proteínas de la célula huésped involucradas en la supresión tumoral (p53 y proteína del retinoblastoma, respectivamente) (v. capítulo 16). FIGURA 1-6 Esquema del ciclo de infección del virus del papiloma humano (HPV). Este es un virus oncogénico que puede causar tumores de cérvix, entre otros, por inactivación de las proteínas Rb y p53. En individuos inmunodeprimidos infectados con HPV existe un alto riesgo de desarrollar carcinomas. Aunque hay numerosos tipos de papilomavirus, cada variante muestra normalmente un tropismo muy específico. Mientras que unos tipos infectan la piel y pueden dar lugar a verrugas plantares (p. ej., HPV-1), otros tienen tropismo por el aparato genital. HPV-6 y 11 son responsables de aproximadamente el 90% de las verrugas anogenitales, mientras que HPV-16 y 18 se asocian con carcinomas cervicales y del pene. La alta prevalencia de las infecciones de HPV entre las mujeres sexualmente activas y el riesgo que tienen de desarrollar cáncer cervical han promovido el desarrollo de vacunas (como Gardasil y Cervarix ) que previenen de modo eficaz la patología vírica. ® ® 48 Virus de la gripe El virus de la gripe (o Influenza) es de tipo ARNmc(−) segmentado en ocho fragmentos, cada uno de los cuales es capaz de codificar proteínas distintas (11 en total) (fig. 1-7). Algunas cepas afectan solo al hombre o solo a animales (cerdo y aves), mientras que otras son infecciosas en ambos, y puede darse, por lo tanto, un salto entre especies. La cápside está recubierta por una envoltura en la que quedan embebidas (sobresaliendo hacia el exterior) dos tipos de proteínas víricas: la neuraminidasa (NA o N) y la hemaglutinina (HA o H). La HA favorece la adhesión de las partículas víricas a la célula huésped, mientras que la NA facilita la salida de la progenie vírica. Además, esta enzima puede degradar el ácido hialurónico, y facilitar así la diseminación del virus. FIGURA 1-7 Esquema representativo del ciclo del virus de la gripe. El proceso secuencial de infección se explica en el texto. En humanos la infección comienza típicamente en las vías respiratorias superiores, tras la invasión del epitelio por parte del virus; allí el ácido siálico de las superficies celulares interactúa con la HA. Tras la adhesión, la partícula vírica entra por un mecanismo de endocitosis mediada por receptor (v. capítulo 5) en vesículas cubiertas de clatrina (v. fig. 1-7, paso 1). El bajo pH típico de los endosomas permite que el virus se libere y salga hacia el citoplasma y, posteriormente, al núcleo (v. fig. 1-7, paso 2). Allí, el ARNmc(−) puede ser transcrito por la ARN polimerasa vírica en ocho moléculas de ARNmc (v. fig. 1-7, paso 3a) que, o bien son exportadas al citoplasma (donde son traducidas para producir proteínas víricas) (v. fig. 1-7, paso 4) o bien permanecen dentro del núcleo, sirviendo como molde para la replicación del genoma (v. fig. 1-7, paso 3b). Algunas proteínas recién sintetizadas son internalizadas hacia el núcleo para formar nuevas partículas víricas (v. fig. 1-7, paso 5a); otras (neuraminidasa y hemaglutinina) pasan al aparato de Golgi y terminan ancladas en zonas concretas de la membrana plasmática (v. fig. 1-7, paso 5b). El ARNmc(−) generado por replicación, junto con otras proteínas víricas, sale del núcleo (v. fig. 1-7, paso 6) y migra hacia las zonas de la 49 membrana donde se encuentran la neuraminidasa y la aglutinina, produciéndose el ensamblaje del virus y su liberación (v. fig. 1-7, paso 7). Como muchos otros virus, el virus de la gripe puede evadir el sistema inmunitario mediante un cambio de estructura en sus antígenos, dando lugar así a nuevas cepas. Cada nueva forma antigénica se enumera en función de las proteínas H y N seguidas de números. La recombinación que tiene lugar entre los fragmentos del genoma, aparte de las mutaciones puntuales que puedan ocurrir, es responsable de la generación de estas variantes antigénicas. Si dos cadenas distintas de ácido nucleico vírico infectan la misma célula huésped, la progenie vírica puede ser empaquetada con una nueva combinación de segmentos de ARN. Estos fenómenos pueden ser suficientes para generar variantes proteicas que no sean reconocidas por los anticuerpos creados durante una infección previa, por lo que las vacunas de la gripe tienen que cambiar cada año. La generación de la variante H1N1 está ligada a la epidemia devastadora que tuvo lugar en 1918 (llamada «gripe española»), que condujo a la muerte de unos 50 millones de personas, así como a la de la pandemia de 2009-2010. Otra variante especialmente virulenta es la H5N1 (gripe aviar), que afecta tanto a algunas aves como a los humanos. Virus de la inmunodeficiencia humana (VIH) El virus de inmunodeficiencia humana (VIH) (fig. 1-8) infecta células que expresan CD4 en su superficie, como los linfocitos T cooperadores y los macrófagos. La propagación de la infección y la muerte de estas células conducen al síndrome de inmunodeficiencia adquirida (SIDA), que aumenta la susceptibilidad del paciente a infecciones oportunistas. El VIH es un retrovirus y, por lo tanto, pertenece al grupo de virus que codifican la transcriptasa inversa. El genoma del VIH es de tipo ARNmc(+), con dos copias idénticas dentro de un virión maduro. Dentro de la cápside, el virus contiene tres enzimas: la transcriptasa inversa, una proteasa y una integrasa. La cápside está rodeada por proteínas de la matriz vírica que están asociadas con una envoltura esférica. Dos glucoproteínas víricas (gp120 y gp41) sobresalen de la envoltura lipídica y permiten al VIH entrar en la célula huésped. Para el proceso de adhesión, la proteína vírica gp120 debe unirse al CD4 y posteriormente a un correceptor: CXCR4 en el caso de células T cooperadoras, o CCR5 en los macrófagos. La unión al receptor permite entonces la formación de un poro de fusión que permite la entrada del virión (v. fig. 1-8, B, paso 1). 50 FIGURA 1-8 Esquema de la estructura del virus del VIH (A) y del proceso de infección (B). El mecanismo básico de infección se explica en el texto. Una vez dentro, la replicación vírica requiere la acción de la transcriptasa inversa: el ARN vírico es transcrito en el citoplasma para formar una copia de ADN (v. fig. 1-8, B, paso 2). La cadena de ADN sirve como molde para generar el ADN bicatenario provírico, que es transportado al núcleo, donde se integra en el genoma de la célula con la ayuda de la enzima integrasa vírica, que tiene actividad endonucleasa (v. fig. 1-8, B, paso 3). El provirus puede permanecer en estado latente (asintomático), pero en presencia de determinados factores de transcripción, las ARN polimerasas de la célula transcriben los ARNm de genes víricos (v. fig. 1-8, B, paso 4) que se traducen en el citoplasma (v. fig. 1-8, B, paso 5). Las proteínas estructurales del VIH son codificadas por los siguientes genes: gag, que codifica varias proteínas que forman la cápside y la matriz en el virión; pol, que codifica la transcriptasa inversa, la integrasa y la proteasa; y env, que da lugar a las glucoproteínas destinadas a la superficie de la envoltura vírica. Los diferentes transcritos se originan a partir del producto inicial de la traducción mediante un procesamiento llamado splicing (v. capítulo 8), para poder formar las proteínas funcionales. El ensamblaje y la liberación de nuevos virus se producen en la membrana plasmática de la célula huésped (v. fig. 1-8, B, pasos 6 y 7). Viroides El término «viroide» se usa para describir un grupo de patógenos intracelulares que causan enfermedades en plantas. Son estructuralmente más simples y pequeños que los virus. Consisten esencialmente en ARN circular de cadena simple sin una cubierta de proteínas ni otra envoltura, y son capaces de autorreplicarse dentro de la célula huésped. 51 Los viroides poseen normalmente de 250 a 400 nucleótidos, y no parecen codificar ninguna proteína. Se sospecha que su estructura de ARN interactúa con componentes celulares, causando así su replicación, patogenicidad y movimiento dentro de las células. Estos agentes son resistentes a ribonucleasas y la replicación parece que tiene lugar mediante la utilización de las ARN polimerasas de la célula huésped. Originan enfermedades porque interfieren con los procesos fisiológicos celulares cuando su número es abundante. Los viroides se caracterizan por poseer estructuras secundarias en forma de bastón con regiones altamente conservadas. Estos agentes entran en el sistema vascular de la planta (el floema), donde pueden circular y, eventualmente, invadir nuevas células, repitiendo así su ciclo replicativo de vida. Priones Las proteínas priónicas (PrP) normales se expresan en las superficies de neuronas en los humanos y en otros mamíferos, aunque su papel exacto dentro del sistema nervioso es desconocido. Sin embargo, su plegamiento anormal se asocia con varias enfermedades neurodegenerativas, incluidas la enfermedad de Creutzfeldt-Jakob (ECJ), el insomnio familiar fatal, el scrapie y el kuru. A pesar de que estas enfermedades son relativamente infrecuentes y tienen características propias, todas ellas causan encefalopatías espongiformes transmisibles. La PrP mal plegada (de aquí en adelante nos referiremos a esta simplemente como «el prión») se convierte en un agente infeccioso que activa una reacción en cadena capaz de cambiar el plegamiento de PrP normales. Cuando un prión patógeno (PrP , del inglés Sc scrapie isoform) entra en contacto con una PrP normal (PrP , del inglés celular isoform), induce un cambio C conformacional en la PrP que la transforma en PrP (y, por lo tanto, en patógena e infecciosa). Aunque no se han C Sc elucidado plenamente los detalles de esta transformación priónica, se ha postulado que la conversión de PrP en PrP C Sc depende de la actividad catalítica del prión y/o de la polimerización dependiente de nucleación. El prión patógeno puede ser el resultado de mutaciones del gen que codifica la PrP (localizado en el cromosoma 20p en los humanos), o puede ser transmitido por la contaminación con tejidos infectados. Entre las enfermedades priónicas familiares se incluyen la ECJ, el síndrome de Gerstmann-Sträussler-Scheinker y el insomnio familiar fatal. Entre las enfermedades originadas por ingestión de alimentos contaminados están el kuru (enfermedad endémica de Nueva Guinea), el scrapie (que se transmite entre ovejas) y las encefalopatías espongiformes bovinas (la enfermedad de las vacas locas). Los PrP son resistentes a proteasas y a tratamientos antisépticos tradicionales, como la cocción, la Sc irradiación o el tratamiento con agentes químicos desnaturalizantes. Los PrP interfieren en el funcionamiento normal Sc de las neuronas, causando su muerte y dando lugar al aspecto espongiforme del cerebro. La clínica de las enfermedades priónicas suele incluir déficits neurológicos y demencia. Lecturas recomendadas 52 Gamazo C, Sánchez S. Camacho AI. Microbiología basada en la experimentación. España: Elsevier; 2014. Neumann G, Noda T, Kawaoka Y. Emergence and pandemic potential of swine-origin H1N1 influenza virus. Nature. 2009;459:931–939. Ramón, Cajal S. Reglas y consejos sobre investigación científica. Madrid: Austral; 2007. Willey J, Sherwood L, Woolverton C. Prescott’s Microbiology. 9.ª ed. Mc Graw Hill; 2013. 53 CAPÍTULO 2 54 Cómo se estudian las células. Métodos y técnicas básicas en biología celular Alfonso Calvo Jackeline Agorreta Raúl Catena Ángela María Suburo Mariana García María Isabel Zudaire Objetivos de aprendizaje • Conocer los fundamentos de la microscopía óptica y electrónica, así como los diferentes tipos de microscopios. • Comprender los mecanismos básicos de las principales técnicas empleadas en biología celular y molecular, con ejemplos concretos sobre su uso en biomedicina. • Entender cómo se modifican genéticamente las células y la utilidad de estos procedimientos en el conocimiento de la fisiología celular y en la terapia génica. • Valorar la utilidad diagnóstica de las técnicas explicadas (en especial la inmunohistoquímica, las técnicas citogenéticas y la PCR, así como sus metodologías derivadas). 55 Introducción Actualmente existen innumerables técnicas que se emplean en biología celular para conocer la estructura y función de las células. Lógicamente, no es el objetivo de este capítulo hacer una exposición exhaustiva de todas ellas y explicar su metodología. Nos interesa únicamente destacar las principales herramientas utilizadas para el estudio más rutinario de las células y su aplicación en biomedicina. Nos centraremos en el microscopio y en las técnicas relacionadas con la microscopía. Algunas otras técnicas más propias de la biología molecular o la bioquímica con interés diagnóstico serán explicadas en el material adicional de la web asociada a la presente obra. 56 Microscopía óptica convencional El microscopio es un elemento imprescindible para el conocimiento y análisis de las células y tejidos. En el estudio de las células se presentan dos problemas fundamentales: su pequeño tamaño y el hecho de que la mayoría de las estructuras celulares son translúcidas, por lo que no se pueden distinguir con claridad. El primer problema se soluciona por medio de los microscopios, que consiguen aumentar la imagen unas 1.500 veces, en el caso de un microscopio óptico convencional, y unas 150.000-200.000 veces en el caso del microscopio electrónico. El segundo problema se soluciona mediante la utilización de técnicas de contraste, como las tinciones o el uso de sistemas ópticos especiales, que permiten distinguir las diferentes estructuras de células y tejidos. El microscopio óptico convencional está formado por tres sistemas (fig. 2-1): 1. Mecánico: consta de pie, platina, tubo y columna. 2. Óptico: formado por el objetivo y el ocular. 3. De iluminación: constituido por el foco de luz, el condensador y el diafragma. FIGURA 2-1 Partes del microscopio óptico clásico (de campo claro). (Dibujo procedente de: Montuenga et al. Técnicas en histología y biología celular. Barcelona: Elsevier; 2009.) Aumentos, poder de resolución y límite de resolución No siempre que aumentamos una imagen conseguimos verla con más nitidez. El ejemplo más claro de esta evidencia lo tenemos en una fotografía impresa que aumentamos una serie de veces. Si la imagen tiene pocos píxeles por pulgada (es decir, tiene poca resolución), aunque aumentemos mucho la imagen, solo conseguiremos verla más grande (pero pixelada, sin mejorar la definición). En microscopía, la calidad de la imagen viene determinada, por un lado, por la correcta preservación de las estructuras del tejido, pero fundamentalmente por la calidad de la óptica del microscopio y por la longitud de onda de la luz empleada. Por eso, en microscopía se ha introducido el concepto de 57 poder de resolución, que se define como la capacidad que tiene un microscopio para distinguir como separados o diferentes dos puntos muy cercanos entre sí. Un concepto inverso es el de límite de resolución (LR), que es la distancia mínima que debe haber entre dos puntos muy cercanos entre sí para poder ser distinguidos como independientes. El LR para el ojo humano es de alrededor de 0,1 mm, de tal manera que si dos puntos están situados a una distancia menor, no los podríamos distinguir con claridad como separados, sino que nos parecería que están juntos. El LR para el microscopio óptico convencional es de ∼0,2 separado esté μm. Todopor lo que una distancia menor, o tenga un tamaño inferior a esta medida, no podrá ser observado con claridad al microscopio óptico. El LR para el microscopio electrónico de transmisión es de 10-20 Å. Las células (10-100 μm), el n lisosomas ( úcleolas μm), celular mitocondrias ( ∼10 y ∼0,5μm) -10 μm),etc., las pueden bacteriasser (0,5 observados al microscopio óptico; en cambio, estructuras como los ribosomas (25 nm), los virus (30-100 nm), la membrana plasmática (7 nm), etc., solo se pueden observar con el microscopio electrónico. Matemáticamente el LR se define como el cociente entre la longitud de onda empleada (λ) multiplicada por una constante k, dividido por la apertura numérica (AN) del objetivo (fig. 2-2). AN se define, a su vez, como el producto del índice de refracción del medio que existe entre la muestra y el objetivo, multiplicado por el seno del semiángulo de haz de luz incidente (α). Como se utiliza luz del espectro visible, comprendida entre 400 y 700 nm, para el cálculo del LR se utiliza un valor intermedio de λ (550 nm; k es una constante que tiene un valor de 0,65). En condiciones óptimas, poniendo todos estos datos en la ecuación, obtendríamos un LR para el microscopio óptico convencional de 0,24 μm. FIGURA 2-2 Definición matemática del límite de resolución (LR). En las mejores condiciones ópticas, el LR del microscopio óptico está en torno a 0,2 μm. La naturaleza ondulante de la luz establece que no se puedan alcanzar límites de resolución inferiores a ∼0,2 para un microscopio óptico convencional. Cuando un tren de ondas lumínicas que están en fase atraviesa los bordes de un objeto, estas sufren desviaciones y chocan con las ondas que viajan paralelas a ellas. Esta interferencia (que se denomina difracción óptica) hace que el borde de dicho objeto no se observe nítido, sino difuso. Por lo tanto, si dos objetos pequeños están muy juntos entre sí, la difracción óptica haría que se confundieran como uno solo. Si se utilizara luz de menor λ se conseguiría que esa desviación fuera menor y, por lo tanto, se disminuiría la interferencia, 58 obteniéndose así un LR más pequeño. Algunos microscopios utilizan luz ultravioleta (por debajo del espectro visible), pero esto implica el empleo de sistemas ópticos que transformen posteriormente la luz en visible (una vez que el haz ha atravesado la muestra). Como se verá más adelante, en el microscopio electrónico se utiliza un haz de electrones acelerado como fuente de iluminación, que posee una λ muy pequeña, lo que permite aumentar considerablemente la resolución. Obtención de contraste El contraste es la propiedad que nos permite distinguir estructuras celulares por su diferente color o brillo. Se puede obtener contraste básicamente mediante dos métodos: a) mediante variaciones en la λ que atraviesa distintas estructuras celulares, y b) mediante variaciones en la amplitud de la onda. Los colorantes modifican la λ, por lo que, cuando se tiñe una célula o un tejido, la tinción diferencial de las diversas estructuras celulares hace que las veamos con distinto color, lo cual proporciona el contraste. El uso combinado de varios colorantes, como por ejemplo la hematoxilina (que nos permitirá ver los núcleos celulares de color azulado) y la eosina (que tiñe de rosa el citoplasma), proporciona un mejor contraste. Cada colorante impide el paso de luz de determinadas λ y permite el paso de otras. El otro modo de obtener contraste es el empleo de sistemas ópticos que consiguen variaciones en la amplitud de la onda en zonas específicas del tejido o célula, lo cual proporciona diferencias en brillos (claros u oscuros). Cuando un tren de ondas en fase atraviesa un tejido sin teñir sufre diferentes retrasos en función de la estructura que atraviese. Por ejemplo, si atraviesa el núcleo o una estructura densa, ese tren de ondas se retrasará con respecto al que haya atravesado una estructura menos densa, como el citoplasma (fig. 2-3). Pero el retraso en los trenes de ondas no proporciona un claro contraste en el ojo humano; es decir, el hecho de que las ondas se retrasen no logra un contraste suficiente. Algunos microscopios, como el de contraste de fases, poseen sistemas ópticos por los que se pueden transformar dichos retrasos en diferencias en amplitud, que darían lugar a claroscuros y, por lo tanto, a contraste. Esto se consigue mediante la recombinación de un haz de luz de referencia (que no atraviesa la preparación) con los haces que atraviesan las distintas partes de la muestra. Como los retrasos de estos haces son diferentes, puede que la recombinación con el haz de referencia tenga lugar fuera de fase (dando lugar a oscuridad) o en fase (lo que causaría brillo) (v. fig. 2-3). 59 FIGURA 2-3 Microscopía de contraste de fases. A. Las ondas que atraviesan una muestra (incluso sin teñir) sufren retrasos de fase con respecto a la onda que no atraviesa la muestra (referencia). B. Si se hace interferir la onda de referencia con las ondas retardadas, puede suceder que se anulen (por coincidir fuera de fase), dando lugar a oscuridad, o que se potencien (por coincidir en fase), produciéndose brillo. C. El microscopio de contraste de fases utiliza este sistema óptico para la observación de células en cultivo (entre otras aplicaciones). (C, procedente de: http://www.microscopyu.com/galleries/phasecontrast/index.html.) El uso de estos microscopios tiene ventajas importantes. Los colorantes habituales que se utilizan en microscopía son «no vitales» (es decir, causan la muerte celular), lo que impide hacer estudios de células vivas. El microscopio de contraste de fases (al igual que el microscopio de interferencia) permite hacer estudios in vivo. En los laboratorios de cultivos celulares se utilizan rutinariamente microscopios de contraste de fases especiales (para poder observar células directamente en placas de cultivos), lo cual permite analizar propiedades celulares como el movimiento, la formación de seudópodos, etc. (v. fig. 2-3). Microscopía de fluorescencia y confocal La microscopía de fluorescencia se basa en la propiedad que tienen las sustancias fluorescentes de absorber luz de una determinada λ y emitir luz con una λ mayor. Este microscopio (fig. 2-4) permite ver solo las estructuras que se han marcado selectivamente con fluorocromos (sustancias fluorescentes). En este caso, el contraste se obtendría por marcaje selectivo de una estructura marcada fluorescentemente, que se observaría al microscopio sobre un fondo oscuro (v. fig. 2-4). Algunas estructuras de los tejidos son autofluorescentes, como las fibras elásticas; pero la mayoría de ellas no lo son, de tal modo que, para su observación, se tienen que conjugar con fluorocromos. Se pueden utilizar colorantes fluorescentes para teñir algunos componentes específicos de la célula, como el naranja de acridina, que tiñe selectivamente el núcleo. Pero para el marcaje se suelen emplear anticuerpos conjugados con fluorocromos, que reconocen específicamente las proteínas presentes en el tejido que se quiere estudiar (como veremos más adelante). 60 FIGURA 2-4 A. Partes esenciales del microscopio de fluorescencia. La luz de excitación es filtrada (para que solo incida la luz que excita máximamente al fluorocromo que se ha empleado) y reflejada sobre la muestra por un espejo dicroico. La muestra emite luz con una λ mayor que la de excitación y puede atravesar el espejo dicroico, filtrándose de nuevo para evitar interferencias y llegándole al observador. B. Imagen de inmunofluorescencia de una célula en cultivo en la que se han empleado anticuerpos antitubulina marcados con una sustancia fluorescente. Existen gran cantidad de fluorocromos con distintas propiedades ópticas que se pueden utilizar en microscopía. El microscopio de fluorescencia tiene una serie de filtros que permiten seleccionar la λ que excita máximamente a un fluorocromo determinado antes de que pase por la muestra. Tras la excitación del fluorocromo, se emite luz fluorescente de una λ específica. Otro filtro situado entre la muestra y el ocular filtra las ondas lumínicas que se hayan podido generar que no correspondan específicamente a la λ de emisión, para evitar que la imagen se vea borrosa. Un fluorocromo muy utilizado es la fluoresceína, que se excita máximamente cuando se hace incidir luz de una λ de 494 nm (color azul) y emite luz de una λ de 521 nm (color verde). El microscopio confocal se puede considerar una variante mejorada del microscopio de fluorescencia. La fuente de iluminación utilizada es, en este caso, un rayo láser, que permite una excitación de los fluorocromos mucho más eficaz que el uso de la luz. Otra ventaja esencial es que el microscopio confocal permite una focalización muy precisa de los puntos que emiten fluorescencia y elimina selectivamente las señales de interferencia generadas por esta. En efecto, en el microscopio de fluorescencia, la imagen que se observa tiene una cierta contaminación lumínica procedente de la fluorescencia que está fuera de foco, lo que disminuye la calidad de la imagen. El microscopio confocal ilumina solo un punto concreto de la muestra, de un modo muy intenso. Para ello el haz láser se hace pasar por un pinhole, un pequeño agujero que permite focalizar el rayo en un punto concreto de la muestra. Tras la excitación de la muestra, la luz fluorescente emitida se filtra también a través de otro pinhole, de tal manera que solo se recoge la fluorescencia específica que proviene del punto que ha sido iluminado, evitándose la luz que está fuera de foco (por eso se llama confocal, es decir, en foco con el punto iluminado). Esto hace que la calidad de las imágenes sea mucho mayor que la de un microscopio de fluorescencia rutinario. Otra característica esencial del microscopio confocal es que posee un sistema de barrido, capaz de desplazar el rayo láser por la preparación en las tres dimensiones del espacio, iluminando así puntos específicos de la misma a distintos tiempos. Como el láser tiene más capacidad de penetración que la luz visible, los tejidos pueden ser más gruesos cuando se utiliza el microscopio confocal. Cada imagen captada por el microscopio corresponde a un plano de fluorescencia que se llama z-stack. El acoplamiento de los diferentes stacks en una computadora con sistemas de análisis de imagen permite hacer una reconstrucción para obtener una imagen tridimensional. Mediante 61 determinados programas informáticos se pueden, además, eliminar señales de interferencia originadas por el uso simultáneo de diferentes fluorocromos, a través de un proceso llamado «deconvolución» y se pueden realizar estudios cuantitativos de las estructuras analizadas. 62 Microscopía electrónica Funcionamiento y tipos El microscopio electrónico utiliza como fuente de «iluminación» un haz de electrones acelerados, lo que consigue mejorar el poder de resolución con respecto al microscopio óptico, permitiendo así la observación de orgánulos celulares. El microscopio electrónico de transmisión (MET) consiste en un tubo de rayos catódicos con una columna de aproximadamente 1 m de longitud. En la parte superior de la columna se encuentra el cátodo, consistente en un filamento tungsteno o wolframio, que emite un haz de electrones, mediante una diferencia de potencial, hacia un ánodo perforado situado más abajo (fig. 2-5). El haz atraviesa el ánodo y se dirige hacia la parte basal de la columna. En su recorrido, el haz es primeramente modificado por una bobina electromagnética que actúa a modo de condensador, focalizando los electrones hacia la muestra. Esta se sitúa en una rejilla de cobre o níquel del tamaño aproximado de una lenteja. El haz atraviesa la muestra y es modificado entonces por una bobina que actúa a modo de objetivo y otra que sirve como sistema de proyección (semejante al ocular en el microscopio óptico). Para poder visualizar la imagen originada por los electrones, es necesario convertir la radiación electrónica en una imagen visible por el ojo humano. Esta imagen se obtiene en una pantalla fluorescente situada en la base del microscopio, que recibe la radiación de los electrones (λ no visible) y emite radiación a una λ mayor (luz visible) (v. fig. 2-5). FIGURA 2-5 Partes del microscopio electrónico de transmisión y comparación de sus sistemas de generación y modificación del haz de electrones con la óptica del microscopio de luz. (Dibujos procedentes de: Montuenga et al. Técnicas en histología y biología celular. Barcelona: Elsevier; 2009.) Para la conducción de los electrones se necesita alto vacío, lo que requiere un sistema de bombas que extraigan el aire de la columna. Esto determina que en este tipo de microscopio no se puedan realizar estudios in vivo. Para que el haz de electrones atraviese la muestra, esta tiene que tener un espesor extraordinariamente fino: unos 10-100 nm. El contraste en microscopía electrónica de transmisión se obtiene por absorción diferencial de metales pesados en forma de sales, que se unen a las estructuras biológicas. Las sustancias más típicas para el contraste son el citrato de plomo y el acetato de uranio. Las estructuras tisulares y celulares presentan diferente afinidad por los metales de elevado peso molecular. Las estructuras que absorben estas sustancias impiden en parte el paso de los electrones, lo que se ve en la 63 pantalla como una zona oscura (también llamada electrodensa). En cambio, las zonas que absorben menos sales permiten el paso de los electrones, y se ven como zonas claras en la pantalla (electrolúcidas) (fig. 2-6). FIGURA 2-6 Imágenes de microscopía electrónica. Las zonas oscuras se denominan electrodensas y las claras, electrolúcidas. A. Imagen de un asa glomerular normal que muestra una célula epitelial (Ep) con delicados podocitos sobre una lámina densa (flechas). E, célula endotelial. B. Glomerulonefritis proliferativa aguda (postestreptocócica). La glomerulonefritis aguda se caracteriza anatómicamente por alteraciones inflamatorias en el glomérulo. En la imagen se observa una proliferación de células endoteliales intracapilares (E) y depósitos electrodensos subepiteliales (D) o «gibas» bajo los podocitos epiteliales. L, luz del vaso. (Imágenes procedentes de: Departamento de Anatomía Patológica de la Universidad de Navarra.) Existe otro tipo de microscopio electrónico llamado microscopio electrónico de barrido (MEB), que se utiliza para observar superficies de células y tejidos a gran aumento y con gran resolución (fig. 2-7). En este caso, las muestras (situadas en la base del microscopio) no van a ser atravesadas por el haz de electrones, sino que, tras un proceso de metalización, van a ser barridas por el haz de electrones, que recorre toda la muestra superficialmente en las tres direcciones del espacio para dar una imagen tridimensional. El MEB permite observar muestras de tamaño considerable, como trozos de tejido, organismos enteros (insectos), etc. El impacto del haz primario de electrones sobre la muestra hace que los electrones situados en los orbitales periféricos de los átomos de la muestra salgan despedidos (son los denominados electrones secundarios). La cantidad de electrones secundarios emitidos tras el choque dependerá del ángulo de incidencia del haz primario. Los electrones secundarios son recogidos por un sensor y proyectados en un monitor de televisión, donde se observa la imagen con un aspecto metalizado y tridimensional (v. fig. 2-7). 64 FIGURA 2-7 A. Esquema del funcionamiento del microscopio electrónico de barrido. B. Imagen de la superficie del intestino colonizada por bacterias, observadas con el microscopio electrónico de barrido. (A, dibujo procedente de: Montuenga et al. Técnicas en histología y biología celular. Barcelona: Elsevier; 2009. B, procedente de: http://www.birmingham.ac.uk.) Técnicas especiales en microscopía electrónica El contraste negativo es una técnica que permite observar macromoléculas al MET con una alta resolución. Esto se debe a que no se utilizan secciones, sino extensiones de material, tal y como este se encuentra, sin cortar. Se puede observar material biológico como bacterias, virus, orgánulos celulares, macromoléculas, etc. Las muestras se tratan con una solución de ácido fosfotúngstico, que queda rodeando estas macromoléculas, pero sin impregnarlas propiamente; de esta manera en la pantalla se observa un fondo oscuro (proporcionado por el ácido fosfotúngstico) rodeando al material que se quiere observar, que posee un aspecto blanquecino (es decir, es como una imagen en negativo) (fig. 2-8). 65 FIGURA 2-8 A. Dibujo que muestra una visión lateral de una extensión de partículas tratadas con ácido fosfotúngstico para su observación mediante contraste negativo. B. Imagen del bacteriófago P2 observada al microscopio electrónico de transmisión tras aplicar la técnica de contraste negativo. (A, dibujo procedente de: Montuenga et al. Técnicas en histología y biología celular. Barcelona: Elsevier, 2009.) El sombreado metálico es otra técnica que permite observar macromoléculas al MET. Para ello, se vaporizan con un determinado ángulo átomos metálicos sobre una superficie donde se pone la muestra (p. ej., bacterias, virus, macromoléculas, etc.), de tal manera que se crea una metalización desigual, porque hay un lado en el que aparece una sombra (el lado contrario al de emisión de los metales). Se crea así un efecto tridimensional. En la criofractura (fig. 2-9) las muestras se congelan rápidamente a la temperatura del nitrógeno líquido (−160 °C), se someten al vacío y se golpean con el borde de una cuchilla afilada. Las muestras congeladas a tan bajas temperaturas se fracturan a través de las zonas celulares que son más débiles, normalmente por el interior hidrófobo de las membranas. Posteriormente se emplea una técnica de sombreado metálico que recubre la superficie de fractura. A continuación se deposita una capa de carbono sobre la película metalizada (que sirve para grabar y estabilizar el metalizado). Por último, se digiere con detergentes el material biológico que está por debajo, permaneciendo solamente la capa fina de metal-carbón (réplica de la superficie de corte), que es lo que se observa al MET. 66 FIGURA 2-9 A. Procedimiento para realizar la técnica de la criofractura. 1, preparación de la muestra en un soporte; 2, congelación; 3, aplicación de un golpe con la cuchilla; 4, la fractura tiene lugar normalmente por las zonas débiles de las células, que corresponden a las zonas hidrófobas de las membranas; 5, metalización y aplicación de la capa de carbono; 6, digestión del tejido biológico y obtención de la réplica metalizada. B. Imagen de una célula observada al microscopio electrónico tras la realización de la criofractura. Se pueden observar la doble membrana nuclear y los poros nucleares. (B, imagen procedente de: Portada de la revista “Molecular Biology of the Cell”, 13 (1), 2002.) Existe una técnica muy relacionada con la anterior, llamada grabado por congelación o criograbado, que añade un paso más a la criofractura, aunque la técnica es inicialmente similar. Después de la fractura de la muestra, y antes del sombreado, tiene lugar una sublimación de una pequeña cantidad de agua de la superficie de la muestra, lo que consigue «ahondar» en la superficie de corte. La sublimación produce un efecto de grabado, que consiste en una acentuación de los detalles de la superficie; por lo tanto, no se observa la superficie de corte, sino orgánulos que quedaron por debajo de la línea de fractura. Posteriormente se realizaría la metalización como se ha explicado antes. Esta técnica ha sido muy útil para estudiar el citoesqueleto celular. 67 Procesamiento de muestras para microscopía óptica y electrónica La observación microscópica de una muestra biológica requiere la aplicación de un procesamiento previo de la misma, que debe asegurar que lo observado se corresponda lo más ajustadamente a la realidad, sin que se modifique su morfología. El procesamiento histológico consta de cuatro pasos fundamentales: a) fijación; b) inclusión; c) microtomía (corte), y d) tinción. En cada apartado del procesamiento existen ciertas diferencias entre la técnica aplicada para microscopía óptica y para electrónica. Fijación La fijación de los tejidos permite detener los procesos de degradación que ocurren tras la muerte celular, como la autolisis mediada por enzimas lisosómicas o bacterianas (putrefacción). Asimismo, provoca reacciones fisicoquímicas que preservan las estructuras y componentes químicos de las células (principalmente proteínas), y da consistencia mecánica a la pieza (endurecimiento), de modo que permite manipulaciones posteriores. Es un paso crítico dentro del procesamiento histológico. Los métodos de fijación se pueden clasificar en métodos físicos y químicos. El método físico más utilizado es la criofijación o congelación. El tejido se expone a temperaturas inferiores a −70 °C, disminuyendo así la actividad de lisis enzimática e inmovilizando las estructuras celulares. Este método de fijación tiene dos inconvenientes; por un lado, es un método reversible que deja de funcionar al aumentar la temperatura, y por otro, se pueden formar cristales de hielo que pueden dañar la estructura del tejido. Existen sustancias crioprotectoras (sacarosa, glicerol) que impiden la formación de cristales. Como ventaja, cabe destacar que es un método de fijación muy rápido, por lo que se suele utilizar cuando se necesita un diagnóstico urgente (como, p. ej., en el caso de las biopsias intraoperatorias). En la fijación química se emplean agentes químicos que reaccionan con las macromoléculas, estabilizándolas. Según su mecanismo de acción, podemos distinguir tres tipos de fijadores químicos: agentes entrecruzantes (dan lugar a un entrelazamiento de las proteínas), oxidantes y precipitantes. Los agentes entrecruzantes más utilizados son el formaldehído y el glutaraldehído. El formaldehído es el fijador más usado para microscopía de luz, mientras que el glutaraldehído se usa preferentemente para microscopía electrónica. El tetróxido de osmio (OsO ) es un fijador 4 oxidante muy utilizado en microscopía electrónica, ya que es capaz de fijar y dar contraste a los lípidos, y permite observar con definición las membranas celulares. Inclusión 68 El objetivo de la inclusión es eliminar el agua de los tejidos y reemplazarla por un medio que solidifica, lo que posibilita el corte posterior. La inclusión es un paso dirigido a proporcionar soporte estructural a la pieza, para obtener cortes suficientemente finos para que puedan ser atravesados por el haz de luz (o de electrones en el caso de la microscopía electrónica). El grosor de los cortes es muy diferente en ambas técnicas, por lo que el proceso previo de inclusión también es distinto. La inclusión puede tener lugar en parafina (para muestras procesadas para el microscopio óptico) o en resinas (para el microscopio electrónico). La parafina es una mezcla de ceras compuesta por hidrocarburos de cadena larga con punto de fusión de 50 °C. Para que la parafina pueda penetrar en el tejido hay que hacer un paso previo de deshidratación. Posteriormente, la pieza se sumerge en parafina líquida, que infiltra los espacios intra- y extracelulares del tejido. Las resinas son más duras que la parafina, por lo que permiten realizar cortes mucho más finos. Como en el caso de la parafina, es necesario realizar un proceso previo de deshidratación. Las resinas son sustancias líquidas cuando se encuentran en su forma monomérica, y polimerizan tras tratamientos de calor o tratamientos con luz ultravioleta, dando lugar a polímeros sólidos de gran dureza que permiten hacer cortes muy finos. Asimismo, esta técnica de inclusión permite realizar cortes semifinos (1 μm de espesor) que pueden ser observados al microscopio de luz. Microtomía Los cortes histológicos para microscopía óptica se realizan con un aparato denominado microtomo, y habitualmente tienen entre 3 y 5 μm de grosor. Para microscopía electrónica se hacen cortes finos (10-100 nm) con un aparato denominado ultramicrotomo. Los cortes de parafina se recogen en portaobjetos de vidrio; sin embargo, los cortes finos se colocan en redes de cobre o níquel para su observación al MET. En el caso de las muestras fijadas por congelación, los cortes suelen ser más gruesos (grosor mínimo de entre 6 y 8 μm) y se utiliza un aparato denominado criostato, que mantiene las muestras a una temperatura de −20 °C durante el corte. Estas muestras no requieren el paso de deshidratación. Hay muestras que no precisan de los procesos de inclusión y corte, sino que la visualización se realiza directamente. Es el caso de las de células sueltas (p. ej., frotis de sangre) o muestras de diversos fluidos biológicos (como esputo o lavado bronquioalveolar), para las que se pueden realizar extensiones directamente sobre el portaobjetos. Tinción 69 Como hemos indicado previamente, las estructuras biológicas presentan dificultades para ser observadas directamente al microscopio, ya que tienen un escaso contraste por su alto contenido en agua. Para mejorar el contraste se utilizan tinciones que permiten colorear artificialmente diferentes elementos tisulares. En el procesamiento para microscopía óptica se utiliza una variedad de colorantes que tiñen diversas estructuras según su composición química. Las tinciones son una combinación de colorantes que resaltan los aspectos que más nos interesan de la preparación. La tinción más utilizada en el diagnóstico anatomopatológico es la hematoxilinaeosina. En el caso de muestras de citología exfoliativa, el método más utilizado es el de Papanicolaou, que combina la hematoxilina con diversas mezclas de colorantes citoplasmáticos. Además de estos procedimientos rutinarios, existen numerosas tinciones que se aplican específicamente a tejidos concretos, como las técnicas de impregnación argéntica para el estudio del sistema nervioso. En el procesamiento para microscopía electrónica de transmisión, el contraste se efectúa mediante moléculas de alto peso molecular que intensifican la capacidad de dispersión de la muestra. Los más utilizados, como ya se ha comentado, son el acetato de uranio y el citrato de plomo. Técnicas inmunohistoquímicas Las técnicas inmunohistoquímicas permiten identificar la presencia de una proteína concreta en una sección de tejido, mediante el uso de anticuerpos. En situaciones patológicas, los tejidos pueden contener proteínas que no estaban en el tejido sano. Por ejemplo, en un tejido infectado por un virus se puede detectar la presencia de proteínas víricas que solo estarán presentes en el tejido infectado. Igualmente, en un tejido tumoral puede haber proteínas que se produzcan en cantidades anormalmente altas o bajas con respecto al tejido normal. Estas alteraciones pueden ser detectadas mediante inmunohistoquímica, que es actualmente una herramienta esencial en los laboratorios de anatomía patológica, por la capacidad que tiene de ayudar en el diagnóstico de enfermedades. Para poder localizar en un tejido humano una determinada proteína, antes hay que haber purificado un anticuerpo que sea capaz de reconocer esa proteína de modo específico. Para obtener dicho anticuerpo se necesita haber inyectado previamente la proteína en un animal (v. proceso completo en el contenido en la web de este capítulo). En la práctica, los anticuerpos para las proteínas utilizadas en diagnóstico están comercialmente disponibles, por lo que no es necesario producir el anticuerpo en animales para su uso rutinario. Las técnicas inmunohistoquímicas se pueden dividir en dos grandes grupos: 1. Técnicas directas: el anticuerpo que reconoce el antígeno de interés (anticuerpo primario) está conjugado con una sustancia que pueda ser detectada al microscopio (como una enzima, fluorocromo o partícula de oro) (fig. 2-10). Es el método más sencillo, ya que la reacción tiene lugar en único paso. 70 2. Técnicas indirectas: el anticuerpo primario no está conjugado, sino que se utiliza un anticuerpo secundario conjugado con la molécula detectable al microscopio, cuya región Fab reconoce la región Fc del anticuerpo primario (v. fig. 2-10). Por lo tanto, la señal vendrá del anticuerpo secundario. En general, los métodos indirectos son los más utilizados. La razón es que los anticuerpos secundarios pueden ser utilizados para reconocer las fracciones Fc de una especie determinada, por lo que pueden emplearse para detectar todos los anticuerpos primarios obtenidos en dicha especie, independientemente del antígeno que reconozcan. Por ello, es más conveniente desde el punto de vista técnico utilizar anticuerpos secundarios conjugados. 71 FIGURA 2-10 A. Esquema de la inmunohistoquímica directa (anticuerpo primario directamente unido por su fracción Fc a la peroxidasa). B. Esquema de la inmunohistoquímica indirecta (el anticuerpo secundario, que se une a la fracción Fc del anticuerpo primario, es el que se une a la peroxidasa). (Dibujos procedentes de: Montuenga et al. Técnicas en histología y biología celular. Barcelona: Elsevier; 2009.) La técnica más utilizada en los laboratorios de diagnóstico es la del marcaje indirecto con anticuerpos secundarios unidos a la enzima peroxidasa. El esquema general es el siguiente (fig. 2-11): • Desparafinación e hidratación los tejidos. • Incubación del tejido con el anticuerpo primario. 72 • Lavado de la preparación para eliminar las inmunoglobulinas no unidas específicamente al tejido. • Incubación con el anticuerpo secundario (obtenido frente a las inmunoglobulinas de la especie del anticuerpo primario) unido a peroxidasa. • Lavado para eliminar el anticuerpo secundario no unido. • Revelado: demostración histoquímica de la actividad enzimática de la peroxidasa ligada al anticuerpo secundario. • Observación. FIGURA 2-11 Esquema del procesamiento de tejidos en la inmunohistoquímica. En este ejemplo se muestran, por un lado, una hipotética sección histológica de hígado infectado con un virus y, por otro, una sección de hígado no infectado. El procedimiento de marcaje indirecto con anticuerpos secundarios unidos a peroxidasa resultaría en la observación de células de color marrón en el primer caso. La presencia de peroxidasa se revela mediante una reacción histoquímica consistente en añadir su sustrato (H O ) en 2 2 presencia de un donador de electrones (normalmente diaminobencidina, DAB). Como consecuencia de la actividad peroxidasa, el H O se reduce y la DAB se oxida, dando lugar a un precipitado de color marrón. Si el antígeno está 2 2 presente en el tejido, se observa el color marrón de las células donde se encuentra dicho antígeno. Posteriormente se utilizan colorantes de contraste, como la hematoxilina, para poder visualizar mejor la estructura del tejido. El uso de la inmunohistoquímica es de gran importancia en el diagnóstico; un claro ejemplo es el cáncer de mama: las pacientes con tumores positivos para el receptor de estrógenos tienen mejor pronóstico que las negativas y se pueden tratar con fármacos como el tamoxifeno. Las pacientes con tumores Her-2/ErbB2 positivos tienen peor pronóstico, pero pueden ser tratadas con un fármaco específico (transtuzumab), que inhibe la proliferación inducida por este receptor (fig. 2-12). 73 FIGURA 2-12 La inmunohistoquímica es una herramienta muy valiosa para el diagnóstico. En el diagnóstico de cáncer de mama es importante conocer si el tumor es positivo para el receptor de estrógenos (A) (como se ve en la imagen, con marcaje nuclear), en cuyo caso las pacientes pueden ser tratadas con fármacos como el tamoxifeno. También es importante conocer si el tumor es positivo para el receptor de membrana Her-2/ErbB2 (B), debido a que se podría aplicar una terapia con transtuzumab. Los anticuerpos también se pueden conjugar con sustancias fluorescentes en su región Fc. El marcaje de anticuerpos con moléculas fluorescentes no requiere la aplicación de revelados enzimáticos para poder observar el marcaje específico, pero precisa del uso de un microscopio de fluorescencia y, además, la señal fluorescente se va perdiendo progresivamente a lo largo del tiempo. Para microscopía electrónica se emplean anticuerpos marcados con partículas de oro o ferritina, que son electrodensas y permiten así su visualización. Estas técnicas se utilizan fundamentalmente para investigación y no para diagnóstico. FIGURA 2-13 Esquema de técnicas relacionadas con la biología celular. KO, knout out; PCR, reacción en cadena de la polimerasa. Lecturas recomendadas Beesley JE. Immunohistochemistry and in situ hybridization in the biological sciences. Boston: Birkhäuser; 2000. Burrell MA, Calvo A, Sesma MP. Atlas de ultraestructura celular. Pamplona: EUNSA; 2011. 74 Freshney RI. Culture of animal cells. A manual of basic technique. 4.ª ed. New York: Wiley-Lis; 2000. Gartler SM. The chromosome number in humans: a brief history. Nature Reviews. 2006;7:655–660. Green JE. Genetically engineered mice for cancer research. New York: Springer; 2012. Montuenga L, Esteban F, Calvo A. Técnicas en histología y biología celular. Barcelona: Elsevier; 2009. Moreno V, Solé X. Uso de chips (microarrays) en medicina: fundamentos técnicos y procedimientos básicos para el análisis estadístico de resultados. Barcelona: Elsevier; 2004. Sato-Otsubo A, Sanada M, Ogawa S. Single-nucleotide polymorphism array karyotyping in clinical practice: where, when, and how? Semin Oncol. 2012;1:13–25. Speicher MR, Carter NP. The new cytogenetics: blurring the boundaries with molecular biology. Nature Reviews Genetics. 2005;6:782– 792. Watson JD, Gilman M. Recombinant DNA. 2.ª ed. New York: Scientific American Books; 1998. Tecnología del ADN recombinante y aislamiento de ácidos nucleicos La tecnología del ADN recombinante incluye una serie de procedimientos que permiten generar, cortar y pegar fragmentos de ADN, lo que posibilita fabricar secuencias de ADN que tengan interés científico o terapéutico. Para poder manipular el ADN, primeramente hay que aislarlo de los tejidos o células. Existen diferentes métodos para aislar ADN (y ARN); los métodos clásicos se basan en su mayoría en una primera separación mediante una extracción en fases orgánicas seguida de una precipitación de los ácidos nucleicos presentes en la fase acuosa resultante, mediante soluciones alcohólicas. Una vez obtenido el ácido nucleico, es importante analizarlo para verificar su calidad. Un método rápido y ampliamente extendido para tal propósito es la electroforesis en geles de agarosa (fig. e2-1). Estos geles están constituidos por matrices porosas en las que se introduce la muestra de ácido nucleico, se aplica una diferencia de potencial (voltaje) a lo largo de la matriz y, en virtud de la carga negativa que poseen tanto el ARN como el ADN, estos migran a través de dicha matriz. En el caso del ADN, debido a su gran longitud, debe ser fragmendo previamente mediante enzimas de restricción (v. más adelante), para que pueda tener lugar la migración. Los fragmentos de ADN generados mediante PCR (v. «Reacción en cadena de la polimerasa») pueden ser sometidos directamente a electroforesis, ya que sus tamaños son compatibles con la migración a través del gel. Debido al tamaño de los poros del gel (que es del orden de magnitud del de las propias moléculas de ácido nucleico), se da un fenómeno de separación de los distintos ácidos nucleicos en función de su tamaño (fenómeno llamado «movilidad electroforética»). Determinar que el tamaño de los fragmentos de ADN/ARN analizados es el esperado es una prueba 75 importante para asegurar su calidad y comprobar que se ha obtenido el fragmento adecuado. La aparición de especies de tamaño menor del esperado puede indicar degradación de la muestra. La visualización de los ácidos nucleicos en los geles se logra con el colorante bromuro de etidio (que se une de forma estequiométrica a los ácidos nucleicos de doble cadena) y la aplicación de luz ultravioleta. También es importante la cuantificación de la cantidad de ácido nucleico obtenido. Para ello se utiliza la propiedad física de la absorbancia, ya que las bases nitrogenadas de los ácidos nucleicos absorben luz con una longitud de onda de 260 nm. Realizando la medición de absorbancia de una solución de ácido nucleico a 260 nm, se puede estimar con mucha precisión la concentración de este. FIGURA E2-1 Electroforesis en gel de agarosa para la observación del ADN. A. Esquema de la técnica. El ADN se carga en unos pocillos realizados en el gel y, tras someterlo a un campo eléctrico, se desplaza a través del gel. La longitud recorrida en el gel depende del tamaño de cada una de las especies de ADN. B. Imagen de un gel de agarosa observado en un transiluminador tras teñirlo con bromuro de etidio (foto superior) y tras obtener una foto del mismo (imagen inferior). Para cortar el ADN se utilizan las llamadas «endonucleasas de restricción» o, en general, enzimas de restricción. Estas enzimas de origen bacteriano son capaces de cortar el ADN cuando reconocen una secuencia concreta de nucleótidos. Las secuencias que la mayor parte de las enzimas reconocen tienen de 4 a 6 nucleótidos, y se caracterizan por un tipo especial de simetría interna: se llaman secuencias palindrómicas, es decir, secuencias que son iguales si se leen en una dirección, o en la dirección contraria (fig. e2-2). Existen gran cantidad de enzimas que cortan el ADN en secuencias específicas. Los cortes originados por algunas enzimas dejan extremos escalonados (o cohesivos) de ADN con un pequeño fragmento monocatenario que puede unirse a otra molécula semejante de ADN para restaurar la doble cadena. Otras enzimas de restricción cortan las dos hebras a la misma altura, generando lo que se llaman fragmentos de restricción de extremos romos. Para unir los fragmentos de ADN se utilizan enzimas denominadas ligasas. 76 FIGURA E2-2 A. El ADN puede ser cortado por diversas enzimas de restricción. En el ejemplo se muestra el corte de un plásmido y de ADN genómico por la enzima EcoR1. El corte produce extremos cohesivos (escalonados) en el ADN, lo que permite la unión por hibridación del ADN del plásmido linearizado con fragmentos del ADN genómico, con la ayuda de una ADN ligasa. B. Mediante este procedimiento se pueden clonar genes de interés en plásmidos que pueden ser introducidos en bacterias y multiplicados durante su crecimiento normal. El corte y empalme del ADN permite clonar genes para obtener múltiples copias del mismo. Existen dos formas principales de clonar un gen: la clonación celular y la clonación acelular. En la clonación celular se utilizan organismos (normalmente bacterias) para producir billones de copias de nuestro fragmento de ADN (cuya cantidad inicial suele ser muy escasa). El ADN se introduce en bacterias en forma de plásmido modificado (al que se denomina vector) y estas, mediante su crecimiento normal, multiplican las copias del plásmido (v. fig. e2-2). La clonación acelular sucede en un tubo de ensayo. El método principal de este tipo de clonación es la PCR (v. «Reacción en cadena de la polimerasa»). Mediante esta reacción se puede multiplicar millones o incluso billones de veces la cantidad de una determinada secuencia de ADN. La clonación permite crear vectores con genes de uso terapéutico que pueden ser utilizados en terapia génica o para producir proteínas recombinantes. Un ejemplo de la aplicación de la tecnología del ADN recombinante y la clonación es la producción de insulina. El gen de la insulina humano se corta y pega en un vector adecuado que permitirá la producción de grandes cantidades de la proteína en bacterias o células de mamífero, con vistas a su uso terapéutico en pacientes con diabetes de tipo I. 77 Reacción en cadena de la polimerasa En el año 1985, el investigador norteamericano Kary Mullis desarrolló el método de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR, del inglés polymerase chain reaction) por el que recibió el premio Nobel de Química en 1993. La técnica se basa en multiplicar de forma exponencial un segmento determinado de ADN, a partir de una muestra muy pequeña (menos de 1 μg de ADN). Previamente, es necesario conocer la secuencia de los nucleótidos correspondientes a los extremos del fragmento que se desea amplificar para diseñar dos oligonucleótidos sintéticos de ADN complementarios a las secuencias de sus extremos 3’. Estos oligonucleótidos cebadores (primers) tienen una extensión promedio de 20 nucleótidos. El desarrollo de esta técnica ha supuesto un enorme avance en biomedicina, ya que la PCR tiene innumerables aplicaciones diagnósticas y terapéuticas. Amplificación del ADN La reacción tiene tres etapas: desnaturalización, hibridación y extensión. La desnaturalización consiste en la separación de las dos hebras del ADN por ruptura de los puentes de hidrógeno intercatenarios, generando moléculas de ADN en forma de cadena simple. Esto se logra por un aumento de la temperatura (90-94 °C) durante unos 5 min para asegurar la desnaturalización total de todas las moléculas de ADN; en caso contrario, el ADN tenderá a renaturalizarse, dificultando la etapa siguiente. En el paso de hibridación se disminuye la temperatura de la reacción hasta 40-60 °C para permitir la unión por complementariedad entre los cebadores (primers en inglés) y las secuencias que flanquean el fragmento que se desea amplificar. La temperatura de hibridación debe ser unos 5-8 ºC menor que la temperatura de fusión (Tm) de los cebadores. La Tm depende de la longitud de los cebadores y el porcentaje de CG de su secuencia. Si la temperatura de hibridación es inferior a la óptima, los cebadores se unirán inespecíficamente, y si la temperatura es superior, disminuirá la eficiencia de la reacción. La Tm puede aproximarse para cebadores de 18 a 24 bases con la fórmula de Wallace, que contempla la proporción de bases del oligonucleótido: Finalmente, la extensión ocurre a 72 °C y consiste en la adición de los desoxirribonucleótidos a partir de los extremos 3’ de los cebadores, utilizando el ADN como molde y por acción de la polimerasa Taq. Esta enzima, llamada así porque se aisló de la bacteria termófila Thermus aquaticus, es resistente a la desnaturalización por calor, lo que le permite ejercer su actividad aun a altas temperaturas. Normalmente una extensión de 20 s es suficiente para fragmentos menores de 500 pares de bases, y 40 s para fragmentos por encima de 1,2 Kb. Tras este primer ciclo se obtienen dos moléculas bicatenarias del fragmento de interés (fig. e2-3). En cada repetición del ciclo se produce un aumento exponencial del número de copias de la secuencia específica (2 , siendo n el número de ciclos), ya que las n 78 moléculas amplificadas en el ciclo anterior sirven de molde para el próximo ciclo. Por lo tanto, tras 20 ciclos se obtienen un millón de copias de la molécula molde (fig. e2-3). FIGURA E2-3 Esquema de la reacción de PCR. Cada ciclo incluye una desnaturalización de la doble cadena del ADN, hibridación de los cebadores sintéticos (P1 y P2) y extensión de las cadenas. Al finalizar un ciclo, comienza otro tomando a las cadenas recién sintetizadas como molde, por lo que la amplificación es exponencial. La mezcla de reacción contiene el ADN que se quiere amplificar, dos oligonucleótidos sintéticos (cebadores o primers: P1 y P2) que servirán como cebadores, una ADN polimerasa termoestable (Taq), los cuatro desoxirribonucleótidos trifosfato (dATP, dGTP, dCTP y dTTP), una solución tamponada y el cofactor de la Taq polimerasa (magnesio). La reacción se lleva a cabo de forma rápida y automatizada con un termociclador, que básicamente consiste en un bloque térmico que aumenta y disminuye la temperatura de acuerdo a las condiciones programadas por el operador. El producto de la amplificación se analiza por electroforesis en gel de agarosa, colocando además un marcador de peso molecular y, por comparación, se comprueba si el producto amplificado tiene el tamaño esperado. Finalmente, se puede secuenciar el producto de amplificación (v. más adelante), con el fin de verificar su correspondencia con la secuencia de ADN estudiada. Variantes del procedimiento La PCR anidada consiste en la amplificación de una secuencia dentro de otra secuencia previamente amplificada, lo que permite aumentar la especificidad del producto obtenido. En la PCR multiplex se amplifican varios fragmentos simultáneamente. Se aplica para la detección de posibles mutaciones o polimorfismos en un gen grande, y es muy útil cuando se requiere la identificación de varios patógenos en la sangre u otros fluidos corporales. La PCR-RFLP (polimorfismos de longitud de fragmentos de restricción) (v. más adelante) amplifica regiones con posibles polimorfismos genéticos que, al ser tratados con enzimas de restricción específicas, producen fragmentos de ADN de diferentes longitudes según la presencia o ausencia de determinados polimorfismos. La RT-PCR es una variante de la PCR que utiliza la enzima transcriptasa inversa (o retrotranscriptasa) para obtener ADN complementario (ADNc) a partir del ARN. El ADNc es luego utilizado como molde en la PCR. De esta forma se puede evaluar la cantidad de ARN mensajero (ARNm), es decir, la expresión de un gen concreto en un tejido o incluso en una única célula, lo que equivaldría (aunque no siempre es así) a conocer la cantidad de esa proteína. Esto puede ser de gran utilidad cuando se quieren analizar variaciones en la expresión génica debidas a situaciones patológicas. Actualmente se utiliza la PCR a tiempo real o cuantitativa (qPCR, del inglés quantitative PCR). A diferencia de la PCR convencional, donde se detecta el producto acumulado al cabo de cierto número de ciclos, en la qPCR el producto se mide a medida que se va formando. Para ello se utilizan sondas o reactivos fluorescentes que, a medida 79 que el producto se amplifica, emiten un nivel de fluorescencia que es proporcional a la cantidad de ADN (o ADNc) presente en la muestra. Aplicaciones biomédicas Son numerosas las aplicaciones biomédicas derivadas de la PCR. A partir del ADN genómico humano, generalmente obtenido de linfocitos, se puede detectar la presencia de mutaciones y polimorfismos asociados con enfermedades hereditarias (talasemias, hemofilias, deficiencia de antitripsina, distrofias musculares y muchas otras), o con la predisposición a distintas enfermedades (como los polimorfismos de ciertos genes asociados a la aparición de algunos tumores malignos). También permite diagnosticar la presencia de gérmenes patógenos, bacterianos o víricos con una alta sensibilidad, gracias al elevado poder de amplificación de esta técnica. El ADN o ARN del microorganismo puede ser detectado antes de la producción de anticuerpos específicos («período ventana» o estado seronegativo de las enfermedades infecciosas), e incluso antes de la aparición de síntomas. Por ejemplo, es habitual utilizar la PCR para la detección e identificación del virus de la inmunodeficiencia humana (VIH) (fig. e2-4). Además de su utilidad en el seguimiento de las terapias retrovíricas, esta técnica permite la detección precoz del virus en bancos de sangre o en neonatos de madres seropositivas. La técnica consiste en detectar secuencias específicas de los genes víricos gag, env o pol, ya sea de ARN vírico o del ADN provírico inserto en las células del hospedador. El ARN vírico se detecta en muestras de plasma sanguíneo mediante RT-PCR; es decir, primero se hace la retrotranscripción de ARN vírico a ADNc y luego se amplifican las secuencias de interés. Existen diversos productos comerciales para detectar las secuencias de interés diagnóstico, que generalmente utilizan qPCR por proporcionar resultados cuantitativos. 80 FIGURA E2-4 Ejemplo de amplificación por RT-PCR del gen env del VIH-1 a partir de plasma de pacientes portadores del virus (calles 2, 3 y 4) y no portadores del virus (calles 5 y 6). La calle 1 es el marcador de peso molecular y las calles 7 y 8 son controles positivos (muestras que dan a conocer el resultado positivo de la RT-PCR). (Imagen procedente de: Dra. A. M. Suburo. Facultad de Ciencias Biomédicas, Universidad Austral.) Fingerprint de ADN La huella genética o fingerprint de ADN permite la identificación de diferentes individuos dentro de una misma especie o población. Aunque en una misma especie los genomas poseen una secuencia común, también poseen regiones variables que son propias de cada sujeto. Estos polimorfismos pueden ser utilizados para la identificación de personas, ya que es poco probable que dos seres humanos no relacionados tengan los mismos polimorfismos. El conjunto de polimorfismos específicos de cada persona se conoce como perfil genético y es único e invariable a lo largo de la vida. Actualmente se conoce la ubicación física (locus), en cada cromosoma, de las distintas secuencias codificantes o no codificantes que componen el genoma. Cada locus cromosómico puede tener una o más variantes de esa secuencia, conocidas como alelos. En la población pueden existir múltiples alelos, pero cada célula diploide solo tiene dos alelos de cada gen: uno de origen materno y otro de origen paterno. El polimorfismo se define como la existencia simultánea, en una población, de genomas con distintos alelos para un locus determinado. Los polimorfismos pueden encontrarse tanto en regiones codificantes como no codificantes del genoma. Cuando el polimorfismo afecta a un único nucleótido se denomina polimorfismo de nucleótido único (SNP, del inglés single-nucleotide polymorphism). Por ejemplo, en el gen del receptor tipo 1 de TGF-β (TGFBR1) se describen diversas variantes polimórficas. Una de ellas es la Int7G24A, denominación que indica que la G24 del intrón 7 puede estar reemplazada por una A (fig. e2-5). Para determinar la presencia de una u otra variante, la zona del ADN genómico correspondiente al TGFBR1 es amplificada por qPCR. FIGURA E2-5 Secuenciación para determinar el polimorfismo Int7G24A del TGFBR1 en pacientes con cáncer colorrectal. Los esquemas muestran las secuencias de tres pacientes, un homocigoto para la variante G (G/G), un heterocigoto (G/A) y un homocigoto para la variante A (A/A). (Imagen procedente de: Castillejo et al. BMC Cancer 2009;9:406.) Existen diversos tipos de polimorfismos, como las secuencias repetidas VNTR-minisatélites (del inglés variable number of tandem repeats) y las STR (del inglés short tandem repeats) que difieren en el número de repeticiones. El análisis de los polimorfismos de longitud de los fragmentos de restricción (RFLP, del inglés restriction fragment length polymorphism) fue la primera técnica utilizada para evaluar estas variantes en 1985 por Sir Alec Jeffreys. Como se mencionó en el apartado de la PCR, el fragmento que se va a estudiar se amplifica previamente y luego es digerido 81 por enzimas de restricción, que producen fragmentos diferentes según la secuencia amplificada. Actualmente existen diversas técnicas más eficientes y rápidas, como las amplificaciones de secuencia por PCR multiplex y la separación de los fragmentos por electroforesis capilar o ensayos comerciales de amplificación por qPCR. En el caso de los SNP, puede utilizarse la secuenciación (v. más adelante) para verificar las bases modificadas. Los polimorfismos son de gran utilidad en medicina forense, ya que el análisis de restos humanos (especialmente en casos de incendios, accidentes o desastres), mediante fingerprint de ADN permite la identificación de sospechosos de delitos y puede utilizarse también en pruebas de paternidad o parentesco. Otros polimorfismos se asocian con determinadas patologías, ya que indican susceptibilidad a presentar determinadas enfermedades como cáncer, enfermedades cardiovasculares, diabetes o patologías del sistema nervioso. También se conocen polimorfismos asociados a la distinta respuesta a fármacos. Este es un campo novedoso, aunque sujeto a controversias, de desarrollo cada vez más acelerado, ya que se intenta llegar a una medicina personalizada, donde los métodos de diagnóstico y el tratamiento se adecúen al genoma de cada individuo. El ADN mitocondrial (ADNmt) también puede ser utilizado para el análisis de individuos. Las mitocondrias contienen ADN circular que codifica para 37 genes y que es de herencia materna. El uso del ADNmt es ventajoso, ya que en cada célula existen hasta 1.000 copias, superando enormemente a las dos copias del ADN genómico. Esto permite la obtención de ADN aun en casos de muestras muy escasas, con ADN degradado o que sufrieron el paso del tiempo (p. ej., restos esqueléticos). Además puede resultar útil para determinar la filiación por vía materna. Las STR del cromosoma Y son muy convenientes para estudiar el patrón genético de un individuo masculino. Por ejemplo, en los casos de agresión sexual, permiten identificar pequeñas cantidades de ADN masculino en presencia de grandes cantidades de ADN femenino. También se pueden usar para determinar el parentesco de varones a través de la vía paterna. 82 Secuenciación de ADN Junto con la PCR, la secuenciación del ADN es, sin duda, otro gran pilar en el campo de la biología molecular y del diagnóstico médico. Secuenciar el ADN significa determinar la secuencia de nucleótidos (A, T, G, C) que conforma una hebra de ADN (y, por lo tanto, su complementaria) en el orden correcto. Algunos ejemplos de los usos que tiene la secuenciación del ADN son el diagnóstico genético, las pruebas forenses, el desarrollo de medicamentos basados en la tecnología del ADN recombinante, el desarrollo de terapias génicas, etc. Durante las décadas de los sesenta y setenta del siglo xx se desarrollaron diversos métodos para la secuenciación del ADN. Sanger y sus colaboradores crearon un método que se estableció como referencia y en el cual se han basado otros sistemas de secuenciación posteriores. Los secuenciadores de alto rendimiento de final del siglo xx (que permitieron, entre otros hitos, secuenciar el genoma humano) se basan en la tecnología desarrollada por Sanger. El método de secuenciación de Sanger se fundamenta en el concepto de «interrupción de la cadena». Se trata de una reacción de PCR especial. A esta PCR se añaden desoxirribonucleótidos dA, dC, dT y dG como en las PCR rutinarias, pero además se añade una versión modificada de cualquiera de los cuatro nucleótidos ddA, ddC, ddT o ddG (aquí dd significa «didesoxi-»). Se realizan cuatro reacciones de secuenciación. En ellas, la PCR sigue su curso normal, pero cuando la polimerasa añade un nucleótido dd a la cadena sintetizada, la reacción se para. Los nucleótidos dd son suficientemente parecidos químicamente a los d, que son los verdaderos componentes del ADN, como para ser reconocidos por la polimerasa y añadidos a la hebra de ADN, pero la carencia de un grupo hidroxilo 3′ imposibilita la unión covalente del siguiente nucleótido en la secuencia, parándose entonces la reacción. Puesto que en la reacción coexisten los nucleótidos d y los dd, la inclusión de unos u otros en la cadena se produce al azar. Por lo tanto, en la reacción se generan productos de PCR de todos los tamaños posibles. Mediante electroforesis de ADN, se pueden analizar estos fragmentos y determinar la secuencia. Una modificación que sufrió esta técnica fue la adición de marcadores fluorescentes de distintos colores a los didesoxirribonucleótidos; de este modo, en vez de cuatro reacciones, se pasó a un único tubo y se posibilitó en análisis automático informatizado de los resultados de la electroforesis (fig. e2-6). 83 FIGURA E2-6 Esquema del proceso de secuenciación del ADN. La reacción de PCR incluye los desoxirribonucleótidos empleados para construir la cadena normal de ADN, junto con didesoxirribonucleótidos (ddATP, ddGTP, ddCTP y ddTTP) marcados con sustancias fluorescentes. La introducción al azar de cualquiera de estos didesoxirribonucleótidos en la hebra de ADN en formación interrumpe la adición de un nuevo nucleótido. Esto hace que se formen especies de ADN con todos los tamaños posibles: desde las que contienen todos los nucleótidos hasta las que solo han incorporado uno; esto permite conocer la secuencia del ADN. Existen otras técnicas de secuenciación que han sido desarrolladas recientemente y que, basándose en distintos principios, alcanzan una mayor eficacia en la secuenciación a precios más asequibles (lo cual es importante debido a la gran longitud de los genomas). A estas tecnologías se les denomina secuenciación de nueva generación. Algunos ejemplos son la pirosecuenciación, SOLiD o Solexa. En un futuro próximo, estos tipos de secuenciación irán sustituyendo la metodología basada en la reacción de Sanger, que sigue siendo actualmente el método más utilizado. Hibridación in situ de ácidos nucleicos La técnica de hibridación in situ (ISH) permite localizar una secuencia específica de ácidos nucleicos en cortes de tejidos. Actualmente, se ha convertido en una herramienta muy útil en cualquier laboratorio de investigación dedicado a la biología molecular y celular. La hibridación in situ se aplica para estudiar la expresión génica diferencial o las alteraciones genómicas en distintas patologías. Esta técnica se basa en la complementariedad de bases de los ácidos nucleicos, de modo que un polinucleótido marcado denominado sonda hibridará con una secuencia complementaria (diana) localizada en una sección histológica, en células aisladas o en cromosomas (fig. e2-7). FIGURA E2-7 Hibridación in situ de ácidos nucleicos. A. Esquema simplificado de la técnica. La hibridación in situ implica la fabricación de una sonda marcada cuya secuencia es complementaria a la que se quiere detectar en el ADN problema. La molécula marcadora permitirá detectar la unión de la sonda solo en las células en las cuales está presente la secuencia problema. B. Imagen de hibridación in situ que muestra un ganglio linfático con células infectadas por el virus Epstein Barr (en color azul oscuro). En este caso, la sonda hibrida específicamente con una secuencia del genoma viral. (Imagen procedente de: Dra. Jackeline Agorreta, Departamento de Histología y Anatomía Patológica, Universidad de Navarra.) En función de las moléculas implicadas, podemos encontrar tres tipos de uniones: ADN-ADN, ADN-ARN y ARNARN. La técnica de ISH permite detectar cambios estructurales en el genoma (ADN-ISH), o cambios en los niveles de expresión del ARN (ARN-ISH). El marcaje de la sonda puede ser radiactivo (algunos átomos de los nucleótidos se sustituyen por isótopos radiactivos como P, P, H, S, I) y no radiactivo (unión a los nucleótidos de moléculas no 32 33 3 35 125 radiactivas como la biotina, digoxigenina o fluorocromos). Las moléculas marcadoras se pueden detectar 84 posteriormente por una reacción antígeno-anticuerpo. Cuando la molécula marcadora es un fluorocromo, la técnica se denomina hibridación in situ fluorescente (FISH) y la reacción se puede visualizar directamente en un microscopio de fluorescencia. En la detección de ARN se pueden usar sondas de ARN o ADN, aunque el empleo de sondas de ARN (ribosondas) es más frecuente, ya que la unión ARN-ARN es más estable que la unión ARN-ADN, y las sondas de ARN hibridan mejor in situ que las de ADN. A pesar de las numerosas ventajas de las ribosondas, su obtención es laboriosa y requiere el empleo de diferentes técnicas de biología molecular. Además, el manejo y la conservación del ARN son delicados debido al carácter ubicuo de las ARNasas, enzimas de difícil inactivación. Las ribosondas se obtienen mediante transcripción in vitro a partir de una secuencia de ADN clonada en un vector que posea los promotores para su transcripción. El marcaje de los transcritos se realiza mediante la incorporación de nucleótidos marcados en la reacción de transcripción. Para localizar secuencias de ADN se utilizan sondas de ADN. En el protocolo es necesario incluir un paso de desnaturalización del ADN para que pueda tener lugar la hibridación de la sonda diana. También existen sondas LNA y PNA, constituidas por análogos de ácidos nucleicos, que hibridan con mayor especificidad y estabilidad. Las aplicaciones de la ISH en el diagnóstico clínico se centran principalmente en dos aspectos: • Detección de la expresión de ARNm en patologías. Se emplea por ejemplo en tumores neuroendocrinos para confirmar que las células del tumor son las responsables de un aumento del nivel de alguna hormona en sangre, pero el tumor es negativo por inmunohistoquímica. Asimismo, la técnica de ISH se emplea en el diagnóstico de tumores hepáticos y linfomas de células B. • En virología, esta técnica se utiliza tanto para identificar una infección vírica como para determinar su extensión. Se usa para el análisis de diversas infecciones como las del virus del papiloma humano, virus de la hepatitis B y C y virus Epstein Barr (v. fig. e2-7). La combinación de la técnica de ISH con la inmunohistoquímica permite localizar los lugares de infección activa y detectar infecciones víricas ocultas en pacientes inmunodeprimidos. 85 Terapia génica Como hemos indicado con anterioridad, la tecnología del ADN recombinante permite la manipulación y transferencia de genes entre distintos organismos. Tras su desarrollo, no tardó mucho en plantearse el empleo de dicha tecnología en el campo de la medicina. La terapia génica consiste en tratar enfermedades mediante la introducción en el organismo de genes terapéuticos, es decir, genes «sanos» que reemplacen los genes que están alterados o ausentes en una determinada enfermedad. Por lo tanto, en vez del uso clásico de fármacos, consistiría en corregir el defecto genético que da lugar a esa enfermedad, mediante la aplicación exógena de genes (fig. e2-8). FIGURA E2-8 Esquema de la terapia génica ex vivo. El gen terapéutico se inserta en un virus modificado para que no se produzcan efectos adversos. Las células patológicas extraídas del paciente (médula ósea, sangre, etc.) se infectan con el virus y el gen terapéutico corrige su defecto. Posteriormente las células se reintroducen en el paciente. Actualmente se investiga sobre la posibilidad de aplicar la terapia génica en un gran número de enfermedades, pero, por desgracia, solo un pequeño porcentaje de ellas están siendo tratadas con éxito en humanos. No obstante, el campo de la terapia génica sigue mirando con optimismo al futuro, y va incorporando nuevos avances técnicos de la biología molecular para solventar las dificultades de bioseguridad que en su momento impidieron la aplicación eficaz de estrategias terapéuticas concretas. Dependiendo del defecto genético causante de la patología, la estrategia de la terapia génica será distinta. En el caso de que una enfermedad sea causada por la falta de un gen concreto, la introducción del gen permite que se produzca la proteína. En cambio, en otros casos la causa molecular es la mutación de un gen que genera una proteína anómala que causa la enfermedad. En este caso, la terapia génica intenta corregir dicha mutación o eliminar las variantes mutantes. Las alternativas terapéuticas de la terapia génica son fundamentalmente las siguientes: • Terapia de aumento génico (GAT, del inglés gene augmentation therapy): consiste en introducir el gen terapéutico del cual carece el tejido enfermo. 86 • Corrección de mutaciones. • Eliminación selectiva de las células patológicas, mediante la transferencia de genes «tóxicos». • Activación del sistema inmunitario contra el tejido enfermo mediante estrategias de terapia génica, como vacunación con ADN recombinante o transferencia de ADN codificante para citoquinas inmunoestimuladoras. • Inhibición génica: mediante estrategias con ácidos nucleicos «antisentido» o de ARN de interferencia. La terapia génica puede realizarse tanto directamente sobre el individuo enfermo (in vivo) como sobre tejidos previamente aislados de este para su posterior reimplantación (ex vivo). Un ejemplo de método ex vivo es la extracción de sangre o médula ósea de un paciente, su cultivo en el laboratorio (durante el cual se introduce el gen o ADN recombinante de interés) y la posterior reinfusión en el paciente (v. fig. e2-8). La terapia génica puede clasificarse en somática o germinal. En la terapia somática se tratan células del organismo adulto, pero el defecto genético no es corregido en las células germinales, por lo que no sería transmitido a la descendencia. La terapia génica germinal acarrea serios problemas éticos al modificar la información genética de la línea germinal de un individuo. Por ejemplo, podría aplicarse con vistas a la mejora genética, por lo que su uso no está permitido. De modo teórico, muchas enfermedades podrían ser corregidas mediante terapia génica. La principal dificultad que encuentra su aplicación es el desarrollo de métodos eficaces y selectivos para la introducción del gen en las células adecuadas en cada caso. Muchas veces no se consigue introducir el factor terapéutico en el suficiente número de células enfermas. En otras ocasiones, la introducción del factor terapéutico en células sanas puede resultar peligrosa (un gen puede curar a un tipo celular pero afectar gravemente a otro). Por todo esto, los mayores esfuerzos en el campo de la terapia génica se centran en el desarrollo de vehículos (vectores) que transfieran el factor terapéutico a las células deseadas de un modo selectivo. Los principales vectores empleados en terapia génica son virus que causan enfermedades en mamíferos. Estos virus son modificados de modo que dejen de ser peligrosos y patógenos, pero mantengan su capacidad de penetrar en células de mamífero. En el genoma de estos virus se incluye la secuencia terapéutica que se quiere introducir en la célula enferma, eliminando las secuencias que permiten la replicación vírica (v. fig. e2-8). Se pueden utilizar diferentes tipos de virus, cada uno de ellos con ventajas e inconvenientes. La elección de uno u otro depende de la patología, de la estrategia terapéutica que se quiera utilizar y del tejido diana. Los adenovirus y virus adenoasociados son virus frecuentemente utilizados en terapia génica. Otro tipo de virus (cuyo genoma se integra en el genoma del hospedador) es el retrovirus, pero la aparición de tumores en varios pacientes durante los ensayos clínicos los ha descartado por el momento para la terapia génica. Además de los virus, existen otras alternativas para introducir ADN recombinante en células. En general, los principales métodos que se están probando en terapia génica son: • Virus: adenovirus, virus adenoasociados, retrovirus, virus del herpes simple y lentivirus. 87 • Microbalas: consiste en recubrir diminutas partículas de metal con el ADN recombinante. Mediante una pistola especial (pistola génica), se lanzan las partículas contra el tejido diana. • Reactivos químicos: existen reactivos químicos capaces de transportar el ADN e introducirlo a través de la membrana celular. • Anticuerpos: mediante un anticuerpo se puede vehiculizar un complejo que contenga el factor génico terapéutico para que entre en la célula diana. Existen muchas circunstancias que hacen que una patología pueda ser más o menos tratable mediante terapia génica. Las más importantes son las siguientes: • Complejidad genética de la enfermedad: las enfermedades genéticas monogénicas son, en principio, mejores candidatas para la terapia génica que las complejas, en las que están involucrados varios defectos genéticos. • Dominancia y penetrancia del defecto genético: los defectos genéticos recesivos y/o poco penetrantes auguran mayor probabilidad de éxito que los dominantes. • Tipo de defecto: la falta de un gen es más fácilmente tratable que el exceso o la mutación. La carencia de un gen se puede tratar mediante terapia de aumento génico, y en muchas ocasiones no requiere la transferencia del factor a todas las células enfermas. En cambio, cuando el defecto incluye la presencia de un gen alterado, es complicado eliminarlo o corregirlo totalmente, algo que, por lo general, incluiría un acceso de la terapia a todas las células portadoras del defecto. El primer caso célebre de terapia génica fue la introducción en 1990 del gen ADA (adenosina desaminasa) ex vivo en la sangre de dos niñas con inmunodeficiencia combinada severa (causada por la falta de dicho gen). Tras ser reinfundida la sangre en la que se corrigió el defecto genético, las niñas comenzaron a desarrollar las funciones inmunológicas de las que carecían. Hoy en día se investiga profusamente en modelos animales la aplicación de terapias génicas aplicadas a un gran número de patologías humanas. Existen actualmente ensayos clínicos para enfermedades genéticas hereditarias (inmunodeficiencia combinada severa, fibrosis quística o hipercolesterolemia familiar), cáncer, desórdenes inmunológicos, Parkinson o SIDA. Microarrays y microchips para estudios genómicos de expresión a gran escala Fundamento de la técnica Muchos procesos biológicos ocurren por cambios en la expresión de diversos genes, lo que desencadena una modificación en la fisiología celular. Para investigar estos cambios, tradicionalmente se han utilizado técnicas como el 88 northern blot, RT-PCR (ambas destinadas a conocer la cantidad de ARNm para un gen concreto presente en un tejido o célula) o Western blot (para el caso de proteínas; v. más adelante). Pero estas tecnologías permiten el análisis de pocos ARNm/proteínas en cada ensayo. La técnica de microarrays proporciona métodos rápidos y proporcionalmente asequibles desde el punto de vista económico para el estudio de la expresión de miles de genes en un solo ensayo, lo que permite una visión global de la actividad celular. Los microarrays consisten generalmente en fragmentos de ADN inmovilizados en puntos definidos de una manera ordenada y precisa, en un soporte físico (fig. e2-9). Los soportes están fabricados de vidrio, silicona o plástico, donde se depositan las sondas, que consisten en fragmentos de ADN con una secuencia de nucleótidos que hibridará con un gen concreto. El ADN sonda de los microarrays puede tratarse de: • Oligonucleótidos (de una longitud de 20-65 pares de bases): se emplean frecuentemente en experimentos de genotipado con el fin de detectar mutaciones o polimorfismos, así como en experimentos para evaluar la expresión génica. • ADNc completo o parcial (500-5.000 pares de bases): se emplean para el análisis de la expresión génica. • ADN genómico (50.000 pares de bases): su uso está destinado principalmente al estudio de pérdidas o ganancias génicas (arrays de CGH, véase más adelante). FIGURA E2-9 A. Esquema de la preparación de muestras para un microarray de expresión. El ARNm de muestras sanas y patológicas se convierte mediante retrotranscripción en ADNc marcado con un fluorocromo que emite luz verde (para la muestra sana) o rojo (para la patológica). A continuación, estos ADNc se hibridan competitivamente con sondas específicas para cada gen situadas en cada uno de los puntos del microarray. Dependiendo de la cantidad de ADNc «verde/rojo» para cada gen en la muestra sana/patológica se obtendrá un color distinto, que se relaciona con la cantidad de expresión (cantidad de ARNm) que tenía cada muestra. B. Imagen de un microarray de expresión hibridado. En los microarrays de expresión, las muestras de ARNm se preparan a partir de células en cultivo o tejidos de interés. Se procede a la obtención del ADNc a partir del ARNm mediante retrotranscripción, utilizando nucleótidos marcados con sustancias fluorescentes, para conseguir ADNc marcado. El ADNc se deposita sobre el microarray para su hibridación con las sondas. Una vez se ha producido la hibridación, se procede a eliminar el ADNc no hibridado y a la cuantificación de cada una de las sondas hibridadas del microarray mediante programas informáticos. Habitualmente, el ADNc de la muestra patológica, marcada con una sustancia fluorescente (p. ej., con un fluorocromo de color rojo) se mezcla en la hibridación con el ADNc de la muestra normal (marcada, p. ej., con un fluorocromo de 89 color verde). Por lo tanto, si la cantidad de ARNm expresada por un gen se encuentra incrementada en la muestra patológica con respecto a la muestra normal, el color resultante en el punto donde se localizaba la sonda correspondiente será el rojo. Si, por el contrario, hay una mayor cantidad de ARNm en la muestra normal, el color resultante será el verde. Una expresión equivalente de un gen en la muestra normal y en la patológica daría lugar a un color amarillo. Este patrón de colores se utiliza para valorar y cuantificar los datos de los microarrays y poder interpretar los resultados de expresión (v. fig. e2-9). Aplicaciones biomédicas Aunque la tecnología de los microarrays todavía no se utiliza con fines diagnósticos de modo rutinario, es una técnica con un gran potencial en este sentido. Las aplicaciones posibles de los microarrays son muy diversas: • Conocimiento de los cambios globales en la expresión génica de tejidos patológicos. • Descubrimiento de nuevos genes causantes de enfermedades. • Estimación de la evolución de una enfermedad. El estudio de genes asociados con la evolución de los pacientes tras la aplicación de una terapia podría predecir el pronóstico de dicha enfermedad. • Farmacogenómica: gracias a la identificación de genes centinelas (o biomarcadores) que demuestran una expresión alterada en una célula o tejido determinado tras la aplicación de un fármaco, se podría determinar si dicho fármaco va a ser efectivo y no va a causar toxicidad en un paciente. Transferencia de ADN a células y embriones de mamíferos. Desarrollo de animales transgénicos y knock out La capacidad de introducir genes de nuestro interés en una célula y expresarlos en grandes cantidades (o, por el contrario, disminuir artificialmente su expresión basal) permite conocer mejor la función de dichos genes. Por otro lado, la terapia génica se basa también en la capacidad de transferir determinados genes en células alteradas. El proceso de introducción de ADN exógeno en células se llama transfección, cuando se hace de modo directo, y transducción cuando se introduce mediante infección vírica. Existen varios métodos de transfección, entre los que citaremos: a) la electroporación, por el que las células se incuban con ADN en unos tubos de ensayo especiales que contienen electrodos y se aplica una pequeña corriente eléctrica que hace que en la membrana se creen poros por los que se introduce el ADN, y b) el uso de liposomas, pequeñas esferas de membrana artificial donde se puede meter el ADN por determinados métodos químicos. Los liposomas se fusionan con la bicapa lipídica de la membrana celular e introducen el ADN en el citoplasma. 90 Estos métodos permiten modificar genéticamente las células para ver cómo cambian sus propiedades o para la creación de animales transgénicos y knock out. Para la creación de animales transgénicos (habitualmente ratones), primero hay que fabricar un vector adecuado que contendrá la secuencia de ADN de interés, la cual lleva el gen codificante para la proteína que se quiere introducir. La expresión de este gen puede estar controlada por un promotor específico de tejido o por un promotor genérico que permitirá la expresión del gen en todas las células del organismo. En ambos casos, el promotor está situado en la región 5 de dicho gen introducido en el vector. El vector se transfiere a un cigoto, donde el ADN se integrará en los cromosomas y, tras su implantación en una hembra preparada para la gestación, se obtendrán animales que llevarán en todas sus células ese transgén. Pero eso no quiere decir necesariamente que todas sus células vayan a expresar o a producir la proteína codificada por el transgén, porque como se puede utilizar un promotor específico, solo se expresará en células del tejido que sea capaz de activar al promotor (fig. e2-10). FIGURA E2-10 A. Esquema simplificado de la generación de ratones transgénicos. En la región 5’ del transgén (en este caso el oncogén antígeno T) se introduce un promotor que permitirá la expresión del mismo en un tejido específico, como por ejemplo la glándula mamaria. Tras la transferencia del ADN a un cigoto e introducción del mismo en una ratona preparada hormonalmente para la gestación, se obtendrá una progenie que lleva en todas sus células el transgén, pero que solo lo expresa en el tejido específico. B. Fotografías de ratones transgénicos C3(1)/Tag hembras donde la expresión del antígeno T en la glándula mamaria genera tumores. (Imágenes procedentes de: Dr. A. Calvo. Departamento de Histología y Anatomía Patológica, Universidad de Navarra.) Los ratones knock out (KO) son ratones alterados genéticamente en los que, utilizando técnicas de ingeniería genética, se elimina uno de sus genes. Si en los ratones transgénicos lo que se intenta es aumentar la expresión de un gen concreto, en los ratones KO se elimina la función de un gen. El propósito es ver qué papel tienen dichos genes en el organismo; si se elimina un gen y no ocurre nada, es que ese gen no es vital para el ratón, pero si observamos un fenotipo patológico podremos conocer en qué funciones fisiológicas participaba ese gen. El primer paso para generar estos ratones es construir un fragmento de ADN con una secuencia modificada que reemplace a la secuencia original del gen, con el fin de inactivarlo. Este fragmento debe incluir una secuencia «de selección» (que va a expresar un gen de resistencia frente a un agente tóxico) flanqueada por secuencias idénticas a la del locus del gen que se quiere inactivar, para que pueda tener lugar la recombinación homóloga. Tras la 91 recombinación entre el ADN exógeno y el ADN genómico, se cultivan las células con el agente tóxico cuyo gen de resistencia lleva el vector (p. ej., la neomicina); solo sobrevivirán entonces las células que lo hayan incorporado (fig. e2-11). FIGURA E2-11 Primeras etapas de la generación de un ratón knock out (KO) para un gen concreto. 1, aislamiento de células embrionarias (ES) de blastocisto de ratón; 2, cultivo; 3, inyección del ADN exógeno (transgén) que lleva el gen alterado, el cual sufrirá recombinación homóloga con el gen que se quiere eliminar presente en las células. El transgén lleva incorporado el gen de resistencia Neor; 4, inyección de las células modificadas en un blastocisto de un ratón con pelaje distinto al original e introducción en una ratona preparada para la gestación; 5, la descendencia dará lugar a ratones quimera. A partir de un blastocisto de ratón (un embrión temprano, formado por una masa esférica de células indiferenciadas rodeada por células extraembrionarias) se aíslan las células madre embrionarias (ES, del inglés embryonic stem) que se cultivan in vitro. En estas células se transfiere el fragmento de ADN que hemos generado para que tenga lugar la recombinación homóloga. El ADN exógeno se integrará en el genoma mediante recombinación homóloga con el ADN genómico de la célula, de tal manera que se sustituye la secuencia original por la del ADN exógeno. Pero la frecuencia de recombinación es muy baja, y en la mayoría de las células se recombina uno solo de los alelos. Por lo tanto, las células modificadas son heterocigóticas para ese gen. Las células que han incorporado el transgén se seleccionan mediante la adición del agente tóxico que va a permitir que solo sobrevivan las que han incorporado esta secuencia de ADN. En este momento tenemos células embrionarias con uno de los alelos deficientes para el gen que queremos eliminar. ¿Cómo conseguir, a partir de esto, un ratón en el cual todas las células de su organismo tengan las dos copias deficientes para ese gen? Para ello hay que recurrir a determinadas técnicas genéticas. Supongamos que las células ES se obtuvieron de un ratón marrón; en este caso, las células ES con una copia deficiente de nuestro gen de interés se introducen en un blastocisto de un ratón cuyo pelaje sea de otro color (p. ej., negro). Los blastocistos se implantan entonces en el oviducto de una ratona a la que se ha preparado hormonalmente para que pueda llevar a cabo la gestación. Los blastocistos contienen en este momento dos tipos de células madre: las originales, que provienen de la ratona portadora de color negro, y las modificadas, provenientes de una ratona de color marrón. Los ratones que nazcan serán quimeras, porque parte del cuerpo se ha desarrollado a partir de células madre originales de la ratona 92 negra, y otra parte de las células que nosotros les hemos inyectado (de la ratona marrón). El pelaje de estos ratones tendrá, por lo tanto, zonas negras y zonas marrones. Los ratones quiméricos solo nos sirven si sus células germinales (las de las gónadas) han incorporado también las células que nos interesan (las que llevan un alelo mutado, provenientes de la ratona marrón), ya que podrán transmitir este gen a la descendencia. Solo si esto es así, tras cruzar los ratones quimera con otros negros se obtendrá una progenie no quimérica marrón (fig. e2-12). Los ratones obtenidos de este modo aún contienen solo una copia funcional del gen (son heterocigóticos) en todas las células de su organismo. Estos ratones tienen que someterse a un cruzamiento endogámico posterior para producir un ratón que no lleve ninguna copia funcional del gen que se quiere inactivar, consiguiendo así una homocigosis de ese alelo. Por lo tanto, el cruce de los ratones marrones heterocigóticos para el transgén con otros del mismo tipo dará lugar a una descendencia en la que el 25% de los ratones serán homocigóticos para el gen alterado. Tras este largo procedimiento obtenemos ratones KO para nuestro gen de interés. FIGURA E2-12 Segunda parte de la generación de un ratón KO. A. Los ratones quimera se cruzan con otros de color negro. Los ratones quimera que tengan células germinales procedentes de las células que llevaban el transgén (que venían de un ratón negro) generarán una descendencia de ratones negros heterocigóticos para el gen que se quiere eliminar; 6, el cruce endogámico de estos ratones producirá una descendencia con un 25% de ratones negros con deleción homocigótica para el gen de interés. B. Ejemplo de ratones wild type (WT) (con fenotipo salvaje; ratón de la izquierda) y ratones obesos (los dos de la derecha) generados por la eliminación de genes que controlan la obesidad. (Imagen procedente de: Sakkou et al. Cell Metabolism 2007;5:450-63.) Esta técnica es valiosa, pero tiene algunas limitaciones; aproximadamente un 15% de los genes que se eliminan son letales para el desarrollo, por lo que los embriones genéticamente alterados no pasan a adultos. Esto indica que son genes imprescindibles para la vida, pero no podemos estudiar qué ocurre en los ratones adultos. Empleando esta tecnología se han conseguido ratones que sirven como modelos para estudiar el cáncer, la obesidad, la diabetes, la ansiedad, el Parkinson o el envejecimiento. Actualmente se están desarrollando tecnologías novedosas como la técnica CRISPR/Cas9, que permite «editar» el genoma de una manera muy precisa, introduciendo las modificaciones que sean de nuestro interés científico. 93 Técnicas citogenéticas Las técnicas citogenéticas tienen como objetivo estudiar los cromosomas en el contexto celular. Son técnicas de desarrollo reciente, que en los últimos años han experimentado un crecimiento exponencial. Se pueden clasificar en dos grupos: técnicas de análisis convencional y técnicas de análisis molecular. El análisis citogenético convencional consiste en el estudio de los cromosomas metafásicos presentes en las células de interés, obtenidos tras el cultivo in vitro del tejido. Fundamento de la técnica El protocolo básico para conseguir cromosomas en metafase de una célula conlleva los siguientes pasos (v. también capítulo 7): • Cultivo in vitro del tejido (sangre, médula ósea, piel, un tumor, etc.) con un medio de cultivo específico a 37 °C y con fitohemaglutinina para inducir la mitosis celular. • Interrupción de la división celular mediante la adición de un agente antimitótico como la colchicina, que detiene la división en la metafase. • Tratamiento de la suspensión celular con una solución hipotónica para romper las membranas celulares, fijación de las estructuras obtenidas y tinción de los cromosomas para la obtención de un patrón de bandas específico. • Recuento y análisis de la estructura de los cromosomas para el estudio de las posibles alteraciones. La técnica de tinción más utilizada en citogenética convencional es la tinción de bandas G. Consiste en el tratamiento de los cromosomas con tripsina y tinción con el colorante Giemsa. De esta manera, los cromosomas aparecen teñidos con un patrón de bandas claras y oscuras que es específico de cada cromosoma, puesto que es reflejo de la secuencia de ADN presente en cada uno de ellos. La disposición ordenada de los cromosomas presentes en la célula, denominada cariotipo (fig. e2-13), permite detectar tanto alteraciones numéricas (monosomías, trisomías, etc.) como estructurales (translocaciones, inversiones, deleciones, etc.). Esta es la técnica más utilizada para el estudio citogenético, debido a que, de forma rápida y económica, permite llevar a cabo un análisis de todo el genoma célula a célula. Sus principales inconvenientes son: la necesidad de disponer de tejido fresco para poder cultivar las células de interés, y su resolución, ya que no son detectadas alteraciones que afectan a regiones de un tamaño menor de 5 Mb. 94 FIGURA E2-13 Imagen de cariotipo humano. Las técnicas de citogenética molecular están basadas en la hibridación in situ fluorescente (FISH), que consiste, como se ha comentado previamente, en la hibridación de un fragmento de ADN o ARN con secuencia conocida (sonda), marcada con una sustancia fluorescente (fig. e2-14). El esquema básico de la técnica de FISH convencional es el siguiente: • Preparación de la sonda: marcaje fluorescente del fragmento de ADN que actúa como sonda. • Preparación del ADN diana, que puede tratarse de cromosomas en metafase o núcleos en interfase. • Desnaturalización de las moléculas de ADN (tanto de la sonda como de la diana) e hibridación de las secuencias. • Procesos de lavado para eliminar las uniones inespecíficas de la sonda. • Análisis mediante el microscopio de fluorescencia. 95 FIGURA E2-14 Técnica FISH para la detección de la amplificación del gen ERBB2 en una muestra de tumor de mama. La sonda de color rojo identifica el gen ERBB2 y la sonda de color verde, el centrómero del cromosoma 17, donde se localiza este gen. Las flechas rojas indican células tumorales con ganancia génica (5-10 copias del gen), y la flecha blanca señala una célula normal con dos copias del gen y del centrómero del cromosoma. (Imagen procedente de: Servicio de Análisis Genéticos de la Universidad de Navarra.) La técnica de FISH ha revolucionado el mundo de la citogenética desde sus primeras aplicaciones a finales de la década de los ochenta del siglo xx, ya que permite llevar a cabo el estudio cromosómico sin la necesidad de tener células en cultivo. Es capaz de detectar no solo ganancias y pérdidas génicas, sino también translocaciones e inversiones en interfase. Además, dado que permite el análisis célula a célula, puede describir la posible heterogeneidad celular de la muestra. Su principal desventaja es que no se trata de una técnica de cribado, porque requiere conocer de antemano cuál es la región genética que se va a estudiar para poder disponer de la sonda adecuada. La visualización de los resultados resulta laboriosa, puesto que implica contar señales fluorescentes, célula a célula. En la actualidad existen algunos equipos capaces de automatizar el análisis de FISH. Con el fin de resolver las principales limitaciones de la técnica de FISH, se han ido desarrollando nuevas metodologías derivadas de ella; una de las más importantes es la hibridación genómica comparada (CGH) (v. capítulo 7). La técnica de CGH consiste en mezclar dos ADN en cantidades equimoleculares (un ADN problema y un ADN normal de referencia) marcados con fluorocromos diferentes (rojo y verde). Estos ADN compiten por hibridar sobre un ADN diana normal en forma de cromosomas en metafase o, más recientemente, chips con miles de secuencias genómicas que pueden llegar a diferenciarse en un único nucleótido (microarray-CGH y microarray-SNP). La diferencia de material genómico entre el ADN problema y el de referencia se manifiesta en una diferencia de intensidad rojo-verde en cada punto del microarray. La imagen obtenida en el microscopio de fluorescencia o en un escáner es cuantificada por un programa informático que calcula el cociente de las intensidades de cada fluorocromo en cada región, dando información de la ganancia o pérdida de material genómico para dicha región. 96 La gran ventaja de la técnica CGH es que, al igual que la citogenética convencional, describe las alteraciones presentes en todo el genoma, pero con una elevada resolución. Su principal inconveniente reside en no ser capaz de detectar reordenaciones equilibradas que no supongan un cambio en la cantidad de material genómico. Aplicaciones biomédicas Las diversas técnicas anteriormente descritas permiten estudiar alteraciones presentes en enfermedades tanto congénitas como adquiridas. Las enfermedades congénitas son aquellas que afectan al individuo desde el nacimiento. Muchas de ellas tienen un origen cromosómico. Tras el examen clínico, su diagnóstico citogenético se lleva a cabo obteniendo el cariotipo principalmente a partir del cultivo de sangre periférica del paciente. En ocasiones, es necesario además recurrir a la técnica de FISH para describir el mosaicismo de la enfermedad (presencia de clones celulares con dotaciones cromosómicas diferentes). Para algunas enfermedades causadas por microdeleciones, la resolución del cariotipo no es suficiente, por lo que se recurre al análisis mediante FISH utilizando una sonda específica de la región delecionada y/o microarrays de CGH. Recientemente se están haciendo grandes esfuerzos para identificar las alteraciones que causan retraso mental. En muchas ocasiones, el cariotipo de los pacientes es normal, y sus características clínicas y fenotípicas no permiten identificar la enfermedad que pueda ser estudiada mediante una sonda de FISH. En estos casos, la técnica de microarrays de CGH ha posibilitado la identificación de alteraciones que afectan a regiones de menos de 3 Mb, características de este tipo de enfermedades. En la tabla e2-1 se presentan algunas de las enfermedades congénitas más importantes y las alteraciones cromosómicas asociadas a ellas. Tabla e2-1 Ejemplos de enfermedades congénitas en relación a sus alteraciones citogenéticas del, deleción, pérdida de un fragmento cromosómico; p, brazo corto del cromosoma; q, brazo largo del cromosoma. En cuanto a las enfermedades adquiridas, el análisis citogenético se ha incorporado en los laboratorios de genética como una técnica que complementa el diagnóstico morfológico e inmunofenotípico de neoplasias hematológicas y tumores sólidos. La citogenética no solo aporta valor diagnóstico, sino que además permite: • Definir el pronóstico del paciente: por ejemplo, en las leucemias agudas linfoides tipo B, la hiperdiploidía de más de 50 cromosomas y la presencia de la translocación t(12;21)/ETV6-AML1 definen un 97 pronóstico favorable, mientras que la casi haploidía (23-28), la presencia de la t(9;22) y la t(4;11)/AF4-MLL indica un pronóstico desfavorable. • Definir la respuesta que va a tener a un determinado tratamiento: por ejemplo, la presencia de la t(15;17) en la leucemia aguda promielocítica permite seleccionar a los pacientes que son susceptibles de ser tratados con ácido retinoico. • Controlar la progresión de la enfermedad. • Controlar el éxito de un trasplante de médula ósea. La lista completa de alteraciones cromosómicas descritas en neoplasias hematológicas puede consultarse en la siguiente base de datos: http://www.ncbi.nml.nih.gov/CCAP. En la rutina diagnóstica, la técnica de FISH es la técnica de elección para el estudio de tumores sólidos, debido a las dificultades encontradas en la obtención de cariotipos de calidad en este tipo de tumores. Los ejemplos más representativos del diagnóstico citogenético en tumores sólidos son los siguientes: • Análisis de translocaciones en distintos tipos de sarcoma: utilizando FISH, junto con otras técnicas de genética molecular como la PCR, se pueden identificar translocaciones que caracterizan distintos subtipos de sarcoma; así, una translocación entre el cromosoma 11 y 22, t(11;22)(q24; q12), que produce la fusión de los genes EWS y FLI1, caracteriza a los sarcomas de Ewing. La translocación t(X;18)(p11;q11) (fusión de los genes SYT/SSX) caracteriza a los sarcomas sinoviales y las translocaciones t(2;13)(q35;q14) y t(1;13)(p36;q14) a los rabdomiosarcomas. • Análisis de la amplificación del gen ErbB2 (o Her-2) en cáncer de mama y del gen EGFR (Her-1) en cáncer de pulmón: los genes de la familia de Her son receptores de membrana encargados de transmitir señales de proliferación celular al interior de la célula. Alrededor del 30% de los tumores de mama y el 80% de los carcinomas de pulmón de células no pequeñas sobreexpresan ErbB2 y EGFR, respectivamente. El estudio mediante FISH de la amplificación de ambos oncogenes está resultando de gran utilidad como complemento al análisis de la sobreexpresión de la proteína, no solo para caracterizar el peor pronóstico de los pacientes, sino también para definir el subgrupo que puede beneficiarse de tratamientos basados en fármacos diseñados para bloquear estos receptores. El enorme desarrollo tecnológico y bioinformático de los últimos años en el ámbito de la secuenciación masiva hace prever una nueva revolución en el campo de la citogenética, con el desarrollo de plataformas que permitirán diagnosticar y pronosticar el curso de una enfermedad, así como poder predecir la respuesta de cada paciente a tratamientos cada vez más individualizados. 98 Producción de anticuerpos policlonales y monoclonales Para obtener anticuerpos específicos contra una proteína de nuestro interés, lo primero que hay que conseguir es aislar y purificar la proteína (o sintetizar un péptido de esa proteína contra el cual se quieren dirigir los anticuerpos). Pongamos por caso una proteína de la cápside del virus de la hepatitis C. Esa proteína, cuando se inyecte en un animal, constituirá un antígeno (Ag), ya que es una sustancia extraña que, introducida en un mamífero, provoca una respuesta inmunitaria que estimula la producción de anticuerpos. Los Ag tienen diversos epítopos o determinantes antigénicos: regiones concretas del Ag que estimulan la producción de anticuerpos. Un mismo antígeno puede tener distintos epítopos. Como se describe con detalle en el capítulo 17, los anticuerpos (o inmunoglobulinas) son glucoproteínas producidas por los linfocitos B en respuesta a una estimulación antigénica. Están constituidos por la asociación de cuatro cadenas polipeptídicas (dos pesadas y dos ligeras) unidas por puentes disulfuro. A su vez, cada cadena posee una región variable, cuya secuencia de aminoácidos es característica de cada anticuerpo y constituye la región del mismo que reconoce y se une al epítopo correspondiente; y otra región constante, con la misma secuencia para cada clase de inmunoglobulina de una especie. Mediante digestión con papaína se obtienen dos fragmentos Fab (antigen binding), que contienen las regiones variables (y, por lo tanto, las que se unen al antígeno), y un fragmento Fc (región constante). La inyección del Ag en el animal causa la producción de un conjunto de anticuerpos que provienen de diferentes clones de linfocitos B y, por lo tanto, tienen diferente especificidad para reconocer diferentes epítopos de ese Ag. Esta es una respuesta policlonal, ya que implica la diferenciación de varios clones de linfocitos B (uno por cada epítopo). Si se obtiene el suero de ese animal, se consigue un suero policlonal, rico en una mezcla de anticuerpos que reconocen los diferentes epítopos del Ag (fig. e2-15). El suero poseerá además muchos otros anticuerpos que reconocen proteínas generadas en otras respuestas inmunes. Por medio de diversas técnicas, se puede purificar la fracción sérica que es rica en nuestro anticuerpo de interés. 99 100 FIGURA E2-15 Representación de la unión de anticuerpos policlonales a distintos epítopos del antígeno (A) y de anticuerpos monoclonales a un único epítopo del antígeno (B). Cada uno de los tipos de estructura geométrica representa un determinante antigénico. Muchas veces, en las técnicas inmunohistoquímicas y en otras aplicaciones de diagnóstico o terapéuticas interesa poder utilizar anticuerpos que solo se dirijan contra un epítopo, es decir, que sean monoclonales (v. fig. e2-15), ya que todos provienen de un único clon de linfocitos B. El aislamiento y mantenimiento en cultivo de un linfocito B productor de un determinado anticuerpo permitiría la obtención de grandes cantidades del mismo, con idénticas características y con la misma afinidad por el Ag. Sin embargo, los linfocitos B no pueden mantenerse en cultivo durante un tiempo suficiente para obtener una cantidad adecuada de anticuerpos. Para solucionar este problema se fusionan los linfocitos B con células de mieloma (células cancerosas que, al ser tumorales, pueden crecer en placas de cultivo de modo indefinido). La fusión celular se consigue mediante polietilenglicol, una sustancia que favorece la fusión de las membranas. Las células de mieloma poseen una deficiencia genética que les impide crecer en un medio de cultivo llamado «HAT» (que contiene hipoxantina, aminopterina y timidina). Por lo tanto, solo van a crecer en cultivo aquellas células de mieloma que se hayan fusionado con linfocitos B (hibridomas), pero no las de mieloma que no se hayan fusionado, debido a que no pueden replicar su ADN en este medio. Los hibridomas se diluyen entonces hasta que se obtiene solo una célula por pocillo de cultivo. Los anticuerpos que estas células generan se analizan entonces por ELISA (v. más adelante) para comprobar que se produce el anticuerpo que nos interesa en grandes cantidades (fig. e2-16). 101 FIGURA E2-16 Esquema del proceso de producción de anticuerpos monoclonales. (Dibujos procedentes de: Montuenga et al. Técnicas en histología y biología celular. Barcelona: Elsevier; 2009.) ¿Cuáles son las ventajas de utilizar anticuerpos monoclonales sobre los policlonales? La obtención de gran cantidad de sueros policlonales implicaría inyectar numerosas veces el antígeno en animales. Esto da lugar a distintas respuestas inmunológicas de diferente intensidad, por lo que la cantidad de anticuerpo y su especificidad pueden ser bastante variables. En el caso de anticuerpos monoclonales, como se ha aislado un clon celular productor del anticuerpo de interés, mediante el cultivo in vitro de dicho clon podemos tener una fuente ilimitada de anticuerpos con una especificidad definida. Al reconocer un único epítopo, se reduce la posibilidad de reacciones cruzadas y, por lo tanto, de que el anticuerpo reconozca otras proteínas que no son las que interesa identificar. No obstante, el procedimiento técnico para obtener anticuerpos monoclonales es bastante más caro y laborioso que el de los anticuerpos policlonales. Las aplicaciones biomédicas de los anticuerpos monoclonales se comentan en el capítulo 17. 102 ELISA El ELISA (enzyme linked immunosorbent assay) es una técnica basada en el reconocimiento antígeno- anticuerpo, muy empleada en los laboratorios de diagnóstico, con la que se puede cuantificar una proteína en un fluido o en un extracto de tejido (fig. e2-17). El modelo más habitual es el llamado «ELISA sándwich». Imaginemos que se quiere conocer si un paciente tiene en la sangre concentraciones altas de una determinada proteína. Si tenemos dos anticuerpos monoclonales que reconocen dos regiones distintas de la proteína, se puede unir covalentemente uno de ellos al fondo de cada pocillo de una placa de cultivo de 96 pocillos (por la región Fc). Se añaden entonces a cada pocillo de la placa muestras de suero de pacientes diferentes (alguno de los cuales contendrá la proteína que se quiere cuantificar). En los pocillos en los que haya suero de los pacientes con concentraciones detectables de la proteína, esta se unirá al anticuerpo (por la región Fab). A continuación se añade el segundo anticuerpo monoclonal, previamente ligado a una enzima capaz de transformar una molécula concreta (sustrato) en un producto coloreado. Finalmente se añade el sustrato de la enzima ligada al segundo anticuerpo monoclonal. En las muestras en las que haya mucha proteína, habrá quedado retenido mucho anticuerpo y, por lo tanto, habrá una cantidad equivalente de enzima capaz de transformar el sustrato en la molécula coloreada. Así, los pacientes cuyos sueros se añadieron en los pocillos que han quedado coloreados contienen niveles elevados de la proteína estudiada. La intensidad del color en cada pocillo tiene, por lo tanto, una relación directa con la cantidad de proteína presente en el suero del paciente. La sencillez y rapidez de esta técnica la convierten en una de las aplicaciones de los anticuerpos más empleada en los laboratorios de investigación y de rutina clínica. FIGURA E2-17 Ilustración del procedimiento del ELISA para la determinación de la cantidad de proteína en un fluido o extracto de tejido. Western blot El Western blot es un método para la detección de proteínas en extractos de tejido o células que implica una separación electroforética de dicha proteína y una identificación mediante interacción antígeno-anticuerpo (fig. e2-18). Con esta 103 técnica se puede identificar la naturaleza de las proteínas presentes en una muestra, así como su cantidad. Las proteínas, debido a su composición de aminoácidos, suelen tener una carga neta positiva o negativa, de modo que si aplicamos un campo eléctrico a un extracto de proteínas, estas migrarán hacia el polo positivo o negativo (dependiendo de su carga), y lo harán más rápido cuanto menores sean su tamaño y su complejidad estructural. La separación electroforética de proteínas se realiza en una matriz sólida de poliacrilamida, compuesta por monómeros de acrilamida entrelazados entre sí, dejando unos poros que variarán de tamaño dependiendo de la proporción de acrilamida presente en la matriz. Al aplicar un campo eléctrico a esta matriz, las proteínas migrarán dependiendo de su carga neta. Si se quisiera determinar tamaños de proteínas, esto sería un problema, puesto que habrá proteínas de distintos tamaños y cargas, que migrarán de forma distinta. Por ello, el Western blot utiliza una modificación de esta electroforesis denominada electroforesis en gel de acrilamida con dodecil sulfato sódico (SDS-PAGE, del inglés sodium dodecyl sulfate poly-acrylamide gel electrophoresis). Las proteínas se colocan en una solución que contiene el dodecil sulfato sódico (SDS), un potente detergente con carga negativa. El SDS es capaz de unirse a regiones hidrófobas presentes en las proteínas, de forma que la carga neta que poseían queda neutralizada y las proteínas adquieren una carga neta negativa otorgada por el SDS. De esta forma, al aplicar un campo eléctrico, las proteínas migrarán ahora al polo positivo, con una velocidad que dependerá solo de su tamaño. Para evitar interacciones debidas a la estructura terciaria de las proteínas, la muestra se calienta a altas temperaturas para desnaturalizar las proteínas. Así, cuanta más masa tenga una proteína, más lenta será al migrar por los poros del gel de poliacrilamida. FIGURA E2-18 Procedimiento para la realización del Western blot. Las proteínas tratadas con SDS y calentamiento se separan según su peso molecular mediante electroforesis en un gel de acrilamida; posteriormente se transfieren del gel a una membrana para su incubación con anticuerpos específicos (primarios) y secundarios marcados con una molécula cromógena (p. ej., una enzima o un fluorocromo). Tras el revelado y obtención de la imagen se observan las bandas positivas situadas a una altura correspondiente al peso molecular de la proteína que se quiere identificar. El esquema muestra un ejemplo de Western blot para detectar la proteína Id1 (imagen superior) y β-actina en células tumorales. Los números indican la masa molecular en kDa. (Imagen procedente de: I. Manrique. CIMA, Universidad de Navarra.) A partir de esta separación de las proteínas de una muestra, en función de su tamaño, podemos identificar una proteína concreta mediante la unión específica antígeno-anticuerpo. Para poder enfrentar estas proteínas a un anticuerpo, se realiza primero una transferencia de las mismas a un soporte más adecuado (una membrana de nitrocelulosa) mediante la aplicación de un campo eléctrico perpendicular al gel (blotting). Una vez que las proteínas 104 están en la membrana, se puede proceder a la incubación de esta con un anticuerpo primario específico para la proteína de interés; posteriormente se aplica un anticuerpo secundario (que se une a la fracción Fc del anticuerpo primario) marcado con un cromógeno que permita detectar la banda correspondiente a la proteína en estudio. La técnica de Western blot no se aplica normalmente para el diagnóstico, pero se utiliza habitualmente en investigación biomédica para el descubrimiento y caracterización de nuevas proteínas, y para el estudio de las alteraciones debidas a patologías (cantidades anormales, diferencias en tamaños, etc.). 105 Citometría de flujo La citometría de flujo es una técnica de análisis del número, tamaño y forma de una suspensión celular. También sirve para cuantificar el número de determinadas poblaciones celulares marcadas específicamente con sustancias fluorescentes y para aislar poblaciones celulares. Por el hecho de analizar suspensiones celulares, esta técnica es especialmente útil para el estudio y evaluación de muestras normales y patológicas de sangre y médula ósea. También se pueden analizar muestras procedentes de tejidos, pero hay que hacer previamente un procesamiento de los mismos para separar las células entre sí y para separarlas también de la matriz extracelular. El citómetro contiene las siguientes partes: • Un sistema fluídico de transporte de células. • Un sistema óptico de iluminación de las partículas mediante láser. Se suele utilizar un láser de argón, ya que la luz que emite es capaz de excitar más de un fluorocromo. • Un detector electrónico que convierte la luz en señal digital. Las señales ópticas son convertidas en señales eléctricas y analizadas en una computadora. En el citómetro de flujo las células se hacen pasar por un capilar muy fino, de tal modo que pasan de una en una, en fila (fig. e2-19). Según van pasando, el rayo láser impacta sobre ellas y se produce una distorsión del rayo que es registrada por el detector. Este sistema de análisis cuantifica el número de eventos (células) que son impactados por el láser, pero también es capaz de analizar la forma y complejidad interna de las células. El grado de alteración que se produce cuando el láser atraviesa los límites celulares da lugar a una dispersión frontal (FSC, del inglés forward scatter), que se relaciona con el tamaño celular (a mayor tamaño, mayor dispersión frontal). La complejidad interna de las células produce una dispersión lateral u ortogonal (SSC, del inglés side scatter). Por lo tanto, las células granulares o complejas producirán mayor dispersión lateral. 106 FIGURA E2-19 Esquema del funcionamiento de la citometría de flujo. A. Las células se hacen pasar por un fino capilar (de una en una), donde son impactadas por un rayo láser; la distorsión lumínica es recogida en un detector. B. El grado de distorsión frontal (FSC, forward scatter) indica el tamaño de la célula y el grado de distorsión lateral (SSC, side scatter), su complejidad interna. C. Representación del patrón observado mediante citometría de flujo de leucocitos. Por ejemplo, si se hace pasar una población de glóbulos blancos por el citómetro y se representa tamaño frente a complejidad, obtenemos unas nubes de puntos correspondientes a cada una de las poblaciones celulares, que sitúa a estas en diferentes regiones de la gráfica en función de estos parámetros. Los linfocitos, células pequeñas y con escasa complejidad interna, quedan situados hacia el borde inferior izquierdo, mientras que los neutrófilos aparecen en el lado superior derecho (v. fig. e2-19). Otra posibilidad es marcar una población celular específicamente con un fluorocromo para identificarla en el citómetro. Un fluorocromo frecuentemente utilizado es el isotiocianato de fluoresceína (FITC), que absorbe luz cerca de los 490 nm y emite luz de 525 nm. Un ejemplo que ilustra la utilidad de esta técnica es la incubación de células sanguíneas con un anticuerpo anti-CD19 (presente solo en las membranas de los linfocitos B, y no en las de linfocitos T o NK). Cuando el láser impacta con un linfocito B se genera información para estimar la FSC y la SSC y, además, se capta la señal debida a la fluorescencia. De este modo, se puede distinguir un linfocito B de uno T o de uno NK. Esto último sería imposible solo con los parámetros FSC y SSC, dado que todos los linfocitos aparecen como una población celular única en función de estos parámetros. La presencia de un número anormalmente alto de células CD19 positivas puede ser indicativo de una leucemia. Habitualmente, se emplean otros marcadores de superficie celular para aseverar una patología neoplásica concreta. Otro ejemplo de uso frecuente en clínica es la detección de linfocitos CD4 positivos para monitorizar la carga vírica de los pacientes infectados con el VIH. La proteína CD4 se encuentra en la membrana de los linfocitos T cooperadores (helper en inglés) y es utilizada por el virus VIH para infectar dichas células. La infección va reduciendo progresivamente el número de linfocitos CD4+, provocando inmunodepresión en el paciente. Mediante el marcaje fluorescente de anticuerpos anti-CD4 y análisis de la sangre de pacientes infectados en el citómetro se puede hacer una cuantificación de la población de linfocitos CD4+ y, por lo tanto, un seguimiento de la evolución de la enfermedad. En este caso, se puede hacer una representación de tipo histograma de la intensidad de fluorescencia frente al porcentaje de células analizadas (fig. e2-20). La población de la izquierda de la gráfica corresponde a células no marcadas, mientras que la población de la derecha (población que emite la fluorescencia) pertenece a las células fluorescentes CD4+. 107 FIGURA E2-20 A. Representación en forma de histograma de una población de linfocitos positivos para el marcador CD4. La población de la derecha indica el porcentaje (44,46%) de linfocitos positivos. B. Representación en forma de nube de puntos tras el marcaje de linfocitos con doble inmunofluorescencia (anti-CD4, en color verde; anti-INF-γ, en color rojo). Se pueden realizar también dobles o múltiples marcajes fluorescentes. Para ello habría que utilizar diferentes anticuerpos, cada uno conjugado con un fluorocromo concreto. Entre los fluorocromos frecuentemente utilizados en citometría están (aparte del FITC), la ficoeritrina (PE; absorción a 480-565 nm, emisión a 578 nm), y la aloficocianina (APC; absorción a 650 nm, emisión a 661 nm). Imaginemos que queremos responder a la siguiente pregunta: ¿cuántos linfocitos CD4+ expresan interferón γ (INF-γ)? Esta pregunta nos puede interesar porque el INF-γ es una citoquina reguladora de la respuesta inmunitaria, que interviene, entre otras cosas, en la activación de los macrófagos y las células NK. Para responder a esta pregunta, lo que habría que hacer es realizar un inmunomarcaje con anticuerpos anti-CD4 conjugados con un fluorocromo (p. ej., FITC, que produce fluorescencia en el verde) y anticuerpos anti-INFγ marcados con otro fluorocromo (p. ej., APC, que produce una fluorescencia en el rojo). En este caso podemos hacer una representación de intensidad de fluorescencia en el verde frente a intensidad de fluorescencia en el rojo. Observaríamos así cuatro nubes de puntos diferentes, correspondientes a cuatro poblaciones celulares. La población A corresponde a células que no se han marcado con ninguno de los anticuerpos (CD4−/INF−). La población B es la que emite fluorescencia en el verde pero no en el rojo (CD4+/INF−), al contrario de lo que ocurre con la C (CD4−/INF+). La población positiva para ambos marcadores corresponde a la D (CD4+/INF+) (v. fig. e2-20). Los citómetros «clásicos», de un solo rayo láser, permiten el análisis de cinco parámetros al mismo tiempo: FSC, SSC y tres canales de fluorescencia. Hoy en día existen aparatos que contienen hasta 18 canales de fluorescencia, lo que constituye un total de 20 parámetros analizables al mismo tiempo, para cada célula. Esto es algo asombroso si tenemos en cuenta que se analizan miles de células por segundo. Con estos equipamientos se puede encontrar una célula con características propias entre una población de cientos de miles, o incluso de millones de células. La tecnología de la citometría de flujo continúa avanzando. El campo principal es el desarrollo de más y mejores fluorocromos, que permitan obtener señales más nítidas y más fuertes, con lo que se potenciaría la capacidad analítica de la técnica. Además de su conjugación con anticuerpos para encontrar proteínas en una célula, el citómetro puede analizar muchas otras funciones y características celulares, como la apoptosis, necrosis, número de mitocondrias, cantidad de ADN, actividad de una determinada enzima, presencia de un determinado metabolito, etc. Algunos 108 citómetros, además de todo esto, permiten el aislamiento de las células analizadas, lo que posibilita una investigación posterior más profunda con otro tipo de técnicas. El campo donde más se ha desarrollado la citometría de flujo es la hematología, donde constituye una técnica diagnóstica esencial. Los distintos tipos de leucemias y tumores hematológicos se pueden clasificar en muchos casos mediante la citometría de flujo. Además, continuamente aparecen publicaciones científicas en las que se describen nuevas subpoblaciones celulares caracterizadas por la presencia de un grupo especial de marcadores celulares, lo cual puede ser importante de cara al diagnóstico o pronóstico de estas enfermedades. 109 Cultivos celulares Fundamento de la técnica Una de las herramientas más utilizadas para el estudio de la biología de las células, tanto normales como tumorales, son los cultivos celulares. Las células cultivadas in vitro provienen de un órgano o un tejido normal o tumoral. Estas células se mantienen en medios de cultivo de composición conocida y condiciones de temperatura y oxigenación controladas. De esta forma, se asegura su supervivencia y propagación, lo que ofrece una fuente ilimitada de células para el estudio. El origen de los cultivos celulares se remonta al siglo xix, cuando se realizaron los primeros ensayos de supervivencia de células fuera de organismos. Actualmente, en el laboratorio se cultivan células procedentes de una amplia gama de tejidos y organismos diferentes. Los cultivos celulares pueden ser de dos tipos: cultivos primarios y líneas celulares. 1. Cultivos primarios: cuando el cultivo proviene de células, tejidos y órganos tomados directamente del paciente o de un animal, recibe el nombre de cultivo primario. Una de las ventajas del cultivo primario es que las células mantienen las características del órgano del que provienen, lo que es fundamental en el campo de la ingeniería de tejidos. En ciertas patologías, como el infarto de miocardio o algunas lesiones hepáticas, las células dañadas se pueden reemplazar por células sanas cultivadas in vitro procedentes del propio paciente (v. capítulo 18). En el caso del tratamiento de quemados, se han desarrollado métodos de cultivo de piel con los que se generan grandes superficies de este tejido en muy poco tiempo, que sirven para regenerar la piel con gran eficacia. 2. Líneas celulares: cuando las células del cultivo primario adquieren capacidad ilimitada de multiplicación y son líneas puras (es decir, sin contaminación de otros tipos celulares) reciben el nombre de línea celular (fig. e2-21). Las líneas celulares son una herramienta de trabajo de fácil manipulación y ofrecen una fuente ilimitada y homogénea de células fácilmente caracterizables. El desarrollo y estudio de las líneas celulares ha sido uno de los mayores logros técnicos de la biología celular, y ha servido como herramienta para el análisis de una gran variedad de funciones celulares: la actividad intracelular (replicación y transcripción de ADN, síntesis de proteínas), el ciclo celular, la diferenciación, las interacciones célula-célula, los análisis genéticos, etc. 110 FIGURA E2-21 Células tumorales en cultivo. (Imagen procedente de: Dra. J. Agorreta. Departamento de Histología y Anatomía Patológica, Universidad de Navarra.) La mayoría de las células normales son capaces de dividirse un número finito de veces, tras el cual entran en senescencia y no son capaces de dividirse más. El proceso de senescencia está relacionado con el acortamiento progresivo de los telómeros, situados en los extremos de los cromosomas. Las células somáticas humanas tienen inactivada la enzima responsable del mantenimiento de los telómeros, la telomerasa, por lo que en cada división celular se produce el acortamiento de los telómeros hasta que la célula entra en el proceso de senescencia. Para obtener una línea celular continua («inmortalizada») es necesario realizar ciertas modificaciones genéticas que confieran a las células capacidad ilimitada de división; por ejemplo, la introducción del gen de la telomerasa, o inactivación de genes de control del ciclo celular como P53. La derivación de líneas celulares a partir de muestras tumorales es una tarea más sencilla a priori, ya que las células tumorales ya poseen modificaciones genéticas que alteran los puntos de control del ciclo celular. No obstante, el estrés al que se ven sometidas en el cultivo in vitro impide a veces el crecimiento de las mismas. Habitualmente, el objetivo principal del cultivo celular es reproducir las condiciones existentes in vivo. Sin embargo, existen ciertas limitaciones inherentes a esta técnica. Las células cultivadas in vitro no se comportan exactamente igual que en el tejido de origen, debido al cambio en las condiciones de crecimiento de las células. Se pierde la estructura tridimensional típica de cada tejido, existen diferencias en las interacciones célula-célula y célula-matriz extracelular, y la disponibilidad de oxígeno y nutrientes se ve fuertemente alterada. Asimismo, las células en cultivo suelen sufrir procesos de desdiferenciación o pérdida de las características típicas del tejido del que se aislaron. Estas limitaciones hacen necesaria una cuidadosa interpretación de los resultados obtenidos mediante esta técnica. Aplicaciones biomédicas En un principio se aislaron líneas celulares para profundizar en el conocimiento de muchos aspectos de su fisiología. Posteriormente, el campo de los cultivos celulares se encaminó hacia el desarrollo de la virología. Las células 111 eucariotas en cultivo son el sustrato perfecto para la replicación de los virus, lo que permite conocer nuevos aspectos de la biología de estos microorganismos, así como el desarrollo de medidas preventivas a través de la producción de vacunas. Igualmente, el desarrollo de las técnicas de fusión y cultivo celular permitió la creación de los anticuerpos monoclonales, contribuyendo así al progreso de la inmunología. Una de las prioridades de la medicina es la comprensión de la biología de la célula tumoral. Actualmente se cuenta con líneas celulares de la mayoría de los tumores conocidos; de hecho, la primera línea celular de origen humano se derivó a partir de un carcinoma de cérvix en 1952 (células HeLa). Esto, junto con el desarrollo de las técnicas de transferencia de material genético en células en cultivo, ha hecho que las líneas celulares sean el modelo más utilizado en el estudio del cáncer. En este sentido, el cultivo primario de células de un determinado tumor podría dar una información muy valiosa acerca de la sensibilidad del paciente frente a ciertos fármacos utilizados en quimioterapia, lo que permitiría dar un tratamiento más personalizado. El desarrollo de las técnicas de aislamiento y cultivo de células madre ha abierto un nuevo campo de tratamiento de muchas enfermedades mediante la terapia celular e ingeniería de tejidos (v. capítulo 18). Las aplicaciones de la terapia celular se extienden a áreas tan diversas como las enfermedades cardiovasculares (regeneración de tejido cardíaco después de un infarto), la oftalmología (regeneración de la córnea) o la traumatología (regeneración de cartílago). 112 Fraccionamiento celular y centrifugación diferencial Si se desea estudiar la composición química y la función de orgánulos y otras partículas subcelulares, necesitamos separarlos del resto de los componentes citoplasmáticos y nucleares. Para ello habría que romper la membrana plasmática, lo que permitiría obtener una suspensión con todos los componentes subcelulares. Existen diversos métodos para romper las células. Uno de ellos es el choque hipotónico. Al sumergir las células en un medio con menor cantidad de solutos que el citoplasma, el agua entra y las células se hinchan, rompiéndose fácilmente. También se utilizan homogeneizadores mecánicos, basados en la aplicación de presión, ultrasonido y otras fuerzas. La homogeneización se realiza en soluciones isotónicas a bajas temperaturas. Un homogenado típico es una suspensión de orgánulos, componentes celulares y macromoléculas, que podemos separar mediante la centrifugación. Centrifugación Las partículas o células en suspensión tienden a sedimentar debido a la fuerza de la gravedad. La velocidad de sedimentación de las partículas pequeñas es muy lenta, pero aumenta si utilizamos un campo centrífugo. Cuando un cuerpo se somete a centrifugación se genera una fuerza que tiende a escapar del centro de rotación (fuerza centrífuga). Los aparatos que utilizan este tipo de fuerza cuentan con un rotor (donde se ubican las muestras) que puede girar a altísimas velocidades. La fuerza centrífuga aplicada a una partícula es proporcional a la velocidad de rotación del rotor (en revoluciones por minuto) y a su distancia con respecto al centro de rotación (en centímetros). La fuerza centrífuga relativa (RCF, del inglés relative centrifugal force), que se expresa en relación con la fuerza gravitacional g, se calcula como: La constante 1.119 depende de la aceleración gravitacional y la RCF se expresa en unidades × g. Por ejemplo, una fuerza centrífuga relativa de 500 × g significa que se aplica una fuerza 500 veces mayor a la fuerza gravitacional. La velocidad con la que sedimentan las partículas depende de su masa y de su densidad, así como de la densidad y viscosidad del medio en el que se encuentran. La sedimentación de una partícula será directamente proporcional a su masa y densidad, e inversamente proporcional a la densidad y viscosidad del solvente. Las moléculas y las estructuras subcelulares se pueden definir por un coeficiente de sedimentación que se expresa en unidades Svedberg (S) (1 S = 10 −13 s). Habitualmente se definen para la sedimentación en agua a 20 °C. El coeficiente refleja no solo su masa, sino también su forma, superficie expuesta y densidad. Esto explica por qué el coeficiente de sedimentación de determinadas partículas celulares, como el ribosoma (80 S), no es igual a la suma de los coeficientes de sus dos subunidades (60 y 40 S, respectivamente). 113 Centrifugación diferencial La centrifugación diferencial aprovecha la propiedad de las partículas de mayor tamaño o densidad para sedimentar más rápido que aquellas de menor tamaño o densidad. Se basa en sucesivas centrifugaciones a velocidades crecientes (fig. e2-22). En el primer precipitado, obtenido a bajas velocidades, aparecen los núcleos y restos de células sin fragmentar. El sobrenadante se centrifuga con velocidad media, precipitando entonces los orgánulos citoplasmáticos de mayor tamaño, como las mitocondrias, lisosomas, peroxisomas y cloroplastos. Cuando el segundo sobrenadante es centrifugado a mayor velocidad, precipita la denominada fracción microsómica, que contiene fragmentos del retículo endoplasmático y de la membrana. La centrifugación del tercer sobrenadante permite la precipitación de los ribosomas, mientras que en el sobrenadante quedan las moléculas solubles del citosol (v. fig. e2-22). Cuando se requieren fuerzas superiores a 20.000 × g, se utilizan ultracentrífugas que trabajan en vacío para evitar el sobrecalentamiento de la muestra y del equipo. FIGURA E2-22 Esquema de una centrifugación diferencial. El homogenado es sometido a sucesivas centrifugaciones. En cada paso se centrifuga el sobrenadante de la centrifugación anterior, pero con mayor velocidad y durante más tiempo. En la figura se muestra la obtención de las cuatro fracciones crudas. Este método tiene poco poder de resolución y las fracciones pueden incluir varios orgánulos con la misma velocidad de sedimentación. Aunque cada fracción cruda (nuclear, mitocondrial, microsómica y ribosómica) está enriquecida en un tipo de estructura u orgánulo, contiene contaminantes que deben ser eliminados mediante la resuspensión del precipitado obtenido tras una nueva centrifugación, o bien aplicando la centrifugación en gradientes 114 de densidad. Para asegurar la pureza de las distintas fracciones se evalúa el enriquecimiento en determinadas moléculas características de cada orgánulo, mediante procedimientos enzimáticos, inmunocitoquímicos o microscópicos. Algunos ejemplos de marcadores son la presencia de ADN (núcleo), citocromo oxidasa (mitocondrias), hidrolasa (lisosomas), catalasa (peroxisomas), α-manosidasa (aparato de Golgi), adenilato ciclasa (membrana plasmática) y lactato deshidrogenasa (citosol). Centrifugación en gradientes de densidad La fuerza centrífuga aplicada a las partículas es contrarrestada por fuerzas de fricción y de flotación. La primera depende de la viscosidad del medio, mientras que la segunda es proporcional a la densidad del medio. La partícula no se mueve cuando su densidad es igual a la del medio (isopícnica). Esta propiedad se refleja en diversos métodos de sedimentación isopícnica (igual densidad) o de equilibrio, que permiten purificar las fracciones crudas. El homogenado o, más frecuentemente, el sobrenadante posnuclear o posmitocondrial, se aplica a un gradiente de osmolaridad, viscosidad o densidad, continuo o discontinuo, cuya mayor densidad se encuentra en el fondo del tubo. Después de cierto tiempo de centrifugación, las partículas forman una banda en la zona del gradiente que tiene la misma densidad que las partículas. Este método se conoce como sedimentación isopícnica o de equilibrio (fig. e2-23, A). 115 FIGURA E2-23 A. Ilustración de la separación isopícnica de la fracción mitocondrial cruda en un gradiente de sacarosa. La densidad de las partículas que se deben separar está comprendida dentro del rango de densidades del gradiente y, al cabo de 2 h de centrifugación, los lisosomas, mitocondrias y peroxisomas se encuentran en bandas situadas en niveles de distinta densidad. B. Ilustración de la centrifugación zonal en gradiente de densidad. La densidad de las partículas que se deben separar es mayor que la del medio. Al centrifugar, las partículas migran más o menos según su coeficiente de sedimentación. La centrifugación debe ser detenida antes de que las más rápidas lleguen al fondo. En la sedimentación zonal, la densidad de las partículas que se deben separar es mayor que la densidad del medio de separación. La fracción que debe purificarse se coloca sobre la solución o gradiente. Al centrifugar, las moléculas se desplazan con una velocidad determinada por su coeficiente de sedimentación. Dado que todos los componentes tienen mayor densidad que la sustancia del gradiente, es indispensable detener la centrifugación cuando las partículas se hayan acumulado en zonas diferentes del tubo (v. fig. e2-23, B). Si la centrifugación es demasiado prolongada, todas las partículas sedimentarán en la base del tubo. Los gradientes se preparan con diferentes sustancias. La sacarosa es una de las más utilizadas, en concentraciones variables desde 5% (1,017 g/ml) hasta 50% (1,23 g/ml). El cloruro de cesio es el componente preferido para la separación de ácidos nucleicos (ADN, ARN). La centrifugación diferencial también puede aplicarse a suspensiones de células enteras. En estos casos suelen utilizarse gradientes de Ficoll, Percoll o Nicodenz. Preguntas de autoevaluación 1. Si se quisiera estudiar si existe una amplificación génica en el gen EGFR en cáncer de pulmón, ¿qué técnica sería adecuada para ello?: a. Inmunohistoquímica. b. Hibridación in situ fluorescente. c. Microarrays de CGH. d. Realizacion del cariotipo. e. Hay dos respuestas correctas. Respuesta correcta: e. 2. ¿Cuál es la respuesta falsa en relación con la producción de anticuerpos monoclonales? a. Los anticuerpos monoclonales reconocen un solo epítopo del antígeno, por lo que todos los linfocitos productores de ese tipo de anticuerpo provienen de una misma estirpe de linfocitos B. b. Solo se conseguirán anticuerpos monoclonales si se fusionan linfocitos B con células de mieloma, ya que los linfocitos B no se pueden mantener mucho tiempo en cultivo. 116 c. Los linfocitos B no pueden crecer en medio HAT, por lo que es necesaria su fusión con células de mieloma. d. El uso de anticuerpos monoclonales proporciona ventajas con respecto al uso de anticuerpos policlonales, porque constituyen una fuente ilimitada de anticuerpos con especificidad definida. e. Para obtener hibridomas que produzcan el anticuerpo de interés habría que realizar una dilución límite hasta conseguir un hibridoma por pocillo de cultivo. Respuesta correcta: c. 3. ¿Cuál es la respuesta falsa con respecto a la técnica del contraste negativo?: a. Es una técnica muy útil para observar virus. b. Las partículas se cubren con ácido fosfotúngstico, por lo que se observan con un aspecto oscuro. c. Una vez procesadas, las muestras se observan al microscopio electrónico de transmisión. d. Esta técnica consigue una alta resolución, por lo que se pueden observar partículas con gran nitidez. e. Con esta técnica no hay que utilizar el ultramicrotomo, ya que no hay que hacer cortes de las muestras que se van a observar. Respuesta correcta: b. 4. Si quisiera inmortalizar un cultivo primario, ¿qué sería necesario modificar en las células?: a. Expresar el gen de P21. b. Expresar el gen de la telomerasa. c. Inactivar el gen de P53. d. Disminuir la expresión de EGFR. e. Las respuestas b y c son correctas. Respuesta correcta: e. 5. Indique cuál de las siguientes frases es falsa en relación con las técnicas utilizadas en biología celular: a. La longitud de onda de emisión de un fluorocromo es mayor que la longitud de onda de excitación. b. Si se utilizara luz de una longitud de onda por debajo del espectro visible se reduciría el poder de resolución de un microscopio. c. Las muestras que se analizan al microscopio electrónico tienen que estar contrastadas con sales de metales pesados, como el citrato de plomo; las zonas de la muestra que absorben más cantidad de dicha sustancia aparecerán como electrodensas. 117 d. En un microscopio de contraste de fases, el contraste se obtiene mediante sistemas ópticos que son capaces de detectar las diferencias en la amplitud de las ondas que han atravesado las distintas estructuras celulares. e. El microscopio confocal permite hacer reconstrucciones tridimensionales de las muestras y cuantificación de la señal inmunofluorescente. Respuesta correcta: b. 6. En una imagen de citometría de flujo de glóbulos blancos donde se representa tamaño (FSC) en el eje X frente a complejidad (SSC) en el eje Y, ¿dónde quedaría situada la población de neutrófilos?: a. En la parte superior izquierda. b. En la parte superior derecha. c. En la parte inferior izquierda. d. En la parte inferior derecha. e. En el centro. Respuesta correcta: b. 7. Elija la respuesta que define mejor la función del glutaraldehído en microscopía: a. Es una sustancia de contraste utilizada en microscopía electrónica. b. Es una sustancia utilizada como colorante en microscopía óptica. c. Es una sustancia fijadora utilizada en microscopía electrónica. d. Es una sustancia que fija especialmente los lípidos de membrana, utilizada en microscopía electrónica. e. Es un componente de las resinas que se utilizan para embeber el tejido en microscopía electrónica. Respuesta correcta: c. 8. En la centrifugación diferencial, los peroxisomas se obtienen en la fracción: a. Nuclear. b. Mitocondrial. c. Microsómica. d. Ribosómica. e. Citosólica. Respuesta correcta: b. 118 9. Indique la correlación falsa: a. Gel de agarosa: separación de ácidos nucleicos en la electroforesis. b. Cloruro de cesio: separación de ácidos nucleicos en centrifugación. c. EcoR1: enzima de restricción de ácidos nucleicos. d. RT-PCR: análisis de polimorfismos del ADN. e. Didesoxirribonucleótidos: secuenciación de ADN. Respuesta correcta: d. 10. Un criostato es: a. Un sustancia que previene la formación de cristales en muestras biológicas congeladas. b. Una sustancia que se utiliza para fijar las biopsias intraoperatorias que van a ser congeladas. c. Un aparato que sirve para almacenar las muestras congeladas a baja temperatura. d. Un aparato parecido a un microtomo que se utiliza para cortar tejidos congelados. e. Nada de lo anterior. Respuesta correcta: d. 119 CAPÍTULO 3 120 Estructura de la membrana plasmática Carlos Bravo Alfonso Calvo Objetivos de aprendizaje • Comprender el modelo estructural de la membrana plasmática vigente en la actualidad (y sus precedentes). • Conocer la composición química, estructura y función de las membranas biológicas. • Iniciarse en el estudio de las variaciones fisiológicas y patológicas de la membrana celular. 121 Introducción Clásicamente, el término membrana era empleado en anatomía e histología para designar a las láminas de tejido conjuntivo que recubrían los miembros (membrum en latín). En la actualidad, es una palabra ampliamente difundida, empleada en una miríada de disciplinas. Sin embargo, dejando aparte los matices particulares de cada acepción, la palabra membrana continúa significando estructura laminar delgada y flexible. En biología celular, la expresión completa y precisa es la de membranas biológicas. En todas las células existe una fina envoltura laminar que recubre su contenido y define sus límites. De esta manera, los espacios extra- e intracelulares pueden tener una composición y actividad diferentes. La envoltura encargada de esta tarea es una membrana biológica denominada membrana celular, plasmática o citoplasmática. Adicionalmente, las células eucariotas presentan un sistema de membranas intracelulares o endomembranas, que dividen el citosol en compartimentos y envuelven determinados orgánulos. Es preciso destacar que las membranas biológicas no hacen de la célula un sistema cerrado o estanco, incompatible con la vida. En esencia, se comportan como barreras semipermeables: permiten un intercambio selectivo de sustancias con su entorno. El análisis bioquímico y ultraestructural de las membranas biológicas revela que están compuestas por lípidos, proteínas y una pequeña fracción de glúcidos, y que comparten una arquitectura básica común. Los lípidos forman una bicapa de 3-5 nm de espesor que constituye la matriz o armazón de la estructura, sobre la que están embebidas en grado variable las distintas proteínas. Ambos aspectos, composición y estructura, permiten explicar las principales funciones de las membranas biológicas. De estas, 1) la individualización que experimenta la célula, y 2) su compartimentación son las más inmediatas. Otros de los procesos que tienen lugar en las membranas son: 3) el tráfico de sustancias, aun en contra de gradiente de concentración; 4) la catálisis enzimática de una gran variedad de reacciones; 5) el anclaje del citoesqueleto, y 6) la comunicación celular. En este capítulo, tras el relato de los descubrimientos y avances científicos que llevaron a la comprensión lograda hasta hoy de las membranas biológicas, se procederá a la descripción de los componentes con los que estas se construyen (lípidos, proteínas y glúcidos). Asimismo, se hará corresponder la estructura con la función y, siempre que sea posible, se completará el estudio de las membranas con algunos aspectos clínicos, atendiendo a los mecanismos moleculares que subyacen a las enfermedades. Se prestará especial atención a la membrana plasmática (sobre todo a la membrana del eritrocito), pero mucha de la información proporcionada será aplicable a las membranas intracelulares. 122 Modelos estructurales de la membrana: perspectiva histórica La observación de la membrana plasmática solo es posible gracias a la microscopía electrónica y, hasta 1950, los primeros pasos que condujeron hacia la concepción de una envoltura celular procedieron de evidencias indirectas, tales como la diferente composición del exterior y el interior celulares o los fenómenos osmóticos puestos de manifiesto por Dutrochet (1827). Los inicios de esta labor de investigación, desprovista aún de medios adecuados, fueron los del trabajo realizado por Overton en torno a 1890 (fig. 3-1, A). El científico comprobó que, mientras que las sustancias liposolubles penetraban en la célula con facilidad, las hidrosolubles apenas lo hacían. En 1895, presumió la existencia de una especie de cubierta celular que, por las propiedades mencionadas, debía poseer naturaleza lipídica. Una década después, Langmuir estudió los lípidos de membrana como moléculas anfipáticas y propuso una organización en monocapa (fig. 3-1, B). Extendió en agua una solución de lípidos de membrana y, al evaporarse el disolvente aromático, observó que en la interfaz aire-agua se formaban espontáneamente monocapas lipídicas. 123 FIGURA 3-1 Desarrollo histórico del modelo estructural de las membranas biológicas, donde se incluyen los principales hitos que condujeron a la concepción actual de la envoltura celular. (Ilustración de: E. Maldonado. Imagen de microscopía electrónica de la unidad de membrana procedente de: Robertson JD. Membrane structure. J Cell Biol 1981;91[3]:189-204). En 1925, Gorter y Grendel extrajeron los lípidos de las membranas plasmáticas de un número conocido de eritrocitos y los extendieron en una monocapa cuya área resultó ser el doble de lo que debían ocupar las membranas de los glóbulos rojos. Este experimento condujo a la conclusión de que la membrana celular debía ser una bicapa o doble capa lipídica, compuesta por el solapamiento de dos monocapas como las descritas por Langmuir (v. fig. 3-1, C). Años después, se descubrieron varias propiedades de la membrana plasmática que, entendida como una bicapa lipídica pura, no se podían explicar. Entre ellas, cabe destacar dos: 1) una tensión superficial menor de lo esperado, y 124 2) una mayor permeabilidad a las moléculas hidrosolubles. Ello apuntó entonces a la necesidad de introducir componentes proteicos. En 1935, Davson y Danielli propusieron el denominado modelo de sándwich, según el cual la membrana plasmática estaba formada por una doble capa lipídica cubierta por finas láminas de proteína en configuración β (v. fig. 3-1, D). Posteriormente se incluyeron en este modelo poros o canales de membrana para explicar el paso de sustancias. La biología celular pudo finalmente comprobar la existencia de la membrana plasmática con el microscopio electrónico, que reveló que se trataba de una estructura trilaminar de unos 10 nm de espesor (v. fig. 3-1, E). Esta se encontraba dividida en una banda clara central bordeada por otras dos láminas densas y de menor grosor. Robertson acuñó el concepto de unidad de membrana para designar esta imagen de tres capas de diferente electrodensidad, ya que se repetía en las micrografías electrónicas de las membranas de todos los tipos celulares (incluidos los sistemas de endomembranas). Él mismo fue quien hizo corresponder el espacio menos teñido con la bicapa lipídica, y las líneas electrodensas con las finas capas de proteína, en coincidencia con el modelo propuesto por Davson y Danielli. 125 Singer y Nicolson: estructura en mosaico fluido Frente a su aparente verificación por las conclusiones de Robertson, el modelo de Davson y Danielli empezó a ser cuestionado a la luz de nuevos datos obtenidos durante la década de los sesenta. Entre los hechos que contradicen las interpretaciones del modelo de sándwich, cabe destacar dos. Uno es la alta variabilidad del cociente proteína/lípido en las membranas biológicas (tabla 3-1), que puede oscilar desde 0,23 en la vaina de mielina hasta 3,54 en la membrana mitocondrial interna. El otro es la presencia de proteínas de membrana globulares, con dominios en hélice α, imposibles de conciliar con las finas láminas β preconizadas por el modelo de Davson y Danielli. Tabla 3-1 Contenido en lípidos, proteínas y glúcidos de ejemplos representativos de las membranas biológicas (expresado como porcentaje en peso) Tomado de Robertson JD. Membrane Structure. J Cell Biol 1981;91(3):189-204. A lo anterior se suman nuevos hallazgos de la microscopía electrónica, gracias al desarrollo de la técnica de criofractura-réplica (fig. 3-2). En este método, primero se congelan las células y, después, el bloque de hielo resultante se fractura con una cuchilla, de modo que el plano de dehiscencia tiende a coincidir con el espacio que separa las dos monocapas (v. capítulo 2). Una vez logrado esto, las muestras resultantes pueden metalizarse con platino y visualizarse al microscopio electrónico. De esta manera, la membrana plasmática fue separada en dos hemimembranas: una externa o exoplasmática (E), orientada hacia el medio extracelular, y una interna o protoplasmática (P), en contacto con el citosol. También se observó que la superficie de ambas monocapas presentaba proteínas globulares de 4-16 nm. Por todo ello, la idea central de una vasta extensión de proteínas en configuración β, propia del trabajo de Davson y Danielli, fue sustituida en 1972 por la propuesta de Singer y Nicolson, que sigue en vigor y se aplica a todas las membranas celulares. 126 FIGURA 3-2 A. Representación esquemática de la parte interna de una bicapa lipídica sometida a criofractura. Se denomina cara E a la hemimembrana externa y cara P a la protoplasmática. En la técnica de criofractura, la línea de separación suele coincidir con la parte interna de la membrana. B. Muestra obtenida por criofractura. Obsérvese que sobre la hemimembrana P se aprecia un mayor número de partículas (correspondientes a proteínas transmembrana). En su lugar, la cara E presenta las oquedades en las que encajan las partículas que sobresalen de la monocapa interna. (A, ilustración de: E. Maldonado. B, ©1981 Rockefeller University Press. Originally published in Journal of Cell Biology.91:189-204.doi:10.1083/jcb.91.3.189s) La denominación de este modelo de mosaico fluido (fig. 3-3; v. fig. 3-1, F) hace alusión a las dos características de la membrana celular que Singer y Nicolson pusieron de manifiesto. De una manera fácil de entender, los científicos describieron la membrana como una bicapa lipídica fluida (en la que las moléculas de lípido pueden desplazarse libremente) sobre la que quedaban incluidas y cohesionadas de forma variable miles de proteínas a modo de mosaico. En la misma década, este modelo se reforzó al ponerse de manifiesto que, gracias a la presencia de dominios transmembrana, las proteínas pueden adoptar configuraciones de longitud suficiente como para atravesar toda la bicapa lipídica (v. fig. 3-1, G). No obstante, otras proteínas se presentan como unidades globulares discretas unidas a la bicapa, o a otras proteínas de la membrana, mediante interacciones más débiles (interacciones electrostáticas o puentes de hidrógeno). 127 FIGURA 3-3 Esquema de la membrana según el modelo de mosaico fluido. Singer y Nicolson imaginaron la membrana como una bicapa lipídica fluida (en la que las moléculas de lípido pueden desplazarse libremente) sobre la que quedaban incluidas y cohesionadas de forma variable miles de proteínas a modo de mosaico. La fracción glucídica de la membrana (pequeñas cadenas de oligosacáridos unidos a lípidos y proteínas) se encuentra dirigida hacia el exterior celular. (Ilustración de: E. Maldonado.) Por lo tanto, el armazón básico de las membranas biológicas está constituido por la bicapa lipídica, mientras que casi todas sus funciones, dependientes de cada orgánulo y tipo celular, son llevadas a cabo por las proteínas que actúan como enzimas, transportadores de sustancias, moléculas de adhesión o receptores de señales extracelulares. La fracción glucídica de la membrana (pequeñas cadenas de oligosacáridos unidos a lípidos y proteínas) se encuentra dirigida hacia el exterior celular, mientras que, por la cara citosólica, las proteínas del citoesqueleto se anclan a la membrana de la célula. 128 Lípidos de membrana Bicapa lipídica Los lípidos de membrana comprenden un grupo heterogéneo de biomoléculas orgánicas formadas básicamente por carbono, hidrógeno y oxígeno. Una característica esencial de los lípidos de membrana, conocida desde las primeras investigaciones sobre la estructura de las membranas biológicas, es que son sustancias anfipáticas. Esto quiere decir que son compuestos dotados de una parte polar e hidrófila (la cabeza) y otra apolar e hidrófoba (una cola de cadenas hidrocarbonadas). Estas últimas regiones, a diferencia de las hidrófilas, no son capaces de interaccionar con el agua mediante la formación de puentes de hidrógeno, y ello hace que los lípidos sean insolubles en disolventes polares. Si se suspenden en agua, los lípidos de membrana, como moléculas anfipáticas que son, se orientan de forma que las porciones hidrófilas interactúan con el medio que las envuelve, mientras que las partes hidrófobas se ven forzadas a formar agregados. De esta manera, la reducción de la superficie de la interfaz agua-lípido supone la minimización de las fuerzas repulsivas. Dependiendo de cuál sea la forma de las moléculas lipídicas, pueden construirse dos tipos de agregados microscópicos: la micela y la bicapa (fig. 3-4). Las micelas son agrupaciones esféricas en las que los compuestos anfipáticos orientan sus regiones hidrófobas de forma radial hacia un punto interior central. Los grupos de cabeza polares quedan en la superficie, en contacto con el medio acuoso. Su formación tiene lugar fácilmente cuando las unidades lipídicas tienen forma de cuña. Tal es el caso de los ácidos grasos, que tienen una sola cola hidrocarbonada. 129 FIGURA 3-4 Agregados de lípidos. Las moléculas lipídicas con forma de cuña (como los ácidos grasos) se organizan en micelas, mientras que las que tienen forma cilíndrica (como los fosfolípidos) forman bicapas. (Ilustración de: E. Maldonado.) La bicapa (o doble capa) es una lámina de dos monocapas de lípidos anfipáticos enfrentadas por las regiones hidrófobas. En esta ocasión, su formación se encuentra favorecida cuando las moléculas son cilíndricas. Tal es el caso de los glicerofosfolípidos y los esfingolípidos, lípidos de membrana que, como se verá en su descripción, tienen dos colas hidrófobas. La bicapa lipídica presenta dos propiedades fundamentales relacionadas con la minimización de fuerzas repulsivas: el autosellado y el autoensamblaje. Debido al autosellado, la bicapa es capaz de reparar espontáneamente una solución de continuidad. Este fenómeno, por lo tanto, asegura la integridad de la membrana y, con ello, la viabilidad celular. La alteración de esta propiedad de la doble capa lipídica es causa de muerte celular y es la base del mecanismo de acción de algunos fármacos antiinfecciosos, como las polimixinas y los macrólidos polienos. Además, el sistema inmunitario, a través de las proteínas del complemento y los linfocitos citotóxicos, destruye a muchos patógenos construyendo en sus membranas unos poros imposibles de arreglar espontáneamente. El autoensamblaje, por su parte, supone un paso más en la minimización de las repulsiones entre el agua y los lípidos de la bicapa. Las porciones hidrófobas de las moléculas de lípido que están en el borde libre de la doble capa 130 lipídica están aún en contacto con el agua. Este inconveniente se resuelve si la bicapa se pliega sobre sí misma, formando espontáneamente un compartimento sellado denominado vesícula (fig. 3-5). FIGURA 3-5 Autoensamblaje de la bicapa lipídica, que forma una vesícula. Si esta se produce in vitro, entonces recibe el nombre de liposoma. (Ilustración de: E. Maldonado.) Si el fenómeno descrito se produce in vitro, las vesículas formadas se denominan liposomas. Se trata de un sistema artificial de membranas utilizado comúnmente en el estudio de las propiedades de la bicapa lipídica, pero que también se utiliza para administrar fármacos. La formulación de ciertos agentes terapéuticos en liposomas permite, en primer lugar, proteger el medicamento de los mecanismos que el organismo tiene para eliminarlo, con lo que se logra una mayor concentración y/o una prolongación de su vida media. Además, el tratamiento sistémico plantea el problema de una escasa especificidad tisular, por lo que un fármaco no solo actúa en su tejido diana, sino que también lo hace en muchos otros órganos sobre los que produce efectos adversos. La posibilidad de emplear liposomas con ligandos específicos pretende vehiculizar estas sustancias hacia su diana terapéutica, aumentar su efecto beneficioso y disminuir, a la par, su toxicidad. Dentro de la membrana plasmática encontramos tres tipos fundamentales de lípidos (fig. 3-6): glicerofosfolípidos, esfingolípidos y esteroles. Los ácidos grasos son componentes esenciales de los dos primeros grupos. 131 FIGURA 3-6 A. Lípidos de membrana: glicerofosfolípidos, esfingolípidos y esteroles. B. Estructura y fórmula de los fosfolípidos más frecuentes de la membrana plasmática. (Ilustración de: E. Maldonado.) Ácidos grasos Los ácidos grasos son ácidos orgánicos con largas cadenas hidrocarbonadas. Los más abundantes en las membranas biológicas tienen un número par de átomos de carbono que varía entre 12 y 20, siendo los más comunes aquellos que poseen 16 y 18. Esto se debe a que fuera de este rango no se podría asegurar la estabilidad de la membrana. Este hecho es el principal condicionante de que el grosor de la bicapa sea de 3-5 nm, en función de la longitud de las cadenas hidrocarbonadas de los ácidos grasos predominantes. Otro de los aspectos que caracterizan a algunos de los ácidos grasos presentes en los lípidos de membrana es la presencia de dobles enlaces o insaturaciones. Todos los ácidos grasos insaturados de las membranas están en configuración cis, es decir, poseen los grupos –H en el mismo lado de un doble enlace. Esto hace que, a nivel de la insaturación, la cadena sufra una torsión de unos 120° aproximadamente. Como se verá más adelante, esto supone un factor decisivo en el estado de fluidez de la membrana. Los ácidos grasos saturados más habituales en los lípidos de membrana son el ácido palmítico y el esteárico (de 16 y 18 átomos de carbono, respectivamente). Los ácidos grasos insaturados más frecuentes son los ácidos oleico, linoleico y linolénico (los tres con 18 átomos de carbono y uno, dos y tres dobles enlaces, respectivamente) y el ácido araquidónico (de 20 átomos de carbono y cuatro dobles enlaces). Glicerofosfolípidos Los glicerofosfolípidos, o fosfoglicéridos, son ésteres de glicerol con dos ácidos grasos y un grupo de cabeza polar. En el caso más sencillo, ese grupo de cabeza está constituido por el ácido fosfórico, y el compuesto resultante se denomina ácido fosfatídico. En este compuesto, los grupos hidroxilo primero y segundo del glicerol están esterificados por sendas moléculas de ácido graso, mientras que el tercer grupo hidroxilo se encuentra esterificado por 132 ácido fosfórico. El ácido fosfatídico actúa de precursor a partir del cual derivan los restantes glicerofosfolípidos por unión al grupo fosforilo de un alcohol, que da nombre al complejo (v. fig. 3-6). Los principales glicerofosfolípidos constituyentes de la membrana son los que contienen los aminoalcoholes colina (fosfatidilcolina o lecitina), serina (fosfatidilserina) y etanolamina (fosfatidiletanolamina o cefalina). Los que contienen inositol en distintos estados de fosforilación (fosfatidilinositoles) u otra molécula de glicerol (fosfatidilglicerol) se hallan en cantidades relativamente pequeñas. En las membranas mitocondrial interna y bacteriana es posible distinguir también un glicerofosfolípido formado por la unión de dos ácidos fosfatídicos a una molécula de glicerol, que actúa de puente (difosfatidilglicerol o cardiolipina). Los glicerofosfolípidos son los constituyentes mayoritarios de las membranas biológicas y, a pH fisiológico, pueden ser neutros (como la cefalina y la lecitina) o tener carga negativa (como la fosfatidilserina, el fosfatidilinositol y el fosfatidilglicerol). Esfingolípidos Los esfingolípidos tienen una estructura análoga a la de los glicerofosfolípidos (un grupo de cabeza polar y dos colas apolares), pero no contienen glicerol y, en su lugar, están compuestos por esfingosina, un aminoalcohol de cadena larga. Sus moléculas anfipáticas tienen dos colas hidrófobas, constituidas por una molécula de ácido graso y una esfingosina unidas por un enlace amida entre el grupo carboxilo del ácido graso y el grupo amino del C-2 de la esfingosina. Se obtiene así una ceramida, el precursor común de los esfingolípidos. Es posible distinguir dos clases de esfingolípidos, según el grupo de cabeza polar que se una a la ceramida: esfingomielinas y osoesfingolípidos (v. fig. 36). Las esfingomielinas contienen como grupos de cabeza polares los aminoalcoholes fosforilados fosfocolina y fosfoetanolamina. Como tienen fósforo, también pueden clasificarse como fosfolípidos junto a los glicerofosfolípidos. Se hallan en las membranas plasmáticas de las células animales, siendo especialmente numerosas en la vaina de mielina que aísla los axones de algunas fibras nerviosas. La vaina de mielina (con un cociente proteína/lípido de 0,23) se forma por la aposición sucesiva de la membrana de las células de la glía en torno al axón de las neuronas. Como la mielina se interrumpe de forma segmentaria en los nódulos de Ranvier, promueve una conducción saltatoria del impulso nervioso, mucho más rápida que la que ocurre en las fibras nerviosas no mielinizadas (v. capítulo 4). La esclerosis múltiple es una enfermedad de componente autoinmunitario que cursa con desmielinización del sistema nervioso central. La pérdida de la mielina hace más lenta e, incluso, interrumpe la transmisión del impulso nervioso, y ello puede generar en los pacientes debilidad, falta de coordinación, problemas de habla y visión, etc. Los osoesfingolípidos, glucoesfingolípidos o, simplemente, glucolípidos están formados por la unión de la ceramida con una o varias unidades glucídicas. Así pues, estos lípidos no contienen ácido fosfórico (no pueden incluirse en el grupo de los fosfolípidos) y su cabeza polar está constituida por un glúcido conectado al grupo –OH 133 del C-1 de la ceramida. Los osoesfingolípidos se subdividen, a su vez, en tres grupos: cerebrósidos, globósidos y gangliósidos. Los cerebrósidos contienen un monosacárido unido a la ceramida, que puede ser glucosa o galactosa. Los globósidos presentan grupos de cabeza polares formados por disacáridos u oligosacáridos. Ambos osoesfingolípidos pertenecen al grupo de los glucolípidos neutros, debido a que no tienen carga a pH fisiológico. Los gangliósidos, en cambio, contienen grupos de cabeza polares formados por oligosacáridos que poseen una o varias unidades de ácido siálico (ácido N-acetilneuramínico). Este glúcido les aporta una carga neta negativa a pH fisiológico. Hasta ahora, se han identificado más de 40 gangliósidos. Son abundantes en la hemimembrana E de las células ganglionares del sistema nervioso central, pero también se hallan en menor cantidad en las membranas del resto de los tejidos animales. Los glucolípidos participan en los procesos de señalización celular, en los que, junto a determinadas glucoproteínas, suponen puntos de reconocimiento para moléculas extracelulares o células adyacentes. La porción glucídica de determinados glucolípidos y glucoproteínas define los grupos sanguíneos humanos y desempeña también un papel esencial durante el desarrollo embrionario, pero además se asocia a determinadas situaciones patológicas. Algunos osoesfingolípidos son puntos de entrada de ciertos patógenos y toxinas bacterianas. Así, el gangliósido G , presente M1 en las células de la mucosa intestinal, actúa como receptor para la toxina producida por Vibrio cholerae. Cuando esta penetra en el enterocito, produce un aumento prolongado de la concentración intracelular de AMPc (v. capítulo 13), lo cual conduce a la hipersecreción de agua y electrólitos responsable de la diarrea acuosa y profusa que caracteriza al cólera. Esteroles Los esteroles son lípidos de membrana presentes en la mayor parte de las células eucariotas. Pertenecen al grupo de los esteroides, con entre 27 y 29 átomos de carbono organizados en torno al núcleo de esterano o ciclopentanoperhidrofenantreno. El más común y relevante de los esteroles en la membrana de las células animales es el colesterol (fig. 3-7). En este, al núcleo de esterano se unen una cadena lateral alifática en el C-17 y un grupo hidroxilo en el C-3, que actúa de grupo de cabeza polar (mínimo en comparación con el cuerpo apolar de la molécula, que resulta casi tan largo como un ácido graso de 16 carbonos). En células eucariotas de plantas y hongos predominan los esteroles estigmasterol y ergosterol, respectivamente. 134 FIGURA 3-7 Estructura esquemática del colesterol, un lípido de naturaleza esteroide habitual en la membrana de las células animales. (Ilustración de: E. Maldonado.) Sin embargo, no se han descubierto esteroles en la membrana de las células procariotas, y también están ausentes en la membrana interna de mitocondrias y cloroplastos, orgánulos semiautónomos que, se piensa, proceden evolutivamente de organismos procariotas. Fluidez de la bicapa lipídica Además de las propiedades de autosellado y autoensamblaje, las bicapas lipídicas tienen otras características que hacen de ellas una matriz ideal para constituir las membranas celulares. Una de las más importantes, ya señalada en el modelo de Singer y Nicolson, es su fluidez. La bicapa lipídica es un fluido bidimensional encerrado en la interfaz de dos medios acuosos, en el que sus moléculas constituyentes se desplazan libremente. Es posible distinguir cuatro tipos de movimiento distintos de los lípidos de membrana (fig. 3-8): 1) la flexión de las cadenas hidrocarbonadas; 2) la rotación de los fosfolípidos alrededor de su eje mayor; 3) la difusión lateral, y 4) la difusión transbicapa, o flip-flop. En las difusiones lateral y transbicapa se produce el intercambio azaroso de posición entre dos moléculas de lípido. La diferencia entre ambos movimientos es que, mientras que en la difusión lateral las moléculas de lípido están situadas dentro de la misma hemimembrana, en el flip-flop se produce el traspaso de una monocapa a otra. A 37 °C, una molécula de lípido individual puede llegar a intercambiar su ubicación con otras moléculas adyacentes unos 10.000.000 veces/segundo por difusión lateral. En cambio, el movimiento de flip-flop en las 135 mismas condiciones experimentales es extremadamente lento, siendo su frecuencia menor de una vez a la semana. Esto se debe a que la difusión transversa requiere que las cabezas polares de los fosfolípidos abandonen su entorno acuoso y se trasladen al interior hidrófobo y no polar de la bicapa en su paso hacia la otra hemimembrana, proceso que no resulta favorable termodinámicamente. FIGURA 3-8 Tipos de movimientos de las moléculas de fosfolípido en la bicapa. (Ilustración de: E. Maldonado.) Agentes que influyen en la fluidez de la membrana Las membranas necesitan permanecer en estado fluido, y los factores que determinan su estructura y flexibilidad son: la temperatura y su composición lipídica. • Temperatura. La fluidez de la membrana disminuye a bajas temperaturas y se eleva con la transmisión de energía térmica, incrementándose la vibración de sus partículas. Una bicapa pasa de un estado cristalino o gel a un estado líquido en un punto o temperatura de fusión específico (Tm, del inglés temperature of melting). Para que una membrana desempeñe su función normal, tiene que hallarse en su estado fluido, es decir, a una temperatura superior a su Tm correspondiente, pero que tampoco exceda los límites fisiológicos. Por debajo o por encima de dicho rango característico, el habitual movimiento de las moléculas lipídicas y proteicas quedará perturbado. • Composición lipídica. El otro agente que modifica el estado de fluidez de la membrana es su composición en lípidos, siendo de especial relevancia: 1) el tipo de ácidos grasos que constituyen los glicerofosfolípidos y esfingolípidos, y 2) la presencia de esteroles: 136 ○Tipo de ácidos grasos (fig. 3-9). Dos son las características de los ácidos grasos que resultan especialmente importantes para regular la fluidez de la membrana: la longitud de la cadena hidrocarbonada y el grado de insaturación. El valor de la Tm es más bajo (es decir, una membrana resulta más difícil de cristalizar) si las cadenas hidrocarbonadas de los ácidos grasos de sus lípidos son cortas o tienen dobles enlaces en configuración cis. Una menor longitud de cadena reduce la tendencia de interacción entre las colas hidrocarbonadas, mientras que los dobles enlaces cis, como se explicó anteriormente, introducen giros intracatenarios de unos 120° que dificultan el empaquetamiento que supone el paso al estado de gel. ○Esteroles (fig. 3-10). La membrana de una célula animal contiene cantidades de colesterol tales que pueden llegar a suponer el 50% del número total de lípidos. Las moléculas de colesterol se orientan en la bicapa lipídica con su grupo hidroxilo hacia la fase acuosa. En esta posición, el anillo esteroide, plano y rígido, inmoviliza los primeros grupos -CH - de las cadenas hidrocarbonadas vecinas, provocando que la bicapa lipídica sea más rígida en esta 2 región. La presencia de moléculas de colesterol en la membrana de una célula animal presenta un doble efecto. Por un lado, frena el aumento de fluidez asociado a temperaturas elevadas. Por otro lado, previene la cristalización derivada de la disminución de la temperatura. Dicho de otro modo, en términos de Tm: el colesterol ejerce el efecto dual de disminuir la fluidez de la membrana y dificultar su congelación por encima y por debajo de su punto de fusión, respectivamente. FIGURA 3-9 Punto de fusión (Tm), según la longitud de la cadena (A) y el grado de insaturación (B) de los ácidos grasos. El valor de Tm disminuye si las cadenas hidrocarbonadas son cortas y tienen dobles enlaces en configuración cis. Este hecho se entiende fácilmente con la representación espacial de las moléculas de los fosfolípidos de membrana (a la derecha). Aquellos que tienen grupos acilo saturados de cadena larga (como los esfingolípidos) encajan bien en la membrana. Por el contrario, aquellos que contienen ácidos grasos de cadena más corta y, fundamentalmente, dobles enlaces no encajan tan bien en la membrana. Ello se debe a que una insaturación cis introduce un giro intracatenario que, como se puede observar, dificulta el empaquetamiento. (Ilustración de: E. Maldonado.) 137 FIGURA 3-10 Distribución de las moléculas de colesterol en la bicapa lipídica. (Ilustración de: E. Maldonado.) Además, los esteroles disminuyen la permeabilidad de las membranas, ya que dificultan el paso a su través de solutos polares. Presumiblemente, rellenan los huecos transitorios que se forman entre las cadenas hidrocarbonadas en constante movimiento, a través de las cuales podrían difundir pasivamente pequeñas moléculas hidrosolubles. De hecho, la membrana luminal de las células epiteliales de la porción distal de la nefrona tiene una cantidad de colesterol tal que es impermeable al agua, y este hecho es clave para el correcto funcionamiento del riñón y el balance de líquidos corporales. Alteración de la fluidez de la membrana y mecanismos de compensación La fluidez de la membrana celular está sometida a varios sistemas de regulación. Las células son capaces de contrarrestar los efectos de un cambio abrupto de temperatura mediante la variación de la composición lipídica de la membrana plasmática. Esta capacidad de mantener la fluidez de la membrana relativamente constante comprende mecanismos muy diversos: desde la alteración en longitud y grado de insaturación de los ácidos grasos de la bicapa hasta la incorporación de colesterol en el caso de células animales. Existe una larga lista de enfermedades en las que se han descrito alteraciones en la fluidez de la membrana de significado incierto. Entre ellas, cabe destacar entidades tan prevalentes o de tanto impacto social como la obesidad, el alcoholismo, la hipertensión arterial, la diabetes, la enfermedad de Alzheimer y la esquizofrenia. La alteración de la fluidez de la membrana del eritrocito conlleva cambios perjudiciales en su estructura y función. La acantocitosis consiste en la presencia de un tipo de eritrocitos anormales, con proyecciones espinosas, conocidos como acantocitos o células en espuela (fig. 3-11). Este fenotipo eritrocitario surge como consecuencia de una alteración en la composición lipídica y una disminución en la fluidez de la membrana. Dado que los eritrocitos requieren cierto grado de flexibilidad para pasar por los capilares, cualquier descenso en la fluidez y elasticidad de su membrana aumenta su fragilidad y favorece su destrucción (hemólisis). La acantocitosis puede darse en una gran variedad de situaciones patológicas. Por ejemplo, algunos pacientes con cirrosis hepática presentan acantocitos, cuya membrana tiene un contenido de colesterol elevado. El aumento de colesterol se traduce en una rigidez excesiva, y la pérdida de la capacidad de deformación hace que los acantocitos se destruyan prematuramente. 138 FIGURA 3-11 A. Frotis de sangre periférica en el que es posible distinguir un acantocito (flecha). B. Detalle de una imagen de microscopía electrónica de barrido en la que se distinguen dos acantocitos. En ambos casos, es fácil distinguirlos de los eritrocitos normales por sus características proyecciones espinosas. (Por cortesía de: http://quimicaviva.qb.fcen.uba.ar/Actualizaciones/fotos.htm.) Las neuroacantocitosis constituyen un grupo raro de enfermedades hereditarias que cursa con acantocitosis junto con una degeneración progresiva del sistema nervioso. El mecanismo por el que las alteraciones genéticas identificadas en estos trastornos se manifiestan en clínica no es del todo conocido. No obstante, se piensa que comparten una fisiopatología común. En dos de estas afecciones, la abetalipoproteinemia y la hipolipoproteinemia, la alteración del metabolismo de las lipoproteínas produce un incremento en las membranas celulares del cociente esfingolípidos/glicerofosfolípidos. Este hallazgo podría conducir a una disminución de la fluidez de la membrana eritrocitaria (y la consiguiente transformación acantocítica) por un mecanismo no dependiente del colesterol, ya que los esfingolípidos, que poseen grupos acilos largos y saturados, tienen una mayor capacidad de empaquetamiento. Por su parte, esta alteración de la composición lipídica en las membranas de las neuronas podría explicar las manifestaciones neurológicas que caracterizan a estas enfermedades. En algunos casos, la alteración de la composición lipídica se extiende también a las membranas intracelulares, lo cual también puede afectar a su fluidez y permeabilidad. En los pacientes con hepatocarcinoma, se ha descrito un incremento en la concentración de colesterol en la membrana mitocondrial externa de las células del tumor. Esta alteración afecta a la fluidez y permeabilidad de la mitocondria, y eso dificulta la acción de los quimioterápicos que 139 inducen apoptosis por vía mitocondrial. La mitocondria es un orgánulo que contiene moléculas promotoras de la muerte celular programa o apoptosis (v. capítulo 11). No obstante, para que estos factores pongan en marcha los mecanismos de muerte celular, tienen que formarse poros en su membrana. En este proceso se basa el efecto citotóxico de algunos fármacos antitumorales. Se piensa que el incremento de los niveles de colesterol, al alterar la fluidez y permeabilidad de la membrana mitocondrial externa, podría impedir una respuesta adecuada al tratamiento quimioterápico. De acuerdo con estos resultados, fármacos como las estatinas, que inhiben la síntesis endógena de colesterol, podrían sensibilizar a las células tumorales frente a los tratamientos de quimioterapia que inducen apoptosis por vía mitocondrial. Asimetría de la bicapa lipídica La asimetría es la otra gran propiedad de la bicapa lipídica: las dos hemimembranas poseen una composición sustancialmente distinta (fig. 3-12). En la hemimembrana E se encuentran la mayoría de los fosfolípidos que tienen colina en su grupo de cabeza (fosfatidilcolina y esfingomielina), así como la mayoría de los glucolípidos. Por su parte, en la hemimembrana P residen las moléculas lipídicas que contienen un grupo amino terminal (cefalina y fosfatidilserina). FIGURA 3-12 Distribución asimétrica de los lípidos de la membrana. El símbolo (−) representa la carga neta negativa de la fosfatidilserina. (Ilustración de: E. Maldonado.) Es necesario puntualizar que esta desigual distribución no es absoluta. Esto quiere decir, por ejemplo, que la mayor parte del fosfatidilinositol presente en la membrana se encuentra en la monocapa interna, salvo una pequeña cantidad localizada en la otra hemimembrana. La asimetría de la bicapa lipídica se remonta a la síntesis de sus componentes y es necesario mantenerla, ya que un cambio en la distribución de lípidos tiene notables consecuencias biológicas (fig. 3-13). 140 FIGURA 3-13 Biosíntesis de los componentes lipídicos de la membrana y origen de la asimetría que presenta la bicapa. A la izquierda se representa el flujo de membrana que tiene lugar entre el retículo endoplasmático (RE) y el aparato de Golgi hasta la superficie celular. A la derecha se refleja el papel de los translocadores de lípidos en el mantenimiento de dicha asimetría. (Ilustración de: E. Maldonado.) Los glicerofosfolípidos son sintetizados en la hemimembrana P (en contacto con el citoplasma) del retículo endoplasmático liso (REL). La distribución equitativa entre las dos monocapas de los lípidos formados se produce por difusión transversa, pero este proceso es extremadamente lento a temperaturas fisiológicas. Este hecho se resuelve mediante la catálisis enzimática del movimiento flip-flop, llevada a cabo por una familia de proteínas conocidas como translocasas. Una translocasa presente tanto en el REL como en la membrana plasmática, denominada escramblasa, equilibra ambas membranas en pocos minutos mediante la catálisis de la difusión transversal inespecífica de glicerofosfolípidos. Sin embargo, aún se necesitan más ajustes, como concentrar la fosfatidilserina y la fosfatidiletanolamina en la hemimembrana P. De esta tarea se encarga la flipasa, otra translocasa que cataliza el transporte de estos fosfolípidos de la monocapa E a la P en la membrana plasmática. Por otro lado, los esfingolípidos son sintetizados en la hemimembrana que está en contacto con el lumen del REL y el aparato de Golgi y, cuando se incorporan en la membrana plasmática, permanecen en dicha monocapa (en contacto, en este caso, con el medio extracelular). Por lo tanto, no es necesario ningún tipo de translocación. Los resultados de esta asimetría son varios. En primer lugar, la concentración de la fosfatidilserina en la cara P ocasiona una marcada diferencia de carga eléctrica entre los dos lados de la bicapa y convierte a la membrana celular en una especie de condensador eléctrico. Por otro lado, los grupos carbohidrato de los osoesfingolípidos sobresalen de la superficie de la monocapa externa, donde están vinculados a procesos de reconocimiento celular. Por su parte, las cefalinas, las fosfatidilserinas y los fosfatidilinositoles son más importantes en la monocapa interna, donde se encuentran comprometidos en la transducción o transmisión de señales de la membrana plasmática al interior celular (v. capítulo 13). En los animales, la localización de la fosfatidilserina determina la viabilidad celular. Cuando una célula entra en apoptosis, este lípido deja de quedar retenido en la monocapa interna y su exposición al exterior celular es una señal de aviso para que los macrófagos lleven a cabo la fagocitosis. Esta misma alteración de la asimetría de la membrana es la que se produce en las plaquetas activadas para que puedan desempeñar su papel en el proceso de la coagulación. 141 La exposición de fosfatidilserina en la monocapa externa es esencial para la activación de la vía terminal de la coagulación de la sangre. Durante la activación plaquetaria, se piensa que la elevación de la concentración intracelular de Ca conduce a una mayor activación de la escramblasa frente a la flipasa, de manera que, nuevamente, la 2+ hemimembrana E expone cantidades sobreelevadas de fosfatidilserina. En el síndrome de Scott, un trastorno hemorrágico heredable, el defecto de la escramblasa se traduce en una deficiente externalización de fosfatidilserina. 142 Balsas lipídicas Hace unos años se descubrió que, además de la asimetría existente entre las dos monocapas, los lípidos de membrana ni siquiera se distribuyen de manera homogénea dentro de una misma hoja. Esta afirmación se traduce en la existencia de unas regiones transitorias, de 50-70 nm de diámetro, conocidas como microdominios o balsas lipídicas (fig. 3-14), en las que la acumulación de determinados lípidos de membrana retiene proteínas implicadas en la señalización celular. Las balsas lipídicas se identificaron por primera vez en la hemimembrana E, pero ya se han detectado también en la monocapa interna. FIGURA 3-14 Representación de un microdominio o balsa lipídica en la bicapa. GPI, glucosilfosfatidilinositol. (Ilustración de: E. Maldonado.) Los microdominios situados en la hemimembrana E se caracterizan por el predominio de esfingolípidos y colesterol. Los esfingolípidos, que contienen normalmente ácidos grasos largos y saturados, pueden forman agrupaciones compactas y relativamente duraderas mediante fuerzas de Van der Waals. En cambio, los glicerofosfolípidos, dotados habitualmente de un ácido graso insaturado y otro saturado de menor longitud de cadena, son incapaces de interaccionar de un modo tan estable y quedan fuera de los microdominios. De esta manera, los esfingolípidos, asociados al anillo esteroide del colesterol, se empaquetan temporalmente en estos agregados, de modo que parecen comportarse como una balsa fluida, pero ordenada, que navega a la deriva por un mar lipídico en desorden. Asimismo, en estas formaciones quedan «secuestradas» proteínas implicadas en la señalización celular. La clave de este hecho reside en las desmesuradas ventajas que los microdominios aportan a la hora de asegurar que una célula se comunique eficazmente con su medio. En muchos procesos de bioseñalización tiene lugar la colisión de proteínas de membrana, por lo que su presencia en una misma balsa, o en balsas separadas que tiendan a fusionarse, aumenta 143 notablemente la probabilidad de interacción. Los receptores inmunológicos, de neurotransmisión y de los factores de crecimiento parecen estar localizados principalmente en estos microdominios, así como algunas proteínas implicadas en el inicio de cascadas de señalización, como receptores de tipo quinasa y proteínas G. El descubrimiento de tantas intervenciones fisiológicas viene acompañado, como era de esperar, por nuevas conexiones clínicas. Por ejemplo, se ha visto que el procesamiento patológico de la proteína precursora del amiloide, implicada en la enfermedad de Alzheimer, podría ocurrir en regiones de la membrana con un alto contenido en colesterol (como las balsas lipídicas). Además, por la elevada concentración de osoesfingolípidos y glucoproteínas, también se piensa que las balsas lipídicas podrían servir como sitios de reconocimiento para la entrada de ciertos patógenos y toxinas bacterianas. Otro tipo de proteína presente en muchas ocasiones en los microdominios de la hemimembrana P es la caveolina. Cuando esta proteína reviste internamente la bicapa, promueve la formación de unas vesículas de 50-80 nm de diámetro denominadas cavéolas (pequeñas cuevas, v. capítulo 5). En el microscopio electrónico, las cavéolas pueden visualizarse en la membrana de varios tipos celulares como unas invaginaciones con forma de matraz. Las caveolinas son proteínas de unión al colesterol y se considera que las cavéolas son especializaciones de las balsas lipídicas caracterizadas por la presencia de caveolina. Se dice que la caveolina es una proteína de andamiaje, que colabora en el reclutamiento de proteínas de señalización, y ha sido implicada en diversas funciones celulares. 144 El mosaico proteico Las proteínas, normalmente, suponen un 50% de la masa de la membrana. Si la bicapa lipídica constituye el armazón básico de la membrana celular, son las proteínas embebidas en la misma las biomoléculas encargadas de conferirle su funcionalidad. Sin estas, la membrana quedaría reducida a una mera barrera semipermeable de función delimitadora, la célula estaría a merced de los gradientes electroquímicos y las diferencias funcionales entre un tipo celular y otro resultarían considerablemente mermadas. La cantidad y el tipo de proteínas de membrana son muy variables, y el estudio de este perfil en un determinado tipo celular puede aportar información acerca de su papel biológico. Proteínas de membrana Una de las propiedades de las proteínas es que poseen un grado de solubilidad muy variable que depende, fundamentalmente, de la naturaleza polar o apolar de las cadenas laterales de sus aminoácidos. En consecuencia, estas moléculas ofrecen grandes diferencias de afinidad por el interior hidrófobo de la bicapa lipídica y, por lo tanto, diferencias en la manera en que se asocian a las membranas biológicas. El criterio clásico de clasificación de las proteínas de membrana se basa en el tipo de procedimientos empleados para su aislamiento, así como en el estado de integridad en que queda la membrana tras hacerlo (fig. 3-15). De forma indirecta, este hecho experimental refleja el grado de interacción proteína-lípido y, por extensión, el modo en que la proteína se asocia a la membrana. Según dicho criterio, es posible distinguir tres categorías de proteínas de membrana: integrales, periféricas y ancladas a lípidos. 145 FIGURA 3-15 Criterio clásico de clasificación de las proteínas de membrana. A. Las proteínas intrínsecas pueden ser extraídas con detergentes, que forman en torno a las mismas unas agrupaciones semejantes a las micelas. B. Las proteínas extrínsecas pueden ser extraídas con soluciones de baja o alta fuerza iónica o un pH extremo. C. Por poseer propiedades de extracción intermedias entre estos dos grupos, las proteínas ancladas a lípidos se catalogan aparte. GPI, glucosilfosfatidilinositol. (Ilustración de: E. Maldonado.) Proteínas integrales o intrínsecas de membrana Las proteínas integrales de membrana se encuentran íntimamente unidas a la bicapa lipídica. Por lo tanto, son difíciles de aislar por técnicas estándar de purificación, y para solubilizarlas y extraerlas es necesario utilizar procedimientos drásticos que destruyan totalmente la estructura de la membrana, como es la aplicación de detergentes, desnaturalizantes y disolventes orgánicosEste hecho experimental se apoya en la afirmación de que las proteínas integrales se encuentran embebidas en la membrana plasmática. Al igual que los lípidos, las proteínas integrales son moléculas anfipáticas. Poseen una o varias porciones hidrófobas que se sitúan en el interior de la membrana y se asocian a las colas hidrocarbonadas de los fosfolípidos, así como una o más regiones hidrófilas que se hallan en la interfaz agua-lípido. Dentro de este grupo de proteínas, unas pocas, denominadas «monotópicas» (fig. 3-16, 4), atraviesan la membrana parcialmente (y están incrustadas solo en la monocapa interna o la externa). No obstante, la mayoría de ellas son proteínas transmembrana, que cruzan toda la bicapa. Estas proteínas pueden ser de paso único o múltiple (v. fig. 3-16, 1 y 2), en función de las veces que atraviesen la membrana, y estar constituidas por una o varias cadenas polipeptídicas. FIGURA 3-16 Proteínas de membrana. 1, proteína integral de paso único con un segmento transmembrana en hélice α; 2, proteína integral de paso múltiple con varios segmentos transmembrana en hélice α; 3, proteína integral de paso múltiple con varias hebras β enrolladas (barril β); 4, proteína integral monotópica; 5, proteína anclada a lípido unida por un enlace covalente a un ácido graso de la bicapa o a un grupo isoprenoide; 6, proteína anclada a lípido unido por un oligosacárido a una molécula de glucosilfosfatidilinositol (GPI) de la hemimembrana E; y 7, proteína periférica de membrana, unida por fuerzas débiles (electrostáticas o puentes de hidrógeno) a una proteína integral (o a un lípido de la bicapa). (Ilustración de: E. Maldonado.) La manera en que una proteína integral se asocia a la bicapa depende de su secuencia de aminoácidos y la optimización de los puentes de hidrógeno con las moléculas que la rodean (esto es, en el ambiente anfipático de la membrana). El enlace peptídico es polar, por lo que los grupos -CO- y -NH- de los enlaces peptídicos embebidos en la membrana (que no pueden interactuar con el medio acuoso) tienden formar puentes de hidrógeno entre sí. El número de puentes de hidrógeno se maximiza en determinadas conformaciones o motivos estructurales. 146 Un motivo estructural común a muchas proteínas transmembrana son las hélices α de unos 20-30 residuos de aminoácidos apolares. Estos segmentos o dominios transmembrana, que se asocian firmemente a la bicapa mediante interacciones hidrófobas (gracias a sus aminoácidos apolares) y se estabilizan mediante puentes de hidrógeno intracatenarios, anclan las proteínas a la bicapa y permiten que actúen como canales, transportadores o receptores de membrana. Otro motivo estructural frecuente es el barril β o barril cerrado, en el que decenas de segmentos transmembrana en configuración β delimitan un poro o canal que permite un intercambio inespecífico de pequeñas moléculas hidrosolubles (v. fig. 3-16, 3). Esta organización es la que se observa en las porinas, proteínas abundantes en la membrana externa de las mitocondrias, los cloroplastos y algunas bacterias. Muchos de los antibacterianos que ejercen su efecto biológico en el interior celular atraviesan la pared bacteriana por los huecos grandes y no selectivos de sus porinas. Es más, uno de los mecanismos por los que las bacterias pueden adquirir resistencia a los antibióticos es la mutación de los genes de las porinas, cuyas nuevas conformaciones dificultan o impiden la entrada del fármaco antibacteriano. Proteínas periféricas o extrínsecas de membrana Las proteínas periféricas de membrana se encuentran débilmente asociadas a la bicapa lipídica, o a las proteínas integrales. Por lo tanto, pueden extraerse con facilidad mediante procedimientos suaves que rompan dichas fuerzas sin comprometer la estructura de la membrana, como la exposición a soluciones de muy alta o baja fuerza iónica o de un pH extremo. A diferencia de las proteínas integrales, las proteínas periféricas no se encuentran embebidas en la membrana. Más bien, se encuentran adheridas a sus caras externa o interna mediante uniones no covalentes (v. fig. 316, 7). Se localizan sobre todo en la superficie de la hemimembrana P y suelen ser enzimas o proteínas de anclaje de la membrana al citoesqueleto. Proteínas de membrana ancladas a lípidos Es posible distinguir un tercer grupo de proteínas de membrana, las ancladas a lípidos, que, por sus características intermedias a las dos clases de proteínas de membrana convencionales, son catalogadas aparte. Estas proteínas se encuentran unidas covalentemente a moléculas de lípido constituyentes de la bicapa. De una forma parecida a las proteínas intrínsecas, están claramente incluidas en la membrana. Por lo tanto, el tratamiento con agentes suaves de extracción, válidos para las proteínas extrínsecas, no tiene ningún efecto si no se rompe antes el enlace covalente que establece la asociación proteína-lípido. Por otro lado, y en consonancia con las proteínas periféricas, el grado de interacción de estas proteínas con los lípidos es más débil que el de las proteínas integrales con la bicapa, y queda restringido a una sola hemimembrana, aquella de la que forme parte el lípido. 147 Las proteínas ancladas a lípidos, encontradas tanto en la monocapa interna como en la externa, se asocian a la membrana celular por medio de varios mecanismos. Las proteínas localizadas en la hemimembrana P (v. fig. 3-16, 5) se anclan a la bicapa mediante cadenas hidrocarbonadas de ácidos grasos saturados o grupos isoprenoides. En el primero de los casos, la proteína se traduce en el citosol y después se une a un ácido graso saturado ya incluido en la bicapa. En el segundo de los casos, la proteína sufre la adición de un grupo isoprenoide como modificación postraduccional, previa inserción en la bicapa. Muchas de estas proteínas actúan como enzimas. Tal es el caso de la proteína Ras (codificada por un protooncogén) cuya mutación puede estar involucrada en la transformación maligna de una célula (v. capítulo 16). Las proteínas ancladas a lípidos son escasas en la hemimembrana E y se fijan a la bicapa a través de un derivado glucosilado del fosfatidilinositol: el glucosilfosfatidilinositol (GPI) (v. fig. 3-16, 6). Son traducidas en el retículo endoplasmático rugoso (RER) en forma de proteínas integrales de paso único y, tras perder su segmento transmembrana, se unen por un enlace covalente al GPI, sintetizado en la cara luminal del retículo endoplasmático (cara E). Esto es posible porque, como ya se precisó en el apartado correspondiente a los lípidos de membrana, la asimetría de la bicapa no es absoluta y el fosfatidilinositol se encuentra mayoritariamente en la monocapa interna, pero también (tal y como puede comprobarse ahora) en la externa. Las proteínas de unión a GPI son especialmente frecuentes en las zonas de la membrana implicadas en el tráfico de sustancias, tales como las balsas lipídicas, donde permanecen agrupadas para desempeñar sus funciones. La hemoglobinuria paroxística nocturna es una enfermedad poco frecuente en la cual un clon de células progenitoras hematopoyéticas adquiere la mutación del gen PIGA (phosphatidylinositol glycan anchor biosynthesis, class A). Este gen está implicado en la síntesis de GPI, de modo que las células sanguíneas que procedan de este clon aberrante carecerán de proteínas ancladas a GPI en la superficie de su membrana. Se ha detectado la desaparición de más de 20 proteínas de membrana ancladas a GPI, entre las que se incluyen moléculas de adhesión, enzimas y receptores implicados en la respuesta inmunitaria y la coagulación sanguínea. Cabe destacar las proteínas DAF (decay accelerating factor) y MIRL (membrane inhibitor of reactive lysis). Su función es la de proteger a los eritrocitos de la hemólisis mediada por el sistema del complemento. Decíamos que las proteínas del complemento eran capaces de destruir patógenos formando poros en su superficie que bloqueen el autosellado de la membrana. El problema es que, una vez activado, el complemento no distingue entre las membranas de los patógenos y la de las células sanguíneas. Las proteínas DAF y MIRL impiden que esos poros se formen en la membrana del eritrocito. Por lo tanto, su déficit favorece que los pacientes presenten crisis hemolíticas intravasculares secundarias a la activación del complemento, que típicamente se dan durante la noche (el complemento se activa por la noche porque el pH de la sangre se vuelve más ácido). Por ello, a la mañana siguiente, estos pacientes presentan crisis o paroxismos de hemoglobinuria (hemoglobina en la orina), que se describe como una orina teñida del color del refresco de cola. Esta es la manifestación más característica de esta enfermedad (de ahí su 148 nombre), pero no la única ni la más grave. El déficit de otras proteínas ancladas a GPI deriva en anemia, trombosis venosa, infecciones recurrentes y aparición de neoplasias. La esperanza de vida de los pacientes con hemoglobinuria paroxística nocturna es inferior al 60% a los 15 años del diagnóstico. Estudio de la membrana del eritrocito La membrana plasmática del eritrocito humano es un buen modelo para explicar los distintos grupos de proteínas de membrana, debido a la abundante información existente. En parte, este hecho se debe a: 1) la facilidad con la que se pueden obtener muestras de sangre periférica, y 2) lo sencillo que es llegar a preparaciones de membrana purificadas (conocidas como fantasmas de eritrocito). En los mamíferos, las células de la línea roja tienen forma de disco bicóncavo de unos 7 μm de diámetro y carecen de núcleo, mitocondrias y sistema endomembranoso. Esto les permite albergar la mayor cantidad posible de hemoglobina, pigmento sanguíneo encargado del transporte de oxígeno a los tejidos. Por ello, su membrana plasmática puede ser purificada sin contaminación con membranas internas. Basta con provocar hemólisis a través de la exposición a un medio hipotónico y retirar la hemoglobina y otras proteínas citosólicas para obtener estos fantasmas de eritrocito. Estos fragmentos de membrana se caracterizan por tener unos 10 nm de grosor y una razón proteína/lípido de 1,14. Se ha descubierto que esta proporción puede extenderse a la mayoría de los tipos celulares, por lo que se trata de un modelo de estudio que, además de ser fácil de obtener, resulta representativo. El estudio de las proteínas de la membrana del eritrocito mediante electroforesis (una técnica utilizada para la separación de proteínas por aplicación de un campo eléctrico; v. capítulo 2) genera un patrón de unas 15 bandas principales, cada una de las cuales se corresponde con una proteína. Proteínas integrales de la membrana del eritrocito La glucoforina (fig. 3-17, A) es una proteína integral de paso único (de 131 aa y 30 kDa). Se orienta en la bicapa de manera que su extremo hidrófilo carboxi-terminal (C-terminal) se encuentra en la cara citosólica de la membrana, mientras que el amino-terminal (N-terminal) se halla en la cara extracelular. El segmento externo está muy glucosilado, con oligosacáridos unidos a oxígeno y nitrógeno que suponen cerca del 60% de la masa total de la glucoproteína. Los abundantes residuos de ácido siálico le confieren a la superficie celular una gran carga negativa. Debido a la existencia de estos grupos aniónicos en su superficie, los eritrocitos se repelen, reduciendo de esta forma la viscosidad de la sangre. 149 FIGURA 3-17 A. Dibujo de la membrana plasmática del eritrocito en el que se representan sus dos proteínas integrales más abundantes (la glucoforina y la proteína banda 3) asociadas a otras proteínas componentes del citoesqueleto. B. Esquema explicativo del papel de la proteína banda 3, junto a la anhidrasa carbónica, en el transporte del CO2 procedente de los tejidos periféricos hacia los pulmones. (Ilustración de: E. Maldonado.) La proteína banda 3 (v. fig. 3-17, A) es una proteína integral de paso múltiple formada por dos cadenas polipeptídicas o monómeros (de 929 aa y 100 kDa). En este caso, los dominios N- y C-terminales están orientados hacia la cara citosólica de la membrana, y su cara externa presenta oligosacáridos unidos a nitrógeno. Esta proteína lleva a cabo el contratransporte de los iones cloruro y bicarbonato (Cl y HCO ), por lo que también es conocida como − 3− intercambiador aniónico (AE, del inglés anion exchanger). Para llevar a cabo esta función, los dímeros de banda 3 se presentan emparejados en forma de tetrámeros. En los glóbulos rojos, el intercambiador aniónico, junto a la enzima anhidrasa carbónica, permite maximizar la cantidad de CO que la sangre puede transportar hasta los pulmones. De 2 150 hecho, del total de CO que viaja en sangre, el sistema banda 3-anhidrasa carbónica es responsable de casi un 70% (v. 2 fig. 3-17, B). Proteínas periféricas de la membrana del eritrocito Muchas de las proteínas de la membrana eritrocitaria distinguibles en el patrón de bandas generado en la electroforesis son proteínas periféricas adosadas a la superficie de la hemimembrana P. Interactúan entre sí para formar una malla o enrejado que recubre la cara citosólica de la bicapa y son las responsables de la estabilidad y las propiedades viscoelásticas del eritrocito. Entre ellas, cabe destacar la espectrina, la anquirina, la proteína banda 4.1, la banda 4.2, la aducina, la actina y la tropomiosina. La más abundante es la espectrina (fig. 3-18, A). Se trata de una proteína fibrilar compuesta por dos tipos distintos de subunidades, α y β (cada una de aproximadamente 250 kDa). Estas subunidades forman heterodímeros que se enrollan de forma antiparalela y se disponen formando una doble hélice visible al microscopio electrónico de transmisión. A su vez, dos de estos dímeros se asocian por sus extremos para formar tetrámeros (αβ) , y son estos los 2 que se organizan como una red (v. fig. 3-18, B). Son las cuerdas de la malla, de una longitud de 200 nm. Su posición se estabiliza por ambos extremos, donde cinco o seis tetrámeros confluyen en unos complejos supramoleculares equiparables a los nudos de la red. En estos, las colas de espectrina están unidas entre sí por filamentos cortos de actina y una molécula de tropomiosina, proteína banda 4.1 y aducina. FIGURA 3-18 A. Dibujo de la estructura de una molécula de espectrina. Se trata de una proteína heterodimérica, formada por dos cadenas polipeptídicas (α y β). A la izquierda, se encuentran los residuos fosforilados por los que los dímeros se asocian para formar tetrámeros. B. Representación del citoesqueleto del eritrocito humano. Está formado por una red de tetrámeros (αβ)2 de espectrina enlazados por complejos de unión, en los que intervienen algunas proteínas periféricas de la membrana de los eritrocitos. (Ilustración de: E. Maldonado.) El resultado es un retículo de citoesqueleto deformable y elástico, que permite a los eritrocitos resistir el estrés mecánico que supone el paso por los estrechos capilares sanguíneos. Sin embargo, aún queda por anclar el 151 citoesqueleto a la membrana. En este caso, los principales puntos de fijación son las dos proteínas integrales de membrana estudiadas: la proteína banda 3 y la glucoforina, que se asocian a la espectrina a través de la anquirina y la proteína banda 4.1, respectivamente. Otras proteínas, como la banda 4.2, que media la unión anquirina-banda 3, actúan como elementos moduladores. En todas las células eucariotas existe una red de citoesqueleto constituida por otras proteínas de morfología semejante a las presentes en la membrana del eritrocito, pero cuya disposición y función no son tan conocidas. De forma general, esta red citosólica recibe el nombre de córtex o corteza celular. Defectos en las proteínas de la membrana eritrocitaria: membranopatías congénitas Las membranopatías congénitas constituyen un grupo de enfermedades genéticas en las que el defecto de alguna de las proteínas de membrana estudiadas en el eritrocito hace que estos sean más frágiles y se destruyan precozmente. El resultado es un síndrome anémico del que, por su fisiopatología, se dice que posee características hemolíticas. Las principales membranopatías congénitas son la esferocitosis y la eliptocitosis hereditarias. La esferocitosis hereditaria o enfermedad de Minkowski-Chauffard se caracteriza por la presencia de eritrocitos esféricos o esferocitos (fig. 3-19). Es la membranopatía congénita más frecuente, con una incidencia de 1 caso por cada 2.000 a 10.000 nacimientos. Su patrón de herencia es, generalmente, autosómico dominante. El principal mecanismo molecular que subyace a la patología es el déficit o alteración de la anquirina, la espectrina α o la espectrina β (3565%), seguido de las proteínas banda 3 o banda 4.2 (15-30%). La transformación esferocítica es el resultado de un fallo en el anclaje del citoesqueleto a la membrana del eritrocito. 152 FIGURA 3-19 A. Frotis de sangre periférica de un paciente con esferocitosis hereditaria en el que es posible distinguir varios esferocitos (flechas). B. Imagen de microscopía electrónica de barrido que muestra un par de esferocitos (flechas) junto a eritrocitos normales. (Por cortesía de http://quimicaviva.qb.fcen.uba.ar/Actualizaciones/fotos.htm.) Los esferocitos no son tan deformables y elásticos como los eritrocitos normales y son más frágiles desde el punto de vista mecánico y osmótico. En consecuencia, pueden quedar retenidos en la microcirculación del bazo, donde acaban sufriendo lisis o fagocitosis por los macrófagos esplénicos. De este hecho fisiopatológico se deduce que el bazo tiene una función fundamental en la aparición de anemia hemolítica en esta enfermedad. Por ese motivo, la esplenectomía (extirpación del bazo) constituye el tratamiento de elección en las formas graves de la enfermedad. Este procedimiento quirúrgico consigue una reducción de la hemólisis que provoca la anemia, a pesar de la persistencia de la morfología esferocítica y la fragilidad de las células. La eliptocitosis u ovalocitosis hereditaria se caracteriza por la presencia de eritrocitos elípticos o eliptocitos. Es una membranopatía menos frecuente que la esferocitosis y se hereda de acuerdo a un patrón autosómico dominante. Los defectos más habituales son anomalías en la espectrina α, la espectrina β y la proteína banda 4.1. El resultado es que no se pueden formar tetrámeros de espectrina. Los glóbulos rojos de estos pacientes pueden seguir deformándose para pasar por los capilares. Sin embargo, pierden la elasticidad que les confiere el citoesqueleto y no pueden recuperar su morfología normal, transformándose en eliptocitos. Es por eso por lo que hasta el 90% de los pacientes carecen de manifestaciones clínicas (nótese la diferencia conceptual entre la fluidez de la membrana, su 153 deformabilidad y su elasticidad). En aquellos casos en los que aparece anemia hemolítica, la esplenectomía puede ser parcialmente eficaz. Una variante asintomática de la eliptocitosis hereditaria es la ovalocitosis del sureste asiático (mutación polimórfica de la banda 3), que está presente hasta en el 7% de determinadas poblaciones porque confiere resistencia al paludismo. Fluidez y asimetría del mosaico proteico La fluidez y la asimetría son dos propiedades de la bicapa lipídica extensibles al mosaico proteico. En primer lugar, las proteínas de membrana presentan cierto grado de movilidad. Algunas proteínas de membrana pueden realizar movimientos de rotación en torno a un eje mayor y difundir lateralmente a una velocidad muy inferior a la de los lípidos, dado su mayor peso molecular. En cambio, no experimentan movimiento flip-flop. Además, muestran una orientación asimétrica. Las proteínas integrales monotópicas y todas las extrínsecas y las ancladas a lípidos se encuentran solo en una de las dos hemimembranas: aquella en la que ejercen su función. Las proteínas integrales transmembrana, por su parte, están embebidas en la bicapa, pero dispuestas asimétricamente. Esto quiere decir que, dada una proteína determinada, sus dominios se encuentran incluidos en la membrana siempre de la misma forma y sus extremos N-terminal y C-terminal están dirigidos siempre hacia la misma cara celular. Sin embargo, el asunto no queda ahí, ya que, además de la asimetría observada entre las dos monocapas, el mosaico proteico ni siquiera se distribuye de manera uniformemente fluida y aleatoria dentro de una misma hoja. En parte, esta afirmación se relaciona con las balsas lipídicas ya comentadas, pero la existencia de las mismas no es el único indicio de una restricción de la movilidad proteica. El desplazamiento lateral de muchas proteínas se encuentra limitado a una o varias áreas específicas de la membrana, donde realizan su función. A estas áreas se las llama dominios de membrana y dan lugar a la polarización celular. Ejemplos de células polarizadas hay muchos. Suelen ser tipos celulares altamente especializados, pero tal vez los más significativos sean: 1) las células epiteliales (con sus superficies apical, basal y lateral); 2) las neuronas (separadas en soma y axón), y 3) el espermatozoide (dividido en tres dominios correspondientes al acrosoma, la región posterior de la cabeza y la cola). Si los distintos mecanismos encargados de mantener semejante polarización desaparecieran, la función de estas células se vería seriamente comprometida. Son varios los mecanismos responsables de la restricción de la movilidad de las proteínas de membrana. Uno de los más simples consiste en la formación de agregados de proteínas en complejos grandes que se mueven lentamente (como los conexones en las células animales). Otro, ya explicado en la membrana del eritrocito, consiste en limitar el desplazamiento de aquellas proteínas integrales que actúen como puntos de fijación del citoesqueleto a la membrana (como la banda 3 y la glucoforina). 154 En muchas ocasiones, se establecen auténticas barreras de separación entre dos dominios diferentes. Los dos mecanismos más extendidos son: el empleo de cinturones de microfilamentos de actina (como es el caso de la separación del soma y el axón neuronales) y las uniones ocluyentes, barreras herméticas que están presentes en el perímetro apicolateral de la mayoría de las células epiteliales (v. capítulo 6). 155 La cubierta de glúcidos: estructura y función del glucocáliz Las membranas biológicas poseen pequeñas fracciones de glúcidos, que pueden llegar a representar un 2-10% de la masa total. Generalmente, se presentan en forma de oligosacáridos unidos por un enlace covalente a lípidos y proteínas de la membrana, dando lugar a glucolípidos (como los osoesfingolípidos y el GPI) y glucoproteínas, respectivamente. Con independencia del número y la longitud de la cadena de monosacáridos, su orientación en la membrana plasmática es marcadamente asimétrica: están dirigidas hacia el exterior celular y, de esta manera, todas las células eucariotas se encuentran recubiertas por una envoltura de residuos de azúcar conocida como glucocáliz (fig. 3-20). FIGURA 3-20 Esquema simplificado del glucocáliz. (Ilustración de: E. Maldonado.) Esta cubierta de azúcares contiene, además, glucoproteínas y proteoglucanos que, después de haber sido secretados al exterior celular, quedan adsorbidos en su superficie. De esta manera, una de las posibles funciones del glucocáliz es proteger a la célula de agresiones químicas y mecánicas, manteniendo los cuerpos extraños y la superficie de otras células a la suficiente distancia como para evitar interacciones no deseadas. Una función importante del glucocáliz es el reconocimiento celular. Los oligosacáridos son moléculas que pueden adquirir composiciones, longitudes y configuraciones tridimensionales muy diversas, lineales o ramificadas. Esta variabilidad los convierte en compuestos idóneos para la comunicación celular. El papel que desempeñan en este sentido se traduce en dos grandes funciones: 1) el reconocimiento y fijación de moléculas libres en el medio extracelular, y 2) la adhesión específica entre dos células y de una célula con la matriz. Reconocimiento y fijación de moléculas libres en el medio extracelular Las cadenas glucídicas expuestas en el glucocáliz son responsables del reconocimiento y la fijación selectivos de ligandos, y de la incorporación de elementos externos por endocitosis. 156 En la mayoría de los tipos celulares, el glucocáliz forma una fina cubierta solo apreciable con el microscopio electrónico, pero en algunas células de epitelios absorbentes, como los enterocitos, está muy desarrollado. Hacia la luz del tubo digestivo, las células del epitelio intestinal poseen numerosas prolongaciones citoplasmáticas denominadas «microvellosidades» (v. capítulo 6), cubiertas por un glucocáliz de 150 nm de grosor que puede distinguirse con el microscopio óptico mediante tinciones específicas para hidratos de carbono (como la tinción PAS). El glucocáliz del enterocito posee enzimas que participan en las últimas etapas de la degradación de polisacáridos y proteínas (disacaridasas y oligopeptidasas, respectivamente). Además, la célula dispone en su membrana de mecanismos de transporte para absorber los nutrientes obtenidos tras la digestión. Sin embargo, las porciones glucídicas de los glucolípidos y las glucoproteínas de la membrana también suponen el mecanismo de adhesión y entrada utilizado por patógenos intracelulares y toxinas bacterianas. Un conocido ejemplo es el del virus de la gripe. Este virus expresa en su superficie la hemaglutinina, una glucoproteína que se fija a los residuos terminales de ácido siálico del glucocáliz de las células de la mucosa respiratoria, a las que infecta introduciéndose por endocitosis (v. capítulo 5). Adhesión específica entre dos células y de una célula con la matriz La exposición de residuos de azúcar en la superficie celular desempeña un papel fundamental en el reconocimiento y adhesión célula-célula y célula-matriz, efectuadas por glucoproteínas transmembrana (v. capítulo 6). Ciertos glucolípidos y glucoproteínas del glucocáliz permiten el agrupamiento de células durante el desarrollo embrionario para generar los tejidos y órganos de un individuo, intervienen en la coagulación de la sangre y tienen propiedades inmunológicas, ya que contienen muchos antígenos celulares que causan el rechazo de los trasplantes y definen los grupos sanguíneos. Otro ejemplo bien conocido del papel del glucocáliz en la adhesión célula-célula es la interacción entre el espermatozoide y el ovocito en la fecundación. La zona pelúcida es una capa de glucoproteínas que rodea al ovocito y facilita la unión del espermatozoide y la reacción acrosómica previas a la fusión de sus membranas. La base molecular de la unión entre los dos gametos reside en una única glucoproteína de la zona pelúcida, la ZP3. Los oligosacáridos ligados a esta proteína son reconocidos por receptores no identificados presentes en la membrana plasmática del espermatozoide, y su unión desencadena cambios intracelulares que conducen a la reacción acrosómica. Por lo mismo, la destrucción de la ZP3 después de la entrada de un solo gameto masculino impide el reconocimiento específico entre el cigoto y los otros espermatozoides circundantes, lo que impide la polispermia. Uno de los principales cambios que experimenta una célula tumoral está relacionado con la modificación del glucocáliz: desaparecen algunos antígenos, que dejan de expresarse, y aparecen otros nuevos. Por lo tanto, pueden producirse cambios en la expresión de las moléculas implicadas en la adhesión célula-célula y célula-matriz, que le 157 permitan abandonar el tumor en el que se originó y migrar hacia los vasos para invadir otros tejidos. Este fenómeno, por el que un foco canceroso se propaga a un órgano distinto de aquel en el que se originó, se denomina metástasis, y constituye un factor de mal pronóstico en los pacientes con cáncer (v. capítulo 16). Además, se piensa que estas metástasis no aparecen en cualquier región, sino que exhiben preferencia o tropismo por determinados tejidos. Por ello, las células cancerosas sacan un doble partido de las propiedades del glucocáliz en el reconocimiento celular, ya que, por un lado, son capaces de ignorar las interacciones que las mantienen retenidas en el tumor primario y crecer en un segundo foco con células extrañas; pero, por otro lado, las emplean para su diseminación más o menos selectiva por el organismo. Lecturas recomendadas Bevers EM, Comfurius P, Zwaal RF. Lipid translocation across the plasma membrane of mammalian cells. Biochim Biophys Acta. 1999;1439:317–330. Boon JM, Smith BD. Chemical control of phospholipid distribution across bilayer membranas. Med Res Rev. 2002;22:251–281. Bretscher MS. Membrane structure: some general principles. Science. 1973;181:622–629. Edidin M. Lipids on the frontier: a century of cell-membrane bilayers. Nat Rev Mol Cell Biol. 2003;4:414–418. Gorter E, Grendel F. On bimolecular layers of lipoids on the chromocytes of the blood. J Exp Med. 1925;41(4):439–443. Le Maire M, Champeil P. Interaction of membrane proteins and lipids with solubilizing detergents. Biochim Biophys Acta. 2003;1612:1– 40. McConnell HM, Radhakrishnan A. Condensed complexes of cholesterol and phospholipids. Biochim Biophys Acta. 2003;1610:159–173. Robertson JD. Origin of the unit membrane concept. Protoplasma. 1967;63(1):218–245. Rodgers W, Glaser M. Distribution of proteins and lipids in the erythrocyte membrane. Biochemistry. 1993;32:12591–12598. Singer SJ, Nicolson GL. The fluid mosaic model of the structure of cell membranes. Science. 1972;175:720–731. 158 Determinación de la temperatura de fusión de las membranas biológicas La temperatura de fusión (Tm, del inglés temperature of melting) de una membrana es aquella a la cual experimenta una transición de fase gel a líquido y viceversa. Sin embargo, ¿cómo es posible determinar la Tm de una membrana? Un método muy difundido es la calorimetría diferencial de barrido (DSC, del inglés differential scanning calorimetry). Mediante esta técnica es posible monitorizar las fluctuaciones del estado físico de la membrana en función de la temperatura. El procedimiento consiste en colocar una muestra de membrana en un calorímetro (una cámara cerrada herméticamente) y someterla a un incremento de temperatura dentro de un rango prefijado de valores. Para determinar la cantidad de calor que absorbe la membrana, se calienta de forma paralela un blanco o muestra de referencia, que suele corresponderse con el líquido en el que la membrana se encuentra suspendida. Ambas muestras deben mantenerse en cada momento a la misma temperatura, pero calentar la muestra de membrana exige una cantidad adicional de calor. Precisamente, dicha cantidad adicional es atribuible a la membrana en suspensión. En esencia, la técnica de DSC permite monitorizar la absorción diferencial de una muestra de membrana frente a una referencia y estudiar sus variaciones de fase haciendo un barrido por un intervalo de temperaturas. Problema Imagínese que pretende determinar el punto de fusión de una muestra de membrana extraída de una población de células humanas en cultivo. Para ello, utiliza la técnica de DSC. Los datos que obtiene son procesados por un software específico y representados en una gráfica (figs. e3-1 y e3-2), donde el eje de ordenadas se corresponde con la absorción diferencial de calor y el eje de abscisas con la temperatura. FIGURA E3-1 159 FIGURA E3-2 160 Cuestiones 1. Acerca de esta muestra de membrana, ¿cuál es su valor de Tm correspondiente? ¿Es un valor normal? Razone su respuesta. 2. Una parte de las células de las que se extrajeron las muestras (población A) fue traspasada a dos medios de cultivo distintos, enriquecidos con mezclas de ácidos grasos de composición diferente. Empleando de nuevo el método DSC, se analizaron las muestras de membrana de la población B (curva azul) y C (curva roja) y se obtuvieron los siguientes resultados (v. fig. e3-2). ¿Qué tipo de ácidos grasos se añadieron a cada medio de cultivo? Razone su respuesta. 3. A continuación, su interés se orienta a la fluidez de la membrana. Divide cada una de las poblaciones celulares de los apartados a y b en tres grupos. El primer grupo de tres placas será colocado en una cámara a 16 ºC; el segundo grupo, en un incubador a 37 ºC, y el tercero, en una estufa a 45 ºC. Suponga que todas las poblaciones sobreviven el choque inicial de temperatura. En el peor de los casos, las células experimentarán un cese inicial de crecimiento y reajustarán la composición lipídica de sus membranas para adaptarse al ambiente. Apoyándose en supuestos teóricos, ¿en qué casos se registraría un cese inicial de crecimiento? ¿Cuáles serían todas las posibles variaciones esperables en la composición lipídica de las membranas? 4. Finalmente, se propone estudiar la susceptibilidad de las distintas poblaciones de células a una infección viral. En su ensayo, dispone de un virus modificado genéticamente, en cuyo genoma se ha introducido la proteína fluorescente GFP (green fluorescent protein). De esta manera, las células infectadas expresarán GFP y podrán ser identificadas al microscopio de fluorescencia como células verdes. Para evitar que el factor temperatura interfiera en la capacidad infectiva del virus, primero incuba una placa de cada grupo a 37 °C durante 24 h. Transcurrido este tiempo, inocula el medio con la misma dosis del virus. Al final del experimento, encuentra que el porcentaje de células verdes es mayor en la población C. Adicionalmente, observa que la infectividad del virus y la capacidad de ensamblaje de su progenie cae drásticamente en las tres poblaciones si, las 24 h previas a la exposición al virus, se añade al medio de cultivo el fármaco ciclodextrina. Es probable que desconozca la acción farmacológica de la ciclodextrina. Antes de buscarla, interprete los resultados del experimento anterior e intente explicarlos vinculándolos con las variaciones en la composición lipídica de las membranas de las tres poblaciones de células. Finalmente, encuentre el efecto biológico de la ciclodextrina y confirme sus sospechas o continúe cavilando para clarificar la respuesta. 5. Una de las manifestaciones atribuibles al efecto citopático del virus que está utilizando es la formación de sincitios por fusión de las células infectadas. Curiosamente, al final del experimento encuentra que, en la placa del grupo B, el número de sincitios es significativamente mayor que en las otras poblaciones. ¿Se le ocurre alguna explicación lógica para este hallazgo relacionada con la alteración de la composición lipídica de la membrana y sus propiedades? 161 Respuestas 1. La Tm de la muestra de membrana es de aproximadamente 28 °C. Por encima de los 28 °C, el equilibrio entre las fases gel y líquido se desplazará hacia la derecha (> 50% en estado fluido). Por debajo de dicha temperatura, se desplazará a la izquierda (< 50% en estado fluido). Una Tm de 28 °C es completamente normal. La temperatura fisiológica del cuerpo humano y de los incubadores estándar ronda los 37 °C. Este valor se encuentra por encima de la Tm de la membrana de las células del estudio. Por tanto, existirá una predominancia de la fase líquida respecto al estado cristalino, situación óptima para el funcionamiento de las membranas biológicas. 2. Población B (curva azul). La curva DSC se encuentra desplazada a la izquierda (dentro de un rango de temperaturas más bajas) y el valor de Tm ronda los 15 °C. La membrana de esta población de células se encuentra enriquecida en ácidos grasos insaturados y/o de cadena corta (pe, ácido oleico).Población C (curva roja). La curva DSC se encuentra desplazada a la derecha (dentro de un rango de temperaturas más altas) y el valor de Tm ronda los 45 °C. La membrana de esta población de células se encuentra enriquecida en ácidos grasos saturados y/o de cadena larga (p.ej., ácido esteárico). 3. Grupo 1 (cámara a 16 °C). En este grupo, la población B de células se encuentra a una temperatura ligeramente superior a su valor de Tm (15 °C), por lo que se ve favorecida respecto al resto de las poblaciones, cuya membrana se encontrará predominantemente en fase gel. El reajuste de la composición de sus membranas se conseguiría, en teoría, mediante adaptaciones que desciendan su valor de Tm. Entre ellas, cabe destacar la incorporación de ácidos grasos insaturados y/o de cadena corta y de colesterol, que dificulta su congelación por debajo de cualquier punto fusión dado. Grupo 2 (incubador a 37 °C). En este grupo, la población A de células se encuentra a una temperatura superior a su valor de Tm (28 °C), por lo que se ve favorecida respecto al resto de las poblaciones, cuya membrana se encontrará con una fluidez excesiva (población B) o predominantemente en fase gel (población C). El reajuste de la composición de sus membranas se conseguiría, en teoría, mediante adaptaciones que cambien su valor de Tm. Entre ellas, cabe destacar: Población C: la Tm debe descender mediante la incorporación de ácidos grasos insaturados y/o de cadena corta y de colesterol, que dificulta su congelación por debajo de cualquier punto fusión dado. Población B: la Tm debe subir mediante la incorporación de ácidos grasos saturados y/o de cadena larga y de colesterol, que disminuye el grado de fluidez de la membrana por encima de cualquier punto de fusión dado (por ese motivo, se dice que el colesterol tiene un efecto paradójico sobre la fluidez de la membrana). Grupo 3 (estufa a 45 °C). En este grupo, la población C de células se encuentra justo a su Tm, por lo que se ve favorecida respecto al resto de las poblaciones, cuya membrana se encontrará en un estado de fluidez excesiva. El reajuste de la composición de sus membranas se conseguiría, en teoría, mediante adaptaciones que aumenten su 162 valor de Tm. Entre ellas, cabe destacar la incorporación de ácidos grasos saturados y/o de cadena larga y de colesterol, que disminuye el grado de fluidez de la membrana por encima de cualquier punto de fusión dado. 4. A 37 °C, la membrana de las células de la población C (enriquecida en ácido esteárico) se encuentra predominantemente en estado de gel o cristalino. En las 24 h preinfección, las células han puesto en marcha los mecanismos que les permiten descender el valor de Tm de sus membranas, entre ellos, la elevación de la concentración de colesterol. Por tanto, las membranas de esta población presentarán una alta cantidad de ácidos grasos saturados y colesterol y una membrana poco o nada fluida (y, desde luego, mucho menos fluida que el resto de las poblaciones). A partir de aquí, el estudiante debería ser capaz de integrar los conocimientos en el capítulo 3. Recordemos que muchos patógenos intracelulares y toxinas bacterianas emplean como puntos de entrada y salida aquellas regiones de membrana caracterizadas por un mayor grado de orden. En este caso, es posible que la escasa o nula fluidez de la membrana de las células de la población C a 37 °C favorezca la interacción de las proteínas de adhesión virales y la superficie de las células y el ensamblaje de la progenie viral en el lado citoplasmático de la membrana. Finalmente, el colesterol debe poseer un papel clave en este proceso, ya que la incubación de las células con ciclodextrina (un compuesto que extrae el colesterol de la membrana) anula la infectividad del virus y su capacidad de ensamblaje en las tres poblaciones. 5. La formación de sincitios se da por la fusión de la membrana de las células infectadas, en las que se expresan proteínas virales que permiten dicho proceso. No obstante, es posible que la dinámica de membranas se vea favorecida (o incluso posibilitada por su estado de fluidez: cuanto más fluida se encuentre una membrana, la fusión de las mismas se producirá con una mayor facilidad). Posiblemente, esta explicación permitiría comprender que la formación de sincitios sea mayor en la población B, aquella que a 37 °C presenta una fluidez exagerada de sus membranas, ricas en ácidos grasos insaturados y/o de cadena corta. Preguntas de autoevaluación 1. La contribución de Davson y Danielli al conocimiento de la estructura de la membrana plasmática fue: a. Establecieron el modelo del mosaico fluido. b. Establecieron el modelo sándwich, proponiendo la existencia de una bicapa lipídica cubierta por una capa de proteínas. c. Propusieron que la membrana estaba formada por una monocapa de fosfolípidos. d. Desarrollaron la técnica de la criofractura. e. Ninguna de las anteriores. Respuesta correcta: b 163 2. Acerca de los esfingolípidos de la membrana celular: a. Derivan del precursor común ácido fosfatídico. b. Las esfingomielinas se encuentran implicadas en procesos de reconocimiento celular. c. La pérdida progresiva de la mielina, propia de la esclerosis múltiple, conduce a la interrupción total o parcial de la transmisión nerviosa. d. Tanto los cerebrósidos como los gangliósidos carecen de carga neta a pH fisiológico y, por ello, son conocidos como glucolípidos neutros. e. Ninguna de las afirmaciones anteriores es correcta. Respuesta correcta: c. 3. Acerca de la fluidez de la membrana: a. Es una propiedad de la membrana que depende solo de la temperatura. b. La predominancia de lípidos con ácidos grasos insaturados se traduce en valores de Tm altos. c. En los eritrocitos, la alteración de la fluidez de la membrana puede producir fenotipos patológicos. d. Las respuestas b y c son ciertas. e. Ninguna de las afirmaciones anteriores es correcta. Respuesta correcta: c. 4. Una de las siguientes proposiciones sobre la fluidez de la membrana es falsa: a. El valor de Tm de una membrana fosfolipídica pura rica en ácido esteárico (CH (CH ) COOH) será mayor que la 3 2 16 de aquella cuyo ácido graso predominante sea el ácido oleico (CH (CH ) CH = CH(CH ) COOH). 3 2 7 2 7 b. Se dice que el colesterol tiene un efecto paradójico en la fluidez de la membrana. c. El riesgo de anemia hemolítica en pacientes con acantocitosis es alto como consecuencia de una fluidez exagerada de la membrana de los glóbulos rojos. d. Una variación patológica de esta propiedad no tendría que afectar solamente a la membrana plasmática, sino que puede involucrar a las membranas intracelulares. e. En pacientes con cirrosis avanzada se pueden encontrar eritrocitos con un alto porcentaje de colesterol en sus membranas. Respuesta correcta: c. 5. En relación con la asimetría de la membrana, señale la opción falsa: 164 a. La hemimembrana P se caracteriza por la presencia de fosfatidilinositol, fosfatidiletanolamina y fosfatidilserina. b. Se caracterizada por una distribución absolutamente desigual de los lípidos en la bicapa. Es imposible encontrar, por ejemplo, fosfatidilinositol en la hemimembra E. c. Se establece durante la propia síntesis de nuevos componentes de membrana en el RE. d. Si esta distribución asimétrica se altera en la membrana de una plaqueta, su superficie adquiere propiedades procoagulantes. e. La fracción glucídica queda situada fundamentalmente hacia el exterior celular. Respuesta correcta: b. 6. En relación con la asimetría de la bicapa lipídica, señale la opción verdadera: a. Es absoluta. b. Una célula que expone fosfatidilserina en la hemimembrana E es una célula apoptótica. c. El fosfatidilinositol, la fosfatidilcolina y la fosfatidilserina predominan en la hemimembrana E. d. La actividad de las translocasas afecta a glicerofosfolípidos y esfingolípidos. e. Las respuestas b y d son verdaderas. Respuesta correcta: b. 7. Las balsas lipídicas: a. Se caracterizan por ser áreas de membrana ricas en triglicéridos y colesterol. b. Se descubrieron en la hemimembrana E, pero aún no han sido observadas en la monocapa interna. c. Las cavéolas constituyen un tipo de balsa lipídica característica de neuronas. d. Muchos receptores de membrana parecen estar retenidos de forma temporal en estos microdominios, por lo que se asocian a una gran variedad de procesos normales y patológicos. e. Ninguna de las afirmaciones anteriores es correcta. Respuesta correcta: d. 8. El criterio clásico de clasificación de las proteínas de membrana se basa en: a. La severidad del procedimiento de extracción empleado: depende de lo fácil o difícil que resulte su aislamiento. b. El grosor de banda correspondiente a cada proteína en una electroforesis. c. Su carga neta a pH fisiológico. 165 d. El número de subunidades que posean: las hay de dos, de tres, etc. e. Nada de lo anterior. Respuesta correcta: a. 9. La proteína banda 3: a. Es un intercambiador iónico que, en concreto, permite la salida unidireccional de bicarbonato del eritrocito, acoplando a este proceso la entrada del ión sodio. b. Se trata de una proteína de cotransporte paralelo (simporte) de bicarbonato y cloruro. c. Es una proteína con dos cadenas polipeptídicas que, en la membrana del eritrocito, se presenta formando dímeros. d. Por acción conjunta de la proteína banda 3 y la anhidrasa carbónica, la cantidad de dióxido de carbono que puede transportar la sangre es menor. e. No existe ninguna patología en la que se encuentre implicada, por lo que carece de interés clínico. Respuesta correcta: c. 10. Señale la opción verdadera: a. El término «dominio de membrana» hace alusión a regiones transitorias de 50-70 nm que se forman en la membrana como consecuencia de una composición rica en fosfatidilcolina y colesterol. b. La alteración del glucocáliz de una célula cancerosa es un evento característico en el progreso de un tumor y en el desarrollo de metástasis. c. A través de la neuraminidasa, el virus de la gripe es capaz de introducirse en una célula de la mucosa respiratoria de un mamífero por endocitosis, previa adhesión a algún elemento del glucocáliz. d. Las respuestas b y c son ciertas. e. Ninguna de las afirmaciones anteriores es correcta. Respuesta correcta: b. 166 CAPÍTULO 4 167 Microtransporte a través de la membrana plasmática Tarek Ajami Diego Peñafiel Estefanía Maldonado Alfonso Calvo Objetivos de aprendizaje • Conocer los mecanismos de la difusión simple y el transporte facilitado a través de la membrana plasmática. • Conocer los fundamentos del transporte activo, sus tipos y el funcionamiento de la bomba Na /K ATPasa. + + • Relacionar la alteración de los mecanismos de transporte con el desarrollo de algunas enfermedades. • Comprender los fundamentos que determinan la génesis del potencial de membrana en reposo. • Conocer las distintas fases del potencial de acción y cómo se propaga. 168 Introducción Como se ha estudiado en el capítulo anterior, la membrana constituye una barrera semipermeable que permite el paso selectivo de sustancias necesarias para el metabolismo celular. Existe un gran trasiego de sustancias que pasan de un lado a otro de la membrana, como iones, agua y macromoléculas de diverso tamaño. Algunas sustancias pueden atravesar la membrana por difusión simple o a través de transportadores específicos, un tipo de transporte que no implica una deformación visible de la membrana; en este caso, hablamos de procesos de microtransporte. En cambio, existe otro tipo de transporte que implica una deformación de la membrana plasmática visible al microscopio; todos estos procesos pertenecerían al macrotransporte. En el presente capítulo, nos ocuparemos de los procesos del microtransporte, mientras que en el capítulo 5 se analizarán los fenómenos de macrotransporte. Las moléculas que van a intervenir en el microtransporte se pueden clasificar en: • Sustancias hidrófobas: aquellas que son liposolubles y repelen el agua. • Sustancias hidrófilas: aquellas que son hidrosolubles. Las sustancias liposolubles pueden atravesar la membrana plasmática sin necesidad de que medie un transportador específico, mientras que las hidrófilas precisan de transportadores, que forman canales por los cuales pueden pasar dichas sustancias, atravesando así la bicapa lipídica. El microtransporte a través de la membrana se puede clasificar en dos tipos: • Transporte pasivo, que no precisa de energía para el transporte y en el que la dirección de este siempre está a favor del gradiente de concentración. • Transporte activo, que requiere de energía para intercambiar los solutos, ya que la dirección del transporte va en contra del gradiente. 169 Transporte pasivo En este tipo de transporte las sustancias se mueven espontáneamente a través de la membrana, impulsadas por fuerzas de gradiente de concentración, o gradiente electroquímico. El transporte pasivo se denomina difusión simple cuando es un movimiento que no implica proteínas especializadas de membrana, sino solo una difusión a través de la doble capa lipídica. En cambio, lo llamamos difusión facilitada cuando está facilitado por proteínas de membrana (canales o proteínas transportadoras). Difusión simple Como hemos indicado, la difusión simple es el transporte a favor de gradiente desde el lado de la membrana donde hay una alta concentración de soluto, hacia el lado con una baja concentración, sin necesidad de ningún transportador en la membrana. Algunas sustancias como los gases (O , N , CO ), las moléculas hidrófobas (benceno) y las sustancias 2 2 2 hidrófilas polares, pero no cargadas (el agua y los alcoholes), presentan liposolubilidad, por lo que pueden pasar directamente a través de la doble capa lipídica y difundir a través de la membrana. En cambio, las sustancias polares grandes no cargadas (como la glucosa) y los iones son incapaces de difundir entre las moléculas lipídicas (fig. 4-1). Por lo tanto, la difusión simple es un proceso relevante para el transporte de moléculas pequeñas y poco polares. La difusión simple tiende al equilibrio de concentraciones; es decir, una vez que se igualan las concentraciones a ambos lados de la membrana, la difusión se para. Como se explicará después, el gradiente de concentración es la fuerza impulsora del transporte. Varios son los factores que afectan a la difusión simple: • Tamaño del soluto: cuanto más pequeño es el soluto, más fácil será atravesar la membrana y penetrar entre las moléculas de fosfolípidos. • Polaridad: debido a la composición lipídica de la membrana plasmática, las moléculas no polares se disuelven con más rapidez en la fase hidrófoba y, así, pueden atravesar más rápidamente la doble capa de lípidos, mientras que las moléculas polares son repelidas. • Liposolubilidad: se mide por el cociente de reparto K , que corresponde al cociente entre la solubilidad del soluto r en aceite y su correspondiente solubilidad en agua. Cuanto más liposoluble sea el soluto, mayor será el cociente de reparto. La permeabilidad de la membrana plasmática a una molécula aumenta paralelamente a su cociente de reparto (fig. 4-2). • Gradiente de concentración: el gradiente de concentración mide la diferencia de concentración entre los dos lados separados por la membrana plasmática. Se refiere a la fuerza impulsora de la difusión, de forma que, lógicamente, cuanto más grande es el gradiente, mayor es la difusión. 170 • Carga: las sustancias cargadas tienen una mayor dificultad a la hora de penetrar en la fase hidrófoba de la bicapa lipídica. Por esta razón, en los ácidos y bases débiles, las formas no disociadas difunden con más facilidad. FIGURA 4-1 Permeabilidad relativa de la membrana plasmática a diferentes moléculas. FIGURA 4-2 Representación del cociente de reparto de algunas moléculas frente a su permeabilidad. Obsérvese que los solutos que poseen un similar cociente de reparto no son igualmente permeables debido a la diferencia de tamaño. La permeabilidad de una sustancia es un parámetro determinado experimentalmente que depende de las características del soluto, además del espesor y la composición de la membrana. La permeabilidad es directamente proporcional al cociente de reparto K : cuanto más liposoluble es la sustancia, más fácil es que difunda a través de la r membrana. La permeabilidad mide la velocidad a la que una sustancia atraviesa la membrana. En la tabla 4-1 se muestra la permeabilidad para diferentes solutos. Tabla 4-1 Permeabilidad (P) de la membrana plasmática para algunos solutos Sustancia P (m/s) H2 O 10-4 Urea 10-6 171 Cl– 10-6 K+ 10-10 Na+ 10-12 Como ya se ha apuntado en el capítulo anterior, la propia composición de la membrana plasmática desempeña también un papel importante en la permeabilidad. Una alta proporción de colesterol confiere a la membrana una menor permeabilidad y una mayor coherencia mecánica para que sea una barrera más eficaz. Por ejemplo, la membrana de las células epiteliales de la rama ascendente del asa de Henle posee una composición con niveles elevados de colesterol, lo que le confiere una impermeabilidad al agua fisiológicamente relevante en el proceso de reabsorción renal. Para comprender completamente el transporte de solutos a través de la membrana, necesitamos entender también la difusión del agua; de hecho, entre las células, es la sustancia que más difunde entre el exterior y el interior celular. En el caso del agua, su concentración a ambos lados de la membrana es esencialmente la misma y, al ser una molécula sin carga, no se ve influida por el potencial de membrana. La difusión del agua a través de la membrana posee un comportamiento diferente a la difusión simple de solutos, ya que aquella atraviesa la membrana en respuesta a una diferencia en la concentración de solutos, difundiendo desde el lado de menor concentración de solutos al lado de mayor concentración. Esta difusión del agua es lo que se conoce como ósmosis, que se define como el movimiento de agua que se produce cuando hay un cambio de osmolaridad (osmolaridad = número de moles de solutos total/volumen); es decir, cuando la concentración de solutos cambia a ambos lados de la membrana con el fin de igualar la concentración en el líquido intra- y extracelular. En la figura 4-3, se comparan la difusión simple y las ósmosis. Para entender las diferencias entre ambos procesos, planteemos el siguiente experimento: supongamos que, en un tubo en forma de «U», se separan dos compartimentos (A y B) mediante una membrana permeable a solutos. Si la concentración inicial de solutos en A es mayor que en B, estos tenderán a pasar por difusión simple del compartimento A al B para igualar las concentraciones. Imaginemos ahora que, entre los dos compartimentos, hay una membrana no permeable a solutos. En este caso, el agua pasará del compartimento B al A, con el fin de igualar las concentraciones de soluto en ambos compartimentos. Por lo tanto, podemos decir que la dirección del agua, debido al efecto osmótico, va desde el medio con una menor concentración de solutos al de mayor concentración. 172 FIGURA 4-3 Diferencia entre difusión de solutos y ósmosis. A. En la difusión, los solutos son permeables a la membrana y se mueven según el gradiente de concentración. B. En la ósmosis, la membrana no es permeable a los solutos y el agua se mueve desde el lado con menos concentración de solutos al de mayor concentración, hasta igualar las concentraciones a ambos lados. La tendencia del agua a difundir se contrarresta por la presión de la columna de agua. (Ilustración de: E. Maldonado.) El movimiento del agua a través de la membrana está relacionado con la osmolaridad. La concentración de solutos suele ser mayor en el interior celular que en el exterior, por lo que el agua tenderá a introducirse en la célula. Esto se debe a que las células necesitan tener una gran cantidad de iones y macromoléculas en su interior, y tienden a ser hipertónicas. La ósmosis tiene gran importancia fisiológica por los siguientes motivos: • Cuando la concentración extracelular de solutos aumenta (p. ej., debido a una pérdida de agua, convirtiéndose en una solución hipertónica), el agua difunde al exterior por ósmosis, haciendo que las células se deshidraten y encojan, lo que altera su función. • Cuando la concentración extracelular de solutos disminuye (p. ej., debido a dilución, convirtiéndose en una solución hipotónica), el agua difunde osmóticamente hacia el interior de las células, haciendo que se hinchen y pudiendo provocar así la rotura de la membrana y, por lo tanto, causando lisis celular (fig. 4-4). 173 FIGURA 4-4 Efecto de la diferencia de osmolaridad entre las células y el líquido extracelular. En soluciones hipertónicas (con mayor osmolaridad que la que posee el interior celular), el agua sale de la célula por ósmosis y la célula se deshidrata. En soluciones hipotónicas (con menor osmolaridad que la celular), hay una entrada de agua que hincha la célula y puede provocar lisis. En soluciones isotónicas (de igual osmolaridad que la celular), no ocurre ninguno de estos efectos. (Ilustración de: E. Maldonado.) El mecanismo por el cual las células solucionan el problema de la elevada osmolaridad es el bombeo hacia el exterior de iones inorgánicos mediante transporte activo, reduciendo así la diferencia en la concentración de iones a ambos lados de la membrana. Esta es la función principal de la bomba Na /K ATPasa, que se explicará más adelante. + + Difusión facilitada La membrana plasmática contiene proteínas integrales que permiten el paso de sustancias que no lo conseguirían (o lo harían de modo extremadamente lento) por difusión simple. Las proteínas que se encargan de la difusión facilitada pueden ser de dos tipos: • Poros o canales de membrana: son canales cuyo interior es hidrófilo, permitiendo el paso de solutos sin que haya un cambio de conformación en la proteína. • Transportador proteico (o permeasas): poseen un lugar donde los solutos se unen a la proteína transportadora (sin establecer enlaces covalentes), induciendo un cambio de conformación que permite el traslado de aquellos al otro lado de la membrana. Canales de membrana Los canales de membrana (fig. 4-5) permiten el paso de moléculas de pequeño tamaño y carga apropiada. Su apertura suele estar regulada, es decir, no se trata simplemente de poros a través de los cuales atraviesan indiscriminadamente las moléculas a favor de gradiente. Se han descrito tres tipos de canales: canales iónicos, acuaporinas y porinas. 174 FIGURA 4-5 Canal de membrana (flecha). Los canales forman poros hidrófilos que permiten el flujo de sustancias que no pueden atravesar la doble capa por difusión simple. (Ilustración de: E. Maldonado.) Canales iónicos Los canales iónicos llevan a cabo un transporte rápido de determinados iones. La estructura proteica del interior del poro está formada por aminoácidos de cadena lateral hidrófila que permiten el paso selectivo de un soluto. De hecho, existe una gran variedad de canales especializados en el transporte de determinados iones, como K , Na , Cl o Ca . + + – 2+ Estos canales no siempre están abiertos, sino que son regulados por diferentes mecanismos que permiten o no su apertura. La regulación de la apertura de los canales iónicos puede provenir de la unión de moléculas extracelulares o de la activación de determinadas cascadas de señalización intracelulares. Existen muchos mecanismos de regulación intracelular, entre los que destacan la unión de metabolitos y ligandos intracelulares (p. ej., AMPc), la fosforilación de los canales o la endocitosis de los canales en vesículas (haciéndolos desaparecer así de la membrana). Según el tipo de regulación, los canales iónicos se pueden dividir en distintos grupos: • Canales mecanosensibles: operan por fuerzas mecánicas y abundan en los mecanorreceptores de la piel y en los cilios de las células ciliadas del oído interno, entre otras localizaciones. El movimiento de los cilios induce un cambio en el citoesqueleto de la célula, lo cual provoca un efecto de tracción mecánica sobre las compuertas del canal, que regula la apertura o el cierre del mismo (fig. 4-6). • Canales quimiosensibles: se regulan mediante la unión de un ligando al canal (que actúa a la vez como un receptor) y son fundamentales en la transmisión sináptica, donde se denominan «canales ionótropos». Cuando se une el ligando, los canales quimiosensibles cambian su conformación, haciendo que este se abra o se cierre, 175 controlando así el flujo de un ión específico (fig. 4-7). Por ejemplo, cuando la acetilcolina se une al sitio específico en los canales de Na de la membrana de la célula postsináptica, estos se abren y permiten la entrada de dicho ión, + generando la despolarización de la membrana. • Canales dependientes de voltaje: son esenciales en la transmisión y propagación de los potenciales de acción en los axones de neuronas y células musculares. Cuando se produce un cambio en el potencial de membrana, se altera la carga eléctrica de los aminoácidos de dichos canales, lo que se traduce en un cambio conformacional que provoca la apertura de los mismos. La regulación de este tipo de canales se explica con más detenimiento en el apartado «Importancia de los canales iónicos en la generación del potencial de membrana». • Canales de las uniones de tipo gap: este tipo de estructuras, también conocidas con el nombre de «uniones en hendidura» o «nexos», están formadas por numerosos canales y están implicadas en la comunicación intercelular, pues permiten el paso de iones y macromoléculas (de peso molecular < 2.000 Da) entre dos células vecinas. La estructura de las uniones de tipo gap se explica con mayor detalle en el capítulo 6. Este tipo de canales constituye la unidad funcional de la sinapsis eléctrica, que es 1.000 veces más rápida que la química. Estas uniones abundan en el tejido neuronal y en otros tejidos donde se precisa un rápido acoplamiento celular de tipo metabólico y eléctrico, como en los cardiomiocitos del corazón, donde actúan para coordinar y sincronizar la contracción muscular y la actividad eléctrica cardíaca. 176 FIGURA 4-6 Canales mecanosensibles. A. Imagen de microscopio electrónico de barrido de dos haces de cilios del oído medio. (Procedente de Holt JR, Corey DP. Two mechanisms for transducer adaptacion in vertebrate hair cells. Proc Natl Acad Sci, 97(22):11730-5@2000 National Academy of Sciences, USA.) B. Representación esquemática de los cilios. La imagen aumentada muestra la íntima relación entre los filamentos del citoesqueleto y los canales de membrana. Según la dirección de la oscilación de los cilios, los filamentos se tensan o se relajan y, en consecuencia, los canales se abren o se cierran. (Ilustración de: E. Maldonado.) FIGURA 4-7 Canales quimiosensibles. Estructura del canal de sodio regulado por el ligando acetilcolina (Ach). Este canal constituye un receptor colinérgico nicotínico. La unión del ligando provoca la apertura del canal y el flujo de iones Na+. (Ilustración de: E. Maldonado.) Muchas enfermedades se asocian a defectos en el funcionamiento de los canales iónicos, como la fibrosis quística (alteración de canales de Cl ), algunos tipos de epilepsia (alteración de canales de Na y K ), enfermedades – + 177 + cardiovasculares (alteraciones de canales de Ca ) y neuromusculares, como la enfermedad de Lambert-Eatons + (presencia de anticuerpos contra canales de Ca presinápticos) o la miastenia gravis (presencia de anticuerpos contra + canales de Na regulados por la acetilcolina en la unión neuromuscular). + Acuaporinas A pesar de que la membrana puede tener cierta permeabilidad al agua, permitiendo que esta la atraviese mediante difusión simple, varios estudios fisiológicos señalaron que, en algunos tejidos (como el túbulo renal, las glándulas secretoras o los eritrocitos) la permeabilidad al agua es mucho mayor de lo que sería explicable por difusión simple. Se dedujo, entonces, que tenía que haber canales especializados, selectivos para el paso del agua, que permitieran un transporte regulable y controlado. Esta idea se comprobó con el descubrimiento, a cargo de Peter Agre y Roderick Mackinnon (Premios Nobel de Química en 2003), de los canales de agua conocidos como acuaporinas (AQP), donde el movimiento de agua se rige por el gradiente osmótico. Hoy en día, se sabe que ambos mecanismos (difusión simple a través de la membrana y flujo a través las AQP), regulan el paso de moléculas de agua en las células (fig. 4-8). FIGURA 4-8 Canal de agua. Obsérvese cómo las moléculas de agua se trasladan simultáneamente en cadena. Es importante señalar que los dos mecanismos son diferentes desde el punto de vista biofísico. La difusión simple es un proceso de movimiento bidireccional con baja capacidad, mientras que los canales de agua poseen una alta capacidad y especificidad. Un aspecto importante de las AQP es que permiten el paso de agua, pero impiden el paso de protones. Como se sabe, los protones existen en los fluidos en forma de ión hidronio (H O ); en los riñones, se 3 + filtran cada día en el glomérulo y se reabsorben 180 l de agua en los conductos renales (de hecho, de no reabsorberse moriríamos por deshidratación). La reabsorción de agua tiene lugar por medio de AQP, que no permiten el paso de protones, ya que, si se reabsorbieran también estos, el cuerpo sufriría de acidosis. 178 Hasta hoy, se han identificado 13 acuaporinas (AQP0-AQP12) en diferentes tejidos. Se encuentran principalmente en el riñón, siendo también abundantes en eritrocitos, epitelio intestinal, células gliales del cerebro, etc. Las AQP forman un poro central a través del cual pasa la molécula de agua (fig. 4-9). El tipo más abundante de acuaporinas es la AQP1. Se trata de un complejo tetramérico compuesto por cuatro canales de agua. Cada monómero consta de 6 hélices α transmembrana con una secuencia conservada de aminoácidos en tándem, la cual incluye secuencias aminoacídicas «asparragina-prolina-alanina» (NPA) (v. fig. 4-9). FIGURA 4-9 Acuaporinas. A. El dibujo superior demuestra la estructura abierta o lineal de la AQP1; consta de 6 hélices transmembrana, con un tándem de aminoácidos conservados: el motivo NPA. El dibujo inferior muestra la forma de un canal plegado: el poro se forma por la unión de los motivos NPA. B. Imagen de inmunohistoquímica para localizar AQP1 (en color marrón) en los túbulos contorneados proximales del riñón. Las AQP son canales esenciales para el intercambio de agua, la regulación osmótica del medio interno y la absorción de agua a nivel intestinal y renal. En el riñón, el órgano encargado de la homeostasis hídrica, se expresan al menos seis tipos de AQP. La AQP1 es muy abundante en la membrana del túbulo proximal, donde se reabsorbe gran cantidad de agua filtrada en el glomérulo renal. 179 La AQP2, en cambio, es abundante en la membrana basolateral del conducto colector. Como todas las acuaporinas, la AQP2 facilita el transporte y la reabsorción de agua; en este caso, lo hace en el último tramo de la nefrona, antes de ser excretada como orina completa. La captación de dicha cantidad de agua (la denominada «oferta distal») depende de la presencia (regulable) de los canales de AQP2 en la membrana apical, lo que depende a su vez de la acción de la hormona antidiurética (ADH, del inglés antidiuretic hormone). La ADH es una hormona producida en los núcleos supraóptico y paraventricular del hipotálamo. Esta hormona, conocida también como «vasopresina», se libera en la hipófisis hacia el torrente sanguíneo y es reconocida por receptores presentes en la membrana basolateral de las células de los conductos colectores, donde regula la absorción de agua procedente del filtrado glomerular. La membrana apical de estas células es impermeable al agua en ausencia de ADH, pero la membrana basolateral es siempre permeable. El receptor V2 de la ADH, situado en la membrana basolateral de los conductos colectores, se une a la hormona y desencadena una respuesta intracelular que implica una elevación citoplasmática de AMPc. Esta situación activa una cascada de señales intracelulares que dan lugar a la fusión de vesículas en cuya membrana estaba «secuestrada» la AQP2, con la membrana apical de las células. Una vez que la AQP2 está en la membrana apical, esta se vuelve permeable al agua y, por efecto osmótico, promueve el paso de agua desde la luz de los conductos colectores hacia la sangre, lo que resulta en un aumento de la concentración de la orina. Una vez que el efecto de la hormona ha terminado, las vesículas se vuelven a internalizar por endocitosis y la AQP2 vuelve a ser «secuestrada» en el interior de la célula, restableciéndose así la impermeabilidad apical de la membrana (fig. 4-10). Cuando existe una alteración en esa secuencia, se da un cuadro de diabetes insípida. Un tipo de diabetes insípida es la nefrógena, que, si es congénita, aparece cuando se producen mutaciones en el gen que codifica para el receptor de la hormona ADH. Esta enfermedad puede ser también adquirida como consecuencia de cualquier otra causa que perjudique la regulación de AQP2. El cuadro general implica poliuria o exceso de orina muy diluida; de ahí proviene el nombre de «insípida», a diferencia de la diabetes mellitus, donde la orina es «dulce» debido a la gran eliminación de glucosa. FIGURA 4-10 Regulación del paso de agua a través de AQP2 en la membrana de las células epiteliales de los conductos colectores renales mediante la hormona ADH (vasopresina). Esta hormona permite la fusión de vesículas citoplasmáticas en las que se mantenía «secuestrada» AQP2, con la membrana plasmática, permitiendo así el flujo de agua. Porinas 180 Las porinas se ubican en la membrana externa de las mitocondrias, los cloroplastos y de muchas bacterias. Constituyen poros de gran tamaño formados por proteínas que atraviesan varias veces la membrana. El interior de estos poros está formado por aminoácidos de cadena lateral hidrófila, mientras que la parte externa transmembrana está constituida por aminoácidos no polares e interacciona con el interior hidrófobo de la membrana. Las porinas son canales bastante inespecíficos que permiten el paso de solutos hidrófilos de hasta 5.000 Da (por lo tanto, de iones y de algunas macromoléculas), cuya función en el paso de sustancias a través de la membrana mitocondrial externa se explica en el capítulo 11. Difusión facilitada por proteínas transportadoras Muchas sustancias hidrófilas que no pueden atravesar la doble capa lipídica por difusión simple o por canales, lo hacen por difusión facilitada (es decir, sin gasto energético) por medio de transportadores proteicos denominados permeasas. El modelo de funcionamiento de estos transportadores se basa en que la proteína alterna entre dos conformaciones, de modo que la unión del sustrato induce un cambio de conformación para que la sustancia a transportar pase de un lado a otro de la membrana (fig. 4-11). El transporte mediante proteínas transportadoras se caracteriza por lo siguiente: • Especificidad de sustrato: cada transportador transporta únicamente una molécula o un grupo de moléculas de la misma categoría (isómeros). El transporte implica la unión del sustrato a un lugar específico del transportador. La especificidad se determina por el encaje preciso entre el soluto y el sitio específico para la proteína transportadora. • Reversibilidad según el gradiente: el transporte es bidireccional, de modo que la dirección se determina dependiendo del gradiente de concentración a ambos lados de la membrana. • Saturación: las proteínas que llevan a cabo el transporte se saturan cuando la concentración de solutos llega a un nivel determinado. • Inhibición competitiva: algunas sustancias que poseen analogía estructural con el soluto compiten por la unión a la proteína transportadora. 181 FIGURA 4-11 Representación esquemática de un transportador de membrana. Los transportadores poseen dos conformaciones, una abierta hacia el exterior celular y otra abierta hacia el interior, permitiendo así el paso de los solutos de un lado a otro de la membrana. (Ilustración de: E. Maldonado.) La cinética del transporte es diferente a la de la difusión simple o a la de los canales, ya que no es lineal, sino hiperbólica (fig. 4-12); es decir, que cuando el número de solutos aumenta, la tasa de transporte lo hace también, hasta llegar a un límite donde las permeasas se saturan y se mantiene en un nivel máximo y constante de transporte. Se puede establecer, por lo tanto, una similitud entre las proteínas transportadoras y las enzimas, debido a las características mencionadas anteriormente. En este sentido, los transportadores catalizan un proceso de transporte de solutos de un lado a otro de la membrana, donde, primero, el sustrato (S) se une al sitio de unión específico de la proteína (formando un complejo intermediario) y, finalmente, se libera el sustrato (que equivaldría al producto de la reacción enzimática): Como en cualquier reacción enzimática, el transporte se caracteriza por una velocidad máxima (V ) y una constante máx (K ), que corresponde a la concentración del sustrato en la que la tasa de la reacción llega a la mitad de su máxima m capacidad. La cinética del transporte se ajusta así a la ecuación de Michaelis-Menten: K es un medidor de la afinidad que presenta el transportador por el sustrato: cuanto más pequeño sea el valor, más m afinidad tendrá para unirse a él. 182 FIGURA 4-12 Diferencia entre la cinética de la difusión simple (lineal) y de la difusión facilitada (hiperbólica). En la difusión simple, la tasa de transporte aumenta en paralelo al aumento de la concentración del soluto, mientras que en la difusión facilitada la tasa llega a una velocidad máxima. Se puede establecer una clasificación de las permeasas (válida también para transportadores de tipo activo indirecto, como se explicará más adelante) en función del modo en que se transportan los solutos (fig. 4-13): • Transporte de tipo uniporte, que corresponde al transporte de un soluto, como ocurre con el transporte de glucosa a través de GLUT (del inglés glucose transporter). • Transporte de tipo acoplado (o cotransporte), donde se produce el transporte simultáneo de dos solutos. Este, a su vez, puede ser: ○Simporte: los dos solutos se transportan en el mismo sentido. Un ejemplo de simporte es el transporte de Na /glucosa, que se analizará más adelante. + ○Antiporte: los dos solutos se transportan en sentidos opuestos. Un ejemplo de antiporte es el transporte de HCO /Cl , que se produce en el intercambiador aniónico del eritrocito y que ya se estudió en el capítulo 3. – 183 3– FIGURA 4-13 Diferencia entre el uniporte y el transporte acoplado. A. El uniporte implica el transporte de una única sustancia. B. El transporte acoplado implica el movimiento simultáneo de dos solutos; el movimiento puede ser en la misma dirección (simporte) o en dirección opuesta (antiporte). (Ilustración de: E. Maldonado.) Los transportadores de glucosa representan una clase paradigmática de transportadores de difusión facilitada por permeasas. La glucosa es un sustrato metabólico de importancia capital en las células animales que, en gran medida, se obtiene del exterior celular. Hay dos grandes familias de proteínas encargadas del transporte de glucosa: los cotransportadores dependientes de Na y las proteínas facilitadoras de tipo uniporte. + Los cotransportadores dependientes de sodio (SGLT, del inglés sodium-glucose transporter) son sistemas de transporte activo indirecto (o secundario) que aprovechan el gradiente de entrada del Na para introducir glucosa del + exterior en contra de su gradiente (se estudian con detenimiento en el apartado «Transporte activo indirecto»). Dicho de otro modo, la incorporación de glucosa en contra de gradiente al interior celular depende de la energía de arrastre del Na en favor de gradiente. Estos cotransportadores se encuentran en las membranas de las células epiteliales + polarizadas del intestino y los túbulos renales. Las proteínas facilitadoras del uniporte de glucosa se denominan transportadores GLUT y realizan un transporte pasivo de glucosa. En cuanto al modelo de función, la teoría más aceptada es la del modelo de alternancia de conformación. El transportador solo tiene capacidad para transportar una molécula de glucosa en cada ciclo, y cada transportador tiene dos conformaciones: una con el sitio de unión de glucosa expuesto al exterior, y otra con el sitio de unión expuesto hacia el citosol. La unión de glucosa en el sitio específico provoca un cambio de conformación que determina su transporte al interior y la liberación de la molécula de glucosa. Hasta hoy, se han descrito 13 tipos de GLUT que se numeran según el orden cronológico de su descubrimiento. Cada uno de estos transportadores está codificado por un gen independiente, y cada tipo de GLUT interviene de modo distinto en el metabolismo de la glucosa. Esta diversidad viene determinada por el patrón de expresión tisular, el nivel de especificidad del sustrato, la cinética del transporte y la regulación de la expresión en diferentes condiciones fisiológicas. GLUT1, GLUT3 y GLUT4 tienen alta afinidad por la glucosa. Debido a que la constante de Michaelis-Menten es menor que la concentración normal de glucosa, estos transportadores siempre funcionan con una tasa próxima a la máxima velocidad. Así, el transporte de glucosa viene limitado por el nivel de expresión tisular. En 184 contraste, la tasa del transporte de glucosa mediada por GLUT2 (K = 17 mM) aumenta en paralelo con el aumento de m los niveles de la glucosa sanguínea (fig. 4-14). FIGURA 4-14 Tasa de captación de glucosa en función de su concentración extracelular. Tanto GLUT1 como GLUT2 poseen una alta tasa de transporte en comparación con la difusión simple. GLUT1 posee una mayor velocidad de transporte que GLUT2, pero también se satura más rápidamente a concentraciones bajas de glucosa. La velocidad de transporte de GLUT2 es menor que la de GLUT1, pero aumenta gradualmente con el aumento de la concentración de glucosa. Los transportadores de alta afinidad se ubican en todos los tejidos, pero su expresión es elevada en células con actividad glucolítica. Por el contrario, GLUT2 (transportador de baja afinidad) se encuentra en tejidos cuya función es crítica en la homeostasis de la glucosa, como por ejemplo el hígado, las células β pancreáticas, el riñón y el intestino. Debido a su elevada K , cuando la glucemia (nivel de glucosa en sangre) sube de 5 mM (nivel basal) a 10 mM, la tasa m de transporte de glucosa casi se duplica en células que expresan GLUT2, mientras que, en células con GLUT1, la tasa aumenta ligeramente (v. fig. 4-14). Esto tiene una consecuencia fisiológica de gran importancia, ya que los tejidos que expresan GLUT2 se encargan de almacenar el exceso de glucosa circulante (como es el caso del hígado) o detectar el aumento de glucemia (como en las células β pancreáticas, que entonces liberan insulina) para disminuir la cantidad de glucosa en sangre. GLUT4 se expresa en el músculo esquelético y los adipocitos. Aunque tiene alta afinidad por la glucosa y funciona a la máxima velocidad, la regulación de la captación de glucosa por GLUT4 viene dada por los niveles de transportador presentes en la membrana plasmática, que están regulados por la acción de la insulina. Las células musculares esqueléticas y los adipocitos responden a la insulina exponiendo el transportador GLUT4 en su membrana plasmática, aumentando así la captación de la glucosa. Los transportadores GLUT4 se mantienen «secuestrados» en vesículas del citoplasma celular en ausencia de insulina en sangre (un sistema parecido al de ADH/AQP2). Tras la liberación de insulina (en situación de hiperglucemia) y su unión a receptores específicos en células de músculo esquelético y adipocitos, se produce una fusión rápida de las vesículas que contienen GLUT4 con la membrana plasmática, que expone dichos transportadores para que puedan introducir la glucosa. La importancia de este fenómeno reside en que, tras la ingesta de alimentos, se reduce la hiperglucemia y la glucosa se almacena en estos tejidos en forma de glucógeno (en el caso del músculo estriado) o triglicéridos (en el caso del tejido adiposo). 185 La disfunción de GLUT4 se asocia a la diabetes mellitus de tipo 2. A diferencia de la diabetes mellitus de tipo 1, donde la hiperglucemia se origina normalmente por destrucción autoinmune de las células β del páncreas, con la consiguiente falta de producción de insulina, en la diabetes mellitus de tipo 2, los niveles de insulina pueden ser normales o incluso elevados. Este tipo de diabetes se produce porque las células musculares esqueléticas y del tejido adiposo se vuelven resistentes al efecto de la insulina. En pacientes con este tipo de diabetes, la insulina no es capaz de estimular la fusión de las vesículas citoplasmáticas que contienen GLUT-4, debido a que los receptores de insulina se vuelven insensibles, lo que ocasiona hiperglucemia. Los mecanismos por medio de los cuales se desarrolla esta resistencia no se conocen bien, pero están relacionados con alteraciones en el metabolismo y con una predisposición genética. De hecho, la diabetes mellitus de tipo 2 se asocia a obesidad y sedentarismo, responsables de la alteración metabólica que, al menos en gran medida, origina la resistencia a la acción de la insulina. Así, el consumo de una dieta hipocalórica, junto con una disminución del peso y un aumento del nivel de ejercicio, pueden revertir los niveles anormales de glucemia en un porcentaje elevado de dichos pacientes, sin necesidad de tomar ninguna medicación. En este sentido, es interesante conocer que el ejercicio aumenta la expresión de transportadores GLUT4 en el músculo y favorece la fusión de vesículas que contienen GLUT4 con la membrana plasmática, induciendo así la captación de la glucosa. GLUT1 desempeña un importante papel en la captación de glucosa en el cerebro. La glucosa es el nutriente principal del cerebro y GLUT1 es el único vehículo por el que esta atraviesa la barrera hematoencefálica, ya que dicho transportador se expresa en el endotelio de los capilares que forman esta barrera. De hecho, algunas mutaciones que afectan al gen que codifica para GLUT1 perjudican seriamente la captación de glucosa. Tales mutaciones causan un síndrome, descubierto en 1991, denominado síndrome de la deficiencia de GLUT1. El síndrome se caracteriza por episodios epilépticos de convulsiones en recién nacidos y retraso mental y del desarrollo. Las manifestaciones clínicas aparecen ya en la infancia, pues el cerebro en desarrollo tiene una gran demanda de glucosa. El diagnostico de esta enfermedad se confirma mediante una punción lumbar y el análisis directo de la secuencia del gen GLUT1. 186 Transporte activo Como ya se ha explicado, los transportadores facilitan el transporte pasivo de las moléculas a través de la bicapa lipídica. Sin embargo, no siempre podemos contar con que vaya a existir un gradiente que garantice el transporte pasivo. Es por esto que las células disponen de unas proteínas de membrana capaces de realizar su función en contra del gradiente electroquímico de la membrana, en un proceso denominado transporte activo. Este transporte es energéticamente desfavorable (endergónico) y, por ello, siempre va acoplado a reacciones que liberan la energía requerida por el transportador para llevar a cabo el traslado del sustrato. Entre las distintas reacciones que proporcionan energía están la hidrólisis de ATP, la oxidación de sustratos en la fosforilación oxidativa o la disipación de un gradiente iónico que, en definitiva, también es muchas veces fruto de la hidrólisis de ATP, como se verá más adelante. El transporte activo es unidireccional (no cambia su sentido), mientras que la difusión pasiva, que depende del gradiente electroquímico, irá en una dirección u otra (hacia el líquido extra- o intracelular) en función del valor neto del gradiente. El transporte activo genera y mantiene un gradiente iónico que es la causa de la diferente concentración iónica, necesaria para la vida, a cada lado de la membrana. Además, permite que la célula incorpore o elimine sustancias independientemente de la concentración de las mismas; es decir, con independencia de si es o no un proceso energéticamente favorable. El transporte activo se puede clasificar en directo o indirecto, en función de la fuente de obtención de la energía que necesita para ser puesto en funcionamiento. La hidrólisis del ATP está asociada al transporte activo directo, mientras que la disipación de un gradiente iónico lo está con el transporte activo indirecto. Transporte activo directo Como hemos indicado, el transporte activo directo obtiene la energía que necesita de la hidrólisis de ATP. Existen distintas ATPasas con capacidad para hidrolizar el ATP, que se exponen a continuación. ATPasa P La ATPasa P (del inglés phosphorylation) es una proteína integral de membrana que se fosforila reversiblemente por ATP. Los distintos subtipos de ATPasa P se asemejan mucho en su secuencia de aminoácidos, en especial en aquellos residuos próximos al aspartato, que es donde resultan fosforiladas. Es sobre este mismo residuo donde se produce la inhibición de las ATPasas por el vanadato, un agente que inhibe todas las ATPasas de tipo P. Como posibles tipos de ATPasas P en el ser humano encontramos la Na /K ATPasa, la Ca ATPasa, la H /K ATPasa y la H ATPasa. Todas + + 2+ 187 + + + ellas, a excepción de la H ATPasa, están formadas por cuatro subunidades, dos α y dos β. Las subunidades α son las + que, al ser fosforiladas, modifican su conformación para formar el canal de paso para los iones. A continuación, comentaremos con mayor detenimiento el funcionamiento de la Na /K ATPasa y la Ca ATPasa. + + 2+ La Na /K ATPasa (también llamada «bomba Na /K ATPasa») es un transportador universal y ubicuo del cuerpo + + + + humano, aunque su número varía en función del tipo celular. Esta ATPasa es responsable de que se mantengan las diferencias en las concentraciones intra- y extracelulares de Na y K , lo cual es necesario para mantener el equilibrio + + osmótico, establecer el potencial de membrana, propagar el impulso nervioso en células excitables y poder realizar el cotransporte de algunos nutrientes junto con el Na (v. apartado «Transporte activo indirecto»). La hidrólisis de ATP + capacita el transporte de dos iones K hacia el líquido intracelular y de tres iones Na hacia el líquido extracelular, en + + contra de gradiente. La Na /K ATPasa presenta dos conformaciones: E1 y E2. En la conformación E1, la proteína está + + abierta hacia el interior celular y presenta afinidad por el Na , mientras que, en la conformación E2, donde se + encuentra abierta hacia el exterior, presenta gran afinidad por el K . En la figura 4-15 se muestra de un modo + secuencial el proceso de expulsión de Na y el de incorporación de K al interior celular en contra de gradiente. En + + primer lugar, la unión de tres iones Na a la proteína en conformación E1 causa la fosforilación de la enzima por ATP, + lo que conlleva un cambio de conformación desde E1 hasta E2. En la conformación E2, los iones Na son liberados + hacia el líquido extracelular. Entonces, dos iones K se unen a la enzima y activan su desfosforilación, lo que provoca + que esta pase de la conformación E2 a la E1, liberándose entonces los iones K en el citoplasma celular. + FIGURA 4-15 Modelo del funcionamiento de la Na+ K+ ATPasa. La bomba alterna entre dos conformaciones: E1 y E2. En la conformación E1, la proteína está abierta hacia el interior celular y presenta afinidad por el Na+, mientras que, en la conformación E2, donde se encuentra abierta hacia el exterior, presenta gran afinidad por el K+. (Ilustración de: E. Maldonado.) Esta bomba iónica es de gran importancia para el organismo, ya que un 25% de la energía total del mismo se invierte en poner en marcha la Na /K ATPasa. Esto es así porque, como ya se ha indicado, resulta imprescindible para + + mantener el potencial de membrana celular, que se ve despolarizado constantemente por otros procesos de transporte. De no realizar su función adecuadamente, la despolarización celular sería la causa del bloqueo de todos aquellos mecanismos que dependen del gradiente natural a cada lado de la membrana, cuya existencia se debe a que las 188 concentraciones de Na en el líquido extracelular (frente al líquido intracelular) y de K en el líquido intracelular (frente + + al medio extracelular) son muchísimo mayores. La actividad de la Na /K ATPasa se puede ver favorecida por determinadas moléculas (como la insulina y las + + catecolaminas) o interrumpida por inhibidores específicos, como la ouabaína (del somalí, «veneno de flecha»). Este compuesto tiene una función experimental en Fisiología, donde se emplean para calcular la energía que consume una célula. Otro compuesto que bloquea la Na /K ATPasa es el digital, procedente de la planta Digitalis purpurea. Este + + compuesto es muy tóxico en altas dosis, pero en dosis terapéuticas se ha usado para el tratamiento de arritmias y de otras alteraciones cardíacas. Actúa inhibiendo la bomba Na /K ATPasa, por lo que se incrementa el Ca intracelular en + + 2+ los cardiomiocitos, ya que, al romperse el gradiente natural de Na , no se produce la salida de Ca mediante el + 2+ intercambiador de transporte activo indirecto Na /Ca (v. apartado «Transporte activo indirecto»). Este compuesto + 2+ tiene, así, un efecto inótropo positivo; es decir, aumenta la fuerza de contracción del músculo cardíaco. Como efecto indirecto, inhibe la bomba Na /K ATPasa a nivel neural, provocando una estimulación vagal. + + Otra ATPasa de tipo P es la Ca ATPasa. Esta bomba se encuentra en la membrana celular bombeando Ca hacia el 2+ 2+ líquido extracelular, y en las membranas del retículo endoplasmático liso (REL) y sarcoplásmico (un tipo de REL de las células musculares especializado en almacenar iones Ca ). Esta ATPasa tiene la importante misión de mantener 2+ bajos los niveles citoplasmáticos de Ca . Los niveles intracelulares de este ión deben ser muy bajos (0,1-0,01 μmol/l) 2+ pues, de lo contrario, se uniría a los P libres dando lugar a fosfato de calcio. Una de las funciones de la Ca ATPasa es 2+ i permitir la adecuada relajación del miocardio a través de la expulsión de Ca citosólico hacia el exterior celular. 2+ Existen hormonas potenciadoras de este transporte, como por ejemplo el calcitriol. Esta es una hormona lipófila de origen esteroideo que actúa sobre distintos órganos, como el intestino, el riñón, la placenta, las glándulas mamarias, los folículos pilosos y la piel, aumentando la expresión de la Ca ATPasa. 2+ ATPasa F La ATPasa F recibe este nombre porque fue identifica como «factor de acoplamiento de energía», es decir, con capacidad para acoplar la energía liberada por la hidrólisis de ATP al impulso de protones contracorriente. Es un transportador activo que puede ser revertido, en cuyo caso el acoplamiento de la energía no es el de aquella liberada por la hidrólisis de ATP, sino el de la liberada como consecuencia del transporte de protones a favor de gradiente. Cuando se utiliza energía liberada por esta reacción para la formación de ATP a partir de ADP + P , denominamos a i esta bomba «ATP sintasa», la cual está presente en la membrana mitocondrial interna (v. capítulo 11). Esta ATPasa tiene un componente de membrana llamado «F0» que es un poro transmembrana de protones, y un componente F1 que protruye hacia el interior de la mitocondria y posee el sitio de unión al ATP. 189 ATPasa V La ATPasa V (vacuolar) se encuentra en vacuolas de hongos y plantas superiores y en los lisosomas, endosomas y complejos de Golgi de las células animales. Acopla la energía del ATP al transporte de protones al interior, mediante el cual se consigue la acidificación de estos compartimentos celulares, superando incluso hasta dos veces la acidez del citosol (pasando así de un pH = 7,5 a uno de 3-6). Los endosomas tardíos y los lisosomas son orgánulos que contienen hidrolasas ácidas (proteasas, nucleasas, lipasas, glucosidasas, fosfatasas, etc.) y que solo son funcionales a pH ácido. Por ello, requieren una bomba de protones que descienda el pH del interior vesicular. Transportadores ABC Los transportadores ABC (de inglés ATP binding cassette) llevan a cabo el transporte de diversas moléculas (con gasto de ATP), como aminoácidos, péptidos, proteínas, iones metálicos, lípidos, así como sales biliares, medicamentos y muchos compuestos hidrófobos que no serían capaces de atravesar la bicapa lipídica de otro modo, o lo harían muy lentamente. Todos los transportadores ABC tienen dos dominios de unión a nucleótidos (NBD, del inglés nucleotidebinding domains) y dos dominios transmembrana. En su mayoría se ubican en la membrana plasmática, pero también se pueden encontrar en la membrana de orgánulos intracelulares, como el retículo endoplasmático, las mitocondrias y los lisosomas. Suelen actuar como bombas; sin embargo, gracias a que el NBD se puede acoplar tanto a bombas como a canales, hay algunos que constituyen canales regulables por la hidrólisis de ATP. Un tipo de transportador ABC es la familia de proteínas llamadas MDR (del inglés multi-drug resistance), o transportadores que confieren a las células resistencia frente a múltiples fármacos. Estos transportadores expulsan xenobióticos, antibióticos y otros tipos de fármacos fuera de la célula. Muchas células tumorales aumentan sus niveles de MDR para poder defenderse de los fármacos antitumorales con los que se trata a los pacientes, lo que constituye un fenómeno de resistencia muy importante para la actuación de estos tratamientos. MDR1, también llamada Pglucoproteína 1, está ampliamente distribuida en el epitelio intestinal, los hepatocitos, el epitelio del túbulo contorneado proximal, la glándula suprarrenal y los capilares del endotelio de las barreras hematoencefálica y testicular. Esta proteína es una bomba que utiliza ATP para expulsar un amplio espectro de compuestos xenobióticos. En las células normales, está involucrada en la defensa contra sustancias dañinas. En las células intestinales, regula el paso de sustancias potencialmente tóxicas. En el riñón, se encarga de la excreción de xenobióticos y de metabolitos tóxicos y, en las barreras hematoencefálicas y hematotesticular, previene el paso de estas sustancias al encéfalo, o a la línea germinal, respectivamente. Las células madre (células de vida larga y expuestas, por lo tanto, a sustancias potencialmente dañinas) suelen poseer una gran expresión de MDR1, actuando así como un mecanismo de defensa. Las células tumorales que expresan MDR1 son resistentes a algunos fármacos antineoplásicos (como la doxorrubicina y la vimblastina), constituyendo así un importante factor de resistencia a estos tratamientos. Otro transportador multifármaco es el MDR2, también conocido como «cMOAT» (transportador canalicular multiespecífico de aniones 190 orgánicos). El MDR2 se expresa en órganos excretores como el riñón y el hígado, donde excreta conjugados que se obtienen al neutralizar productos tóxicos con sustancias como el ácido glucurónico, el sulfato, el acetato o el glutatión, de manera que sean más fáciles de excretar. Otra proteína con importancia clínica y que está estructuralmente relacionada con los transportadores ABC es la llamada CFTR (regulador de la conductancia transmembrana de la fibrosis quística). El gen CFTR codifica para una proteína de canal que permite el paso del Cl , el cual posee una función muy importante en la creación de la – mucosidad respiratoria, el jugo digestivo y el sudor. Esta proteína posee dos dominios con capacidad de hidrolizar el ATP, lo que posibilita la actividad del canal. Cuando esta proteína resulta inactivada por mutaciones, se desarrolla una enfermedad llamada fibrosis quística; en ella, los pacientes no tienen capacidad de expulsar iones Cl . En – individuos sanos, algunas células especializadas del organismo secretan iones Cl para diluir las secreciones. Por – ejemplo, las células epiteliales de las vías respiratorias liberan este ión hacia la luz, lo cual atrae de modo simultáneo a iones Na . Esto provoca un efecto osmótico que arrastra agua desde el líquido intersticial hacia la luz, haciendo que las + secreciones mucosas estén bien hidratadas. La hidratación de las secreciones es esencial para que estas puedan fluir hacia el exterior de las vías respiratorias, llevándose consigo bacterias y agentes nocivos (fig. 4-16). En los pacientes con fibrosis quística, las mutaciones en CFTR pueden afectar de modo diverso a la proteína, pero es frecuente que esta quede retenida en el retículo endoplasmático sin llegar a la membrana luminal de las células, donde desempeña su función. Por lo tanto, no se produce la salida del Cl hacia la luz y, como consecuencia, no hay un arrastre de agua, – haciendo que las secreciones mucosas sean demasiado espesas y no puedan ser expulsadas por el movimiento de los cilios, acumulando así sustancias tóxicas y microorganismos (v. fig. 4-16). Esta acumulación estática dificulta la respiración y favorece la proliferación de bacterias, lo que genera importantes infecciones. Las consecuencias de esta enfermedad son graves, pudiendo incluso causar la muerte de los pacientes. FIGURA 4-16 La fibrosis quística se produce por mutaciones en un transportador de Cl–, lo cual provoca, entre otras cosas, un aumento en el espesor de la mucosidad de las vías respiratorias que dificulta la respiración y causa infecciones. (Ilustración de: A. Calvo.) 191 La ausencia de transporte de Cl también afecta a otros órganos, como el páncreas, acumulándose en él enzimas – digestivas y produciéndose un quimo demasiado ácido que, como consecuencia, produce dispepsia; en las glándulas sudoríparas, la inutilización de los canales produce un sudor con elevada concentración de sal (NaCl); por esta razón, a los niños que padecen esta enfermedad se les conoce como «niños salados». La enfermedad afecta gravemente a la calidad de vida de los pacientes, dificultando sobre todo a la capacidad de respirar y causando infecciones pulmonares recurrentes que pueden requerir un trasplante pulmonar. Se ha reportado que la esperanza de vida se sitúa en torno a los 25-45 años de vida, dependiendo de los países. Transporte activo indirecto El transporte activo indirecto o secundario recibe esta denominación porque traslada el sustrato de un medio a otro aprovechando la energía liberada al equilibrarse un gradiente electroquímico. La mayoría de las proteínas asocian su transporte al gradiente de los iones Na e H . Este ha sido previamente generado gracias al transporte activo primario; + + de no existir este, tampoco lo haría el indirecto. Se pueden diferenciar dos tipos: el cotransporte y el contratransporte. Cotransporte En el cotransporte, ambos sustratos se desplazan en el mismo sentido. Casi siempre se ven propulsados por un gradiente de Na generado por la bomba Na /K ATPasa, que actúa como mecanismo propulsor del transporte activo + + + secundario. Los transportadores Na /glucosa (SGLT, del inglés sodium-glucose transporters) desempeñan un papel + esencial en la absorción de glucosa en el tubo digestivo y en la reabsorción de este azúcar por parte del riñón (fig. 417). El SGLT1 se encuentra, esencialmente, en la membrana apical de los enterocitos del intestino y en las células epiteliales de los túbulos rectos del riñón. En la membrana basolateral del epitelio, la bomba Na /K ATPasa expulsa + + Na fuera de la célula, por lo que se crea un gradiente para la entrada de este ión. En la membrana apical, los + transportadores SGLT incorporan glucosa desde la luz, incluso cuando sus concentraciones son mucho menores en la luz que dentro de las células epiteliales (es decir, en contra de gradiente), aprovechando la energía motriz que proporciona el gradiente de entrada de Na (v. fig. 4-17). De este modo, los enterocitos son capaces de concentrar la + glucosa intracelular, en contra de gradiente, hasta 9.000 veces por encima de la de la luz del intestino. Por lo tanto, el transporte de Na /glucosa es un cotransporte (de ambas sustancias en la misma dirección) activo y de tipo indirecto, al + depender del transporte activo de la bomba Na /K ATPasa, que genera el gradiente de Na . Finalmente, en la + + + membrana basal, la glucosa difunde pasivamente por medio de transportadores GLUT hacia la sangre, que la que transportará hacia el resto de células del organismo. Como este tipo de cotransporte hay otros muchos en el organismo, que transportan aminoácidos y otras moléculas. 192 FIGURA 4-17 Cotransporte de Na+/glucosa. Los transportadores SGLT, situados en la membrana apical, aprovechan el flujo de entrada del Na+ a favor de gradiente para introducir glucosa en contra de gradiente. La glucosa sale por difusión facilitada a través de los transportadores GLUT situados en la membrana basolateral. Contratransporte Funcionan de acuerdo con los principios de transporte activo indirecto explicados anteriormente, aunque, en este caso, el transporte de la molécula va en un sentido mientras que el ión que promueve el transporte sigue el opuesto. Algunos ejemplos de este transporte activo secundario son el transporte de intercambio Na /Ca , en el cual, + 2+ aprovechando el gradiente de entrada del Na , las células expulsan Ca al espacio extracelular; o el intercambiador de + 2+ Na /H , que utiliza un mecanismo similar y tiene importancia en la regulación del pH celular (fig. 4-18). + + FIGURA 4-18 Ejemplos de contratransportes (transporte activo de tipo indirecto o secundario): transporte de intercambio de Na+/Ca2+ y de Na+/H+. (Ilustración de: E. Maldonado.) 193 Importancia de los canales iónicos en la generación del potencial de membrana El transporte de iones a través de proteínas de canal es esencial en la generación del potencial de membrana. El potencial de membrana es la medida del campo eléctrico que existe en el líquido intracelular en contacto con la membrana de todas las células vivas, y se mide en milivoltios (mV). Se produce por una asimetría en la distribución de cargas (iones) a ambos lados de la membrana plasmática, de modo que las células en reposo poseen normalmente un exceso de carga negativa en su interior y un exceso de carga positiva fuera de ellas. El potencial eléctrico que resulta de esta asimetría de cargas se denomina potencial de membrana en reposo (V ). Para medir el potencial de m membrana, se inserta un electrodo en la membrana plasmática hasta el interior de la célula. Después, se coloca otro electrodo en el líquido extracelular y se mide la diferencia de potencial entre el interior y el exterior de la célula utilizando un voltímetro (fig. 4-19). FIGURA 4-19 Medida del potencial de membrana en reposo. (Ilustración de: E. Maldonado.) Las células en reposo tienen un potencial de membrana negativo porque el interior de la célula presenta un exceso de carga negativa; no obstante, no todas las células presentan el mismo potencial de membrana en reposo. La tabla 4-2 recoge valores del potencial en reposo de diferentes células. Tabla 4-2 Valor del potencial de membrana en reposo en distintos tipos celulares Tipos celulares Potencial de membrana en reposo (Vm) Axón gigante de calamar − 60 mV Fibras de músculo liso, enterocitos, hepatocitos, hematíes, células tubulares renales, etc. − 60 mV 194 Axones, miocitos esqueléticos − 80 mV Miocitos auriculares o ventriculares − 90 mV La excitabilidad eléctrica es una propiedad que presentan algunas células, como las nerviosas, las musculares, los islotes de Langerhans, etc. Estas células se caracterizan por tener canales iónicos (de Na , Ca , K o Cl ) que dependen + 2+ + – del voltaje. Ciertos estímulos son capaces de generar un potencial de acción, que consiste en un cambio del V que m siempre es despolarizante; es decir, el potencial de membrana varía de valores negativos a positivos. Tras la despolarización, se produce un período de repolarización, en el cual el potencial de membrana vuelve otra vez a sus valores negativos. La duración de todos estos cambios de voltaje producidos durante el potencial de acción (despolarización y repolarización) es variable, como queda reflejado en la tabla 4-3. Tabla 4-3 Duración del potencial de acción en distintos tipos celulares Tipos celulares Duración del potencial de acción (ms) Axones 1-2 Músculo esquelético 5-10 Músculo liso 50 Nódulo sinoauricular 800 Nódulo auriculoventricular 1.100 Sincitio auricular 150 Sincitio ventricular 250 Haz de His-Purkinje 350 La importancia biológica del potencial de acción en las células del sistema nervioso reside en que actúa transmitiendo señales eléctricas a lo largo del axón, porque es capaz de propagarse a grandes distancias (incluso metros) sin experimentar decremento alguno. Potencial de membrana en reposo (Vm) La composición química del líquido extracelular (LEC) es diferente a la del líquido intracelular (LIC). La solución acuosa de sales que forma el LEC tiene, principalmente, NaCl, y en menor proporción, KCl. En cambio, lo más 195 característico del LIC es que posee K como catión principal (tabla 4-4). Los aniones citoplasmáticos son, + fundamentalmente, macromoléculas que no pueden salir de la célula (proteinatos y ARN, entre otras). Tabla 4-4 Distribución de los iones Na , K y Cl en el LIC y el LEC del axón de calamar y la neurona de mamífero + + – Concentraciones iónicas expresadas en mM Para comprender el porqué del potencial de membrana debemos tener en cuenta tres aspectos importantes: • La dirección de la difusión de las sustancias. Como hemos indicado previamente, la difusión va desde donde los solutos se encuentran más concentrados hacia donde están menos concentrados (gradiente de concentración). El gradiente de un ión viene dado por la distribución asimétrica de las concentraciones del mismo a ambos lados de la membrana, y se expresa como el siguiente cociente: [X] /[X] , donde [X] es la concentración del ión. LEC LIC • La electroneutralidad. Para evitar desequilibrios de carga, los iones que se hallan en soluciones se presentan como pares; es decir, por cada carga de un ión existe un contraión con carga opuesta. El K en el citoplasma actúa como + contraión de los aniones atrapados en el LIC, mientras que el Cl es el contraión del Na en el LEC. – + • Debemos tener en cuenta que el potencial (o voltaje) es la tendencia a atraerse entre sí de los iones con cargas opuestas. La intensidad de la corriente, que se mide en amperios (A), se produce por el movimiento de un ión hacia otro de carga opuesta. La membrana plasmática posee canales de fuga de K , lo que hace que sea permeable a este ión, de tal modo que el + K difunde del LIC, donde está más concentrado, hacia el LEC. Pero la salida de K no está acompañada con la salida + + de sus contraiones intracelulares, ya que la mayoría de ellos son macromoléculas. Por esta razón, la salida de K deja + aniones en el LIC que no están compensados eléctricamente con cationes. Por ello, en el citosol se acumula un exceso de carga negativa, y en el LEC un exceso de carga positiva. La cantidad de K que sale es osmóticamente inapreciable, + pero es relevante desde el punto de vista eléctrico. La membrana plasmática actúa como un dieléctrico, ya que el K + que sale de la célula compensa las cargas negativas del LIC. De esta forma, podemos comprender que la membrana actúa como un excelente condensador cargado con un potencial que se corresponde con el V . En este contexto, se m comprende que el V refleja el trabajo espontáneo que hay que realizar para separar dos iones que deberían estar m juntos en el LIC. El potencial de membrana se puede calcular utilizando la ecuación de Nernst. 196 Debido a la salida de K de la célula, el LIC queda cargado negativamente, generándose de esta forma un potencial + de membrana que tenderá a oponerse a la salida de K . El potencial de membrana neutraliza la tendencia del K a + + difundir a favor de gradiente de concentración. Se trata de un equilibrio electroquímico, es decir, un equilibrio donde el gradiente químico se equilibra con el potencial eléctrico. El potencial de membrana en el equilibrio electroquímico se denomina «potencial de equilibrio». Aunque aproximadamente el 80% del valor del V depende del K , hay otros iones que también participan: Na y Cl . + m + – El Na entra en la célula por un doble gradiente: gradiente de concentración y gradiente eléctrico. La entrada de Na en + + la célula tiene un efecto despolarizante, esto es, hace que el potencial de membrana sea menos negativo. La contribución del Cl al V es pequeña, ya que el Cl que entra en la célula por medio del gradiente de concentración – – m sale a través de sistemas de contratransporte; de ahí que las variaciones que se puedan producir en la concentración de Cl del LEC no afecten prácticamente al V . Además, la entrada de Cl en la célula puede ser repelida por el – – m potencial negativo de membrana, por lo que este anión suele entrar asociado a cationes como el Na . Si aumentara la + permeabilidad celular al Cl , se produciría una hiperpolarización (potencial de membrana más negativo de lo – habitual). Como se ha señalado repetidamente a lo largo del presente capítulo, la bomba Na /K ATPasa es la responsable de + + mantener las diferencias de concentración de Na y de K a través de la membrana celular, ya que, a pesar de que la + + célula sea poco permeable al Na , si este ión continúa entrando, se producirían un hinchamiento y lisis celular por un + efecto osmótico. Netamente, la bomba Na /K ATPasa saca una carga positiva hacia el LEC (transporta dos iones K + + + hacia el LIC y tres iones Na hacia el LEC), haciendo que el exterior sea más electropositivo. Esta actividad electrógena + de la Na /K ATPasa también contribuye en aproximadamente un 5-10% al valor final del V ; si bien es cierto que no es + + m la causa del V , sí es imprescindible, ya que se encarga de restablecer las concentraciones de Na y K . + m + Excitabilidad eléctrica y canales dependientes de voltaje Las células que son excitables eléctricamente poseen canales iónicos dependientes de voltaje, de ahí que, frente a una despolarización de la membrana, este tipo de células responda con la generación de un potencial de acción. En cambio, las células que no son excitables eléctricamente, tras haber sido despolarizadas temporalmente, vuelven a su potencial de reposo. Los canales iónicos de Na y K dependientes de voltaje son los responsables de que se genere el + + potencial de acción. En 1991, el fisiólogo Bert Sakman y el biofísico Erwin Neher (ambos alemanes) recibieron el Premio Nobel en Fisiología o Medicina por el desarrollo de la técnica del patch clamp, que permite medir corrientes iónicas de un solo canal. Para ello, se utiliza una micropipeta con una punta de aproximadamente 1 μm de diámetro; se presiona y se realiza una suave succión, de modo que se pueda conseguir bajo la punta de la pipeta una superficie de membrana 197 que esté aislada del medio circundante. Esta superficie de la membrana es lo suficientemente pequeña como para que tan solo se encuentre en ella un canal o, en su defecto, unos pocos. La técnica se realiza a un voltaje fijo que se consigue aplicando un pulso despolarizante, de modo que el potencial de membrana sea constante a pesar de que las propiedades eléctricas de la membrana cambien (fig. 4-20). La aplicación de esta técnica ha demostrado que, al abrirse un canal de Na , este conduce siempre la misma cantidad de + corriente. Por lo tanto, no existen estados en los que un canal se halle parcialmente abierto o cerrado de modo que conduzca más o menos corriente; en este sentido, sigue la ley del todo o nada: el canal está abierto o cerrado. En el caso de los canales de Na dependientes de voltaje, al fijar el potencial de membrana en +50 mV, se genera una corriente de + 1 pA (10 A). –12 FIGURA 4-20 Técnica del patch clamp. Esta técnica permite medir la corriente iónica que fluye únicamente a través de uno o dos canales. (Ilustración de: E. Maldonado.) Los canales de Na dependientes de voltaje (CNaDV) son monómeros proteicos con cuatro dominios separados. En + el caso de los canales de K dependientes de voltaje (CKDV) nos hallamos ante proteínas multiméricas (varias + subunidades proteicas separadas que se asocian entre sí). Ambos canales poseen un poro central, para que los iones puedan circular. Cada subunidad (o dominio) está formada por seis hélices α transmembrana (S1-S6). En la región transmembrana de S4 existen aminoácidos con carga positiva, de tal modo que esta región actuaría como un sensor de voltaje, ya que, al sustituir experimentalmente los aminoácidos cargados positivamente por otros con carga neutra, el canal no se abre. Al parecer, los cambios de voltaje que se producen a través de la membrana actuarían sobre los mencionados aminoácidos de S4, produciendo la apertura o el cierre del canal. La selectividad iónica del canal depende del tamaño del poro central y del modo en el que interacciona con el ión en cuestión. La selección de iones con la carga adecuada se produce, principalmente, por atracción electrostática o repulsión hacia los aminoácidos cargados que forman la apertura del poro. El CNaDV tiene dos compuertas: la compuerta de activación (m), que se proyecta hacia el LEC, y la compuerta de inactivación (h), en contacto con el interior celular (fig. 4-21). Mientras se da el potencial de membrana en reposo (consideremos un V de unos −90 mV) la m 198 compuerta de inactivación está abierta, pero la de activación está cerrada, por lo que el Na no puede entrar en la + célula. Cuando el potencial de membrana se hace menos negativo que el potencial de reposo, es decir, cuando el potencial de membrana tiende a 0 mV, existe un voltaje (aproximadamente entre −70 mV y −50 mV) en el cual se produce un cambio conformacional de la compuerta de activación, de modo que se abre. A este estado del canal se le denomina estado activado, y es un estado en el que el ión puede difundir hacia el LIC a través del canal, ya que m y h están abiertas (fig. 4-22 y v. fig. 4-21). FIGURA 4-21 Esquema del funcionamiento de los canales de Na+ y K+ dependientes de voltaje. A. Los canales de Na+ dependientes de voltaje tienen dos compuertas: una de activación (en el lado extracelular), o compuerta m, y otra de inactivación (h). B. Los canales de K+ dependientes de voltaje tienen una sola compuerta para regular el paso de este ión. 199 FIGURA 4-22 A. Potencial de membrana en función del tiempo durante el potencial de acción. B. Secuencia de acontecimientos que se producen durante el potencial de acción. 1, potencial de membrana en reposo. Los canales de Na+ y K+ dependientes de voltaje están cerrados. 2, despolarización. Apertura de los canales de Na+. 3, repolarización. Compuerta de inactivación del canal de Na+ cerrada y compuerta del canal de K+ abierta. 4, hiperpolarización. Antes de llegar de nuevo al potencial en reposo, sigue saliendo K+ y el valor del potencial de membrana adquiere valores más negativos que los de reposo, hasta que se cierran los canales de K+. (B, ilustración de: E. Maldonado.) 200 El aumento de voltaje causado por la apertura de la compuerta de activación también causa el cierre de la compuerta de inactivación. Pero el cambio conformacional que produce el cierre de la compuerta de inactivación es más lento que el producido por la apertura de la compuerta de activación. En el momento en el que se produce el cierre de la compuerta de inactivación, el potencial de membrana comienza a recuperarse para alcanzar su valor en reposo; es decir, la membrana se repolariza. Finalmente, destacaremos que la compuerta de inactivación del canal de Na dependiente de voltaje no se vuelve a abrir hasta que el potencial de membrana tome valores cercanos al reposo. + Cuanto más negativo sea el potencial de reposo, mayor será el porcentaje de canales que tengan la compuerta de inactivación abierta. Los CNaDV son muy abundantes en los nódulos de Ranvier (v. «Propagación saltatoria» en el siguiente apartado) de las fibras nerviosas mielinizadas (tabla 4-5). Tabla 4-5 Densidad de canales de Na dependientes de voltaje en fibras nerviosas mielinizadas y no mielinizadas + Fibras nerviosas N.° de canales/μm2 No mielinizadas 20 Mielinizadas (nódulos de Ranvier) 104 En cuanto al canal de K dependiente de voltaje, tan solo tiene una compuerta que regula la salida de los iones. + Cuando el potencial de membrana está en reposo, la compuerta permanece cerrada, pero cuando se da una despolarización del potencial de membrana, se produce una apertura conformacional de la compuerta, de modo que los iones K difunden hacia el espacio extracelular a través del canal. La apertura de la compuerta de dichos canales se + produce con cierto retraso, y se podría considerar que se abren al mismo tiempo que empiezan a cerrarse las compuertas de inactivación del canal de Na dependiente de voltaje. Por esta razón, se recupera el potencial de + membrana en reposo en poco tiempo, ya que la disminución de entrada de Na en la célula y el aumento de la salida + de K se suman para acelerar la repolarización. + Canalopatías y sustancias que alteran el funcionamiento de los canales dependientes de voltaje Las canalopatías son los trastornos que se producen en los canales iónicos y que, como consecuencia, alteran su funcionamiento. Numerosas canalopatías se han asociado con enfermedades neurológicas, como es el caso de la ataxia episódica de tipo I, causada por una mutación en el canal de K . Se trata de una enfermedad autosómica dominante + que afecta al cromosoma 12p13. Otra canalopatía es la epilepsia generalizada con convulsiones febriles, asociada a mutaciones en la subunidad β1 de CNaVD (mutación en el cromosoma 19q13.1). 201 Existen diversas sustancias que alteran el funcionamiento normal de los canales dependientes de voltaje (fig. 4-23). La tetrodotoxina (TTX), un veneno procedente del pez globo, bloquea la conducción de los impulsos nerviosos a lo largo de los axones y de las membranas excitables de las fibras nerviosas, originando parálisis respiratoria. La TTX, que posee un grupo guanidino, se utiliza como sonda, ya que es específica de los canales de sodio dependientes de voltaje, por lo que bloquea el flujo de este ión. La saxitoxina (STX), que posee dos grupos guanidino, es producida por algunos dinoflagelados marinos y actúa de la misma forma que la TTX. El grupo guanidino cargado positivamente interacciona con los carboxilatos (cargados negativamente) de la entrada del canal de sodio desde la parte extracelular de la membrana. Ambas toxinas actúan como inhibidores competitivos del Na . + FIGURA 4-23 Estructura química del grupo guanidino y de las toxinas tetrodotoxina y saxitoxina. Las flechas señalan la ubicación del grupo guanidino en la estructura química de las toxinas. Dado que ambas toxinas tienen unas elevadas especificidad y afinidad por el conducto de Na dependiente de + voltaje, si previamente son marcadas radiactivamente, se puede cuantificar la densidad de dichos canales en las membranas excitables. Potencial de acción Alan Hodgkin y Andrew Huxley estudiaron cómo se generaban los potenciales de acción, para lo cual emplearon el axón gigante de calamar. Este axón posee un diámetro que, en algunas especies, puede llegar a 1 mm, unas dimensiones enormes si las comparamos con el diámetro del axón amielínico de mamífero, que es de aproximadamente 0,5-1 μm. En 1962, Hodgkin publicó un trabajo donde demostraba que la generación y la propagación del potencial de acción por un axón al que se sustituyó el axoplasma por una solución salina con Na y K + en ausencia de ATP. Dado que, en estas condiciones, se podían generar un millón de potenciales, dedujo que la señal eléctrica solo requería la integridad de la membrana y la presencia de esos iones. Este trabajo hizo que Hodgkin y Huxley recibieran el Premio Nobel en Fisiología o Medicina en 1963. Propagación de señales eléctricas 202 + Los potenciales de acción se utilizan para transportar señales nerviosas. El potencial de acción es un proceso electroquímico que consta de una despolarización producida por la entrada de Na y una repolarización causada por + la salida de K . El potencial de acción es desencadenado por impulsos que llegan al cono axónico, donde existen gran + cantidad de canales dependientes de voltaje. El potencial de acción viaja a lo largo de la membrana desde el punto de origen; este proceso se denomina propagación. Como hemos visto al principio del presente capítulo, existen varios factores (gradiente y permeabilidad iónica) que intervienen en la formación del potencial de membrana en reposo. Esta situación se ve alterada en el momento en el que se produce una despolarización. Pero no cualquier despolarización es capaz de generar un potencial de acción; si esta es pequeña (unos 20 mV), el potencial de membrana retorna a sus valores en reposo sin generar un potencial de acción. Esto es así porque existe un potencial umbral a partir del cual se puede generar el potencial de acción. Movimiento iónico a través de la membrana axonal durante el potencial de acción Durante el potencial de membrana en reposo de una célula excitable (v. fig. 4-22, [secuencia 1]).los canales iónicos dependientes de voltaje se hallan cerrados. En dicho momento, la permeabilidad del K es unas 100 veces mayor que + la del Na , ya que el K difunde por los canales de fuga (no confundirlos con los canales dependientes de voltaje). + + Cuando una región de la membrana está ligeramente despolarizada, existe una fracción de canales de Na + dependientes de voltaje que se abre, de modo que el Na difunde hacia el LIC (aumenta la conductancia del Na ). Esta + + corriente de Na es despolarizante, por lo que se produciría un circuito de retroalimentación positiva denominado + ciclo de Hodgkin (fig. 4-24). FIGURA 4-24 Esquema que ilustra el ciclo de Hodgkin. Al comienzo de este apartado, se ha mencionado que una ligera despolarización no es capaz de generar un potencial de acción. Esto es así porque existe un importante factor que rompe el ciclo despolarizante de Hodgkin: la difusión de iones K hacia el LEC. Este hecho hace que el potencial de membrana retorne a sus valores de reposo y que + no se genere un potencial de acción, pues la despolarización inicial no alcanza el umbral para que así sea. En la generación del potencial de acción se distinguen las siguientes fases: • Fase de despolarización. Tras la fase de reposo, cuando la membrana plasmática se despolariza alcanzando un valor umbral, la salida de K por los canales de fuga es incapaz de compensar la entrada de Na , ya que se ha + + abierto un mayor porcentaje de canales de Na dependientes de voltaje que cuando se da una despolarización + 203 subumbral. Podemos afirmar que el potencial de acción se produce cuando la tasa de entrada de Na por los + canales dependientes de voltaje es mayor a la tasa de salida del K por los canales de fuga. La despolarización + alcanza un máximo de unos +40 mV (fig. 4-25; v. también fig. 4-22 [secuencia 2]). • Fase de repolarización. La repolarización (v. secuencia 3 en fig. 4-22) se produce debido a la inactivación de los canales de Na dependientes de voltaje y a la apertura de los canales de K dependientes de voltaje. De esta forma, + + se detiene el flujo de Na hacia el LIC y se permite que el K difunda hacia el exterior de la célula, principalmente + + por el canal dependiente de voltaje. Como ya hemos comentado, existe una diferencia en la velocidad de respuesta de los canales dependientes de voltaje, ya que, cuando la célula se despolariza, los canales de K se + abren más lentamente que los de Na , de ahí que primero se dé un aumento de la conductancia del Na + + (despolarización) y luego un aumento de la conductancia de K (repolarizante) (v. figs. 4-22 y 4-25). + • Fase de hiperpolarización. La hiperpolarización se produce en la mayoría de las neuronas y se caracteriza por que el valor del potencial de membrana adquiere valores más negativos que los de reposo (v. figs. 4-22 [secuencia 4] y 4-25). Esto se produce por el aumento de la permeabilidad de los iones K , ya que los canales dependientes de + voltaje permanecen todavía abiertos. El potencial de membrana adquiere los valores en reposo conforme se van cerrando los canales de K dependientes de voltaje. La recuperación del potencial de membrana en reposo no + depende del transporte activo de la bomba Na /K ATPasa. De hecho, Hodgkin y Huxley demostraron que, en + + ausencia de ATP, las células podían seguir generando potenciales de acción. La bomba Na /K ATPasa es la + + encargada, no obstante, de restablecer las concentraciones iónicas a cada lado de la membrana, ya que durante la despolarización entra Na , y durante la repolarización sale K . Así, una fibra nerviosa puede transmitir entre 10 y + + 5 50 impulsos antes de que las diferencias de concentración alcancen el punto en el que se interrumpa la 6 conducción del potencial de acción. Una actividad neuronal intensa puede alterar significativamente las concentraciones de los iones. Podría así ocurrir que la cantidad de K que se acumula fuera de la célula fuera + tóxica para ella y para el resto de las neuronas circundantes; de ahí la importancia de los astrocitos que captan el exceso de K . + • Períodos refractarios. Después de un potencial de acción, no se puede generar otro durante algunos milisegundos, aunque el estímulo sea intenso, porque los canales de Na dependientes de voltaje están + inactivados (compuerta h cerrada). A este período de tiempo se le denomina «período refractario absoluto» (PRA). En el período de hiperpolarización, los canales de Na dependientes de voltaje se vuelven activables, por lo + que es posible producir un potencial de acción, aunque el estímulo despolarizante debe tener la suficiente magnitud como para poder superar las corrientes de K . A este período se le «denomina período refractario + relativo» (PRR). 204 FIGURA 4-25 Modificación de la conductancia iónica durante el potencial de acción. Obsérvese que la curva de conductancia del K+ está desplazada hacia la derecha con respecto a la del Na+. Propagación del potencial de acción a lo largo del axón La transmisión de señales nerviosas requiere que los fenómenos de despolarización y repolarización ocurran a lo largo de la membrana neuronal. Cuando un punto de la membrana se despolariza, se produce una difusión pasiva de la despolarización, esto es, se transmite a regiones adyacentes. Durante este proceso, la onda despolarizante pierde intensidad, por lo que hace prácticamente imposible que se dé una propagación a largas distancias. De ahí que el potencial de acción tenga que ser generado punto a punto en la membrana; de esta forma, no pierde intensidad y es capaz de recorrer grandes distancias. Cuando una señal despolarizante llega al soma neuronal o a las dendritas, la onda despolarizante difunde pasivamente hasta el cono axónico. En el cono axónico, la generación de potenciales de acción se ve favorecida, ya que la densidad de canales de sodio dependientes de voltaje es mayor que en el soma y en las dendritas. Ante un estímulo despolarizante en zonas donde la densidad de canales de Na es mayor, se producirá una mayor corriente de este ión, + que es lo que sucede en el cono axónico y en los nódulos de Ranvier (v. más adelante). El potencial de acción producido en el cono axónico se propagará a lo largo de la membrana axonal. Se diferencian dos tipos de propagación del impulso nervioso: • Propagación punto a punto. Se da en los axones no mielinizados y consiste básicamente en la generación de sucesivos potenciales de acción desde el cono axónico hasta el botón terminal del axón (fig. 4-26). Dado que el potencial de acción se está generando continuamente, se produce una propagación sin decremento de la intensidad. La tabla 4-6 recoge la velocidad de propagación punto a punto de las fibras amielínicas. • Propagación saltatoria. Se da en axones mielinizados (fig. 4-27; v. también fig. 4-26). La vaina de mielina es un excelente aislante eléctrico que disminuye el flujo iónico a través de la membrana. La vaina de mielina de las neuronas del sistema nervioso central está formada por los oligodendrocitos, mientras que la del sistema nervioso periférico está formada por las células de Schwann. Para formar la vaina de mielina, la membrana de la célula de Schwann rodea al axón. Después, la célula rota varias veces alrededor del axón, depositando múltiples capas de 205 membrana que contiene mielina. La mielina está compuesta, a partes iguales, por esfingomielina, glucolípidos (sobre todo cerebrósidos y sulfatósidos) y colesterol. Dado que cada célula de Schwann rodea a un segmento corto del axón, se requieren muchas células para rodear un axón del sistema nervioso periférico. En la unión entre dos células de Schwann sucesivas a lo largo del axón, existe una región no aislada de unos 2-3 μm de longitud denominada nódulo de Ranvier (v. fig. 4-27). Solo en estas zonas de la membrana pueden los iones fluir con facilidad entre el LEC y el LIC, a través de la membrana del axón. FIGURA 4-26 Propagación del impulso nervioso «punto a punto» (dibujos del lado izquierdo) y propagación saltatoria (dibujos del lado derecho). A. En la propagación «punto a punto», la secuencia de eventos 1-5 muestra cómo el cambio de signo (2) en el interior celular (correspondiente a la despolarización) se transmite de modo continuo de izquierda a derecha. La salida de K+ en el lado izquierdo de 4 y 5 provoca la repolarización de la membrana en dichos puntos. B. En la propagación saltatoria, la despolarización va teniendo lugar de modo sucesivo, pero entre los nodos de Ranvier «salta» de un nodo a otro. De nuevo, la salida de K+ en los nodos del lado izquierdo de 4 y 5 repolariza la membrana. (Dibujo modificado de: figs. 3.15 y 3.17, de Becker WM. El mundo de la célula. 6.ª ed. Madrid: Pearson; 2007.) Tabla 4-6 Velocidad de propagación del potencial de acción en fibras amielínicas Fibra amielínica Diámetro de la fibra Velocidad de propagación Humano 0,5-1 μm 1 m/s Axón gigante de calamar 1.000 μm 25-30 m/s 206 FIGURA 4-27 Estructura de una neurona mielinizada por células de Schwann. Los espacios que quedan entre las vainas de mielina corresponden a los nódulos de Ranvier. (Ilustración de: E. Maldonado.) La mielina hace que la capacidad de retener carga disminuya, por lo que permite que una despolarización se propague más lejos y más rápido (aproximadamente a una velocidad de 100 m/s) de lo que lo haría en un axón no mielinizado. Pero el potencial de acción debe ser renovado periódicamente para que la despolarización se extienda por toda la neurona. Esto sucede en los nódulos de Ranvier, al ser el único lugar de la membrana donde se encuentran los canales de sodio dependientes de voltaje (10 /μm ). Por esta razón, los potenciales de acción «saltan» de nódulo a 4 2 nódulo a lo largo de los axones mielinizados. A este fenómeno se le llama «propagación saltatoria», que es mucho más rápida que la propagación continua punto a punto. La organización de los nodos de Ranvier evita que los canales dependientes de voltaje se muevan por toda la membrana axonal. El potencial de acción se transmite finalmente de una neurona a otra mediante la sinapsis, que se define como un tipo de comunicación intercelular mediante el cual una neurona es capaz de transmitir un potencial de acción eléctrico a otra célula. Las neuronas no solo se comunican entre ellas, sino que también lo hacen con las glándulas y las células musculares a través de la sinapsis. Estructuralmente, podemos diferenciar dos tipos de sinapsis: • Sinapsis eléctrica: la neurona presináptica está conectada con la neurona postsináptica a través de uniones de tipo gap o nexo (para conocer con detalle su estructura, v. capítulo 6). Estas uniones permiten que los iones se muevan directamente de una célula a otra, y en cualquier sentido, de modo que la despolarización se transmite pasivamente. Se trata, prácticamente, de una transmisión sin retrasos que se halla en lugares del sistema nervioso donde la velocidad de transmisión es crítica. • Sinapsis química: en este tipo de sinapsis, las neuronas presináptica y postsináptica no están conectadas directamente. El espacio que las separa se denomina «brecha» o «hendidura sináptica» y tiene una longitud de unos 20-50 nm. Pero una señal nerviosa no puede saltar de una neurona a otra como un impulso eléctrico; por ello, la señal eléctrica (potencial de acción) en la neurona presináptica induce la liberación de una sustancia química desde el botón terminal denominada neurotransmisor, que difunde por la hendidura sináptica. El neurotransmisor se une a receptores anclados en la membrana de la neurona postsináptica, donde se convierten en señales eléctricas mediadas por cambios iónicos. Los procesos de liberación de los neurotransmisores implican procesos de exocitosis por parte de la neurona presináptica, que se estudian con más profundidad en el capítulo 5. 207 Como ejemplo de una enfermedad donde se produce una alteración en la conducción del impulso nervioso por alteraciones en la vaina de mielina, podemos citar la esclerosis múltiple (EM). La EM es una enfermedad desmielinizante del sistema nervioso central, caracterizada por un proceso inflamatorio idiopático que destruye selectivamente la mielina. Se caracteriza por la presencia de inflamación, desmielinización y gliosis (tejido cicatricial). Causa lesiones focales en la sustancia blanca, denominadas «placas», en las que se da una desmielinización con preservación relativa del axón. Si el componente inflamatorio es muy marcado, incluso se puede observar destrucción axonal (fig. 4-28). La etiología de la EM es desconocida, pero se piensa que es probable que determinados factores de origen todavía desconocidos induzcan una respuesta inmunitaria mediada por células T autorreactivas (CD4+ o CD8+) en personas genéticamente predispuestas. Se ha sugerido como posible desencadenante el mimetismo molecular entre virus responsables de infecciones respiratorias y antígenos mielínicos que activarían linfocitos T. FIGURA 4-28 Corte histológico del neocórtex de un paciente con esclerosis múltiple. La flecha negra señala una zona de desmielinización intracortical. La flecha blanca indica un área de desmielinización leucocortical. (Imagen procedente de: Popescu y Lucchinetti. BMC Neurology 2012;12:11.) La mayoría de los estudios sobre la etiopatogenia de la EM apoyan la hipótesis de que se trata de una enfermedad autoinmunitaria mediada por linfocitos T específicos (Th1) frente a antígenos de la mielina. La proteína mielínica básica (MBP, del inglés myelin basic protein) es un antígeno importante. La activación de los linfocitos B y la respuesta de anticuerpos es necesaria para el desarrollo de lesiones desmielinizantes. El cuadro clínico de la EM es muy variable. Las lesiones suelen afectar preferentemente a ciertas zonas del sistema nervioso central, como el nervio y quiasma ópticos, el tronco cerebral, los pedúnculos cerebelosos y la médula. Esto da lugar a debilidad, alteración sensitiva, afectación de la visión, disartria (trastorno del habla), ataxia (falta de coordinación del movimiento), disfunción vesical, alteraciones del estado de ánimo y deterioro cognitivo. Lecturas recomendadas Agre P, Kozono D. Aquaporin water channels: molecular mechanisms for human diseases. FEBS Lett. 2003;555(1):72–78. 208 Ashcroft FM. From molecule to maladies. Nature. 2006;440(7083):440–447. Cano A, Ticus I, Chabrol B. Glucose transporter type 1 (GLUT-1) deficiency. Rev Neurol (Paris). 2008;164(11):896–901: Epub 2008 Apr 3. Gonen T, Walz T. The aquaporin structure. Quarterly Reviews of Biophysics. 2006;39(4):361–396. Kristopher T, Kahle J, Simard Marc. Molecular Mechanisms of Ischemic Cerebral Edema: Role of Electroneutral Ion Transport. Physiology. 2009;24:257–265. Lehmann-Horn F, Jurkat-Rott K. Voltage-gated channels and hereditary disease. Physiol Rev. 1999;79(4):1317–1372: Cited on PubMed PMID10508236. Mouritsen OG, Zuckermann MJ. What’s so special about cholesterol? Lipids. 2004;39(11):1101–1113. Mueckler MM. The molecular biology of mammalian glucose transporters. Curr Opin Nephrol Hypertens. 1992;1(1):12–20. Nielsen S, Frøkiær J, Marples D, Kwon T-H, Agre P, Knepper MA. Aquaporins in the kidney: from molecules to medicine. Physiol Rev. 2002;82:205–244. Nielsen S, Kwon T-H, Mønster B, Christensen, Promeneur D, Frøkiær J, Marples D. Physiology and Pathophysiology of Renal Aquaporin. J Am Soc Nephrol. 1999;10:647–663. Perozo E. Gating prokaryotic mechanosensitive channels. Nat Rev Mol Cell Biol. 2006;7:109–119. Popescu BF, Lucchinetti CF. Meningeal and cortical grey matter pathology in multiple sclerosis. BMC Neurol. 2012;12:11: Cited on PubMed PMID 22397318. Thorens B. Glucose transporters in the regulation of intestinal, renal, and liver glucose fluxes. Am J Physiol. 1996;270(4 Pt 1):G541–G553. 209 Ecuación de Nernst El gradiente electroquímico de un ión determina el flujo a través de un canal que está influido por el gradiente de voltaje y el gradiente de concentración del ión a través de la membrana. Cuando estos dos gradientes se contrarrestan mutuamente, el gradiente electroquímico del ión es cero y no existe un flujo neto a través del canal. El gradiente de voltaje al cual se alcanza el equilibrio electroquímico se denomina «potencial de equilibrio». Se puede calcular utilizando la ecuación de Nernst: En el equilibrio electroquímico: por lo tanto, Si el ión X fuera el único ión permeable, el potencial de equilibrio de la membrana de equilibrio de dicho ión . ∆V = potencial de equilibrio en voltios (potencial interno menos potencial externo). concentraciones externa e interna del ión (respectivamente). R = constante de los gases ( ). T = temperatura absoluta (K). F = constante de Faraday ( ). Z = valencia del ión. Ln = logaritmo en base e. Preguntas de autoevaluación 210 coincidiría con el potencial 1. Con respecto al transporte pasivo, señale la opción correcta: a. Las porinas son canales altamente selectivos de la membrana mitocondrial externa. b. El agua atraviesa la membrana tanto por difusión simple como por difusión facilitada. c. Ante un mismo soluto, todas las membranas plasmáticas del organismo muestran un mismo comportamiento de difusión simple. d. La difusión simple del K a través de la membrana plasmática es mayor que la del benceno. + e. Las soluciones extracelulares hipertónicas provocan hinchamiento celular. Respuesta correcta: b. 2. Con respecto a los canales iónicos, señale la opción falsa: a. Los órganos de los sentidos poseen canales mecanosensibles. b. La unión de acetilcolina al sitio específico en los canales de Na de la membrana de la célula postsináptica es un + tipo de regulación de canales quimiosensibles. c. La regulación de los canales iónicos siempre es a través de sustancias extracelulares. d. Los canales de las uniones de tipo gap configuran las sinapsis eléctricas. e. El transporte de iones a través de estos canales tiene lugar de modo pasivo. Respuesta correcta: c. 3. La diabetes «insípida» se caracteriza por: a. Alteraciones en la proteína AQP1. b. Presencia de orina concentrada en exceso. c. Ausencia de AQP2 en la membrana apical del túbulo colector. d. Presencia de glucosa en la orina. e. Hiperactivación de la hormona ADH. Respuesta correcta: c. 4. Señale la opción falsa con respecto a los transportadores GLUT: a. Es un ejemplo de transportador de tipo uniporte. b. Transportan glucosa en contra de gradiente. c. Su funcionamiento sigue la ecuación de Michaelis-Menten. 211 d. El transportador GLUT4 transporta glucosa en el músculo esquelético. e. Son un tipo de permeasas. Respuesta correcta: b. 5. La Na K ATPasa: +/ + a. Es inhibida por el vanadato. b. La hidrólisis de ATP capacita el transporte de dos iones Na hacia el líquido intracelular. + c. La ouabaína favorece el funcionamiento de esta ATPasa. d. Es una ATPasa de tipo vacuolar. e. Ninguna de las anteriores es cierta. Respuesta correcta: a. 6. ¿Cuál de las siguientes afirmaciones no es correcta en relación con la fibrosis quística?: a. Se produce por un defecto en un transportador de Cl , codificado por CFTR. − b. Produce un sudor salado en los pacientes con esta enfermedad. c. La mayoría de mutaciones asociadas a esta enfermedad provocan una retención de la proteína en el retículo endoplasmático. d. La esperanza de vida media de estos pacientes no supera los 10 años. e. El trasplante pulmonar es una opción terapéutica para estos pacientes. Respuesta correcta: d. 7. Elija la respuesta verdadera en relación con el potencial de membrana en reposo (V ): m a. La concentración de K en el LEC es superior a la del LIC. + b. La entrada de Na en la célula tiene un efecto repolarizante. + c. La bomba Na /K ATPasa hace que el exterior celular sea más electronegativo. + + d. El flujo de iones K a través de la membrana plasmática es el factor que determina, en mayor porcentaje, el valor + del potencial de membrana en reposo. e. Los cambios en la concentración del Cl en el LEC afectan de manera crítica al potencial de membrana en reposo. – Respuesta correcta: d. 8. Con respecto a los canales iónicos dependientes de voltaje, elija la respuesta falsa: 212 a. Los canales iónicos dependientes de voltaje tienen aminoácidos cargados positivamente que actúan como sensores de voltaje. b. Con la técnica del patch clamp se demostró que los canales iónicos dependientes de voltaje adoptan estados conformacionales que les permiten estar parcialmente abiertos. c. En el estado activado del canal de Na dependiente de voltaje, las compuertas «m» y «h» están abiertas. + d. La compuerta de inactivación del canal de Na dependiente de voltaje no se vuelve a abrir hasta que el potencial + de membrana adquiera valores cercanos al reposo. e. El canal de K dependiente de voltaje solo tiene una compuerta que regula la salida de iones. + Respuesta correcta: b. 9. En relación con el potencial de acción, escoja la respuesta falsa: a. Para que el potencial de acción se produzca, es necesario que la tasa de entrada de Na a la célula sea superior a la + salida de K . + b. Durante la fase de repolarización, los canales de Na dependientes de voltaje se inactivan y el K sale de la célula + + principalmente a través del canal de K dependiente de voltaje. + c. La difusión de iones K hacia el LEC favorece que se perpetúe el circuito despolarizante, llamado «ciclo de + Hodgkin». d. Durante el período refractario absoluto, los canales de Na dependientes de voltaje se encuentran inactivos. Por + esta razón, no se puede generar otro potencial de acción durante este período. e. Para poder generar un potencial de acción durante el período refractario relativo, el estímulo despolarizante debe tener una magnitud suficiente, que supere a la corriente de K . + Respuesta correcta: c. 10. Señale la respuesta correcta: a. Durante la propagación «punto a punto» se produce un decremento de la intensidad del potencial de acción. b. Las células de Schwann forman la vaina de mielina del SNC. c. El nódulo de Ranvier es la región del axón no aislada por células de Schwann. d. La propagación continua es más rápida que la saltatoria. e. La región de la membrana que está envuelta por la vaina de mielina presenta una mayor permeabilidad al flujo iónico. Por esta razón, la velocidad de propagación es mayor en los axones mielinizados. Respuesta correcta: c. 213 CAPÍTULO 5 214 Macrotransporte a través de la membrana plasmática: endocitosis y exocitosis Álvaro Martín Diego Peñafiel Alfonso Calvo Objetivos de aprendizaje • Entender los procesos moleculares de macrotransporte a través de la membrana plasmática. • Conocer cómo tiene lugar la exocitosis, concretamente en la liberación de neurotransmisores en la neurona presináptica y en el funcionamiento de la sinapsis neuronal. • Comprender la etiopatogenia de las enfermedades relacionadas con la endocitosis y la exocitosis. • Conocer los mecanismos por los cuales los microorganismos utilizan los procesos de macrotransporte a través de la membrana para infectar a las células. 215 Introducción En el capítulo anterior se han estudiado aquellos mecanismos de transporte a través de la membrana plasmática que no implican una deformación de la misma. En este capítulo nos ocuparemos de los mecanismos de transporte a una escala mayor: los que requieren deformación de la membrana y que, por lo tanto, pueden ser observados al microscopio. Las células pueden incorporar material extracelular mediante procesos de endocitosis o fagocitosis. Estos procesos implican la pérdida de porciones de membrana que son incorporadas al interior celular mediante la creación de vesículas, donde queda incluido el contenido extracelular transportado. Estas pérdidas de membrana son compensadas mediante procesos de exocitosis, donde vesículas generadas en el interior celular se fusionan con la membrana plasmática, vertiéndose así el contenido de estas al exterior celular. Tanto la incorporación de vesículas como su fusión con la membrana plasmática implican la actuación de orgánulos citoplasmáticos que participan en un proceso denominado «tráfico intracelular de vesículas» y que gobiernan el correcto funcionamiento de estos sistemas. Este transporte demanda un gran gasto de energía en forma de ATP y en él participan numerosas proteínas que ejercen diferentes funciones. Como detallaremos más adelante, muchos microorganismos patógenos aprovechan esta vía de transporte para introducirse en la célula e infectarla, por lo que el conocimiento del modo en que tiene lugar este fenómeno es importante para poder desarrollar estrategias terapéuticas. 216 Endocitosis El proceso por el cual las células captan e internalizan macromoléculas, partículas grandes e incluso otras células recibe el nombre de endocitosis. El término fue acuñado en 1963 por Christian de Duve (premio Nobel de Fisiología o Medicina en 1974). La endocitosis es el primer paso de la ruta que conduce hasta la digestión celular en los lisosomas. Para captar el material a endocitar, la membrana plasmática se invagina y forma vesículas, cuyo tamaño permite distinguir los dos tipos de endocitosis. El primero se denomina pinocitosis, y consiste en la ingestión de fluido extracelular con pequeños solutos, en vesículas con un diámetro de aproximadamente 100 nm (fig. 5-1); el segundo tipo es la fagocitosis, y en él se ingieren grandes partículas, como microorganismos o restos celulares, en vesículas mayores. Todos los procesos de endocitosis requieren un consumo de energía en forma de ATP. FIGURA 5-1 Imágenes de microscopía electrónica que muestran el proceso de endocitosis en vesículas revestidas de clatrina. Las flechas señalan las vesículas, y las puntas de flecha, el material extracelular. En la imagen central se observa una depresión revestida en formación, mientras que la imagen derecha corresponde a un estado más avanzado del proceso de endocitosis. (Procedente de: Shieh JC, Schaar BT, Srinivasan I, Brodsky FM, McConnell SK (2011) Endocytosis Regulates Cell Soma Translocation and the Distribution of Adhesion Proteins in Migrating Neurons. PLoS ONE 6(3):e 17802) Pinocitosis La pinocitosis («bebida celular») es un proceso continuo que se da prácticamente en la totalidad de las células eucariotas. Mediante la pinocitosis, se incorporan al citoplasma tanto fluido extracelular con moléculas disueltas, como otras partículas e incluso algunos virus. Se pueden considerar tres tipos de pinocitosis: 1) la mediada por clatrina, denominada clásicamente «endocitosis mediada por receptor»; 2) la mediada por caveolinas, que tiene lugar en unas estructuras llamadas «cavéolas», donde hay participación de unas proteínas denominadas caveolinas, pero no de la clatrina, y 3) la macropinocitosis, no mediada por clatrina ni por caveolinas, donde tiene lugar una incorporación masiva de fluido extracelular con emisión de amplias protrusiones citoplasmáticas a modo de lamelipodios. Esta clasificación de la endocitosis es, probablemente, una simplificación de la realidad. La endocitosis es un campo en el que se está llevando a cabo una intensa investigación y donde se están descubriendo nuevas variantes de incorporación al interior celular, así como nuevas rutas de tráfico intracelular de las vesículas incorporadas y nuevas moléculas implicadas en estos procesos. Endocitosis en vesículas recubiertas por clatrina 217 El tipo más conocido de pinocitosis es la endocitosis en vesículas recubiertas por clatrina (tradicionalmente llamada endocitosis mediada por receptor). Clásicamente, se diferenció entre endocitosis mediada por receptor (un proceso altamente específico para algunos sustratos, donde las vesículas de endocitosis eran formadas por la acción de la clatrina) y la endocitosis no mediada por receptor (fenómeno por el cual se incorporan sustancias de modo continuo e inespecífico). Sin embargo, cada vez hay más datos que muestran que la endocitosis que se consideraba «no mediada por receptor» es un proceso altamente regulado para la incorporación de sustancias específicas y con vías intracelulares propias, lejos, por lo tanto, de ser un proceso inespecífico. Este proceso de endocitosis mediada por receptor consiste en la unión de macromoléculas a receptores específicos de membrana que se concentran, al inicio de la endocitosis, en zonas concretas llamadas depresiones revestidas de clatrina. Los mecanismos moleculares de este tipo de endocitosis son bien conocidos: cuando las moléculas se unen a sus receptores, los complejos ligando-receptor se concentran en las depresiones y penetran en la célula en vesículas recubiertas de clatrina. Se han descrito numerosas moléculas que entran en la célula mediante endocitosis mediada por receptor: hormonas y factores de crecimiento (como insulina, glucagón, GH y EGF), proteínas séricas (como lipoproteínas de baja densidad [LDL, del inglés low density lipoproteins], transferrina e IgA), virus (como el virus de la gripe o los adenovirus) y toxinas (como las del cólera o la difteria). El ejemplo más estudiado de endocitosis mediada por receptor es el de la captación de colesterol extracelular contenido en las LDL. El colesterol es una molécula esencial para la síntesis de membrana y la formación de ácidos biliares y hormonas esteroideas. Se transporta en sangre unido a proteínas, formando las LDL (fig. 5-2). Estas lipoproteínas se unen a receptores de LDL localizados en la membrana de las células que captan colesterol. Los receptores de LDL insertos en la membrana plasmática tienden a acumularse en las depresiones revestidas de clatrina; de esta forma, se consigue concentrar el colesterol que se va a endocitar (fig. 5-3). Tras producirse la endocitosis de las vesículas de clatrina (que posteriormente pierden su revestimiento), se fusionan con un orgánulo denominado «endosoma» (cuya estructura y función se detallan más adelante), quedando libres las moléculas de LDL en su interior. Posteriormente, el endosoma se fusionará con un lisosoma, donde se liberarán las moléculas de colesterol, que pasarán entonces al citoplasma (v. fig. 5-3). 218 FIGURA 5-2 Molécula de LDL. Estas moléculas, de forma esférica, tienen una masa de 3 × 106 Da, presentan un núcleo de ésteres de colesterol rodeado por una monocapa de fosfolípidos y moléculas de colesterol no esterificadas. La apoproteína B100 se encarga de organizar la estructura de la partícula y de la unión de la LDL a su receptor en la membrana plasmática celular. (Ilustración de: E. Maldonado.) FIGURA 5-3 Endocitosis mediada por receptor. El esquema representa la endocitosis de las moléculas de LDL. Tras la internalización de la vesícula recubierta de clatrina, esta se desprende del recubrimiento y se une al endosoma. En el interior de este orgánulo, el pH ácido provoca la separación entre las moléculas de LDL y sus receptores, que son devueltos en vesículas a la membrana plasmática. Por su parte, el contenido del endosoma termina en el lisosoma, en el cual se libera el colesterol, que queda a disposición de la célula para su utilización. (Ilustración de: E. Maldonado.) Cuando las células no pueden captar colesterol, este se acumula en la sangre y tiende a formar las llamadas «placas de ateroma» en las paredes arteriales. El estudio de pacientes afectos de hipercolesterolemia familiar fue un hecho clave a la hora de dilucidar el mecanismo de endocitosis mediada por receptor. La hipercolesterolemia familiar es una enfermedad genética, de herencia autosómica, que se caracteriza por que los pacientes que la sufren presentan unos niveles de colesterol sérico muy elevados. Estas altas concentraciones provocan que el colesterol se deposite en las arterias desde edades muy tempranas, lo que explica la alta incidencia de infarto de miocardio que sufren dichos 219 pacientes antes de alcanzar los veinte años de edad. Esta enfermedad se produce porque existe una mutación en el receptor de LDL, que se manifiesta de dos formas distintas: como falta de expresión de la proteína o incapacidad de la misma para unirse a la molécula de LDL; o bien, como falta de internalización del complejo LDL-receptor por incapacidad de este último para concentrarse en las depresiones revestidas y ser endocitado (fig. 5-4). FIGURA 5-4 Las mutaciones en el receptor de las LDL causan hipercolesterolemia familiar, que normalmente ocasiona aterosclerosis. A. Esquema de los receptores normales de LDL, que se unen a la molécula de LDL y se concentran en las depresiones revestidas de clatrina para ser endocitados. B. Por su parte, los receptores mutados pueden unir las LDL, pero no se agrupan en las depresiones revestidas y, por lo tanto, la célula no puede endocitar el colesterol. Esto se traduce en un aumento acusado de los niveles de LDL en sangre, característico de los pacientes aquejados de hipercolesterolemia familiar. C. Imagen macroscópica de la sección transversal de una arteria de un paciente con aterosclerosis donde se observa la placa de ateroma en la pared, que obtura parcialmente la luz del vaso. D. Sección histológica de una arteria con la misma patología, que muestra cómo la placa de ateroma cierra prácticamente la luz del vaso. (A y B, ilustraciones de: E. Maldonado; C, procedente de: The Lancet, Vol. 370, Issue 9602, p1803-1804; D, procedente de: The Lancet, Vol. 372, Issue 9644, p11261128.) El mecanismo por el cual se produce la enfermedad es el siguiente: la ausencia de captación de LDL, sobre todo en los hepatocitos, conlleva un aumento de la producción hepática de colesterol. Dicho aumento se debe a que los bajos niveles citoplasmáticos de colesterol activan la hidroximetilglutaril-CoA reductasa, enzima limitante en la ruta de biosíntesis del colesterol. Al ser liberado, los niveles de colesterol en sangre aumentan de cuatro a seis veces por encima de su valor normal. Las manifestaciones clínicas de la enfermedad incluyen aterosclerosis y la aparición de xantomas y xantelasmas (depósitos de colesterol en la piel y en los párpados, respectivamente). El conocimiento de los mecanismos de la hipercolesterolemia familiar se debe a los estudios realizados por los investigadores Michael Brown y Joseph Goldstein en los años setenta del siglo xx. Gracias a su trabajo, consiguieron además sentar las bases para el estudio de los procesos de incorporación de macromoléculas por las células. Su descubrimiento les valió recibir el premio Nobel en Fisiología o Medicina en 1985. Muchos receptores transmembrana de la membrana plasmática, entre los que se encuentra el receptor de LDL, presentan «péptidos señal» que dirigen a dichos receptores a las depresiones revestidas. Uno de estos péptidos está constituido únicamente por cuatro aminoácidos: Y-X-X-ψ, siendo Y tirosina, X cualquier aminoácido polar y ψ un aminoácido hidrófobo. En el caso del receptor de LDL, esta señal está formada por los aminoácidos Asn-Pro-Val-Tyr. 220 Una vez que las moléculas de LDL se han unido a sus receptores en las depresiones revestidas, estas se invaginan para formar las vesículas recubiertas de clatrina. La clatrina es una proteína formada por tres subunidades grandes y tres pequeñas que forman una estructura trirradiada denominada «trisquelión» (fig. 5-5). Los trisqueliones se ensamblan formando una red de hexágonos y pentágonos a modo de cesto, configurando la depresión revestida. Cuando se forma la vesícula, se organizan 36 trisqueliones, formando 12 pentágonos y 8 hexágonos. FIGURA 5-5 Estructura de la molécula de clatrina. A. Modelo molecular de las estructuras primaria y secundaria de un trisquelión de clatrina. B. Modelo molecular de la organización tridimensional de los trisqueliones para rodear a las vesículas endocitadas, dando lugar a las vesículas revestidas. La cubierta está formada por 36 trisqueliones organizados en una red de 12 pentágonos y 6 hexágonos. (Procedente de: Stagg et al. Curr Opin Struct Biol 2007;17[2]:221-8.) Además de la clatrina, en las vesículas revestidas encontramos otras proteínas. De entre ellas, la más importante es el complejo adaptina, que sirve de puente entre el receptor de transporte (p. ej., el receptor de LDL) y las moléculas de clatrina (fig. 5-6). La formación de la depresión revestida está facilitada por el ensamblaje progresivo de adaptinas y trisqueliones de clatrina en la cara citosólica de la membrana. En este proceso son muy importantes las interacciones laterales entre las moléculas para dar forma a la depresión y a la vesícula revestida. FIGURA 5-6 Formación de las depresiones y de las vesículas recubiertas de clatrina. La adaptina se une a los trisqueliones de clatrina y a los receptores de moléculas específicas, favoreciendo de esta forma la concentración de receptores en las depresiones. Para la separación de la vesícula, se requiere la participación de la dinamina. Cuando la vesícula ya se ha internalizado, la cubierta se separa rápidamente y sus componentes vuelven a la membrana plasmática, donde formarán una nueva depresión revestida. (Ilustración de: E. Maldonado.) 221 Para que la vesícula se pueda separar de la membrana plasmática, son necesarias una serie de proteínas que la estrangulen. La dinamina (v. fig. 5-6), una GTPasa de 100 kDa, es la proteína clave en este proceso, ya que cataliza y regula la frecuencia de separación de las vesículas. Junto con otras proteínas, la dinamina se ensambla en el cuello de la vesícula y contribuye a deformar y desestabilizar las membranas, lo que provoca su separación de la membrana plasmática. Se cree que la dinamina distorsiona la estructura de la bicapa lipídica y que también altera la composición de los lípidos. Una vez se ha separado la vesícula, la cubierta de clatrina se desprende inmediatamente. Esta eliminación depende de una chaperona, la HSP70, que separa las proteínas de la cubierta mediante su actividad ATPasa. La HSP70 es activada por una proteína unida a la vesícula: la auxilina. Las adaptinas y clatrinas separadas vuelven a la membrana plasmática para formar nuevas depresiones revestidas. El proceso de endocitosis en vesículas recubiertas por clatrina se muestra al microscopio electrónico de transmisión en la figura 5-7. FIGURA 5-7 Imágenes de microscopía electrónica de transmisión que muestran la secuencia de formación de las vesículas recubiertas. A. En la secuencia de imágenes se puede ver cómo el material de carga se va concentrando en la superficie de la depresión revestida formando una densa capa. B. Asimismo, se observa la progresiva invaginación de la membrana, debida al ensamblaje de clatrina. C. Por último, se estrangula el cuello de la vesícula y se fusionan las membranas. D. También se muestra una vesícula internalizada que aún no ha perdido su cubierta de clatrina. (Procedente de: Perry et al. J Cell Sci 1979;39:257-72.) Todas las vesículas cargadas de complejos receptor-ligando continúan la ruta endocítica hacia los endosomas. El endosoma es un orgánulo constituido por túbulos y vesículas delimitadas por una membrana que se extiende desde la periferia celular, justo debajo de la membrana plasmática (endosoma temprano), hasta localizaciones perinucleares cercanas al Golgi (endosoma tardío) (fig. 5-8). Estos orgánulos son intermediarios del proceso endocítico y tienen la función primordial de clasificar las sustancias endocitadas y dirigirlas hacia diferentes rutas intracelulares. Son, asimismo, orgánulos donde se produce el desacoplamiento ligando-receptor. Aparte de la localización, los endosomas se diferencian por su contenido interno y por su pH. Estos orgánulos muestran un ambiente ácido gracias a las bombas de protones (H ) dependientes de ATP (ATPasa-V) que introducen H desde el citosol al lumen. Los + + endosomas tardíos son los que tienen un pH más ácido. 222 FIGURA 5-8 Participación del endosoma en la endocitosis. Las moléculas que se unen a sus receptores en la superficie de la célula son endocitadas y posteriormente se fusionan con los endosomas tempranos. Aquí los ligandos se disocian de sus receptores gracias al pH ácido del interior del endosoma; esto se consigue mediante la actividad de una bomba ATPasa de membrana. Los ligandos continúan su camino hacia el endosoma tardío, donde se unen a vesículas procedentes del Golgi cargadas de enzimas hidrolíticas, dando lugar así al lisosoma. El tráfico de vesículas entre el Golgi y el endosoma está mediado por vesículas recubiertas de clatrina o de COP I (para el tráfico retrógrado; v. capítulo 10). CGN, red Cis del Golgi; TGN, red Trans del Golgi. (Ilustración de: E. Maldonado.) La primera estación de la ruta de endocitosis la constituyen los endosomas tempranos, donde se clasifican las moléculas para sus destinos posteriores (v. más adelante). La acidez del lumen endosómico favorece que los receptores liberen sus ligandos. Los receptores pueden entonces ser devueltos a la membrana mediante vesículas de transporte (vía del reciclaje de los receptores) o continuar la misma ruta de degradación que los ligandos. El contenido de los endosomas tempranos madura en los endosomas tardíos, situados normalmente en una localización más interna de la célula que los endosomas tempranos. Las moléculas cuyo destino final es la degradación viajan, por lo tanto, desde los endosomas tempranos hasta los tardíos. El mecanismo mediante el cual se lleva a cabo el transporte no está claro. Se cree que fragmentos de los endosomas tempranos migran, acoplados a los microtúbulos, hacia el interior celular, fusionándose entonces con los endosomas tardíos. Estos fragmentos de endosomas reciben el nombre de cuerpos multivesiculares, pues su membrana se ha invaginado y ha formado múltiples vesículas internas (fig. 5-9). Algunos investigadores sugieren que los cuerpos multivesiculares se fusionan entre sí para formar el endosoma tardío. Otra hipótesis establece que es el mismo endosoma temprano (o parte de él) el que se transforma en tardío, introduciéndose hacia el interior del citoplasma. Al final, los endosomas tardíos se fusionan con vesículas cargadas de hidrolasas procedentes del complejo de Golgi y se acidifican hasta un pH < 6, convirtiéndose en lisosomas (v. capítulo 10). El pH ácido activa las enzimas hidrolíticas, comenzando así la digestión celular de las moléculas previamente endocitadas. 223 FIGURA 5-9 Imagen de microscopía electrónica de transmisión de una neurona de hipocampo de rata donde se aprecian cisternas de retículo endoplasmático rugoso (RER) y un cuerpo multivesicular (flecha). Obsérvese la presencia de varias vesículas adyacentes al cuerpo multivesicular. (Procedente de: Atlas of Ultrastructural Neurocytology: http://synapses.clm.utexas.edu.) Las vesículas endocitadas en la membrana plasmática pueden no finalizar en la ruta degradatoria; así, pueden dirigirse a un dominio distinto de la membrana, en un proceso denominado transcitosis (explicado más adelante en este capítulo). Por lo tanto, los receptores que participan en la endocitosis mediada por vesículas de clatrina pueden seguir una de esas tres rutas (fig. 5-10): 1. Vía del reciclaje. 2. Transcitosis. 3. Vía degradatoria en los lisosomas. 224 FIGURA 5-10 Posibles destinos para los receptores endocitados. La ilustración muestra las distintas vías que pueden seguir los receptores desde el endosoma temprano en una célula. La vía de reciclaje (1) devuelve a los receptores al mismo dominio de membrana del que procedían. En el proceso de transcitosis (2), por el contrario, se dirigen a un dominio distinto. Los receptores que no se reciclan siguen la ruta hacia el endosoma tardío y los lisosomas, donde serán finalmente degradados (3). (Ilustración de: E. Maldonado.) El receptor de LDL sigue la vía del reciclaje. Cuando la LDL se disocia en el endosoma temprano, los receptores se incorporan a la membrana plasmática a partir de vesículas de reciclaje que parten del endosoma, aportando membrana previamente retirada (en el proceso de endocitosis) y receptores. Otro ejemplo de la vía de reciclaje lo constituye el receptor de transferrina. La transferrina es una globulina sérica que fija y transporta hierro en la sangre. Cuando el receptor unido a la transferrina alcanza el compartimento endosómico, la transferrina libera el hierro unido, pero ella permanece unida al receptor. De esta manera, la apotransferrina (transferrina no unida a hierro) se recicla unida a su receptor, separándose de este cuando entra en contacto con el pH neutro del espacio extracelular. Así, la transferrina puede volver a la circulación y captar más hierro, y el hierro ya liberado queda a disposición de la célula para su utilización. La otra alternativa, aparte de la transcitosis que se comenta más adelante, es la vía de la degradación. Es el caso, por ejemplo, del receptor de EGF (del inglés epidermal growth factor, factor de crecimiento epidérmico). Estos receptores solo se acumulan en las depresiones revestidas cuando tienen el EGF unido y no se reciclan, sino que se degradan junto a su ligando en los lisosomas. Por lo tanto, la unión del EGF activa las vías de señalización intracelulares que estimulan la proliferación, tras lo cual disminuye el número de receptores de EGF disponibles mediante endocitosis. Este último proceso se conoce como regulación por disminución del receptor (downregulation) y sirve para reducir la sensibilidad de la célula al factor de crecimiento. Si no fuera así, las células sufrirían un crecimiento incontrolado que podría desembocar en la aparición de tumores. Endocitosis mediada por cavéolas 225 Las células, además de la endocitosis en vesículas recubiertas de clatrina, poseen otros mecanismos de pinocitosis. Uno de estos mecanismos está mediado por cavéolas (del latín, «pequeñas cavidades»), invaginaciones de membrana de entre 50 y 100 nm de diámetro. Las cavéolas se demostraron mediante microscopía electrónica en las células endoteliales, donde forman parte del proceso de transcitosis, aunque se encuentran en la mayoría de los tipos celulares. Resultan especialmente abundantes en los adipocitos, así como en neumocitos de tipo I y en células musculares lisas y estriadas. La membrana de las cavéolas es parecida a la que presentan las balsas lipídicas (lipid rafts), caracterizadas por ser regiones muy ricas en colesterol, glucoesfingolípidos, esfingomielina y proteínas unidas a membrana (como se explicó en el capítulo 3); estas regiones de la membrana se caracterizan también por contener receptores de señales celulares. La principal proteína presente en estas balsas es la caveolina, una proteína integral de membrana que favorece la formación de cavidades de la membrana en forma de matraz (fig. 5-11). Además de constituir el principal componente estructural de las cavéolas, las caveolinas actúan como proteínas de andamiaje, capaces de reclutar y concentrar múltiples moléculas señalizadoras, así como de regular su actividad. Por lo tanto, las cavéolas no están implicadas exclusivamente en el transporte de macromoléculas, sino también en procesos de transducción de señales. 226 FIGURA 5-11 A. Esquema donde se representa el mecanismo de formación de una cavéola. En un microdominio de la membrana interna, las moléculas de caveolina forman dímeros, forzando a la membrana a invaginarse y a adoptar la morfología típica de matraz. B. Imagen de microscopía electrónica en donde se observan numerosas cavéolas en la membrana, interconectadas entre sí, en el citoplasma celular. (A, ilustración de: E. Maldonado. B, imagen procedente de: http://pcwww.liv.ac.uk/~emunit/images/caveolae2.jpg.) La caveolina es sintetizada en el retículo endoplasmático rugoso (RER) y los monómeros se oligomerizan en heptámeros, que son fosforilados para prevenir su ensamblaje prematuro. Los heptámeros se transportan al Golgi, 227 donde se desfosforilan. En la red Trans del Golgi, la membrana que contiene la caveolina se enriquece en colesterol y, al invaginarse, forma la cavéola que se dirigirá a la membrana plasmática. Tras la fusión de membranas, queda en ella la región rica en colesterol que contiene la caveolina y que se endocitará para formar una nueva cavéola. Cuando las cavéolas se invaginan y se separan de la membrana, pueden dirigirse a compartimentos endosómicos o, mediante transcitosis, migrar hasta otro dominio de la membrana de una célula polarizada. En el proceso de invaginación y estrangulación de la cavéola también participa la dinamina. Actualmente, se conocen tres tipos de caveolinas: las caveolinas 1 y 2 se expresan de manera ubicua, mientras que la caveolina-3 es exclusiva del músculo estriado y cardíaco. La mutación del gen CAV-3, que codifica para la proteína caveolina-3, está relacionada con diversas patologías musculares. Estudios realizados con ratones knock-out para las caveolinas 1 y 2 implican también a estas cavéolas en diversas enfermedades humanas. El gen que codifica para la caveolina-3 se encuentra en el brazo corto del cromosoma 3 (en el locus 3p25) y, como hemos indicado, se expresa específicamente en el tejido muscular esquelético, tanto estriado como cardíaco. Las mutaciones identificadas en este gen interfieren con los procesos de oligomerización proteica o de señalización intracelular, interrumpiendo la formación de cavéolas y provocando distintas enfermedades musculares. Entre ellas, se encuentra la distrofia muscular congénita de tipo 1C, que se caracteriza por afectar principalmente a la musculatura de las cinturas escapular y pélvica. Esta enfermedad, de herencia autosómica dominante, cursa con una expresión muy disminuida de caveolina-3 en el tejido muscular, con la consiguiente pérdida de cavéolas en el sarcolema. La proteína caveolina-3 mutante forma agregados inestables con la proteína nativa, por lo que ambas formas son retenidas en el Golgi y destinadas, mediante ubiquitinación, a su degradación en el proteasoma. Las primeras manifestaciones de la enfermedad aparecen en la primera década de la vida, alrededor de los 5 años de edad, siendo el desarrollo motor normal hasta ese momento. Entre las manifestaciones clínicas de esta afección se incluyen debilidad muscular proximal (en las cinturas), mialgias, calambres musculares, seudohipertrofia de las pantorrillas y signo de Gowers positivo (signo clínico típicamente positivo en las distrofias musculares de la infancia). Los estudios complementarios demuestran altos niveles de creatina quinasa en el suero de estos pacientes y cambios distróficos en la biopsia muscular. Una miopatía más benigna, la enfermedad muscular ondulante (rippling muscle disease), también está causada por mutaciones del gen CAV-3. Esta patología se caracteriza por contracciones musculares inducidas por el estiramiento, que se extienden a las fibras musculares vecinas, dando la apariencia de ondas moviéndose sobre el músculo. El déficit de caveolina-3 también es causa de hiper-CKemia (elevación persistente de la creatina quinasa sérica sin debilidad muscular) y de enfermedades del corazón, como la miocardiopatía hipertrófica familiar o el síndrome de QT largo de tipo 9. Asimismo, se ha propuesto que la mutación de CAV-3 puede ser una causa del síndrome de muerte súbita del lactante. 228 Por otra parte, la endocitosis mediante cavéolas es utilizada por múltiples microorganismos patógenos para infectar las células; entre ellos encontramos al virus SV40 (simian virus 40), que constituye el paradigma de patógeno que utiliza las cavéolas para penetrar en las células. Aunque se desconoce si es un agente infeccioso en humanos, su patrón de infección podría ser similar al que utilizan otros virus infectivos para el hombre. El SV40 se une a su receptor de membrana (se cree que lo hace a glucolípidos o proteínas de unión a GPI muy numerosas en las cavéolas) y, tras ser endocitado, se acumula en unas estructuras denominadas caveosomas (endosomas que contienen caveolina-1 en su membrana). Posteriormente, es transferido al retículo endoplasmático rugoso, donde inicia el ciclo infectivo. De esta forma, el virus evita la ruta clásica endosoma-lisosoma y no sufre la acción degradativa de las hidrolasas ácidas. Por último, las cavéolas parecen desempeñar un papel destacado en la homeostasis del colesterol. Los niveles de expresión de caveolina-1 se relacionan directamente con los de colesterol celular, pues ambas moléculas se encuentran en altas concentraciones en las cavéolas. También se ha demostrado que la caveolina-1 transporta moléculas de colesterol de nueva síntesis desde el retículo endoplasmático a las cavéolas. Una vez en la membrana, este colesterol se libera y es captado por las lipoproteínas de alta densidad, o HDL (del inglés high density lipoproteins). Estos datos sugieren que las cavéolas son el principal sitio de intercambio de colesterol entre la membrana plasmática y las moléculas de HDL, aunque aún no se ha confirmado. Macropinocitosis Por su parte, la macropinocitosis es el proceso de endocitosis de fase fluida en grandes vesículas (macropinosomas) de entre 0,15 y 5,0 μm de diámetro (fig. 5-12). Se basa en la formación de evaginaciones de membrana, a modo de lamelipodios, basadas a su vez en la polimerización de la actina. El tipo celular en el que más se ha estudiado esta forma de endocitosis es la célula dendrítica. En su forma inmadura, estas células incorporan múltiples antígenos disueltos en el fluido extracelular para su ulterior procesamiento y presentación, asociados a moléculas del complejo principal de histocompatibilidad II (CPH-II). La macropinocitosis sería, en este caso, un proceso constitutivo que no se observa en las células dendríticas maduras. Por otra parte, hay células en las que se desarrollan estas vesículas en respuesta a la estimulación con factores de crecimiento; entre ellas, se encuentran macrófagos, linfocitos, fibroblastos y células epiteliales. 229 FIGURA 5-12 Imagen de microscopía electrónica que muestra la formación de varios macropinosomas en la superficie de una célula. La formación de macropinosomas se indujo en células en cultivo mediante el tratamiento con ésteres de forbol (TPA). La enzima peroxidasa de rábano (HRP, del inglés horseradish peroxidase) se añadió también al cultivo celular y, tras ser captada en los macropinosomas, se reveló su actividad enzimática con diaminobencidina y H2O2, dando lugar al color negro que se observa en la imagen. Las flechas indican las ondulaciones de membrana. FS, superficie libre de la célula; Mp, macropinosoma. (Reproducida de Grimmer, S. et al. Jounal of Cell Science 115, 2953-2962 (2002) © The Company of Biologists Ltd.) Actualmente, se están estudiando otras funciones de la macropinocitosis, como el hecho de que sirvan de puerta de entrada para microorganismos patógenos, entre los cuales se puede citar el virus del Ébola. La macropinocitosis se puede inducir en células en cultivo mediante el tratamiento de las células con ésteres de forbol (v. fig. 5-12), que son agentes que activan la proteína quinasa C (PKC), lo que muestra la implicación de dicha enzima en el proceso. Fagocitosis La fagocitosis («comida celular») es una forma de endocitosis especializada, pues solo la llevan a cabo unas células denominadas «fagocitos profesionales». En los mamíferos hay tres tipos celulares con capacidad fagocítica: los macrófagos, los leucocitos polimorfonucleares neutrófilos y las células dendríticas. Su capacidad de fagocitosis defiende al organismo frente a las infecciones, ingiriendo y eliminando los microorganismos patógenos (fig. 5-13). Además, los macrófagos desempeñan una función muy importante al digerir los restos de células senescentes o que han muerto por apoptosis. El ejemplo más claro de esta última función lo encontramos en el bazo, donde los macrófagos retiran diariamente de la circulación más de 10 eritrocitos viejos. 11 230 FIGURA 5-13 Imagen de microscopía electrónica de transmisión de un neutrófilo que ha fagocitado a la bacteria Bacillus anthracis. La flecha indica una espora, y la punta de flecha, una bacteria germinada. El recuadro superior muestra con más aumento la espora y la bacteria germinada. Barra en la imagen: 5 μm; barra en el recuadro: 500 nm. (Procedente de: Mayer-Scholl et al. PlosPathogenes 2005;1[3]:e23.) El mecanismo de fagocitosis se desencadena por la unión de determinadas moléculas de membrana a receptores específicos de la célula fagocítica. Esto provoca que la célula emita unas extensiones citoplasmáticas, o seudópodos, que, gracias a un movimiento basado en la polimerización de actina, van cerrándose progresivamente alrededor del microorganismo, partícula o célula a eliminar. Las membranas de los seudópodos terminan por confluir y fusionarse para delimitar la vesícula fagocítica o fagosoma (fig. 5-14). Las moléculas que activan la fagocitosis se denominan opsoninas; de entre ellas, las más estudiadas son los anticuerpos, que se unen por su fracción variable a la membrana del patógeno y exponen su fracción constante (Fc) a los receptores Fc de la superficie de macrófagos y neutrófilos. Las fracciones C3b del complemento, la fibronectina y la fosfatidilserina (un fosfolípido de la cara citosólica de la membrana plasmática) también actúan como opsoninas. En el caso de la fosfatidilserina, las células que están en apoptosis pierden la distribución normal de lípidos de membrana y así exponen la fosfatidilserina al exterior celular (v. capítulo 3), activando la célula fagocítica, que eliminará a la célula apoptótica. 231 FIGURA 5-14 Proceso de fagocitosis por parte de un neutrófilo. La fagocitosis comienza cuando la célula reconoce el material a endocitar; en este proceso, son clave los anticuerpos, que se unen por su región variable a los antígenos del microorganismo, y por su región constante (Fc) al receptor Fc del neutrófilo. Una vez fijado, el microorganismo es rodeado por seudópodos del neutrófilo. Los seudópodos terminan por confluir, fusionando sus membranas. Posteriormente se forma el «fagosoma», al que se unen los lisosomas para formar el fagolisosoma, donde se producirá la digestión del patógeno. Las enzimas lisosómicas matan y digieren al microorganismo fagocitado y el material digerido puede ser liberado al exterior celular mediante exocitosis o bien permanecer en el interior de la célula formando un cuerpo residual. (Ilustración de: E. Maldonado.) Una vez formado el fagosoma, se unen a él los lisosomas, cuyas enzimas digieren el material ingerido. La vesícula resultante tras la unión de los lisosomas se denomina fagolisosoma. Si el material no puede ser digerido completamente, permanecerá en el interior del lisosoma formando un cuerpo residual (fig. 5-15). Antes de que se produzca la fusión de los lisosomas, hay moléculas de la membrana endocitada que son recicladas en vesículas de transporte y devueltas a la membrana plasmática. Por otro lado, existen materiales que los macrófagos no pueden fagocitar completamente, bien por su excesivo tamaño, o por tratarse de partículas inertes (suturas, látex, etc.). Cuando esto ocurre, se pueden unir un grupo de macrófagos para formar una célula gigante de cuerpo extraño que envuelva dicho material (fig. 5-16). FIGURA 5-15 Cuerpo residual (flecha) en el interior de una célula observado al microscopio electrónico de transmisión. El cuerpo residual es la última estación en la ruta de digestión lisosómica. (Imagen procedente de: SynapseWeb, Harris KM: http://synapses.clm.utexas.edu.) 232 FIGURA 5-16 Corte histológico de mama que muestra una célula gigante de cuerpo extraño con numerosos núcleos en su interior (flecha) originada como reacción a la silicona (material birrefringente claro que aparece en la imagen). (Procedente de: http://www.breastpathology.info/BMS%20Trimming.html.) Tras una fagocitosis de gran intensidad ante una infección bacteriana, aumenta mucho la presión osmótica en el interior de los fagocitos. Si se supera un determinado umbral de presión, las membranas pueden romperse y se provoca la autólisis de las células fagocíticas por las propias enzimas hidrolíticas. Los restos de macrófagos y neutrófilos necrosados forman entonces el pus. Transcitosis Como se ha comentado con anterioridad, la transcitosis (también llamada «citopensis») es el transporte intracelular de moléculas desde un espacio extracelular a otro diferente mediante vesículas de endo- y exocitosis. Este tipo de transporte tiene lugar, sobre todo, en células epiteliales polarizadas, como el endotelio vascular o los enterocitos de la mucosa intestinal. Un ejemplo de transcitosis lo encontramos en el transporte intracelular de la inmunoglobulina A (fig. 5-17). En los recién nacidos, el sistema inmunitario no está aún desarrollado y las defensas del organismo son escasas. Por este motivo, el calostro contiene inmunoglobulinas del tipo IgA, que son incorporadas a la circulación del neonato a través del epitelio intestinal. Cuando la leche materna alcanza el intestino, el pH ácido de la luz favorece la unión de las IgA con sus receptores en la superficie de los enterocitos. Tras la unión, se forman vesículas recubiertas de clatrina que se unen con los endosomas tempranos. De los endosomas, parten vesículas de transporte exocíticas que se fusionan con la membrana basolateral de la célula. El pH neutro del fluido extracelular provoca que la IgA se disocie de su receptor y pueda pasar a la circulación. 233 FIGURA 5-17 Transcitosis. El dibujo de la izquierda muestra el proceso de transcitosis de las IgA desde la parte basal de células epiteliales de la glándula mamaria hacia la luz. El de la derecha muestra la transcitosis de la IgA desde la parte apical de la célula epitelial de enterocitos a la parte basal, donde alcanza los vasos sanguíneos. (Ilustración de: E. Maldonado.) Pero antes, para que la IgA llegue a la leche materna, es necesario otro proceso de transcitosis. Durante el embarazo, con el desarrollo de las glándulas mamarias, el tejido conjuntivo que rodea a los lobulillos glandulares es infiltrado por linfocitos B. Estos linfocitos B se diferencian a células plasmáticas productoras de IgA; las IgA secretadas son captadas por la parte basal de la membrana plasmática de las células del epitelio glandular, que las exocitan en la superficie luminal para que formen parte de la secreción láctea (v. fig. 5-17). Este mismo proceso ocurre en otros epitelios, como el de las glándulas salivales o el epitelio intestinal adulto, ya que las IgA forman parte de las secreciones de dichos tejidos. Pero, sin duda, el proceso de transcitosis más importante es el que tiene lugar en el endotelio vascular. Los capilares sanguíneos y las vénulas poscapilares son los vasos de intercambio de sustancias, y están constituidos solamente por una capa de células endoteliales. Para que exista un intercambio eficaz de sustancias (nutrientes o moléculas de desecho) entre los tejidos y la sangre, dichas sustancias han de atravesar la barrera endotelial. El transporte de macromoléculas en uno y otro sentido se realiza mediante el proceso de citopensis de vesículas revestidas y, sobre todo, de cavéolas. 234 Exocitosis La exocitosis constituye el proceso de fusión de vesículas intracelulares con la membrana plasmática para liberar su contenido al espacio extracelular. Estas vesículas proceden del complejo de Golgi y se encargan de aportar material proteico y lipídico a la membrana de la célula. En su interior, pueden contener moléculas muy diversas, y el momento en el que se produce la secreción distingue los dos procesos de exocitosis. La exocitosis constitutiva aporta las moléculas que forman parte de la matriz extracelular, además de ampliar la superficie de la membrana por la fusión de las bicapas lipídicas. Por su parte, la exocitosis regulada es propia de células especializadas y, mediante esta vía, se secretan hormonas, neurotransmisores o enzimas (fig. 5-18). FIGURA 5-18 Esquema de las dos rutas de exocitosis: constitutiva y regulada. Ambas vías se separan en la red Trans del Golgi. La vía constitutiva tiene lugar en todas las células de forma continua; la regulada solo ocurre en aquellas células especializadas en la secreción de neurotransmisores, enzimas u hormonas, y se activa siempre en respuesta a un estímulo extracelular. CGN, red Cis del Golgi; TGN, red Trans del Golgi. Exocitosis constitutiva La exocitosis constitutiva es la ruta de exocitosis por defecto. En las células no polarizadas, o en aquellas encargadas de formar la matriz extracelular, las vesículas que salen del Golgi se dirigen, sin ninguna señal específica, hacia la membrana plasmática. Para la fusión de membranas no se necesita una señal extracelular, algo que sí ocurre en la vía de secreción regulada. La vía constitutiva es realizada de un modo continuo por la mayor parte de las células. Entre las moléculas que salen al medio extracelular por esta ruta, se incluyen proteoglucanos y proteínas de la matriz extracelular, elementos de las membranas basales de los epitelios, receptores celulares de membrana y los constituyentes de la propia membrana y del glucocáliz. 235 Cuando las vesículas de secreción se unen con la membrana plasmática, su membrana se suma a la de la célula. Esto provoca un aumento en la superficie total de la membrana, aunque efímero, pues al mismo tiempo se están internalizando fragmentos de membrana por endocitosis. Existe, por lo tanto, un equilibrio entre los flujos endo- y exocítico que regula el crecimiento celular. Los mecanismos de control de esta homeostasis de membrana aún no se conocen. Exocitosis regulada Las células especializadas en secretar sustancias cuando reciben el estímulo adecuado son las únicas que presentan exocitosis regulada. Las sustancias que se secretan son sintetizadas previamente en el retículo endoplasmático, procesadas en el Golgi y almacenadas en vesículas de secreción. 236 Gemación y fusión de vesículas en los procesos de endocitosis y exocitosis La gemación y formación de las vesículas y el tráfico de estas entre los distintos compartimentos celulares que participan en los procesos de endocitosis y exocitosis requieren la intervención de tres grupos de proteínas: a) proteínas de recubrimiento de la vesícula; b) proteínas GTPasas monoméricas y proteínas adaptadoras, que regulan el proceso de gemación y fusión, y c) proteínas transmembrana de la familia SNARE, que sirven para el anclaje específico entre la vesícula y el compartimento con el que se fusionan. Hay que tener en cuenta, no obstante, que las proteínas que intervienen son específicas en cada caso, dependiendo del tipo de compartimento dador-aceptor. Las vesículas que geman de un compartimento celular concreto pueden estar recubiertas por clatrina o por coatómeros, que pueden ser de dos tipos: COPI y COPII (v. capítulo 10). El recubrimiento de clatrina participa en la endocitosis, la exocitosis regulada y en el transporte bidireccional entre la zona Trans del Golgi, los endosomas, los lisosomas y la membrana plasmática. El recubrimiento de COPII participa en el transporte de vesículas desde el retículo endoplasmático hasta el Cis-Golgi. Las vesículas que contienen COPI viajan a través de los sacos del Golgi y realizan un transporte retrógrado Golgi-retículo endoplasmático; participan también en la secreción constitutiva. A diferencia del recubrimiento de clatrina (que se pierde poco después de ocurrir la gemación de la vesícula), los coatómeros se mantienen en la vesícula durante su desplazamiento por el citoplasma. En cuanto a las proteínas GTPasas monoméricas, intervienen dos familias: a) las GTPasas reclutadoras del recubrimiento: ARF (para el recubrimiento de clatrina y COPI) y Sar1 (para el recubrimiento de COPII), y b) familia de las Rab; ambas familias pertenecen a la superfamilia de las proteínas Ras (v. capítulo 13). Estas proteínas son activas cuando llevan GTP unido, mientras que su unión a GDP determina su estado inactivo. Para pasar del estado inactivo al activo se requiere de la actuación de un factor de intercambio de nucleótidos de guanina GEF (guanine nucleotide exchange factor), que intercambia el GDP por GTP. Al contrario, para que la proteína se inactive se necesita la actividad de la proteína GAP (GTPase activating protein), que acelera la actividad de las GTPasas para que puedan disociar el GTP en GDP+Pi. Nos centraremos, a modo de ejemplo, en la formación de vesículas de clatrina en la zona Trans del Golgi mediante la actividad de ARF. En condiciones basales, antes de que comience el proceso de gemación de las vesículas, la proteína ARF se encuentra unida a GDP en el citoplasma (fig. 5-19). La actuación del factor GEF (localizado en la membrana del Golgi) añade GTP a la proteína ARF, produciendo un cambio conformacional que le permite activarse y anclarse a la membrana. La ARF-GTP recluta y une proteínas adaptadoras que comienzan el proceso de gemación de la vesícula a la vez que sirven de puente entre las proteínas transmembrana y la clatrina. El ensamblaje de la clatrina sobre las proteínas adaptadoras es responsable del proceso de gemación y formación de una vesícula esférica (v. fig. 5-19). Cuando la vesícula ya se ha formado, se induce la actividad GTPasa de ARF mediante una proteína gap, hidrolizándose GTP en GDP+Pi, lo que conlleva un cambio conformacional que provoca el desensamblaje de la cubierta. Se piensa que este proceso de gemación y formación de la cubierta de clatrina puede 237 ocurrir también en la endocitosis mediada por receptor que tiene lugar en la membrana plasmática, pero los componentes moleculares que intervienen no han sido dilucidados. La fusión de la vesícula secretora con la membrana del orgánulo diana requiere de dos acontecimientos consecutivos. El primero de ellos es el reconocimiento de la membrana diana con la cual la vesícula se ha de fusionar y el segundo es la fusión en sí misma: la unión de las membranas y la liberación del contenido de la vesícula al orgánulo diana o al espacio extracelular. Existen dos familias de proteínas responsables del reconocimiento específico de membranas y de su ulterior unión: las SNARE y las GTPasas de direccionamiento Rab. FIGURA 5-19 Participación de las proteínas ARF en la gemación de vesículas recubiertas por clatrina en la zona Trans del Golgi. Antes del comienzo de la gemación, ARF está unido a GDP en el citosol. Al iniciarse la gemación, el factor GEF intercambia GDP por GTP, y ARF cambia de conformación y se ancla en la membrana. Esto inicia el proceso de reclutamiento de proteínas adaptadoras y clatrina, que se asocian y forman la vesícula. Tras la formación, el factor GAP (no mostrado en el dibujo) induce la disociación del GTP en GDP+Pi y se desensambla el recubrimiento de la vesícula. (Ilustración de: E. Maldonado y A. Calvo.) Las proteínas SNARE son proteínas transmembrana complementarias, presentes en la membrana de las vesículas (v-SNARE) y en la membrana diana (t-SNARE; la t proviene del inglés target, diana) (fig. 5-20). En su dominio citoplasmático presentan una estructura helicoidal que, al interaccionar con la SNARE complementaria, forma complejos estables que favorecen la unión de las membranas. Por su parte, las proteínas Rab son las encargadas de regular la frecuencia de anclaje y fusión de vesículas mediante su interacción con las SNARE. Las proteínas Rab son GTPasas que, unidas a GDP, se encuentran inactivas y libres en el citosol. En su estado Rab-GTP, están unidas a la membrana de la vesícula o del orgánulo diana. En este estado, la proteína se puede unir a otras (los efectores de Rab) que van a dirigir la vesícula hacia su membrana diana específica (v. fig. 5-20). El resultado final de la acción de Rab y sus efectores es concentrar vesículas cerca de la membrana diana y activar las proteínas SNARE para la fusión y la exocitosis. 238 FIGURA 5-20 Mecanismo propuesto para el trasvase de vesículas de un compartimento celular a otro, donde participan las proteínas Rab y SNARE. Una proteína GEF cataliza el cambio de Rab-GDP a Rab-GTP. En su forma activa, la proteína se une a la membrana de la vesícula en formación (este mecanismo es el mismo que para el ensamblaje de la cubierta, omitido en esta imagen). Una vez que la vesícula llega a la membrana diana, Rab interacciona con las proteínas efectoras de Rab, lo que favorece el anclaje y la interacción entre las v- y t-SNARE. Tras la fusión de membranas, el GTP se hidroliza a GDP y Rab queda libre, pudiendo ser reutilizada. La forma libre en el citosol de Rab-GDP se encuentra unida a un inhibidor de la disociación de GDP que impide que este nucleótido se intercambie antes de llegar a la membrana dadora. (Ilustración de: E. Maldonado.) Para que dicha fusión se lleve a cabo, las membranas han de estar ancladas mediante las proteínas v- y t-SNARE. Tras el anclaje, y ante el estímulo adecuado (un incremento del Ca intracelular en la exocitosis regulada), las SNARE 2+ interaccionan más estrechamente entre sí y reducen la distancia entre las membranas a 1,5 nm. A esta distancia, los lípidos pueden fluir de una membrana a otra, y así se disgregan y se fusionan. Pero, antes de la fusión, es necesario desplazar las moléculas de agua que se interponen entre las dos bicapas; para ello, se necesita energía, lo que implicaría reacciones catalizadas por proteínas especializadas en la fusión de membranas. También se cree que el enrollamiento de las hélices de las SNARE, con la consiguiente liberación de energía, expulsaría las moléculas de agua. 239 Exocitosis y endocitosis en la sinapsis neuronal El ejemplo más estudiado de exocitosis regulada es el de la sinapsis neuronal. La sinapsis es un tipo de unión intercelular mediante el cual una neurona es capaz de transmitir un potencial de acción eléctrico a otra célula (v. capítulo 4). Existen dos tipos de sinapsis: la química y la eléctrica. Aquí vamos a considerar únicamente la sinapsis química, cuyo mecanismo de transmisión es indirecto, pues las células están física y eléctricamente separadas. El espacio que separa la célula presináptica de la postsináptica mide unos 200-300 Å y recibe el nombre de hendidura o espacio sináptico. Cuando la neurona presináptica es excitada, sufre un cambio en su potencial eléctrico que provoca la liberación de los neurotransmisores, moléculas señal responsables de la transmisión nerviosa. Dichos transmisores, que se almacenan en vesículas exocíticas, determinan el tipo de sinapsis química. Existen neurotransmisores excitadores, como la acetilcolina (Ach), el glutamato y la serotonina; y otros inhibidores, como el ácido γ-aminobutírico y la glicina. El carácter excitador o inhibidor viene dado por el receptor al que se unen en la membrana de la neurona postsináptica y por el efecto que producen en ella. Estos receptores son proteínas transmembrana que actúan como canales iónicos regulados por el neurotransmisor, y son selectivos para determinados iones. Así, la apertura de canales de Na permite la entrada de este ión al interior celular, causando un incremento del potencial eléctrico y la + despolarización de la membrana. Por su parte, los canales permeables para el K o el Cl inhiben la transmisión + – nerviosa, pues «negativizan» el interior celular, dificultando la despolarización de la membrana. En resumen, la sinapsis excitadora es aquella en la que una corriente intracelular de Na despolariza la membrana postsináptica; y la + inhibidora es aquella en la que la corriente, ya sea de K o de Cl , hiperpolariza la neurona (v. capítulo 4). + – Pero no solo existen estos neurotransmisores. Hay otros, de estructura más compleja y conocidos como neuropéptidos, que se unen a receptores metabotrópicos. Estos receptores están formados por una proteína de siete dominios transmembrana unidos a proteínas G (v. capítulo 13), y median vías de señalización más complejas y de efectos más lentos y duraderos. La activación de estos receptores desencadena una cascada intracelular de segundos mensajeros que termina produciendo cambios en las neuronas que intervienen en procesos como el aprendizaje y la memoria. Mediante estudios realizados con microscopía electrónica, se pudo poner de manifiesto la estructura anatómica de la sinapsis. Los terminales presinápticos, estructuras terminales del axón, tienen forma redondeada u ovalada. En su interior podemos distinguir abundantes mitocondrias y unas estructuras esféricas de aproximadamente 50 nm de diámetro: las vesículas sinápticas. Algunas de estas vesículas se acumulan en regiones especializadas de la membrana presináptica denominadas «zonas activas». Es aquí donde se produce la fusión de las vesículas y la liberación del neurotransmisor a la hendidura sináptica (fig. 5-21). Las vesículas sinápticas tienen un proceso especial de síntesis que merece la pena comentar. Cuando una neurona es estimulada, debe liberar rápidamente vesículas cargadas de neurotransmisor para transmitir el impulso nervioso. Además, los estímulos pueden ser continuos, lo que conlleva 240 una repetida liberación de vesículas sinápticas. Cabe pensar que, si las vesículas sinápticas, como el resto de las vesículas de exocitosis, se generan en el Golgi, la excitación nerviosa mantenida no sería posible, pues el transporte de vesículas a través del axón es un proceso lento. Por ello, se cree que el proceso de síntesis de vesículas sinápticas implica una serie de acontecimientos que se describen a continuación (v. fig. 5-21). FIGURA 5-21 A. Imagen de microscopía electrónica de transmisión de una sinapsis axosomática sobre una célula de Purkinje (P). En el botón presináptico (B) se aprecian varias mitocondrias y múltiples vesículas sinápticas, la mayoría de ellas concentradas en la zona activa (zona más electrodensa de la membrana presináptica). Entre ambas membranas se encuentra la hendidura sináptica. B. Sinapsis axodendrítica. Se aprecia el momento justo en el que varias vesículas de neurotransmisor se fusionan con la membrana presináptica para liberar su contenido a la hendidura sináptica (flechas). A, axón; D, dendrita. C. Esquema que muestra el proceso molecular propuesto para la formación de vesículas sinápticas. (A y B, procedentes de: SynapseWeb, Harris KM: http://synapses.clm.utexas.edu. C, ilustración de: E. Maldonado.) Desde la red Trans del Golgi surgen vesículas que contienen en su membrana proteínas estructurales y transportadoras propias de las vesículas sinápticas. Estas vesículas son transportadas a lo largo del axón mediante transporte anterógrado rápido (200-400 μm/día) utilizando los neurotúbulos y neurofilamentos. Cuando han llegado al terminal presináptico, se fusionan con la membrana plasmática para liberar los componentes de las vesículas sinápticas, lo que constituye un proceso de exocitosis constitutiva. Posteriormente, estos componentes son endocitados (mediante vesículas recubiertas de clatrina) y pueden seguir dos vías: formar directamente vesículas sinápticas, o bien fusionarse con un endosoma, que funcionaría como estación intermedia. Una vez formadas por una u otra ruta, las vesículas se cargan de neurotransmisor mediante una proteína de contratransporte que intercambia protones con la molécula de neurotransmisor (Ach, dopamina, GABA u otros), que es sintetizada en el propio terminal. El transporte del neurotransmisor se lleva a cabo gracias al gradiente de protones creado por bombas de H + que se encuentran en la membrana de la vesícula. Aquí resulta clave el papel de las mitocondrias del botón terminal, pues se encargan de generar el ATP necesario para que se lleve a cabo este proceso. Tanto en las vesículas sinápticas como en la membrana plasmática presináptica se encuentran las proteínas que forman el complejo SNARE. La v-SNARE corresponde a la sinaptobrevina, y la t-SNARE a la sintaxina y la SNAP-25 241 (figs. 5-22 y 5-23). Algunas vesículas están ancladas a la membrana gracias a la unión parcial del complejo SNARE; dichas vesículas se encuentran en un estado de prefusión que permite la liberación rápida del neurotransmisor una vez llega el potencial de acción. FIGURA 5-22 Esquema que representa el complejo SNARE de la sinapsis neuronal. La sinaptobrevina (v-SNARE) se encuentra anclada con la sintaxina y la SNAP-25 (t-SNARE). La sinaptotagmina (con sus dominios C2A y C2B) es una proteína integral de la membrana vesicular que actúa como sensor de Ca2+. Cuando este se une, se pone en marcha toda la maquinaria que termina por unir ambas membranas y liberar el neurotransmisor al espacio sináptico. (Ilustración de: E. Maldonado.) 242 FIGURA 5-23 Esquema de la maquinaria exocítica de una vesícula sináptica con la membrana del terminal axónico. 1, la vesícula se encuentra anclada al citoesqueleto por la sinapsina. La llegada de Ca2+ activa a la calmodulina y esta a la CAM-quinasa, que libera a la vesícula. 2, la vesícula desciende hasta la membrana plasmática y las SNARE interactúan entre sí. 3, acoplamiento de las SNARE y fusión de las membranas. 4, el complejo NSF/α-SNAP, utilizando ATP, desensambla el complejo de fusión. 5, la vesícula vuelve al interior citoplasmático. (Ilustración de: E. Maldonado y A. Calvo.) Para que la liberación del neurotransmisor se lleve a cabo, la neurona debe ser previamente excitada por un potencial de acción que la recorra y que llegue hasta el botón presináptico. En este punto, el potencial activa canales de Ca dependientes de voltaje y se produce un incremento brusco y súbito de la concentración de Ca intracelular. El 2+ 2+ proceso de fusión de las vesículas sinápticas se puede dividir en cinco etapas (v. fig. 5-23). En la primera se produce una aproximación (1) de la vesícula desde una zona más interna del citoplasma, donde está anclada mediante la unión de la sinapsina al citoesqueleto, hacia la membrana plasmática. Parte del Ca que entra en el terminal se une a la 2+ calmodulina, una proteína que, tras dicha unión, sufre un cambio conformacional que le permite activar a la CAM quinasa. Esta enzima fosforila a la sinapsina, separándose entonces del citoesqueleto y dejando libre a la vesícula para que esta pueda ser exocitada. Por otro lado, el Ca que ha entrado en el botón terminal se une también a la sinaptotagmina, proteína sensora de 2+ calcio unida a la vesícula sináptica. Cuando la sinaptotagmina no está unida a Ca impide la interacción de las v- y t2+ SNARE. La unión al Ca promueve un cambio conformacional que deja libre a las SNARE para que se unan entre sí. 2+ La vesícula, por lo tanto, desciende (2) y las v- y t-SNARE, interactuando entre sí (3), facilitan el anclaje de la vesícula a la membrana plasmática. El siguiente paso es la fusión de las membranas, proceso en el que parece intervenir la proteína sinaptofisina (no dibujada en el esquema), que actúa como un poro que, al abrirse, inicia la fusión de las membranas y la liberación del neurotransmisor. Tras la fusión y liberación del neurotransmisor entra en acción el complejo formado por las proteínas α-SNAP y el factor sensible a N-etilmaleimida (NSF, del inglés N-ethylmaleimide sensitive factor), con el objetivo de desensamblar (4) el complejo de fusión y reciclar las SNARE. Este proceso requiere la energía proporcionada por la actividad ATPasa del NSF. La actividad de este complejo permite separar (5) de nuevo la vesícula y que la situación vuelva a la inicial (v. fig. 5-23). La incorporación de múltiples vesículas sinápticas incrementaría la superficie del botón terminal con la consiguiente desestructuración del mismo. Pero esto no ocurre, gracias a un proceso de endocitosis mediante el cual se recupera la membrana fusionada. Sin embargo, el proceso de endocitosis es mucho más lento que el de exocitosis, por lo que no se explica que la membrana no se altere, ni tampoco cómo puede la neurona presináptica descargar múltiples vesículas en un período de tiempo tan corto como el de la sinapsis (del orden de milisegundos). La explicación a estos fenómenos se encuentra en la llamada teoría de «kiss and run» («besa y corre»). Esta teoría defiende que, durante la exocitosis, la membrana de la vesícula sináptica no se fusiona por completo con la membrana plasmática, sino que se produce un contacto temporal y reversible de ambas membranas. Durante el mismo, se libera el neurotransmisor, e inmediatamente después, se internaliza la vesícula. Todo ello implica que los procesos de exocitosis y endocitosis dependen el uno del otro, es decir, que están interconectados. Las vesículas internalizadas por este proceso se pueden volver a cargar de neurotransmisor mediante el transportador transmembrana que 243 intercambia moléculas de neurotransmisor con protones. De esta manera, las vesículas son recicladas y quedan listas para volver a liberar su contenido en la misma sinapsis o en la siguiente. Para terminar de completar el proceso de la sinapsis, cuando el neurotransmisor es exocitado y difunde por la hendidura sináptica, se une a los receptores situados en la membrana del elemento postsináptico (pudiendo ser otra neurona o una célula efectora, como una fibra muscular o una célula glandular). Con el fin de ilustrar mejor este proceso, repasaremos el ejemplo de la unión neuromuscular. La unión neuromuscular es la sinapsis química que se produce entre una motoneurona y una fibra muscular esquelética, y es la responsable de la contracción muscular. El neurotransmisor de esta sinapsis es la acetilcolina (Ach), que es sintetizada a partir de acetil-CoA y colina en el terminal presináptico, en una reacción catalizada por la enzima colina acetiltransferasa (fig. 5-24). La Ach se incorpora a vesículas de endocitosis mediante un transporte acoplado de tipo antiporte, por el cual se introduce el neurotransmisor a costa de expulsar protones (H ). Los protones han sido + introducidos previamente en las vesículas en contra de gradiente mediante la actividad de una ATPasa de tipo vacuolar. Tras la despolarización de la motoneurona α, situada en el asta anterior de la médula espinal, el impulso nervioso recorre todo el axón hasta llegar al botón terminal para que las vesículas cargadas de Ach sean exocitadas. Cuando la Ach difunde por la hendidura sináptica, se une a su receptor en el sarcolema (membrana plasmática de la célula muscular). Tras dicha unión, el receptor, que es un canal para el Na , se abre y provoca una entrada de este ión + que despolariza la membrana e inicia el proceso de contracción muscular. FIGURA 5-24 El esquema representa el proceso general de la sinapsis colinérgica en la unión neuromuscular. 1, incorporación, mediante un cotransporte dependiente de Na+, de colina al botón terminal. Síntesis de acetilcolina (Ach) catalizada por la colina acetiltransferasa. 2, incorporación de Ach a la vesícula sináptica mediante un antiporte con H+. 3, cuando el Ca2+ penetra en el terminal, la vesícula sináptica es exocitada y la Ach se libera al espacio sináptico. 4, unión del neurotransmisor a sus receptores en la membrana de la célula muscular. 5, degradación de la Ach por la acetilcolinesterasa (AchE). (Ilustración de: E. Maldonado.) Para que el estímulo de la Ach no sea excesivo en intensidad ni en duración, el neurotransmisor debe ser rápidamente eliminado del espacio sináptico. Esto se consigue mediante la actividad de una enzima, la acetilcolinesterasa (AchE), presente en la hendidura y encargada de hidrolizar la Ach en acetato y colina, productos 244 sin actividad biológica. Posteriormente, la colina es captada por un transportador de membrana presináptico de tipo simporte acoplado al transporte de Na , que la reintroduce en el citoplasma del botón terminal para su reciclaje. + Por último, en el proceso de eliminación de neurotransmisores del espacio sináptico, muchos de ellos (pero no la Ach) se reciclan intactos, introduciéndose de nuevo en la neurona presináptica. Ejemplos de estos neurotransmisores son el GABA, la noradrenalina, la dopamina y la serotonina. Este sistema de transportadores es de tipo simporte y acopla la incorporación del neurotransmisor a la introducción de Na . Los transportadores de serotonina, dopamina y + noradrenalina son inhibidos por la cocaína. Estos transportadores poseen importancia clínica, pues son la diana de acción de algunos fármacos antidepresivos, conocidos como antidepresivos inhibidores de la recaptación. Estos pueden ser no selectivos (como los tricíclicos) o selectivos, como los inhibidores selectivos de la recaptación de serotonina. Su mecanismo de acción se fundamenta en la teoría monoaminérgica de la depresión, que postula que la génesis de esta enfermedad se encuentra en un déficit de neurotransmisión a nivel cerebral de determinados transmisores como la noradrenalina, la serotonina y la dopamina. Al administrar estos fármacos, los niveles de dichos neurotransmisores aumentan en el espacio sináptico. Con ello se favorece la transmisión nerviosa en determinadas regiones corticales y se produce una mejora de los síntomas depresivos. Para finalizar, comentaremos brevemente dos patologías que se producen por disfunciones en la sinapsis neuronal. La AchE de la placa neuromuscular constituye una importante diana terapéutica en el tratamiento de la miastenia grave (o gravis). Esta es una enfermedad autoinmune que afecta a la placa neuromuscular. En la mayoría de los casos, está causada por la presencia de autoanticuerpos dirigidos contra el receptor nicotínico de la Ach de la membrana de la fibra muscular. Estos anticuerpos pueden bloquear o destruir los receptores, disminuyendo su número e imposibilitando la contracción muscular. Clínicamente, la enfermedad se presenta con fatiga y debilidad fluctuante de la musculatura esquelética. Los síntomas empeoran con la actividad y mejoran con el reposo. La musculatura más frecuentemente afectada es la ocular extrínseca, provocando ptosis palpebral (caída del párpado superior) y diplopía (visión doble); también se afecta la musculatura bulbar, causando disartria (un trastorno del habla) y disfagia (dificultad para la deglución). Como ya se ha mencionado, el tratamiento de la enfermedad se basa en el empleo de fármacos anticolinesterásicos como la neostigmina y la piridostigmina. Estos agentes terapéuticos que inhiben la AchE provocan un aumento de la presencia de la Ach en la unión neuromuscular, con lo que se incrementa la fuerza muscular. Otros tratamientos se basan en reducir la respuesta inmunitaria anómala con el empleo de inmunodepresores, plasmaféresis, inmunoglobulina intravenosa o recurriendo a la timectomía. El otro ejemplo de enfermedad que afecta a la sinapsis es el botulismo. En este caso, se afecta la sinapsis colinérgica tanto en los ganglios nerviosos periféricos como en la unión neuromuscular. Constituye un síndrome neuroparalítico causado por la toxina de Clostridium botulinum (toxina botulínica), una bacteria anaerobia ubicua en nuestro medio. La neurotoxina de esta bacteria está compuesta por dos subunidades: una pesada, que se une al receptor de membrana, y otra ligera, que se transloca al interior del citoplasma neuronal mediante endocitosis mediada por receptor. En el interior celular, la toxina se une a la sinaptotagmina II bloqueando la liberación de la Ach y, por lo tanto, la sinapsis. 245 La enfermedad se presenta con debilidad de la musculatura inervada por los pares craneales de forma bilateral y continúa con afectación simétrica descendente. El tratamiento de la enfermedad se realiza con inmunoglobulinas antitoxina. La toxina botulínica (Botox ) se ha hecho famosa por su aplicación en la industria cosmética. Dosis diluidas de esta ® toxina se emplean para eliminar las arrugas que aparecen en la piel al suprimir la contracción de la musculatura facial. 246 Mecanismos de infección que dependen del macrotransporte a través de la membrana plasmática Como se indicó previamente, los microorganismos patógenos han desarrollado estrategias para infectar nuestras células utilizando las rutas de macrotransporte. Dicha capacidad de infección y de proliferación intracelular supone una ventaja adaptativa para ellos. En primer lugar, dentro de las células, los microorganismos se aprovechan de estas para obtener nutrientes y así poder desarrollarse y proliferar. Además, están a salvo de la acción de los anticuerpos y de los macrófagos, elementos constituyentes del sistema inmunitario. De esta manera, su erradicación resulta más complicada para el organismo hospedador. Los patógenos, agentes causantes de enfermedades infecciosas y parasitarias, constituyen un grupo muy heterogéneo de microorganismos. Probablemente, los más conocidos sean las bacterias y los virus, pero también podemos encontrar hongos, parásitos e, incluso, estructuras tan simples como las proteínas priónicas. En esta sección se exponen algunos ejemplos de cómo los patógenos se aprovechan de las rutas de endocitosis y exocitosis para infectar a las células y, posteriormente, diseminarse por otras estructuras del organismo. Endocitosis de virus por la célula huésped La mayoría de los virus penetran en las células mediante endocitosis. Tras esta, los virus siguen la ruta endocítica pasando por diversos compartimentos endosómicos y, una vez allí, liberan su genoma al citoplasma celular. El proceso difiere según el tipo de virus. Así, los virus envueltos (aquellos recubiertos de una membrana lipídica) fusionan su envoltura con la del orgánulo celular, gracias a un proceso catalizado por proteínas. Los virus no envueltos, por su parte, lisan la membrana de los endosomas o generan en ella un poro para que el genoma lo atraviese. El virus de la gripe (como se explicó en el capítulo 1) es un tipo de virus de ARN envuelto, único integrante de la familia de los ortomixovirus. En su bicapa lipídica hay dos tipos de proteínas integrales de membrana, la hemaglutinina (HA) y la neuraminidasa (NA). En su cara interna se encuentran las proteínas de la matriz (M1) y de membrana (M2). La hemaglutinina se une a un residuo de ácido siálico del receptor de la superficie celular epitelial y estimula la fusión de la envoltura vírica con la membrana celular. Tras la unión con el receptor, el virus sufre un proceso de endocitosis mediada por receptor y penetra en la célula en una vesícula recubierta de clatrina. A continuación, pasa por diversos compartimentos hasta llegar al endosoma tardío. En el ambiente ácido del endosoma (pH ∼ 5), la HA cataliza ribonucleoproteínas del virus (fig. 5-25). El último paso de la infección consiste en el anclaje de estas 247 ribonucleoproteínas a un complejo de poro nuclear y la internalización del ARN al interior del núcleo para su expresión y replicación. FIGURA 5-25 Penetración del virus de la gripe en las células. A través de la hemaglutinina, el virus se une a residuos de ácido siálico del receptor de membrana. A continuación, el complejo virus-receptor es endocitado en una vesícula recubierta. El virus llega finalmente al endosoma, cuyo pH ácido activa a la hemaglutinina; así, se fusionan las membranas y el genoma vírico es liberado al citosol del huésped. La liberación del ARN de su cubierta proteica se produce también gracias al ambiente ácido endosómico. (Ilustración de: E. Maldonado.) Cuando el virus ya se ha replicado y ha sintetizado las proteínas de la cápside, abandona la célula por gemación desde la superficie apical de las células de las vías respiratorias superiores. Así, puede infectar a otras células o transmitirse a otro huésped. Mecanismos de infección de las bacterias intracelulares El caso de las bacterias es distinto. Las bacterias presentan un tamaño mucho mayor que el de los virus, con lo que no pueden aprovecharse del mecanismo de endocitosis mediada por receptor. Como se vio en el apartado «Fagocitosis» de este mismo capítulo, las bacterias son fagocitadas por diversos tipos celulares para prevenir y eliminar la infección. Ahora bien, existen bacterias de vida intracelular que han desarrollado la capacidad de sobrevivir en el ambiente hostil de los fagocitos; en su interior, pueden permanecer en estado de latencia o incluso proliferar y continuar con el proceso infeccioso. Un ejemplo clásico de bacteria intracelular es el Mycobacterium tuberculosis o bacilo de Koch, agente responsable de la tuberculosis. La tuberculosis es una enfermedad que afecta de forma característica a los pulmones, causando una lesión típica: el granuloma caseoso. Cuando una persona se expone a la bacteria, esta alcanza las vías respiratorias inferiores llegando hasta los alvéolos, donde son fagocitadas por los macrófagos alveolares. Para sobrevivir en su interior, M. tuberculosis inhibe la fusión entre el fagosoma y los lisosomas, impidiendo así que las enzimas ácidas la ataquen. Además, los bacilos fagocitados forman intermediarios reactivos del nitrógeno a partir del NO y los aniones superóxido, con lo que evitan su destrucción. Tras la infección, los macrófagos secretan determinadas moléculas que favorecen la inflamación, atrayendo hacia el foco infeccioso a linfocitos T y células NK. El resultado de todo ello es la formación del granuloma tuberculoso, una estructura histopatológica formada por un núcleo necrótico de macrófagos, células epitelioides y células gigantes de Langhans con micobacterias fagocitadas, todo ello rodeado por 248 una pared de linfocitos T, células NK y macrófagos. Las micobacterias pueden quedar, así, en un estado latente que puede prolongarse durante décadas. Los cambios en el estado inmunológico del paciente portador de los bacilos pueden reactivar la infección y causar la enfermedad tuberculosa. Por otra parte, hay bacterias capaces de inducir un proceso de fagocitosis en células que no disponen habitualmente de esta capacidad. Un ejemplo de estas bacterias lo constituye Listeria monocytogenes, un bacilo grampositivo intracelular. Listeria es un patógeno ubicuo causante de listeriosis, una rara enfermedad relacionada con el consumo de alimentos contaminados. Cuando se ingieren dichos alimentos, la bacteria es capaz de sobrevivir a la acción de los ácidos gástricos, las enzimas digestivas y las sales biliares. De esta forma, alcanza el intestino y se une a los enterocitos y las células M de las placas de Peyer. Para adherirse a la membrana celular, Listeria utiliza unas proteínas, denominadas internalinas, que se unen a la cadherina E (proteína de adhesión). Este hecho provoca que la célula intente formar un complejo de unión movilizando el citoesqueleto de actina (v. capítulo 12); finalmente, la célula se va extendiendo alrededor de la bacteria y esta termina por ser fagocitada. Este mecanismo de invasión se conoce como mecanismo de tipo cremallera (fig. 5-26). FIGURA 5-26 A. Mecanismo de cremallera para la invasión de células no fagocíticas. Algunas bacterias presentan en su superficie unas proteínas, denominadas «adhesinas», que se unen a receptores en la membrana del huésped. Finalmente, la bacteria queda engullida en una vacuola endocítica. B. Mecanismo desencadenante de invasión celular. El mecanismo de secreción de tipo III de algunas bacterias introduce en el citoplasma de la célula a infectar una serie de toxinas que activan a la enzima Rho-GTPasa. Esta enzima favorece la polimerización del citoesqueleto de actina para crear ondulaciones de membrana y, finalmente, una vacuola que engulla a la bacteria. (Ilustración de: Diego Peñafiel.) Posteriormente, la vacuola fagocítica se une a los lisosomas generando un pH ácido en su interior. El bajo pH activa la listeriolisina O (una toxina) y la fosfolipasa C (una enzima) de la bacteria que lisan la membrana del fagolisosoma, liberando a aquella al citoplasma. Una característica llamativa de Listeria es su facultad de moverse por el interior celular gracias a su capacidad para ensamblar la actina. Una proteína de la bacteria, la ActA, induce el ensamblaje de los filamentos de actina y permite a Listeria desplazarse hacia la membrana de la célula, donde forma una protrusión que es finalmente fagocitada por una célula vecina (v. capítulo 12). De esta manera, Listeria es capaz de diseminarse por las células adyacentes. Otras bacterias también utilizan este desplazamiento basado en la actina, como algunas especies de Shigella y de Rickettsia. El otro mecanismo de invasión de células sin capacidad fagocítica es el mecanismo desencadenante (v. fig. 5-26). Este mecanismo comienza cuando la bacteria introduce en el citosol de la célula hospedadora una serie de moléculas a través de un sistema de secreción de tipo III. Dicho sistema funciona como una especie de jeringa molecular, gracias a 249 la cual, la bacteria, que no se adhiere a la célula hospedadora, inyecta en ella proteínas que favorecen su ingestión. Así ocurre, por ejemplo, en las especies del género Shigella, una bacteria que causa una enfermedad intestinal conocida como shigelosis o disentería. El sistema de secreción de tipo III de Shigella inyecta cuatro proteínas que provocan la ondulación de las membranas de las células epiteliales y los macrófagos, ondulaciones similares a las de los macropinosomas. Por lo tanto, estas bacterias (y otras como Salmonella) son endocitadas por un mecanismo que recuerda a la macropinocitosis. Las bacterias, una vez engullidas, pueden replicarse dentro del macropinosoma, como en el caso de Salmonella, o bien lisarlo y replicarse libremente en el citoplasma celular, como hace Shigella. Invasión de parásitos intracelulares Las infecciones parasitarias tienen un mecanismo patogénico radicalmente distinto al expuesto hasta ahora. Si los virus y las bacterias se aprovechan de la maquinaria y de la energía de la célula a la que van a infectar, los parásitos emplean su propia energía para invadir las células. Así lo hace, por ejemplo, Toxoplasma gondii, un parásito intracelular presente en muchos animales, cuyo hospedador típico es el gato, y que también afecta al ser humano. Este microorganismo posee un complejo apical denominado «conoide», una estructura de microtúbulos en espiral, clave para la invasión celular. Gracias al conoide, el parásito se reorienta hacia la célula y, a partir de ahí, empieza a empujar la membrana celular para abrirse camino hacia el interior. Conforme avanza, va secretando lípidos y proteínas que van a formar una vacuola que termina por envolver al parásito. De esta forma, Toxoplasma queda alojado en el interior de la célula huésped, pero recubierto por una membrana propia, que lo aísla y lo protege frente a la digestión celular. Trypanosoma cruzi es otro parásito que provoca enfermedad en los humanos. En concreto, da lugar a la enfermedad de Chagas, una patología multiorgánica exclusiva del continente americano. Este parásito interacciona con las integrinas β1 de la membrana de la célula hospedadora, provocando así un aumento del calcio a nivel local. Este hecho sirve para atraer lisosomas al citoplasma sobre el que se encuentra el parásito. Los lisosomas se fusionan con la membrana plasmática y, de esta manera, forman una vacuola en la que entra Trypanosoma. Una vez dentro de ella, el parásito secreta una enzima y una toxina que provocan la lisis de la membrana vacuolar, quedando así libre en el citoplasma de la célula huésped, donde se replica. Lecturas recomendadas Cohen AW, Hnasko R, Schubert W, Lisanti MP. Role of caveolae and caveolins in health and disease. Physiol Rev. 2004;84(4):1341–1379. Hansen CG, Nichols BJ. Molecular mechanisms of clathrin-independent endocytosis. J Cell Sci. 2009;122(Pt 11):1713–1721. 250 Henley JR, Cao H, McNiven MA. Participation of dynamin in the biogenesis of cytoplasmic vesicles. FASEB J. 1999;13(Suppl 2):S243– S247. Lakadamyali M, Rust MJ, Zhuang X. Endocytosis of influenza viruses. Microbes Infect. 2004;6(10):929–936. Lledo PM. Exocytosis in excitable cells: a conserved molecular machinery from yeast to neuron. Eur J Endocrinol. 1997;137(1):1–9. Nichols B. Caveosomes and endocytosis of lipid rafts. J Cell Sci. 2003;116(Pt 23):4707–4714. Pang ZP, Südhof TC. Cell biology of Ca2+-triggered exocytosis. Curr Opin Cell Biol. 2010;22(4):496–505. Parkar NS, Akpa BS, Nitsche LC, Wedgewood LE, Place AT, Sverdlov MS, et al. Vesicle formation and endocytosis: function, machinery, mechanisms, and modeling. Antioxid Redox Signal. 2009;11(6):1301–1312. Swanson JA, Watts C. Macropinocytosis. Trends Cell Biol. 1995;5(11):424–428. Tuma PL, Hubbard AL. Transcytosis: crossing cellular barriers. Physiol Rev. 2003;83(3):871–932. Preguntas de autoevaluación 1. En relación con la endocitosis mediada por receptor, ¿cuál es la respuesta falsa?: a. La clatrina se une a las vesículas después de su internalización, para dirigirlas al compartimento endosómico. b. Mientras que los receptores de LDL son reciclados después de su internalización, los receptores de EGF son degradados. c. Un trisquelión es una unidad de clatrina, cada una de ellas formada por tres subunidades grandes y tres pequeñas. d. La unión entre la clatrina y los receptores de membrana no es directa, pues necesita de proteínas adaptadoras para ello. e. Los cuerpos multivesiculares son orgánulos celulares derivados de los endosomas. Respuesta correcta: a. 2. Señale la opción falsa con respecto a la hipercolesterolemia familiar: a. Es una enfermedad genética con herencia autosómica. b. Entre sus manifestaciones clínicas, encontramos depósitos de lípidos en varios tejidos y complicaciones cardiovasculares, como el infarto. 251 c. El defecto molecular que explica la enfermedad se encuentra en los receptores de membrana para las moléculas de LDL. d. La ruta de síntesis hepática de LDL-colesterol es defectuosa en esta patología. e. La esperanza de vida de los pacientes afectos es actualmente inferior a la de las personas que no padecen la enfermedad. Respuesta correcta: d. 3. Señale la respuesta correcta en relación con el proceso de endocitosis mediada por cavéolas: a. Las cavéolas son estructuras que solo se encuentran en el endotelio vascular y en las células musculares. b. Las bacterias constituyen el ejemplo típico de microorganismo que utiliza las cavéolas para infectar las células. c. Las mutaciones en las caveolinas, proteínas principales de las cavéolas, se han relacionado con diversas afecciones musculares. d. Las cavéolas intervienen en el proceso de homeostasis del colesterol, pues el colesterol que liberan al espacio extracelular es captado por las moléculas de LDL. e. La caveolina es una proteína integral ubicua en la membrana plasmática, pues no se concentra en regiones concretas de la misma. Respuesta correcta: c. 4. Señale la opción correcta sobre el proceso de transcitosis: a. La transcitosis es un proceso unidireccional en el que las moléculas solo se transportan del polo apical al polo basal de las células. b. Las células epiteliales son las que más transcitosis presentan. c. En los estudios con microscopía se observan, fundamentalmente, vesículas recubiertas como mediadoras de la transcitosis. d. Su existencia es imprescindible para que las células obtengan sus nutrientes y puedan eliminar los productos de desecho. e. Mediante este proceso, las inmunoglobulinas IgA e IgE pueden formar parte de las secreciones externas. Respuesta correcta: d. 5. ¿Cuál de las siguientes afirmaciones sobre el mecanismo de la exocitosis es falsa? a. Las vesículas de exocitosis abandonan el Golgi sin un recubrimiento proteico. 252 b. La exocitosis constitutiva sirve para incluir en la membrana receptores y moléculas del glucocáliz, así como elementos de las membranas basales y de la matriz extracelular. c. La exocitosis regulada solo la llevan a cabo determinados tipos celulares y en presencia de estímulos concretos, como potenciales de acción u hormonas. d. Las proteínas ARF son enzimas con actividad GTPasa que intervienen en la formación de las vesículas de exocitosis. e. En el proceso de fusión de membranas, las principales proteínas implicadas son las SNARE y las Rab. Respuesta correcta: a. 6. Con respecto a la sinapsis neuronal, señale la afirmación correcta: a. Las vesículas sinápticas cargadas de neurotransmisor se sintetizan en el aparato de Golgi y son transportadas hasta el terminal presináptico. b. En la sinapsis, las proteínas SNARE son la sinaptotagmina (v-SNARE) y la sintaxina (t-SNARE). c. La sinapsina mantiene las vesículas sinápticas ancladas al citoesqueleto. d. La unión neuromuscular (la sinapsis entre la motoneurona y las fibras musculares estriadas) es un ejemplo de sinapsis eléctrica. e. El mecanismo de acción de los antidepresivos tricíclicos consiste en su unión a los receptores postsinápticos como agonistas, emulando la acción de los neurotransmisores. Respuesta correcta: c. 7. ¿Cuál de las siguientes afirmaciones sobre la miastenia grave es falsa? a. Se considera una enfermedad de origen autoinmune. b. La enzima acetilcolinesterasa es la diana terapéutica de los fármacos clásicos empleados para tratar la enfermedad. c. Existen anticuerpos dirigidos contra la acetilcolinesterasa, lo que provoca una disminución muy importante del neurotransmisor disponible en el espacio sináptico. d. Es una enfermedad que afecta a la sinapsis neuromuscular. e. La estructura proteica del receptor postsináptico es normal. Respuesta correcta: c. 8. En relación con las opsoninas: 253 a. Intervienen en la transcitosis. b. Favorecen la fagocitosis. c. Intervienen en la exocitosis constitutiva. d. Facilitan la adhesión de los virus para que puedan entrar en la célula huésped por endocitosis. e. Participan en la sinapsis neuronal. Respuesta correcta: b. 9. Con respecto a la infección de células por parte del virus de la gripe, elija la opción falsa: a. El virus de la gripe es un tipo de virus envuelto que penetra en las células mediante endocitosis mediada por receptor. b. Los receptores celulares para este virus contienen residuos de ácido siálico a los que se une la proteína vírica hemaglutinina. c. El material genético del virus debe translocarse al núcleo celular para poder ser replicado utilizando las enzimas de la célula huésped. d. Tras la endocitosis del virus, la proteína neuraminidasa cataliza la fusión entre la membrana del virus y la del endosoma, lo que permite la liberación del ARN al citoplasma celular. e. La salida de las nuevas partículas víricas sintetizadas y ensambladas en la célula huésped se produce mediante un proceso de gemación de membrana. Respuesta correcta: d. 10. ¿Cuál de las siguientes opciones sobre los mecanismos de infección de las bacterias intracelulares es correcta? a. La mayoría de las bacterias penetran en el interior celular mediante un mecanismo de fagocitosis, aunque algunas pueden hacerlo mediante un proceso de endocitosis mediada por receptor. b. Toxoplasma gondii es una bacteria que típicamente utiliza el sistema de cremallera para penetrar en la célula huésped. c. Algunas bacterias han desarrollado diversos mecanismos, como el desencadenante, para provocar la muerte de la célula huésped. d. Mycobacterium tuberculosis impide su digestión intracelular mediante enzimas que atacan y degradan la membrana del fagolisosoma. e. La bacteria Shigella posee un mecanismo de secreción de tipo III para promover su fagocitosis y poder replicarse en el citoplasma celular tras romper la vacuola fagocítica. 254 Respuesta correcta: e. 255 CAPÍTULO 6 256 Especializaciones de la membrana plasmática e interacción de la célula con su entorno M.ª Elena Bodegas Alfonso Calvo Objetivos de aprendizaje • Conocer las especializaciones de la membrana plasmática en los distintos dominios celulares (apical, lateral y basal). • Comprender la estructura molecular de las diferentes especializaciones de la membrana plasmática. • Conocer la estructura de la membrana basal y las fibras de la matriz extracelular, así como la biogénesis del colágeno. • Relacionar algunas patologías humanas con alteraciones de origen molecular y/o celular en las especializaciones de membrana plasmática, en la membrana basal y en la matriz extracelular. Las células se encuentran normalmente asociadas entre sí o con proteínas de la matriz extracelular (MEC) que las rodea. La interacción de las células con su entorno es de vital importancia para que desarrollen las funciones que ejercen en un tejido concreto. De hecho, la mayoría de las células necesitan de estas interacciones para su supervivencia, ya que, si no se pueden adherir al sustrato o a otras células, terminan muriendo por un proceso llamado «anoikis» (apoptosis causada por falta de adhesión). Este tipo de interacción célula-célula y célula-MEC es también esencial en la comunicación y señalización intercelulares. La membrana plasmática desempeña un papel esencial en estos procesos, desarrollando diferentes estructuras que facilitan la adhesión, el contacto con otras células o, en general, la interacción con el medio que las rodea. En este capítulo, se describen las especializaciones de la membrana plasmática y las principales moléculas extracelulares con las que interactúan. 257 Especializaciones de la membrana plasmática La membrana plasmática puede poseer distintas diferenciaciones (fig. 6-1) en: a) la superficie libre de las células (aquella que no está en contacto con otras células), como las microvellosidades, los cilios y los flagelos (estas dos últimas diferenciaciones se explican en el capítulo 12), y b) la superficie de contacto con otras células o con la MEC, que incluyen las interdigitaciones, los pliegues basales y las estructuras de unión célula-célula y célula-MEC. Estas últimas pueden clasificarse a su vez, atendiendo a su función, en: • Uniones de anclaje. • Uniones ocluyentes. • Uniones comunicantes. FIGURA 6-1 Representación de una célula epitelial idealizada en la que se han incluido diferenciaciones en la membrana de la superficie libre de la célula, estructuras de unión celular y la matriz extracelular sobre la que se asientan las células epiteliales. CA, cinturones de adhesión; CI, cilios; DE, desmosomas; FB, fibroblastos; HD, hemidesmosomas; ID, interdigitaciones; MB, membrana basal; MEC, matriz extracelular; MV, microvellosidad; PB, pliegues basales; UC, uniones comunicantes; UO, uniones ocluyentes. (Ilustración de: A. Calvo.) 258 Microvellosidades Las microvellosidades son proyecciones digitiformes de la superficie apical de las células epiteliales que sirven para aumentar la superficie de absorción (fig. 6-2, A). Estas estructuras tienen aproximadamente 1 μm de largo y 0,08 μm de ancho. En su interior, están estabilizadas por un fascículo de 20-30 filamentos de actina, unidos entre sí por villina y fimbrina y fijados a la membrana celular por medio de miosina I y calmodulina. Estas diferenciaciones de membrana están ancladas en la red (o velo) terminal, que contiene espectrina, miosina y filamentos intermedios de queratina. Las microvellosidades tienen un glucocáliz muy desarrollado, que puede ponerse de manifiesto al microscopio óptico mediante el uso de tinciones específicas para sacáridos, como el PAS (periodic acid Schiff) (fig. 6-2, B). FIGURA 6-2 Microvellosidades. A. Representación esquemática de una microvellosidad donde se muestran las proteínas que configuran su estructura. B. La tinción de PAS permite observar el glucocáliz (color rosado) de la chapa estriada del intestino; CC, células caliciformes; ChE, chapa estriada; Ent, enterocitos; MB, membrana basal. C. Imagen al microscopio electrónico de microvellosidades intestinales; GC, glucocáliz; MV, microvellosidades. (B, ilustración de: A. Calvo; C, procedente de: Burrell MA et al. Atlas de ultraestructura celular. Pamplona: EUNSA; 2011.) Las microvellosidades se pueden presentar como estructuras individuales en una amplia variedad de células epiteliales, pero, en muchos otros casos son muy abundantes, como es el caso de los epitelios del intestino, túbulo contorneado proximal y plexos coroideos. Al microscopio óptico se suele denominar «chapa estriada» al borde apical PAS+ del epitelio intestinal y «ribete en cepillo»» en el caso de los túbulos contorneados proximales del riñón. En el epitelio intestinal, las microvellosidades (fig. 6-2, C) desempeñan un papel esencial en la absorción de alimentos, al aumentar la superficie de membrana que posee gran cantidad de glucoproteínas transportadoras. En la membrana de las microvellosidades hay además numerosas enzimas que son responsables de los pasos finales de la digestión de proteínas y azúcares. Cuando estas proteínas se encuentran alteradas por diversas causas, aparecen cuadros patológicos tanto por defecto (como la intolerancia a la lactosa) como por exceso de absorción (como la hemocromatosis). La intolerancia a la lactosa suele comenzar en la infancia, aunque sus primeros síntomas pueden aparecer en la edad adulta. En pacientes con esta enfermedad se observa, entre otras alteraciones, un déficit secundario de lactasas (enzimas presentes en la membrana de las microvellosidades de los enterocitos), cuya función 259 es desdoblar la lactosa ingerida en las comidas en sus dos componentes básicos: glucosa y galactosa, que posteriormente serán absorbidas. Cuando esta enzima se encuentra parcial o totalmente ausente, la lactosa no se digiere, lo que se traduce en un cuadro diarreico. La hemocromatosis es una enfermedad genética autosómica recesiva que se caracteriza por una excesiva acumulación de hierro en distintos órganos. Esta patología se caracteriza por la mutación del gen HFE, que condiciona una sobreexpresión en las microvellosidades intestinales del transportador DMT-1, cuya función es absorber hierro. Por lo tanto, cuando existe un aumento de esta proteína en la superficie epitelial (como en el caso de la hemocromatosis), esto se traduce en una absorción excesiva de dicho mineral. La alta concentración de hierro en estos pacientes hace que se acumule en distintos órganos, como el hígado, el corazón (dando lugar a un cuadro de miocardiopatía) o la hipófisis (lo cual explica el hipogonadismo hipogonadotrópico en estos pacientes). Micropliegues: interdigitaciones y pliegues basales Los micropliegues son evaginaciones/invaginaciones angostas de la membrana celular en la superficie de contacto con otras células o con la MEC. Pueden aparecer en las superficies laterales y ser de número escaso (interdigitaciones), lo que permite reforzar la unión entre las células epiteliales (fig. 6-3, A). También pueden aparecer invaginaciones en la zona basal de la membrana de la membrana de células epiteliales, denominadas pliegues basales (fig. 6-3, B), como es el caso de los túbulos contorneados distales del riñón, donde son muy profundas y numerosas. En el citoplasma que queda comprendido entre los pliegues basales se sitúan numerosas mitocondrias. Esta disposición guarda relación con la regulación osmótica mediante intercambio iónico que desempeñan estas células, para lo que necesitan una gran fuente de energía. Las invaginaciones aumentan la superficie de la zona basal de la membrana en la que se encuentran situadas las proteínas transportadoras de iones. FIGURA 6-3 Micropliegues. A. Interdigitaciones en células epiteliales; D, desmosomas; Int, interdigitaciones; N1, núcleo de la célula 1; N2, núcleo de la célula 2. B. Pliegues basales de células epiteliales del túbulo contorneado distal; MT, mitocondrias; PB, pliegues basales. (A, procedente del: Departamento de Histología y A. P. de la Universidad de Navarra; B, procedente de: Fawcett DW. The Cell. Philadelphia: Saunders Company; 1981.) Uniones de anclaje celular 260 Las células se adhieren entre sí y con la MEC a través de moléculas de membrana específicas llamadas moléculas de adhesión celular. Estas moléculas son principalmente proteínas transmembrana que, junto a otras proteínas asociadas, pueden estar ubicadas en sitios específicos de la membrana plasmática. Las proteínas transmembrana que participan en la adhesión pertenecen, fundamentalmente, a cuatro familias: cadherinas, integrinas, selectinas y moléculas de adhesión celular de la superfamilia de las inmunoglobulinas (IgSF-CAM, del inglés immunoglobulin superfamily-cell adhesion molecules). Estas proteínas transmembrana establecen uniones con proteínas de células vecinas o de la MEC (en el caso de las integrinas), para ejercer su función adherente. Las proteínas de estas familias pueden ser monoméricas (IgSF-CAM y selectinas) o aparecer en forma de dímeros; así, las cadherinas forman homodímeros (dímeros formados por el mismo tipo de proteína), mientras que las integrinas forman heterodímeros (dímeros constituidos por proteínas diferentes) (tabla 6-1). Asociadas a estas proteínas transmembrana se encuentran gran cantidad de proteínas, situadas normalmente en el lado citoplasmático, que participan en la estructuración y estabilización de la unión y en su anclaje al citoesqueleto celular. Cuando una proteína de adhesión de una célula se une a otra del mismo tipo en la célula vecina, hablamos de uniones homófilas, mientras que, si se une a proteínas (u otro tipo de moléculas) diferentes, hablamos de uniones heterófilas. Las uniones también pueden ser de tipo estable o transitorio (v. tabla 6-1). Tabla 6-1 Tipos de moléculas de adhesión celular que participan en uniones de anclaje y tipos de interacciones que establecen A continuación, señalaremos las principales características de las proteínas de adhesión celular. Cadherinas La familia de las cadherinas constituye una familia de proteínas cuya estructura está compuesta por 700-750 aminoácidos. Son proteínas de paso simple y presentan cinco dominios extracelulares, cuatro de los cuales son homólogos y contienen sitios de unión al Ca (fig. 6-4, A). Las cadherinas forman homodímeros y presentan uniones 2+ homófilas dependientes de Ca . Al grupo de las cadherinas pertenecen más de 40 proteínas diferentes, entre las que 2+ cabe destacar la cadherina E (que se encuentra en las células epiteliales) (fig. 6-4, B) y la cadherina N (presente en células del tejido nervioso, el cristalino del ojo y las células musculares esqueléticas y cardíacas). 261 FIGURA 6-4 Cadherinas. A. Representación de la estructura de las cadherinas y las proteínas que interactúan con ella en el dominio citoplasmático. B. Inmunofluorescencia de células epiteliales en cultivo marcadas con anticuerpos anticadherina-E (color rojo). El marcaje se observa en las membranas celulares. El color azul corresponde a una tinción de contraste de los núcleos celulares. (A, ilustración de: A. Calvo.) Las cadherinas se pueden agrupar en lugares concretos de las células para formar estructuras complejas de anclaje (o adhesión). Estas estructuras son típicas de células epiteliales, aunque también aparecen en otros tipos de tejidos. Existen dos clases fundamentales de estructuras complejas de anclaje dependientes de cadherinas: 1. La zonula adherens o cinturón de adhesión. 2. La macula adherens o desmosoma. A continuación, analizaremos la organización básica de cada una de estas estructuras y alguna de las patologías que se desarrollan cuando se desorganizan o sufren alteraciones. Zonula adherens o cinturón de adhesión La zonula adherens consiste en un cinturón celular con función adherente de 0,1-0,5 μm de espesor, situado normalmente en la zona apical de las membranas laterales celulares, que desempeña un papel esencial en el anclaje de células epiteliales (fig. 6-5, A). Las cadherinas (llamadas desmocolinas y desmogleínas) constituyen las proteínas transmembrana de estas estructuras, cuya porción citoplasmática se une a una placa de adhesión que contiene desmoplaquina, placofilina y placoglobina (catenina γ) (fig. 6-5, B). Un complejo de cateninas α y β unen la placa de adhesión a filamentos de actina que se extienden por el citoplasma, formando una red de anclaje intracitoplasmática. La unión por medio de cinturones de adhesión deja un espacio entre las células de 20-40 nm de ancho. 262 FIGURA 6-5 Cinturones de adhesión y desmosomas. A. Representación de los cinturones de adhesión, desmosomas y hemidesmosomas en células epiteliales. B. Moléculas que intervienen en los cinturones de adhesión. C. Imagen de microscopía electrónica de un desmosoma. D. Representación de las moléculas que forman parte del desmosoma. (A, B y D, ilustraciones de: A. Calvo.) Macula adherens o desmosoma La macula adherens (también denominada desmosoma) es una unión puntiforme con un tamaño de 0,1-0,5 μm que se sitúa normalmente en las membranas laterales de las células epiteliales, proporcionando anclaje entre ellas (fig. 6-5, C). También existen este tipo de uniones en los discos intercalares que unen los cardiomiocitos adyacentes en el corazón, donde cumplen una función importante en el mantenimiento estructural del tejido cardíaco. Las proteínas transmembrana que forman los desmosomas también son cadherinas (desmocolinas y desmogleínas). En este sentido, los desmosomas resultan comparables, desde un punto de vista estructural, a los cinturones de adhesión, pero son de morfología puntiforme y no poseen cateninas α y β (fig. 6-5, D). En este caso, la placa de adhesión del desmosoma se une directamente a filamentos intermedios, en lugar de a filamentos de actina. En la piel, los filamentos intermedios son de queratina (tonofilamentos), de desmina en los discos intercalares de los cardiomiocitos y de vimentina en las meninges que revisten la superficie externa del encéfalo y la médula espinal. Los desmosomas dejan un espacio célula-célula de 20-40 nm. Existen diferentes tipos de desmogleínas, que se expresan de modo distinto según los tejidos. Las principales desmogleínas presentes en la epidermis de la piel (donde los desmosomas son muy abundantes) son las desmogleínas 1 y 3. Dos enfermedades dermatológicas en las que las desmogleínas están implicadas son el pénfigo vulgar y el pénfigo foliáceo. Se trata de enfermedades caracterizadas por la presencia de ampollas en la superficie cutánea de los pacientes. El pénfigo vulgar (PV) es una enfermedad que se caracteriza por la aparición, en la superficie de la piel, de 263 ampollas que se rompen con mucha facilidad (fig. 6-6, A). Las lesiones pueden localizarse en la mucosa oral (fig. 6-6, B), o extenderse a lo largo de la piel de la cara, el cuello, las extremidades y el tronco. Los pacientes refieren prurito y dolor en las áreas afectadas, y es común sufrir infecciones como consecuencia de la ulceración de las lesiones. El estudio anatomopatológico del PV muestra una separación entre los queratinocitos de la piel, denominada acantólisis (fig. 6-6, C). Estas lesiones se localizan, típicamente, por encima de la capa basal de la epidermis. El análisis de las biopsias por inmunofluorescencia revela un depósito de IgG sobre la superficie de los queratinocitos, ya que es una enfermedad de tipo autoinmune. Los autoanticuerpos de los pacientes se dirigen frente a desmogleína 3 (que se expresa principalmente en la capa basal de la piel y las mucosas), frente a desmogleína 1 (que se expresa sobre todo en las capas superficiales de la piel y, en menor medida, en las mucosas), o frente a ambas. Los autoanticuerpos son los responsables de la desestructuración de los desmosomas de los queratinocitos (donde son muy abundantes) y de la aparición de las ampollas. El tratamiento de esta enfermedad es sintomático e incluye el uso de corticoides y otros inmunodepresores, así como el control del dolor y de las posibles infecciones. FIGURA 6-6 Lesiones producidas por el pénfigo vulgar. A. Lesiones ampollosas en el brazo de un paciente. B. Lesiones en la mucosa oral. C. Imagen histológica de la epidermis de un paciente con pénfigo vulgar. Se observa una rotura (acantólisis) de la epidermis por encima de la capa basal. (Imágenes por cortesía del Dr. Agustín España. Departamento de Dermatología, Clínica Universidad de Navarra.) El pénfigo foliáceo es también una enfermedad autoinmune donde se observa un depósito de IgG frente a desmogleína 1. Por lo tanto, las ampollas solo se sitúan en niveles superiores de la epidermis y se rompen fácilmente. El pronóstico de la enfermedad es mejor que el del PV, y su tratamiento se basa en la aplicación de corticoides intralesionales o sistémicos. Integrinas 264 Las integrinas son una familia de proteínas que participan en la adhesión permanente o transitoria célula-MEC y célula-célula. Son heterodímeros compuestos por dos subunidades diferentes: subunidad α y subunidad β (fig. 6-7, A). La subunidad α posee sitios de unión para cationes bivalentes (Ca , Mg ). Estas moléculas se unen tanto a 2+ 2+ componentes de la MEC como a proteínas del citoesqueleto intracelular por medio de su interacción con proteínas como la vinculina, la actinina α y la talina, que interactúan generalmente con filamentos de actina, pero también con filamentos intermedios de queratina. El dominio extracelular de la subunidad β tiene capacidad de unión a la secuencia tripeptídica RGD (arginina-glicina-ácido aspártico) que se encuentra en proteínas extracelulares (laminina y fibronectina), las cuales interaccionan con colágeno de tipo IV, heparán sulfato y entactinas. Las integrinas intervienen de modo muy significativo en la migración de células embrionarias, células del sistema inmunitario o células tumorales metastásicas. 265 FIGURA 6-7 Integrinas. A. Estructura molecular de las integrinas. B. Representación de un hemidesmosoma y de sus componentes. C. Esquema de las moléculas que componen las adhesiones focales. (Ilustraciones de: A. Calvo.) Estas proteínas pueden aparecer como moléculas simples o agruparse para formar estructuras complejas de adhesión, constituyendo así los hemidesmosomas y las adhesiones focales. Los hemidesmosomas son estructuras estables de adhesión típicas de células sésiles, mientras que las adhesiones focales, que son características de células en movimiento, son estructuras en constante proceso de formación y destrucción. Hemidesmosomas Los hemidesmosomas (fig. 6-7, B) son estructuras que, atendiendo a su morfología, se asemejarían a la mitad de un desmosoma situado en la parte basal de las células. Estas estructuras sirven de anclaje entre la célula y la membrana basal extracelular subyacente (v. más adelante) en la que se asienta la célula. Pero las proteínas que forman parte de los hemidesmosomas son diferentes a las de los desmosomas, tanto en lo que se refiere a las proteínas transmembrana de anclaje (que en este caso son integrinas en vez de cadherinas) como a las proteínas de la placa. La integrina que forma parte de los hemidesmosomas es la integrina α β , y las proteínas de la placa se denominan plaquinas. Otra 6 4 proteína transmembrana del hemidesmosoma es la BPGA2 (del inglés bullous pemphingoid antigen-2). La placa está conectada por el lado citoplasmático a tonofilamentos (fig. 6-7, B). Los hemidesmosomas aumentan la estabilidad global de los tejidos epiteliales y permiten su asentamiento en la MEC mediante la unión de los tonofilamentos del citoesqueleto con los componentes de la membrana basal. Adhesiones focales Las células migratorias se unen a la MEC mediante adhesiones focales (fig. 6-7, C), que están constituidas por agrupaciones de integrinas interconectadas con haces de filamentos de actina por medio de las proteínas talina, actinina α y vinculina. Estas estructuras son muy dinámicas, formándose y destruyéndose de modo continuo durante el proceso de migración celular, donde sirven para contactar en puntos concretos con el sustrato. Son abundantes en los lamelipodios (v. capítulo 12), que utilizan las células para avanzar a través de un sustrato inerte. Las adhesiones focales no solo cumplen una función en la adhesión, sino que también participan en la señalización intracelular. Así, la interacción de las integrinas con el sustrato en las adhesiones focales tiene como consecuencia la fosforilación de la proteína tirosina quinasa de adhesión focal (FAK, del inglés focal adhesion kinase), que promueve la activación de proteínas involucradas en la migración celular y, además, protege a las células de la anoikis. Las integrinas actúan como transductores de señales, informando a la célula de las condiciones (principalmente de adhesión) del medio extracelular. La hiperactivación de FAK se ha asociado con una mayor capacidad de metástasis por parte de las células tumorales. 266 También hay integrinas que median los contactos célula-célula sin formar parte de ninguna estructura de unión. Estas interacciones son, normalmente, de tipo transitorio, y se suelen dar en procesos de adhesión de células del sistema inmunitario. Entre estas integrinas podemos destacar las denominadas «LFA-1», o antígeno de función linfocitaria 1 (linfocitos), y Mac-1 (su equivalente en macrófagos). Estas integrinas tienen su receptor en moléculas ICAM y VCAM (v. más adelante) de la superficie de células endoteliales, con lo que refuerzan la interacción producida por las selectinas (v. «Selectinas», a continuación) en el proceso de extravasación de leucocitos. La molécula LFA-1, presente en los leucocitos, ha sido objeto de numerosos estudios, dado su papel tan importante en el reclutamiento de células inflamatorias. Recientemente, se han empezado a utilizar anticuerpos anti-LFA-1 en el área de los trasplantes de órganos, ya que, al bloquear la unión de estas moléculas con sus receptores (ICAM), se ha observado una menor tasa de rechazo. Se cree que este fenómeno se produce al impedir la migración de células inflamatorias hacia el órgano trasplantado. Por otro lado, se ha observado que la unión de LFA-1 con ICAM parece actuar como señal coestimuladora en la activación de linfocitos; por lo tanto, cuando se bloquee dicha unión será necesaria una mayor cantidad de antígeno para poder alcanzar un mismo grado de activación linfocitaria. Selectinas Las selectinas son moléculas de adhesión dependientes de Ca , con afinidad para unirse a hidratos de carbono 2+ presentes en otras células (fig. 6-8, A). No se encuentran formando estructuras complejas de unión, sino que intervienen en contactos moleculares no visibles al microscopio que, generalmente, son de tipo temporal. Participan frecuentemente en las uniones de los leucocitos a las células endoteliales facilitando su salida de los vasos sanguíneos hacia un foco inflamatorio (fig. 6-8, B). FIGURA 6-8 Selectinas. A. Dibujo de las selectinas mostrando su interacción con azúcares presentes en glucoproteínas de otras células. B. Las selectinas intervienen en procesos de adhesión de leucocitos (p. ej., neutrófilos) al endotelio vascular para facilitar la migración hacia focos inflamatorios. La interacción y extravasación no solo está mediada por selectinas sino también por uniones que implican a integrinas y a moléculas de tipo IgSF-CAM. (Ilustraciones de: A. Calvo.) La membrana plasmática de la mayoría de los leucocitos presenta selectina L («L» de leucocitos), que interacciona con su receptor mediante uniones heterófilas en la membrana plasmática de las células endoteliales que revisten los vasos sanguíneos. Los receptores para las selectinas son oligosacáridos que forman parte de glucoproteínas (como las IgSF-CAM) o glucolípidos de la membrana plasmática. Además, las propias células endoteliales poseen también dos 267 tipos de selectinas: selectina P (cuyo nombre deriva de «plaquetas», donde la expresión de esta selectina es abundante) y selectina E (de endotelio), que interaccionan a su vez con oligosacáridos de la superficie de los leucocitos. Las selectinas están involucradas en la inflamación y el cáncer. En procesos inflamatorios, determinados estímulos (como la histamina y la trombina) estimulan a las células endoteliales para que produzcan selectina P en la superficie celular. Además, algunas citoquinas (como TNF-α) causan un aumento de expresión de las selectinas E y P en el endotelio, favoreciendo así la unión de leucocitos. Esto conduce después a una unión más firme, mediada por integrinas-IgSF-CAM (v. «IgSF-CAM», a continuación), y, finalmente, a la migración de los leucocitos hacia el foco inflamatorio. IgSF-CAM Las moléculas de adhesión de la superfamilia de las inmunoglobulinas IgSF-CAM (fig. 6-9) poseen en su estructura dominios organizados en forma de lazo, que se asemejan a los que están presentes en las inmunoglobulinas. Establecen uniones heterófilas (interactuando con integrinas y selectinas) u homófilas (uniéndose entonces a otras IgSF-CAM) (fig. 6-10). Las IgSF-CAM no tienen sitios de unión para el Ca y median uniones celulares, normalmente 2+ de tipo temporal. Esta superfamilia de proteínas interviene en la adhesión de células del sistema inmunitario. Entre las IgSF-CAM, podemos destacar las siguientes: • Moléculas de adhesión intercelular (ICAM) y moléculas de adhesión de las células vasculares (VCAM). Están presentes en muchos tipos celulares, especialmente en células endoteliales, mediando interacciones con células sanguíneas que poseen integrinas en su membrana. La interacción es, por lo tanto, heterófila. • Moléculas de adhesión de las células nerviosas (NCAM). Se encuentran en las neuronas y se unen por interacción homófila con otras NCAM. 268 FIGURA 6-9 Estructura molecular de la ICAM-1 (molécula de adhesión intercelular perteneciente a la familia de IgSF-CAM). Estas moléculas de adhesión poseen dominios extracelulares en forma de lazo, parecidos a los de las inmunoglobulinas. (Ilustraciones de: A. Calvo.) FIGURA 6-10 Las IgSF-CAM se pueden unir entre sí mediante uniones homófilas o con integrinas mediante uniones heterófilas. (Ilustraciones de: A. Calvo.) Uniones ocluyentes (zonula occludens o unión estrecha) La unión ocluyente (también llamada «unión estrecha») es una zona de contacto con forma de cinturón, de 1 μm de ancho, que se encuentra casi con exclusividad en los epitelios (fig. 6-11). Este cinturón ocluyente está formado por un entramado de proteínas que une las membranas de células contiguas, quedando el espacio intercelular ocluido por un sistema de crestas de cierre anastomosadas y de complejidad variable, como se comprueba, de forma particularmente llamativa, en las imágenes de criofractura para microscopía electrónica (v. fig. 6-11, C). 269 FIGURA 6-11 Uniones ocluyentes. A. Las uniones ocluyentes (UO) suelen presentarse en células epiteliales para impedir el paso de sustancias a través del espacio existente entre las membranas de dos células vecinas; CA, cinturones de adhesión; DE, desmosomas. B. Estas uniones tienen forma de cinturón y están compuestas por un sistema de crestas de cierre formadas por proteínas que unen las membranas de células contiguas, quedando el espacio intercelular ocluido. C. Las imágenes de criofractura son especialmente relevantes a la hora de mostrar el sistema de cierre u oclusión de estas estructuras. (A, ilustración de: A. Calvo; B, © 2009 from Physical Biology of the Cell. by Philips et al. Reproduced by permission of Garland Science/Taylor & Francis Group LLC; C, procedente de: Fawcett DW. The Cell. Philadelphia: Saunders Company; 1981.) Las uniones estrechas desempeñan dos funciones esenciales: 1. Determinan la polaridad de la membrana de las células epiteliales, al separar el dominio apical del dominio basolateral, evitando la libre difusión de lípidos y proteínas entre estos dos dominios. 2. Impiden el paso de sustancias entre las células epiteliales (transporte paracelular). No obstante, a veces las células pueden modificar sus uniones estrechas para permitir el paso de ciertas sustancias, cuando hay tal exceso de estas que el transporte a través de la membrana no basta para incorporarlas. Así ocurre en el intestino con el exceso de aminoácidos y azúcares, que pueden incorporarse al organismo mediante un transporte paracelular. Las crestas de cierre están formadas por hileras entrecruzadas de proteínas transmembrana (fig. 6-11, B), particularmente ocludinas y claudinas, que se unen de forma directa a proteínas semejantes en la célula contigua. Las ocludinas y claudinas pertenecen a la familia de las tetraspaninas y, por lo tanto, presentan cuatro dominios transmembrana, dos bucles externos y dos colas citoplasmáticas cortas. En el lado intracelular, las ocludinas y las claudinas se encuentran ancladas a diversas proteínas estructurales, como las ZO-1, ZO-2 y ZO-3. Algunas enfermedades se han asociado a mutaciones en las proteínas de las uniones ocluyentes. La expresión de claudina 16 es máxima a nivel del epitelio del asa ascendente gruesa de Henle. En condiciones normales, dicha proteína regula el transporte paracelular del magnesio y de parte del calcio. En pacientes con mutaciones de la claudina 16 aparece un síndrome poco frecuente que se caracteriza por hipomagnesemia y convulsiones. 270 Uniones comunicantes (o uniones de tipo gap, nexo o hendidura) Las uniones comunicantes, denominadas también «uniones de tipo nexo», «uniones en hendidura» o «de tipo gap», son uniones maculares de tamaños diversos que comunican los citoplasmas de células vecinas, permitiendo el trasvase directo de iones y macromoléculas (fig. 6-12). La unidad básica de las uniones comunicantes es el conexón. Los estudios con técnicas de criofractura y contraste negativo muestran que los conexones configuran un enrejado hexagonal. Cada conexón mide unos 6,5 nm de diámetro y sus centros están equidistantes unos 9 nm. Con contraste negativo se aprecia que cada conexón está constituido por seis moléculas de conexina (proteínas transmembrana) alrededor de un conducto central. La disposición crea, por lo tanto, un conducto directo de comunicación (de 1,5-2 nm de diámetro) entre el citoplasma de las dos células adyacentes. Cada unión de tipo nexo puede contener desde unos pocos conexones hasta cientos de ellos, que pueden formar placas de unos 0,3 mm de diámetro. El espacio intercelular está estrechado, alcanzando alrededor de 2-5 nm, y solo es identificable como una hendidura cuando las células se observan a gran aumento con el microscopio electrónico. FIGURA 6-12 Uniones comunicantes. A. Las uniones comunicantes, de tipo gap o nexos están formadas por agrupaciones de conexones. B. Estas estructuras, constituidas por proteínas llamadas «conexinas», se agrupan en forma de hexágono para formar un canal de 1,5 nm de diámetro, por el cual pueden atravesar iones y moléculas de pequeño tamaño. C. Las imágenes de criofractura muestran que las uniones de tipo gap pueden contener cientos o miles de conexones. (A y B, ilustraciones de: A. Calvo; C, procedente de: Fawcett DW. The Cell. Philadelphia: Saunders Company; 1981.) Estas uniones facilitan el movimiento de moléculas de un tamaño máximo de 1,2 nm de diámetro (como iones inorgánicos, oligosacáridos, aminoácidos, nucleótidos, vitaminas y AMPc) entre las células. La formación de estas uniones es Ca independiente, pero la permeabilidad del canal está regulada por el Ca y el pH, de modo que se 2+ 2+ reduce al descender el pH o al aumentar la concentración intracelular de Ca . Cuando se produce un daño celular, el 2+ Ca invade la célula en forma masiva e instantánea, por lo que el cierre de estos canales impide que el posible daño se 2+ transmita a células vecinas. Esta unión es responsable del acoplamiento eléctrico y químico entre células adyacentes, lo cual es particularmente relevante en la comunicación entre algunas neuronas y entre células musculares cardíacas, que tienen que transmitir 271 la excitación con rapidez y sincronía. Como se explicó en el capítulo 4, las sinapsis eléctricas están formadas por uniones de tipo gap. Otro de los ejemplos importantes en los que aparecen uniones de tipo gap son los epitelios ciliados, como el de las vías respiratorias. El movimiento síncrono de los cilios para expulsar la mucosidad de las vías respiratorias requiere una comunicación rápida de las moléculas de señalización a través de los citoplasmas de células contiguas, lo que se consigue mediante uniones de tipo gap. La familia de los genes que codifican para las conexinas posee muchos miembros, los cuales se designan de acuerdo con su peso molecular. Existen diversas enfermedades que se han asociado a mutaciones de las conexinas. La conexina 26 forma uniones comunicantes en la cóclea y facilita el reciclaje del ión K . Las mutaciones en la conexina 26 + podrían ser responsables de más del 20% de los casos de sordera en la infancia. Las dos mutaciones más frecuentes son la 30delG y 167delT, que se dan en más del 50% de los casos. Las mutaciones del gen de la conexina 50 se asocian a las cataratas congénitas, que producen ceguera. Las células óseas (osteoblastos y osteocitos) están conectadas mediante uniones comunicantes y expresan conexina 43 y 45. Las mutaciones en la conexina 43 son responsables de la displasia oculodentodigital (ODD), enfermedad que se caracteriza por defectos en el desarrollo esquelético que conllevan malformaciones corporales y presencia de ojos y dientes pequeños. La mutación de la conexina 32 se relaciona con una enfermedad denominada atrofia muscular de Charcot-Marie-Tooth (CMT). La CMT es una neuropatía que afecta tanto a los nervios motores como a los sensitivos. Clínicamente, los pacientes con CMT presentan debilidad muscular típicamente distal, atrofia muscular, hipoestesia (disminución de la sensibilidad) y reflejos osteotendinosos débiles o ausentes. Es muy típico de estos pacientes que la enfermedad se localice primero en los pies y las piernas, y que se manifieste posteriormente en las extremidades anteriores. La marcha de los pacientes es característicamente anómala, con pasos grandes que favorecen las caídas. También es frecuente la asociación con una deformidad ortopédica denominada «pie cavo», debido a la atrofia de la musculatura del pie. 272 Membrana basal En el límite entre el epitelio y el tejido conjuntivo subyacente existe una fina capa extracelular de soporte, rica en proteínas y polisacáridos y de espesor variable (0,5-1,5 μm), denominada tradicionalmente membrana basal. En ocasiones, la membrana basal es tan gruesa que, en las preparaciones histológicas, se distingue como un engrosamiento que limita el epitelio del tejido conjuntivo, como ocurre por ejemplo en la membrana de Descemet del epitelio posterior de la córnea (que mide 10 μm) (fig. 6-13, A). Pero, por lo general, su escaso espesor y su coloración con eosina impide distinguirla del tejido conjuntivo adyacente y solo se visualiza con claridad mediante tinciones especiales. La membrana basal se observa bien con tinción de PAS (que tiñe los glúcidos de los proteoglucanos presentes en dicha membrana) y con la técnica de impregnación argéntica. También se puede detectar mediante inmunohistoquímica, utilizando anticuerpos específicos para proteínas de la membrana basal, como el colágeno IV (fig. 6-13, B). FIGURA 6-13 Membrana basal. A. La membrana de Descemet del epitelio posterior de la córnea es extraordinariamente gruesa (flecha), llegando a medir 10 µm de grosor. B. Las técnicas inmunohistoquímicas permiten identificar la membrana basal; en este caso, se han utilizado anticuerpos anticolágeno IV (proteína de la membrana basal) en una sección de riñón. C. Lámina basal y lámina fibrorreticular. (B, con autorización de Rockland Immunochemicals, Gilbertsville, PA, USA; C, ilustración de: A. Calvo.) Mediante el examen con el microscopio electrónico se observa que la membrana basal contiene varios componentes estructurales. Se distingue una capa continua de matriz electrodensa (50-100 nm), denomina lámina basal, que se divide a su vez en dos zonas: 1. Lámina lúcida o rara: zona poco electrodensa que se sitúa inmediatamente por debajo de las membranas plasmáticas de las células del epitelio y que mide 40-60 nm de grosor. 2. Lámina densa: situada más externamente, presenta una mayor densidad electrónica. Está formada por filamentos de 3-4 nm, orientados aleatoriamente. 273 La lámina fibrorreticular queda situada por debajo de la lámina basal y es una capa de fibras reticulares, integrada por proteínas y polisacáridos. La capacidad de impregnación de sales de plata que posee la membrana basal se debe a las fibras reticulares presentes en esta capa. En algunas localizaciones, como en los alvéolos pulmonares y en los glomérulos renales, las membranas basales de los epitelios y endotelios se fusionan para formar parte de las barreras de difusión respiratoria y de filtración glomerular. La lámina basal se compone, fundamentalmente, de un fino reticulado de colágeno de tipo IV, glucoproteínas adhesivas (laminina y entactina) y proteoglucanos (principalmente el perlecano, que contiene heparán sulfato) sintetizados por las células epiteliales. El colágeno de tipo IV se encuentra exclusivamente en la lámina basal, donde conforma un enrejado filamentoso de 1,5 nm de espesor que representa la parte central de la lámina densa. Confiere una gran resistencia a la tracción y proporciona flexibilidad para acomodarse al estiramiento de los tejidos. La laminina es una glucoproteína adhesiva de gran tamaño cuya estructura se detalla más adelante. Esta proteína fija la lámina densa a la membrana plasmática de las células epiteliales gracias a su unión con las integrinas. Además, se une al colágeno IV gracias a la entactina, y también al heparán sulfato del perlecano. La entactina o nidógeno es una pequeña proteína que se une tanto a la laminina como al colágeno de tipo IV, por lo que parece servir de enlace entre ambas proteínas. El perlecano es un proteoglucano de gran tamaño con un eje proteico de 600 kDa y con 2-15 cadenas de glucosaminoglucanos (principalmente el heparán sulfato), que proporciona una fuerte carga negativa a la lámina densa. La carga negativa contribuye a su función como filtro selectivo, principalmente en los glomérulos renales, regulando el paso de los iones. La membrana basal desempeña importantes funciones en los tejidos: • Actúa como sostén del epitelio, dado que permite la fijación de la parte inferior del epitelio con la MEC subyacente, en especial con el colágeno. • Constituye un filtro molecular pasivo, al retener moléculas en función de su tamaño, forma y carga eléctrica. • Separa y aísla el tejido conjuntivo de los epitelios, nervios y músculos. Por lo tanto, actúa como filtro celular, permitiendo el paso de ciertas células (entre ellas los glóbulos blancos, involucrados en la defensa contra microorganismos invasores), mientras que impide que otros tipos celulares del tejido conjuntivo ingresen al epitelio, o viceversa. • Ayuda a la regeneración de los tejidos tras una lesión. Cuando se destruyen epitelios, músculo o nervios, si la membrana basal presente en los mismos persiste, proporciona el soporte sobre el que pueden migrar nuevas células que reconstruyen el tejido original. • Influye sobre la diferenciación y la organización celulares, dado que la membrana basal y, en general, los componentes de la MEC, modifican la forma, el movimiento, el metabolismo y la diferenciación de las células en cultivo. 274 Bajo ciertas condiciones patológicas, la membrana basal sufre marcadas alteraciones. En la diabetes mellitus, enfermedad que produce importantes trastornos en el sistema vascular, se comprueba un engrosamiento notable de la membrana basal de los vasos sanguíneos de pequeño calibre. Aun así, los capilares de los glomérulos renales de las personas diabéticas filtran más proteínas plasmáticas que los de individuos normales. La causa de este engrosamiento es un aumento de colágeno de tipo IV y laminina, aunque hay menos heparán sulfato, lo que contribuiría al aumento de la permeabilidad capilar. La progresión del daño renal comienza con el engrosamiento de la membrana basal e hipertensión a nivel glomerular. Más tarde comienza la aparición de microalbuminuria (presencia de albúmina en orina en el rango 30-300 mg/24 h), que refleja el estado de hiperfiltración de la membrana basal glomerular. A medida que avanza el daño, la albuminuria se convierte en proteinuria; finalmente, puede aparecer un cuadro de hipertensión sistémica y pérdida de la función renal que puede requerir un trasplante. Existe una patología hereditaria, denominada síndrome de Alport, en la que la membrana basal de los glomérulos renales se encuentra también alterada, constituyendo la nefritis hereditaria más frecuente. Se produce por la alteración de la cadena α5 del colágeno de tipo IV presente en la lámina densa. Se han descrito numerosos tipos de mutaciones que pueden dar lugar a este cuadro. El síndrome de Alport se da en 1 de cada 10.000 individuos, siendo varones la mayor parte de los casos, en los cuales la enfermedad es más grave que en las mujeres, al ser una enfermedad ligada al sexo. La clínica de este síndrome se caracteriza por afectar a distintos órganos. A nivel renal es típica la hematuria (presencia de sangre en orina); a nivel auditivo puede dar lugar a sordera neurosensorial, afectando específicamente a los tonos agudos; y a nivel oftalmológico es muy frecuente la asociación con lenticono (proyección cónica en la superficie del cristalino). El pronóstico de esta enfermedad lo marca el daño renal, ya que es frecuente que la hematuria progrese a nefritis y acabe en un fallo renal en la adolescencia. El trasplante renal suele acabar por ser necesario. El síndrome de Goodpasture es una enfermedad que se basa en la presencia de anticuerpos frente a la cadena α3 del colágeno de tipo IV, típicamente presente en la membrana basal del riñón y del pulmón. Esta enfermedad aparece con mayor frecuencia en varones y a edades tempranas (normalmente en la adolescencia), y se caracteriza por la presencia de hematuria, proteinuria y sedimentos patológicos en la orina. Es frecuente que se asocie con hemoptisis (presencia de sangre en el esputo), indicando una afectación pulmonar que precede al daño renal. Si el cuadro avanza, da lugar a hemorragias pulmonares que comprometen la vida del paciente y a una glomerulonefritis rápidamente progresiva que finaliza en un fallo renal. El tratamiento consiste en plasmaféresis y en el uso de corticoides e inmunodepresores. 275 Matriz extracelular (MEC) Como se ha venido indicando a lo largo del capítulo, las células establecen relaciones muy estrechas con los componentes de la matriz extracelular (MEC). En algunos tejidos (como algunos epitelios o el sistema nervioso central) la MEC es casi inexistente, pero en otros (como el tejido conjuntivo, el cartílago y el hueso) las células están embebidas en una matriz muy abundante. La MEC es un complejo de macromoléculas elaborado y secretado por las células hacia el espacio extracelular. Se compone de una sustancia fundamental hidratada similar a un gel, con fibras incluidas en ella. Además, contiene agua, sales minerales y otras sustancias de bajo peso molecular, hormonas, proteínas y nutrientes. El agua, las sales y muchas de las proteínas de la sustancia fundamental provienen del plasma sanguíneo y forman el líquido tisular. Fibras de la MEC Las fibras que contiene la MEC están presentes en cantidades variables, según las necesidades estructurales y la función del tejido en que se ubiquen. Los histólogos clásicos describieron tres tipos de fibras, teniendo en cuenta su morfología y su reactividad con colorantes histológicos: fibras de colágeno, reticulares y elásticas. Fibras de colágeno Las fibras de colágeno (o colágenas) (fig. 6-14) son fibras flexibles con una notable resistencia tensora en sentido longitudinal, incluso mayor que la del acero inoxidable de diámetro similar. El colágeno incluye una familia de proteínas muy abundante que constituye alrededor del 20-25% del total de proteínas del organismo humano. En preparados de tejido fresco no coloreados, el colágeno se observa en forma de hebras incoloras o blancas, brillantes y de recorrido ligeramente ondulado. Al desnaturalizarse mediante cocción, da lugar a la gelatina, que posee mucho poder nutritivo por su alto contenido en proteínas. El colágeno es acidófilo debido a la carga positiva de los grupos laterales, por lo que se tiñe con eosina; también se tiñe de color azul con tinción tricrómica de Masson, y de rojo con el método de Van Gieson. Las fibras presentan un grosor variable (1-10 µm) y están compuestas por fibrillas (0,2-0,5 µm de diámetro), que se mantienen unidas en paralelo mediante una matriz amorfa. Con el microscopio electrónico de transmisión se observa que las fibrillas están compuestas por microfibrillas paralelas de un diámetro aproximado de 50 nm. En ellas, se distingue un rayado transversal característico que se repite cada 67 nm. 276 FIGURA 6-14 Fibras de colágeno. A. Fibras de colágeno de la matriz extracelular observadas al microscopio electrónico de transmisión. B. Mediante la técnica de contraste negativo, al microscopio electrónico se observa con claridad que las fibras de colágeno presentan una característica estriación transversal periódica. C. Esquema de la síntesis de las fibras colágenas; RER, retículo endoplasmático rugoso. (A y B, procedentes de: Burrell MA et al. Atlas de ultraestructura celular. Pamplona: EUNSA; 2011; C, ilustración de: A. Calvo.) La molécula que forma estas microfibrillas es el tropocolágeno. Cada molécula está compuesta por tres cadenas polipeptídicas, denominadas «cadenas α», enrolladas helicoidalmente para formar una triple hélice dextrógira, excepto en los extremos. Las cadenas α poseen alrededor de 1.000 residuos de aminoácidos y una composición poco común, siendo la glicina (33,5%), la prolina (12%) y la hidroxiprolina (10%) los aminoácidos más abundantes. Algunos aminoácidos, como la hidroxiprolina y la hidroxilisina, son característicos del colágeno; tienen, además, secuencias repetidas en las cadenas: Gly-X-Y (siendo X frecuentemente prolina, e Y, frecuentemente hidroxiprolina). Los enlaces de hidrógeno de la hidroxiprolina conservan juntas las tres cadenas α, y la hidroxilisina permite la formación de fibrillas por la unión entre sí de moléculas de tropocolágeno. La resistencia de la fibrilla es consecuencia de los enlaces covalentes que hay entre las moléculas de tropocolágeno de hileras contiguas, y no de las uniones cabeza-cola entre las moléculas de una hilera. Asociados con la hélice, hay grupos sacáridos que están unidos a residuos hidroxilisílicos. Debido a la presencia de estos grupos, el colágeno se clasifica con propiedad como una glucoproteína. Las moléculas de tropocolágeno, de 280 nm de longitud, se disponen una detrás de otra, dejando una distancia aproximada de 37 nm entre la terminación de una y el comienzo de la siguiente. Las diferentes hileras no están al mismo nivel, sino desfasadas, produciéndose así las características estriaciones transversales. La posición del colágeno se repite cada cinco hileras. En el escorbuto, enfermedad producida por la carencia de vitamina C (o ácido ascórbico), no se forman fibras de colágeno normales. El ácido ascórbico es un agente reductor necesario para la prolilhidroxilasa y la lisilhidroxilasa, que catalizan la hidroxilación de la prolina y la lisina. Sin la hidroxilación postraduccional de la prolina y la lisina no se pueden formar los enlaces de hidrógeno indispensables para formar hélices estables, y las moléculas de tropocolágeno no pueden agregarse en fibrillas. El trastorno afecta primero a los tejidos conjuntivos con un recambio elevado de colágeno, como el ligamento periodontal y las encías. Debido a que estas dos estructuras tienen a su cargo la conservación de los dientes en sus alvéolos, los síntomas de escorbuto incluyen encías con hemorragia y dientes flojos. Si la deficiencia de vitamina C es prolongada, también se afectan otras partes del cuerpo (piel, articulaciones). 277 En niños, otro síntoma esencial son los defectos en la osteogenia, con tendencia a deformaciones y fracturas. También puede existir sangrado intraarticular, intraperitoneal, intrapericárdico e, incluso, hemorragias en las glándulas suprarrenales. El tratamiento de este déficit se basa en la administración de vitamina C, consiguiéndose la recuperación pocos días después del inicio del tratamiento. La deficiencia de la enzima lisilhidroxilasa, trastorno genético que se conoce como síndrome de Ehlers-Danlos, produce un enlace transversal anormal entre moléculas de tropocolágeno. Los individuos afectados por esta anomalía poseen fibras de colágeno alteradas que dan lugar a articulaciones hipermóviles, dificultad en la curación de las heridas, baja estatura y piel hiperextensible (fig. 6-15). En muchos casos, la piel de los pacientes se traumatiza con facilidad y el enfermo está sujeto a luxaciones de las articulaciones afectadas. La biogénesis de las fibras de colágeno se puede resumir en los siguientes pasos: 1. Síntesis en el RER (a partir de su correspondiente ARNm) de cadenas individuales de preprocolágeno, que son cadenas α que poseen secuencias adicionales de aminoácidos, conocidas como propéptidos, en los extremos amino y carboxilo. 2. En el RER, después de la escisión del péptido señal, se dan las siguientes modificaciones: a. Hidroxilación de algunos residuos de prolina y lisina, mientras los polipéptidos todavía están en la conformación no helicoidal, por las enzimas hidroxilasa de peptidilprolina e hidroxilasa de peptidilisina. b. Glucosilación (de tipo O-ligada) de algunos residuos de hidroxilisinas caracterizados por la adición de glucosa y galactosa. c. Se alinean entre sí tres moléculas de preprocolágeno y se ensamblan para formar una configuración helicoidal ajustada, conocida como molécula de procolágeno. Al parecer, los propéptidos tienen la función adicional de conservar solubles las moléculas de procolágeno y prevenir así su agregación espontánea a fibras de colágeno dentro de la célula. d. Formación de enlaces de hidrógeno intra- e intercatenarios que ejercen influencia sobre la forma de la molécula y estabilizan las interacciones de los polipéptidos. 3. Las moléculas de procolágeno salen del RER mediante vesículas de transferencia recubiertas de coatómeros que las transportan al aparato de Golgi, donde se modifican otra vez por la adición a las dos posiciones terminales de oligosacáridos de tipo N-ligados. 4. Las moléculas de procolágeno modificadas se empaquetan en la red del Trans Golgi y se transportan de inmediato fuera de la célula. 5. A medida que el procolágeno entra en el ambiente extracelular, las procolágeno peptidasas (enzimas asociadas a la membrana celular) segmentan los propéptidos de los terminales amino y carboxilo. La molécula recién formada es más corta (280 nm de longitud) y se conoce como molécula de tropocolágeno. 278 6. Las moléculas de tropocolágeno se autoensamblan espontáneamente en una dirección específica (la cabeza con la cola) y en una disposición escalonada y regular, formando fibrillas con bandas a una distancia de 67 nm. La formación y conservación de la estructura fibrilar aumenta por enlaces covalentes formados entre los residuos de lisina e hidroxilisina de moléculas de tropocolágeno adyacentes. Este proceso es catalizado por la acción de la enzima lisil oxidasa (enzima que oxida la lisina), que también actúa en el espacio extracelular. 7. La célula controla la disposición ordenada de las fibrillas neoformadas al dirigir las vesículas de secreción hacia un sitio focalizado de la superficie celular para que se produzca la exocitosis. 8. La polimerización puede continuar para formar fibras más gruesas, de hasta 100 nm. FIGURA 6-15 El síndrome de Ehlers-Danlos, causado por una deficiencia de la enzima lisilhidroxilasa, afecta a la estructura de las fibras de colágeno y se caracteriza por dar lugar a una piel hiperextensible y a articulaciones hipermóviles. En realidad, las fibras de colágeno están constituidas por una familia de proteínas muy relacionadas (aunque genéticamente diferentes), que comparten ciertas características de organización molecular, pero cuyas cadenas α difieren en la secuencia y composición de aminoácidos. Las tres cadenas α que componen el tropocolágeno no tienen por qué ser iguales, lo que constituye la principal diferencia entre los tipos. Inicialmente, se distinguió entre dos tipos de cadenas: α1 y α2. Después, se identificaron cuatro subtipos de cadenas dentro del tipo α1, por lo que las cadenas se denominaron α1I, α1II, α1III y α1IV. Más tarde, se distinguieron nuevos subtipos de cadenas α1 (hasta α1XII). Por último, se descubrieron varios subtipos de cadenas α2 y las cadenas α3. Se han encontrado hasta 27 tipos de cadenas α, reconocibles por diferencias en la secuencia de aminoácidos y codificadas por su gen correspondiente. Las diferentes combinaciones entre los distintos tipos de cadenas producen diversas configuraciones de colágeno. Estas configuraciones originan, al menos, 20 variedades de fibras de colágeno. Estos tipos se clasifican con números romanos sobre la base cronológica de su descubrimiento, y se localizan en regiones específicas del cuerpo, donde desempeñan varias funciones. Los colágenos se pueden dividir en distintas familias, de acuerdo con el tipo de estructura que formen: 279 • Colágenos que forman fibrillas largas: tipos I, II, III, V y XI. Forman fibrillas claramente visibles a microscopio electrónico. • Colágenos FACIT (del inglés fibril-associated collagen with interrupted triple helix): tipos IX, XII y XIV. Son estructuras de poca longitud que unen entre sí las fibrillas de colágeno y otros componentes de la MEC. • Colágenos de cadena corta: tipos VIII y X. • Colágenos que forman redes: tipo IV. Forma una red tridimensional en las membranas basales. • Otros colágenos: tipos VI, VII y XIII. Fibras reticulares Aunque hoy en día sabemos que las fibras reticulares son, de hecho, un tipo de fibras de colágeno, muchos histólogos conservan el término «fibras reticulares» no solo por razones históricas, sino también por conveniencia, al caracterizar tejidos que poseen grandes cantidades de este tipo de fibras, como los hemopoyéticos y los linfopoyéticos (a excepción del timo). Las fibras reticulares son teñidas preferentemente por sales argénticas o por la tinción de PAS; de hecho, contienen un 6-12% de hexosas, mientras que las fibras de colágeno contienen únicamente un 1%. Las fibras reticulares también se conocen como «fibras argirófilas» o «fibras argentófilas»; este tipo de fibras no forma haces, sino finas redes de fibras delgadas con un diámetro de 0,5-2 µm. Fibras elásticas Las fibras elásticas son, típicamente, más delgadas (0,2-1 µm) que las fibras de colágeno, y se organizan de acuerdo a un modelo ramificado para formar una red tridimensional. A diferencia de las fibras de colágeno, las fibras elásticas son sumamente ajustables y pueden estirarse sin romperse hasta una vez y media su longitud en reposo, regresando a su longitud inicial cuando se libera la fuerza (fig. 6-16). Se encuentran en proporciones variables en la mayoría de los tejidos conjuntivos, a los que confieren la elasticidad que les permite recuperar su forma cuando sufren deformaciones fisiológicas normales. Son particularmente abundantes en los órganos sometidos a fuerzas de estiramiento, como los ligamentos amarillos de la columna vertebral (ligamento flava), las cuerdas vocales, las arterias elásticas, las vías respiratorias y el parénquima pulmonar, la piel, el cartílago elástico y la vejiga urinaria. Se pueden teñir mediante coloraciones específicas para elastina, como la resorcina-fucsina o la orceína. 280 FIGURA 6-16 Fibras elásticas. Estas fibras se caracterizan por su capacidad de distensión cuando son sometidas a una fuerza de estiramiento, y por su capacidad de relajación (volviendo a su longitud inicial) tras cesar dicha fuerza. (Ilustración de: A. Calvo.) Al microscopio electrónico de transmisión, se observa que las fibras elásticas contienen dos elementos: un centro amorfo con elastina y una región externa y angosta con microfibrillas. Las microfibrillas poseen un diámetro de 10-12 nm y una periodicidad de 56 nm, y comprenden varias glucoproteínas, algunas de las cuales guardan cierto parecido químico con el colágeno, mientras que otras difieren notablemente de él. No contienen prolina ni lisina; en cambio, son ricas en aminoácidos polares y cisteína. La fibrilina es la glucoproteína predominante. Las microfibrillas desempeñan un papel importante en la organización en fibras de la elastina. Por lo general, las fibras elásticas se forman en las células del músculo liso, pero, en los tejidos que carecen de estas células, la producción está a cargo de los fibroblastos. En el interior de estos tipos celulares pueden observarse, en una matriz amorfa, las microfibrillas de 12 nm formando la tropoelastina. Esta matriz se segrega al espacio extracelular y se ensambla en fibrillas, observables en invaginaciones de la superficie celular. En la elastogénesis, primero se sintetiza el material fibrilar y luego el amorfo. La elastina es una proteína no glucosilada de 750 aminoácidos, rica en glicina, lisina, alanina, valina y prolina. A diferencia del colágeno, la elastina contiene poca hidroxiprolina y carece de hidroxilisina. La presencia de aminoácidos de desmosina e isodesmosina es exclusiva de las fibras elásticas, formando enlaces cruzados entre las moléculas de elastina para dar lugar a una red de cadenas enrolladas que son las responsables de su elasticidad. Los pacientes con síndrome de Marfan, que poseen mutaciones en la proteína fibrilina, tienen miembros largos y finos y presentan aracnodactilia (dedos largos parecidos a patas de araña), trastornos visuales y aneurisma de la aorta. La incidencia del síndrome de Marfan es de 1 por cada 10.000 habitantes, siendo un trastorno que se hereda de manera autosómica dominante. La causa más frecuente de mortalidad en estos pacientes es la patología del sistema cardiovascular asociada. Es frecuente que los pacientes presenten un prolapso en la válvula mitral que puede dar lugar a un cuadro de insuficiencia cardíaca. También es usual que la base de la aorta se dilate, formando un aneurisma que puede provocar una insuficiencia aórtica, así como una rotura que pone en riesgo la vida de estos pacientes. 281 La alteración de las moléculas de elastina puede provocar un cuadro muy raro denominado cutis laxa o elastólisis. No se sabe a ciencia cierta cuál es la causa subyacente a este síndrome, aunque se cree que puede deberse a una disminución en la concentración de los inhibidores de elastasas, a un aumento descontrolado de la actividad de las elastasas per se, o a alteraciones en los genes encargados de la síntesis de elastina. La clínica de esta patología cursa con una piel que no es capaz de recuperar su posición natural cuando se la estira, confiriendo un aspecto arrugado a todo el cuerpo. Es frecuente la aparición en la cara de piel «péndula», lo que produce un efecto envejecedor en los pacientes que lo padecen. Sustancia fundamental La sustancia fundamental ocupa el espacio que hay entre las células y las fibras. Es una sustancia viscosa que posee un alto contenido en agua y que disminuye con la edad, compuesta por glucosaminoglucanos (GAG), proteoglucanos (PG) y glucoproteínas de adhesión. Glucosaminoglucanos Los GAG son polisacáridos de cadenas largas, inflexibles, sin ramificaciones, compuestos por unidades repetidas de disacáridos (70-200 residuos). El primer azúcar del disacárido suele ser un aminoglucano (N-acetil-glucosamina o Nacetil-galactosamina); el segundo suele ser un ácido urónico (ácido glucurónico o idurónico). Los GAG tienen un carácter acido debido a la presencia de grupos laterales hidroxilo, carboxilo y sulfato unidos a las unidades de disacáridos. Por ello, se tiñen con colorantes básicos, además de teñirse con PAS y azul alcián. En la mayoría de los casos, los GAG están sulfatados (SO o SO ), por lo que, junto a la presencia de grupos 42– 3– hidroxilo y ácido o carboxilo (COO ), hace que la carga neta de estas moléculas sea muy negativa, atrayendo así iones – Na . La alta concentración de Na atrae, a su vez, líquido extracelular, proporcionando turgencia y favoreciendo la + + resistencia a fuerzas de compresión. A medida que estas moléculas están más próximas entre sí, su carga negativa las repele, lo que favorece que tengan una textura resbaladiza, como demuestran el humor vítreo del ojo y el líquido sinovial. La presencia de tipos específicos de GAG en diferentes tejidos confiere atributos especiales a la matriz extracelular. El hialuronato es el único GAG no sulfatado; puede tener hasta 25.000 unidades repetidas de disacáridos, con una longitud de 2,5 µm, y es de gran importancia para la formación de agregados de proteoglucanos. A la vez que en el tejido conjuntivo laxo, se encuentra en el líquido sinovial de las articulaciones, el humor vítreo del ojo, el cordón umbilical y el cartílago. 282 Una de sus propiedades más importantes es su elevada viscosidad en solución acuosa, lo que contribuye a la consistencia de gel propia de la sustancia fundamental. Su estado de gel no supone barrera alguna para la difusión de metabolitos a través de su fase acuosa, pero probablemente represente un impedimento significativo para la diseminación de las bacterias que pudieran penetrar en los tejidos. Es interesante señalar que algunas especies bacterianas con mayor capacidad invasiva han contrarrestado esta propiedad mediante la capacidad para sintetizar la enzima hialuronidasa, que despolimeriza el hialuronato de la sustancia fundamental. Otros GAG son el condroitín sulfato (abundante en el cartílago, aunque también se encuentra en los vasos sanguíneos, el hueso, la córnea y la gelatina de Wharton), el dermatán sulfato (presente en las válvulas cardíacas, la piel y los vasos sanguíneos), el queratán sulfato (en la cornea y el cartílago de los discos intervertebrales) y el heparán sulfato (en los vasos sanguíneos, en pulmón y la lámina basal). Proteoglucanos Los proteoglucanos (PG) son complejos macromoleculares de GAG (generalmente, condroitín sulfato y queratán sulfato) unidos covalentemente a un núcleo proteico de longitud variable (fig. 6-17). Esta unión no suele ser directa, sino mediada por trisacáridos. El contenido en hidratos de carbono puede alcanzar hasta el 95%, en los PG a diferencia de las glucoproteínas, que contienen como máximo el 60%. Por lo tanto, los PG tienen más características de polisacáridos que de proteínas. Los centros proteicos de los PG se sintetizan en el RER, donde tiene lugar una glucosilación ligada a N (v. capítulo 10), mientras que la mayor parte de los hidratos de carbono se integran en el Golgi mediante glucosilación ligada a O; los grupos GAG se unen de manera covalente a la proteína en el aparato de Golgi. En este último, también se produce la sulfatación, catalizada por sulfotransferasas, y la epimerización (reordenamiento de diversos grupos alrededor de átomos de carbono de las unidades de azúcar). FIGURA 6-17 Agregado de proteoglucanos asociados a una molécula de hialuronato. Los proteoglucanos poseen un eje proteico sobre el que se disponen perpendicularmente glucosaminoglucanos (GAG), como el queratán sulfato o el condroitín sulfato. (Ilustración de: A. Calvo.) 283 Los PG se caracterizan por su diversidad molecular y se pueden localizar en gránulos citoplasmáticos de células (como los gránulos de la heparina de los mastocitos), en la superficie de las células (sindecano), en las láminas basales (perlecano) o en la matriz extracelular (agrecano). Muchos PG, en especial el agrecano (una macromolécula que se encuentra en el cartílago y el tejido conjuntivo), se unen al hialuronato. Los PG tienen múltiples funciones, como por ejemplo la resistencia a la compresión. Debido a su elevada viscosidad y a su localización estratégica en los espacios intercelulares, estas sustancias actúan como barrera frente a la penetración de bacterias y de otros microorganismos invasores o frente al movimiento de células metastásicas. Además, conjuntamente con la lámina basal, forman filtros moleculares con poros de tamaños y distribuciones de carga variable, que seleccionan y retardan el paso de macromoléculas. Algunos PG, como el sindecano, en lugar de liberarse hacia la matriz extracelular, permanecen unidos a la membrana de la célula. Las proteínas centrales de los sindecanos son de tipo transmembrana y se unen a los filamentos de actina del citoesqueleto. La parte extracelular de la molécula se fija a componentes de la MEC, contribuyendo así al anclaje celular a la matriz. Además, los sindecanos de los fibroblastos funcionan como correceptores, ya que se unen el factor de crecimiento de fibroblastos (FGF, del inglés fibroblast growth factor) y lo presentan a receptores de la membrana celular. Glucoproteínas adhesivas La capacidad de las células para adherirse a componentes de la MEC está mediada, en gran parte, por glucoproteínas adhesivas. Estas glucoproteínas tienen varios dominios responsables de la unión a proteínas de la superficie celular (integrinas), fibras de colágeno y proteoglucanos. De esta forma, las glucoproteínas de adhesión conectan los diversos componentes de los tejidos entre sí. La fibronectina (fig. 6-18, A), la más abundante, es un dímero grande (440 kDa) compuesto por dos subunidades polipeptídicas similares, unidas entre sí en sus extremos carboxilo mediante enlaces disulfuro. Cada brazo de esta macromolécula en forma de «U» tiene sitios de unión para diversos componentes extracelulares (colágeno, heparán sulfato, ácido hialurónico, hialuronato, etc.) y para integrinas de la membrana celular. Como ya se ha indicado, la secuencia de aminoácidos RGD de la fibronectina se une a las integrinas de la membrana plasmática de muchos tipos celulares. La fibronectina es producida por fibroblastos, miofibroblastos, condrocitos, células de Schwann, astrocitos, y células epiteliales y endoteliales. También se ha encontrado en los gránulos de las plaquetas, en la sangre y en los líquidos corporales. 284 FIGURA 6-18 Estructura molecular de la fibronectina (A) y la laminina (B). Estas dos proteínas de la matriz extracelular participan en procesos de adhesión. (A y B, ilustraciones de: A. Calvo.) La fibronectina es una glucoproteína multifuncional que existe bajo tres grandes formas: a) plasmática, que se encuentra en forma dimérica, es soluble en el plasma sanguíneo y favorece la coagulación y la fagocitosis; b) de la superficie celular, que reviste la superficie de los tipos celulares que la producen, y c) fibronectina de la MEC, que forma fibrillas insolubles. 285 La laminina (fig. 6-18, B) es una proteína producida por la mayoría de las células epiteliales y endoteliales. Se localiza únicamente en la lámina basal y en las láminas externas de células musculares, células de Schwann y adipocitos. Es una glucoproteína sulfatada muy grande (850 kDa) compuesta por tres cadenas polipeptídicas unidas entre sí por puentes disulfuro, en forma de cruz latina. La cadena α se dispone de modo lineal en el brazo largo de la cruz; las cadenas β y γ rodean la cadena α en el brazo largo y configuran los brazos cortos de la cruz. La laminina tiene sitios de unión para el heparán sulfato, el colágeno de tipo IV, la entactina y las integrinas. Los múltiples ligandos para la laminina hacen de ella una de las principales moléculas extracelulares de unión entre las células y la MEC. Existe una distrofia muscular congénita causada por el déficit de la cadena α2 de la laminina, que se hereda de manera autosómica recesiva. Esta enfermedad tiene una baja incidencia (0,7 por cada 100.000 habitantes) y la sintomatología se puede observar desde el nacimiento, con una hipotonía grave generalizada. Los niños que nacen con esta enfermedad no pueden caminar solos debido a una extrema debilidad y a la falta de tono muscular; incluso se describen cuadros de insuficiencia respiratoria, al fallar también la musculatura que permite la respiración. No existe tratamiento específico para esta enfermedad, aunque la fisioterapia y el apoyo ventilatorio han aumentado la esperanza de vida de estos pacientes. Experimentos en animales aplicando terapia génica han conseguido la expresión de la molécula deficitaria; sin embargo, estos ensayos aún no han sido aplicados en humanos. Otras glucoproteínas adhesivas son la entactina y tenascina. La entactina es una glucoproteína que se une a la laminina y al colágeno de tipo IV, y es sintetizada por las células epiteliales. La tenascina es una glucoproteína grande, compuesta por seis cadenas polipeptídicas (210 kDa cada una), unidas entre sí por enlaces disulfuro. Esta macromolécula tiene sitios de unión para los sindecanos transmembrana y la fibronectina. La distribución de la tenascina suele limitarse al tejido embrionario (mesenquimatoso y nervioso), donde marca vías migratorias para células específicas y el crecimiento de los axones; también es producida por células metastásicas, para favorecer la migración. Lecturas recomendadas Assimakopoulos SF, Papageorgiou I, Charonis A. Enterocytes’ tight junctions: From molecules to diseases. World J Gastrointest Pathophysiol. 2011;2(6):123–137. Franke WW. Discovering the molecular components of intercellular junctions —a historical view. Cold Spring Harb Perspect Biol. 2009;1(3): a003061. Garrod D, Chidgey M. Desmosome structure, composition and function. Biochim Biophys Acta. 2008;1778(3):572–587. Gelse K, Pöschl E, Aigner T. Collagens — structure, function, and biosynthesis. Adv Drug Deliv Rev. 2003;55(12):1531–1546: 28. 286 Giepmans BN. Gap junctions and connexin-interacting proteins. Cardiovasc Res. 2004;62(2):233–245. Lai-Cheong JE, Arita K, McGrath JA. Genetic diseases of junctions. J Invest Dermatol. 2007;127(12):2713–2725. Miosge N. The ultrastructural composition of basement membranes in vivo. Histol Histopathol. 2001;16(4):1239–1248. Mooseker MS. Organization, chemistry, and assembly of the cytoskeletal apparatus of the intestinal brush border. Annu Rev Cell Biol. 1985;1:209–241. Wiig H, Gyenge C, Iversen PO, Gullberg D, Tenstad O. The role of the extracellular matrix in tissue distribution of macromolecules in normal and pathological tissues: potential therapeutic consequences. Microcirculation. 2008;15(4):283–296. Wiradjaja F, DiTommaso T, Smyth I. Basement membranes in development and disease. Birth Defects Res C Embryo Today. 2010;90(1):8– 31. Preguntas de autoevaluación 1. Indique cuál de las siguientes afirmaciones es verdadera con respecto a las microvellosidades: a. Son proyecciones digitiformes de la superficie lateral de las células epiteliales. b. Sirven para aumentar la superficie de absorción. c. Tienen más o menos 1 μm de ancho y 0,08 μm de largo. d. No poseen un glucocáliz muy pronunciado. e. Las microvellosidades del intestino no pueden observarse al microscopio electrónico. Respuesta correcta: b. 2. Los pliegues basales son abundantes en: a. Intestino. b. Túbulo contorneado distal del riñón. c. Ovocitos. d. Células secretoras exocrinas del páncreas. e. Células secretoras endocrinas del páncreas. 287 Respuesta correcta: b. 3. La respuesta falsa con respecto a las cadherinas es: a. Son moléculas que dependen del Ca para ejercer sus funciones de adhesión. 2+ b. Establecen uniones heterófilas. c. Forman parte de los desmosomas. d. Son responsables de establecer uniones célula-célula. e. Las desmogleínas son un tipo de cadherinas. Respuesta correcta: b. 4. Las moléculas de adhesión que intervienen en la unión de los leucocitos a las células endoteliales en el marco de su salida de los vasos sanguíneos son: a. Ocludinas. b. Conexinas. c. Cadherinas. d. Selectinas. e. Claudinas. Respuesta correcta: d. 5. ¿Cuál de las siguientes estructuras no forma parte de los contactos que sirven para la unión mecánica de las células?: a. Cinturones de adhesión. b. Desmosomas. c. Hemidesmosomas. d. Uniones tipo nexo. e. Todos los anteriores tienen funciones mecánicas. Respuesta correcta: d. 6. Las uniones tipo nexo (o gap) no permiten el paso entre dos células de: a. Ca . 2+ b. H O. 2 288 c. Proteínas. d. Aminoácidos. e. AMPc. Respuesta correcta: c. 7. Indique cuál de las siguientes afirmaciones es incorrecta: a. La membrana basal es el soporte de todos los epitelios y está constituida por componentes derivados exclusivamente del tejido conjuntivo subyacente. b. La membrana basal es un indicador de polaridad de las células epiteliales y filtra las sustancias que se intercambian entre los tejidos epitelial y conjuntivo. c. Entre los componentes típicos de la membrana basal, son importantes las glucoproteínas, responsables de la positividad del PAS. d. La membrana basal contiene fibras de colágeno de tipo IV y proteínas adhesivas que interactúan con las integrinas presentes en la membrana plasmática basal de la célula epitelial. e. La lámina lúcida de la membrana basal está constituida por finos filamentos y su visualización solo es posible con microscopio electrónico. Respuesta correcta: a. 8. ¿Cuál de las siguientes frases no se refiere al pénfigo vulgar?: a. Produce acantólisis. b. Es una enfermedad autoinmunitaria en la que se producen autoanticuerpos contra desmogleínas. c. Origina lesiones ampollosas. d. Causa lesiones en las fibras elásticas, lo que hace que la piel sea demasiado extensible. e. Los pacientes con pénfigo sufren infecciones frecuentemente. Respuesta correcta: d. 9. La molécula de tropocolágeno acaba de formarse en: a. El retículo endoplasmático rugoso (RER). b. El retículo endoplasmático liso (REL). c. El aparato de Golgi. d. Las vesículas de secreción. 289 e. El medio extracelular. Respuesta correcta: e. 10. Los pacientes con síndrome de Marfan tienen miembros largos y finos con aracnodactilia. La enfermedad es causada por defectos moleculares de la: a. Fibrilina. b. Elastina. c. Fibras de colágeno de tipo I. d. Fibras de colágeno de tipo IV. e. Fibras reticulares. Respuesta correcta: a. 11. Indique cuál de las siguientes afirmaciones acerca de la sustancia fundamental es incorrecta: a. Ocupa el espacio que hay entre las células y las fibras. b. Es una sustancia viscosa, clara y resbaladiza al tacto que posee un alto contenido en agua. c. En los preparados histológicos de rutina, se extrae durante la fijación y la deshidratación del tejido. d. Permite la difusión del oxígeno y los nutrientes entre la microvasculatura y los componentes celulares del tejido. e. Está compuesta de glucosaminoglucanos, proteoglucanos, glucoproteínas de adherencia y fibras. Respuesta correcta: e. 290 CAPÍTULO 7 291 El núcleo. Parte I: organización de la cromatina y conservación de la información genética José Luis Vizmanos Objetivos de aprendizaje • Conocer el núcleo como estructura celular organizada que interacciona con el resto de la célula, y en la que reside el genoma principal de los organismos eucariotas. • Comprender la relación entre la estructura del núcleo y la información genética. • Conocer la estructura del material genético dentro del núcleo eucariota y su análisis a nivel citológico. • Relacionar la estructura y el número de los cromosomas con las alteraciones genéticas causantes de enfermedad. • Conocer la estructura básica del genoma nuclear eucariota, su replicación y los mecanismos que generan variabilidad genética a nivel molecular. 292 Introducción El núcleo es la estructura celular que contiene la mayor parte del material genético y en el que se llevan a cabo los procesos de replicación y transcripción. Este material genético es común en todas las células de un mismo organismo, que se diferenciarán y llevarán a cabo funciones distintas dependiendo de cómo utilicen esta información. La morfología del núcleo (fig. 7-1) de todas las células eucariotas es similar y consta fundamentalmente de una masa amorfa encerrada en una envoltura nuclear que la separa del citoplasma. Esta masa amorfa está formada por fibras de ADN y proteínas que dan lugar a la cromatina (y que en determinadas fases del ciclo celular se condensan para la formación de los cromosomas), uno o más nucléolos (estructuras más densas en las cuales se producen la síntesis del ARN ribosómico), el nucleoplasma o matriz líquida y una matriz nuclear compuesta por una red de fibras de proteínas que conforman el armazón estructural del núcleo (v. fig. 7-1). FIGURA 7-1 A. Esquema del núcleo celular y sus diferentes componentes. B. Imagen de microscopía electrónica de un núcleo celular. Se observan la membrana nuclear (MB), el nucléolo (NL), la eucromatina (EU) y la heterocromatina (HET). C. Imagen de la envoltura nuclear. La flecha negra indica la lámina nuclear, y la flecha roja, un poro. (A, ilustración de: I. Baraibar; B, procedente de: Vázquez JJ, Díaz del Corral JL. Citología Práctica. Pamplona: EUNSA; 1991; C, procedente de: Trump BF, Jones R, eds. Diagnostic Electron Microscopy. New York: John Wiley & Sons; 1980.) La presencia de envoltura nuclear como barrera separadora entre el núcleo y el citoplasma es una de las diferencias más importantes entre las células eucariotas y procariotas. Sin embargo, esta envoltura no es completamente impermeable sino que permite el paso de ciertos componentes de manera selectiva. La envoltura nuclear está formada por dos membranas paralelas (interna y externa) que se fusionan en algunos lugares para formar poros de 293 comunicación citoplasma-núcleo recubiertos de complejos proteicos. Estos poros permiten el intercambio controlado de moléculas (como ciertas proteínas y ARN), lo que es vital para el mantenimiento de la composición interna del núcleo y la regulación de la expresión del material genético. 294 Envoltura nuclear. Poros nucleares La membrana nuclear externa se encuentra recubierta por ribosomas y fusionada al retículo endoplasmático rugoso, de manera que el interior de este y el espacio intermembrana de la envoltura nuclear se encuentran unidos. Por el contrario, la membrana nuclear interna está unida a la lámina nuclear, constituida por unas proteínas denominadas láminas, que se asocian constituyendo una red de filamentos polipeptídicos. La lámina nuclear sirve de soporte mecánico y de lugar de unión a las fibras de cromatina periféricas. Existen diversos tipos de proteínas que configuran la lámina nuclear, pero todas ellas son proteínas fibrosas muy relacionadas con las proteínas de los filamentos intermedios del citoesqueleto. Inicialmente forman dímeros que, unidos entre sí, originan filamentos que se unen a la membrana nuclear interna y que, hacia el interior de la matriz, sirven como punto de unión a las fibras de cromatina. Parece que la organización laminar, además de cumplir con la función de soporte estructural del núcleo, sería esencial para la replicación del material genético y la regulación de su expresión. Las proteínas de la lámina nuclear sufren fosforilación durante la prometafase, lo que ocasiona su desensamblaje, y ocasiona la ruptura de la envoltura nuclear durante la mitosis. En la telofase, las láminas se desfosforilan y constituyen de nuevo filamentos, de tal manera que la envoltura nuclear se estructurará de nuevo. Se ha comprobado que mutaciones en los genes que codifican determinados polipéptidos que forman la lámina nuclear son los responsables de algunas enfermedades genéticas. Por ejemplo, la distrofia muscular de EmeryDreifuss (autosómica dominante) surge por mutaciones en el gen que codifica para la lámina A y C; se caracteriza por cambios en determinados músculos del esqueleto, así como por contracturas tempranas en cuello, codos, tendones de Aquiles, y defectos de conducción cardíaca. Las mutaciones en este gen también son responsables de ciertas cardiomiopatías idiopáticas familiares y de algunas lipodistrofias familiares parciales. La progeria de HutchinsonGilford está asociada a mutaciones en heterocigosis surgidas de novo en el gen de la lámina A. Esta enfermedad es muy rara y se caracteriza por una senilidad precoz. La clínica suele aparecer durante el primer año de vida y el 90% de los pacientes mueren por graves trastornos cardiovasculares alrededor de los 13 años. Sin embargo, en algunos pacientes el fenotipo surge más tarde y muestran una mayor esperanza de vida. Como se ha señalado, la envoltura nuclear no aísla por completo el citoplasma del núcleo. Así, los poros nucleares son indispensables para que los productos de la expresión de la información genética salgan del núcleo al citoplasma. Los procesos de replicación y transcripción se producen dentro del núcleo, mientras que la síntesis de proteínas se lleva a cabo en el citoplasma. Ambos procesos necesitan de productos sintetizados en el otro lado. La traducción o síntesis de proteínas necesita de moléculas como los ARN ribosómicos, ARN de transferencia y ARN mensajeros (v. capítulos 8 y 9) que se sintetizan en el núcleo; mientras que la replicación y la transcripción necesitan de proteínas sintetizadas en el citoplasma. Además, a través de estos poros también se realiza el intercambio de otras moléculas como lípidos y carbohidratos. Una célula puede tener alrededor de 2.000 poros de este tipo, aunque el número de poros no es estático y suele guardar relación con la actividad funcional de la célula. Así, en células en las que hay 295 mucha actividad de síntesis proteica (como por ejemplo los ovocitos o los hepatocitos) hay muchos más poros nucleares que en células sin actividad sintética (como linfocitos inactivos o espermatozoides). De esta manera, dependiendo de la necesidad de síntesis de proteínas, las células pueden modificar el número de poros nucleares para hacer frente a estas nuevas situaciones fisiológicas. Los poros nucleares se encuentran recubiertos por un complejo proteico denominado complejo del poro nuclear (NPC, del inglés nuclear pore complex), probablemente uno de los mayores complejos proteicos celulares (con un tamaño cercano a 30 veces el de un ribosoma). Este complejo se encarga de controlar que las moléculas que atraviesan estos poros sean las adecuadas (fig. 7-2), mientras que permite la difusión pasiva de iones y moléculas muy pequeñas (de menos de 9 nm de diámetro). Otras moléculas como proteínas, ARN y ribonucleoproteínas mayores de 9 nm necesitan ser transportadas de manera activa mediante un mecanismo dependiente de energía y mediado por señales. FIGURA 7-2 A. Complejo del poro nuclear (NPC, del inglés nuclear pore complex) y sus partes principales. B. Imagen de criofractura de la membrana nuclear, donde se observan con claridad numerosos poros nucleares. Flecha, poro nuclear; MB-I, membrana nuclear interna; MB-E, membrana nuclear externa. (A, ilustración de: I. Baraibar; B, imagen procedente de: Fawcett DW. The Cell. Philadelphia: Saunders; 1981.) El NPC está formado por más de 50 proteínas diferentes llamadas nucleoporinas (Nup). Aproximadamente la mitad presentan dominios tipo hélice α y láminas β, mientras que la otra mitad carecen de una estructura secundaria 296 ordenada y presentan repeticiones Phe-Gly (FG). En vertebrados, se muestra como una masa molecular de ∼1 con una estructura cilíndrica de simetría octogonal en el eje de transporte. Tiene unos 145 nm de diámetro y unos 80 nm de largo a través de la membrana, lo que a nivel celular son dimensiones importantes. Dependiendo del tamaño de las moléculas, el paso a través de este complejo del poro se lleva a cabo por dos mecanismos principales. Las moléculas pequeñas y las proteínas de masa inferior a los 50 kDa pasan libremente en ambas direcciones mediante difusión pasiva. Sin embargo, la mayor parte de las proteínas y los ARN no pueden atravesar los poros y necesitan ser reconocidas y transportadas de manera selectiva y activa en una determinada dirección. Para ello, es necesario que el canal central sufra una serie de cambios en su conformación. Las proteínas que se translocan al núcleo deben tener una señal de localización nuclear (NLS, del inglés nuclear localization signal). La primera señal de localización nuclear fue caracterizada en 1984 en experimentos donde se utilizó el antígeno T del virus del simio SV40. El antígeno T es una proteína de 94 KDa codificada por el virus y necesaria para la replicación del ADN vírico, por lo que debe entrar en el núcleo. La NLS se identificó al observar que una mutación en Lys-128 (lisina sustituida por treonina o asparragina) impedía que el antígeno se introdujera en el núcleo. Posteriormente, se identificó la secuencia de siete aminoácidos Pro-Lys-Lys-Lys-Arg-Lys-Val (aminoácidos 126-132) responsable del transporte del antígeno T. De hecho, al crear quimeras fusionando proteínas que normalmente no se hallan en el núcleo (β-galactosidasa, piruvato quinasa) con la secuencia de la señal de localización nuclear, se consigue que estas proteínas se acumulen en el núcleo. En el caso de la proteína nucleoplasmina (proteína que participa en el ensamblaje de la cromatina), la NLS consta de dos partes: Lys-Arg separada por diez aminoácidos de otra secuencia Lys-Lys-Lys-Lys. La secuencia de diez aminoácidos que se halla en medio no interviene en el transporte hacia el núcleo. Este tipo de señales bipartitas son más frecuentes que las señales únicas, en las que todos los aminoácidos implicados en el transporte se disponen uno detrás de otro. El transporte requiere de la actividad de la proteína Ran, proteína perteneciente a la familia de las GTPasas, que aporta la energía necesaria para el transporte (fig. 7-3). La proteína Ran está tanto en el citoplasma como en el núcleo y se necesita tanto para la importación como para la exportación de proteínas. Ran actúa como un interruptor molecular, en función de si está unida a GTP o a GDP; la unión a uno u otro nucleótido depende de la actuación de: a) la proteína citosólica activadora de GTPasa (GAP, del inglés GTPase activating protein) que provoca la hidrólisis de GPT, y transforma así a Ran-GPT en Ran-GDP; b) de un factor nuclear intercambiador de guanina (GEF, del inglés guanine exchange factor), que desempeña un papel opuesto, transformando Ran-GDP en Ran-GTP. El sistema Ran-GAP se localiza en el citoplasma, mientras que el sistema Ran-GEF se sitúa en el núcleo, de tal modo que el Ran-GDP es abundante en el citoplasma y Ran-GTP en el núcleo. La existencia del gradiente de Ran-GTP (de mayor concentración en el núcleo) y Ran-GDP (de mayor concentración en el citoplasma) determina la direccionalidad del transporte. 297 FIGURA 7-3 Modelo molecular que explica la presencia de Ran-GDP y Ran-GTP en el citoplasma y el núcleo, respectivamente. La GTPasa GAP hidroliza el GTP unido a Ran en el citoplasma, dando lugar a Ran-GDP + Pi. El intercambiador de nucleótidos GEF añade GPT a Ran en el interior nuclear, separándose así el GDP-Ran. (Ilustración de: A. Calvo.) El transporte ocurre del siguiente modo (fig. 7-4): las proteínas que van a ser transportadas al interior del núcleo deben unirse en el citoplasma a unas proteínas transportadoras, las importinas, que reconocen las NLS de las proteínas a transportar. El complejo de unión proteico así formado interacciona con proteínas del poro nuclear, las cuales permiten su paso al interior del núcleo. Una vez en el núcleo, Ran-GTP se une a la importina (que a su vez lleva unida la proteína de transporte), lo cual favorece la disociación del complejo, liberándose así la proteína de transporte. Tras la liberación, el complejo Ran-GTP-Importina interacciona con las proteínas del poro situadas en el interior nuclear y se produce su expulsión hacia el citoplasma. Allí, la proteína activadora citoplasmática GAP favorece la hidrólisis de GTP hacia GDP, lo que promueve la separación del complejo. Ahora queda en el citoplasma la importina separada de Ran-GDP y el ciclo puede comenzar de nuevo (v. fig. 7-4). 298 FIGURA 7-4 Modelo molecular que explica el transporte de proteínas desde el citoplasma hasta el núcleo (parte izquierda del dibujo) y desde el núcleo hasta el citoplasma (parte derecha). El transporte hacia ambos lados requiere que las proteínas a transportar tengan señales específicas y sean reconocidas por importinas (en el caso de transporte citoplasma-núcleo) o por exportinas (en el caso de transporte núcleo-citoplasma). La energía que requiere el transporte está proporcionada por el sistema Ran-GTP/Ran-GDP. (Ilustración de: A. Calvo.) De la misma manera, las proteínas que salen del núcleo hacia el citoplasma se unen a proteínas denominadas exportinas también a través de secuencias de aminoácidos específicas o señales de exportación nuclear (NES, del inglés nuclear export signals). En este caso, el Ran-GTP presente en el núcleo favorece la unión de la exportina a la proteína de transporte, en vez de fomentar su disociación. Una vez en el citoplasma, la hidrólisis de GTP hacia GDP causa la liberación de la carga, y separa esta de Ran-GDP (v. fig. 7-4). La mayor parte de las proteínas transportadas a través del NPC lo hacen hacia el interior del núcleo, ya que son sintetizadas en el citoplasma. En el caso de los ARN el proceso es el inverso, ya que su síntesis tiene lugar en el núcleo pero su salida es vital para que se lleve a cabo la traducción de proteínas en el citoplasma. Esta salida también requiere de un transporte activo y selectivo en el que de nuevo interviene Ran. Para su transporte, los ARN deben formar complejos de ribonucleoproteína (RNP) para su reconocimiento. Estos complejos son distintos para cada uno de los tipos de ARN y están formados por múltiples proteínas. El proceso de transporte del ARN se explica con más detalle en el capítulo 8. La alteración de diversos componentes del NPC se ha asociado tanto a cáncer como a enfermedades autoinmunes. Un ejemplo de ello es NUP98, cuyo gen localizado en el cromosoma 11 se ha encontrado implicado en varias translocaciones cromosómicas somáticas relacionadas con el desarrollo de mielodisplasias y de leucemia mieloide aguda. Estas translocaciones tienen como resultado la formación de proteínas quiméricas que contienen parte de NUP98 y parte de otra proteína. El potencial oncogénico de estas proteínas quimera podría deberse a la presencia en su extremo aminoterminal de repeticiones FG, capaces de reclutar factores de transcripción y alterar la regulación de la expresión de diversos genes. Se han encontrado alteraciones semejantes en el gen que codifica para NUP214 en el cromosoma 9 en otras mielodisplasias, leucemias mieloides agudas y en más del 5% de las leucemias agudas linfoblásticas T. 299 La autoinmunidad frente a diversos componentes del NPC parece que podría ser importante en el diagnóstico y la etiología de varias enfermedades autoinmunitarias. La cirrosis biliar primaria es una enfermedad crónica del hígado en la que se produce una inflamación y destrucción de los conductos biliares intrahepáticos. Esto, a su vez, produce un cuadro de colestasis crónica que desemboca en cirrosis. La etiología de esta enfermedad se desconoce, aunque parece tener una naturaleza autoinmune. Los pacientes con cirrosis biliar primaria generan frecuentemente autoanticuerpos frente a NUP62, NUP180 y la proteína gp210, una glucoproteína que también forma parte del NPC. Por ello, han sido utilizados como marcadores diagnósticos de esta enfermedad. 300 Organización del núcleo en interfase Inicialmente se pensó que el material genético se distribuía de manera aleatoria y desorganizada en el núcleo eucariota. Pero, de la misma manera que el citoplasma, el núcleo también presenta una estructura organizada y, en cierto modo, compartimentalizada. Dentro del núcleo en interfase, las moléculas de ADN (que como veremos más adelante formarán los cromosomas) parecen ocupar determinadas zonas no solapantes y no aleatorias denominadas territorios cromosómicos. Estos se encuentran separados entre sí por regiones no cromatínicas en las que se sitúan determinadas enzimas y proteínas implicadas en la expresión del genoma. Los territorios, además, son bastante estáticos dentro de un determinado núcleo. Parece que los cromosomas más ricos en genes tenderían a ocupar regiones nucleares centrales; mientras que los cromosomas con menos genes estarían localizados hacia las zonas de la membrana nuclear donde existe una menor actividad de la expresión génica. La posición de los genes activos dentro de un determinado territorio es tema de debate. Inicialmente se pensó en que estos genes estarían localizados preferentemente en la superficie de los territorios, accesibles a la maquinaria transcripcional. Sin embargo, experimentos recientes muestran que los transcritos de ARN también se generan dentro de los territorios, y los análisis microscópicos detallados muestran que cada uno de ellos está recorrido por varios canales que los unirían a las regiones no cromatínicas. Esto podría permitir el acceso de la maquinaria transcripcional al interior de los territorios (fig. 7-5). FIGURA 7-5 Modelos de estructura de la organización del núcleo en territorios cromosómicos. (Ilustración de: I. Baraibar.) La localización estática de los cromosomas descondensados dentro del núcleo y la posición relativa de cada uno de ellos ha llevado a postular que esta sería una de las razones por lo que las translocaciones cromosómicas (intercambio de segmentos entre dos o más cromosomas) afectan de manera recurrente a algunos de ellos, ya que su posición relativa haría que estuvieran físicamente muy cerca. Estas translocaciones cromosómicas son causa de algunos tipos de cáncer. Ejemplos conocidos son la translocación que implica los cromosomas 9 y 22 (lo que da lugar al cromosoma Philadelphia) causa de la leucemia mieloide crónica o la que implica a los cromosomas 15 y 17 en la leucemia promielocítica aguda. 301 Además, en el núcleo existe una subestructura compleja o matriz nuclear formada por una red de proteínas y ARN a la cual se unen las fibras de cromatina a través de unas secuencias de ADN conocidas como regiones de unión a la matriz o MAR (matrix attachment regions). Esta matriz ayudaría al mantenimiento de la forma del núcleo. Dentro del núcleo, con el microscopio electrónico se puede diferenciar una zona más densa denominada nucléolo, donde se sintetiza y procesa el ARN ribosómico (ARNr) (v. capítulo 8). Los genes del ARNr se encuentran agrupados en los brazos cortos de los cromosomas humanos 13, 14, 15, 21 y 22, que lógicamente se situarán en esa zona nucleolar donde se transcribe el ARNr. En el núcleo también se pueden diferenciar los cuerpos de Cajal, donde se produce la síntesis de las ribonucleoproteínas nucleares pequeñas (snRNP, del inglés small nuclear ribonucleoprotein) y los cuerpos PML, con apariencia de anillo, donde se localizaría la proteína de la leucemia promielocítica (PML, del inglés promyelocytic leukemia). Los pacientes con este tipo de leucemia presentan una aberración cromosómica formada por la translocación entre los cromosomas 15 y 17, antes mencionada. Esta alteración conduce a la fusión de parte de los genes PML y RARA (codificante del receptor del ácido retinoico). La proteína de fusión formada como consecuencia de esta translocación no es capaz de dar lugar a estos cuerpos PML de manera normal. El tratamiento con ácido retinoico en este tipo de pacientes restaura la capacidad de formación de estos cuerpos, permitiendo la localización correcta de la proteína PML. Otros dominios descritos hasta la fecha incluyen las fibrillas de pericromatina, donde se localizan las moléculas de ARN naciente, los cuerpos de rotura, lugares de poliadenilación y rotura del ARN, y los conjuntos granulares de intercromatina, involucrados en el splicing, ayuste o corte y empalme del ARN. 302 Estructura de la cromatina en interfase. Histonas En total, la longitud completa de los más de 3.000 millones de nucleótidos que conforman las cadenas de ADN nuclear ocupan una longitud de aproximadamente un metro dividido en 23 fragmentos de longitud variable en el caso de la especie humana. Esto es así para el genoma haploide, pero cada célula somática tiene dos copias, por lo que se estima que el genoma diploide puede tener unos dos metros de longitud (en 46 fragmentos) empaquetados en una estructura como el núcleo, cuyo diámetro es alrededor de 5 μm. Este enorme empaquetamiento, que además no debe impedir al genoma nuclear realizar sus funciones, se lleva a cabo mediante la unión de las moléculas de ADN con varios tipos de proteínas, formando la cromatina. A lo largo del ciclo celular, cada uno de los fragmentos de ADN, junto con las proteínas que intervienen en su empaquetamiento, llevan a cabo distintos procesos de condensación y descondensación con cambios en su grosor y longitud. Los cromosomas son las estructuras que se observan cuando esta condensación es máxima, pero representan un estado muy poco frecuente, ya que se observan brevemente durante un determinado momento de la división celular. En interfase, la etapa más larga del ciclo celular, los cromosomas no son fácilmente visibles ya que se encuentran más dispersos y descondensados. Su estructura la veremos posteriormente. De esta manera, los cromosomas en sus distintos estados de condensación más o menos visibles no son más que el reflejo del empaquetamiento del ADN que hemos señalado anteriormente. Existen varios niveles de empaquetamiento del ADN (figs. 7-6, 7-7 y 7-8). En el nivel más básico (nivel 1), la doble hélice de ADN (unas 146 pb) se enrolla alrededor de un core u octámero de histonas (llamadas H2A, H2B, H3 y H4) en una superhélice levógira (1,75 vueltas) y dará lugar a una estructura conocida como nucleosoma (v. fig. 7-6). Entre dos nucleosomas consecutivos existe una distancia de unas 50-70 pb, lo que hace que, con el microscopio electrónico, esta estructura tenga una apariencia de cuentas de collar (v. fig. 7-8). Las histonas son proteínas básicas (cargadas positivamente) cuya secuencia está muy conservada en la escala evolutiva. Tienen entre 102 y 135 aminoácidos. Como se ha indicado, las histonas H2A, H2B, H3 y H4 se asocian entre sí para formar un octámero. Dos moléculas de H3 junto con dos de H4 forman un tetrámero y dos dímeros H2A-H2B forman otro tetrámero. Ambos tetrámeros se asocian entre sí formando el núcleo proteico alrededor del cual se enrolla el ADN. En el caso de los espermatozoides, las histonas son sustituidas por otras proteínas básicas, las protaminas, que permiten un mayor empaquetamiento. 303 FIGURA 7-6 Estructura del nucleosoma. (Ilustración de: I. Baraibar.) FIGURA 7-7 Niveles de empaquetamiento de ADN genómico nuclear de eucariotas para formar los cromosomas. (Ilustración de: I. Baraibar.) FIGURA 7-8 Imagen de microscopía electrónica de la fibra de 11 nm (A) y de 30 nm (B) del ADN extendida sobre una superficie. (A y B, procedentes de: Olins, D. E. & Olins, A. L. Chromatin history: our view from the bridge. Nature Reviews Molecular Cell Biology.) 304 En conjunto, esta estructura de nucleosomas unidos entre sí, o estructura en cuentas de collar, da lugar a una fibra de cromatina de 11 nm de diámetro (v. figs. 7-7 y 7-8). En esta estructura, unos 200 pb ocupan 11 nm, lo que significa una reducción de la longitud de unas seis veces. La asociación con las histonas forma el nucleosoma y tiene importancia en la regulación de la expresión génica, como se verá más adelante y en el capítulo 8. En condiciones fisiológicas, esta fibra de 11 nm se vuelve a enrollar dando lugar a una fibra de cromatina de 30 nm (nivel 2), en una estructura en solenoide que contiene unos seis nucleosomas por vuelta (v. figs. 7-7 y 7-8). En este momento el grado de empaquetamiento del ADN es de 40 veces. La estructura en solenoide queda estabilizada por la quinta histona, la H1 o histona de unión, que separa los núcleos de los nucleosomas adyacentes. Esta histona presenta una secuencia menos conservada evolutivamente. A su vez, la fibra de cromatina de 30 nm sufre durante la interfase distintos grados de empaquetamiento hasta la mitosis o división celular (nivel 3), en el que este es máximo, y que permite la observación de los cromosomas por empaquetamiento de cada una de las moléculas de ADN. En este empaquetamiento, la fibra de 30 nm forma asas unidas por su base a una estructura proteica de andamiaje (scaffold, en inglés). Esta estructura está formada por proteínas no histonas como la Sc1 (idéntica a la topoisomerasa II) y la Sc2, también conocidas como condensinas. Las asas de cromatina se unen a este andamio mediante unas secuencias ricas en A y T llamadas SAR (del inglés scaffold attachment region), que se cree pueden tener un cierto papel en la replicación. Esto da lugar a una fibra de 300 nm de diámetro con un empaquetamiento total de unas 2.000 veces. Durante la mitosis se vuelve a condensar la fibra de 300 nm para constituir una fibra de 600-700 nm (o cromátida) en la que el empaquetamiento máximo final es de 10.000 veces. La cromatina, por lo tanto, está compuesta tanto por ADN como por proteínas de tipo histona y no histona, entre las cuales hay proteínas estructurales que se encargan del mantenimiento de la estructura del empaquetamiento, pero también otras relacionadas con las funciones del material genético (como la replicación y transcripción). La formación de los nucleosomas tiene una gran importancia en la expresión del genoma. A veces, es necesario que estos se muevan o que la unión ADN-histonas se afloje para que determinadas regiones de ADN queden accesibles para la compleja maquinaria de transcripción. Por ello, la interacción entre las histonas y el ADN debe ser dinámica. La estabilidad de la interacción entre el octámero de las histonas y el ADN está afectada por la acción de los llamados complejos remodeladores nucleosómicos, que provocan cambios como el deslizamiento del octámero a lo largo del ADN, la transferencia del octámero a otra molécula de ADN y el remodelado del nucleosoma para permitir un mayor acceso al ADN. Los cambios estructurales exactos de este proceso todavía no se conocen. Las modificaciones químicas que pueden sufrir las histonas cumplen un papel muy importante en este remodelado. Las histonas que forman el octámero central del nucleosoma tienen una cola aminoterminal sin estructura definida, aunque accesible dentro del cromosoma intacto, que pueden sufrir diversas modificaciones químicas. Las lisinas de estas colas pueden estar acetiladas o metiladas y las serinas pueden estar fosforiladas. Se ha propuesto que todas estas 305 modificaciones químicas constituirían un verdadero código de histonas que puede ser leído por las proteínas que participan en la expresión del material genético y en la división celular. La acetilación de las histonas está asociada con activación transcripcional, es decir, al acetilarse una lisina, disminuye la carga positiva de la histona, lo que reduce su afinidad por el ADN (cargado negativamente) y abre la cromatina; por lo tanto esto permite una más fácil transcripción (fig. 7-9). En consecuencia, los nucleosomas acetilados se asocian con regiones genómicas activas transcripcionalmente, mientras que su desacetilación está relacionada con zonas de transcripción reprimida. Con respecto a la metilación de las colas de histonas, esta se puede asociar tanto con cromatina activa como reprimida, dependiendo de dónde tenga lugar la metilación y a qué modificación dé lugar. Por último, la fosforilación de la cola aminoterminal de la histona H3 es máxima en la cromatina de los cromosomas mitóticos. FIGURA 7-9 La acetilación de histonas relaja la cromatina y facilita la transcripción, mientras que la desacetilación promueve una cromatina más compacta. (Ilustración de: I. Baraibar.) Las modificaciones químicas de las colas de histonas son dinámicas y están mediadas por enzimas específicas. Por ejemplo, las acetiltransferasas de histonas (HAT, del inglés histone acetyl transferase) catalizan la acetilación de las lisinas mientras que las desacetilasas de histonas (HDAC, del inglés histone deacetylase) tienen el efecto contrario. Hay varios tipos de HAT dependiendo de la histona o incluso de la lisina modificada. Los efectos de estas modificaciones químicas se producen a través de distintos mecanismos. En general, la acetilación y metilación reducen la carga positiva de las colas de histonas y disminuyen la afinidad de estas por la 306 cadena de ADN, de carga negativa. Además, parece que estas modificaciones químicas crean sitios de unión a otras proteínas con bromodominios y cromodominios (dominios proteicos específicos que median estas interacciones). Las proteínas con bromodominios interaccionan con las histonas acetiladas, mientras que las proteínas con cromodominios lo hacen con las colas metiladas. Ambos tipos de proteínas participan en complejos que llevan a cabo estas modificaciones químicas y en otros complejos importantes para la regulación de la transcripción (v. capítulo 8) y la formación de heterocromatina. La replicación del ADN nuclear requiere la duplicación de la propia doble hélice (que se tratará en el apartado «Replicación del ADN genómico»), así como también la síntesis acoplada de nuevas histonas y la formación con rapidez de los nucleosomas. Además, para la duplicación del ADN se requiere la desorganización parcial de estas estructuras. Esto hace que el ensamblado del nucleosoma sea un proceso dinámico, complejo y que debe llevarse a cabo de manera muy ordenada. Dada la importancia de la modificación de las histonas sobre la funcionalidad de la cromatina, es interesante tener en cuenta el destino de las histonas antiguas y las recién sintetizadas en el reensamblaje de los antiguos nucleosomas y en la formación de los nuevos. Si todas las histonas nuevas formaran parte de los nuevos nucleosomas, la duplicación del material genético borraría por completo las modificaciones químicas de los nucleosomas antiguos en una de las moléculas hijas. En realidad, podemos encontrar histonas antiguas en ambas moléculas de cromatina aunque no en una mezcla uniforme. Los tetrámeros H3-H4 y los dímeros H2A-H2B están compuestos todos por histonas nuevas o todos por histonas antiguas. Conforme pasa la horquilla replicativa, los nucleosomas se desorganizan, pero mientras los tetrámeros H3-H4 se mantienen unidos a cualquiera de las moléculas de ADN hijas, los dímeros H2A-H2B se liberan y se reparten. Esto permite la propagación de la modificación de las histonas, ya que la presencia de histonas modificadas en ambas hebras hijas permite reclutar la maquinaria enzimática que añada las modificaciones químicas necesarias en los nucleosomas adyacentes. 307 Eucromatina y heterocromatina La cromatina, como hemos visto, es la estructura visible que resulta del empaquetamiento de las moléculas de ADN junto con determinadas proteínas. Su estructura no es uniforme a lo largo de las moléculas de ADN. La observación con el microscopio óptico y el electrónico pone de manifiesto que algunas partes permanecen condensadas durante la interfase y se tiñen profundamente (heterocromatina) mientras que otras se encuentran descondensadas y no se tiñen tan fuertemente (eucromatina). La eucromatina, que se encuentra dispersa por el núcleo, es la porción mayoritaria durante la interfase, y solo se condensa durante los procesos de división celular para formar los cromosomas. Por el contrario, la heterocromatina se encuentra más frecuentemente cerca de la membrana nuclear, está altamente condensada y se tiñe fuertemente con colorantes de ADN, como el de Feulgen, durante la mayor parte de la interfase. La idea general es que los genes que se están transcribiendo de manera activa se localizan en la eucromatina, mientras que en la heterocromatina se encontraría el ADN que no se transcribe. Esta heterocromatina también se replicaría de manera más tardía. Generalmente, las secuencias que forman parte de la heterocromatina son secuencias repetitivas del genoma que se encuentran alrededor de los centrómeros (centros cinéticos de los cromosomas que veremos más adelante), las regiones subteloméricas o próximas a los extremos, los brazos cortos en los cromosomas de tipo acrocéntrico, las regiones no expresadas del cromosoma Y en varones y determinadas regiones cortas dispersas por distintos cromosomas. Existen dos tipos de heterocromatina: constitutiva y facultativa. La heterocromatina constitutiva estaría formada por aquellos segmentos de ADN que, siempre y en todos los tipos celulares, se encuentran en la forma condensada, mientras que la heterocromatina facultativa sería más variable, ya que en algunos tipos celulares formaría parte de la heterocromatina y en otros no. La cantidad de heterocromatina y eucromatina suele guardar relación con la actividad celular. Una gran cantidad de eucromatina es un rasgo morfológico que indica gran actividad transcripcional de la célula; en cambio, una célula con núcleo muy heterocromático indica que tiene poca actividad transcripcional. Esta no es una situación estática, pudiendo variar la cantidad de cada tipo de cromatina en función del estado funcional de la célula. En las células de hembras de mamíferos (con dos cromosomas X) se puede observar al microscopio una región heterocromática normalmente situada junto a la membrana nuclear, llamada corpúsculo de Barr (fig. 7-10). Esta cromatina (llamada también cromatina sexual) corresponde a una porción de uno de los cromosomas X que está inactivado por un alto grado de empaquetamiento. En los mamíferos, los cromosomas sexuales son diferentes en cuanto a su contenido génico, ya que el cromosoma X es muy grande y posee más de 1.000 genes, mientras que el Y contiene menos de 100. Para compensar la dosis génica entre machos y hembras, las células recurren a la inactivación transcripcional de uno de los cromosomas X, mediante heterocromatización del mismo. Esta inactivación tiene lugar al inicio del desarrollo embrionario (en hembras), condensándose uno de los cromosomas al azar. Es decir, en una 308 célula se puede inactivar el cromosoma X que procede del padre (Xp), mientras que en otra célula puede hacerlo el que procede de la madre (Xm). Las células que inactivaron uno de los dos cromosomas X mantienen dicho cromosoma inactivado en la descendencia (tras la división celular). Se forman así clones celulares con el cromosoma Xp inactivo (procedente de una célula inicial embrionaria donde se inactivó este cromosoma X), junto con otros clones donde se inactivó el Xm (cuya célula de origen sufrió esta inactivación) (v. fig. 7-10). En el individuo adulto coexisten ambos clones celulares, por lo que los tejidos son en realidad mosaicos con ambos grupos de células y comprenden mezclas de clones celulares en los que se ha inactivado el Xp y clones celulares en los que se ha inactivado el Xm. La heterocromatización se mantiene en las células somáticas, pero revierte en las células germinales, de tal modo que todos los ovocitos haploides contienen un cromosoma X activo. FIGURA 7-10 Inactivación del cromosoma X. A. Imagen microscópica del corpúsculo de Barr en el núcleo de una célula femenina (con dos cromosomas X). Las células con la composición cromosómica X e Y no poseen corpúsculo de Barr. Este corpúsculo es un reflejo morfológico del empaquetamiento de la cromatina que tiene lugar para reducir la dosis génica del cromosoma X. B. Durante el desarrollo embrionario se produce la condensación (reflejada en el dibujo con unos círculos unidos) al azar del cromosoma X paterno (Xp) o materno (Xm), que se mantiene en células hijas de modo clonal. (B, ilustración de: A. Calvo.) Es interesante conocer que, en individuos con genotipo X0 (con síndrome de Turner, como se verá más adelante), no se inactiva el cromosoma X remanente. En individuos XXY (con síndrome de Klinefelter) hay inactivado un 309 cromosoma X, y en individuos XXXY, se inactivan dos, de tal modo que se mantiene una dosis única del cromosoma X. El fenómeno de la inactivación del cromosoma X está implicado en la aparición de ciertas enfermedades con herencia ligada al sexo. Por ejemplo, una mutación en un gen del cromosoma X resulta en acromatopsia (daltonismo), la incapacidad de distinguir colores. La enfermedad se debe a un alelo recesivo del gen (X ). Todos los varones que d poseen esa mutación (genotipo X Y) presentan la alteración fenotípica. La mayoría de las mujeres portadoras de la d mutación (genotipo X X ) tienen visión normal, pero pueden ver las imágenes con peor resolución. Esto se debe al N d fenómeno de inactivación de cromosoma X junto al mosaicismo en los conos de la retina, donde la mitad de los conos tienen inactivado el cromosoma X con alelo normal, y la otra mitad tienen inactivado el cromosoma X con alelo mutado. Los mecanismos de inactivación no están del todo claros, pero se sabe que dependen del locus XIC (del inglés Xinactivation center), localizado en el cromosoma X. La transcripción de este locus produce un ARN llamado XIST, que no se traduce a proteína, pero gobierna de algún modo la inactivación del cromosoma a partir del cual se transcribe, aunque aproximadamente un 10% del cromosoma permanece activo, sin condensar. 310 Cromosomas Como se ha señalado en el apartado «Estructura de la cromatina en interfase», los cromosomas son la consecuencia del empaquetamiento del ADN nuclear junto con diversas proteínas en su grado de condensación máximo, en el que la fibra de cromatina de 300 nm se enrolla en espiral. Esta condensación permite su observación con el microscopio óptico en las fases del ciclo celular que tienen que ver con la división, y facilita el reparto de material genético. Cada especie eucariota posee un número característico de cromosomas (número n), consecuencia cada uno de ellos del empaquetamiento de distintas moléculas largas y lineares de ADN. No parece que haya una relación directa entre la complejidad de un organismo y su número de cromosomas. En la mayor parte de las células hay dos conjuntos (o juegos) completos de cromosomas (células diploides o con 2n cromosomas). Uno de ellos se hereda del padre y el otro de la madre a través de sus gametos que, por lo tanto, contienen uno solo de estos conjuntos y la mitad de cromosomas (células haploides o con n cromosomas). Cada cromosoma de un conjunto tiene su correspondiente en el otro conjunto (constituyendo un par homólogo) que son iguales en estructura y tamaño y que contienen los mismos genes y lugares genéticos (o loci, plural del latín locus) aunque en distintas formas denominadas alelos (con diferencias en su secuencia de nucleótidos). De esta manera poseen la información para el mismo conjunto de características hereditarias (fig. 7-11). En el caso de la especie humana tenemos 46 cromosomas (2n) y cada uno de los juegos cromosómicos está compuesto de 23 cromosomas (n). De estas parejas, 22 de ellas están formadas por cromosomas estrictamente homólogos en cuanto a tamaño, forma e información genética (son los autosomas que se numeran del 1 al 22), mientras que la pareja formada por los cromosomas sexuales X e Y, aunque se comportan como homólogos en la división celular, no tienen el mismo tamaño, forma ni contienen exactamente la misma información genética. Como se ha señalado previamente, las mujeres son el sexo homogamético (dos cromosomas X), y los varones, el heterogamético (XY). 311 FIGURA 7-11 Esquema de la estructura y partes fundamentales de los cromosomas. (Ilustración de: I. Baraibar.) El mayor grado de condensación de los cromosomas se observa en la metafase de la división celular o mitosis. En ese momento pueden observarse fácilmente al microscopio óptico los distintos cromosomas y sus diferentes partes. El cromosoma metafásico se observa tras la replicación del ADN, que ha tenido lugar en la interfase como preparación a la división celular, y que deberá repartir exactamente la misma cantidad de este en las dos células hijas (genéticamente idénticas a la célula de la que provienen). Por ello, cada molécula de ADN se ha duplicado y ambas copias se mantienen unidas por el centrómero o constricción primaria (v. fig. 7-11). Cada una de esas copias es una cromátida. Las dos cromátidas que forman un cromosoma metafásico (cromátidas hermanas; v. fig. 7-11) son, si no se han producido errores en la replicación, de secuencia idéntica y serán repartidas en las células hijas al final de la división celular. Ambas cromátidas hermanas se mantienen unidas a través de unas proteínas denominadas cohesinas. El centrómero divide a cada una de las cromátidas en dos brazos que, dependiendo de su posición, pueden ser iguales o distintos en longitud. Por convenio, cuando el cromosoma se coloca en posición vertical siempre se coloca hacia arriba el brazo pequeño (brazo p, del francés petit) y hacia abajo el brazo grande (brazo q, simplemente la siguiente letra del abecedario). Los extremos de las cromátidas se denominan telómeros. En función de la posición del centrómero, los cromosomas se clasifican en cuatro tipos básicos: metacéntricos, cuando el centrómero se localiza aproximadamente en el centro, dividiendo al cromosoma en dos brazos de la misma longitud; submetacéntricos, cuando el centrómero queda algo desplazado hacia un lado dividiendo al cromosoma en un brazo largo y otro corto; acrocéntricos, cuando el centrómero se encuentra cerca de un extremo haciendo que el brazo p sea muy pequeño; y telocéntricos, cuando el centrómero se encuentra en el extremo haciendo que el brazo p 312 sea prácticamente inexistente (no aparecen en humanos con genotipo normal). De esta manera, los distintos cromosomas pueden diferenciarse en función de su tamaño, posición del centrómero y tinción con distintas técnicas. El centrómero, o constricción primaria, es el centro cinético del cromosoma y es absolutamente esencial para que se pueda llevar a cabo el reparto o segregación de material genético durante la división. Los cromosomas que, por diversas causas, carecen de centrómero (acéntricos) no pueden unirse a las fibras del huso acromático y no pueden ser transportados hacia lo que será el futuro núcleo de las células hijas. Al final de la profase de la mitosis, a cada lado del centrómero, se une a ambas cromátidas hermanas un gran complejo proteico denominado cinetocoro. Los microtúbulos del huso se unen a ambos cinetocoros que, en la anafase, promueven que cada una de las cromátidas hermanas migren hacia polos opuestos tras la degradación de las cohesinas por modificaciones químicas, generando dos cromosomas independientes e idénticos en ambas células hijas. Los centrómeros están formados por secuencias de ADN específicas. En organismos como la levadura estas son relativamente cortas, de unos 110 pares de bases (pb), e intercambiables entre los cromosomas sin efectos evidentes. Sin embargo en los mamíferos, los centrómeros están formados por cientos de kilobases (Kb) de ADN repetitivo que, a veces, son específicos de cromosoma. Un ADN de este tipo es el ADN satélite α (v. más adelante el apartado «Complejidad del ADN humano. Tipos de secuencias en el ADN») que es una repetición en tándem de una unidad de 171 pb. Por su parte, los telómeros están formados por estructuras especializadas de ADN y proteínas. Sus funciones son variadas. Por un lado mantienen la integridad estructural del cromosoma, ya que si se pierden los cromosomas tienden a fusionarse entre sí o degradarse. Además, también ayudan a establecer la arquitectura tridimensional del núcleo y probablemente a posicionar cada cromosoma en su sitio. Finalmente, como veremos más adelante, aseguran que la replicación del ADN sea completa. Las secuencias que forman los telómeros son cadenas largas de una determinada secuencia variable entre especies, aunque relativamente bien conservada en la evolución. En humanos esta secuencia es TTAGGG, que se encuentra repetida en tándem hasta una longitud variable de entre 3 y 20 Kb, precedida por entre 100 y 300 Kb de otro tipo de repeticiones cuya función exacta se desconoce. Métodos de estudio de los cromosomas. Nomenclatura Algunas patologías humanas están relacionadas con alteraciones tanto en el número como en la estructura de los cromosomas. Del análisis a nivel cromosómico se encarga la citogenética. Los cromosomas se observan en las células en división, un estado que no puede identificarse fácilmente en las células obtenidas directamente del cuerpo humano. Actualmente, las fuentes más frecuentes de células para este tipo 313 de análisis son la médula ósea (en la que se pueden observar bastantes células en división), sangre periférica (más fácil de obtener) y, en algunos casos, fibroblastos de la piel o células del fluido amniótico o tejido coriónico. Para el análisis citogenético (fig. 7-12), es necesario cultivar las células nucleadas de estos tejidos estimuladas con fitohemaglutinina durante un determinado período de tiempo para lograr su entrada en división celular. Posteriormente, el tratamiento con colchicina disgrega las fibras del huso acromático aumentando el índice mitótico (proporción de células en mitosis), lo que incapacita a las células para abandonar la división celular. Esto hace que se acumulen en metafase. Tras el tratamiento de las suspensiones celulares con medio hipotónico y posterior fijación, por medio del microscopio óptico seremos capaces de observar los cromosomas y analizarlos realizando el cariotipo. FIGURA 7-12 Etapas para la realización de un cariotipo. Aunque ahora nos parezca sorprendente, hasta 1956 no se determinó que el número de cromosomas de la especie humana era 46. Poco más tarde se identificaron las primeras patologías relacionadas con alteraciones en ese número, como los síndromes de Down, Turner y Klinefelter. Hasta la década de los setenta del siglo pasado, los cromosomas únicamente podían ser identificados en base a su longitud y posición del centrómero. Posteriormente, la introducción de técnicas de tinción específica permitió identificar de manera inequívoca cada uno de ellos y analizar posibles alteraciones en su estructura, en lo que se conoce como técnicas de bandeo cromosómico. En estas técnicas los cromosomas se desnaturalizan o digieren enzimáticamente y posteriormente se añaden compuestos que tiñen específicamente el ADN, provocando que los cromosomas mitóticos se tiñan de bandas claras y oscuras alternativamente en distintos niveles de resolución (400, 550 y 850 bandas por juego haploide). Mediante el método de las bandas Q (de quinacrina), los cromosomas se tiñen con un colorante fluorescente que se une preferentemente a las zonas ricas en A y T. Las bandas así obtenidas son similares a las del método de bandas G (de Giemsa), el más utilizado (v. figs. 7-12 y 7-13). Con este método se somete a las preparaciones a una digestión suave con tripsina y, posteriormente, se añade Giemsa. Esta tinción puede observarse con la ayuda del microscopio óptico. Las bandas G oscuras se relacionan con regiones que se replican más tarde en la fase S y se encuentran en la cromatina más densa. Las bandas R son básicamente el reverso de las bandas G, para lo cual es necesario desnaturalizarlas mediante calor suave en solución salina antes de tratar con Giemsa. Este tratamiento desnaturaliza 314 preferentemente las zonas ricas en AT, por lo que las bandas R son claras con quinacrina. Las bandas C se obtienen al teñir con Giemsa tras una desnaturalización con hidróxido de bario y marcan básicamente la heterocromatina constitutiva, principalmente los centrómeros. Las bandas T identifican un subgrupo de bandas R concentradas en los telómeros y se obtiene tras tinción con Giemsa de cromosomas fuertemente desnaturalizados por calor. FIGURA 7-13 Cariotipo humano y grupos de cromosomas (A-G). (Imagen por cortesía del Departamento de Genética de la Universidad de Navarra.) En la actualidad, tras la fijación, se aplican cualquiera de estas técnicas de tinción (la más frecuente es la de bandas G), tras la cual los cromosomas de un núcleo se fotografían, se recortan (mediante técnicas digitales con ayuda de programas informáticos específicos) y se ordenan para obtener el cariotipo (v. figs. 7-12 y 7-13). Su análisis visual permite comprobar la integridad del número y estructura de los cromosomas. El patrón de bandas de los cromosomas se puede representar mediante un ideograma específico para cada uno de los cromosomas (fig. 7-14). En el cariotipo, los cromosomas se ordenan en parejas de cromosomas homólogos. Estos cromosomas son metafásicos, por lo que recordaremos que cada uno de ellos tiene a su vez dos cromátidas resultado de la replicación del ADN en la fase S. Generalmente, estas cromátidas se encuentran unidas y no se distinguen con el microscopio óptico. La base de los criterios internacionales para la ordenación de los cromosomas humanos (International System for Human Cytogenetic Nomenclature [ISCN]) se estableció en París en 1971 y tiene en cuenta la longitud, posición del centrómero y tinción diferencial en bandas. Los autosomas se dividen en grupos, desde el A hasta el G (v. fig. 7-13), mientras que los cromosomas sexuales forman un grupo aparte. La tinción de bandas hace que, dentro de cada uno de los brazos p y q de los cromosomas, se puedan observar alternativamente regiones claras y oscuras (v. figs. 7-13 y 7-14) que se numeran de manera consecutiva p1, p2, etc. Dentro de cada región, y dependiendo del nivel de resolución, se observan bandas numeradas como p11 (uno-uno, nunca once), p12 (uno-dos, no doce), etc., subbandas (p11.1, p11.2) y sub-subbandas (p11.21, p11.22). Para esta numeración siempre se empieza desde la posición proximal (cercana al centrómero) hacia la posición distal (hacia el telómero). 315 FIGURA 7-14 Ideogramas que muestran la tinción diferencial de bandas G de los cromosomas humanos. Según el ISCN, para la descripción de un cariotipo primero se especifica el número total de cromosomas, seguido de la composición de cromosomas sexuales y después las posibles alteraciones. Todos estos datos irán separados por comas sin espacios. Por ejemplo, el cariotipo de un varón normal sería 46,XY y el de una mujer normal, 46,XX. En los individuos mosaicos, o con dos o más constituciones cromosómicas distintas, cada una de ellas vendría separada por una barra (/). Las ganancias o pérdidas de cromosomas completos se indican con el signo + o – antes del cromosoma implicado (47,XY,+21 sería el cariotipo correspondiente a un varón con trisomía 21 o síndrome de Down). Las alteraciones estructurales presentan una descripción algo más compleja en la que debe quedar clara la región cromosómica que se encuentra implicada. Esta nomenclatura internacional permite definir con exactitud todas las alteraciones cromosómicas que pueden observarse. Además de las técnicas convencionales de análisis citogenético por tinción de bandas (citogenética convencional) en la actualidad se dispone de otras técnicas de análisis englobadas bajo el nombre de citogenética molecular, que permiten el estudio de determinadas alteraciones de manera más específica y sensible. En la citogenética molecular se combinan las técnicas clásicas de obtención y ordenación de cromosomas con la hibridación específica de ciertas zonas de estos con sondas de ADN más o menos largas. La base de todas ellas es la técnica de FISH (del inglés fluorescence in situ hybridization) en la cual la preparación de los cromosomas se seca, se desnaturaliza y posteriormente se hibrida con sondas específicas marcadas con fluorocromos (v. capítulo 3). Esta hibridación posteriormente se analiza con un microscopio de fluorescencia que, utilizando diversos filtros, es capaz de detectar en un mismo ensayo la hibridación con las sondas diferencialmente marcadas. Generalmente, la técnica se realiza sobre cromosomas en metafase (FISH en metafase) pero en algunos casos es complicado obtener células en división (p. ej., en células incluidas en parafina), por lo que también se puede realizar en interfase (FISH en interfase o sobre núcleos) (fig. 7-15). 316 FIGURA 7-15 Análisis mediante FISH de células en metafase (A) e interfase (B). En este caso se utilizaron dos sondas flanqueantes al gen PDGFRA (situado en 4q12), una marcada con un fluorocromo verde y la otra con un fluorocromo rojo. El patrón observado muestra colocalización de las señales verdes y rojas, indicando que ninguno de los alelos de este gen se encuentra fragmentado. (Imágenes por cortesía del Departamento de Genética de la Universidad de Navarra.) Una variante de la técnica de FISH se basa en el empleo de un conjunto de sondas que son específicas de un determinado cromosoma. El resultado es lo que se conoce como pintado (painting) cromosómico. La combinación de distintos fluorocromos y sondas de pintado es la base del SKY (spectral karyotyping) o cariotipo espectral en el que se pueden visualizar de distinto color los 24 cromosomas diferentes humanos. Este análisis es muy útil cuando las alteraciones son múltiples y prácticamente imposibles de caracterizar mediante el cariotipo convencional; sin embargo, se requiere un equipo complejo que hace que su coste sea elevado para los análisis de rutina. Otra variante es la CGH (del inglés comparative genomic hybridization) o hibridación genómica comparada (v. capítulo 3). En esta técnica se hibridan todos los cromosomas con el conjunto de sondas para cada uno de ellos marcadas en dos colores simultáneamente. Esto permite detectar ganancias y/o pérdidas de material a nivel genómico global y se utiliza mucho en la búsqueda de regiones cromosómicas perdidas o amplificadas en tumores o en otro tipo de enfermedades. Aberraciones cromosómicas y enfermedades humanas Muchas de las alteraciones en la estructura o el número de los cromosomas (aberraciones cromosómicas o cromosomopatías) pueden ser observadas mediante la realización de un cariotipo convencional y las técnicas de tinción de bandas. Sin embargo, este análisis requiere de personal altamente especializado y, a pesar de dar una excelente visión del estado general del genoma, no es capaz de detectar (en el mejor de los casos) alteraciones que afecten a menos de 4 Mb. Este nivel de detección ha sido considerablemente reducido con las técnicas de citogenética molecular. Las cromosomopatías pueden clasificarse en dos tipos. Las alteraciones cromosómicas constitucionales están presentes en todas las células de un organismo y han podido aparecer bien en el cigoto o en alguna fase muy temprana del desarrollo. Generalmente, son consecuencia de alteraciones presentes en alguno de los gametos o de algún error durante la fertilización. Estas alteraciones estarán presentes en la línea germinal del individuo y, por ello, 317 podrán ser transmitidas a la descendencia a través de los gametos. Por el contrario las alteraciones cromosómicas somáticas están presentes únicamente en algunos tejidos o células del individuo. Como resultado de ello, el individuo será un mosaico ya que contendrá células de constituciones genéticas distintas, aunque todas ellas derivadas de un mismo cigoto. Además, las aberraciones cromosómicas pueden ser numéricas o estructurales. Las primeras son consecuencia de una alteración en el número de cromosomas, mientras que en las segundas se observa un cambio en la estructura de alguno de ellos. Algunos ejemplos de alteraciones estructurales son duplicaciones (repeticiones de segmentos cromosómicos), deleciones (pérdida de segmentos), inversiones (cambio en la orientación), inserciones y translocaciones (o intercambio de segmentos entre cromosomas distintos). Algunas de estas alteraciones son frecuentes en distintos tipos de cáncer. Las alteraciones cromosómicas numéricas pueden ser de dos tipos. En la aneuploidía aparecen uno o más cromosomas de más o de menos, pero sin llegar al número haploide completo con respecto al número normal diploide (individuo disómico, 2n). Las aneuploidías presentan distintos grados de severidad en los fenotipos que provocan en la especie humana, siendo más graves en general cuando afectan a un autosoma que a un cromosoma sexual, y las pérdidas resultan más graves que las ganancias. La ausencia completa de un par cromosómico (nulisomía, 2n-2) es incompatible con la vida. Cuando falta uno de los dos cromosomas de un par se denomina monosomía (2n-1); cuando tenemos tres copias de un cromosoma, trisomía (2n + 1); si hay cuatro copias, tetrasomía (2n + 2), y si hay cinco, pentasomía (2n + 3), etc. En el cáncer aparecen frecuentemente células aneuploides, pero de manera constitucional solo se observan algunas de todas las posibles en humanos. Por ejemplo, solo hay tres trisomías de autosomas viables en humanos, las que afectan a los cromosomas 13, 18 y 21. La trisomía 21 (47,XX,+21 o 47,XY,+21) o síndrome de Down es la causa más frecuente de retraso mental congénito con una prevalencia de uno por cada 650 nacidos vivos y fue la primera patología descrita con causas cromosómicas en 1959. Los individuos con esta enfermedad tienen una apariencia característica: estatura baja, alteraciones cardíacas y un retraso mental variable. Los individuos mosaicos con poblaciones celulares normales son clínicamente más leves. No todos los individuos con síndrome de Down presentan trisomía 21 pura, sino que hay casos en los cuales la causa es una alteración estructural (translocación robertsoniana) que implica a los cromosomas 14 y 21. En estos casos se presenta recurrencia familiar. La trisomía 13 (47,XX,+13 o 47,XY,+13) es la causa del síndrome de Patau, con una prevalencia de uno cada 10.000 nacidos vivos, de los que el 90% fallecen en el primer año de vida. La mayoría de los afectados son varones que presentan malformaciones en múltiples órganos, polidactilia y microftalmía. La trisomía 18 (47,XX,+18 o 47,XY,+18) es la causa del síndrome de Edwards. Su prevalencia es de uno cada 6.000 nacidos vivos y afecta más frecuentemente a mujeres. De nuevo, muy pocos casos sobreviven al primer año de vida y es la cromosomopatía que suele observarse en abortos espontáneos. Los afectados también presentan malformaciones en múltiples órganos. La causa más frecuente de estas trisomías es la no disyunción (segregación) de los cromosomas en la meiosis que da lugar a los gametos. 318 Las aneuploidías que afectan a cromosomas sexuales son mejor toleradas. La monosomía X (45,X o 45,X0) o síndrome de Turner es la única monosomía viable en humanos. Los afectados son fenotípicamente mujeres, ya que carecen del cromosoma Y. Clínicamente se caracteriza por amenorrea primaria, ausencia de cambios puberales femeninos y estatura anormalmente baja. Su frecuencia es de 1 cada 5.000 niñas nacidas vivas. Este síndrome no suele asociarse a retraso mental ni parece relacionado con la edad materna. Existen individuos mosaicos 46,XX/45,X con esta enfermedad. El síndrome de Klinefelter (47,XXY) es una aneuploidía relativamente frecuente en varones (1 cada 1.000 nacidos vivos) y se caracteriza clínicamente por hipogonadismo y ginecomastia. También existen individuos mosaicos e individuos con tres o cuatro cromosomas X; en estos últimos casos el fenotipo clínico es más grave. La euploidía es el otro tipo de aberración cromosómica numérica y se produce por alteración en el número de juegos haploides. Estas alteraciones genéticas, cuando son constitucionales, son letales en la especie humana. Sin embargo pueden aparecer en células somáticas y se observan, por ejemplo, en células tumorales. Las más frecuentes serían las triploidías (3n, 69 cromosomas) y las tetraploidías (4n, 92 cromosomas). 319 Complejidad del ADN humano. Tipos de secuencias en el ADN El genoma es el conjunto de material genético de un organismo. La palabra proviene de gen, que actualmente se define como el conjunto de secuencias de ADN de todo tipo (estructurales y reguladoras) necesarias para codificar un producto génico, sea este un ARN maduro o cualquier otro tipo de proteína funcional. Así, el genoma humano es el conjunto de moléculas de ADN que se encuentran dentro de todas y cada una de las células del cuerpo humano. Todas las células poseen el mismo genoma (salvo los gametos, que tienen la mitad), pero la expresión diferencial de unos genes u otros (v. capítulo 8) hará que cada una cumpla distintas funciones dentro de un organismo. De esta manera, el genoma contiene toda la información necesaria para que el cigoto se convierta en un ser humano adulto. El genoma humano se encuentra localizado en el núcleo y, en una pequeña proporción, en las mitocondrias (v. capítulo 11). El genoma humano nuclear haploide tiene un tamaño de aproximadamente 3.200 millones de nucleótidos (megabases, Mb). En las células somáticas o diploides, la cantidad contenida en el núcleo es el doble, ya que proviene del cigoto formado por la unión de dos células (los gametos) de genomas haploides en la fecundación. La estructura de este genoma es bastante compleja (fig. 7-16) aunque una primera clasificación sencilla nos permitiría dividirlo en dos partes. Una primera parte (aproximadamente el 30%) estaría constituida por todas aquellas secuencias que forman parte de los genes y se relacionan con ellos (englobando aquí los exones, intrones, las regiones no traducidas que contienen secuencias reguladoras, etc.). Una segunda parte (70%) estaría formada por el ADN que se encuentra entre los genes, el denominado ADN extragénico, que no codificaría ninguna proteína ni contendría ningún elemento funcional. Del 30% correspondiente a genes y secuencias relacionadas, solo el 5% sería codificante (exones); esto es, solo el 1,5-2% del genoma humano codificaría proteínas. Desde esta perspectiva, la mayor parte del genoma nuclear correspondería a ADN extragénico y, en principio, no funcional. Sin embargo, los últimos resultados obtenidos por el proyecto ENCODE (ENCyclopedia Of DNA Elements) en septiembre de 2012 indican que probablemente esto no es así. Según sus resultados, la mayor parte del ADN humano se transcribiría en moléculas de ARN funcionales. Este hecho, de confirmarse, cambiaría radicalmente la visión que se tiene del genoma como una pequeña parte de secuencia codificante en una mayoría de secuencia no activa biológicamente. Estos nuevos datos indicarían que, en realidad, el genoma nuclear contendría pocas secuencias realmente sin función. 320 FIGURA 7-16 Tipos de secuencias presentes en el genoma nuclear humano. Un gen típico estaría formado por un segmento de ADN que codifica para un producto funcional. Su estructura básica consistiría en una secuencia transcrita (que codifica el producto) y en secuencias accesorias reguladoras (que harán que ese producto se sintetice en el momento y lugar preciso). La secuencia transcrita generalmente no es continua, ya que está compuesta por segmentos codificantes o exones interrumpidos por segmentos no codificantes o intrones (fig. 7-17). A pesar de que esto parece a simple vista un derroche de secuencia y un aumento innecesario de la complejidad, confiere un enorme potencial y flexibilidad al genoma eucariota, ya que un mismo gen será capaz de codificar varios productos distintos y relacionados (v. capítulo 8). Las secuencias reguladoras se encuentran flanqueando la secuencia transcrita tanto a izquierda como a derecha. Las más importantes son las secuencias promotoras, que son zonas de unión a distintos factores de transcripción (proteínas cuya unión hará que se active o desactive la expresión de un determinado gen) generales o específicos de tejido o tipo celular. Otros elementos reguladores son los potenciadores, silenciadores, etc. FIGURA 7-17 Estructura de un gen de eucariotas. (Ilustración de: I. Baraibar.) Los datos obtenidos tras la secuenciación del genoma humano indican que una de sus características es la heterogeneidad, aunque se pueden dar varios datos promedio. Frente a las primeras especulaciones que indicaban que había alrededor de 100.000 genes, actualmente este valor se estima que estaría entre 20.000 y 40.000 (sin tener en cuenta los datos del Proyecto ENCODE mencionado anteriormente). La densidad media de genes sería de uno cada 100 Kb, aunque hay una gran variabilidad, con regiones ricas en genes y regiones pobres en genes. Esto hace que en cada millón de pares de bases nos podemos encontrar una media de 10 genes. El tamaño promedio de cada gen sería de 20-30 Kb con una media de siete a ocho exones por gen, aunque también existe una gran variabilidad en ambos aspectos. El tamaño medio por exón sería de unos 150 pb, siendo el tamaño de los intrones enormemente variable. Esto nos daría un ARNm medio de entre 1,8 y 2,2 Kb, con una porción codificante de aproximadamente 1,4 Kb. El contenido del genoma humano en G + C es de aproximadamente el 41%, menor al teóricamente esperado del 50%. Esta proporción de bases no se distribuye de manera homogénea, ya que existen regiones en las cuales la densidad de G + C es mayor y en las que se concentran un mayor número de genes. Este hecho era conocido antes de la publicación de la secuencia del genoma humano y dio lugar al modelo de isocoros en la organización de los genomas eucariotas. Según este modelo, los genomas de vertebrados y plantas son en realidad mosaicos de segmentos de ADN de, al menos, 300 Kb de secuencia uniforme dentro de cada segmento pero distinta del resto de los 321 segmentos. Así, los primeros experimentos de fraccionamiento del genoma humano y centrifugación diferencial en gradientes de densidad (separación en base a su composición) permitieron comprobar la existencia de cinco isocoros o fracciones según su contenido en G + C: L1 y L2 (L, de low, o bajo contenido en G + C) y H1, H2 y H3 (H, de high, o alto contenido en G + C). Por ejemplo, el isocoro H3 ocupa la menor proporción (inferior al 10%) pero contendría hasta el 25% de todos los genes. En realidad, el modelo de isocoros es una excesiva simplificación de la estructura del genoma humano, pero ejemplifica su heterogeneidad. La perspectiva tradicional indica que la mayor parte del ADN extragénico está formado por secuencias repetitivas (repetidas muchas veces en el genoma) mientras que el ADN correspondiente a genes y secuencias relacionadas es de secuencia única o de bajo número de copias (secuencias que se encuentran repetidas en el genoma una o muy pocas veces). Entre estas últimas se encuentran las familias de genes. Las familias de genes son grupos de genes con una secuencia idéntica o similar que pueden estar agrupados en determinadas regiones cromosómicas o dispersos por todo el genoma. Estas familias parecen haberse formado debido a procesos de duplicación del material genético ancestral y posterior divergencia mediante mutación. Entre ellas, las familias génicas clásicas están formadas por copias idénticas o casi idénticas que codifican para el mismo producto y que la célula requiere en gran cantidad. Este es el caso de los genes de las histonas o de los diversos ARNr o ARNt. Las familias multigénicas, por el contrario, están formadas por copias similares (pero no idénticas) que codifican para productos relacionados que pueden tener funciones distintas o expresarse en distintas fases del desarrollo, como la familia de las globinas. Entre las distintas copias puede haber copias funcionales, fragmentos de genes, genes truncados y seudogenes. Los seudogenes son copias similares a los genes funcionales pero inactivas, generalmente por acumulación de mutaciones, y que pueden considerarse reliquias evolutivas de copias funcionales. Algunos seudogenes se transcriben, aunque no dan lugar a la proteína final. Se calcula que en el genoma humano puede haber unos 20.000 seudogenes formados a partir de la duplicación de unos 2.500 genes. Más del 50% del genoma humano está formado por ADN repetitivo. Dado que, en su mayor parte, es no codificante, tradicionalmente a esta fracción del genoma se le ha considerado ADN basura o chatarra (en inglés junk). Esta definición es probablemente errónea, dados los últimos resultados de proyectos como ENCODE. El ADN repetitivo se puede dividir en dos categorías: las repeticiones dispersas (a lo largo del genoma) y las repeticiones en tándem (seguidas una detrás de la otra) (fig. 7-18). 322 FIGURA 7-18 Esquema de los diversos tipos de secuencias repetidas en el genoma humano. (Ilustración de: I. Baraibar.) El ADN no codificante repetido en tándem se puede clasificar en función del tamaño originado por la repetición. Gran parte de este genoma (unas 250 Mb) es ADN satélite (llamado así porque al separar el ADN genómico por centrifugación en gradiente de densidad aparece como bandas «satélites» de la banda principal). Este ADN satélite está formado por la repetición miles de veces de determinadas secuencias, dando lugar a secuencias repetidas de entre 100 Kb a varias megabases. Hay varias clases de ADN satélite; por ejemplo, en el satélite 1 la secuencia repetida es de 42 nucleótidos, en el satélite 2 de diez y en el satélite 3 de cinco. Los satélites α, β y γ (con unidades repetidas de 171, 68 y 220 nucleótidos, respectivamente) son componentes importantes de los centrómeros de los cromosomas humanos. Otros dos tipos de ADN no codificante repetido en tándem son los minisatélites y los microsatélites. El ADN minisatélite está formado por secuencias de seis a 25 nucleótidos repetidas en tándem para formar unidades de entre 100 nucleótidos y 20 Kb. Un ejemplo de este tipo de ADN es el que forman los telómeros (o extremos de los cromosomas). Además, algunas de estas repeticiones son polimórficas (presentan distintos tamaños o formas en la población) y forman los marcadores VNTR (variable number of tandem repeats) utilizados en genética forense y en técnicas de identificación individual (v. capítulo 3). El ADN microsatélite, por su parte, está formado por secuencias de dos a cuatro nucleótidos que forman bloques de tamaño inferior a 150 nucleótidos. Un ejemplo son las repeticiones tipo (CA) , siendo n un número variable. De nuevo, su elevado polimorfismo y la frecuencia de este tipo de secuencias n en el genoma han hecho que sean muy utilizados en genética forense y en identificación individual como marcadores STR (short tandem repeats). El ADN no codificante repetido de manera dispersa es el resultado de la copia de una determinada secuencia en distintas partes del genoma. Esta copia puede aparecer miles de veces a lo largo del genoma y en total constituye prácticamente el 45% de todo el genoma humano. De nuevo, puede clasificarse en función del tamaño de la secuencia repetida. Entre este tipo de secuencias destacan los SINE (short interspersed nuclear elements, o elementos nucleares dispersos cortos) que son unidades de 100-500 nucleótidos, repetidas miles de veces. El principal SINE es la familia de elementos Alu específica de primates (secuencia de 250 a 280 pb con 1.500.000 copias, lo que le hace ser la secuencia más repetida del genoma humano con una copia cada 3 o 4 Kb). Estos elementos actúan como un retrotransposón, pudiendo copiarse e insertarse en otras regiones del genoma, aunque no de manera autónoma. Otras secuencias 323 repetidas dispersas son los LINE (long interspersed nuclear elements, o elementos nucleares dispersos largos) que son secuencias con un tamaño de varias Kb que pueden transponerse de manera autónoma, ya que codifican para una transcriptasa inversa y una endonucleasa. Los LINE se agrupan en distintas familias: LINE1 (L1), LINE2 y LINE3. En conjunto suponen alrededor del 20% del genoma humano aunque L1 es el más importante, con el 17% del genoma y más de 500.000 copias. Las proteínas codificadas por este elemento son utilizadas para la retrotransposición de los SINE y, además, parece que los L1 también pueden modificar la transcripción de los genes en los que se encuentran. Otros elementos repetidos dispersos son los transposones LTR y los transposones ADN. Los transposones LTR son secuencias semejantes a las de los genomas de retrovirus que se han ido integrando en el genoma humano en el curso de la evolución y que se encuentran flanqueadas por repeticiones largas directas (LTR, del inglés long terminal direct repeats) y que pueden ser elementos autónomos y no autónomos. En total hay unas 450.000 copias que ocupan algo más del 8% del genoma. Los elementos autónomos se denominan HERV (human endogenous retroviral sequences) y constituyen casi un 5% del genoma humano. Los elementos no autónomos son copias truncadas de estas secuencias. Por último, aproximadamente un 3% del genoma humano está formado por transposones ADN, con alrededor de 300.000 copias. Estos elementos son semejantes a los transposones bacterianos y consisten básicamente en una secuencia con repeticiones terminales invertidas y un segmento interno que codifica para una enzima denominada transposasa. Generalmente, el gen de la transposasa aparece mutado, por lo que muchos de los transposones presentes en el genoma humano no pueden codificar una enzima activa. Sin embargo, la transposasa codificada por algunos de ellos puede actuar sobre las copias inactivas. Este tipo de secuencias se agrupan en distintas familias entre las que destacan las MER1 y MER2 y los elementos mariner, responsables de algunas reordenaciones cromosómicas importantes en patología humana. Tanto los retrotransposones como los transposones son capaces de moverse creando copias por el genoma. Sin embargo, afortunadamente, esto sucede con una frecuencia muy baja, ya que se calcula que solo uno de cada 100-200 nacimientos nuevos lleva una inserción nueva de un elemento Alu o L1. Lógicamente, los efectos de este movimiento dependerán de la zona del genoma en la que se produzca la inserción. Los efectos patogénicos pueden deberse a la rotura de genes por su interrupción, a alteraciones en su expresión (por inserción de elementos en los elementos reguladores) o a recombinaciones ilegítimas entre segmentos repetidos. 324 Proyecto genoma humano Con la descripción de la estructura del ADN como una doble hélice, por J. D. Watson y F. H. C. Crick (1953), comienza a desarrollarse la genética molecular, que desembocaría en el desarrollo de la tecnología del ADN recombinante en la década de los setenta. Sin embargo, la obtención en el laboratorio de la secuencia (el orden y posición de los distintos nucleótidos) de un segmento de ADN (secuenciación) fue uno de los grandes retos que no se resolvió hasta 1977, año en el cual se publicaron los métodos enzimáticos (de Sanger) y químicos (de Maxam y Gilbert). La automatización de este proceso en la década de los noventa permitió obtener secuencias a gran escala que permitieron definitivamente el reto de la secuenciación de grandes genomas completos como el humano, de más de 3.000 millones de nucleótidos (el haploide). Solo 50 años más tarde de la descripción de la doble hélice, el 14 de abril de 2003, se publicó la secuencia preliminar del genoma humano, cuyos datos se hicieron de libre acceso. Este hecho ha sido considerado como el comienzo de la era genómica. Las técnicas de secuenciación habían permitido a finales de la década de los ochenta conocer la secuencia de la mayor parte de los genes humanos cuya alteración era la causa de las enfermedades monogénicas más frecuentes. Esto resultó fundamental para conocer la naturaleza molecular de estas enfermedades, diagnosticarlas y, en último término, desarrollar terapias efectivas frente a algunas de ellas. Sin embargo, este esfuerzo resultaba enorme. En muchos casos, varios grupos de investigación trabajaban simultáneamente en la caracterización de un gen que, finalmente, era publicado por solo uno de ellos. Además, los esfuerzos de la investigación en genética comenzaban a encaminarse al conocimiento de las causas de las enfermedades multifactoriales, en cuyo desarrollo intervienen tanto efectos ambientales como una combinación de distintas mutaciones o polimorfismos (variantes de secuencia con una frecuencia superior al 1% de los alelos de la población). Esto hacía que su identificación fuera muy complicada con la estrategia de análisis clásica. Esta preocupación, junto con el interés del Departamento de Energía de EE. UU. en la investigación de los efectos de la radiación sobre el genoma, cristalizó en la puesta en marcha del Proyecto Genoma Humano (PGH) en 1990. Este fue uno de los proyectos más ambiciosos de investigación en biomedicina de colaboración internacional llevados a cabo hasta entonces. Su objetivo era, en último término, conocer la secuencia del genoma nuclear humano en 15 años. La secuencia del genoma humano mitocondrial (ADNmt, v. capítulo 11) se conocía desde 1981. La obtención de la secuencia del genoma nuclear no era un trabajo sencillo en aquel momento, ya que la tecnología existente no permitía obtener más que los datos de unos pocos cientos de nucleótidos al día a un investigador experimentado. Sin embargo, se alcanzó antes de lo esperado, debido al desarrollo de tecnologías de secuenciación automática y a la competencia en EE. UU. de la empresa privada Celera Genomics. Para conseguir tal información era necesario cumplir previamente varios objetivos parciales, que posteriormente (conforme avanzó el Proyecto) serían revisados. Así, en el desarrollo del PGH se pueden establecer dos fases. La primera, llevada a cabo hasta 1998, se centró en la construcción de distintos tipos de mapas del genoma. Esto es, en la construcción de diferentes «bocetos» por medio de distintas herramientas, que permitieran posteriormente localizar 325 en el genoma la posición de los distintos fragmentos de secuencia que se iban a ir obteniendo para reconstruir la secuencia global como si fuera un puzle. Las reacciones de secuenciación llevadas a cabo en el laboratorio permitían obtener fragmentos de secuencia inferiores a 1.000 nucleótidos, por lo que era necesario empalmar cientos y miles de ellos para reconstruir los distintos cromosomas y, finalmente, el genoma nuclear completo. Durante la segunda fase, llevada a cabo desde 1998, se realizó la secuenciación propiamente dicha. Para entonces, la tecnología se había desarrollado lo suficiente como para afrontar este reto con garantías. De manera simultánea, el PGH desarrolló proyectos de secuenciación de los genomas de otros organismos modelo. Esto se realizó con dos objetivos fundamentales. En primer lugar se necesitaba comprobar que las estrategias experimentales funcionaban con genomas más pequeños. Pero más importante y a más largo plazo, la secuencia obtenida de los genomas de estos organismos permitiría conocer la función de una gran cantidad de secuencias que fueran homólogas en nuestro genoma. Uno de los aspectos más importantes del PGH fue el programa Ethical, Legal and Social Implications (ELSI), al que se dedicó una parte importante del presupuesto inicial. Desde un primer momento quedaron patentes las consecuencias que la información obtenida por este proyecto iba a tener en las vidas de todos. Cuestiones como el diagnóstico de enfermedades que no tienen tratamiento, la posible generalización de una mentalidad eugenésica de discriminación por razones genéticas, el diagnóstico prenatal de alteraciones genéticas que confieran predisposición al desarrollo de enfermedades en la edad adulta, la confidencialidad de los datos genéticos y su posible uso con fines laborales, de inmigración o simplemente de seguros médicos, son y serán temas frecuentes de debate en la sociedad, con importantes implicaciones en nuestras vidas. Otros objetivos importantes planteados en el transcurso del PGH fueron el desarrollo de la bioinformática, la enseñanza y entrenamiento en genómica, la distribución inmediata y gratuita de los datos que se fueran obteniendo (prácticamente a tiempo real a través de Internet), el estudio de la variación del genoma humano (a través de proyectos anejos como el Proyecto Diversidad del Genoma Humano o el Proyecto HapMap o de mapas de haplotipos) y, sobre todo, el desarrollo de la genómica funcional para la identificación de todos los genes y para determinar la función de cada uno de ellos. Este último objetivo es uno de los grandes retos de la investigación biomédica de este siglo. El desarrollo de las herramientas bioinformáticas para la recolección, distribución y análisis de los datos obtenidos fue (y sigue siendo), junto con el desarrollo de las tecnologías de secuenciación automática a gran escala, fundamental para el PGH. La comunicación entre los distintos centros implicados en el proyecto y el resto de investigadores es básicamente electrónica, a través de Internet. Para ello, fue necesaria la creación de grandes bases de datos que pudieran recolectar los resultados de los distintos centros y distribuirlos en tiempo real; pero también era necesario el desarrollo de programas informáticos que fueran capaces de analizar tal cantidad y complejidad de datos. 326 El PGH ha sido un proyecto de investigación de cooperación internacional, a pesar de que en un primer momento fue impulsado desde el Departamento de Energía de EE. UU., que en 1986 lideró la Iniciativa del Genoma Humano. En 1988 se unieron a esta iniciativa los National Institutes of Health (NIH) de EE. UU. para crear la Office for Human Genome Research y más tarde el National Human Genome Research Institute (NHGRI). De manera casi simultánea, Reino Unido y Francia comenzaron a desarrollar sus propios proyectos Genoma, que fueron seguidos rápidamente por Alemania y Japón. Para coordinar la labor de todos los centros implicados se creó la Human Genome Organization (HUGO). Finalmente, el International Human Genome Sequencing Consortium quedó integrado por 20 centros. Doce de estos centros estaban situados en EE. UU., tres en Alemania, dos en Japón y uno en el Reino Unido, Francia y China. En total, EE. UU. obtuvo casi la mitad de la secuencia, un tercio se obtuvo en el Reino Unido en un solo centro (el Wellcome Trust Sanger Institute), mientras que en Japón se obtuvo un 10%. Francia, Alemania y China contribuyeron con el 2,5, el 1,5 y el 1%, respectivamente. 327 Replicación del ADN genómico La replicación, o copia del material genético, en una célula eucariota se lleva a cabo durante la interfase, período comprendido entre dos divisiones celulares consecutivas. La interfase se subdivide a su vez en tres fases, G1 (gap 1), S (síntesis) y G2 (gap 2). Durante las tres hay una intensa actividad metabólica, pero es en la fase S donde tiene lugar la duplicación de los componentes celulares, incluida la cromatina. Hacia el final de la fase G2, el volumen celular prácticamente se multiplica por dos y la célula es capaz de entrar en división. El ciclo celular y su control se explican en detalle en el capítulo 14. Una vez duplicado, el nuevo ADN formado debe ser capaz de empaquetarse en los distintos niveles señalados anteriormente. Por ello, la replicación debe ser un proceso íntimamente ligado a la síntesis de las histonas, cuyo número prácticamente se duplica en poco tiempo. Durante la replicación, el empaquetamiento de la molécula que está siendo copiada se altera muy poco, ya que únicamente quedan afectados de manera simultánea unos pocos nucleosomas y el reensamblaje de la cromatina se produce prácticamente de manera simultánea a la copia. Además, es importante mantener la memoria acerca del estado funcional de las distintas partes de la cromatina, como las modificaciones químicas de las histonas que se han señalado anteriormente. El proceso de replicación es esencial desde el punto de vista biológico y debe realizarse con precisión (para conservar la información genética transmitida entre células y organismos), pero también con una cierta permisividad (que permita su variación y la creación de formas nuevas para que actúe la evolución). En la especie humana, donde el genoma nuclear haploide tiene unos 3.000 millones de nucleótidos, un error de 1 entre un millón provocaría que en cada ciclo de replicación surgieran 3.000 errores, algo inaceptable. La replicación del ADN, como otros procesos en los cuales están implicados los ácidos nucleicos, está íntimamente ligada a la complementariedad de las bases nitrogenadas. En este sentido, en la publicación donde se proponía el modelo de la doble hélice para la estructura del ADN, Watson y Crick ya lo sugirieron: «[…] No se nos escapa que el emparejamiento específico que postulamos sugiere por sí mismo un posible mecanismo de copia para el material genético…» . 1 En 1958 Mathew Meselson y Franklin Stahl propusieron el modelo de replicación semiconservativa en procariotas, que se comprobó que era universal y aplicable también a eucariotas. Este modelo llevó a desechar los modelos de replicación conservativa y dispersiva y consistía básicamente en que, conforme la doble hélice se desenrollaba (como si fuera una cremallera), cada nucleótido a lo largo de las dos hebras tendría afinidad por su nucleótido complementario. Si a lo largo de las dos hebras los nucleótidos se unieran covalentemente entre sí, el resultado sería la producción de dos dobles cadenas idénticas. Cada una de ellas estaría formada por una hebra vieja y otra de nueva síntesis. En el modelo conservativo la réplica sería semejante pero, al final, una de las dobles hélices estaría formada por la reasociación de las dos hebras viejas y la otra por la asociación de las dos hebras nuevas. El modelo dispersivo 328 es más complicado y supondría que cada una de las hebras estaría formada por segmentos nuevos y viejos, lo que implicaría su corte en algunas de las etapas del proceso (fig. 7-19). FIGURA 7-19 Modelos de replicación del ADN. Se ha demostrado que el modelo correcto es el de replicación semiconservativa. (Ilustración de: I. Baraibar.) La replicación debe empezar en determinados puntos u orígenes de replicación. En el caso de procariotas y en genomas circulares hay uno o muy pocos orígenes de este tipo. Sin embargo, en organismos más complejos y con genomas muy grandes y fragmentados en múltiples segmentos (como los eucariotas), los orígenes de replicación deben ser cientos o miles para que el proceso tenga lugar en un período de tiempo razonable. La replicación comienza en cada uno de estos orígenes aunque no de manera simultánea. En cada origen de replicación se forma lo que se conoce como burbuja de replicación. Unas enzimas helicasas se encargan de abrir la doble hélice y permiten la unión de las ADN polimerasas en un proceso muy regulado (ya que cada origen solo puede servir como tal una vez por cada ciclo de replicación) por complejos proteicos como el ORC (origin recognition complex). La apertura de la doble hélice y la formación de la burbuja de replicación hacen que, en los genomas circulares (procariotas), se genere una tensión en ambos extremos de esta por superenrollamiento. Las topoisomerasas de ADN se encargan de relajar esta tensión. Por cada burbuja de replicación van a formarse dos horquillas de replicación, una a cada lado, que se irán abriendo en direcciones contrarias y en las cuales se producen los mismos hechos, por lo que solo nos fijaremos en lo que ocurre en uno de los lados. Las burbujas de replicación son estructuras estabilizadas por diversas proteínas de unión a ADN monocatenario (SSBP, del inglés single-stranded binding proteins), como la RPA (replication protein A). Posteriormente se produce la unión (en cada horquilla o lado) de una primasa o ARN polimerasa ADN dependiente, que sintetiza un pequeño fragmento de ARN complementario a la secuencia de ese punto de inicio y que servirá de cebador (primer) necesario para la acción de la ADN polimerasa. Existen varios tipos de ADN polimerasas tanto en procariotas como en eucariotas, cada una de ellas con distintas funciones, pero en general todas ellas presentan una actividad 3’ → 5’exonucleasa que permite la corrección de los errores del proceso. Ninguna de las ADN polimerasas de procariotas o eucariotas son capaces de comenzar la síntesis de novo de una cadena de ADN, sino que solo son capaces de elongar cadenas de ácido nucleico (en este caso son capaces de elongar en forma de ADN el pequeño fragmento de ARN 329 sintetizado por la primasa). El cebador tiene entre 5 y 15 nucleótidos de longitud en procariotas. En eucariotas la actividad primasa se encuentra en una de las subunidades de la ADN polimerasa α, que sintetizará un ADN iniciador compuesto por unos 10 nucleótidos de ARN y un fragmento de ADN de unos 20 a 30 nucleótidos. La reacción propia de síntesis o elongación de la cadena de cebador tiene lugar siempre en dirección 5’ a 3’; esto es, el nuevo desoxinucleótido se añade al extremo 3’ de la hebra en crecimiento (donde radica el grupo OH libre del anterior) por el grupo fosfato unido a su carbono en 5’. De esta manera se forma un enlace fosfodiéster con liberación de dos grupos fosfato del desoxinucleótido (dNTP). Ambas hebras son copiadas de manera simultánea en cada uno de los lados de la burbuja de replicación. Sin embargo, debemos recordar en este punto la naturaleza antiparalela de ambas. Así, la hebra que se encuentra en a→hebra 5’seráconductora, cop iad a en líder d irección o guía 5’→ (leading 3’. Esta dirección 3’ strand) y su síntesis se realiza de manera continua. Sin embargo, la otra hebra molde se encuentra en sentido 5’ por lo que debería ser copiada en dirección 3’ →3 → ión,5’por . Laslopolim que, para erasaslano s síntesis de la hebra complementaria a esta, se sintetizan varios cebadores a pequeñas distancias que se elongan cada uno de ellos en dirección 5’ → 3’. Esto resu lta en semidiscontinua en dirección u na síntesis 3’ → 5’d e es denominada hebra retrasada (lagging strand). Los fragmentos resultantes de la síntesis semidiscontinua de la hebra retrasada se denominan fragmentos de Okazaki y son de menor tamaño en eucariotas (100-150 nucleótidos) que en procariotas (1.000-2.000 nucleótidos). Cada hebra líder necesita un solo cebador, pero en la hebra retrasada se requiere un cebador nuevo por cada fragmento de Okazaki. Esto supone un total de cientos o miles en el caso de eucariotas, ya que una horquilla de replicación puede participar en la replicación de millones de pares de bases. Todo el proceso en procariotas queda esquematizado en la figura 7-20. FIGURA 7-20 Proceso de replicación en procariotas. Para simplificar el esquema (por mayor claridad), se han dibujado separadas las ADN polimerasas III que van replicando tanto la hebra conductora como la retrasada. En realidad, las dos unidades de ADN polimerasa III están interconectadas entre sí (formando una estructura dimérica), por lo que actúan juntas en el proceso de replicación del ADN. (Ilustración de: I. Baraibar.) 330 El avance de la horquilla de replicación es en una única dirección, por lo que se propone que, para la síntesis continua y semidiscontinua de ambas hebras de manera simultánea, es necesaria la formación de un bucle de esta última sobre el complejo enzimático encargado de la síntesis. La síntesis principal de ambas hebras la realiza la ADN polimerasa III en el caso de procariotas y la ADN polimerasa δ en el caso de eucariotas. Una vez finalizada esta, deben eliminarse los segmentos de ARN de los cebadores, rellenar los huecos dejados (por la ADN polimerasa I en procariotas y la ADN polimerasa δ en eucariotas) y unir los diversos fragmentos entre sí por medio de ADN ligasa. El hecho de que para iniciar toda síntesis de ADN sea necesario un cebador de ARN crea un problema importante en la replicación de los extremos de las moléculas de ADN lineales, como el caso de nuestros cromosomas, a diferencia de lo que ocurre en el material genético de procariotas y algunos virus (fig. 7-21). Una vez eliminado el cebador de ARN situado en el extremo 5’ de la cadena retrasada surge un problema importante. De manera normal, el hueco generado sería rellenado por una ADN polimerasa que añadiría un nuevo nucleótido al OH terminal en 3’. Sin embargo, en el extremo del cromosoma no existe esa posibilidad. Esto supone que, en cada ronda de replicación, cada cromosoma o cadena lineal de ADN se acortaría en una longitud igual a la del cebador de ARN, lo que sería letal en las células que se dividen un gran número de veces. FIGURA 7-21 El problema de la replicación en los extremos. (Ilustración de: I. Baraibar.) Para evitar esta situación, los extremos de los cromosomas eucariotas (los telómeros) presentan una estructura especial. Los telómeros están formados por la repetición múltiple de una pequeña secuencia en los extremos 3’ de una de las hebras de la doble hélice que hace que esta sea algo más larga que la hebra antiparalela. En humanos, esta repetición es del hexanucleótido 5’-TTAGGG-3’. La telomerasa es la enzima encargada de mantener estas repeticiones, y su actividad permite evitar el proceso de acortamiento progresivo de los extremos de los cromosomas. Esta enzima es una ribonucleoproteína en cuya estructura molecular hay un pequeño fragmento de ARN que sirve de guía y molde para la síntesis de estas repeticiones. Las secuencias de los telómeros están bastante conservadas en la evolución, lo que refleja una función muy crítica. De hecho, el acortamiento de los telómeros se ha asociado con los procesos de envejecimiento celular. En la mayoría de las células somáticas, la telomerasa presenta una actividad muy baja o inexistente, haciendo que en cada división 331 celular los cromosomas se acorten, hasta llegar a un límite a partir del cual la célula pierde su capacidad de división. Esto hace que el acortamiento de los cromosomas sea similar a un reloj biológico que controla el número de divisiones hasta que acontece la muerte celular. Se ha observado que en determinadas células neoplásicas la actividad telomerasa es mayor, lo que haría posible su inmortalización. Esto abre esperanzas para pensar en esta enzima como una posible diana terapéutica antitumoral o frente a procesos de envejecimiento. 332 Estabilidad y reordenamiento del ADN genómico Normalmente, se tiene la visión del genoma como algo estático; no en vano tiene que servir de nexo de unión entre descendientes y progenitores. Sin embargo, la molécula de ADN es una molécula química muy flexible que permite la existencia de variación en los distintos nucleótidos. Estos cambios pueden suceder de manera lenta, base de la evolución y de la generación de nuevas especies, pero también pueden suceder de manera rápida dentro incluso de la vida de un organismo. Algunos de los cambios que puede sufrir el genoma ocurren a nivel de un único nucleótido, en lo que se conoce como mutaciones puntuales. Estos cambios no tienen por qué ser perjudiciales, dependiendo del nucleótido que esté afectado. De hecho, se calcula que en el genoma humano hay un cambio de este tipo cada 500-1.000 nucleótidos, dando lugar a los denominados SNP (single nucleotide polymorphism, o polimorfismos de un solo nucléotido). Sin embargo, otros son el resultado de mecanismos que afectan a segmentos importantes. Uno de estos mecanismos es la duplicación de ciertas regiones del genoma. Este mecanismo es muy importante desde el punto de vista evolutivo, ya que las nuevas copias pueden evolucionar como genes nuevos que posean funciones diversas, como propuso Susumo Ohno en 1971. Este puede ser el caso de los genes de las globinas. En el genoma existen también elementos genéticos transponibles o transposones (v. el apartado «Complejidad del ADN humano. Tipos de secuencias en el ADN»), que son segmentos que pueden moverse por el genoma insertándose en diversas posiciones de uno o varios cromosomas distintos. A pesar de que fueron descritos hace más de 50 años, su naturaleza tardó en ser aceptada por la comunidad científica. Este tipo de segmentos existen en múltiples organismos, desde bacterias hasta humanos (en los que, como hemos visto en el apartado ya mencionado anteriormente hay millones de copias y ocupan una parte importante del genoma). Algunas de estas copias han mutado a lo largo de la evolución, de tal manera que han perdido la capacidad de moverse, pero otras no. Su movimiento a lo largo del genoma puede interrumpir genes y generar daños en los cromosomas por roturas de la doble cadena, causando alteraciones variables. Se han descrito casos de hemofilia causados por la inserción de transposones en genes codificantes de proteínas relacionadas con la coagulación, y se calcula que una de cada 500 mutaciones causantes de enfermedad puede ser consecuencia de la inserción de algún elemento transponible. Estos transposones pueden moverse tanto por escisión de su lugar original y posterior inserción en otro lugar del genoma (en un mecanismo de «corte e inserción») como, en el caso de los retrotransposones, mediante la creación de una copia a ARN intermediario que, tras su nueva copia a ADN (por una retrotranscriptasa o transcriptasa reversa), se insertará en el genoma (en un mecanismo de «copia e inserción»). Hay diversas opiniones sobre el papel real de los elementos transponibles en el genoma, dada su frecuencia. Algunos investigadores los consideran simples parásitos genéticos sin una función beneficiosa, cuya única misión sería replicarse y propagarse, formando parte de lo que se conoce como ADN «basura». Sin embargo, otras opiniones 333 les atribuyen un importante papel evolutivo que puede estar implicado en la formación de nuevos genes, la especiación e incluso en la defensa frente a enfermedades infecciosas. 334 Recombinación homóloga Como se verá en el capítulo 15, durante la meiosis se produce un intercambio de material genético entre los diferentes cromosomas homólogos. Este proceso es muy importante, ya que hace que cada uno de los organismos originados por medio de la reproducción sexual sea genéticamente único, al tener una combinación de alelos difícilmente repetible. Cada uno de los nuevos cromosomas que se originan en la meiosis es una combinación de material genético del cromosoma paterno y del cromosoma materno de la célula originaria, como consecuencia del intercambio de segmentos de ADN entre regiones homólogas o recombinación homóloga. El primer paso para que se pueda producir este intercambio será la alineación de ambas moléculas en sus regiones homólogas. Estas regiones corresponden a los mismos genes y loci, aunque su secuencia no es absolutamente idéntica (existen diversos alelos o formas en la población). Esta alineación es facilitada por la formación del complejo sinaptonémico (una estructura proteica) que mantiene unidos los cromosomas homólogos desde la profase I de la meiosis. Los primeros modelos que explicaban este intercambio de material genético desde el punto de vista molecular surgieron entre 1960 y 1970 y proponían que las dos dobles hélices alineadas (correspondientes cada una de ellas a una de las cromátidas de ambos cromosomas homólogos) sufrían un corte en la misma posición en una de las dos hebras que componen cada una. Ambas hebras de ADN podían entonces intercambiarse libremente y fusionarse con su homóloga (fig. 7-22) dando lugar a una estructura entrecruzada. La migración hacia cualquiera de los lados de este entrecruzamiento formaría moléculas heterodúplex o híbridas (que no emparejan completamente, dado que ambas moléculas no presentan una secuencia totalmente idéntica). Esto origina una estructura cruciforme dinámica o estructura de Holliday (por ser el primero que la propuso) cuya rotación y posterior corte dará lugar a la existencia o no de recombinación o intercambio real de parte de las cromátidas parentales, en función de en qué dirección se produzca este corte. Así, se puede producir el intercambio de un segmento de una única hebra (entrecruzamiento sin recombinación) o el intercambio de un segmento completo de la molécula bicatenaria (entrecruzamiento con recombinación). 335 FIGURA 7-22 Modelo de Holliday y Whitehouse de recombinación homóloga. En la figura se muestran dos moléculas homólogas. Las cadenas antiparalelas están indicadas por letras mayúsculas y minúsculas. (a) A, a, B y b son distintos alelos para los genes A y B. (b) En cada una de las dobles hélices se rompe una de las hebras y esta invade la otra doble hélice (c). En (d) y (e) se observa la formación de enlaces covalentes entrecruzando las dos moléculas hasta desplazarse el punto de intersección (f). En (g), (h) e (i) se muestra la rotación de un segmento de las dos dobles hélices entrecruzadas hasta los segundos cortes alternativos (j-l, arriba o abajo). (Ilustración de: I. Baraibar.) Sin embargo, es bastante improbable que para iniciar este proceso ambas moléculas homólogas de ADN sufran un corte en exactamente la misma posición. Así, Meselson y Radding propusieron otro modelo de generación de las moléculas heterodúplex por el cual sería suficiente que solo una de las dos hebras sufriera este corte. El extremo libre generado podría ser capaz de invadir la molécula homóloga, dando lugar a la estructura de Holliday. Actualmente, diversos estudios han mostrado que, en realidad, la recombinación se inicia mediante la aparición de una rotura completa de una de las dos dobles hélices homólogas con generación de una rotura bicatenaria (DSB, del inglés double-strand break). Este modelo además explicaría el fenómeno de conversión génica observado en hongos, levaduras y otros eucariotas, y por el cual uno de los alelos parece que se convierte en otro tras la recombinación meiótica. Se ha comprobado cómo este tipo de roturas se producen de manera más o menos frecuente en la célula, pero en la meiosis su tasa de aparición es entre 100 y 1.000 veces superior. De acuerdo a esto, la recombinación se iniciaría no con un corte en una de las dos cadenas polinucleótidas de una de las dos dobles hélices implicadas, sino con un corte completo de una de las dos moléculas de ADN implicadas. Posteriormente se produciría un acortamiento de una de las dos cadenas polinucleótidas en ambos trozos dando lugar a extremos protuberantes en 3’. Una de esas cadenas sería entonces capaz de invadir la molécula de ADN homóloga de manera semejante al modelo de Meselson-Radding, emparejándose con la cadena complementaria antiparalela y se extendería (utilizando la anterior como molde) por medio de una ADN polimerasa (fig. 7-23). Esto formaría una estructura semejante a la propuesta por Holliday, cuyo entrecruzamiento iría migrando conforme se produjera esta síntesis. La otra molécula con extremos protuberantes también sufre esta síntesis, tomando como molde la cadena polinucleótida desplazada por la anterior. 336 FIGURA 7-23 Modelo de recombinación homóloga a través de la creación de roturas bicatenarias. (Ilustración de: I. Baraibar.) Es importante tener en cuenta que, en este modelo, la extensión de las cadenas polinucleótidas de la molécula rota que ha iniciado el proceso se realiza tomando como molde las regiones equivalentes de la doble cadena no cortada. Así, los segmentos de las cadenas polinucleótidas eliminadas tras el corte para la generación de los extremos 3’ protuberantes han sido sustituidos por copias de la molécula de ADN homóloga no cortada, explicando el proceso de conversión génica. Tras la ligación de las cadenas polinucleótidas rotas, el resultado es la formación de dos estructuras de Holliday cuya resolución conjunta tendrá diversas consecuencias. Si ambas estructuras se resuelven en el mismo plano, no se producirá recombinación o intercambio de segmentos completos de las dobles hélices. Sin embargo, si se resuelven en planos distintos, el resultado será la aparición de moléculas de ADN en las cuales existe un fragmento completo de la molécula homóloga, esto es, recombinación. 337 Mutación y reparación del ADN genómico Tradicionalmente se considera a una mutación como un cambio de la secuencia de nucleótidos en una región determinada del genoma (mutaciones génicas), aunque también las aberraciones cromosómicas pueden considerarse mutaciones cromosómicas. En realidad, la mutación es un fallo en la fidelidad del almacenamiento de la información, ya que hay un cambio de la información guardada. La mutación puede ocurrir de manera espontánea o inducida por diversos factores externos y puede transmitirse a la descendencia o no, dependiendo del momento del desarrollo y el tipo celular que la sufra. Aunque la mutación se asocia rápidamente a algo perjudicial (a enfermedad) es la base de la evolución y de la variabilidad interindividual. Además, gran parte de nuestro conocimiento acerca de la función de determinados productos génicos se ha conseguido a través de la existencia de mutaciones. Sabemos qué hacen porque vemos lo que falta o está alterado cuando esos genes están mutados. Si la mutación tiene un efecto pernicioso tenderá a eliminarse de la población mediante la selección natural a lo largo de sucesivas generaciones. Si tiene un efecto ventajoso, podrá alcanzar una frecuencia del 100% en la población (se podrá fijar). Si es neutra, su permanencia en la población será un proceso de puro azar. Cuando una mutación neutral alcanza una frecuencia mayor al 1% del conjunto de alelos presentes en la población, se habla de polimorfismo. Esto indica que en la población habría múltiples formas (alelos) de ese gen. Existen varias clasificaciones de las mutaciones dependiendo de sus efectos sobre la secuencia de ADN, sobre el gen de manera global, sobre las células a las que afecta, sobre el fenotipo del organismo y, finalmente, también se pueden clasificar según su origen. Así, teniendo en cuenta la secuencia de ADN, las mutaciones pueden ser sustituciones o cambios de un nucleótido por otro (denominándose transiciones cuando el cambio es de una purina por purina o pirimidina por pirimidina, o transversiones cuando el cambio es de purina por pirimidina o viceversa), inserciones de uno o varios nucleótidos, deleciones de uno o varios nucleótidos o inversiones, cuando un determinado fragmento cambia 180° de orientación. Teniendo en cuenta los efectos sobre el gen (o sobre la proteína que codifica), las mutaciones pueden ser silenciosas o sinónimas (sense, en inglés), cuando no provocan cambios en el aminoácido codificado, con cambio de sentido (missense, en inglés), cuando sí provocan un cambio en el aminoácido codificado (que podría ser conservadora o no dependiendo de si el aminoácido sustituido tiene propiedades fisicoquímicas semejantes o no) o sin sentido (nonsense, en inglés), cuando dan lugar a un codón de parada que provoca la terminación prematura de la traducción dando lugar a una proteína truncada. Este último efecto también puede ser el inverso si la mutación convierte un codón de parada en un codón codificante que provocaría la terminación retrasada de la traducción. Por último, las inserciones y deleciones pueden desencadenar mutaciones con cambio de fase (frameshift, en inglés), en las cuales se produce un corrimiento del marco de lectura. Según las células a las que afecta, las mutaciones pueden ser somáticas o germinales. Las mutaciones somáticas afectan a determinadas células de un organismo, por lo que, salvo que estas den lugar a los gametos, no se transmiten 338 a los descendientes (no son heredables). Sin embargo, sí poseerán la mutación las células que provienen de ellas por mitosis. Cuanto más precozmente se produzca la mutación en el desarrollo, mayor será el número de células del organismo que tendrá ese cambio. Por el contrario, las mutaciones germinales (o de la línea germinal) se producen en células que producirán gametos. Esto hará que estas mutaciones sí puedan transmitirse a la descendencia, dando lugar a organismos que tendrán dicha mutación en todas sus células. Teniendo en cuenta los efectos fenotípicos sobre el organismo, tendremos que las mutaciones letales son aquellas que provocan la muerte prematura del organismo y las mutaciones condicionales son aquellas cuyos efectos únicamente pueden observarse en ciertas condiciones. Por otro lado, las mutaciones con pérdida de función producen la ausencia completa o parcial de la función normal del producto del gen, mientras que las mutaciones con ganancia de función dan lugar a una activación constitutiva de la proteína, a la aparición de características nuevas o a la funcionalidad del producto génico en tejidos y momentos inadecuados. Las mutaciones se deben a factores internos del propio organismo o a causas externas. Las mutaciones espontáneas surgen de manera natural sin que haya factores físico-químicos que las condicionen, mientras que las mutaciones inducidas son causadas por factores físicos o químicos externos. Así, existen tres causas principales de la aparición de las mutaciones. Por un lado, durante la replicación se pueden incorporar a la cadena naciente nucleótidos erróneos. En principio, las polimerasas tienen capacidad correctora y estos errores se presentan en frecuencias bajas, entre 10 a 10 –9 –11 mutaciones por nucleótido incorporado en cada división celular en el hombre. Por otro lado, existen multitud de compuestos químicos y algunos agentes físicos (como las radiaciones) que son capaces de aumentar considerablemente la frecuencia de aparición de estos cambios. Para mantener en la medida de lo posible la integridad y fidelidad en la transmisión de información existen diversos sistemas de reparación que minimizan estos cambios. Podemos diferenciar distintas vías de reparación del ADN que comparten ciertas características. Por un lado, la mayoría de ellas necesitan la presencia de las dos cadenas de nucleótidos, ya que el reemplazamiento de uno de ellos requiere una cadena molde que indique la secuencia correcta. Además, estas vías son, en muchos casos, redundantes. Esto significa que algunos de los daños que puede sufrir el ADN pueden ser corregidos por más de una vía, lo que asegura su reparación final. Además de las distintas vías de reparación, existen también sistemas de detoxificación que se encargan de eliminar moléculas que pueden dañar el ADN, antes de que esto ocurra. Los sistemas más simples de reparación son los que se encargan de revertir directamente la lesión, como ciertas enzimas desmetilantes como la O -alquilguanina alquitransferasa (metilguanina metiltransferasa, MGMT) o ciertas 6 fotoliasas de procariotas y algunos eucariotas, que se encargan de reparar los dímeros de pirimidina formados por la luz ultravioleta. Las vías más complejas se clasifican en tres tipos principales: 339 1. Las que se encargan de reparar desemparejamientos entre nucleótidos (reparación de bases desapareadas o mismatch repair). 2. Las que lo hacen a través de una escisión de bases nitrogenadas (BER, del inglés base escision repair) o escisión de nucleótidos (NER, del inglés nucleotide escision repair). 3. Las que reparan roturas bicatenarias o DSB. Los desemparejamientos entre nucleótidos se pueden originar por varios mecanismos, como la tautomería de las bases nitrogenadas (en la cual la forma infrecuente imina de la C empareja con la A, o la forma infrecuente enol de la T empareja con la G), los errores inherentes a la actividad polimerasa, las mutaciones de inserción o deleción por deslizamiento de cadena o la desaminación espontánea (p. ej., las citosinas metiladas en las islas CpG se desaminan a timina). Estas alteraciones se corrigen por la vía de reparación de bases desapareadas, formada por varias proteínas que reconocen la formación de los bucles originados en la molécula y que cortan la sección distorsionada de la cadena recién sintetizada. Actúan facilitando su rellenado con nucleótidos nuevos que son añadidos por una polimerasa que utiliza la cadena original como molde. Para ello, es importante que el sistema reconozca de manera efectiva cuál es la cadena vieja correcta y cuál es la nueva donde se ha producido el error. En E. coli esto se realiza mediante el retardo en la metilación de secuencias específicas tras la síntesis. La cadena vieja estará metilada mientras que la nueva no. La presencia de bases nitrogenadas anormales, consecuencia generalmente de agentes mutágenos y radiaciones, es reparada básicamente a través de las reparaciones por escisión de bases y por escisión de nucleótidos. La reparación por escisión de bases (fig. 7-24) es un proceso de corrección de los daños sufridos en las bases nitrogenadas por agentes químicos que las alteran, o porque han sido hidrolizadas (se calcula que el genoma humano sufre una hidrólisis lenta de unas 10.000 purinas al día que generan los denominados «sitios apurínicos»). En este sistema primero hay un reconocimiento de la base alterada por ADN-glucosilasa específicas a los distintos tipos de daño. Esto crea sitios AP (apurínicos o apirimidínicos) en los que actúa una AP endonucleasa, que elimina el azúcar dañado creando una distorsión estructural. Posteriormente el hueco es rellenado por una ADN polimerasa (I en procariotas y β en eucariotas). Una ADN ligasa sellará el último enlace, restaurándose así la secuencia intacta. 340 FIGURA 7-24 Proceso de reparación del ADN mediante el mecanismo de escisión de bases. (Ilustración de: I. Baraibar.) La reparación por escisión de nucleótidos es un proceso de corrección de daños más generales que distorsionan la estructura en doble hélice (como los dímeros de pirimidina). Este proceso es muy importante, ya que puede reparar muchos tipos de daños diferentes. Primero, un complejo enzimático examina al ADN en busca de distorsiones estructurales. Cuando se encuentra una, se separan las dos cadenas de la región dañada para posteriormente cortar el esqueleto azúcar-fosfato de la cadena dañada a ambos lados de la lesión. Uno de los cortes se hace entre tres y nueve nucleótidos en dirección 3’ del daño y el otro entre 16 y 25 nucleótidos en dirección 5’. Como en el caso anterior, posteriormente, la ADN polimerasa rellena el hueco dejado y la ADN ligasa sella el último enlace. Se han asociado mutaciones en varias de las proteínas relacionadas con esta vía de reparación en el síndrome de Cockayne o el Xeroderma pigmentosum, donde los pacientes presentan fotosensibilidad e inestabilidad cromosómica y aumento del riesgo de desarrollar cáncer de piel (v. capítulo 16). Las roturas bicatenarias de ADN (DSB, v. el apartado «Recombinación homóloga») son roturas necesarias para los procesos de recombinación genética en la meiosis y para la reorganización V(D)J de los genes de las inmunoglobulinas y de los receptores de células T. También aparecen durante la replicación y pueden ser causadas por radiaciones ionizantes y metabolitos celulares. Estas roturas se reparan por dos mecanismos: a) por recombinación homóloga, y b) por fusión no homóloga de extremos. El mecanismo de recombinación homóloga ya ha sido tratado en el apartado «Recombinación homóloga». La fusión no homóloga de extremos (NHEJ, del inglés non-homologous end joining) tiene un mecanismo similar pero sin 341 recombinación, ya que en este caso no existe una doble cadena homóloga, sino que simplemente se fusionan los extremos libres que habrían sido previamente procesados por una nucleasa. Este es el mecanismo responsable de la reorganización de los segmentos V(D)J de los genes de las inmunoglobulinas en linfocitos y parece que en estas células es un mecanismo de reparación muy importante. Mutaciones en una de las proteínas responsables de este proceso provocan la inmunodeficiencia combinada severa (SCID, del inglés severe combined immunodeficiency), también conocida como el síndrome del niño burbuja, al ser los enfermos extremadamente vulnerables a infecciones, por tener una forma muy severa de inmunodeficiencia que hace que deban vivir en ambientes estériles. Cuando una determinada región del genoma ha sufrido daños muy considerables que no pueden ser reparados por las vías anteriormente señaladas, la célula puede entrar en un proceso de muerte programada (apoptosis, v. capítulo 15) o se puede intentar replicar esa región, aun cuando el resultado sean moléculas de ADN mutadas. Organismos como E. coli eligen la segunda opción, poniendo en marcha mecanismos de emergencia que evitan las zonas muy dañadas. Uno de estos mecanismos es la reparación SOS. Mediante este mecanismo se crea un complejo proteico que es capaz de hacer que la polimerasa III (en procariotas) copie la zona dañada del genoma, incluso cuando esa copia contenga gran cantidad de errores. Esta es una manera de supervivencia bacteriana bajo condiciones adversas, aunque el precio es una elevada tasa de mutación. Este mecanismo no evita las mutaciones, simplemente permite la replicación de regiones muy dañadas. En eucariotas parece que también hay polimerasas capaces de saltarse las lesiones. Lecturas recomendadas Alabert C, Groth A. Chromatin replication and epigenome maintenance. Nat Rev Mol Cell Biol. 2012;13(3):153–167. Alberts B. ADN replication and recombination. Nature. 2003;421(6921):431–435. Bártová E, Krejcí J, Harnicarová A, Galiová G, Kozubek S. Histone modifications and nuclear architecture: a review. J Histochem Cytochem. 2008;56(8):711–721. Branco MR, Pombo A. Chromosome organization: new facts, new models. Trends Cell Biol. 2007;17(3):127–134. Campos EI, Reinberg D. Histones: annotating chromatin. Annu Rev Genet. 2009;43:559–599. Dupont JM. Arquitectura de la cromatina en el núcleo en interfase. Atlas Genet Cytogenet Oncol Haematol 2006. Disponible en: http://AtlasGeneticsOncology.org/Educ/ArchitectChromatinSpID30016SS.html. Fedorova E, Zink D. Nuclear architecture and gene regulation. Biochim Biophys Acta. 2008;1783(11):2174–2184. Ferguson-Smith MA. Cytogenetics and the evolution of medical genetics. Genet Med. 2008;10(8):553–559. 342 International Human Genome Sequencing Consortium. Finishing the euchromatic sequence of the human genome. Nature. 2004;431(7011):931–945. Lander ES. Initial impact of the sequencing of the human genome. Nature. 2011;470(7333):187–197. Mattei MG, Luciani J. Heterocromatina, del cromosoma a la proteína. Atlas Genet Cytogenet Oncol Haematol 2003. Disponible en: http://AtlasGeneticsOncology.org/Educ/HeterochromID30058SS.html. Moss B, ed. Nucleic acid structure and function. 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Algunas de ellas son heredables (afectan a la línea germinal), mientras que otras están causadas por mutaciones somáticas en algún gen. La base de datos Online Mendelian Inheritance in Man (OMIM ; http://omim.org) es el catálogo de genes y ® ® enfermedades genéticas humanas más importante. Contiene información sobre todas las enfermedades conocidas de base genética y más de 12.000 genes, siempre centrándose en la relación entre genotipo y fenotipo. Se actualiza de manera diaria y todos los registros contienen múltiples enlaces a otras bases de datos, herramientas de análisis y referencias bibliográficas. Esta base de datos se comenzó a construir a comienzos de la década de los sesenta por el Dr. Victor A. McKusick (http://en.wikipedia.org/wiki/Victor_A._McKusick) como un catálogo de caracteres mendelianos y enfermedades denominado «MIM» (Mendelian Inheritance in Man). Entre 1966 y 1998 se publicaron 20 ediciones en libro de este catálogo. La versión online se creó en 1985 mediante una colaboración entre la National Library of Medicine (NLM) de EE. UU. y la William H. Welch Medical Library de la Facultad de Medicina de la Johns Hopkins University 343 (Baltimore, MD, EE. UU.). Desde 1987 está disponible en Internet y desde 1995 al verano de 2011 estuvo alojada en la web del National Center for Biotechnology Information (NCBI). Actualmente, OMIM es responsabilidad del McKusick-Nathans Institute of Genetic Medicine de la Facultad de Medicina de la Johns Hopkins University y, desde julio de 2011, cuenta con su propia web independiente del NCBI (http://omim.org). OMIM es una base de datos diseñada para su utilización por personal médico y personal relacionado con las ciencias biomédicas; básicamente investigadores y estudiantes de estas áreas. Aunque es gratuita y abierta su consulta al público en general, no pretende responder a criterios diagnósticos ni de otra índole personal. En su versión actual está directamente unida al traductor de Google (parte superior de la página) por lo que permite ver los registros en el idioma que deseemos (teniendo en cuenta que las traducciones de Google son automáticas). Puede buscar la información sobre las enfermedades que se citan. Después conteste a las siguientes cuestiones: 1. Al buscar una de estas enfermedades encuentra uno o varios registros distintos. ¿Por qué? 2. Cada registro OMIM presenta un número precedido por un símbolo (asterisco *, número #, más +, porcentaje %, careta ^). Estos símbolos tienen un significado. ¿Cuál es? 3. ¿Qué tipo de información puede obtener de cada una de estas enfermedades? Actividad práctica 2 Imagine que crea en el laboratorio un fragmento de ADN que codifica para el antígeno T (Tag) y la placoglobina (proteína del desmosoma), según el siguiente dibujo: Dicho ADN va a generar una «proteína de fusión» que incluye tanto el antígeno T como la placoglobina. Este ADN lo microinyecta en el núcleo de células en cultivo para hacer experimentos de localización celular. Tras un tiempo de la microinyección, realiza la técnica de inmunofluorescencia con anticuerpos anti-antígeno T (o antiplacoglobina). ¿Dónde es más probable que encuentre el marcaje inmunofluorescente, en el núcleo, en los desmosomas, o en ambas localizaciones por igual? Razone su respuesta. Preguntas de autoevaluación 344 1. La envoltura nuclear es: a. Una estructura rígida e impermeable que protege al material genético alojado en el núcleo. b. Una estructura rígida y bastante impermeable, que únicamente permite la salida de ARN del núcleo para que se lleve a cabo la traducción. c. Una estructura flexible que permite el intercambio controlado de ciertas moléculas entre el citoplasma y el núcleo. d. Una estructura flexible que permite el paso de cualquier molécula entre el citoplasma y el núcleo. e. Una estructura flexible que únicamente permite el paso de moléculas del citoplasma hacia el núcleo. Respuesta correcta: c. 2. Señale cuál de las siguientes afirmaciones es cierta en cuanto a la organización del núcleo en interfase en eucariotas y la expresión génica: a. El núcleo en interfase es una mezcla desorganizada de cromatina en la que la posición de los distintos genes no tiene relación con su expresión. b. El núcleo en interfase es una mezcla desorganizada de cromatina, sin embargo, la posición de los genes en él está relacionada con su expresión. c. El núcleo en interfase es una estructura altamente organizada en la que la posición de los genes en posiciones cercanas a los dominios intercromosómicos es importante para su expresión. d. El núcleo en interfase es una estructura bastante desorganizada en la que la posición de los genes en posiciones cercanas a los dominios intercromosómicos es importante para su expresión. e. Ninguna de las afirmaciones anteriores es cierta. Respuesta correcta: c. 3. Indique cuál de las siguientes características no es propia de la heterocromatina humana: a. Existen dos tipos de heterocromatina, la facultativa y la constitutiva. b. La heterocromatina se observa más densa en interfase que la eucromatina. c. La heterocromatina es minoritaria frente a la eucromatina en el núcleo de una célula somática humana. d. Se cree que la heterocromatina es transcripcionalmente activa. e. La heterocromatina se replica más tarde que la eucromatina. Respuesta correcta: d. 4. En cuanto al componente proteico de los cromosomas humanos: 345 a. Existen dos tipos: las histonas y las proteínas no histonas. b. Las proteínas no histonas tienen un papel exclusivamente estructural. c. Las histonas son proteínas de carácter ácido poco conservadas en la escala evolutiva. d. Las histonas carecen de papel estructural, su papel es solo funcional y regulador. e. Las proteínas histonas son de ocho tipos distintos y forman un octámero. Respuesta correcta: a. 5. En relación con el empaquetamiento del ADN para formar los cromosomas en eucariotas, señale cuál de los siguientes conceptos es el correspondiente al «enrollamiento de la doble hélice de ADN alrededor del octámero de histonas en una superhélice levógira»: a. Nucleoide. b. Nucleosoma. c. Solenoide. d. Estructura en «cuentas de collar». e. Cromatina. Respuesta correcta: b. 6. Las estructuras de los cromosomas responsables del reparto del material genético entre las células hijas en la división celular son: a. Los brazos q. b. Los telómeros. c. Los centrómeros. d. Los dos brazos p y q. e. Las cromátidas hermanas. Respuesta correcta: c. 7. En la especie humana: a. Hay 23 pares de cromosomas, de los que un par son cromosomas sexuales y el resto son autosomas. b. Hay 22 pares de cromosomas, de los que un par son cromosomas sexuales y el resto son autosomas. c. Hay 46 pares de cromosomas, de los que un par son cromosomas sexuales y el resto son autosomas. 346 d. Hay 44 pares de cromosomas, de los que un par son cromosomas sexuales y el resto son autosomas. e. Ninguna de las afirmaciones anteriores es correcta. Respuesta correcta: a. 8. Los cromosomas homólogos son: a. Un par de cromosomas de la misma longitud y posición del centrómero, contienen los mismos loci, aunque pueden contener distintos alelos para cada gen. b. Un par de cromosomas de la misma longitud y posición del centrómero, contienen los mismos loci y deben tener los mismos alelos para cada gen. c. El conjunto de cromosomas que proviene de cada uno de los progenitores. d. Los cromosomas sexuales por un lado y los autosomas por otro. e. Lo mismo que las cromátidas hermanas, pero en una fase distinta del ciclo celular. Respuesta correcta: a. 9. Las bandas que aparecen tras la tinción con diferentes compuestos químicos de los cromosomas metafásicos: a. Permiten clasificar los cromosomas. b. Están asociadas a diferentes características funcionales de las regiones que tiñen. c. No son siempre las mismas, ya que dependen del estado funcional del cromosoma. d. La a y b son ciertas. e. La b y c son ciertas. Respuesta correcta: d. 10. El análisis citogenético permite la observación de: a. Alteraciones en la estructura de los cromosomas de un individuo. b. Mutaciones en la secuencia de ADN. c. Alteraciones en el número de cromosomas de un individuo. d. La a y b son ciertas. e. La a y c son ciertas. Respuesta correcta: e. 347 11. Cuando un organismo presenta uno o varios cromosomas de más con respecto al número habitual de su especie pero sin llegar a un juego haploide completo se dice que presenta una: a. Poliploidía. b. Euploidía c. Aneuploidía d. Triploidía. e. Trisomía. Respuesta correcta: c. 12. ¿Cuál es la diferencia principal entre el ADN de tipo microsatélite y el ADN minisatélite? a. Su posición en el cromosoma. b. Su capacidad de codificar o no para un producto. c. El tamaño de la unidad que se repite. d. El primero es ADN repetitivo, el segundo no. e. Ninguna de las anteriores respuestas es correcta. Respuesta correcta: c. 13. Los sistemas de reparación del ADN son sistemas: a. Que previenen y reparan las mutaciones y daños al ADN y que están presentes en procariotas y eucariotas. b. Que previenen y reparan las mutaciones y daños al ADN y que solo están presentes en procariotas, ya que los eucariotas no los necesitan. c. Que previenen y reparan las mutaciones y daños al ADN y que solo están presentes en eucariotas, ya que en procariotas no importan tanto y la existencia de muchas mutaciones facilita su evolución. d. Que previenen y reparan las mutaciones y daños al ADN del nucleoide de procariotas. e. Que previenen y reparan las mutaciones y daños únicamente a las secuencias que forman parte de los genes y que están presentes en procariotas y eucariotas. Respuesta correcta: a. 348 1 Watson JD, Crick FHC. Molecular Structure of Nucleic Acids: A Structure for Deoxyribose Nucleic Acid. Nature 1953;171:737-8. 349 CAPÍTULO 8 350 El núcleo. Parte II: transcripción y maduración del ARN y estructura del nucléolo María S. Aymerich Mariana García Ángela M. Suburo Rubén Pío Objetivos de aprendizaje • Conocer las etapas de síntesis y maduración del ARN. • Entender los mecanismos de regulación de la transcripción. • Conocer la morfología y la función del nucléolo. • Comprender la relevancia biológica del proceso de corte y empalme de exones. • Relacionar ciertas situaciones patológicas con el incorrecto funcionamiento de los procesos de síntesis y maduración del ARN. 351 Introducción Las células contienen en su genoma las instrucciones necesarias para la síntesis de las biomoléculas que determinarán su tamaño, forma y función. Estas instrucciones están contenidas en unidades de información denominadas genes. Un gen se define como un segmento de ADN que contiene la información necesaria para la síntesis de una molécula biológicamente activa. Esta información está escrita en forma de secuencia de nucleótidos y mediante el proceso de transcripción es transmitida a una molécula de ARN. En algunos casos, este ARN es el producto final del gen; en otros muchos casos, la información contenida en la secuencia del ARN se utiliza para la síntesis de una cadena polipeptídica, en un proceso conocido como traducción (v. capítulo 9). Este flujo de información génica, junto con la replicación del ADN, se conoce como el dogma central de la biología molecular (fig. 8-1). En esta cadena de procesos, el ARN ejerce de «mensajero» entre la información original (secuencia del ADN) y el producto final (secuencia de aminoácidos de una proteína). Además, antes de la traducción, se produce la maduración del ARN, mediante la cual se modifican algunas de sus bases, se eliminan nucleótidos y se adicionan secuencias no presentes en el ADN de origen. FIGURA 8-1 Los procesos asociados al flujo de la información génica, junto con el proceso de replicación del ADN, constituyen «el dogma central de la biología molecular». Este modelo fue propuesto en 1958 por Francis Crick y explica cómo la célula es capaz de descodificar la información contenida en los genes y sintetizar las proteínas funcionalmente activas. (Ilustración de: I. Baraibar.) 352 En este capítulo se describen las características básicas de los procesos de transcripción y maduración del ARN. También se destaca la importancia del nucléolo como expresión morfológica del proceso de transcripción del ARN ribosómico y se presentan ejemplos de la importancia del metabolismo del ARN, tanto en situaciones fisiológicas como patológicas. 353 Síntesis del ARN: transcripción Todas las células del organismo comparten un mismo genoma, en el que están codificadas todas las instrucciones para su desarrollo, diferenciación y funcionamiento. Sin embargo, una determinada célula, en un momento concreto, solo utiliza una pequeña fracción de los aproximadamente 25.000 genes del genoma humano. El proceso mediante el cual la célula transforma la información de un gen en un elemento funcional se denomina expresión génica. El primer paso en la expresión de un gen es la síntesis de una molécula de ARN. Este proceso se conoce como transcripción y tiene lugar solo en las regiones del ADN que contienen genes. Esto contrasta con la replicación, un proceso en el que interviene la secuencia completa del ADN. Las funciones que debe desempeñar una célula, así como las condiciones ambientales en las que se encuentra, van a determinar qué genes se expresan en un momento dado; por ello, la transcripción de un gen está sometida a un estricto control (fig. 8-2). Este control se lleva a cabo a través de secuencias reguladoras, denominadas promotores, que se localizan al comienzo del gen (v. fig. 8-2). FIGURA 8-2 A. La diferenciación celular se asocia con una transcripción selectiva de genes. Algunos de los genes del genoma se expresan en todas las células del organismo (genes constitutivos) (gen A). Otros genes son inducibles, por lo que solamente se expresan en determinados tipos celulares y sus concentraciones son variables (genes B-D). En algunos casos, la expresión de un gen es específica de un único tipo celular (gen C). B. El proceso de transcripción de un gen se inicia en su región promotora, situada en el extremo 5’ de la hebra codificante y en el extremo 3’ de la hebra molde. La región promotora permite el control de la expresión génica. (Ilustración de: I. Baraibar.) La ARN polimerasa es la principal enzima implicada en la transcripción. Esta enzima cataliza la síntesis de una molécula de ARN de cadena simple a partir un gen, constituido por un segmento de ADN de cadena doble. Cada una de las hebras del ADN cumple un papel diferente en la transcripción. La ARN polimerasa utiliza una de ellas como molde, de tal manera que la secuencia de nucleótidos del ARN sintetizado es complementaria a la secuencia de 354 nucleótidos de la hebra molde del ADN, también conocida como hebra no codificante o antisentido (fig. 8-3). La otra hebra del ADN se denomina hebra no molde, codificante o sentido. La secuencia de bases del transcrito de ARN es idéntica a la secuencia de la hebra sentido (v. fig. 8-3), con la diferencia de que el ARN contiene uracilos en lugar de timinas y grupos hidroxilo en el carbono 2’ de las pentosas. Esta última característica hace que las moléculas de ARN se hidrolicen más fácilmente que las moléculas de ADN. Las cadenas de ARN de hebra sencilla tienden a plegarse sobre sí mismas, dando lugar a una diversidad estructural mucho mayor que la observada en el ADN y, por lo tanto, a una mayor diversidad funcional. Entre las funciones desempeñadas por las moléculas de ARN destacan las relacionadas con la transmisión de la información génica entre el ADN y las proteínas. En ella intervienen distintos tipos de ARN, siendo los tres principales: • ARN mensajero (ARNm): transporta la información contenida en el ADN desde el núcleo hasta los ribosomas, los orgánulos celulares donde se produce la síntesis de las cadenas polipeptídicas (las proteínas). • ARN ribosómico (ARNr): es el tipo de ARN más abundante. Forma parte de la estructura de los ribosomas. • ARN de transferencia (ARNt): transporta los aminoácidos necesarios para la síntesis de las proteínas en los ribosomas. FIGURA 8-3 Las hebras de ADN tienen distinta función en la transcripción. La síntesis de la molécula de ARN se lleva a cabo utilizando como molde la hebra antisentido, a partir de la cual se sintetiza su secuencia complementaria. Esto da lugar a una molécula de ARN idéntica a la hebra codificante o sentido (con nucleótidos de uracilo en lugar de nucleótidos de timina). Existen, además, otras muchas moléculas de ARN y complejos ARN-proteína con diversas funciones reguladoras y catalíticas: ribonucleoproteínas heterogéneas nucleares (hnRNP, del inglés heterogeneous nuclear ribonucleoproteins), ribonucleoproteínas pequeñas nucleares (snRNP, del inglés small nuclear ribonucleoproteins) y micro-ARN, entre otros. La ARN polimerasa La ARN polimerasa es la enzima responsable de la síntesis del ARN. La reacción catalizada por esta enzima es la siguiente: (NMP) representa una cadena de ARN con «n» nucleósidos monofosfato (NMP). La ARN polimerasa añade nuevos n nucleósidos trifosfato (NTP) en el extremo 3’ del polímero en formación. Los nucleótidos se incorporan como NMP, liberándose pirofosfato (PP ). i 355 El mecanismo molecular de la transcripción es similar al de la replicación. Sin embargo, existen importantes diferencias entre ambos procesos, así como entre las polimerasas que intervienen en ellos (tabla 8-1). Tabla 8-1 Similitudes y diferencias entre la replicación y la transcripción dNTP, desoxirribonucleósidos trifosfato; NTP, ribonucleósidos trifosfato. En las células eucariotas existen varias isoenzimas de la ARN polimerasa, que difieren entre sí en el tipo de ARN que sintetizan y en su localización nuclear (tabla 8-2). La estructura de estas enzimas es compleja: están compuestas por numerosas subunidades que necesitan unirse a diversas proteínas, denominadas factores de transcripción, para formar un complejo activo que permita el inicio de la transcripción. Tabla 8-2 Tipos principales de ARN polimerasas en eucariotas ARN polimerasa Tipos de ARN sintetizados Localización I ARNr 28 S, 18 S y 5.8 S Nucléolo II ARNm Nucleoplasma III ARNt, ARNr 5 S Nucleoplasma Fases de la transcripción Al igual que en la replicación, el proceso de transcripción se puede dividir en tres fases: iniciación, elongación y terminación. Iniciación El proceso de transcripción se inicia con la unión de la ARN polimerasa al promotor, una secuencia específica del gen que se encuentra en la posición 3’ de la hebra molde y en la 5’ de la hebra codificante (v. fig. 8-2). La región promotora se extiende desde decenas o cientos de bases antes del sitio de iniciación de la transcripción, hasta unas pocas bases 356 más allá de este punto de inicio. La secuencia del promotor de un gen va a determinar su nivel de expresión basal, así como su regulación. Aunque los promotores son muy variados, existen secuencias consenso que se repiten frecuentemente entre los distintos genes. Algunas de estas secuencias están presentes en un gran número de ellos, mientras que otras son específicas de determinados grupos de genes. En el inicio de la transcripción están implicadas diversas proteínas. Para que la ARN polimerasa se una al promotor es necesaria la presencia de los llamados factores de transcripción basales (fig. 8-4). Estos factores van a reclutar y situar a la ARN polimerasa en el inicio del gen. La unión ADN-factor de transcripción se consigue mediante la interacción específica entre residuos de aminoácidos del factor de transcripción y la zona exterior de la doble hebra del ADN. Estos factores suelen formar dímeros (homo- o heterodímeros) y la mayoría de ellos se agrupan en familias de proteínas en función de las estructuras supersecundarias que presentan: «hélice-vuelta-hélice», «hélice-lazohélice», «cremallera de leucina» o «dedos de zinc». Además, estas proteínas tienen dominios adicionales que interaccionan con otras proteínas, entre ellas la ARN polimerasa. Junto con los factores de transcripción basales, actúan otros muchos factores de transcripción que regulan de manera más específica la expresión de cada gen. El papel de estos factores en el control del inicio de la transcripción se abordará en el siguiente apartado del tema. Cuando estos factores sitúan correctamente a la ARN polimerasa sobre el promotor, el ADN se desenrolla y la polimerasa sufre cambios conformacionales y químicos (fosforilación) que inducen el inicio de la transcripción. FIGURA 8-4 Formación del complejo de inicio de la transcripción sobre un gen. El factor TBP reconoce una secuencia consenso denominada «caja TATA» (presente en un gran número de genes eucariotas) y recluta diversos factores de transcripción basales (TFII), que a su vez reclutan a la enzima ARN polimerasa II y la sitúan en el punto de inicio de la transcripción. Los factores de transcripción basales también modifican conformacionalmente a la enzima e inducen su fosforilación, lo que permite el inicio de la síntesis del ARN. A fin de simplificar la imagen, se ha omitido una de las dos hebras del ADN, aunque la ARN polimerasa se une a las dos. Elongación La mayor parte de los factores de transcripción basales se liberan al comienzo de la fase de elongación y son sustituidos por los factores de elongación. El complejo de transcripción avanza en dirección 5’ → 3’pr topoisomerasas que van desenrollando las hebras de ADN (fig. 8-5). Durante la elongación, el grupo hidroxilo en el extremo 3’ del ARN en formación reacciona con un fosfato del ribonucleósido trifosfato entrante, formándose un nuevo enlace fosfodiéster. La velocidad de elongación es de aproximadamente 20-50 bases por segundo y la enzima tiene una tasa de error relativamente alta (un nucleótido mal incorporado por cada 10 -10 nucleótidos) debido a la 4 ausencia de actividad correctora. 357 5 FIGURA 8-5 Representación esquemática de la fase de elongación de la transcripción. Terminación La síntesis del ARN finaliza cuando la ARN polimerasa reconoce ciertas secuencias del ADN que se sitúan en el extremo 3’ de los genes. El mecanismo de terminación se ha estudiado intensamente en procariotas, donde se conocen secuencias y factores que participan en la parada de la elongación y en la liberación de la maquinaria de transcripción. Sin embargo, en eucariotas los detalles del proceso son hasta el momento poco conocidos. Regulación de la transcripción La capacidad de las células para diferenciarse y responder a los estímulos externos requiere de una regulación muy precisa de la expresión génica. El conjunto de los genes expresados en una célula en un determinado momento se conoce como transcriptoma. A diferencia del genoma, el transcriptoma es variable y dependiente del contexto celular en el instante de su determinación. En relación con la expresión, se distinguen dos tipos de genes: • Genes constitutivos o «domésticos» (del inglés housekeeping): son aquellos que se expresan de manera rutinaria, ya que dan lugar a productos que se requieren para llevar a cabo funciones celulares básicas. Entre este tipo de genes se encuentran aquellos que codifican los ARNr, los ARNt o los ARNm de proteínas esenciales (como las proteínas ribosómicas o las histonas). • Genes inducibles: son aquellos que solo se expresan en algunos tipos celulares o en determinadas circunstancias. Por ejemplo, la hemoglobina se expresa específicamente en eritrocitos, o diversas citoquinas se expresan en células del sistema inmunitario solo tras su activación. Existen varios niveles de regulación en la expresión de un gen. En primer lugar, la compactación de la cromatina en el núcleo limita el acceso de la maquinaria de transcripción. En una célula en interfase, la cromatina se encuentra en dos disposiciones distintas: la heterocromatina y la eucromatina. Cada célula, al diferenciarse, genera un patrón específico de heterocromatina y eucromatina. La heterocromatina está empaquetada tan densamente que es transcripcionalmente inactiva. La eucromatina es una forma menos condensada que permite una actividad transcripcional. Los genes activos se sitúan en las zonas menos compactas de la eucromatina (denominadas «regiones 358 hipersensibles», por ser más susceptibles a la acción de DNasas). El grado de compactación de la cromatina no es algo estable, sino que está sometido a un proceso conocido como remodelación de la cromatina. Entre los agentes que controlan la compactación de la cromatina están: • Factores de remodelación de la cromatina: son complejos enzimáticos que relajan la cromatina desplazando a los nucleosomas. Uno de los más conocidos es el complejo multiproteico SWI/SNF (switch/sucrose nonfermentable), inicialmente descrito en levaduras, que es capaz de desestabilizar las interacciones entre el ADN y las histonas. • Histona-acetiltransferasas (HAT): estas enzimas acetilan residuos de lisina en los extremos amino de las histonas. La adición del grupo acetilo elimina la carga positiva de las cadenas laterales de las lisinas, reduciendo su afinidad por el ADN y haciendo que la cromatina se relaje (fig. 8-6). Además, los residuos de lisina acetilados interaccionan con otras proteínas que regulan la transcripción. Existen también histona-desacetilasas (HDAC) que catalizan la desacetilación de histonas, favoreciendo de este modo la compactación del ADN genómico y, por lo tanto, el silenciamiento de los genes. FIGURA 8-6 Acetilación y desacetilación de histonas en el control de la expresión génica. La acetilación de grupos amino en ciertas lisinas de las histonas relaja la compactación de la cromatina, lo que favorece la transcripción de los genes localizados en esta región del genoma. HAT, histona-acetiltransferasas; HDAC, histona-desacetilasas. (Ilustración de: A. Calvo.) La pérdida de compactación de la cromatina es solo el primer requisito para que un gen pueda ser transcrito. Existen muchos otros elementos que controlan el destino final del producto génico (cuadro 8-1). De todos ellos, uno de los más estrictamente regulados es la unión de la ARN polimerasa para el inicio de la síntesis del transcrito primario. Cuadro 8-1 Puntos de control en la expresión de un gen y de su proteína • Condensación de la cromatina. • Síntesis del transcrito primario (ARN inmaduro). • Modificaciones postranscripcionales del ARN inmaduro. 359 • Estabilidad del ARN. • Síntesis proteica (traducción). • Modificaciones postraduccionales. • Transporte y localización de la proteína. • Degradación de la proteína. Las secuencias consenso de la región promotora, localizada en la porción inicial del propio gen, son reconocidas por los factores de transcripción de la fase de iniciación, lo que determina la unión de la ARN polimerasa y el inicio de la transcripción (v. fig. 8-4). Los genes constitutivos contienen promotores que están siempre activos en cualquier tipo celular. En estos genes, existen secuencias consenso en la región promotora que permiten una transcripción constante, ya que a ellas se unen factores de transcripción basales que siempre están presentes en la célula. Los genes inducibles contienen sistemas más específicos para el control de su expresión. En la regulación de estos genes participan regiones más o menos cercanas al promotor, que poseen la capacidad de unir factores de transcripción que controlan el reclutamiento de la ARN polimerasa. Si los factores de transcripción facilitan este reclutamiento actuarán como activadores de la transcripción, mientras que si dificultan la incorporación de la ARN polimerasa actuarán como represores. La presencia de un patrón concreto de factores de transcripción, condicionada por el tipo celular y las condiciones ambientales, determinará la expresión de un gen regulable (fig. 8-7). Algunos de estos factores regulan la transcripción de grupos concretos de genes, permitiendo una respuesta celular coordinada (v. fig. 8-7). FIGURA 8-7 A. Regulación de la expresión de un gen inducible a través de la unión de diversos factores de transcripción en regiones cercanas al lugar de unión de la ARN polimerasa. Estas regiones se conocen como potenciadoras (en inglés, enhancers) y a ellas se unen los activadores de la transcripción. En algunos casos, también existen factores represores que bloquean el inicio de la transcripción. B. Estrategia celular para la respuesta coordinada ante un daño en el material genético mediante la inducción de la transcripción de genes por parte del factor de transcripción p53. (Ilustración de: I. Baraibar.) La importancia fisiológica de la regulación de la expresión génica se manifiesta en la implicación de factores de transcripción en diversas patologías. Comentaremos brevemente su importancia en el desarrollo del cáncer. La transformación de una célula normal en una célula cancerosa tiene lugar a través de la acumulación de alteraciones en 360 su genoma que le confieren capacidades funcionales propias de las células malignas: insensibilidad a factores inhibidores del crecimiento, autosuficiencia en factores de crecimiento, inmortalidad, inhibición de la muerte celular programada, capacidad angiogénica y capacidad de migrar e invadir tejidos alejados del punto de origen del tumor (v. capítulo 16). Los genes alterados a lo largo del proceso de carcinogénesis se pueden clasificar en dos grandes grupos: los oncogenes y los genes supresores tumorales. Los oncogenes son genes cuyo producto génico contribuye al proceso de carcinogénesis. Los genes supresores, por el contrario, dan lugar a moléculas, principalmente proteínas, que impiden el desarrollo tumoral. Son muchos los oncogenes y genes supresores que se han asociado al desarrollo del cáncer. Aunque algunos oncogenes provienen de virus oncogénicos, otros muchos se originan a partir de genes propios de la célula. Estos genes, denominados protooncogenes, sufren mutaciones o sobreexpresiones que alteran su regulación y, por lo tanto, su patrón normal de expresión. Diversos factores de transcripción forman parte de esta categoría de genes. Un ejemplo muy conocido es el protooncogén cMyc. Este gen da lugar a una proteína cuya función es la de actuar como factor de transcripción para genes implicados en la proliferación celular. En casi todas las células humanas, cMyc está silenciado, ya que únicamente las células en división expresan este factor de transcripción. Sin embargo, se ha observado que el gen cMyc está mutado o amplificado en diversos tipos de tumores. Esto hace que cMyc no pueda ser regulado correctamente y que los niveles de su proteína sean anormalmente altos. En esta situación la proteína cMyc actúa como un oncogén, ya que activa de forma continua la transcripción de genes implicados en la proliferación celular, haciendo que la célula afectada se divida de manera incontrolada. El ejemplo opuesto lo tenemos en p53 (v. capítulos 14 y 16). La proteína p53 es un factor de transcripción que regula la expresión de genes que inhiben el ciclo celular e inducen la muerte por apoptosis (v. fig. 8-7). Por lo tanto, p53 se comporta como un gen supresor tumoral con capacidad para impedir el crecimiento de las células tumorales. En la mayoría de los tumores humanos, el gen p53 se encuentra inactivado (bien por mutación o bien por pérdidas de material cromosómico). En esta situación, la célula tumoral crece de manera descontrolada, ya que no es capaz de iniciar la transcripción de genes relacionados con el control del ciclo celular y la apoptosis. Otra alteración frecuentemente asociada a la aparición del cáncer es la metilación aberrante del ADN. En regiones concretas del genoma, algunos nucleótidos contienen 5-metilcitosina como base nitrogenada. La metilación de citosinas es quizás la modificación epigenética más frecuente en nuestro genoma. Las modificaciones epigenéticas se definen como cambios químicos reversibles que, por lo tanto, no afectan a la secuencia original del ADN. Los cambios epigenéticos pueden ser muy variados (acetilaciones, metilaciones, fosforilaciones, etc.) y afectan de manera importante a la transcripción de genes. En el caso de la metilación de citosinas, la adición del grupo metilo es catalizada por las ADN metiltransferasas. La metilación se produce en zonas ricas en dinucleótidos CG, conocidas como islas CpG. Si la metilación de citosinas tiene lugar en la región promotora de un gen, se impide su transcripción, debido a que la metilcitosina es reconocida por factores que reclutan histona desacetilasas y factores remodeladores que compactan la cromatina y la inactivan transcripcionalmente. Una de las alteraciones más importantes en el cáncer es la hipermetilación específica de determinados promotores. Los genes afectados por esta metilación pertenecen a la 361 categoría de genes supresores tumorales. A modo de ejemplo, es frecuente encontrar tumores en los cuales existe una hipermetilación del promotor del gen de p16 (v. capítulo 14), lo que impide el inicio de su transcripción y la consiguiente síntesis de la proteína, cuya función es la regulación del ciclo celular (fig. 8-8). En la actualidad se está evaluando la eficacia terapéutica de inhibidores de las ADN metiltransferasas en el tratamiento del cáncer. El objetivo es impedir la hipermetilación anormal de genes supresores, lo que permitirá nuevamente su expresión y su función inhibidora del crecimiento tumoral. La decitabina, un análogo de la citidina, es un agente desmetilante aprobado para el tratamiento del síndrome mielodisplásico. FIGURA 8-8 La hipermetilación del promotor de p16 en células tumorales inhibe su transcripción. Esto, a su vez, permite a la célula tumoral crecer de manera descontrolada, ya que la ausencia de la proteína p16 impide el bloqueo del ciclo celular. (Ilustración de: I. Baraibar.) Inhibidores de la transcripción Existen moléculas capaces de inhibir el proceso de transcripción. Algunas de ellas actúan de manera preferente sobre la maquinaria transcripcional de procariotas y se usan en clínica para el tratamiento de infecciones. Por ejemplo, la rifampicina inhibe la síntesis del ARN al unirse específicamente a una de las subunidades de la ARN polimerasa bacteriana. La rifampicina se utiliza en el tratamiento de diversas infecciones, como por ejemplo la tuberculosis o la lepra, causadas por bacterias del género Mycobacterium. Debido a las diferencias estructurales entre las polimerasas procariotas y eucariotas, la rifampicina apenas tiene efectos tóxicos en el hombre. Sin embargo, otros inhibidores, como la actinomicina D, actúan tanto sobre células procariotas como sobre células eucariotas. La actinomicina D se intercala en el ADN e impide el proceso de elongación. El hongo Amanita phalloides ha desarrollado un mecanismo de defensa basado en la producción de la toxina α-amanitina (fig. 8-9). La α-amanitina es un octapéptido cíclico que inhibe a la ARN polimerasa II (y en menor medida a la III) impidiendo la elongación del ARN en eucariotas. Esta toxina es muy dañina, ya que la actividad de la ARN polimerasa II es esencial para las células. Tras su ingestión, se producen trastornos gastrointestinales pasajeros. Sin embargo, al cabo de los días, órganos vitales como el hígado o el riñón no pueden reponer sus proteínas y pierden su función, causando el coma y la muerte. 362 FIGURA 8-9 Diversos hongos del genero Amanita, como A. phalloides, producen una molécula tóxica denominada α-amanitina, un potente inhibidor de la transcripción de los ARNm en eucariotas. 363 El nucléolo: expresión morfológica del proceso de transcripción Estructura y función El 80% del ARN que se sintetiza en una célula en interfase es ARN ribosómico (ARNr). Este ARN se produce fundamentalmente en los nucléolos, estructuras nucleares complejas, altamente ordenadas y formadas a partir de regiones de ADN en las que se transcriben múltiples copias de un ARNr inmaduro (45 S), que posteriormente será procesado para dar lugar a los ARNr 28 S, 18 S y 5.8 S. A continuación, estos ARNr se ensamblarán con diversas proteínas para constituir las subunidades ribosómicas. Sin embargo, la formación de los ribosomas no es la única función del nucléolo. Esta estructura nuclear también interviene en el ensamblaje de ribonucleoproteínas (RNP) no ribosómicas, en la edición del ARNm, en la progresión del ciclo celular y en las vías de señalización relacionadas con el estrés celular. Entre las RNP no ribosómicas formadas en el nucléolo están, por ejemplo, la partícula de reconocimiento de la señal (SRP), que dirige la síntesis de proteínas hacia el retículo endoplasmático rugoso (v. capítulo 10) y la telomerasa, que cataliza el alargamiento de los telómeros en cada división celular (v. capítulo 14). Se podría decir que el nucléolo es la expresión morfológica de la síntesis y procesamiento de RNP, tanto ribosómicas como no ribosómicas. Los nucléolos son visibles al microscopio óptico (fig. 8-10) y su número y tamaño suelen guardar relación con la actividad celular. Muchas células presentan uno o dos nucléolos; sin embargo, las células inactivas no lo suelen tener, mientras que las células que requieren una síntesis proteica elevada (embrionarias, tumorales, neuronales, etc.) pueden tener múltiples nucléolos. Cuando las células se dividen, los nucléolos presentes en la interfase desaparecen en la profase y reaparecen en forma de cuerpos prenucleolares en la telofase. Este comportamiento se denomina ciclo del nucléolo. 364 FIGURA 8-10 A. Imagen de un nucléolo (flecha) en una neurona, observado al microscopio óptico. B. Imagen de microscopía electrónica de un nucléolo (flecha). C. Imagen de microscopía electrónica donde se pueden distinguir el componente granular (GC, del inglés granular component), el centro fibrilar (asterisco) y el componente fibrilar denso (flecha). D. Imagen a mayor aumento que muestra las partes del nucléolo. (A y B, imágenes procedentes de: Departamento de Histología de la Universidad de Navarra; C y D, procedentes de: Hernandez-Verdun D et al. Wiley Interdiscip Rev ARN 2010;1:415-31.) A nivel ultraestructural, el nucléolo aparece como una estructura sin membrana, normalmente de forma esférica, que posee zonas electrolúcidas y electrodensas (v. fig. 8-10). Las zonas más electrolúcidas corresponden a la parte amorfa (o nucleoloplasma). Las zonas electrodensas (parte densa o nucleolonema) presentan tres compartimentos o subdominios: el componente fibrilar denso (CFD), el centro fibrilar (CF) y el componente granular (CG). El CFD es homogéneamente electrodenso y está compuesto por fibrillas altamente empaquetadas. El CFD se suele situar alrededor del CF, que es algo menos electrodenso. El CG se compone de gránulos de unos 10-20 nm de diámetro, intercalados entre los componentes fibrilares (v. más adelante fig. 8-22). Estos subdominios de la parte densa del nucléolo reflejan distintas etapas de la biogénesis de los ribosomas. En el CF tiene lugar la transcripción del pre-ARNr 45 S, mientras que en las otras zonas se produce su maduración y la formación de las RNP. Cada nucléolo puede contener múltiples CF rodeados por el CFD. En algunas células no se observa el CF, por lo que se piensa que en estos casos la síntesis del pre-ARNr se realiza en el CFD. La estructura de los nucléolos, al igual que ocurría con su número y tamaño, puede verse también condicionada por la actividad celular. En los linfocitos humanos maduros, donde la actividad transcripcional es baja, existe un único CF. Sin embargo, tras ser estimulados, la producción de ribosomas se acelera, el nucléolo se agranda y aparecen numerosos CF pequeños, rodeados por un CFD. Morfológicamente también se puede observar la existencia de cromatina en disposición perinucleolar y/o intranucleolar. Esta cromatina se denomina cromatina asociada al nucléolo y en algunas células se encuentra en la periferia del nucléolo cubriéndolo parcialmente a modo de capuchón. Este compartimento perinucleolar aparece habitualmente en células tumorales y se ha asociado con la iniciación o la progresión del tumor. Los dominios de cromatina asociada al nucléolo contienen regiones cromosómicas inactivas (siendo ricos en ADN de tipo satélite) y 365 genes codificantes pertenecientes a las familias de proteínas «dedo de zinc», receptores olfatorios y defensina, entre otros. Regiones organizadoras de los nucléolos y transcripción del ARNr En las células en interfase, el ADN ribosómico (ADNr) se agrupa en una zona del núcleo junto con enzimas que van a participar en los procesos de transcripción y procesamiento del pre-ARNr 45 S, formando así el nucléolo. Los genes ribosómicos están repetidos múltiples veces, en tándem, en regiones específicas del ADN denominadas regiones organizadoras nucleolares (NOR, del inglés nucleolar organizer regions). En el genoma humano existen unas 400 NOR distribuidas a lo largo de los cromosomas acrocéntricos (cromosomas 13, 14, 15, 21 y 22). Cada gen ribosómico es una unidad de transcripción que contiene los ARNr 18 S, 5.8 S y 28 S, junto con regiones espaciadoras; todas estas secuencias conjuntamente conforman el pre-ARNr 45 S. Las NOR se localizan en los CF de los nucléolos y contienen proteínas fuertemente argirófilas que se pueden visualizar con tinciones de plata, por lo que a estos dominios también se les llama Ag-NOR. Cuando las células entran en mitosis, las NOR quedan situadas en la región satélite de los cromosomas acrocéntricos, y pueden identificarse mediante estas tinciones. La transcripción del ARNr policistrónico está a cargo de la ARN polimerasa I (v. tabla 8-2), que se localiza en los CF de los nucléolos junto con factores de transcripción específicos (como el upstream binding factor, UBF). En 1960, Oscar Miller fue capaz de aislar las porciones fibrilares del nucléolo de ovocitos y observarlas al microscopio electrónico de transmisión. Lo que se encontró fueron múltiples estructuras en forma de «árbol de Navidad», cada una de las cuales correspondía a una unidad de transcripción del ADNr. La interpretación molecular de estas estructuras se explica en la figura 8-11. FIGURA 8-11 Transcripción del ADN ribosómico en forma de estructuras de «árbol de Navidad». El «tronco» del árbol corresponde al ADNr, en el que se han unido numerosas ARN polimerasas I, cada una de las cuales está en un proceso secuencial de transcripción. Las «ramas» corresponden al pre-ARNr 45 S en distintas fases de síntesis: cerca del inicio de la transcripción las «ramas» son más cortas, mientras que las de mayor longitud corresponden al pre-ARN ya sintetizado, al que se le van uniendo proteínas que participan en su maduración, dando lugar a la RNP 45S. El ensamblaje de los componentes que participan en la maduración del pre-ARNr es cotranscripcional. (Imagen de microscopía procedente de: Miller O. J Cell Biol 1981;91:15-27. Ilustración de: A. Calvo.) 366 Los ribosomas también contienen ARNr 5 S. La transcripción de este ARNr sigue un proceso independiente al de 45 S, ya que es codificado por genes presentes en el cromosoma 1, tiene lugar fuera del nucléolo y su transcripción está a cargo de la ARN polimerasa III (v. tabla 8-2). Al igual que ocurría con el pre-ARNr 45 S, existen múltiples copias del gen que codifica el ARNr de 5 S situadas en tándem. El ARNr 5 S es un ARN pequeño (120 nucleótidos) con una masa molecular de 40 kDa. Tiene una estructura secundaria muy conservada y se caracteriza por formar una partícula prerribosómica con la proteína L5. Esta partícula es transportada hasta el nucléolo, donde se ensambla con el resto de componentes de la subunidad mayor del ribosoma. Otros cuerpos nucleares En el núcleo podemos distinguir, aparte del nucléolo, otros dominios o cuerpos nucleares relacionados con los procesos de transcripción y procesamiento del ARN (fig. 8-12). Entre ellos se encuentran: a) unas zonas de pequeño tamaño conocidas como partículas nucleares (speckles, en inglés), que participan en el corte y empalme del ARNm; b) los cuerpos de Cajal, involucrados en procesos relacionados con el metabolismo del ARN, tales como la biogénesis, maduración y reciclaje de snRNP, el procesamiento del ARNm de las histonas y el mantenimiento de los telómeros, y c) los cuerpos nucleares de la leucemia promielocítica aguda (PML-NB, del inglés promyelocytic leukemia nuclear bodies). Una misma proteína puede estar asociada con más de un cuerpo nuclear, pudiendo ser transportada desde uno a otro subdominio. Este tráfico es particularmente intenso entre el nucléolo y el resto de partículas nucleares. FIGURA 8-12 Los cuerpos nucleares incluyen el nucléolo, los cuerpos de Cajal y los cuerpos nucleares de la leucemia promielocítica aguda (PML-NBs). (Por cortesía de Dr. Graham Dellaire, Dept. of Pathology Dalhousie University, Halifax, Canada.) 367 Maduración del ARN El ARN sintetizado en la transcripción se conoce como ARN primario, transcrito primario o pre-ARN. Los ARN primarios de las células eucariotas sufren una serie de transformaciones, denominadas modificaciones postranscripcionales, que los convierten en su forma madura (cuadro 8-2). Este proceso de maduración del ARN tiene lugar en el núcleo y se solapa con el proceso de transcripción, de tal manera que el extremo 5’ del ARN transcrito puede estar siendo modificado cuando su extremo 3’ todavía no se ha sintetizado. Cuadro 8-2 Modificaciones postranscripcionales del ARN primario • Eliminación de fragmentos de la cadena de ARN. • Adición de nuevos nucleótidos. • Modificaciones covalentes de bases nitrogenadas. Maduración del ARN mensajero En células eucariotas, los genes dan lugar a proteínas mucho más pequeñas de lo que cabría esperar por la longitud de su secuencia de nucleótidos. Esto se debe a que contienen regiones que no son utilizadas para la síntesis de la proteína. Estas regiones se denominan intrones y se eliminan durante la maduración del ARNm mediante un proceso conocido como corte y empalme o ayuste; aunque también es muy frecuente el uso del término anglosajón splicing. Los segmentos de ARN que permanecen en el ARN maduro se denominan exones (fig. 8-13). El splicing del ARN tiene lugar en el núcleo de la célula de manera simultánea a la transcripción. Además, el ARNm sufre también modificaciones en sus dos extremos: la adición de la caperuza 5’ y la adición de una cola poli(A) en el extremo 3’. 368 FIGURA 8-13 Proceso de splicing del ARN. Durante el proceso de splicing se elimina una parte de la secuencia del transcrito primario (intrón). Los segmentos de secuencia que permanecen en el ARN maduro se denominan exones. Como se observa en la electronografía, este proceso tiene lugar de manera simultánea a la transcripción. La molécula de ADN entra por la parte superior de la imagen y sale por la inferior. El asterisco indica el punto de inicio de la transcripción. Las flechas señalan bucles en los que se está dando el splicing. La flecha más grande (inferior) señala un ARN completamente transcrito que ya se ha separado del ADN. Tamaño de la barra: 200 nm. (Imagen procedente de: Proudfoot N. Trends Biochem Sci 2000;25:290-3. Ilustración de: I. Baraibar.) Splicing del ARN mensajero El splicing es el proceso de eliminación de intrones de un ARN inmaduro. Este proceso se lleva a cabo mediante el corte de los intrones y el posterior empalme de los exones (v. fig. 8-13). El splicing reduce notablemente el tamaño del ARN maduro, que puede pasar a ser varias veces más pequeño que el transcrito primario. El tamaño y número de intrones y exones es muy variado. Hay genes con decenas de intrones y exones, mientras que otros solo contienen unos pocos. Hay incluso genes sin intrones, como los que codifican para las histonas. Respecto al tamaño, existen intrones de 50 a 20.000 nucleótidos y exones de 100 a 1.000 nucleótidos (aunque en la mayoría de los casos no superan los 250 nucleótidos). En función del tipo de intrón, los mecanismos de splicing son distintos (fig. 8-14). Además, la distribución de los tipos de intrones difiere entre los distintos tipos de ARN (cuadro 8-3). FIGURA 8-14 Esquema de los cuatro posibles mecanismos de splicing. En los intrones del grupo I, el proceso se inicia con una molécula de guanosina que actúa de nucleófilo, atacando al sitio de corte 5’. En el caso del grupo II y del splicing mediado por el espliceosoma, una adenosina del propio intrón lleva a cabo el ataque sobre el extremo 5’ del intrón. (Ilustración de: I. Baraibar.) Cuadro 8-3 Tipos de intrones y moléculas de ARN en los que se localizan • Grupo I: en el ARNr, el ARNt y el ARNm. • Grupo II: en el ARNm mitocondrial. 369 • Intrones cuya eliminación está mediada por el espliceosoma: en el ARNm nuclear. • Intrones cuya eliminación está mediada por endonucleasas: en el ARNt. Los intrones del grupo I y del grupo II son un ejemplo de autocatálisis. Para la eliminación del intrón no se requiere la participación de ningún factor proteico, sino que el propio ARN actúa como catalizador del proceso. Los ARN con capacidad catalítica se denominan ribozimas. La existencia de este tipo de moléculas en los seres vivos ha dado lugar a teorías sobre el origen de la vida que postulan que las primeras biomoléculas fueron cadenas de ARN, con capacidad de actuar como catalizadores de su propia replicación. La división de funciones entre el ADN (almacenamiento de la información genética) y las proteínas (catálisis) se habría producido en una etapa posterior de la evolución. Los intrones más comunes y característicos de las células eucariotas (tercer tipo) son aquellos que requieren de la participación de complejos ARN-proteína denominados ribonucleoproteínas nucleares pequeñas (snRNP). Existen cinco tipos de ARN nucleares pequeños que forman parte de las snRNP: U1, U2, U4, U5 y U6. Cada uno de ellos se asocia a un complejo de proteínas para dar lugar al espliceosoma, que cataliza la eliminación de intrones con gasto de energía en forma de ATP. Estos intrones, típicos de los ARNm, parecen haber evolucionado a partir de los intrones del grupo II y contienen secuencias consenso que determinan el reconocimiento, por parte del espliceosoma, de las zonas de unión exón-intrón (fig. 8-15). FIGURA 8-15 Secuencia consenso de nucleótidos para el ensamblaje del espliceosoma y la eliminación de los intrones de los ARNm eucariotas. El cuarto tipo de intrones está restringido a ciertos ARNt. El proceso de splicing requiere de una endonucleasa que corta los enlaces fosfodiéster en ambos extremos del intrón. La unión de exones se lleva a cabo con consumo de ATP mediante un mecanismo similar al que utilizan las ligasas de ADN. La formación del espliceosoma es un proceso complejo; los ARN nucleares pequeños se sintetizan en el núcleo y se exportan al citoplasma, donde se ensamblan con proteínas para dar lugar a las snRNP. Las snRNP se transportan al núcleo y se acumulan en los cuerpos de Cajal, que son especialmente abundantes en células en proliferación o en células metabólicamente muy activas, como las neuronas. Como hemos indicado previamente, estas estructuras participan en el empaquetamiento, maduración y reciclaje de las snRNP. Una vez ensambladas en los espliceosomas, las snRNP se desplazan a los lugares transcripcionalmente activos. La proteína de supervivencia de motoneuronas (SMN, del inglés survival motor neuron protein) es un componente esencial en la maduración de las snRNP que se localiza tanto en el citoplasma como en los cuerpos de Cajal. En el citoplasma, la SMN forma parte del complejo proteico y actúa como chaperona en el ensamblaje de las snRNP. A su vez, el complejo proteico acompaña a las snRNP hasta los cuerpos de Cajal en el núcleo, donde podría contribuir a su maduración. 370 La atrofia muscular espinal abarca un conjunto de enfermedades neurodegenerativas que afectan específicamente a las motoneuronas del asta anterior de la médula espinal, generando atrofia y debilidad muscular. La forma más común de la enfermedad está causada por mutaciones que afectan al gen de la SMN, dando lugar a una alteración del proceso de biogénesis de las snRNP. En la actualidad, se desconoce el mecanismo por el cual una mutación en la SMN, que causa un defecto general en el splicing, se manifiesta principalmente en una degeneración de las motoneuronas. Importancia clínica del correcto reconocimiento de las secuencias de splicing La secuencia de nucleótidos en la región de unión entre exones e intrones determina el correcto funcionamiento de la maquinaria de splicing de la célula. Si la secuencia consenso en este punto se ve alterada, el ARN no se procesa adecuadamente y su producto, normalmente una proteína, será defectuoso. En algunas ocasiones, esto puede conducir a ciertas patologías. De hecho, se estima que el 15% de las enfermedades genéticas se deben a mutaciones que afectan a puntos de splicing entre intrones y exones. Esto ocurre, por ejemplo, en algunos tipos de talasemia. Las talasemias son enfermedades genéticas causadas por la síntesis inadecuada de la hemoglobina, lo que provoca anemia en los individuos que la padecen. Se distinguen dos tipos de talasemias en función de la cadena de hemoglobina afectada: α-talasemias y β-talasemias. Las α-talasemias suelen producirse por pérdidas completas de material genético en la región de la α-globina. Las β-talasemias suelen estar asociadas a mutaciones que afectan a la regulación de la transcripción del gen de la β-globina o al procesamiento de su ARN. En concreto, algunas β-talasemias están asociadas a cambios en las regiones consenso de los sitios de unión exon-intrón, lo que provoca procesamientos anormales del ARN (fig. 8-16). FIGURA 8-16 Una mutación en un único nucleótido del primer intrón del gen de la cadena β de la hemoglobina puede afectar al patrón de splicing de su ARN, causando una β-talasemia. En la figura se muestra el caso de un paciente en el que la mutación (G → A) origina un nuevo sitio de splicing 3’ (ya que se genera una nueva secuencia consenso AG). Esto provoca un procesamiento anormal del ARN que resulta en la síntesis de una proteína defectuosa. Las alteraciones en el splicing también están implicadas en el desarrollo del cáncer. Si la maquinaria de splicing no funciona de manera adecuada, se pueden sintetizar transcritos extraños que darán lugar a proteínas no funcionales o con funciones potencialmente peligrosas para la célula. En diversos tipos de cáncer existen cambios en la selección de 371 los lugares de splicing en genes relacionados con la susceptibilidad a padecer cáncer o con la progresión tumoral. Las alteraciones en el splicing pueden conllevar la síntesis de proteínas con funciones protumorales. Alternativamente, pueden hacer desaparecer proteínas con capacidad supresora tumoral. Por ejemplo, existen mutaciones somáticas que afectan al splicing del ARN del gen NF1, un gen supresor tumoral frecuentemente alterado en neuroblastomas. El estudio del splicing anormal en cáncer podría tener importantes repercusiones en el manejo clínico de esta patología. En primer lugar, el conocimiento de los eventos de splicing específicos de tumores se podría utilizar para el desarrollo de biomarcadores de diagnóstico o pronóstico basados en la identificación de las variantes, ARN o proteína, propias del tumor. Al mismo tiempo, también podría servir para el desarrollo de nuevas estrategias terapéuticas, tales como la inmunoterapia con anticuerpos capaces de reconocer proteínas específicas del tumor. Splicing alternativo del ARN mensajero Algunos transcritos de ARN pueden tener distintos patrones de corte y empalme, de tal manera que un único ARN inmaduro puede dar lugar a varios ARN maduros. Este fenómeno, denominado splicing alternativo, se puede producir de modos muy variados (fig. 8-17). El splicing alternativo es un fenómeno muy frecuente que se da en más de la mitad de los genes humanos. FIGURA 8-17 A. Mediante splicing alternativo, un único pre-ARNm puede dar lugar a varios ARN maduros, cada uno de los cuales producirá una proteína con características distintas. En el ejemplo, el splicing alternativo de los exones 2 y 3 de un ARN primario da lugar a cuatro moléculas de ARN distintas, que a su vez producen cuatro proteínas distintas. B. Tipos principales de splicing alternativo. (Ilustración de: I. Baraibar.) 372 La importancia fisiológica del splicing alternativo es evidente. Como la secuencia del ARN maduro determina la secuencia de aminoácidos de la proteína final, el splicing alternativo permite la síntesis de distintas proteínas a partir de un único gen. De hecho, este proceso tiene una gran influencia en la diversidad proteica de los organismos superiores, ya que permite maximizar la capacidad codificante del genoma. Por ejemplo, a partir de un único gen, el splicing alternativo permite variar las características de una proteína a lo largo de las distintas fases del desarrollo o entre distintos tejidos (fig. 8-18). Aunque ya se han identificado muchos de los factores implicados en el proceso de splicing alternativo, todavía no se conocen con precisión los mecanismos de selección de los lugares de corte alternativos. FIGURA 8-18 La síntesis de α-tropomiosinas es un claro ejemplo de la diversidad proteica generada mediante splicing alternativo. Las α-tropomiosinas son proteínas esenciales para la contracción del músculo. Cada tipo muscular contiene un tipo distinto de αtropomiosina, pero todos ellos se obtienen a partir de un único gen, que da lugar a un único transcrito primario. Este transcrito primario es procesado de manera distinta mediante splicing alternativo, y origina proteínas con las características apropiadas para cada tejido. (Adaptado de: Nadal-Ginard B, et al. Adv. Enzyme Regul 1991;31:261-86. Ilustración de: I. Baraibar.) Para ilustrar la importancia del splicing alternativo, explicaremos brevemente la determinación sexual en la Drosophila melanogaster, una mosca utilizada frecuentemente en estudios genéticos que han ayudado a descubrir importantes genes en humanos. El regulador fundamental de la determinación sexual en esta mosca es la proteína Sxl (sex lethal). La proteína Sxl se expresa en las moscas hembras, reprimiendo eventos de splicing que permitirían el desarrollo de los caracteres masculinos. Sxl se puede clasificar funcionalmente como una proteína de unión al ARN. Las dianas moleculares de esta proteína son muy variadas, aunque aquí únicamente veremos dos ejemplos (fig. 8-19). Sxl puede unirse al transcrito primario del gen Tra (transformer). En ausencia de Sxl, la maduración de Tra da lugar a un ARN que codifica para una proteína Tra sin actividad, ya que contiene un codón de terminación prematuro. Sin embargo, en las moscas hembra, la proteína Sxl se une a un intrón de Tra, modificando la unión de la maquinaria de splicing. De esta manera, se produce un splicing que elimina el codón de terminación prematuro. Esto permite sintetizar una proteína Tra completa y activa. La proteína Tra es capaz de regular varios genes, activando patrones de splicing específicamente femeninos. 373 FIGURA 8-19 Regulación por splicing alternativo de dos genes fundamentales en la determinación sexual de la mosca Drosophila melanogaster: Transformer (Tra) y Male-specific lethal 2 (Msl2). La unión de la proteína Sxl al ARN de estos dos genes afecta a su splicing. La función de las isoformas proteicas originadas a partir de estos ARN determinará los caracteres sexuales del insecto. Sxl se expresa únicamente en las moscas hembra. (Ilustración de: I. Baraibar.) Otra diana de Sxl es Msl2 (male-specific lethal 2). Msl2 es una proteína importante para el desarrollo sexual de la mosca, ya que regula el nivel de expresión de los genes del cromosoma sexual X. Nuevamente, Sxl es capaz de modificar el splicing de Msl2. En las moscas hembra, Sxl está presente y es capaz de unirse al primer exón del transcrito primario de Msl2, bloqueando la unión de factores importantes para el splicing. En este caso, la maquinaria de splicing es incapaz de eliminar el intrón 1 del gen, lo que hace que la célula lo retenga en el ARN maduro. Como consecuencia de esto, en las moscas hembra, la proteína Msl2 contiene una secuencia adicional de aminoácidos, lo que modifica su actividad (v. fig. 8-19). Adición de la caperuza 5’ Durante el proceso de maduración, el extremo 5’ del ARN mensajero se modifica por la adición de un residuo de 7metilguanosina a través de un enlace 5’,5’-trifosfato (fig. 8-20). También es frecuente que se metilen los grupos 2’-OH de los dos nucleótidos adyacentes. Esta estructura, denominada caperuza 5’, aumenta la estabilidad del ARN, ya que no es reconocida por las ARNasas celulares. Además, la caperuza 5’ también está implicada en el transporte del ARNm al citoplasma y en la unión al ribosoma. 374 FIGURA 8-20 A. Estructura de la caperuza 5’ del ARNm maduro. A menudo, los nucleótidos adyacentes a la 7-metilguanosina están metilados en la posición 2’-OH. B. Adición de la cola poli(A) al ARNm inmaduro. Adición de la cola poli(A) La mayoría de los ARNm maduros contienen un extremo 3’ con una secuencia de 80-250 residuos de adenilato denominada cola poli(A). La secuencia de esta cola no está presente en el gen, sino que es añadida al transcrito de ARN mediante la acción de una endonucleasa y el complejo enzimático de la poliadenilato polimerasa, que se encarga de añadir los nucleótidos de adenina sin necesidad de un molde (v. fig. 8-20). Esta estructura protege al ARNm de la degradación y participa en su transporte al citoplasma. Algunos genes contienen más de una secuencia consenso de poliadenilación, lo que permite generar distintos polipéptidos mediante la elección de una u otra de las regiones. Un ejemplo de este sistema de control es el procesamiento diferencial del transcrito del gen de la calcitonina. El transcrito primario tiene dos sitios de poliadenilación; uno se utiliza predominantemente en el tiroides y el otro en el cerebro. Además, mediante splicing alternativo, en el cerebro se elimina un intrón que en la glándula tiroides se conserva. Esto da lugar a dos hormonas 375 distintas a partir del mismo gen: la calcitonina en el tiroides y el CGRP (o péptido relacionado con la calcitonina) en el cerebro. Maduración del ARN ribosómico y síntesis de los ribosomas Los transcritos primarios de ARNr también necesitan ser sometidos a diversas modificaciones químicas para dar lugar a los ARNr maduros. Este proceso tiene lugar en el nucléolo. Los transcritos de 45 S son cortados, empalmados y modificados por las ribonucleoproteínas nucleolares pequeñas (snoRNP, del inglés small nucleolar ribonucleoproteins). Los ARN nucleolares pequeños de las snoRNP se aparean con el transcrito primario por complementariedad de bases. Las snoRNP se sitúan principalmente en el CFD, mientras que en el CG, que rodea a los CF y a los CFD, se encuentran diversas partículas ribosómicas en distintas etapas de maduración. El ensamblaje y la actividad de los componentes que modifican el ARN prerribosómico es cotranscripcional (v. fig. 8-11) y tiene lugar en varios pasos (fig. 8-21). En las primeras etapas del procesamiento se producen modificaciones químicas que consisten en la metilación de ribosas, para dar lugar a 2’-O-metilribosas, y en el reemplazo de algunos residuos de uridina por seudouridina (ψ). Existen dos clases principales de snoARN: a) los snoARN con cajas C/D, y b) los ARN nucleolares pequeños con cajas H/ACA. Los snoARN C/D participan en la metilación-2’-O del pre-ARN y se unen a la proteína fibrilarina. Esta proteína, que aparece concentrada en el CFD, es la enzima que cataliza la metilación de ribosas. Los ARN nucleolares pequeños H/ACA se asocian a proteínas diferentes, como la disquerina, que cataliza la isomerización del residuo de uridina. Se considera que estas modificaciones facilitan el plegamiento y aumentan la estabilidad del ARNr. Además, los ARN nucleolares pequeños U3 y U14 (de clase C/D), junto con snR10 y snR30 (de clase H/ACA), intervienen en el procesamiento del ARNr 18 S. Los ARN nucleolares pequeños maduran en los cuerpos de Cajal, desde donde migran al nucléolo para llevar a cabo estas funciones. La disquerina, aparte de la función ya mencionada, también interviene en la actividad de la telomerasa, y determinadas mutaciones en el gen que codifica para esta proteína causan la disqueratosis congénita, una enfermedad genética rara que cursa con alteraciones de la médula ósea y trastornos cutáneos. FIGURA 8-21 Maduración de los ARN ribosómicos 28 S, 5.8 S y 18 S a partir de un único gen. (Ilustración de: I. Baraibar.) 376 La maduración final de los ARNr y su ensamblado con las proteínas ribosómicas ocurre principalmente en el CG del nucléolo (fig. 8-22). Un procesamiento endo- y exonucleolítico libera los ARNr del precursor policistrónico. Los ARNr 5.8 S y 28 S se unen al ARN 5 S (sintetizado fuera del nucléolo) y a unas 49 proteínas para formar la subunidad 60 S; por otro lado, el ARNr 18 S, junto con unas 33 proteínas, forman la subunidad 40 S. Ambas subunidades son exportadas por separado hacia el citoplasma, donde se unirán en el momento de la traducción proteica (v. capítulo 9). Los genes que codifican las proteínas ribosómicas se encuentran dispersos en el genoma, pero poseen promotores característicos y todos ellos incluyen una secuencia consenso de pirimidinas en el extremo 5’. Los ARNm de estas proteínas son de vida media relativamente corta, lo que obliga a su transcripción continua. Las proteínas ribosómicas llegan al núcleo en cantidades supraestequiométricas, y el exceso es ubiquitinado y degradado a través del proteasoma. FIGURA 8-22 Transcripción y procesamiento de los ARNr y ensamblaje de los ribosomas. Se destacan los tres subdominios del nucléolo. (Ilustración de: I. Baraibar y A. Calvo.) Algunas patologías se han relacionado con alteraciones del nucléolo y del procesamiento del ARNr, incluidas determinadas situaciones de estrés, infecciones víricas, enfermedades neurodegenerativas (como el síndrome de Werner), la disqueratosis congénita o el cáncer (como la leucemia aguda promielocítica). La composición proteica del nucléolo es variable y se modifica rápidamente bajo condiciones de estrés (daño del ADN, alteraciones en la nutrición, hipoxia, choque térmico, etc.). Diversas infecciones víricas afectan a la morfología nucleolar y a la producción de ribosomas, modificando tanto la cantidad de ribosomas que producen las células infectadas como el proceso de traducción proteica. También se alteran las vías de procesamiento, con la acumulación de intermediarios que normalmente no se encuentran en el nucléolo; así, se reduce el nivel de metilación del ARNr y se redistribuye la fibrilarina fuera del nucléolo. Las proteínas nucleolina y nucleofosmina, localizadas en el nucléolo, contribuyen a la intensa coloración del nucléolo en la interfase. Ambas proteínas aumentan anormalmente su expresión en las células cancerosas, lo que explica que las alteraciones nucleares y nucleolares sean utilizadas por los patólogos para el diagnóstico del cáncer. En 377 algunas líneas tumorales, la relación CF/CFD aumenta, junto con la producción de ARNr y la acumulación de material prerribosómico. Maduración del ARN de transferencia Las células contienen unos 40-50 tipos de ARNt que se transcriben a partir de genes repartidos a lo largo de todo el genoma. En general, todos los ARNt maduros proceden de precursores más largos que sufren degradaciones en ambos extremos por acción de diversas nucleasas. En el procesamiento del ARNt participan algunas ribozimas, como la ARNasa P que elimina secuencias de ARN del extremo 5’. También se pueden dar eliminaciones de intrones por acción de determinadas endonucleasas. Además, se añade el trinucleótido CCA en el extremo 3’. Esta estructura es esencial para la traducción, ya que es el lugar de unión del aminoácido entrante. La adición del trinucleótido es llevada a cabo por la ARNt nucleotidiltransferasa (fig. 8-23). FIGURA 8-23 Etapas en la maduración del ARN de transferencia. (Ilustración de: I. Baraibar.) 378 El ARNt también se caracteriza por una alta frecuencia de modificaciones en sus bases nitrogenadas. Se conocen más de 60 tipos de bases modificadas en los ARNt: por procesos de metilación, desaminación o reducción, entre otros. 379 Metabolismo del ARN maduro Transporte del ARN del núcleo al citoplasma Los ARN maduros llevan a cabo sus funciones en el citosol. Por ello, tras el proceso de maduración, el ARN activo debe ser transportado fuera del núcleo. En general, los ARN forman complejos de ribonucleoproteínas y son trasladados al citoplasma a través de los poros nucleares. Uno de los mecanismos más conocidos es el transporte dependiente de la proteína Ran-GTPasa (fig. 8-24). FIGURA 8-24 Transporte de moléculas de ARN del núcleo al citoplasma mediante el sistema de transporte dependiente de Ran. Los ARN unidos a proteínas en complejos ribonucleoproteicos se unen a la exportina y a Ran-GTP para atravesar los poros nucleares. Una vez en el citoplasma, se induce la actividad GTPasa de Ran, generándose Ran-GDP, lo que provoca la liberación de la ribonucleoproteína. Este mecanismo es muy utilizado en el transporte de los ARN al citoplasma, aunque no es el único. (Ilustración de: I. Baraibar.) Estabilidad y degradación del ARN Las moléculas de ARN tienen vidas medias relativamente cortas, en claro contraste con la gran estabilidad del ADN. Esto es reflejo de sus distintas funciones en la célula. Mientras que el ADN debe almacenar y transmitir la información del genoma, una molécula de ARN tiene funciones más concretas en el tiempo, y tras su eliminación puede ser nuevamente reemplazada si vuelve a ser necesaria. Esto explica también la importancia de la actividad correctora durante el proceso de replicación del ADN y la existencia de complejos sistemas de detección y reparación de daños en la doble hebra. Ninguno de estos procesos tiene lugar en el ARN. De hecho, las células disponen de sistemas de reconocimiento para la degradación inmediata de las moléculas de ARN defectuosas. La eliminación de las moléculas de ARN tiene lugar en el citoplasma y es llevada a cabo por ribonucleasas. Estas enzimas catalizan la hidrólisis del ARN y liberan nucleótidos que pueden ser reutilizados para la síntesis de nuevos ácidos nucleicos. Existen grandes diferencias de estabilidad entre las moléculas de ARN. Esto es especialmente patente en los ARNm. La vida media de algunos ARNm puede ser de unos pocos minutos, mientras que la de otros puede sobrepasar los días. Diversos factores afectan a la estabilidad del ARN, muchos de los cuales todavía son poco conocidos. Los micro-ARN y su importancia en la fisiología humana 380 Uno de los más recientes avances en el conocimiento del control de la expresión génica ha sido el descubrimiento los micro-ARN. Los micro-ARN son pequeñas moléculas de ARN de 18-24 nucleótidos capaces de unirse por complementariedad de bases a los ARN mensajeros. Cuando un micro-ARN se une a su ARNm diana induce su degradación o bloquea su traducción a proteína. Los primeros micro-ARN fueron descritos en C. elegans, un gusano muy utilizado en investigación biomédica. Estos micro-ARN son fundamentales para el desarrollo normal del animal. Desde principios del siglo xxi el estudio de los micro-ARN en la fisiología y patología humana ha crecido de manera exponencial. Los micro-ARN se transcriben por la ARN polimerasa II o la III en forma de largos precursores que, a través de una serie de procesamientos postranscripcionales (tanto nucleares como citoplasmáticos), dan lugar a los micro-ARN maduros. Se estima que en el genoma humano existen aproximadamente 1.000 micro-ARN distintos. Dependiendo de su secuencia, cada uno de ellos tendrá unas dianas de ARNm concretas. Se calcula que aproximadamente el 30% de los ARNm están controlados por micro-ARN. Las implicaciones fisiológicas de estas pequeñas moléculas están solo empezando a vislumbrarse. Existen trabajos que demuestran su participación en procesos como el crecimiento celular, la diferenciación, la consolidación de la memoria, la apoptosis o la respuesta inmunitaria. También se han encontrado alteraciones en la función de los micro-ARN en diversas situaciones patológicas. En concreto, multitud de micro-ARN presentan una expresión alterada en cáncer. Algunos de ellos tienen un papel oncogénico, mientras que otros actúan como genes supresores tumorales. El descubrimiento de este nuevo sistema de regulación de la expresión génica y su implicación en el desarrollo de enfermedades ha abierto nuevas perspectivas para el diseño de tratamientos y sistemas diagnósticos. Lecturas recomendadas Boisvert FM, Van Koningsbruggen S, Navascués J, Lamond AI. The multifunctional nucleolus. Nat Rev Mol Cell Biol. 2007 Jul;8:574–585. Cook A, Bono F, Jinek M, Conti E. Structural biology of nucleocytoplasmic transport. Annu Rev Biochem. 2007;76:647–671. Esteller M. Non-coding RNAs in human disease. Nat Rev Genet. 2011;12:861–874. Fedor MJ, Williamson JR. The catalytic diversity of RNAs. Nat Rev Mol Cell Biol. 2005;6:399–412. Li B, Carey M, Workman JL. The role of chromatin during transcription. Cell. 2007;128:707–719. Nizami Z, Deryusheva S, Gall JG. The Cajal body and histone locus body. Cold Spring Harb Perspect Biol. 2010;2:a000653. Pajares MJ, Ezponda T, Catena R, Calvo A, Pio R, Montuenga LM. Alternative splicing: an emerging topic in molecular and clinical oncology. Lancet Oncol. 2007;8:349–357. Portela A, Esteller M. Epigenetic modifications and human disease. Nat Biotechnol. 2010;28:1057–1068. Salz HK. Sex determination in insects: a binary decision based on alternative splicing. Curr Opin Genet Dev. 2011;21:395–400. 381 Venters BJ, Pugh BF. How eukaryotic genes are transcribed. Crit Rev Biochem Mol Biol. 2009;44:117–141. Preguntas de autoevaluación 1. Respecto al transcrito primario, es cierto que: a. Contiene tanto intrones como exones. b. Se sintetiza en el citoplasma. c. Toda su secuencia es codificante. d. Contiene bases modificadas. e. Es un ácido nucleico de doble hebra. Respuesta correcta: a. 2. La ARN polimerasa: a. Tiene actividad correctora de pruebas. b. Necesita un cebador para poder iniciar el proceso de polimerización. c. Sintetiza una molécula de ARN complementaria a la hebra molde. d. Incorpora desoxinucleósidos trifosfato a la molécula de ARN. e. Sintetiza la molécula de ARN en dirección 3’ → 5’. Respuesta correcta: c. 3. El promotor de un gen es: a. Una secuencia de ARN que regula su plegamiento. b. Una secuencia de ADN que se encuentra en la región 3’ del gen. c. Una secuencia codificante. d. Una región del ADN que regula su expresión. e. Un conjunto de factores de inicio de la transcripción. Respuesta correcta: d. 4. Los factores de transcripción son: 382 a. Enzimas con actividad endonucleasa que participan en la fase de elongación de la transcripción. b. Secuencias consenso en el promotor de un gen. c. Proteínas que forman parte del espliceosoma y participan en el splicing. d. Enzimas que intervienen en la remodelación de la cromatina. e. Proteínas que se unen al ADN y regulan la expresión de un gen a nivel de su transcripción. Respuesta correcta: e. 5. Para que se produzca la transcripción es necesario que: a. Los factores de transcripción recluten a la ARN polimerasa. b. La cromatina esté en forma de heterocromatina. c. Las histonas estén desacetiladas. d. El promotor esté hipermetilado. e. Se haya producido el proceso de corte y empalme. Respuesta correcta: a. 6. ¿Cuál de estos ARNr no se transcribe en el nucléolo?: a. 28 S. b. 18 S. c. 5.8 S. d. 5 S. e. Todos los ARNr se transcriben en el nucléolo. Respuesta correcta: d. 7. Indique cuál de los siguientes procesos tiene lugar en la maduración del ARN: a. Corrección de los nucleótidos incorporados erróneamente. b. Eliminación de secuencias no codificantes. c. Hipermetilación de islas CpG. d. Unión a factores de transcripción. e. Incorporación de la 7-metilguanosina en el extremo 3’. 383 Respuesta correcta: b. 8. Los complejos snRNP son importantes en el proceso de corte y empalme de los intrones: a. Del grupo I. b. Del grupo II. c. Cuya eliminación está mediada por el espliceosoma. d. Cuya eliminación está mediada por endonucleasas. e. Todos ellos. Respuesta correcta: c. 9. Son elementos importantes en la maduración del ARN ribosómico: a. Las snoRNP. b. Los factores de transcripción basales. c. Los micro-ARN. d. El complejo multiproteico SWI/SNF. e. Las ADN metiltransferasas. Respuesta correcta: a. 10. En una célula cancerosa, la expresión de un gen supresor tumoral puede verse comprometida por: a. La pérdida de material genético en su región cromosómica. b. La hipermetilación de su promotor. c. La sobreexpresión de un micro-ARN que se une al ARNm del gen supresor. d. La aparición de mutaciones en regiones consenso de splicing. e. Todas ellas. Respuesta correcta: e. 384 CAPÍTULO 9 385 Síntesis y modificación de proteínas Igor Hernández Alfonso Calvo Objetivos de aprendizaje • Entender cómo se transfiere la información genética almacenada en el ADN a una secuencia de aminoácidos para constituir una proteína funcional. • Conocer los aspectos moleculares de la síntesis proteica y los elementos fundamentales para llevarla a cabo. • Comprender la importancia de las modificaciones postraduccionales en la funcionalidad de las proteínas. • Conocer algunas enfermedades que se producen por alteración de procesos de síntesis o modificación postraduccional de las proteínas. 386 Introducción En capítulos anteriores se ha explicado cómo el ADN almacena y conserva la información genética, y cómo el ARN transmite esa información desde el núcleo hasta la maquinaria citoplasmática, donde se traduce a una secuencia de aminoácidos que constituyen las proteínas, que son las que ejecutan propiamente las funciones celulares. Los mecanismos de síntesis (traducción proteica) y las modificaciones postraduccionales que sufren las proteínas en los organismos eucariotas son algo distintos a los de los procariotas. Ya que el objeto del presente libro es el estudio de la célula eucariota humana, obviaremos en este capítulo lo referente a organismos procariotas. Las proteínas son un conjunto ordenado y secuencial de aminoácidos que forman una cadena polipeptídica y se organizan tridimensionalmente en el espacio. Todas las proteínas, tanto las de células procariotas como las de eucariotas, están construidas a partir del mismo conjunto de 20 aminoácidos (fig. 9-1). Las células pueden producir proteínas con propiedades y actividades diferentes uniendo los mismos 20 aminoácidos y dando lugar así a multitud de combinaciones y secuencias distintas. De esta manera, se pueden fabricar polipéptidos tan diversos como enzimas, hormonas, anticuerpos, proteínas estructurales del citoesqueleto, etc. FIGURA 9-1 Estructura de los 20 aminoácidos. Los aminoácidos situados dentro del recuadro azul corresponden a aminoácidos no polares; los del recuadro verde, a polares; los del recuadro naranja, a básicos, y los del recuadro violeta, a ácidos. Los nombres de los aminoácidos se muestran en los tres códigos comúnmente aceptados: nombre completo, código de tres letras y código de una letra. (Ilustración de: E. Maldonado.) 387 Todos los aminoácidos tienen una estructura característica: contienen un grupo carboxilo y un grupo amino unidos al mismo átomo de carbono (fig. 9-2). Este átomo de carbono se denomina α y establece enlaces con un hidrógeno y una cadena lateral (o grupo R), que es lo que diferencia a cada uno de los aminoácidos, confiriéndoles sus propiedades físico-químicas características. Para formar una proteína, los aminoácidos se unen entre sí formando un enlace amida sustituido, denominado enlace peptídico (v. fig. 9-2). Estos enlaces permiten la libre rotación de los átomos que unen, lo cual confiere a las cadenas polipeptídicas una gran flexibilidad tridimensional. FIGURA 9-2 A. Estructura genérica de un aminoácido. B. Formación de un enlace peptídico entre dos aminoácidos. 388 Maquinaria para la síntesis proteica Para construir la cadena de aminoácidos que es propia de cada proteína se necesitan principalmente tres elementos: el ARN mensajero (ARNm), los ribosomas y distintos ARN de transferencia (ARNt) que transportan cada uno de los aminoácidos que se van a ir incorporando a la proteína, según tiene lugar su proceso de síntesis. Los ribosomas se unen a un ARNm para «leer» su información genética e incorporar secuencialmente ARNt cargados (cada uno de ellos) con un aminoácido específico, a partir de los cuales se construye la proteína. Normalmente, varios ribosomas «leen» de modo secuencial la información genética contenida en un mismo ARNm, lo cual resulta en un proceso altamente eficaz de traducción (fig. 9-3). Al microscopio electrónico de transmisión se puede observar este conjunto de ribosomas en proceso de traducción de un mismo ARNm, formando lo que se conoce como polirribosomas o polisomas. El número de ribosomas unidos a cada ARNm depende de la longitud del ARNm; en un ARNm de unos 300 nm aparecerían unos 10 ribosomas. Para la traducción de las proteínas los ribosomas recorren el ARNm en sentido 5’ → codones) 3’. Por se cada incorpora tres nucleótid un aminoácido os qu e recor al polipéptido en formación. Una vez que ha terminado el proceso de síntesis, los ribosomas se separan del ARNm y la proteína recién sintetizada queda libre. FIGURA 9-3 Estructura de los ribosomas y polirribosomas. A. Esquema de la estructura y subunidades de un ribosoma de 80 S. B. Representación de un polirribosoma (o polisoma) donde se muestran diferentes ribosomas en proceso de traducción de un mismo ARNm. C. Imagen de microscopía electrónica de polisomas. La flecha negra indica polisomas en una cisterna de RER; las flechas rojas indican polisomas libres en el citoplasma. (Ilustraciones de: E. Maldonado; C, procedente de: Vázquez JJ, López Díez del Corral J. Citología Práctica. Pamplona: Eunsa; 1981.) ARN mensajero El ARNm contiene, como hemos indicado, la información genética acerca de la secuencia de aminoácidos que se va a incorporar a la proteína; es decir, es el molde a partir del cual se sintetiza cada proteína. Consiste en una secuencia monocatenaria en cuyo extremo 5’ hay un nucleótido guanina metilado a modo de caperuza y en cuyo extremo 3’ existe una cadena de adeninas denominada cola poli-A (v. capítulo 8). No toda la secuencia del ARNm es utilizada 389 como patrón para la síntesis de la proteína, sino que esta queda delimitada por la porción comprendida entre el triplete de nucleótidos que constituye el codón de iniciación y el triplete que constituye el codón de parada. Ribosomas Los ribosomas, unidades estructurales donde se lleva a cabo el proceso de traducción, son ribonucleoproteínas formadas por varios ARN ribosómicos (ARNr) asociados a un conjunto de proteínas (v. fig. 9-3). Los ribosomas de células eucariotas poseen una velocidad de sedimentación de 80 S, y están formados por dos subunidades: la subunidad pequeña (o menor) posee una velocidad de sedimentación de 40 S y contiene un único ARNr de 18 S y unas 30 proteínas; la subunidad grande (o mayor) posee una velocidad de sedimentación de 60 S y contiene 3 ARNr (de 28 S, 5,8 S y 5 S) y alrededor de 45 proteínas. Los ribosomas de procariotas tienen una velocidad de sedimentación de 70 S. La subunidad mayor, de 50 S, contiene una molécula de ARNr de 23 S y otra de 5 S, junto a 34 proteínas. La subunidad menor posee un ARNr de 16 S y 21 proteínas. Como se analizó en el capítulo 8, la síntesis de los distintos ARNr y el ensamblaje de las ribonucleoproteínas que forman el ribosoma tienen lugar en el nucléolo. Cada una de las subunidades formadas en el nucléolo (mayor y menor) sale de forma separada del núcleo y es exportada al citoplasma; las subunidades se unirán entonces entre sí y con el ARNm cuando tenga lugar la traducción de las proteínas. Los ribosomas se pueden encontrar libres en el citoplasma o adosados al lado citoplasmático de la membrana del retículo endoplasmático rugoso (RER), ya que muchas proteínas son sintetizadas y a la vez incorporadas al interior de este orgánulo. Como se estudia en el apartado «Transporte y localización de las proteínas», el hecho de que una proteína se sintetice en el citoplasma o en el RER determinará su localización final en la célula. También existen ribosomas en las mitocondrias, ya que estos orgánulos pueden realizar su propia síntesis de proteínas (v. capítulo 11). Pero en este caso, los ribosomas son diferentes a los citoplasmáticos, ya que poseen una velocidad de sedimentación de 55-60 S, con una subunidad mayor de 35 S (que contiene un ARNr de 16 S semejante al de los ribosomas de procariotas, y otro de 4 S) y una subunidad menor de 25 S (con un ARNr de 12 S). Los ribosomas mitocondriales son parecidos a los de los organismos procariotas no solo en cuanto a su estructura, sino también en lo referente a su sensiblidad a antibióticos y fármacos inhibidores de la traducción (v. capítulo 11). ARN de transferencia Los ARNt son las moléculas encargadas de suministrar los aminoácidos necesarios para construir las proteínas (v. capítulo 8). Los ARNt son ARN relativamente pequeños (4 S), formados por una sola hebra de ARN plegada sobre sí misma en una estructura tridimensional que se suele representar en forma de hoja de trébol (fig. 9-4). Los ARNt tienen entre 73 y 93 nucleótidos y están organizados en cuatro brazos, de los cuales dos son críticos para su función: por una 390 parte el brazo que se une al aminoácido, en el extremo 3’ del ARNt, que termina siempre con la secuencia trinucleotídica CCA. El aminoácido queda unido por un enlace éster de su grupo carboxilo al grupo hidroxilo 2’ o 3’ del residuo adenosina (A) terminal del brazo del aminoácido. Por otra parte, el brazo del anticodón (situado en el extremo opuesto al brazo que se une al aminoácido) posee la secuencia trinucleotídica específica complementaria a un codón en el ARNm, que determina el aminoácido que se debe unir al ARNt. Cada anticodón (y por lo tanto cada ARNt) es específico para un aminoácido, aunque como se verá más adelante, algunos aminoácidos son reconocidos y unidos por dos o más ARNt. Otro de los brazos del ARNt se encarga de la unión del ARNt al ribosoma y se denomina lazo T, debido a que contiene la base T (ribotimina), que forma parte de la secuencia: T-ψ-C; la base designada como ψ es una base poco común, cuya denominación es la de seudouridina. Finalmente, hay un brazo del ARNt que reconoce la enzima aminoacil-ARNt sintetasa (v. más adelante), denominado lazo D, que contiene dos bases D (dihidrouridina). FIGURA 9-4 Esquema de la estructura y partes de los ARNt. D, dihidrouridina; Gm, metilguanosina; I, inosina; mI, metilinosina; T, ribotimina; ψ, pseudouridina. 391 Código genético Una vez descritos los elementos necesarios para llevar a cabo las síntesis de las proteínas, surge una importante pregunta: ¿de qué modo se traduce la información genética contenida en el lenguaje de 4 «letras» de los nucleótidos ACG y T (U al ser ARN) de los ácidos nucleicos al lenguaje de 20 «letras» de los aminoácidos de las proteínas? La respuesta está en combinaciones diferentes de los cuatro nucleótidos. Las cuatro letras del ARNm en grupos de dos solo pueden dar 16 combinaciones (4 ), que es un número insuficiente para abarcar todos los aminoácidos (20); por lo 2 tanto, la respuesta tiene que estar en la agrupación de las 4 letras en grupos de tres, con un resultado de 64 combinaciones posibles (4 ). Las agrupaciones de tres nucleótidos en el ARNm se conocen como codones. La secuencia 3 de cada codón es complementaria a la de un anticodón presente en un determinado ARNt, que a su vez se asocia con un aminoácido específico. El ARNm es «leído» por la maquinaria de traducción como una secuencia de codones. Cada codón determinará la incorporación de un aminoácido a la proteína, de tal manera que la secuencia de codones del ARNm se traducirá en una secuencia de aminoácidos que compondrán la proteína. Este código de información es lo que se conoce como código genético (fig. 9-5). FIGURA 9-5 Tabla del código genético. Los tripletes del codón del ARNm indican qué aminoácido se incorporará a la proteína en proceso de traducción; algunos codones indican parada y finalización de la traducción. Como se puede observar, existen más codones disponibles que aminoácidos posibles. Este hecho confiere al código genético una característica fundamental, a la que se denomina degeneración, lo que significa que un aminoácido determinado puede ser codificado por más de un codón. Es importante subrayar que degenerado no significa imperfecto: el código genético no es ambiguo, porque ningún codón codifica más de un aminoácido. Cuando un aminoácido tiene varios codones que pueden codificarlo, la diferencia entre los codones se encuentra normalmente en la tercera base. Las dos primeras letras de cada codón son, por lo tanto, determinantes primarios de la especificidad. Las reglas que rigen la especificidad en la unión de un codón del ARNm y del anticodón en un ARNt fueron establecidas por Francis Crick y se exponen a continuación: 392 • Las primeras dos bases de un codón forman enlaces fuertes con sus pares correspondientes, las dos últimas bases del anticodón. • Cuando la primera base del anticodón es C o A, la fijación a la tercera base del codón es específica y solo se reconoce un codón por parte de dicho ARNt. Cuando, en cambio, la primera base del anticodón es U o G, la fijación a la tercera base del codón es menos específica, pudiendo reconocerse dos codones por parte del ARNt. Por último, cuando la inosina (un tipo de nucleósido modificado presente en el ARNt) es la primera base del anticodón, la unión con el tercer nucleótido del codón es muy débil y el ARNt puede reconocer hasta tres codones. • Cuando un aminoácido es codificado por varios codones diferentes, los codones que difieren en cualquiera de las dos primeras bases requieren ARNt diferentes. Teniendo en cuenta los enunciados anteriores, se requiere un mínimo de 32 ARNt para traducir los 61 codones del código genético. Los tres codones restantes no son reconocidos por ningún ARNt y se les conoce como codones de terminación, ya que señalan el final de la síntesis de la cadena proteica. 393 Proceso de síntesis proteica en los ribosomas Una vez descritos los elementos esenciales que se requieren para la síntesis de proteínas y los mecanismos necesarios para «leer» la información genética contenida en el ARNm, procederemos a explicar el proceso de traducción que tiene lugar en el ribosoma. Cabe destacar que, aunque los ribosomas, el ARNm y los ARNt son tres elementos claves para esta función, la traducción implica también la participación de un conjunto de factores proteicos que son esenciales para que tenga lugar el proceso, denominados «factores de iniciación, elongación y terminación». Para que pueda realizarse la síntesis proteica, primeramente cada ARNt debe acoplarse con su aminoácido correspondiente. Los pasos de este proceso son los siguientes (fig. 9-6, A): • Activación de un aminoácido mediante su unión a AMP, formándose un intermediario aminoacil-AMP; esta reacción requiere de ATP. • Unión del aminoacil-AMP al ARNt en la secuencia terminal CCA del brazo de unión al aminoácido, liberándose el AMP y formándose un aminoacil-ARNt. FIGURA 9-6 Cada uno de los ARNt lleva unido un aminoácido específico. A. El proceso de unión tiene lugar primeramente por la formación de un aminoacil-AMP (1) y posteriormente por la formación de un aminoacil-ARNt (2), reacciones que implican la actuación de aminoacil-ARNt sintetasas, con el correspondiente consumo de energía. B. Se representa como ejemplo la aminoacil-ARNt sintetasa específica para histidina y su actividad para unir la histidina a su ARNt correspondiente. Ambas reacciones son catalizadas por una enzima aminoacil-ARNt sintetasa específica para cada uno de los aminoácidos, la cual reconoce a su aminoácido correspondiente. Esto es posible porque cada una de estas enzimas posee un centro activo en el que encaja solamente un aminoácido determinado; es decir, existen (al menos) 20 aminoacil-ARNt sintetasas distintas para reconocer a cada uno de los 20 aminoácidos (v. ejemplo en la figura 9-6, B). Una vez que los aminoácidos están unidos a su ARNt correspondiente, la subunidad menor del ribosoma se anclará al ARNm que se va a traducir para que, tras la unión de la subunidad mayor, puedan entrar en un sitio preciso del ribosoma los distintos ARNt cuya secuencia anticodón sea complementaria a la del codón del ARNm en ese sitio del 394 ribosoma (v. proceso en detalle más adelante). Por su parte, la subunidad mayor del ribosoma será la encargada de catalizar la formación de los enlaces peptídicos en el polipéptido emergente. Ambas subunidades poseen unos dominios internos que permiten alojar a los ARNt a lo largo de las diferentes fases de la síntesis proteica (fig. 9-7, A). El sitio A hace referencia al sitio de unión del aminoacil-ARNt que entra inicialmente en el ribosoma. El sitio P es el lugar que ocupa el aminoacil-ARNt una vez que se ha unido a la cadena polipeptídica en crecimiento (peptidil-ARNt). El sitio E corresponde al lugar de salida (exit) del ARNt que ha transferido la cadena polipeptídica en formación y se dispone a abandonar el ribosoma. El proceso de traducción se puede dividir en tres pasos muy definidos: FIGURA 9-7 A. Sitios de la subunidad ribosómica menor: E (Exit), P (Peptidyl), A (Aminoacyl). B. Factores de iniciación que se unen tanto al ARNt como a la subunidad menor del ribosoma y al ARNm para comenzar el proceso de traducción. (Ilustración de: E. Maldonado.) Iniciación Durante esta fase, la subunidad menor del ribosoma se une al ARNm (figs. 9-7, B y 9-8, fase 1). La traducción en células eucariotas siempre comienza por el codón AUG, que codifica para la metionina (Met). El ARNt iniciador (que lleva unido el aminoácido Met) se une a la subunidad menor del ribosoma en el sitio P ayudado por el factor de iniciación eIF2 (eukayotic iniciation factor 2) unido a un GTP. Por su parte, la subunidad menor se asocia a los factores eIF1, eIF1A, eIF3 y eIF5. El ARNm también necesita unirse a varios factores: eIF4E, eIF4G (ambos asociados a la región 5’), eIF4A, eIF4B y PABP (poly A binding protein; proteína de unión a la cola poli-A). La unión de esta última proteína permite que la región 3’ del ARNm (que contiene la cola poli-A) se repliegue y quede junto a la región 5’. 395 FIGURA 9-8 Inicio del proceso de traducción. La subunidad menor del ribosoma se une al ARNt iniciador (que lleva el aminoácido metionina, Met) (1) y se desplaza por el ARNm (2) hasta que reconoce el codón de iniciación AUG, complementario al anticodón en el ARNt (3); la unión implica el acoplamiento de la subunidad mayor (4). (Ilustración de: E. Maldonado.) Tras la unión, el complejo de preiniciación formado por la subunidad menor del ribosoma y los factores nombrados, se desplaza por el ARNm (por la región 5’ UTR, del inglés 5’ untranslated region, que no se traduce) hasta que el codón de iniciación AUG es localizado sobre el sitio P del ribosoma (v. fig. 9-8, fases 2, 3); este proceso necesita un gasto energético en forma de ATP. Cuando el codón de iniciación es reconocido por el anticodón, el factor eIF5 provoca la hidrólisis del GTP presente en el factor eIF2. Entonces, los factores de iniciación (incluyendo el eIF2, que ahora está unido a GDP) se liberan y un nuevo factor denominado eI5B-GTP (no mostrado en el dibujo), mediante la hidrólisis del GTP, permite el anclaje de la subunidad mayor (fig. 9-8, fase 4). De esta manera, la maquinaria para la síntesis proteica queda preparada para la siguiente fase (v. fig. 9-8). 396 Elongación El segundo ARNt que entra en el ribosoma (p. ej., fenilalanina, Phe) precisa de la ayuda de dos factores proteicos de elongación (eukaryotic elongation factors) (eEF1A unido a GTP y eEF1B) para colocarse en el sitio A del ribosoma (fig. 99, fase 5). La correcta colocación de este aminoacil-ARNt en el sitio A produce un cambio de conformación que induce la hidrólisis del GTP del eEF1A, lo cual provoca la liberación de este factor (que ahora está unido a GDP). La energía liberada en la hidrólisis del GTP orienta el aminoácido unido al ARNt hacia el sitio P, donde se sitúa el primer aminoácido que se incorporó a la cadena (Met). La orientación de ambos aminoácidos en el ribosoma permite la formación del enlace peptídico mediante la actividad peptidil-transferasa que posee un ARNr perteneciente a la subunidad mayor del ribosoma, que funciona como una ribozima (v. capítulo 8). La cadena polipeptídica formada por sus dos primeros aminoácidos queda anclada al ARNt colocado en el sitio A (v. fig. 9-9, fase 6). Tras la formación del primer enlace peptídico, el ribosoma se desplaza en sentido 5’ → 3’d el aminoácidos (Met y Phe) queda ahora situado en el sitio P y el ARNt que llevaba inicialmente Met se sitúa en el sitio de salida (E). De este modo, el siguiente codón disponible del ARNm queda localizado en el sitio A. Estos desplazamientos reciben el nombre de «translocación» y requieren energía, que es suministrada por la hidrólisis de un GTP unido al factor eEF2. Este factor se une al ribosoma una vez que ha tenido lugar la catálisis del enlace peptídico y, además de proporcionar la energía necesaria para la translocación, también contribuye a la misma por medio de cambios conformacionales coordinados con el ribosoma. Cuando ha finalizado la translocación, se desprenden del ribosoma el factor eEF2 y el ARNt del sitio E, dejando al ribosoma preparado para una nueva ronda de elongación. 397 FIGURA 9-9 Elongación del proceso de traducción. Se produce la entrada de un nuevo ARNt con un segundo aminoácido (en este caso fenilalanina [Phe]) en el sitio A y se establece un enlace peptídico por el que se une el aminoácido metionina (Met) a la Phe en el sitio A (5, 6). Posteriormente, el ribosoma se desplaza en sentido 5´→ 3´ y el ARNt con el dipéptido queda en el sitio P, mientras que el ARNt que inicialmente llevaba Met queda en el sitio E (de salida). Se produce la entrada de un nuevo aminoácido (alanina [Ala]) en el sitio A. El proceso se repite con la incorporación de nuevos aminoácidos, completándose la generación de la cadena polipeptídica (7, 8). (Ilustración de: E. Maldonado.) Terminación Conforme avanza la elongación, quedan disponibles en el sitio A nuevos codones del ARNm y se añaden nuevos aminoácidos a la cadena polipeptídica en formación (fig. 9-9, fases 7 y 8) hasta que un codón de parada (UAA, UAG, UGA) alcanza el sitio A (fig. 9-10, fase 9). Las secuencias de parada en eucariotas son reconocidas por un dominio específico del factor de terminación eRF3 (eukaryotic release factor 3), que forma un complejo con otro factor de 398 terminación, eRF1. Una vez que este complejo proteico se une al ribosoma, se produce un cambio de conformación en dicho complejo que permite al factor eRF1 hidrolizar la proteína recién sintetizada y liberarla de su unión con el ARNt (v. fig. 9-10, fases 10 y 11). Posteriormente, la proteína recién formada y el factor de terminación se desprenden del ribosoma, terminando así la traduccion. Una vez concluida la síntesis, todavía el ARNt y el ARNm permanecen unidos al ribosoma. Será necesaria la actuación de un complejo proteico formado por varios factores para su escisión, aunque el mecanismo exacto por el cual tiene lugar este proceso no se conoce. FIGURA 9-10 Terminación del proceso de traducción. La aparición de uno de los codones de parada en el sitio A determina la unión de factores de terminación (9, 10), que favorecerán la liberación del polipéptido (11) y el desensamblaje del ribosoma (12). (Ilustración de: E. Maldonado.) La traducción proteica puede ser interrumpida mediante el uso de determinados compuestos químicos, como la puromicina, cuya estructura es parecida a la de un ARNt unido a un aminoácido. La cicloheximida es otro compuesto que impide la traducción proteica, ya que inhibe la actividad peptidil-transferasa de los ribosomas 80 S y se utiliza frecuentemente en experimentos bioquímicos para estudiar procesos celulares en los que se quiere analizar la ausencia de traducción. 399 La síntesis de proteínas es un proceso vital de todo organismo vivo, por lo que resulta lógica la escasez de enfermedades relacionadas con la disfunción de la maquinaria encargada de la síntesis proteica, ya que este defecto resultaría letal. Cualquier alteración significativa en sus componentes suele llevar a la muerte casi inmediata del individuo, antes incluso de que este rebase la fase embrionaria del desarrollo. No obstante, hay algunas enfermedades que se asocian con fallos estructurales de proteínas que participan en la traducción. Un ejemplo de este tipo de patologías es la anemia de Diamond-Blackfan, enfermedad congénita autosómica dominante que se manifiesta durante el período neonatal. Los individuos afectados sufren una aplasia eritroide (deformación de los eritrocitos que lleva a una rápida degradación). La mitad de los pacientes sufren síntomas adicionales que incluyen malformaciones craneofaciales, urogenitales, anomalías en las extremidades y defectos cardíacos, entre otros. Aunque esta patología se ha asociado a diversas alteraciones moleculares, en la mayor parte de los casos se debe a una mutación en el gen RPS19, que codifica diversas isoformas de una pequeña proteína ribosómica de entre 88 y 144 aminoácidos que se integra en la subunidad pequeña del ribosoma. No obstante, no se ha determinado todavía el mecanismo por el que esta alteración interfiere en el desarrollo normal del linaje eritropoyético y en el resto de las malformaciones descritas anteriormente. 400 Estructura tridimensional, plegamiento y localización de las proteínas Niveles estructurales de las proteínas La síntesis de la cadena polipeptídica es solo el primer paso para conseguir una proteína funcional. Las proteínas tienen que plegarse para adquirir una conformación tridimensional propia, que viene determinada por la secuencia de aminoácidos y por la interacción con otras cadenas polipeptídicas. Además, muchas proteínas necesitan otras modificaciones posteriores (llamadas modificaciones postraduccionales) para llegar a ser totalmente funcionales, como son su unión a carbohidratos o lípidos, la adición de determinados grupos químicos (fosfato, GTP, etc.) o sufrir fenómenos de proteólisis. En cualquier proteína se pueden distinguir tres (o en ocasiones cuatro) niveles de organización dentro de su estructura (fig. 9-11). FIGURA 9-11 Estructura primaria y secundaria de las proteínas. La secuencia de aminoácidos propiamente dicha determina la estructura primaria; las interacciones entre aminoácidos en posiciones contiguas de la cadena polipeptídica dan lugar a la estructura secundaria, formando hélices α o láminas β. Las estructuras terciaria y cuaternaria se forman a partir de la estructura secundaria (no se representan en el dibujo). (Ilustración de: E. Maldonado.) Estructuras primaria y secundaria La secuencia de aminoácidos propiamente dicha se denomina estructura primaria de la proteína. Las interacciones entre aminoácidos en posiciones contiguas de la cadena polipeptídica (a través de puentes de hidrógeno) conforman lo que se denomina la estructura secundaria. Los dos tipos de disposición más frecuentes que se establecen a partir de dichas interacciones son las hélices α y las láminas β (v. fig. 9-11). En una hélice α, una misma cadena polipeptídica gira sobre sí misma, dando lugar a una estructura helicoidal. En cambio, las láminas β son cadenas polipeptídicas agrupadas en un mismo plano y paralelas entre sí, que conforman una estructura plana. 401 Estructura terciaria La posición tridimensional final que adquiere la proteína, resultado de las interacciones entre las estructuras secundarias, da lugar a la estructura terciaria. Hay varias estructuras terciarias posibles, que pueden estar formadas solo por hélices α, solo por láminas β o por combinaciones de ambas. En los dos primeros tipos se forman muchas de las proteínas de tipo fibroso, mientras que el tercer tipo da lugar a proteínas globulares. Las proteínas fibrosas son resistentes e insolubles en agua y suelen realizar funciones estructurales. Las proteínas globulares suelen ser solubles en agua e intervienen en múltiples funciones. Aunque la conformación final de cada proteína es específica, ciertas combinaciones de hélices α y láminas β se empaquetan formando unidades comunes a diversas proteínas, cada una de las cuales se denomina dominio proteico. Las hélices α y láminas β quedan conectadas por «regiones en asa» que protruyen hacia la superficie del dominio. Las regiones en asa, de longitud variable y superficie irregular, a menudo forman lugares por donde la proteína se une a otras moléculas. Los dominios son las unidades básicas a partir de las cuales se construyen las proteínas, y existen numerosas familias de dominios. Mientras que las proteínas más pequeñas pueden presentar un solo dominio, las de mayor tamaño y complejidad presentan varios, normalmente conectados por cadenas polipeptídicas de longitud relativamente variable. Estructura cuaternaria Finalmente, los polipéptidos individuales se pueden asociar entre sí, constituyendo subunidades de moléculas mayores, a veces denominadas agregados moleculares o complejos proteicos, en los cuales las distintas subunidades están unidas entre sí por un elevado número de débiles interacciones no covalentes. Esto corresponde a la estructura cuaternaria de las proteínas. Un ejemplo de proteína con estructura cuaternaria es la hemoglobina, formada por dos cadenas polipeptídicas α y dos β. Plegamiento Como hemos indicado, a partir de la secuencia de aminoácidos, las cadenas polipeptídicas se pliegan espontáneamente adoptando una conformación particular para cada proteína. Esto es debido a que los esqueletos de los diferentes aminoácidos (los grupos R), a modo de cadenas laterales del eje proteico principal, se asocian entre sí y con las moléculas de H O circundantes, formando enlaces no covalentes débiles. Uno de los factores importantes que 2 condiciona el plegamiento de una proteína es la distribución de sus cadenas polares y no polares. Las cadenas laterales hidrófobas, muy abundantes, tienden a agruparse en el interior de la molécula, lo cual les permite evitar el contacto con el entorno acuoso. Por el contrario, las cadenas polares tienden a disponerse cerca de la parte externa de 402 la molécula proteica, donde pueden interactuar con el H O y con otras moléculas polares. De esta manera, se forma un 2 esqueleto fundamental de plegamiento que sirve de base para los ajustes finos posteriores. El plegamiento inicial se forma rápidamente y de modo espontáneo, de tal manera que los elementos principales (hélices α y láminas β) se disponen de una forma cercana al plegamiento correcto de la proteína. A este respecto cabe destacar la formación de puentes disulfuro, que se establecen entre los aminoácidos cisteína de la cadena polipeptídica, ya que es sumamente importante para el plegamiento y la estabilidad de muchas proteínas. Esta modificación tiene lugar en el RER (donde hay un ambiente oxidante) y es catalizada por la proteína disulfuro isomerasa (v. capítulo 10). En el proceso de ajuste fino del plegamiento (un proceso relativamente lento), se pueden producir plegamientos incorrectos que induzcan una agregación anómala de las proteínas. Para impedir los fenómenos de alteración en el plegamiento y la consiguiente agregación, la célula utiliza una familia de proteínas denominadas chaperonas. La función de estas proteínas consiste en ayudar a las proteínas recién sintetizadas a plegarse y ensamblarse en estructuras estables y activas. Las chaperonas se unen a las regiones hidrófobas expuestas de la proteína en fase de plegamiento y modifican zonas erróneamente plegadas. Además, estabilizan las proteínas que deben ser transportadas en forma parcialmente plegada desde el citoplasma a determinados orgánulos (como las mitocondrias) (v. capítulo 11). La actividad de las chaperonas es indispensable para asegurar un control de calidad de las proteínas celulares y para mantener la homeostasis proteica. Las chaperonas se identificaron inicialmente como una familia de proteínas cuya expresión aumentaba al someter a la célula a determinadas condiciones de estrés (como un aumento de temperatura), por lo que muchas de ellas se llaman proteínas de choque térmico (heat shock proteins, Hsp). Las estrategias de plegamiento que adopta la maquinaria de chaperonas del organismo se pueden dividir en dos: • Plegamiento cotraduccional. En eucariotas, un complejo asociado al ribosoma (RAC, del inglés ribosome-associated complex), formado entre otras proteínas por las chaperonas Hsp40 y 70, se une a la subunidad mayor del ribosoma con anterioridad a la salida del polipéptido. Desde esta posición, las chaperonas interactúan con los segmentos enriquecidos en residuos hidrófobos, tan pronto como salen del ribosoma. Conforme un complejo RAC se une a una primera zona hidrófoba de la proteína que está en fase de síntesis, otro complejo RAC se asocia con la subunidad mayor y se dispone a unirse a la siguiente porción hidrófoba que surja del ribosoma. De esta manera se evita una agregación prematura del polipéptido y se permiten su elongación hasta que haya suficiente información estructural que posibilite un plegamiento adecuado. • Plegamiento postraduccional. Solo el 20% de las proteínas se pliegan satisfactoriamente durante su síntesis. Si la proteína necesita rondas de plegamiento adicionales, queda unida a la chaperona Hsp70, que es el organizador central de la red de plegamiento. Junto con la Hsp90, la Hsp70 se une a las regiones hidrófobas de la proteína en sucesivas rondas de acoplamiento y desacoplamiento (con consumo de energía en forma de ATP) que permiten que la proteína intente diferentes plegados hasta alcanzar el conformacionalmente adecuado. Pero existe un conjunto de proteínas (generalmente las más voluminosas) con patrones de plegamiento muy complejos, debido a que es necesaria la interacción de dominios proteicos muy alejados entre sí. En estos casos, la proteína Hsp70 403 conduce a estos polipéptidos al sistema chaperonina TRiC/CCT (fig. 9-12). Este sistema consiste en un complejo multiproteico en forma de barril, en cuyo interior es introducida la proteína en fase de plegamiento, aislándola así de otras proteínas que pudieran interferir en este proceso, lo que permite que sus dominios puedan interaccionar libremente, sin peligro de formar agregados, hasta alcanzar la configuración adecuada. FIGURA 9-12 La proteína Hsp70 es clave en el proceso de plegamiento de las proteínas (con gasto de ATP, omitido en el dibujo). El plegamiento puede requerir la incorporación de la proteína al complejo multiproteico de la chaperonina (también con gasto de ATP), para mantenerla aislada del resto de proteínas. (Ilustración de: E. Maldonado.) Existen chaperonas en la mayoría de los compartimentos celulares, lo cual facilita el transporte de las proteínas a sus localizaciones funcionales y garantiza un adecuado plegamiento para la consecución de sus actividades. El incorrecto plegamiento de las proteínas en el RER da lugar a una respuesta de estrés denominada unfolded protein response (v. capítulo 10). Un plegamiento erróneo de las proteínas puede dar lugar a diversas patologías. Según se explicó en el capítulo 1, las encefalopatías espongiformes se deben a un plegamiento defectuoso de la proteína priónica. Los resultados experimentales indican que la acción patógena de los priones consiste en inducir en las formas sanas de la proteína un plegamiento alterado mediante un mecanismo todavía desconocido. Este proceso tiene lugar en una reacción en cadena que acaba por formar agregados proteicos que alteran el funcionamiento normal de las células, causando la muerte celular. La proteína priónica normal, denominada PrP tiene 209 aminoácidos, un peso molecular de 36 kDa y una c estructura secundaria formada principalmente por α-hélices (fig. 9-13). Su función exacta no se conoce, aunque se piensa que podría estar implicada en mecanismos de establecimiento de la memoria a largo plazo y de comunicación intercelular. La forma infecciosa y patógena de la proteína, denominada PrP , aunque posee la misma secuencia de Sc aminoácidos que la versión normal, adquiere un plegamiento defectuoso (por causas desconocidas) que genera un cambio en su estructura secundaria, con un elevado porcentaje de láminas β. El contacto de la proteína PrP con la Sc proteína PrP induce un cambio de conformación en la proteína PrP , que provoca que se convierta en patológica c c (PrP ). Las proteínas defectuosas se agregan en una estructura altamente ordenada que precipita en forma de placas. Sc El acúmulo de dichas placas provoca la muerte neuronal causando síntomas degenerativos, que incluyen convulsiones, demencia, ataxia y cambios de comportamiento y personalidad. A pesar de todo lo que se ha avanzado 404 en el estudio de la enfermedad, quedan todavía muchos aspectos por investigar; entre otros, el mecanismo molecular por el que se desarrolla la neurodegeneración y el mecanismo por el que la proteína priónica PrP consigue cambiar la Sc configuración de la proteína sana. FIGURA 9-13 Esquema de la estructura de plegamiento del prión normal (PrPC), que posee un 43% de su estructura en forma de hélices α. En cambio, la estructura del prión anormal (PrPsc) posee un plegamiento diferente, con una alta proporción de plegamiento en láminas β. (Ilustración de: E. Maldonado.) Transporte y localización de las proteínas Todas las proteínas empiezan a ser sintetizadas en el citosol, excepto las que son producidas en los ribosomas de las mitocondrias y de los plastos (en plantas). Su destino final depende de la presencia de una secuencia señal de aminoácidos, que dirige a las proteínas hacia determinadas localizaciones celulares. Muchas proteínas no presentan señales de clasificación y, en consecuencia, permanecen en el citosol de modo permanente. En aquellas que presentan estas señales, se pueden diferenciar dos tipos de secuencias señalizadoras: • Péptido señal: es una región continua de la secuencia de aminoácidos (entre 15-60 residuos de largo, normalmente). • Región señal: la señal está formada por una región estérica de la proteína que incluye varios péptidos señales que, situados en una disposición tridimensional característica cuando se pliega la proteína, constituyen la región señal. Los aminoácidos que pertenecen a la región señal pueden estar bastante distantes en la secuencia polipeptídica, y la región señal solo se forma tras el plegamiento de la proteína madura. Para determinar las distintas localizaciones celulares se utilizan diferentes tipos de péptido/región señal. Todas las secuencias señalizadoras de proteínas que tienen el mismo destino son funcionalmente intercambiables, aunque sus secuencias de aminoácidos pueden variar mucho. Se necesitan péptidos/regiones señales para aquellas proteínas que 405 se vayan a incorporar al interior del núcleo (v. capítulo 7), de las mitocondrias y peroxisomas (v. capítulo 11) y del RER (v. capítulo 10). Las proteínas cuyo destino final es el núcleo, las mitocondrias o los peroxisomas se incorporan a estos orgánulos una vez que se ha completado la síntesis proteica en el citosol. La translocación a estos orgánulos es, por lo tanto, de tipo postraduccional. En cambio, muchas proteínas comienzan su síntesis en el citosol pero, tras quedar expuesto un péptido señal en el polipéptido naciente durante la traducción proteica, son incorporadas al RER. Esto implica una parada temporal de la síntesis proteica que continúa más tarde, cuando el ribosoma ha quedado fijado a la membrana del RER y el polipéptido continúa su traducción, a la vez que se introduce en el interior del RER. En este caso, la translocación es de tipo cotraduccional, ya que tiene lugar al mismo tiempo que se lleva a cabo la síntesis de la proteína. De entre las proteínas que pasan por el RER, la mayoría de ellas serán conducidas (por medio de vesículas) al aparato de Golgi y, posteriormente, quedarán ancladas a la membrana plasmática o saldrán hacia el exterior celular. Algunas proteínas permanecen en el RER o en el aparato de Golgi, para lo cual necesitan tener péptidos/regiones señales específicas que las mantengan en dichos orgánulos, para no continuar así por la vía secretora (v. capítulos 9 y 10). 406 Modificaciones postraduccionales y regulación de la función proteica Las proteínas pueden requerir para su correcto funcionamiento la presencia de factores reguladores de carácter externo, como cofactores, otros complejos proteicos o factores físico-químicos del medio (p. ej., un pH determinado). Además de estos factores, pueden tener lugar cambios en la propia estructura de la proteína que regulan su actividad y que se conocen con el nombre de modificaciones postraduccionales. La importancia de estas modificaciones reside en el hecho de que modifican de modo muy importante la funcionalidad de la proteína, pudiendo cambiar su afinidad por un sustrato u otras proteínas, activar o inactivar su función catalítica, alterar su localización celular o provocar su degradación. Se han descrito numerosas formas de modificación postraduccional; a continuación, se describen aquellas modificaciones más frecuentes y mejor caracterizadas. Adición de grupos funcionales Fosforilación/desfosforilación Consiste en añadir o retirar un grupo fosfato (PO ) a proteínas que contienen serina, tirosina, treonina o histidina, 4 uniendo el fosfato a un grupo hidroxilo de estos residuos. La adición de un grupo fosfato está catalizada por proteínas quinasas (fig. 9-14) y la eliminación de dicho grupo, por fosfatasas. Por medio de la fosforilación se pueden activar o inactivar enzimas y modular su capacidad de interacción con otras proteínas. Esta modificación es especialmente relevante en proteínas que intervienen en fenómenos de señalización celular (v. capítulos 13 y 14). 407 FIGURA 9-14 Ejemplos de modificaciones postraduccionales. A. Fosforilación/desfosforilación de una proteína en un residuo tirosina. B. Proceso de miristoilación (una de las clases de acilación). (B, ilustración de: E. Maldonado.) Acetilación/desacetilación Esta modificación consiste en añadir un grupo acetilo sobre residuos lisina o serina aminoterminales de una proteína. Las enzimas acetiltransferasas y desacetilasas son las encargadas de catalizar estas reacciones. La acetilación/desacetilación tiene una gran importancia en las histonas (proteínas que empaquetan el ADN), ya que regulan su interacción con el ADN y, por lo tanto, el grado de compactación de la cromatina (v. capítulo 7). Esta modificación también regula la actividad de factores de transcripción, importinas nucleares y la α-tubulina. Metilación/desmetilación Mediante reacciones de metilación se añade uno o más grupos metilo a un residuo de lisina o arginina en una cadena polipeptídica. La reacción química que la lleva a cabo es una metiltransferasa, mientras que la reacción opuesta está catalizada por una amina oxidasa desmetilasa. La función tal vez más conocida es la que ejerce sobre la modulación de la expresión génica, a través de la metilación de histonas (v. capítulo 7), aunque también desempeña un papel importante asegurando la estabilidad de ciertas proteínas. 408 Acilaciones Es un tipo de modificación por la cual se añade una molécula de carácter lipídico a la proteína, lo que le permite anclarse a la membrana plasmática por el lado citosólico. Ejemplos de este tipo de modificación son la miristoilación sobre residuos de lisina o glicina, y la farsenilación o palmitoilación sobre residuos de cisteína (v. fig. 9-14). Glucosilación Es uno de los mecanismos de modificación postraduccional más frecuentes y consiste en la adición de un oligosacárido, o bien sobre el grupo amino de un residuo de asparragina (N-glucosilación, que tiene lugar en el RER), o sobre el grupo hidroxilo de una serina o una treonina (O-glucosilación, que ocurre en el aparato de Golgi). La glucosilación se da, por lo tanto, en proteínas que se traducen en el RER y pasan al aparato de Golgi, y desempeña un papel importante en la estabilidad proteica, en la hidratación de secreciones celulares y en el reconocimiento y adhesión célula-célula y célula-sustrato (v. capítulos 6 y 10). Adición de péptidos A este proceso se le denomina ubiquitinación y se lleva a cabo por medio de una pequeña cadena polipeptídica de 76 aminoácidos denominada «ubiquitina», presente en todas las células eucariotas y que está muy conservada a lo largo de la evolución. Esta pequeña proteína se une covalentemente a los residuos de lisina de las proteínas, regulando su actividad de múltiples maneras. La adición de ubiquitina requiere la actividad de una enzima denominada ubiquitina ligasa. Esta reacción es reversible, y la ubiquitina se puede sustraer de la proteína por la acción de una enzima denominada «isopeptidasa desubiquitinilante». Una proteína puede ser mono- o poliubiquitinada en una o más lisinas. La ubiquitinación cambia las propiedades funcionales de la proteína, los sustratos o complejos proteicos con los que puede interactuar, o incluso la posibilidad de que sea degradada. Generalmente, la poliubiquitinación de una proteína lleva a su degradación (v. más adelante). La monoubiquitinación puede influir en la actividad de algunas proteínas celulares. Un tipo similar de modificación es la adición de SUMO (small ubiquitin-related modifier) o SUMO-ilación, que actúa como marcador de localización y regulación de algunas proteínas. Cambio en la naturaleza química de los aminoácidos La hidroxilación es un tipo de modificación postraduccional donde se añade un grupo hidroxilo al anillo de una prolina. Esta reacción está catalizada por una prolilhidroxilasa y es de carácter reversible. Es una modificación 409 presente en las moléculas de colágeno que permite dar a las fibras colágenas la consistencia estructural necesaria para servir de soporte estructural de los tejidos de sostén (v. capítulo 6). Proteólisis Por medio de esta modificación, una proteína se escinde en uno o más fragmentos. Generalmente, la escisión suele producirse de tal manera que se separan dominios completos de la proteína que poseen por sí mismos una identidad funcional. Esta es una modificación postraduccional de gran importancia por su amplio abanico regulador, ya que permite la activación de dominios inactivos en la proteína completa (o viceversa), la interacción de estos con complejos moleculares en localizaciones lejanas a la original y la liberación de péptidos señalizadores (mediante peptidasas señal). La fragmentación proteica tiene lugar mediante proteólisis, que consiste en la rotura de enlaces peptídicos en una reacción catalizada por enzimas específicas denominadas proteasas. Existen numerosos tipos de proteasas que se suelen clasificar en función del agente que cataliza la ruptura del enlace peptídico. Así, se pueden distinguir proteasas de serina, treonina, cisteína, aspartato, glutámico y metaloproteasas. Un ejemplo de proteína que debe ser proteolizada para ser funcional es la insulina (fig. 9-15). Esta hormona se sintetiza como un precursor polipeptídico (preproinsulina) que debe ser fragmentado dos veces. La primera fragmentación elimina el péptido señal aminoterminal responsable de que la preproinsulina pase al RER para ser traducida. Además, en el RER se forman tres puentes disulfuros que pliegan la estructura de la molécula. Se forma así la proinsulina, que es fragmentada de nuevo en el aparato de Golgi y en los gránulos de secreción para dar lugar a dos cadenas polipeptídicas unidas por puentes disulfuro (insulina madura, de 51 aminoácidos; v. capítulo 10) más el péptido C de 31 aminoácidos (que era el fragmento conector y que sufre también proteólisis). FIGURA 9-15 Fragmentación de la insulina. Primeramente, se elimina de la preproinsulina la secuencia señal; en una segunda proteólisis se forman la proteína madura, que contiene dos cadenas (A y B) unidas por puentes disulfuro, y el polipéptido C (que corresponde al fragmento conector, que sufre a su vez proteólisis). Otras proteínas activadas por proteólisis son las enzimas digestivas (que se producen en forma de zimógenos precursores inactivos), proteínas que participan en la coagulación sanguínea, y proteínas de la familia de las caspasas (que necesitan proteolizarse para participar en los procesos de apoptosis, como se describe en el capitulo 15). 410 Las alteraciones celulares que conllevan anomalías en la modificación postraduccional y en la adecuada regulación y función de las proteínas dan lugar a diferentes patologías, entre las que se puede destacar el Alzheimer. La enfermedad de Alzheimer es una patología neurodegenerativa que se manifiesta en un deterioro cognitivo y trastornos conductuales. Se caracteriza en su forma típica por una pérdida progresiva de la memoria y de otras capacidades mentales, a medida que diferentes zonas del cerebro se atrofian por muerte neuronal. Las causas de esta enfermedad no han sido completamente esclarecidas, aunque existen varias hipótesis que apuntan a defectos en las modificaciones postraduccionales de dos proteínas: la proteína precursora de amiloide (APP, del inglés amyloid protein precursor) y la proteína asociada a microtúbulos tau. La APP es una proteína presente en la membrana plasmática de las neuronas, indispensable para su crecimiento y supervivencia. Esta proteína puede ser proteolizada por hasta tres enzimas distintas denominadas α, β y γ secretasas. Existen dos procesamientos posibles de la proteína (fig. 9-16). En el primero interviene la α-secretasa, que libera el fragmento extracelular al exterior (conocido como sAPPα), el cual posee propiedades neuroprotectoras. En cambio, la APP puede ser proteolizada secuencialmente por las β- y γ-secretasas, generando así un pequeño péptido de 42 aminoácidos (llamado Aβ ), que es responsable de la formación de las placas amiloides. Estos péptidos se agregan 42 rápidamente entre sí y se depositan sobre la matriz extracelular del tejido nervioso, dando lugar a formaciones microscópicamente densas conocidas como placas seniles (responsables de muchas de las alteraciones asociadas al Alzheimer), que pueden crecer continuamente por agregación de nuevos fragmentos Aβ . 42 FIGURA 9-16 Fragmentación de la proteína precursora de amiloide (APP, del inglés amiloid protein precursor). En un primer tipo de proteólisis interviene la α-secretasa, que libera el fragmento extracelular sAPPα. En cambio, la APP puede ser proteolizada secuencialmente por la β y la γ secretasas, generando así un pequeño péptido de 42 aminoácidos (llamado Aβ42), que es responsable de la formación de las placas amiloides del Alzheimer. La proteína tau es una proteína que, tras ser fosforilada, se une a las moléculas de tubulina que forman los microtúbulos de las neuronas y los estabiliza, posibilitando así el transporte de vesículas a través de dichos microtúbulos (v. capítulo 12). Por causas que se desconocen, la proteína tau sufre una hiperfosforilación aberrante 411 durante el desarrollo del Alzheimer, lo que lleva a su separación de la tubulina y a la agregación de las unidades hiperfosforiladas, formando los llamados ovillos neurofibrilares y provocando la desintegración del sistema de transporte de la neurona. Aunque no se sabe con certeza cuál de los defectos en estas dos proteínas puede originar la enfermedad (o cuál es más decisivo), parece claro que ambos fenómenos provocan la muerte de las neuronas por apoptosis y disparan la respuesta inflamatoria en el tejido circundante, lo que derivará en daños tisulares de mayor envergadura. 412 Degradación de proteínas Las proteínas tienen una tasa de recambio cuya velocidad depende de su naturaleza y función, por lo que, además de sintetizarse, deben destruirse. La vida media de las proteínas es muy variable (desde minutos, hasta días); además, si las proteínas tienen algún defecto en el plegamiento o están dañadas en su estructura, son reconocidas como defectuosas y degradadas. Existen dos mecanismos principales degradación, que se exponen a continuación. Degradación no selectiva Es la llevada a cabo por las hidrolasas presentes en los lisosomas. Los lisosomas reciclan los constituyentes celulares (incluidas las proteínas) al fusionarse con vacuolas autofágicas rodeadas de membrana proporcionada por el retículo, que contienen pequeñas áreas de citoplasma u orgánulos (v. capítulo 10). Degradación selectiva Requiere que las proteínas sean marcadas por medio de una modificación postraduccional que se ha comentado con anterioridad, la poliubiquitinación. Aquellas proteínas que no se pliegan correctamente, o que tienen errores estructurales, son reconocidas por las chaperonas celulares, activándose entonces el mecanismo de poliubiquitinación. La ubiquitina se une a la proteína diana mediante la actuación de tres enzimas distintas: a) la enzima activadora de ubiquitina (E1); b) la enzima conjugadora de ubiquitina (E2), y c) la enzima con actividad ligasa E3. La ubiquitina se activa primeramente mediante su unión a E1, en un proceso que requiere la hidrólisis de ATP. Posteriormente, se conjuga con E2 y entonces el complejo E2-ubiquitina se une a E3. El complejo ubiquitina-E2/E3 se une a la proteína diana, donde la enzima E3 transfiere el grupo ubiquitina a la proteína diana (fig. 9-17). Tras la primera ubiquitinación, la enzima E2 queda libre y otra enzima E2 unida a ubiquitina entra en su lugar, produciéndose de nuevo la transferencia de ubiquitina a la proteína diana (mediante la actividad de E3). El proceso se repite varias veces hasta que se obtiene una proteína diana poliubiquitinada. En una fase posterior, la proteína poliubiquitinada (que queda así marcada para su degradación) se desprende de E3 y es reconocida por un complejo multiproteico de degradación denominado proteasoma, que tritura las proteínas en un proceso que requiere energía en forma de ATP. El proteasoma posee varios tipos de actividades peptidasa que le permiten destruir cualquier proteína. El proceso de degradación mediante el sistema ubiquitina/proteasoma es importante también para regular el funcionamiento de algunas actividades celulares. Un ejemplo representativo es la destrucción de las ciclinas durante el ciclo celular. Cada una de las ciclinas se expresa cíclicamente en una fase concreta del ciclo celular para, después de unirse a su correspondiente Cdk, favorecer el paso hacia la siguiente fase del ciclo. Tras la actuación de los complejos Cdk-ciclina es necesario inactivar el sistema, lo que se consigue mediante proteólisis de las ciclinas en el sistema 413 ubiquitina/proteasoma (v. capítulo 14). Muchos tumores presentan una actividad del proteasoma mayor que la de las células normales, por lo que se han desarrollado inhibidores del proteasoma para el tratamiento del cáncer. Este es el caso de bortezomib, un inhibidor que se utiliza actualmente para el tratamiento del mieloma múltiple, un tipo de tumor de células plasmáticas en la médula ósea donde se producen grandes cantidades de inmunoglobulinas y se genera un importante estrés celular. Uno de los principales efectos de este fármaco es impedir la degradación en el proteasoma de un factor llamado IkB, cuyo papel es inactivar al factor NF-kB (factor de estrés que promueve el crecimiento tumoral). FIGURA 9-17 Degradación de proteínas por el complejo ubiquitina/proteasoma. La ubiquitina se une primeramente a la enzima activadora E1 (con gasto de ATP), que la transfiere a la enzima conjugadora de ubiquitina E2; la enzima con actividad ligasa E3 se une tanto al complejo ubiquitina-E2 como a la proteína diana. La poliubiquitinación secuencial, llevada a cabo por la cooperación de las enzimas E2/E3, marca la proteína para ser reconocida por el complejo multiproteico del proteasoma, donde la proteína diana es degradada. (Ilustración de: A. Calvo.) 414 Uso biomédico de proteínas recombinantes Muchas patologías implican alteración, carencia o insuficiencia de algún tipo de proteína. En algunas enfermedades es posible suministrar al paciente la proteína de la que carece, utilizando la tecnología del ADN recombinante (v. capítulo 2). Los avances experimentados en el campo de la biología molecular y el conocimiento preciso de la síntesis y modificación de las proteínas han hecho posible que se puedan sintetizar numerosas proteínas recombinantes, algunas de las cuales se utilizan ya en clínica, mientras que otras todavía están en fase de ensayo clínico. Para fabricar proteínas recombinantes es necesario primeramente clonar el gen de interés (habitualmente a través de la amplificación por PCR), incluirlo en un elemento génico capaz de expresar dicho gen (denominado vector) y, finalmente, introducir dicho elemento génico en un organismo (como bacterias o células eucariotas) que sea capaz de expresar el gen y sintetizar la proteína en grandes cantidades. El cultivo a gran escala de estos organismos proporciona una abundante cantidad de la proteína de interés, que tiene que ser aislada y purificada posteriormente para poder ser utilizada en clínica. Varios son los aspectos a tener en cuenta a la hora de generar una proteína recombinante. Se pueden utilizar diversos organismos que actúan como hospedadores y productores de la proteína objeto de estudio: fagos, bacterias, levaduras, plantas, hongos y células de insectos o de mamíferos. Cada uno de estos hospedadores y sistemas de expresión tiene sus ventajas e inconvenientes para producir proteínas humanas. La utilización de células de organismos distintos a los humanos puede tener consecuencias funcionales, como cambios en la conformación, en las modificaciones postraduccionales o en la antigenicidad de las proteínas. Adicionalmente, el tipo de organismo influye en la manera de purificar la proteína y en las sustancias de carácter tóxico que puedan encontrarse como elementos traza en el proceso de purificación, que pueden condicionar su uso en humanos. Estos son algunos de los aspectos que habría que considerar para algunos de los organismos más usados en la producción de proteínas: • Bacterias: no realizan splicing (corte y empalme del ARN) ni tienen lugar muchas de las modificaciones postraduccionales necesarias para la función de las proteínas humanas (en particular, la glucosilación). El uso de bacterias ha sido el modo tradicional de obtener grandes cantidades de proteínas para su purificación, por lo que hay mucha experiencia técnica al respecto. • Levaduras: sí realizan glucosilación, pero las cadenas glucídicas son distintas a las de las células humanas. • Células de insectos: ofrecen la ventaja de que el vector se puede introducir en la célula mediante baculovirus, que infectan específicamente células de insectos. Se obtienen también proteínas glucosiladas, pero distintas a las humanas. Muchas veces se buscan mutantes que sean capaces de glucosilar las proteínas de forma parecida a los humanos. • Células de mamíferos: el problema de la glucosilación estaría solucionado. El inconveniente principal de utilizar células de mamíferos es que suelen ser cultivos lentos y de bajo rendimiento. 415 Un ejemplo de proteína recombinante utilizada en clínica es la insulina. Esta hormona, responsable de la captación de glucosa por parte de los tejidos (en concreto, el músculo esquelético y el tejido adiposo) para normalizar la glucemia, no se produce en pacientes con diabetes mellitus de tipo I, ya que en esta enfermedad hay una destrucción autoinmune de las células β del páncreas. Hasta los años sesenta del pasado siglo, el único tipo de insulina disponible para el tratamiento de la diabetes era la purificada a partir de páncreas de animales. Poco más tarde, Herbert Boyer consiguió elaborar por primera vez insulina mediante ingeniería genética (tecnología del ADN recombinante) en bacterias. Desde ese momento se han mejorado mucho las técnicas de síntesis y la oferta de insulina recombinante. Otras proteínas recombinantes utilizadas actualmente en clínica son factores de coagulación (para el tratamiento de la hemofilia), eritropoyetina (anemia), glucocerebrosidasa (enfermedad de Gaucher), hormona del crecimiento (enanismo) e interferón α (tratamiento de enfermedad crónica granulomatosa o determinadas neoplasias). Lecturas recomendadas Ciechanover A. Proteolysis: from the Iysosome to ubiquitin and proteasome. Nat Rev Mol Cell Biol. 2005;6:79–86. Citron M. Alzheimer’s disease: strategies for disease modification. Nature Reviews in Drug Discovery. 2010;9:387–398. Kupfer L, Hinrichs W, Groschup MH. Prion Protein Misfolding. Curr Mol Med. 2009;9:826–835. Mathews CK, Van Holde KE, Ahern KG. Bioquímica. 3.ª ed. Madrid: Addison Wesley; 2002. Ramakrishnan V. Ribosome Structure and the Mechanism of Traslation. Cell. 2002;108:557–572. Seet BT, Dikic I, Zhou MM, Pawson T. Reading proteins modifications with interaction domains. Nat Rev Mol Cell Biol. 2006;7:473–483. Sims RJ, Reinberg D. Is there a code embedded in proteins that is based on post-translational modifications? Nat Rev Mol Cell Biol. 2008;9:1–6. Steitz TA. A structural understanding of the dynamic ribosome machine. Nat Rev Mol Cell Biol. 2008;9:242–253. Ulrich-Hartl F, Hayer-Hartl M. Converging concepts of protein folding in vitro and in vivo. Nat Struct Mol Biol. 2009;16(69):574–581. Ye Y, Rape M. Building ubiquitin chains: E2 enzymes at work. Nat Rev Mol Cell Biol. 2009;10:755–764. Preguntas de autoevaluación 1. Para formar el enlace peptídico que une dos aminoácidos: a. Se unen las dos cadenas laterales de los aminoácidos. b. Se une el grupo amino de un aminoácido con el grupo carboxilo del otro. 416 c. Se une el grupo amino de un aminoácido con la cadena lateral del otro. d. Se unen los dos grupos carboxilos de los aminoácidos entre sí. e. Se unen los dos grupos aminos de los aminoácidos entre sí. Respuesta correcta: b. 2. Señale la opción verdadera: a. La cola poli-A se añade en el extremo 5’ del ARNm. b. La subunidad mayor del ribosoma de eucariotas contiene un único ARN ribosómico. c. La subunidad menor del ribosoma de eucariotas contiene dos ARN ribosómicos. d. El brazo dihidrouridina del ARNt es el encargado de anclar el aminoácido. e. Todas las anteriores son falsas. Respuesta correcta: e. 3. Respecto al código genético: a. Existen más codones disponibles que aminoácidos posibles. b. Existen más aminoácidos posibles que codones disponibles. c. El número de codones disponibles es exactamente igual al de aminoácidos posibles. d. El número de aminoácidos disponibles es igual al de todos los codones disponibles, excepto los codones de parada. e. Todas las anteriores son falsas. Respuesta correcta: a. 4. Señale la opción verdadera: a. El ARNt que transporta el aminoácido que se va a añadir a la cadena polipeptídica en síntesis se sitúa en el sitio P del ribosoma. b. El ARNt despojado de la cadena polipeptídica se sitúa en el sitio E del ribosoma. c. La hidrólisis del GTP que transporta el factor eEF1A se produce una vez que el nuevo aminoácido se ha unido a la cadena polipeptídica en síntesis. d. La translocación del ribosoma que permite liberar el sitio A durante el proceso de elongación de la síntesis proteica no necesita consumo de energía. 417 e. Todas las anteriores son verdaderas. Respuesta correcta: b. 5. Respecto al plegamiento de proteínas: a. Las cadenas laterales polares tienden a agruparse en el interior de la molécula. b. Dos de los esquemas más frecuentes en la estructura cuaternaria de las proteínas son las hélices α y las láminas β. c. En el plegamiento cotraduccional la proteína Hsp70 conduce a los polipéptidos en proceso de plegamiento al sistema chaperonina TRiC/CCT. d. La chaperona Hsp70 desempeña un papel fundamental en todos los tipos de plegamiento. e. Todas las anteriores son verdaderas. Respuesta correcta: d. 6. La proteína Prp tiene: sc a. Un alto porcentaje de plegamiento en forma de hélice α. b. Un alto porcentaje de plegamiento en forma de lámina β. c. Un porcentaje similar entre hélices α y láminas β. d. No posee hélices α ni láminas β. e. Un plegamiento similar a la proteína Prp . c Respuesta correcta: c. 7. Señale el aminoácido que no puede experimentar una fosforilación: a. Serina. b. Tirosina. c. Glutamina. d. Treonina. e. Histidina. Respuesta correcta: c. 8. Señale el aminoácido que puede ser objeto de todas las siguientes modificaciones postraduccionales: acetilación, metilación, acilación y ubiquitinación. a. Serina. 418 b. Lisina. c. Tirosina. d. Arginina. e. Triptófano. Respuesta correcta: b. 9. Señale el enunciado verdadero: a. El péptido Aβ es el responsable de la formación de las placas amiloides y es generado por la acción de las α y β 42 secretasas. b. El péptido Aβ es el responsable de la formación de las placas amiloides y es generado por la acción de las α y γ 42 secretasas. c. El péptido Aβ es el responsable de la formación de las placas amiloides y es generado por la acción de las β y γ 42 secretasas. d. El péptido Aβ es el responsable de la formación de las placas amiloides y es generado tras la metilación de la 42 proteína precursora amiloide. e. El péptido Aβ no es responsable de la formación de las placas amiloides. 42 Respuesta correcta: c. 10. La proteína tau está asociada al desarrollo del Alzheimer porque: a. Está mutada en esta enfermedad, por lo que no tiene actividad. b. Está hiperactivada en esta enfermedad. c. Está hiperfosforilada, lo que provoca agregación proteica. d. Está hiperglucosilada, lo que provoca un plegamiento anormal. e. Tiene alterada la secuencia señal, por lo que, en vez de localizarse en el citoplasma, se localiza en el núcleo. Respuesta correcta: c. 419 CAPÍTULO 10 420 Sistema de endomembranas celulares: retículo endoplasmático, aparato de Golgi y lisosomas María Ángela Burrell Alfonso Calvo Objetivos de aprendizaje • Tener una visión general de las vías de transporte de macromoléculas en la célula eucariota. • Conocer la estructura y la función del retículo endoplasmático, el aparato de Golgi y los lisosomas. • Ser capaz de describir las rutas biosintéticas de las proteínas y las vías de transporte hacia su destino celular concreto. • Conocer algunos tipos celulares representativos que muestran un especial desarrollo de los distintos elementos de la vía biosintética-secretora. • Conocer ejemplos de enfermedades cuyo origen está en alteraciones en los distintos compartimentos del sistema de endomembranas. 421 Introducción Las células eucariotas, a diferencia de las procariotas, poseen una serie de membranas internas que definen unos compartimentos membranosos con una morfología y función determinadas. Esta red de compartimentos requiere un complejo sistema de transporte que hace posible el movimiento de moléculas de unos a otros. Estos compartimentos membranosos (u orgánulos) son el retículo endoplasmático (o endoplásmico), con sus componentes rugoso y liso, el aparato de Golgi y los lisosomas. Las funciones de estos orgánulos (a excepción del retículo endoplasmático liso [REL]) están relacionadas con la síntesis, procesamiento, tráfico y localización de una gran parte de las proteínas celulares. El REL, por su parte, juega un papel clave en la síntesis de lípidos, por lo que provee de elementos de membrana al resto de los compartimentos celulares. 422 Retículo endoplasmático rugoso Estructura y composición El retículo endoplasmático rugoso (RER) es una red interconectada de sáculos (o cisternas) aplanados y túbulos membranosos con ribosomas adheridos a su superficie (fig. 10-1). Estos sáculos se conectan con la envoltura nuclear y también con el REL. En cortes de microscopía electrónica los sáculos aparecen como «perfiles» (cuyo interior denominamos «luz»), que presentan normalmente un grosor aproximado de 20 a 30 nm, aunque en ocasiones pueden aparecer muy dilatados (p. ej., en las células plasmáticas). Claude, Porter y Fulham realizaron en 1945 las primeras descripciones del RER al microscopio electrónico, que fueron completadas posteriormente por Sjöstrand, Palade y Porter, quienes, además, relacionaron este orgánulo con la síntesis de proteínas. FIGURA 10-1 Morfología del RER. A. Representación esquemática del RER. B. Electronografía en la que el RER aparece cortado en distintas orientaciones: perpendicularmente (flecha gruesa) y tangencialmente (flecha fina). (A, ilustración de E. Maldonado y A. Calvo; B, imagen por cortesía de: Departamento de Histología y A.P. Universidad de Navarra.) El RER está presente en todas las células nucleadas (exceptuando los espermatozoides) y está especialmente desarrollado en células con una elevada síntesis proteica. En una célula pancreática exocrina, el RER puede llegar a constituir hasta el 20% del volumen celular. Las células con abundante RER presentan la propiedad llamada basofilia citoplasmática, que consiste en la apetencia por los colorantes básicos que presentan ciertas áreas del citoplasma celular. La basofilia citoplasmática se corresponde con zonas de abundancia del ARN de los ribosomas libres en el citosol o presentes en el RER. De acuerdo con la disposición de ese componente basófilo, se distinguen tres tipos de basofilia (fig. 10-2): • Basofilia difusa, cuando prácticamente todo el citoplasma es basófilo. Es frecuente observar una zona no basófila, que corresponde al aparato de Golgi y se suele denominar «zona Golgi negativa». Un ejemplo de basofilia difusa es la que presentan las células plasmáticas. • Basofilia basal: en este caso, la basofilia se presenta en la zona basal de la célula; esta disposición es muy común en células epiteliales secretoras que poseen gran cantidad de RER en el citoplasma basal. Ejemplos de este tipo de basofilia los encontramos en células epiteliales del páncreas exocrino y en células epiteliales de las glándulas salivales. 423 • Basofilia en grumos: el componente basófilo aparece en grumos o paquetes, que corresponden a zonas de acúmulo de RER o ribosomas libres. Esta basofilia es típica de hepatocitos y neuronas (las zonas basófilas en este último tipo celular corresponden a los grumos o cuerpos de Nissl). FIGURA 10-2 Basofilia citoplasmática. Dibujos esquemáticos que muestran cómo se observaría la basofilia en microscopía óptica (dibujos de la izquierda) y electrónica (dibujos centrales). En la parte derecha se muestran imágenes de microscopía óptica representativas de cada uno de los tipos de basofilia. A. Basofilia difusa en células plasmáticas (tinción de verde metilo pironina). B. Basofilia basal en acinos pancreáticos (tinción de hematoxilina-eosina). C. Basofilia en grumos en hepatocitos (tinción de hematoxilinaeosina). (Ilustración de: E. Maldonado y A. Calvo.) Los estudios funcionales de los años sesenta del siglo pasado demostraron que el RER estaba involucrado en la síntesis y distribución de proteínas. Mediante el uso de aminoácidos radiactivos y técnicas de autorradiografía en células acinares pancreáticas, se comprobó que los aminoácidos añadidos a las células se incorporaban a proteínas primeramente en el RER. Tiempos de incubación mayores revelaban que las proteínas se habían desplazado al aparato de Golgi, posteriormente a vesículas de secreción y, finalmente, eran secretadas al exterior celular. Por lo tanto, estos experimentos mostraron la presencia de una ruta sintética y secretora de proteínas que pasaban del RER al Golgi y luego a la membrana plasmática y al exterior celular. Experimentos de fraccionamiento celular y centrifugación diferencial (v. capítulo 2) lograron aislar fragmentos del retículo endoplasmático que, tras la centrifugación, se encuentran en la fracción microsómica (fig. 10-3). Cuando las células se rompen durante el proceso de centrifugación, el retículo se fragmenta en vesículas de pequeño tamaño (de aproximadamente 100 nm de diámetro) denominadas microsomas. Los microsomas constituyen un instrumento muy útil para los estudios bioquímicos y funcionales del RER y han permitido conocer muchos aspectos de sus funciones. Los microsomas incluyen fragmentos tanto de RER como de REL, pero ambos tipos de microsomas pueden separarse mediante una centrifugación en gradiente de sacarosa. 424 FIGURA 10-3 A. Obtención de la fracción microsómica mediante fraccionamiento celular y centrifugación diferencial. B. Representación de cómo las cisternas del RER se fragmentan tras el fraccionamiento celular y se forman los microsomas rugosos. (Ilustración de: E. Maldonado y A. Calvo.) La membrana del RER presenta la típica estructura trilaminar de las membranas celulares y su grosor es de unos 5-6 nm, es decir, algo menor que la que presenta la membrana plasmática. Posee algunas diferencias en composición con las otras membranas celulares, pues contiene un mayor porcentaje de lípidos y una serie de proteínas exclusivas de este orgánulo. Entre estas últimas cabe señalar las proteínas que permiten la unión de los ribosomas y la translocación de las proteínas hacia su luz. Además, el interior del RER posee toda una serie de proteínas propias de este orgánulo, como enzimas relacionadas con la glucosilación de proteínas, peptidasas, isomerasa de puentes disulfuro y chaperonas (binding protein [BiP], calnexina y calreticulina). Traducción de proteínas en el RER Las proteínas celulares pueden traducirse completamente en ribosomas libres presentes en el citosol o comenzar su traducción en ribosomas citosólicos pero continuarla en el RER. Esta diferencia marca el destino de las proteínas, ya que aquellas cuya síntesis pasa por el RER irán destinadas a permanecer en este mismo orgánulo, en el aparato de Golgi, en los lisosomas o en la membrana plasmática, o bien serán secretadas al exterior celular. En cambio, las proteínas que sean traducidas completamente en el citosol podrán permanecer en el citosol o ser incorporadas posteriormente al núcleo, mitocondrias o peroxisomas. Como la incorporación de estas proteínas a sus orgánulos diana tiene lugar una vez que la proteína ha sido completamente traducida, se habla de una importación postraduccional. En cambio, los ribosomas que se adhieren a la membrana del RER sintetizan las proteínas a la vez que estas se van incorporando al RER, por lo que se habla de una importación cotraduccional. Las proteínas que van a ser traducidas en el RER presentan un péptido señal de 16 a 30 residuos situado en la región N-terminal, producto de la traducción de un conjunto de codones señal presentes en el ARNm que codifica 425 para estas proteínas. La teoría sobre cómo tiene lugar el proceso de traducción e incorporación simultánea de las proteínas al RER fue elaborada en los años setenta del siglo pasado y se denominó «hipótesis de la señal»; ha sido verificada y completada con muchos otros experimentos posteriores. La existencia de señales peptídicas en las proteínas, responsables de su incorporación a compartimentos celulares específicos, se comprobó también en el caso del núcleo, las mitocondrias, los cloroplastos y los peroxisomas. ¿Cómo tiene lugar la traducción e incorporación simultánea de proteínas en el RER? Se pueden distinguir varias etapas secuenciales (fig. 10-4): Paso 1: la traducción comienza en ribosomas libres. Cuando en el extremo N-terminal de la proteína en formación aparece el péptido señal que indica que la proteína debe ser traducida en el RER, ese péptido es reconocido por la partícula reconocedora de la señal (PRS). La PRS está formada por una molécula de ARN y seis proteínas, y consta de varios dominios (de unión al péptido señal, de parada de la traducción, de unión al ribosoma y de unión a GTP). Paso 2: la unión de la PRS al ribosoma provoca una parada en la traducción y causa un cambio de conformación en PRS que le permite ser reconocida y unirse a su receptor en la membrana del RER. El complejo ribosoma/PRS y su receptor interactúan entonces con un translocador, un complejo proteico que permitirá el paso de la proteína en formación hacia la luz del RER. Paso 3: el translocador se abre y continúa la síntesis proteica, pero el péptido señal queda anclado en la región interna del translocador mediante interacciones proteicas, por lo que no pasa al interior del RER. La proteína en síntesis va atravesando el translocador y penetrando hacia el interior del RER. Se produce la hidrólisis de GTP y, como consecuencia, cambios conformacionales que hacen que se libere la PRS. Paso 4: una peptidasa señal, que está asociada a la cara interna de la membrana, corta el péptido señal de la proteína que se está incorporando al RER. Paso 5: se continúa la traducción de la proteína, que quedará en la luz del RER. FIGURA 10-4 Síntesis e importación cotraduccional de proteínas en el RER. PRS, partícula reconocedora de la señal. (Ilustración de: E. Maldonado y A. Calvo.) 426 Localización y orientación de las proteínas en el RER Este mecanismo de incorporación que acabamos de explicar no es en realidad un mecanismo común a todas las proteínas que se traducen en el RER, ya que las proteínas que quedan situadas en la membrana de este orgánulo poseen señales hidrófobas que les permiten anclarse a la bicapa lipídica (fig. 10-5). En efecto, algunas proteínas poseen, además del péptido señal en el dominio N-terminal, una secuencia de parada de la transferencia en una región interna de la proteína. Esta secuencia consiste en un grupo de aminoácidos de naturaleza hidrófoba (constituido por unos 20-25 aminoácidos) que impide que la proteína continúe translocándose hacia la luz del RER. En este caso, la proteína continúa traduciéndose, pero la región proteica que queda por detrás de la secuencia de parada de la transferencia quedará orientada hacia el lado citoplasmático. Por lo tanto, una vez que finalice la traducción se obtendrá una proteína anclada a la membrana del RER con su extremo N-terminal orientado hacia la luz y su extremo carboxilo (C-terminal) hacia el citoplasma (v. fig. 10-5). FIGURA 10-5 Proceso de síntesis e inserción en la membrana del RER de una proteína de paso único en la que el extremo carboxilo terminal queda orientado hacia el lado citoplasmático. (Ilustración de: E. Maldonado y A. Calvo.) Pero hay proteínas que se orientan en la membrana de otra manera, con el extremo N-terminal hacia el citosol o los dos extremos hacia el mismo lado, o incluso hay proteínas que atraviesan varias veces la membrana del RER. Para conseguir estas orientaciones se precisan diversas estrategias consistentes en una o varias secuencias de inicio de la translocación y de parada de la transferencia. Algunas proteínas tienen la secuencia señal de inicio situada en una zona interna de la proteína, en vez de en su dominio N-terminal. En este caso, el ribosoma que la traduce solo se incorporará al RER cuando aparezca esta señal, lo cual va a determinar que el extremo N-terminal quede en el lado citoplasmático cuando comienza su translocación a través de la membrana del RER. La traducción de la proteína continúa de tal manera que su extremo carboxilo queda situado en el lado luminal del RER (fig. 10-6). En este caso no hay una escisión de la secuencia señal por parte de la peptidasa señal, quedando así la proteína embebida en la membrana con la señal hidrófoba inmersa en la misma. Las secuencias internas de las proteínas pueden disponerse de tal modo que dirijan la translocación orientando el extremo N-terminal hacia el lado citoplasmático o hacia el lado luminal del RER, lo que permitirá una conformación diferente de la proteína en la membrana. Mediante la redirección de las secuencias señales de inicio de la translocación y secuencias de parada, las proteínas se pueden orientar además con los dos extremos (N- y C-) terminales hacia el mismo compartimento (ya sea el luminal o el citosólico). La 427 presencia de varias secuencias señal de inicio de la translocación y varias secuencias de parada de transferencia permite la existencia de proteínas que atraviesan múltiples veces la membrana del RER (fig. 10-7). FIGURA 10-6 Proceso de síntesis e inserción en la membrana del RER de una proteína de paso único en la que el extremo N-terminal queda orientado hacia el lado citoplasmático. (Ilustración de: E. Maldonado y A. Calvo.) FIGURA 10-7 Tipos de orientaciones de las proteínas en la membrana del RER y ejemplos de proteínas de cada tipo. (Ilustración de: E. Maldonado y A. Calvo.) Modificaciones postraduccionales Las proteínas traducidas en el RER deben adquirir su conformación final para que sean perfectamente funcionales. Esta conformación implica un correcto plegamiento de la proteína y una serie de modificaciones postraduccionales en el interior del RER (glucosilación, fragmentación y formación de enlaces disulfuro). De las proteínas celulares, solo aquellas que pasen por el RER estarán glucosiladas, lo cual no quiere decir que todas las proteínas que se traduzcan en este orgánulo vayan a sufrir glucosilación (aunque sí la mayoría). La glucosilación es un proceso que comienza en el RER y finaliza en el aparato de Golgi. Ambos orgánulos poseen enzimas capaces de transferir azúcares a las proteínas, o de eliminar algunos de ellos para dar lugar a cadenas de oligosacáridos específicos para cada proteína. La glucosilación es una modificación importante, ya que algunas proteínas requieren ser glucosiladas para poderse plegar correctamente en el RER; además, la glucosilación impide la agregación de las proteínas. 428 Todas las proteínas glucosiladas en el RER (fig. 10-8) sufren inicialmente una transferencia en bloque de un oligosacárido de 14 residuos: 3 de glucosa, 9 de manosa y 2 de N-acetilglucosamina, catalizada por una transferasa de oligosacáridos. El oligosacárido se ha formado previamente en el lado citosólico de la membrana del RER mediante la actividad de diversas enzimas que construyen la cadena de azúcares sobre un lípido de membrana llamado dolicoldifosfato. Una vez que se ha construido el oligosacárido de 14 azúcares, se produce una translocación de la cadena glucídica desde el lado citoplasmático hasta el lado luminal del RER. La transferencia del oligosacárido a la proteína tiene lugar sobre un aminoácido asparragina (Asn) que se encuentre en una secuencia Asn-X-Ser/Thr (donde X puede corresponder a cualquier aminoácido; Ser: serina; Thr: treonina). Tras la transferencia del oligosacárido se produce un procesamiento, que consiste en la eliminación de algunos azúcares: primero un residuo de glucosa, luego otros dos de glucosa y uno de manosa, catalizados por glucosidasas y manosidasas, respectivamente. Posteriormente este oligosacárido será modificado en el aparato de Golgi. FIGURA 10-8 Glucosilación de proteínas en el RER. Un oligosacárido de 14 residuos de azúcares se transfiere en bloque a la proteína naciente. Tras la transferencia se produce la eliminación de algunos residuos. (Ilustración de: E. Maldonado y A. Calvo.) La correcta formación de una estructura tridimensional (o correcto plegamiento) por parte de las proteínas es un fenómeno de gran importancia, para el que el RER cuenta con la participación de: • Enzimas, como la isomerasa de puentes disulfuro. • Chaperonas como la BiP, la calnexina (proteína de membrana) y la calreticulina (soluble), dependientes de Ca ; 2+ son lectinas que se unen a proteínas incompletamente plegadas, reteniéndolas en el RER. La formación de puentes disulfuro (S-S) contribuye a la adquisición de la correcta estructura de la proteína. En las proteínas de la luz del RER se forman enlaces disulfuro por la pérdida de dos electrones de grupos SH de cisteínas. Los electrones se transfieren desde la proteína a un enlace disulfuro de la enzima isomerasa de puentes disulfuro (PDI) y esta, a su vez, los transfiere a la proteína Ero1. La formación de puentes disulfuro es importante para el correcto plegamiento de las proteínas y la adquisición de una adecuada conformación tridimensional. Esta modificación proteica tiene lugar en el RER debido al ambiente oxidante que promueve la formación de uniones S-S, a diferencia del ambiente reductor que caracteriza al citosol. 429 El plegamiento de proteínas en el RER es un proceso complejo no del todo conocido. En él, las chaperonas y enzimas de procesamiento proteico actúan como sensores capaces de detectar proteínas mal plegadas para expulsarlas al citosol, con el fin de que puedan ser degradadas. La chaperona BiP (también llamada «HSP-70», o heat shock protein70) se une a la proteína naciente en el interior del RER para favorecer su correcto plegamiento (fig. 10-9). Tras la eliminación de las dos primeras moléculas de glucosa del oligosacárido, las proteínas del RER se unen a calreticulina, que favorece el plegamiento y elimina el tercer residuo de glucosa. Entonces, la proteína es reconocida por «sensores de plegamiento», tras cuya interacción puede ocurrir lo siguiente: a) que esté correctamente plegada y continúe su ruta normal; b) que esté incorrectamente plegada y sea reglucosilada para volver a ser reconocida por la calreticulina e intentar de nuevo el plegamiento, o c) que la falta de plegamiento no se pueda resolver y sea enviada fuera del RER (mediante retrotranslocación) para que sea destruida. Este proceso implica su desglucosilación mediante una Nglucanasa, ubiquitinación y proteólisis en el proteasoma (fig. 10-10). FIGURA 10-9 Participación de distintas proteínas (BiP, calnexina, calreticulina y PDI) en el plegamiento de una proteína recién sintetizada en el RER. (Ilustración de: E. Maldonado y A. Calvo.) FIGURA 10-10 Degradación en el proteasoma de proteínas plegadas incorrectamente en el RER. (Ilustración de: E. Maldonado y A. Calvo.) En condiciones de estrés celular, provocado por hipertermia, hipoxia o ayuno (entre otros), se produce la acumulación de proteínas mal plegadas en el RER. En esta situación se desencadena una respuesta celular denominada unfolded protein response (UPR), o respuesta ante proteínas mal plegadas, que implica el aumento de la transcripción de genes que codifican para chaperonas del RER y para proteínas implicadas en la retrotranslocación al 430 citosol, y finalmente la degradación de las proteínas mal plegadas. En este proceso, la chaperona BiP actúa como sensor del estado general del plegamiento proteico, induciendo la UPR. Hay evidencias de que el estrés en el RER está implicado en algunas enfermedades neurodegenerativas como el Alzheimer, el Parkinson, el cáncer, la obesidad y la diabetes. Estas enfermedades se asocian al mal plegamiento de proteínas, y en ocasiones se pueden observar los acúmulos de proteínas mal plegadas, bien en la luz del RER (formando los denominados «cuerpos de Russell») o bien en el citosol, como un material amorfo denso sin membrana limitante, denominado «agresoma». Algunas proteínas del RER sufren también otro tipo de modificaciones que consisten en la unión a glucolípidos de membrana. Estos glucolípidos contienen fosfatidilinositol, por lo que las uniones se llaman anclajes de glucofosfatidilinositol (GPI, del inglés, glycoposphatidyl inositol). Los GPI contienen los dos ácidos grasos embebidos en la membrana del RER, inositol (junto con otros azúcares) y etanolamina. La transferencia de la proteína al GPI forma una unión que deja a dicha proteína anclada a la membrana por este tipo de glucolípido. Determinadas proteínas traducidas en el RER permanecen en este orgánulo (proteínas residentes), bien en la membrana o en la luz, ya que presentan secuencias señal específicas que son reconocidas por receptores. El resto deben ser transportadas hacia los distintos componentes del sistema de endomembranas y hacia la membrana plasmática, lo que implica su paso por el aparato de Golgi. Para ello, a partir del RER se forman unas estructuras tubulovesiculares lisas (elementos de transición) que se fusionarán con las cisternas de la cara Cis del aparato de Golgi, donde continúa su proceso de maduración, como se verá más adelante. 431 Retículo endoplasmático liso El REL está constituido por un conjunto de estructuras membranosas, esencialmente tubulares, sin ribosomas adosados, y se diferencia del RER tanto en su morfología y composición, como en su función (fig. 10-11). Aunque existen diferencias morfológicas y funcionales entre ambos retículos, se encuentran interconectados entre sí, formando una estructura o compartimento en contigüidad de membrana. Entre las características del REL que le diferencian del RER podemos citar: • No presenta ribosomas. • Los elementos membranosos son fundamentalmente túbulos (no sáculos). • Posee una composición distinta de la membrana (con diferencias en sus proteínas y con mayor porcentaje de lípidos). • Sus funciones están relacionadas principalmente con la síntesis de lípidos y derivados lipídicos. • Es abundante solo en células especializadas (hepatocitos, células secretoras de hormonas esteroideas, células musculares, etc.). 432 FIGURA 10-11 A. Dibujo esquemático de la estructura del REL y su relación con el RER. B. Electronografía en la que aparece el REL muy desarrollado en un hepatocito. Flecha: REL. M, mitocondria. (B, reproducida a partir de: Burrell MA et al. Atlas de ultraestructura celular. Pamplona: EUNSA; 2011.) El REL ejerce numerosas funciones en la célula, fundamentalmente relacionadas con la síntesis de lípidos, que sirve para incrementar o reponer los elementos de membrana de distintos orgánulos y de la membrana plasmática. Se resumen a continuación sus funciones. Funciones Síntesis de lípidos y derivados lipídicos 433 En todas las células debe llevarse a cabo la síntesis de fosfolípidos y colesterol para renovar las membranas celulares, función que lleva a cabo este orgánulo. Además, hay células especializadas del organismo en las cuales el REL es muy abundante; en estas células tiene lugar la síntesis de determinados lípidos o derivados lipídicos. La síntesis lipídica se desarrolla en varias fases (fig. 10-12). En la primera, que tiene lugar en el citoplasma, dos ácidos grasos unidos a coenzima A (CoA) se unen al glicerol 3-fosfato, formando el ácido fosfatídico, que se inserta entonces en la membrana del REL. Posteriormente, una fosfatasa convierte el ácido fosfatídico en diacilglicerol (DAG). En una tercera fase se produce la unión de los diferentes grupos de cabeza polares al DAG, formándose así la fosfatidilcolina, fosfatidiletanolamina y fosfatidilserina. El fosfatidilinositol se genera a partir del ácido fosfatídico, en vez de hacerlo a partir del DAG. En el REL también se sintetizan el colesterol y la ceramida, que van a ser componentes de las membranas, junto con los glicerofosfolípidos. La ceramida dará lugar a glucolípidos y a la esfingomielina en el aparato de Golgi (v. capítulo 3), donde se completará la formación de estos lípidos de membrana. Tanto el colesterol como la esfingomielina formarán parte de las balsas lipídicas o rafts, descritas en el capítulo 3. FIGURA 10-12 Síntesis de fosfolípidos en el REL. Las aciltransferasas (1) forman ácido fosfatídico, cuyas dos cadenas hidrocarbonadas quedan ancladas a la membrana. Una fosfatasa (2) convierte el ácido fosfatídico en diacilglicerol. La fosfotransferasa de colina (3) transfiere la cabeza polar (en este caso, la fosforilcolina). Una escramblasa (4) cataliza el paso del fosfolípido de una hemimembrana a la otra. CMP: citidina monofosfato colina; CTD: citidina difosfato colina. (Ilustración de: E. Maldonado y A. Calvo.) La síntesis de lípidos tiene lugar en la hemimembrana citosólica del retículo endoplasmático, de tal modo que la adición de moléculas lipídicas solo tendría lugar en ese lado de la membrana. Para redistribuir los lípidos en ambas hemimembranas y establecer la asimetría que la caracteriza en cuanto a su composición (v. capítulo 3) se necesita de la actuación de unas enzimas llamadas escramblasas, que catalizan el paso, energéticamente desfavorable, de los grupos polares de los lípidos de un lado al otro de la membrana (v. capítulo 3). Los lípidos sintetizados en el REL serán distribuidos mediante transporte vesicular a los distintos compartimentos membranosos (RER, aparato de Golgi, lisosomas) y a la membrana plasmática. Para su transporte a mitocondrias y peroxisomas se requieren proteínas citosólicas intercambiadoras de fosfolípidos. Por su función en la síntesis de lípidos, el REL contribuye también de modo muy importante en la formación de lipoproteínas, ácidos biliares y hormonas esteroideas. Los enterocitos contienen RER y REL que contribuyen a la formación de quilomicrones, formados por triglicéridos, fosfoglicéridos, colesterol y proteínas. En el hígado también se sintetizan lipoproteínas (LDL, VLDL, HDL y VHDL, que se vierten posteriormente al torrente sanguíneo) y ácidos 434 biliares, que se forman a partir de colesterol (y se vierten a los canalículos biliares). La síntesis de hormonas esteroideas tiene lugar en células endocrinas especializadas, y se desarrolla en pasos sucesivos que implican la acción de enzimas mitocondriales y del REL a partir de colesterol. Se forman así hormonas como la testosterona, el estradiol, el cortisol, la aldosterona, etc. Detoxificación de sustancias liposolubles El REL tiene un importante papel en la degradación de sustancias tóxicas liposolubles, como algunos fármacos, alcohol, pesticidas y carcinógenos, además de compuestos dañinos producidos por el propio metabolismo. Todas estas sustancias son convertidas en productos hidrosolubles, más fácilmente eliminables por el organismo. En los hepatocitos, cuando hay altas dosis de estas sustancias tóxicas, se observa un REL muy desarrollado con presencia de enzimas detoxificantes (como la familia de los citocromos P450, que están anclados en el lado citosólico de la membrana del REL). Las enzimas del citocromo P450 se agrupan en 27 familias de genes y se designan mediante las letras CYP, seguidas por un número del 1 al 10. La actividad de estas enzimas incluye oxidación, hidrólisis o reducción de las sustancias que tienen que ser modificadas químicamente para reducir su toxicidad. Otras enzimas citoplasmáticas actúan conjugando estas sustancias con determinados grupos químicos (glucurónico, sulfato, acetilo, etc.), que facilitan la excreción de las mismas. Participación en el metabolismo del glucógeno El REL aparece frecuentemente cercano a los depósitos de glucógeno de algunos tipos celulares, particularmente de los hepatocitos. Estas células poseen una importante función en el acúmulo de glucosa en forma de glucógeno. En el lado citosólico de la membrana del REL se encuentra la glucosa 6-fosfatasa, una enzima que hidroliza la glucosa-6fosfato, produciendo glucosa libre, que puede así pasar al torrente sanguíneo y ser utilizada por los tejidos ante una situación de falta de glucosa. Almacenamiento de Ca 2+ Como se explicó en el capítulo 4, el REL posee bombas Ca ATPasas que introducen Ca en su interior en contra de 2+ 2+ gradiente, con el fin de que los niveles citoplasmáticos de este ión permanezcan bajos; por lo tanto, el REL actúa como reservorio intracelular de Ca . El aumento de los niveles de Ca citoplasmático desencadena la activación de cascadas 2+ 2+ de señalización que pueden tener diferentes consecuencias, dependiendo del tipo celular (v. capítulo 13), por lo que actúa como un segundo mensajero en la señalización intracelular. En las fibras musculares esqueléticas existe un REL 435 especial, denominado «retículo sarcoplásmico», que forma una envuelta alrededor de las miofibrillas. Constituye un almacén de Ca que se libera con la llegada del impulso nervioso y desencadena la contracción muscular (v. capítulo 2+ 12). 436 Aparato de Golgi Estructura y propiedades El aparato de Golgi fue descubierto por Camillo Golgi en 1898 cuando estudiaba las neuronas de Purkinje del cerebelo con una tinción específica para neuronas (con sales de osmio y rubidio). Observó alrededor del núcleo unas estructuras intensamente teñidas que denominó «aparato reticular interno»; en 1914 Cajal confirmó su existencia en otros tipos celulares y describió su relación con la secreción. El aparato de Golgi está constituido por un conjunto de estructuras membranosas, fundamentalmente sáculos aplanados y apilados en disposición paralela (fig. 10-13). También aparecen vesículas alrededor de los sáculos, especialmente junto a los extremos, además de elementos membranosos tubulares. Todos estos elementos se agrupan en unidades denominadas dictiosomas, cuyo número y distribución son variables según el tipo celular (p. ej., un hepatocito puede tener hasta 50 dictiosomas). El aparato de Golgi está muy desarrollado en células productoras de glucoproteínas y proteoglucanos, como las células de los acinos pancreáticos, células caliciformes, hepatocitos, neuronas, etc. FIGURA 10-13 Imagen de microscopía electrónica del aparato de Golgi donde se pueden observar varias cisternas del dictiosoma. (Procedente de: Electron Microscopy Service, University of Yale, USA.) El aparato de Golgi presenta polaridad, lo que indica que existen dos zonas con morfología y composición bien distinta, denominadas cara Cis (o de formación) y cara Trans (o de maduración) (fig. 10-14). En el aparato de Golgi tiene lugar la maduración de las proteínas, que ocurre mediante cambios sucesivos que se producen desde la cara Cis hasta la cara Trans. La maduración proteica, por lo tanto, está polarizada hacia la cara Trans del Golgi. Por ello, el aparato de Golgi presenta una clara compartimentación funcional y morfológica, de manera que en él se pueden distinguir cinco compartimentos (v. fig. 10-14): • Red del Cis Golgi (CGN, del inglés Cis Golgi Network). 437 • Cisternas Cis. • Cisternas mediales. • Cisternas Trans. • Red del Trans Golgi (TGN, del inglés Trans Golgi Network). FIGURA 10-14 Representación esquemática del aparato de Golgi en la que se observan los distintos compartimentos, correspondientes a la zona CGN (Cis Golgi Network), Cis, medial, Trans y TGN (Trans Golgi Network). Los distintos compartimentos poseen enzimas que modifican a las glucoproteínas según avanzan de la zona Cis a la Trans. En la parte de la derecha se representan algunos cambios que pueden sufrir las glucoproteínas; la altura a la que ocurren estos cambios corresponde aproximadamente con los compartimentos en los que hay mayor cantidad de las enzimas responsables de dichos cambios. GlcNAC: N-acetilglucosamina. (Ilustración de: A. Calvo.) Los dos compartimentos extremos (CGN y TGN) no están formados por verdaderas cisternas, sino por una red irregular de túbulos y vesículas (de ahí el término en inglés network). Cada compartimento posee un grupo específico de enzimas responsables de la maduración secuencial de las proteínas. Así, en la región CGN y en la zona Cis se encuentran enzimas que transfieren grupos fosfato y que eliminan residuos de manosa, respectivamente. En las cisternas mediales se añade N-acetilglucosamina; en las Trans, galactosa y ácido siálico, mientras que en la zona TGN se encuentran enzimas que transfieren grupos sulfato a algunas proteínas. Funciones En el aparato de Golgi las proteínas y lípidos sintetizados en el RE continúan su maduración. Los cambios más importantes que sufren son la glucosilación, las fragmentaciones y la sulfatación. Glucosilación Las transferasas de azúcares llevan a cabo la glucosilación de proteínas y lípidos, dando lugar a la formación de glucoproteínas, proteoglucanos y glucolípidos. Los radicales glucídicos se añaden siempre hacia el interior de las cisternas del Golgi. Se dan también procesos de desglucosilación, en los que se eliminan, por ejemplo, grupos manosa. 438 En cuanto a las proteínas anteriormente glucosiladas en el RER (donde tenía lugar la N-glucosilación), en el aparato de Golgi se eliminan algunos de sus radicales glucídicos y se añaden otros, dando lugar a glucoproteínas que contienen N-oligosacáridos que se pueden clasificar en tres grandes grupos: a) ricos en manosa; b) complejos, y c) híbridos, que vienen a ser oligosacáridos intermedios entre los grupos anteriores. Los oligosacáridos ricos en manosa contienen manosa y N-acetilglucosamina. Los complejos poseen manosa, N-acetilglucosamina, galactosa y ácido siálico (o neuramínico) (pueden contener también fucosa). Aparte de la modificación de los oligosacáridos de las N-glucoproteínas, el aparato de Golgi también es responsable de la O-glucosilación (que tiene lugar de modo exclusivo en este orgánulo). En este tipo de glucosilación se unen azúcares a un grupo OH de los aminoácidos serina, treonina y, en el caso del colágeno, hidroxilisina. La Oglucosilación da lugar a cadenas cortas de azúcares (unos 10, por término medio), que se añaden de modo secuencial (no en bloque, como en el caso de la N-glucosilación). Además, en la O-glucosilación no se añade ni glucosa ni manosa. Las proteínas O-glucosiladas pueden formar parte de las mucinas, abundantes en las células secretoras de mucosustancias; también el colágeno tiene azúcares O-ligados (en este caso la unión tiene lugar entre la hidroxilisina y la galactosa). Los proteoglucanos son estructuras de alto contenido proteico a las que se unen largas cadenas de azúcares (v. capítulo 6) que se llaman «glucosaminoglucanos» y se añaden en el aparato de Golgi. Los azúcares que forman parte de estas cadenas son: N-acetilglucosamina, N-acetilgalactosamina, galactosa, manosa, ácido siálico, ácido glucurónico y ácido idurónico, entre otros; muchos de ellos están, además, sulfatados. La adición de ácido siálico tiene lugar en las cisternas Trans del aparato de Golgi. El ácido siálico proporciona una carga negativa a las proteínas, lo cual tiene importancia en algunas interacciones célula-célula o en la infección de microorganismos. Por ejemplo, las células metastásicas poseen una gran cantidad de glucoproteínas con ácido siálico, lo cual puede facilitar su salida de los tejidos hacia el torrente sanguíneo. El virus de la gripe se une al ácido siálico de la superficie de eritrocitos y células de las vías respiratorias, permitiendo así su entrada en las células. Algunas proteínas sufren sulfatación en sus tirosinas, reacción que es catalizada por una sulfotransferasa en la zona TGN del Golgi. La sulfatación parece estar relacionada con la estabilidad de las interacciones proteína-proteína. Entre las proteínas que sufren sulfatación están determinadas moléculas de adhesión, proteínas de matriz extracelular o los receptores asociados a proteínas G. El proceso de glucosilación de proteínas y lípidos está alterado en algunas situaciones patológicas, como el cáncer. Se ha comprobado que las células tumorales producen glucoproteínas y glucolípidos con oligosacáridos distintos a los de las células normales, lo cual facilita su adhesión y migración a través de determinados tejidos y, por lo tanto, el proceso de metástasis. Marcaje de enzimas lisosómicas 439 Las enzimas de tipo hidrolasa ácida que van a ser responsables de la digestión celular llevada a cabo por los lisosomas son clasificadas mediante una ruta especial, que las dirigirá hacia este orgánulo. Los lisosomas primarios se forman a partir de vesículas revestidas de clatrina que se originan en la zona TGN del Golgi. El proceso comienza en la zona CGN, que contiene enzimas que añaden grupos fosfato sobre el carbono 6 de manosas terminales en las proteínas de tipo hidrolasa que van a ir destinadas a lisosomas. La manosa-6-fosfato (M6P) constituye, por lo tanto, un marcaje de aquellas proteínas cuyo destino es el lisosoma. Todas estas proteínas poseen N-glucosilación y la adición del fosfato tiene lugar mediante la acción de la enzima N-acetilglucosamina fosfotransferasa, que transfiere un grupo fosfato a la manosa de las enzimas lisosómicas a partir de una molécula de N-acetilglucosamina-UDP. Las hidrolasas lisosómicas marcadas son reconocidas por receptores de M6P presentes en TGN. De esta manera, se formarán vesículas revestidas de clatrina que salen del TGN y se fusionan con el endosoma tardío. La alteración de este sistema de clasificación produce consecuencias graves para la célula, ya que estas enzimas no son destinadas al lisosoma, sino que siguen la ruta secretora y son secretadas al exterior celular, como ocurre en la mucolipidosis de tipo II (v. más adelante). Reciclaje de membranas El aparato de Golgi es un compartimento muy dinámico que debe estar en continuo equilibrio, puesto que recibe continuamente aportaciones de elementos membranosos procedentes de la endocitosis, y a su vez libera vesículas de la vía secretora, cuya membrana pasa a formar parte de la membrana plasmática. Por lo tanto, es un orgánulo responsable de la adecuada distribución de membrana entre los distintos elementos membranosos de la célula. Distribución adecuada de las distintas macromoléculas Como hemos mencionado anteriormente, el aparato de Golgi es un compartimento clasificador, a partir del cual emergen vesículas con diferentes destinos celulares. La figura 10-15 muestra el recorrido de varias macromoléculas desde el inicio de su síntesis en el RER hasta su destino final. Las proteínas pueden dirigirse hacia la membrana plasmática y permanecer en ella (si son proteínas ancladas en la membrana), ser expulsadas hacia el exterior (si son solubles), permanecer como proteínas residentes en el aparato de Golgi o ir destinadas a los lisosomas. 440 FIGURA 10-15 Esquema que muestra el tráfico de varias macromoléculas a través del Golgi. Las proteínas pueden dirigirse al exterior celular, quedar ancladas en la membrana plasmática, permanecer residentes en el Golgi o ir destinadas a lisosomas. Los distintos tipos de proteínas corresponden a: rosa: proteína residente del Golgi; morada: proteína secretada; amarilla: enzima lisosómica. Las enzimas lisosomales se marcan en el Cis Golgi reticular (mediante adición de manosa-6-fosfato), lo cual se representa en color verde. Fragmentación y condensación La fragmentación y condensación de proteínas secretadas es otra de las funciones que tiene lugar tanto en el aparato de Golgi como en las vesículas de secreción. Algunas hormonas y neurotransmisores son sintetizados en forma inactiva, y deben sufrir fragmentaciones para ser funcionales. La fragmentación tiene lugar en aminoácidos cargados positivamente (Lys-Lys, Lys-Arg, Arg-Arg, Arg-Lys). En el aparato de Golgi y en las vesículas de secreción inmaduras, estas proteínas son procesadas mediante enzimas que eliminan parte de la proteína, dejando libre la forma activa. Algunos polipéptidos cortos secretados, como las encefalinas, tienen que sintetizarse como moléculas más largas para poder seguir la ruta secretora, tras lo cual son proteolizadas y dan lugar a los péptidos funcionales. El tráfico de sustancias secretadas desde el RER hasta la membrana plasmática implica una condensación progresiva en su proceso de maduración (hasta 200 veces), como es el caso de los gránulos de zimógeno de los acinos pancreáticos, que se condensan antes de ser liberados al exterior celular. En este proceso intervienen bombas de H situadas en la + membrana de las vesículas de secreción. 441 La síntesis y secreción de la insulina (fig. 10-16) ilustra las modificaciones postraduccionales y la secreción regulada en las células β del páncreas. La traducción del ARNm de la insulina tiene lugar en el RER y genera una cadena polipeptídica precursora llamada «pre-proinsulina». Posteriormente, este precursor pierde el péptido señal por proteólisis, generando así la proinsulina, cuya estructura final de plegamiento se consigue mediante la formación de puentes disulfuro (v. capítulo 8). La proinsulina pasa entonces al aparato de Golgi y desde ahí a gránulos de secreción inmaduros. Finalmente es procesada mediante una serie de proteasas (prohormona convertasa 1/3, carboxipeptidasa E) para dar lugar a la insulina madura y al péptido C. Los gránulos de secreción que contienen la insulina madura son exocitados cuando las células β activan una cascada de señalización intracelular en respuesta a la glucemia elevada y a otros estímulos. FIGURA 10-16 Tránsito de la insulina a través de la ruta secretora. A. Representación esquemática de los diferentes orgánulos implicados. B. Electronografía de una célula β del páncreas. E, exocitosis; G, Golgi; Im-G, gránulos inmaduros de secreción; L, lisosoma; M, mitocondria; N, núcleo; RER, retículo endoplasmático rugoso; SG, gránulos maduros de secreción; TGN, Trans Golgi Network. (Procedente de: LeRoith D et al. Diabetes Mellitus: A Fundamental and Clinical Text. Philadelphia: Lippincott Williams & Wilkins; 2004.) Tráfico vesicular y formación de vesículas de secreción La regulación del tráfico intracelular de vesículas en las vías endocítica y exocítica requiere de la actuación de una serie de proteínas de revestimiento (coating proteins), que seleccionan las zonas de membrana que formarán las vesículas. El revestimiento tiene, al menos, dos funciones: a) proveer la fuerza mecánica para deformar la membrana, y b) capturar en esas zonas los receptores específicos. Para este propósito se pueden formar dos tipos de vesículas (cuya estructura se explicó en el capítulo 5) (fig. 10-17): • Vesículas revestidas de clatrina: participan en la formación de vesículas en el aparato de Golgi que irán destinadas a lisosomas, en la endocitosis mediada por receptor y en la exocitosis regulada. • Vesículas revestidas de coatómeros (COPI y COPII): su revestimiento está formado por un gran complejo proteico, el coatómero, compuesto por las subunidades proteicas COPI y COPII (del inglés coating protein). Estas proteínas de recubrimiento median el transporte del RER al aparato de Golgi (COPII), el que se desarrolla entre 442 cisternas del Golgi y de recuperación a RER (COPI), y el del TGN hacia la membrana plasmática (secreción constitutiva) (COPI). FIGURA 10-17 Esquema de los recubrimientos de las vesículas que intercambian material entre el RER, el Golgi y la membrana plasmática. (Ilustración de: E. Maldonado y A. Calvo.) Se pueden distinguir cuatro vías de comunicación mediante vesículas entre diferentes compartimentos celulares: • Transporte del RER al aparato de Golgi: las proteínas presentes en el RER que deben pasar al aparato de Golgi son empaquetadas en vesículas revestidas de COPII, que se forman en regiones especializadas del RER, sin ribosomas, denominadas exit sites (lugares de salida). Solo abandonan el RER las proteínas correctamente plegadas y ensambladas, ya que hay chaperonas que retienen a las proteínas mal plegadas. Estas vesículas se fusionan formando agregados tubulovesiculares que se desplazan hacia el Golgi, en un movimiento dependiente de microtúbulos. • Vía de retorno del aparato de Golgi al RER: las proteínas residentes del RER que hayan pasado al aparato de Golgi para ser modificadas, vuelven mediante vesículas recubiertas de COPI. En concreto, las proteínas solubles residentes del RER (como BiP o isomerasa de puentes disulfuro) presentan una pequeña señal carboxilo terminal que consiste en una secuencia de aminoácidos Lys-Asp-Glu-Leu (o KDEL). Las proteínas de membrana del RER poseen también secuencias específicas, que contienen dos residuos de lisina (KKXX), que las devuelven a través de la vía de reciclado. Estas proteínas son reconocidas por receptores presentes en la membrana de los agregados tubulovesiculares y del aparato de Golgi, en zonas que forman vesículas revestidas de COPI y son devueltas al RER. • Transporte a través del Golgi: como hemos indicado, las proteínas procedentes del RER son incorporadas al aparato de Golgi por su cara Cis y van madurando en su recorrido hacia la cara Trans. El movimiento preciso que siguen las proteínas a través del Golgi es todavía objeto de debate. Existen dos posibles modelos teóricos, aunque en realidad, está prácticamente aceptado que lo que se da es una mezcla de ambos (fig. 10-18): a) transporte 443 vesicular, en el que las cisternas son estáticas, con proteínas residentes características, y b) maduración o progresión de las cisternas, en el que estas van madurando, por lo que debe haber un transporte vesicular retrógrado de las proteínas residentes de cada compartimento. • Transporte del Golgi a la membrana plasmática: este proceso repone la membrana perdida por endocitosis y sirve a la vez para verter al exterior celular moléculas de secreción y sustancias que formarán parte de la matriz extracelular (v. capítulo 5). Existen dos grandes vías secretoras: a) la vía secretora constitutiva, que se da en todas las células y supone una constante exocitosis de vesículas que contienen proteínas y lípidos de la membrana plasmática, así como proteoglucanos y glucoproteínas de la matriz extracelular, y b) la vía secretora regulada, que tiene lugar solo en células especializadas en secreción. En ella las moléculas son secretadas en respuesta a un estímulo y pueden ser hormonas, enzimas o neurotransmisores. FIGURA 10-18 Modelos de maduración del aparato de Golgi. (Ilustración de: E. Maldonado y A. Calvo.) 444 Lisosomas Estructura, características y tipos Los lisosomas fueron descubiertos por Christian De Duve cuando estudiaba muestras de hígado mediante la técnica de fraccionamiento celular y centrifugación diferencial. Detectaba actividad fosfatasa ácida en una fracción con propiedades intermedias entre la fracción mitocondrial y la microsómica, y concluyó que en ella debía existir un orgánulo con membrana que contenía esa actividad fosfatasa ácida. Paralelamente, Novikov observó al microscopio electrónico de transmisión orgánulos esféricos de aproximadamente 0,5 μm de diámetro, con membrana simple y contenido denso a los electrones, que denominó «cuerpos densos pericanaliculares» y que identificó como los orgánulos descritos por De Duve. Posteriormente, cuando se comprobó su función de digestión intracelular de sustancias, se les denominó «lisosomas». Los lisosomas están presentes en la mayoría de las células animales nucleadas. Son especialmente abundantes en células con función fagocítica: leucocitos polimorfonucleares, macrófagos, osteoclastos, etc. Los lisosomas contienen hasta 40 tipos de enzimas hidrolíticas o hidrolasas ácidas (nucleasas, proteasas, glucosidasas, lipasas, etc.), que son capaces de digerir de manera controlada los distintos tipos de macromoléculas. Su diámetro puede ser variable, siendo por lo general de 0,2 a 0,5 μm. El pH en su interior es ácido (en torno a 5), lo que es óptimo para la actuación de las hidrolasas. No todos los lisosomas contienen todas las enzimas capaces de digerir cualquier macromolécula de la célula, pero todos ellos contienen al menos la fosfatasa ácida, que se considera un marcador universal de lisosomas. La membrana de este orgánulo tiene características peculiares: por un lado presenta bombas de protones, cuya actividad genera el pH ácido al introducir iones H en contra de gradiente. Además + contiene gran número de proteínas transportadoras para translocar al citosol los productos de la digestión de las distintas macromoléculas (aminoácidos, azúcares y nucleótidos), y proteínas de membrana glucosiladas de manera inusual, lo que parece protegerlas de la acción de las propias hidrolasas. Si se digiriera la membrana o se rompiera por cualquier causa, quedarían libres en el citoplasma las hidrolasas, que podrían digerir los componentes celulares y causar la muerte celular. Esto es, de hecho, lo que ocurre en algunas patologías que comentaremos más adelante. La clasificación clásica distingue entre dos tipos de lisosomas: primarios y secundarios. Los primarios son orgánulos esféricos, de pequeño tamaño (alrededor de 0,5 μm), contenido homogéneo denso y pH no muy ácido. Se trata de vesículas desprendidas del aparato de Golgi cargadas de enzimas hidrolíticas que todavía no han digerido, por lo que en la actualidad se les tiende a denominar «vesículas hidrolíticas del Golgi». Los lisosomas secundarios (fig. 10-19) son aquellos que están digiriendo o ya han digerido los diferentes sustratos celulares. Estos lisosomas son el resultado de la fusión de los lisosomas primarios con los endosomas tardíos, con un pH ácido, donde se concentran los sustratos que han sido incorporados mediante endocitosis. La fusión de ambos 445 orgánulos da lugar a un compartimento con un pH ácido, enzimas hidrolíticas y sustratos para la digestión. Los lisosomas secundarios son de mayor tamaño y más irregulares que los primarios y poseen contenido heterogéneo. Presentan una gran variabilidad morfológica, dependiendo del tipo celular y del tipo de material digerido. La digestión incompleta de las sustancias puede generar lisosomas (generalmente grandes y con forma irregular) con material de residuo en su interior, llamados cuerpos residuales o gránulos de lipofuscina (v. fig. 10-19) (también se denominan «pigmento de envejecimiento», típico de las neuronas y del músculo cardíaco). FIGURA 10-19 Electronografía de un lisosoma secundario junto a un REL muy desarrollado. (Reproducida a partir de: Vázquez J, López J. Citología práctica. Pamplona: EUNSA; 1991.) Como hemos comentado, los lisosomas primarios se forman por gemación en la zona TGN del Golgi. Las hidrolasas lisosómicas marcadas con las M6P añadidas a N-oligosacáridos son reconocidas por receptores de M6P presentes en TGN. De esta manera, se formarán vesículas revestidas de clatrina que salen del TGN y se fusionan con el endosoma tardío (fig. 10-20). El endosoma tardío proviene del endosoma temprano (v. capítulo 5), donde se habían ido acumulando diversos sustratos procedentes de la endocitosis. El pH del endosoma tardío favorece la disociación de la hidrolasa ácida de su receptor de membrana, lo que, a su vez, posibilita que el receptor retorne a la zona TGN del Golgi mediante gemación de vesículas recubiertas de retrómeros, para comenzar de nuevo el proceso. En el endosoma tardío tiene lugar, por su parte, la disociación de los grupos fosfato que constituían el marcaje de las enzimas lisosómicas. Una vez que las enzimas están libres de su grupo fosfato, pueden actuar, digiriendo sus sustratos específicos. 446 FIGURA 10-20 Esquema de la formación de los lisosomas y del transporte de nuevas hidrolasas al lisosoma. (Illustración de: E. Maldonado y A. Calvo.) Tipos de digestión celular Los lisosomas llevan a cabo la digestión intracelular controlada de macromoléculas, pero algunos tipos celulares pueden realizar una digestión extracelular mediante exocitosis de sus lisosomas. Por ejemplo, el acrosoma del espermatozoide es un lisosoma especial que hace posible la fecundación; el contacto con la zona pelúcida del ovocito induce la reacción acrosómica, que lleva consigo la liberación de varias enzimas hidrolíticas que facilitan el paso del espermatozoide a través de la zona pelúcida y su posterior fusión con el ovocito. La fusión del acrosoma con la membrana plasmática en el espermatozoide causa la liberación de las enzimas capaces de digerir la zona pelúcida. Otro ejemplo de digestión extracelular es la llevada a cabo por los osteoclastos, células residentes en el hueso cuya misión es la remodelación ósea. La exocitosis de los lisosomas de los osteoclastos libera enzimas al espacio extracelular que son capaces de digerir los componentes orgánicos de la matriz ósea. La digestión intracelular de sustratos mediada por lisosomas puede ser de dos tipos: a) heterofagia, cuando los sustratos que se digieren provienen del exterior celular mediante endocitosis o fagocitosis, y b) autofagia, cuando las células digieren sus propios componentes celulares. La autofagia consiste básicamente en un proceso de autodigestión mediante el cual las células fagocitan sus propias estructuras. Esto beneficia en diversos aspectos a las células. En primer lugar es un mecanismo protector que implica un reciclaje dinámico de sus estructuras, gracias al cual tienen lugar la renovación y la homeostasis celular. Se eliminan así componentes celulares alterados, hipertrofiados o invadidos por agentes infecciosos. Además supone un mecanismo de supervivencia celular en situaciones de inanición o estrés. Existe un tipo especial de autofagia (denominada crinofagia) en el cual la célula digiere sus propios gránulos de secreción. La autofagia está controlada 447 genéticamente por la familia de genes Atg (autophagy-related genes). Se pueden distinguir tres tipos de autofagia en función de su forma de realización (fig. 10-21): • Macroautofagia: en este tipo de autofagia a gran escala, una membrana (probablemente derivada del RE) engloba una porción de citoplasma, que incluye material soluble y orgánulos (fig. 10-22). El elemento membranoso formado (autofagosoma) se fusiona con un lisosoma, formándose un autolisosoma en el que se llevará a cabo la digestión. • Microautofagia: en este caso, pequeñas porciones de citoplasma son captadas por invaginaciones de la membrana del lisosoma, donde tiene lugar la digestión de las sustancias. • Autofagia mediada por chaperonas: algunas proteínas citosólicas presentan una secuencia de tipo KFERQ. Son reconocidas por la chaperona Hsc70 y otras cochaperonas, y translocadas al lisosoma mediante la proteína transmembrana del lisosoma Lamp-2A. FIGURA 10-21 Esquema que muestra los distintos tipos de autofagia: macroautofagia, microautofagia y autofagia mediada por chaperonas. FIGURA 10-22 Imagen de un autofagosoma producido por la degradación de mitocondrias en una célula oxíntico-péptica. (Reproducida a partir de: Burrell MA et al. Atlas de ultraestructura celular. Pamplona: EUNSA; 2011.) La autofagia es un proceso inducido por el estrés celular y por diversas patologías. En situaciones de falta de alimento se activan los procesos de autofagia, principalmente en el hígado, páncreas, músculo esquelético y riñón. La 448 insulina (hormona reguladora de la glucemia) bloquea los procesos de autofagia. También se activa para eliminar orgánulos hipertrofiados; por ejemplo, la administración de fenobarbital en ratas provoca un gran aumento del REL en hepatocitos, con el fin de eliminar dicha sustancia tóxica. Posteriormente, el retículo se elimina por un proceso de autofagia. De esta forma se previene el acúmulo de proteínas, lípidos y orgánulos dañados. Las alteraciones en la autofagia se han relacionado con diversas patologías hepáticas y neurodegenerativas, con el envejecimiento, el cáncer y el síndrome metabólico. Numerosos estudios están analizando la contribución de la autofagia en estas enfermedades, en las que parece que puede jugar un papel crítico para su desarrollo. Actualmente hay muchas evidencias referentes al papel que desempeña la autofagia en el control del envejecimiento, habiéndose demostrado la importancia de varias proteínas relacionadas con este proceso en la longevidad de algunas especies. El papel de la autofagia en el cáncer no está del todo claro. Podría actuar como mecanismo de resistencia frente a la apoptosis, por lo que proporcionaría una ventaja a las células tumorales. Por otro lado, se ha demostrado la presencia de fármacos inductores de muerte por autofagia en células tumorales que son resistentes a la muerte inducida por apoptosis. La temozolomida (que se utiliza para el tratamiento de los pacientes con glioblastoma) y algunos inhibidores de las moléculas de señalización intracelular de la vía de mTOR (mammalian Target of Rapamycin), PI3K y AKT causan muerte celular por autofagia. Por ejemplo, la rapamicina y sus derivados inhiben la acción de la proteína mTOR, relacionada con síntesis de proteínas, metabolismo y supervivencia celular, e inducen muerte por autofagia. Existe actualmente una intensa investigación sobre la autofagia, ya que parece que este mecanismo puede estar involucrado de modo significativo en numerosas patologías humanas. Patologías relacionadas con disfunciones de los lisosomas Existen distintas patologías relacionadas con alteraciones de la actividad de los lisosomas. Estas enfermedades se pueden clasificar básicamente en dos grupos (dependiendo del origen de la alteración) que se exponen a continuación. Por ruptura de los lisosomas Existen algunos productos químicos (vitamina A y algunas hormonas) que alteran la estabilidad de la membrana de los lisosomas, pudiendo producirse una liberación anormal de las hidrolasas. En otros casos la función normal de los lisosomas se ve alterada al verse obligados a captar grandes cantidades de alguna sustancia (cristales de urato en la gota, partículas de sílice en la silicosis) que las células no son capaces de digerir, provocando la lisis lisosómica. Profundizaremos algo más en la enfermedad de la silicosis, que puede servir como ejemplo para mostrar este tipo de patologías. Se trata de una enfermedad que se agrupa bajo el término de neumoconiosis o enfermedades pulmonares por inhalación de polvo inorgánico. Es típica de los mineros y de otras 449 profesiones donde puede haber inhalación de sílice. Se desencadena como consecuencia del depósito de estas partículas en el parénquima pulmonar, donde los intentos de aclaramiento bronquial por parte de los fagocitos resultan ser insuficientes. Los cristales de sílice, que no pueden ser digeridos por los fagocitos, rompen las membranas del lisosoma y causan la muerte de los fagocitos. Esto provoca inflamación crónica y reclutamiento de células del sistema inmunitario, en un intento por eliminar estas partículas. La presencia de células inflamatorias de modo crónico libera sustancias oxidantes, factores de crecimiento y citoquinas, que conducen a una citotoxicidad y a fibrosis pulmonar. Así, aumenta el riesgo de padecer infecciones (como la tuberculosis) y el cáncer. De hecho, en modelos animales a los que se les administra una sola dosis de sílice de un determinado tamaño, acaban produciéndose lesiones neoplásicas. Enfermedades causadas por acumulación o almacenamiento Son enfermedades hereditarias, de baja incidencia, en las que faltan una o más enzimas lisosómicas para la degradación de macromoléculas, con la consiguiente acumulación progresiva del sustrato correspondiente. Las manifestaciones clínicas de estas enfermedades dependen de la enzima afectada; normalmente dan lugar a cuadros neurodegenerativos, organomegalia, y anomalías cutáneas, oculares y óseas. Existe un gran número de enfermedades de este tipo (tabla 10-1); nos centraremos en el estudio de tres de ellas: las enfermedades de Fabry, Gaucher y la mucolipidosis tipo II. Tabla 10-1 Ejemplos de trastornos causados por almacenamiento lisosómico Enfermedad de Fabry Está causada por un déficit de la enzima α-galactosidasa A. Se origina por un defecto genético localizado en el cromosoma X, lo que explica su mayor incidencia en varones. Debido a que la función de esta enzima es la eliminación de un compuesto de carácter lipídico (la globotriaosilceramida GL-3), su déficit conducirá a una progresiva acumulación de esta sustancia en las células, lo que ocurre de modo importante en los vasos sanguíneos, hígado, corazón, piel y cerebro (fig. 10-23). Entre las manifestaciones clínicas son característicos el ardor en 450 las palmas de las manos, la disminución de la sudoración, la intolerancia al calor y al ejercicio, la aparición de angioqueratomas (manchas rojas en la piel, que cuando se dan sobre el ombligo o la rodilla tienen valor diagnóstico), el fallo renal y la opacidad de la córnea, entre otras. Esta enfermedad no tiene cura, pero un diagnóstico temprano permite moderar los daños gracias a la aplicación de un tratamiento que consiste en la administración de la enzima y el control de los síntomas. Su elevado coste, sin embargo, impide a muchos pacientes un tratamiento adecuado. FIGURA 10-23 Electronografía de una célula epitelial renal de un paciente con enfermedad de Fabry, donde se observan los depósitos de glucolípidos sin digerir en los lisosomas (flecha). (Reproducida a partir de: Abe A et al. J Clin Invest 2000;105(11):1563-71.) Enfermedad de Gaucher Es la enfermedad por acumulación en los lisosomas más común. Es una lipidosis con tres presentaciones clínicas que difieren en severidad y grado de afectación del sistema nervioso. El déficit de glucocerebrosidasa explica su patogenia, puesto que no pueden ser degradados los glucocerebrósidos a glucosa y ceramida. La variante I es menos severa; no afecta al sistema nervioso, pero se aprecian lesiones óseas, esplenomegalia y hepatomegalia. Tiene una distribución característica, ya que afecta fundamentalmente a la población judía (1/2.500 individuos). Por otro lado, las variantes II y III, aunque menos frecuentes, se manifiestan tanto en la población judía como en la no judía. La primera cursa con una importante afectación del sistema nervioso central que aparece en la infancia, cuya evolución puede causar la muerte en edad temprana; y la variante III (con una afectación intermedia) da lugar a síntomas neurológicos como la demencia y la espasticidad hacia los 10 años de edad. El tratamiento enzimático sustitutivo y el control de síntomas mejoran las condición de los pacientes; al igual que en la enfermedad de Fabry, el elevado coste representa un serio problema para estos enfermos. 451 Mucolipidosis tipo II Conocida en inglés como I-cell disease (inclusion-cell disease), es una enfermedad poco común en la que los lisosomas están desprovistos de todas las enzimas hidrolíticas, debido a la falta de la enzima fosfotransferasa de N-acetil glucosamina, que cataliza el primer paso en el marcaje de las enzimas lisosómicas con M6P. La alteración funcional de esta enzima impide que las enzimas lisosómicas alcancen su destino, por lo que, en vez de dirigirse a los lisosomas, continúan la ruta de secreción y aparecen en el exterior celular. En estos pacientes hay una presencia en el suero de las hidrolasas lisosómicas, lo que permite un fácil diagnóstico. Cursa con malformaciones, retraso en el crecimiento, falta de tono muscular y fallecimiento, muy frecuentemente antes de cumplir los 5 años de edad. Lecturas recomendadas Bonifacino JS, Glick BS. The mechanisms of vesicle budding and fusion. Cell. 2004;116:153–166. Farquhar MG, Palade GE. The Golgi apparatus: 100 years of progress and controversy. Trends Cell Biol. 1998;8:2–10. Futerman AH, Van Meer G. The cell biology of lysosomal storage disorders. Nat Rev Mol Cell Biol. 2004;5:554–565. Kaushik S, Cuervo AM. Chaperone-mediated autophagy: a unique way to enter the lysosome world. Trends Cell Biol. 2012;22(8):407– 417. Mazzarello P, Garbarino C, Calligaro A. How Camillo Golgi became “the Golgi”. FEBS Lett. 2009;583:3732–3733. Mellman I, Nelson WJ. Coordinated protein sorting, targeting and distribution in polarized cells. Nat Rev Mol Cell Biol. 2008;9:833–845. Mizushima N, Komatsu M. Autophagy: renovation of cells and tissues. Cell. 2011;147:728–741. Rothman JE, Wieland FT. Protein sorting by transport vesicles. Science. 1996;272:227–234. Scales SJ, Gomez M, Kreis TE. Coat proteins regulating membrane traffic. Int Rev Cytol. 2000;195:67–144. Walter P, Ron D. The unfolded protein response: From stress pathway to homeostatic regulation. Science. 2011;334:1081–1086. Preguntas de autoevaluación 1. ¿De los siguientes tipos celulares, cuáles poseen la vía secretora regulada?: a. Todas las células epiteliales. 452 b. Las células secretoras de hormonas. c. Todas las células excepto las células secretoras de hormonas. d. Todas las células. e. Ninguna de las opciones es correcta. Respuesta correcta: b. 2. De los siguientes tipos celulares, ¿cuál presenta basofilia en grumos?: a. Células del páncreas. b. Espermatozoides. c. Hepatocitos. d. Células plasmáticas. e. Células epiteliales. Respuesta correcta: c. 3. La fosfatasa ácida es una enzima que está típicamente presente en: a. Las cisternas Cis del aparato de Golgi. b. Los lisosomas. c. El RER. d. Las cisternas Trans del aparato de Golgi. e. El REL. Respuesta correcta: b. 4. La enfermedad de Gaucher se debe a la ausencia de: a. α-galactosidasa A. b. Todas las enzimas lisosómicas. c. Glucosa-fosforilasa. d. Glucocerebrosidasa. e. Ninguna de las anteriores. Respuesta correcta: d. 453 5. ¿Cómo se llama el gran complejo proteico citosólico especializado en degradación de proteínas?: a. Lisosoma. b. Autofagosoma. c. Proteasoma. d. Microsoma. e. Ninguna de las opciones es correcta. Respuesta correcta: c. 6. De las siguientes proteínas, ¿cuál de ellas no es una chaperona?: a. Binding protein (BiP). b. Hsc70. c. Isomerasa de puentes disulfuro (PDI). d. Calnexina. e. Calreticulina. Respuesta correcta: c. 7. De los siguientes tipos celulares, ¿en cuál está especialmente desarrollado el REL?: a. Neuronas. b. Células secretoras de hormonas esteroideas. c. Células secretoras de proteínas. d. Osteoclastos. e. Espermatozoides. Respuesta correcta: b. 8. ¿Qué tipo de vesículas participa en el transporte desde el RER al Golgi?: a. Revestidas de clatrina. b. Revestidas de COPI. c. Revestidas de COPII. d. Cavéolas. 454 e. Vesículas lisas. Respuesta correcta: c. 9. ¿Qué señal contienen las proteínas solubles residentes en el RER?: a. Manosa 6-fosfato. b. Glucosa 6-fosfato. c. KFERQ. d. KDEL. e. Ninguna de estas opciones es correcta. Respuesta correcta: d. 10. La proteína mTOR está involucrada en: a. Autofagia. b. Síntesis de lípidos. c. Translocación de hidratos de carbono al RER. d. Plegamiento de proteínas en el RER. e. Ninguna de las anteriores. Respuesta correcta: a. 455 CAPÍTULO 11 456 Mitocondrias y peroxisomas. Bioenergética y metabolismo oxidativo Matías Ávila Carmen Berasain Objetivos de aprendizaje • Conocer los aspectos fundamentales de la estructura y de la función mitocondrial. • Describir la estructura, la expresión y la transmisión del material genético mitocondrial. • Identificar y describir los procesos esenciales del metabolismo oxidativo mitocondrial, del papel de la mitocondria en la generación de especies reactivas de oxígeno y de su implicación en la apoptosis. • Conocer las características básicas de la estructura, la regulación y la función de los peroxisomas. • Describir los mecanismos responsables de las principales patologías asociadas a las alteraciones mitocondriales y peroxisómicas. 457 Estructura y composición de las mitocondrias Las mitocondrias son orgánulos celulares de forma generalmente oval y de tamaño variable según su origen y estado metabólico, aunque típicamente miden 2 μm de longitud y 0,5 μm de diámetro, aproximadamente el tamaño de una bacteria. Las mitocondrias no solamente desempeñan un papel esencial en el metabolismo oxidativo y la generación de energía en forma de ATP, sino que también participan en una serie de procesos fundamentales como son la señalización celular, la diferenciación y apoptosis, y el control del crecimiento de la célula. El número de mitocondrias por célula varía según el tipo celular; así, algunas células poseen una sola mitocondria mientras que otras contienen varios miles. Estos orgánulos citoplasmáticos están delimitados por una doble membrana lipídica: una fina membrana externa y una membrana interna muy amplia que presenta unas invaginaciones o plegamientos denominados crestas (fig. 11-1). La membrana externa presenta una relación fosfolípido/proteína similar a la membrana plasmática (1:1 en peso). Esta membrana contiene unas proteínas integrales denominadas porinas, las cuales forman canales que permiten la libre difusión de moléculas de hasta 10 kDa, por lo que la composición del medio que ocupa el espacio entre las dos membranas (espacio intermembrana) es muy similar a la del citoplasma. Las proteínas de mayor tamaño pueden entrar también en las mitocondrias siempre que presenten una secuencia señal en su extremo N-terminal. Como se comentará más adelante, esta secuencia es reconocida por un complejo multiproteico denominado translocasa, asociado a la superficie de la mitocondria, que media el transporte activo de proteínas de gran tamaño al interior del orgánulo. La membrana mitocondrial externa puede asociarse a la membrana del retículo endoplasmático, formando unas estructuras que permiten la transmisión de señales mediada por iones Ca y la transferencia de lípidos entre 2+ ambos compartimentos. 458 FIGURA 11-1 A. Estructura de la mitocondria. B. Imagen de una mitocondria al microscopio electrónico de transmisión. (B, reproducida a partir de Don W. Fawcett. The Cell. Philadelphia: Saunders, 1981.) La membrana mitocondrial interna presenta una alta relación proteína/fosfolípido (más de 3:1 en peso), y solo es permeable a O , CO y H O. Esta membrana es rica en un fosfolípido poco común, la cardiolipina, que además de en la 2 2 2 mitocondria se encuentra también en las membranas plasmáticas bacterianas. La cardiolipina contiene cuatro ácidos grasos en vez de dos, lo que hace que este fosfolípido contribuya a la impermeabilidad de la membrana interna. Además de las proteínas de la cadena respiratoria, la membrana mitocondrial interna contiene numerosos transportadores encargados de regular el paso de metabolitos (como el ATP, el ADP y el piruvato) e iones (como el Ca ). Asociados a la membrana interna se encuentran también sistemas de transporte de proteínas al interior de la 2+ mitocondria, como el complejo de la translocasa situado en esta membrana. Esta permeabilidad tan controlada permite la generación de gradientes iónicos esenciales para la compartimentalización de las funciones metabólicas entre el citosol y la mitocondria. La presencia de las crestas anteriormente mencionadas incrementa significativamente la superficie de la membrana interna. De esta manera, en las mitocondrias de los hepatocitos, por ejemplo, la superficie de la membrana interna es cinco veces mayor que la de la membrana externa. El número de crestas varía con la actividad respiratoria de cada tipo particular de célula, debido a que las proteínas implicadas en el transporte de electrones y la fosforilación oxidativa están unidas a la membrana mitocondrial interna. Así, las mitocondrias de células que tienen mayor demanda de ATP, como las células del músculo cardíaco, contienen más crestas que las mitocondrias de los hepatocitos, células con una menor velocidad de respiración. El compartimento interno mitocondrial que queda delimitado por la membrana interna se denomina matriz (v. fig. 11-1), y contiene una sustancia tipo gel (<50% de agua) muy rica en proteína (66% del total de la proteína de la mitocondria). Entre estas proteínas destacan las enzimas solubles del metabolismo oxidativo, como las del ciclo del 459 ácido cítrico o ciclo de Krebs. También hay metabolitos (como el piruvato y el citrato), cofactores nucleotídicos e iones inorgánicos. La matriz mitocondrial también contiene su propio material genético, así como la maquinaria para sintetizar sus propios ARN (ARNm, ARNt y ARNr) y proteínas, como se describe a continuación. 460 Genoma mitocondrial El ADN mitocondrial (ADNmt) presenta una serie de características específicas. El ADNmt humano es una molécula circular cerrada de 16.569 pares de bases cuya secuencia es totalmente conocida. Una mitocondria puede contener de 2 a 10 copias de su ADN, de tal forma que una célula puede contener entre 1.000 y 10.000 copias de ADNmt, dependiendo del tejido o de las condiciones fisiológicas (poliplasmia). A diferencia del ADN nuclear, el ADNmt no se encuentra asociado a histonas, lo que unido a su proximidad a los centros de producción de radicales libres de oxígeno podría explicar su alta tasa de mutación, 10 veces superior a la del ADN nuclear. En una misma célula pueden coexistir mitocondrias con el ADN normal junto a mitocondrias con el ADN mutado (heteroplasmia) (fig. 112). El ADNmt codifica 37 genes: 13 correspondientes a subunidades de los complejos respiratorios I, III, IV y V; 22 correspondientes a ARNt (para los 20 aminoácidos más un gen extra para el ARNt de la leucina y otro para el de la serina), y dos ARNr (ARNr 12S y 16S). No todas las proteínas necesarias para la función y la biosíntesis mitocondrial son codificadas por el ADNmt; por ejemplo, la mayoría de los polipéptidos de los complejos respiratorios son codificados por el genoma nuclear y posteriormente importados a la mitocondria (tabla 11-1). FIGURA 11-2 Heteroplasmia y segregación mitótica. Tabla 11-1 Componentes del sistema mitocondrial de la fosforilación oxidativa La organización genética del ADNmt es muy compacta. En humanos carece de intrones y ambas cadenas están casi completamente ocupadas por genes; contiene muy poco ADN repetitivo y no hay ninguna región 5’ y 3’ que no se traduzca (fig. 11-3). 461 La cadena pesada (H) codifica para doce polipéptidos, los dos ARNr y 14 ARNt, mientras que la cadena ligera (L) codifica solamente para un polipéptido y ocho ARNt. El origen de replicación de la cadena H está dentro de una región conocida como bucle D, que también contiene los promotores para las cadenas H y L. Desde estos promotores se dirige la síntesis de dos precursores de ARN de gran tamaño, que posteriormente son procesados a moléculas de ARN individuales. Muchos de los genes que codifican para polipéptidos carecen de un codón de terminación completo, y terminan en una T o TA después del último codón con sentido. El agregado de una cola de poli(A) al extremo 3’ del ARNm proporciona un codón de terminación UAA que detiene la traducción. FIGURA 11-3 Estructura del ADNmt. pb, pares de bases. El código genético mitocondrial es más flexible o relajado que el nuclear, de tal forma que muchas moléculas de ARNt reconocen tripletes con cualquiera de los tres nucleótidos en la tercera posición del codón. Como consecuencia de ello, la síntesis de proteínas mitocondriales solo requiere 22 moléculas de ARNt. Además, el código mitocondrial presenta excepciones a la universalidad del código genético, y hay cuatro codones o tripletes que codifican para aminoácidos diferentes en el núcleo y en la mitocondria. Por ejemplo, el codón de terminación UGA es leído como triptófano en las mitocondrias (fig. 11-4). Otra particularidad y similitud con los procariotas es que la síntesis proteica en los ribosomas mitocondriales se inicia con N-formil-metionina. Estos ribosomas, al igual que los bacterianos, son sensibles a antibióticos como el cloranfenicol y la estreptomicina, lo cual representa la principal causa de toxicidad de estos antibióticos, y a diferencia de los ribosomas citosólicos, son resistentes a la cicloheximida (tabla 11-2). 462 FIGURA 11-4 Código genético mitocondrial. N indica el código genético dependiente del núcleo. M indica el código genético mitocondrial. Tabla 11-2 Sensibilidad a antibióticos de los ribosomas mitocondriales Ribosoma de mitocondrias y bacterias Ribosoma citosólico Cloranfenicol Inhibe No inhibe Estreptomicina Inhibe No inhibe Cicloheximida Inhibe No inhibe Las mitocondrias se replican por fisión binaria, de manera similar a como lo hacen las bacterias, pero a diferencia de estas, las mitocondrias también pueden experimentar procesos de fusión con otras mitocondrias. La regulación de esta división no es igual en todas las células eucariotas. En eucariotas unicelulares la división está ligada al ciclo celular, mientras que en eucariotas superiores la replicación de las mitocondrias está asociada principalmente a la demanda energética. Cuando la demanda energética disminuye, las mitocondrias pueden ser destruidas o permanecer inactivas. El ADNmt no se replica de manera ordenada y regulada como el ADN nuclear, sino que tiene la capacidad de replicarse durante todo el ciclo celular sin coordinarse con la replicación del material genético del núcleo. La replicación del ADNmt la realiza una ADN polimerasa específica denominada ADN polimerasa γ. Durante la división celular las mitocondrias sufren una segregación mitótica y se distribuyen al azar entre las células hijas. De esta forma, una célula con heteroplasmia puede dar lugar a células con fenotipos diferentes. Al estar contenidos en un orgánulo citoplasmático, los genes mitocondriales no se heredan de la misma manera que los genes nucleares, sino que lo hacen exclusivamente por vía materna (presentando, por lo tanto, un patrón no mendeliano). Tanto el espermatozoide como el óvulo poseen mitocondrias; sin embargo, el contenido de ADNmt del óvulo es muy superior al del espermatozoide. Además, tras la fertilización, las mitocondrias paternas que penetran en el óvulo son eliminadas. 463 Incorporación de proteínas a la mitocondria Se ha estimado que las mitocondrias contienen entre 1.000 y 2.000 tipos diferentes de proteínas, dependiendo de su tejido de origen. Como se ha mencionado anteriormente, el ADNmt solamente codifica para 13 de estas proteínas, por lo que la mayoría de las proteínas presentes en la mitocondria son codificadas por el genoma nuclear, sintetizándose en los ribosomas citosólicos, y debiendo ser importadas posteriormente a la mitocondria. Esto sugiere la existencia de mecanismos específicos que coordinen el transporte y la acumulación de proteínas desde el citosol a la mitocondria de manera regulada, para garantizar el correcto funcionamiento de la maquinaria mitocondrial. Estos mecanismos deben ser capaces también de mediar el transporte de las proteínas a diferentes compartimentos dentro de la propia mitocondria: la membrana externa, el espacio intermembrana, la membrana interna y la matriz mitocondrial. Las proteínas que deben ser transportadas a las mitocondrias poseen unas secuencias señal que permiten su reconocimiento por receptores presentes en la superficie de estos orgánulos y su posterior transporte por la translocasa de la membrana externa (TOM, del inglés translocase of the outer membrane), o por una de las dos translocasas de la membrana interna (TIM, del inglés translocase of the inner membrane) (fig. 11-5). Todas las proteínas que se localizarán en la matriz mitocondrial, así como algunas de las dirigidas al espacio intermembrana y a la membrana interna, poseen en el extremo N-terminal secuencias de entre 15 y 40 residuos de aminoácidos básicos e hidroxilados capaces de formar hélices anfipáticas. Por otra parte, aproximadamente el 30% de las proteínas dirigidas a la mitocondria no presentan estos motivos estructurales en el extremo N-terminal, y la información que permite su localización mitocondrial está contenida en su secuencia interna. Entre estas proteínas se encuentran algunas de la membrana interna y del espacio intermembrana, así como todas las localizadas en la membrana externa. Las señales de localización mitocondrial de estas proteínas son de naturaleza más heterogénea y aún no se han caracterizado completamente. A pesar de esta heterogeneidad, todas las proteínas que son dirigidas a la mitocondria son capaces de interaccionar con el complejo TOM. Este complejo reconoce a las proteínas en el citoplasma, facilita su disociación de factores citosólicos a los que puedan estar unidas, contribuye a su desplegamiento y transfiere los polipéptidos a través de poros en la membrana, mediando también la inserción en la misma de aquellas proteínas cuyo destino es la membrana mitocondrial externa. Todas estas funciones son realizadas por diferentes componentes del complejo TOM, que comprende tanto diferentes subunidades con capacidad receptora (Tom70, Tom20 y Tom22) como elementos estructurales de los poros (Tom5, Tom6, Tom7 y Tom40). Tanto la estructura como la función del complejo TOM están muy conservadas en la escala evolutiva. 464 FIGURA 11-5 Sistemas de transporte de proteínas a la mitocondria. ME, membrana externa; MI, membrana interna; MPP, peptidasa de matriz mitocondrial; TIM, translocasas de la membrana interna; TOM, translocasa de la membrana externa. El denominado complejo TIM23 es el responsable del transporte de todas las proteínas de la matriz mitocondrial y de aquellas que residen en la membrana interna de la mitocondria. Para funcionar, este complejo requiere energía, que deriva de dos fuentes distintas: el potencial de la membrana y el ATP. Los componentes del complejo TIM23 pueden dividirse en dos grupos que operan de manera secuencial y cooperativa. Por una parte, se identifican las subunidades que se encuentran embebidas en la membrana, las cuales actúan de receptores y componentes estructurales del canal (Tim17, Tim21, Tim23 y Tim50). Estas subunidades, además de ser responsables de reconocer las señales de importación, intervienen en los pasos iniciales del transporte a través de la membrana interna, empleando para ello energía derivada del potencial de membrana. El segundo grupo de componentes del complejo TIM23 (Tim14, Tim16, Tim44, mtHsp70 y Mge1) lleva a cabo la translocación a la matriz mitocondrial en un proceso dependiente de ATP. Una vez en la matriz mitocondrial, las secuencias N-terminales de las proteínas transportadas son eliminadas por una proteasa, denominada peptidasa de matriz mitocondrial. Por otra parte, dado que las proteínas son transportadas a la mitocondria en una conformación desplegada, necesitan recuperar su estructura nativa para realizar su función. Esto se consigue mediante la acción de una serie de chaperonas esenciales para el correcto funcionamiento de la mitocondria, como son Hsp70 y Hsp60/Hsp10. Existe una condición fisiológica en la que la mitocondria libera proteínas hacia el citoplasma; es el caso de la muerte celular programada (fig. 11-6). La activación de la denominada vía intrínseca de la apoptosis (v. capítulo 15) resulta en la permeabilización de la membrana mitocondrial externa y la liberación de proteínas proapoptóticas, tales como el citocromo c (que, como veremos más adelante, participa en la formación del apoptosoma), Smac/Diablo, el factor inductor de apoptosis (AIF) o la endonucleasa G. Estas proteínas, en último término, activan las caspasas efectoras (p. 465 ej., caspasa 3), las cuales provocan la fragmentación de numerosos sustratos e inducen una secuencia de cambios morfológicos en la célula que van desde la fragmentación del ADN y la condensación nuclear, hasta la exposición de la fosfatidilserina y de moléculas de adhesión en la superficie celular. Todo ello tiene como consecuencia la muerte celular por apoptosis. FIGURA 11-6 La mitocondria en el proceso de apoptosis. AIF, factor inductor de apoptosis; IAP, inhibidor de la proteína apoptótica; TNF, factor de necrosis tumoral; Cit c, citocromo c. Las caspasas efectoras se pueden activar por dos vías diferentes. La vía extrínseca, que implica la activación de receptores de muerte, como los miembros de la familia del receptor del factor de necrosis tumoral (TNF) y el receptor FAS, lleva a la activación de una cascada de caspasas iniciada por la caspasa 8. Como hemos señalado más arriba, la mitocondria desempeña un papel central en la vía intrínseca de la apoptosis. La formación de los poros en la membrana externa de la mitocondria y la liberación de las proteínas proapoptóticas (es decir, el destino celular — supervivencia o muerte—), dependen del balance entre los miembros proapoptóticos y antiapoptóticos de la familia de proteínas Bcl-2 (del inglés B-cell lymphoma 2) presentes en la membrana mitocondrial. Las proteínas antiapoptóticas de esta familia comparten de dos a cuatro dominios de homología (BH1-4) e incluyen los miembros BCL-2, BCL-XL, Mcl1, BCL-W y A1. Estas proteínas realizan su función secuestrando e inhibiendo a los miembros proapoptóticos, que se dividen en dos grupos: las proteínas multidominio BAX y BAK (que son capaces de producir los poros e inducir la apoptosis) y las proteínas BAD, BIM, BID, BIK, HRK, NOXA y PUMA (que poseen solo el dominio BH3 [BH3-only] y una función proapoptótica reguladora no efectora). Entre estas proteínas, BID se activa mediante proteólisis mediada por la caspasa 8, de tal forma que sirve de conexión entre las vías de apoptosis extrínseca e intrínseca (v. capítulo 15). En respuesta a diferentes señales de estrés o tras la activación de p53 como consecuencia de un daño sobre el ADN, se induce la expresión de los genes proapoptóticos BH3-only. Estas proteínas inhibirán a las proteínas antiapoptóticas y, como consecuencia, se activarán las proteínas BAX y BAK, y se producirá la pérdida de la integridad mitocondrial y la liberación del citocromo c al citoplasma. En el citoplasma, el citocromo c formará el complejo del apoptosoma junto a APAF1 y la caspasa 9. En presencia de ATP se producirá la activación de la caspasa 9 y la subsiguiente activación de las caspasas efectoras y la muerte celular. 466 467 Metabolismo oxidativo mitocondrial Como se ha comentado anteriormente, entre las funciones fundamentales de la mitocondria se encuentran la producción de ATP y la regulación del metabolismo celular. La fosforilación oxidativa es el proceso en el que se genera energía química en forma de ATP como resultado de la transferencia de electrones del NADH o el FADH 2 formados durante la glucólisis, el ciclo de Krebs y la oxidación de los ácidos grasos, al O (fig. 11-7). El ciclo de Krebs, 2 también conocido como ciclo del ácido cítrico o ciclo de los ácidos tricarboxílicos, tiene lugar en la matriz mitocondrial, y es una ruta común en el metabolismo de todos los sustratos energéticos, incluidas las grasas, los azúcares y las proteínas. El ciclo de Krebs lo constituye una secuencia cerrada de nueve reacciones cuyo producto inicial y final es el oxaloacetato (v. fig. 11-7). El primer paso de este ciclo consiste en la condensación del oxaloacetato con la acetil-coenzima A (acetil-CoA) para formar el citrato, reacción que es catalizada por la enzima citrato sintasa. En cada vuelta del ciclo se consume un grupo acetilo del acetil-CoA que se oxida a dos moléculas de CO , y se generan 2 tres moléculas de NADH, una de FADH y un GTP. El acetil-CoA es un producto común a varias vías catabólicas que 2 puede provenir de la glucólisis mediante la descarboxilación oxidativa del piruvato catalizada por el complejo de la piruvato deshidrogenasa. Como veremos más adelante, el acetil-CoA también puede obtenerse en la oxidación de los ácidos grasos (β-oxidación), así como del catabolismo de los aminoácidos. En el siguiente paso del ciclo, el citrato es isomerizado a isocitrato por la enzima aconitasa. A continuación, la isocitrato deshidrogenasa y la α-cetoglutarato deshidrogenasa, secuencialmente, catalizan la descarboxilación oxidativa del isocitrato y del α-cetoglutarato respectivamente, reacciones en las que se generan dos moléculas de NADH y se produce finalmente succinil-CoA. Ambas reacciones son fuertemente exergónicas, sobre todo la catalizada por la isocitrato deshidrogenasa, lo cual determina la irreversibilidad del ciclo. La succinil-CoA es una molécula rica en energía que, a su vez, es metabolizada por la enzima succinil-CoA-sintetasa. En esta reacción, la energía del enlace tioéster de la succinil-CoA se conserva al formarse GTP a partir de GDP y fosfato inorgánico; se regenera entonces el CoA y se produce succinato. A partir del succinato se llegará finalmente al oxaloacetato en tres reacciones. En primer lugar, la succinato deshidrogenasa oxida el succinato a fumarato, formándose FADH . Es interesante mencionar que, a diferencia de las demás enzimas del ciclo 2 de Krebs, la succinato deshidrogenasa no se encuentra de forma soluble en la matriz mitocondrial, sino que está fijada a la membrana mitocondrial interna, actuando de nexo de unión entre este ciclo y la fosforilación oxidativa, como se verá más adelante. El fumarato es convertido en malato por la enzima fumarasa, y el malato pasa a oxaloacetato por acción de la malato deshidrogenasa, en una reacción en que se genera NADH, completándose así el ciclo de los ácidos tricarboxílicos. Como se mencionó anteriormente, el NADH y el FADH formados en este ciclo serán empleados 2 posteriormente en la cadena de transporte electrónico, regenerándose así NAD y FAD de manera acoplada al + consumo de oxígeno, lo cual implica que el ciclo de Krebs es un proceso obligatoriamente aeróbico. Es importante destacar que el ciclo de Krebs cumple también una importante función en procesos biosintéticos; así, el oxaloacetato y el α-cetoglutarato son importantes precursores en la síntesis de aminoácidos, el citrato participa en la síntesis de 468 ácidos grasos y esteroides, y el succinato es esencial para la síntesis de porfirinas. El ciclo también puede recibir nuevos componentes que se incorporan en diferentes puntos contribuyendo a mantener su funcionamiento. Las reacciones que proporcionan estos componentes se denominan reacciones anapleróticas, y un ejemplo de ellas es la catalizada por la enzima piruvato carboxilasa, que genera oxaloacetato a partir de piruvato y CO , consumiendo ATP. 2 FIGURA 11-7 Ciclo de Krebs. CPT, carnitina palmitoiltransferasa. Dada la importancia clave de este ciclo en el metabolismo celular, su regulación es esencial. En presencia de adecuadas concentraciones de sus componentes, sustratos y cofactores podríamos decir que el ciclo funciona de forma autónoma. Sin embargo, se pueden identificar puntos de control que garantizan la direccionalidad del mismo (reacciones irreversibles), así como pasos sensibles a la carga energética de la célula (el cociente ATP/ADP), y reacciones que requieren el posterior acoplamiento del ciclo a la fosforilación oxidativa en la que se regeneran el NAD + y el FAD a partir de NADH y FADH . Así, por ejemplo, la piruvato deshidrogenasa, punto de control estratégico en el 2 que la glucólisis se une al ciclo de Krebs, es inhibida alostéricamente por el ATP, al igual que le ocurre a la citrato sintasa. Por otra parte, tanto la isocitrato deshidrogenasa como la succinato deshidrogenasa se inhiben cuando los niveles de NADH aumentan. También hay mecanismos para activar el ciclo cuando el cociente ATP/ADP disminuye, como, por ejemplo, la activación alostérica de la isocitrato deshidrogenasa por el ADP. Como ya se ha comentado, otro origen metabólico del NADH y el FADH (que serán empleados en la fosforilación 2 oxidativa) es el catabolismo de los ácidos grasos en el proceso conocido como β-oxidación (fig. 11-8). Con la excepción de los ácidos grasos de cadena muy larga (>20 átomos de carbono) que se metabolizan en los peroxisomas, esta ruta tiene lugar en la matriz mitocondrial. Si bien los ácidos grasos de cadena corta y media pueden atravesar la membrana mitocondrial por difusión pasiva, los ácidos grasos de cadena larga (principales componentes de los triglicéridos almacenados en el tejido adiposo y de las grasas de la dieta) deben ser transportados al interior mitocondrial por un sistema específico, como veremos a continuación. El primer paso en el catabolismo de los ácidos grasos implica su activación mediante la unión al CoA, formándose la acil-CoA por la acción de la acil-CoA sintetasa de ácido graso, o tioquinasa, localizada en la superficie exterior de la membrana mitocondrial externa. Si bien la acil-CoA representa la forma activada de los ácidos grasos para su catabolismo, el tamaño y la polaridad de la CoA no le permite atravesar la membrana mitocondrial interna. Aquí interviene un complejo sistema de transporte que comienza con la transferencia 469 del ácido graso de la acil-CoA a una molécula de menor tamaño (la carnitina) mediante la carnitina palmitoiltransferasa I (CPT-I), también localizada en la membrana mitocondrial externa. La molécula de acilcarnitina es transportada a la matriz mitocondrial por una translocasa, o transportador acilcarnitina, localizado en la membrana mitocondrial interna. En el interior de la mitocondria la acilcarnitina es convertida nuevamente a acil-CoA por la acción de la carnitina palmitoiltransferasa II (CPT-II), localizada también en la membrana mitocondrial interna. Finalmente, la carnitina que se ha intercambiado por la CoA es devuelta al espacio intermembrana por la misma translocasa, en lo que se conoce como un mecanismo de antitransporte, en el que la carnitina y el derivado acilcarnitina se mueven en sentido contrario a través de la membrana mitocondrial interna. FIGURA 11-8 La β-oxidación de los ácidos grasos. Una vez en la matriz mitocondrial, los ácidos grasos serán oxidados en una serie de cuatro reacciones que implican la oxidación del carbono β a una cetona, proceso que da nombre a esta ruta metabólica. Tras la oxidación, se produce la ruptura enzimática del enlace entre los carbonos α y β por una tiolasa, de manera que en cada ciclo se produce un mol de acetil-CoA, FADH y NADH, junto a un acil-CoA con dos átomos de carbono menos. El ciclo continúa hasta 2 que todo el ácido graso ha sido convertido en acetil-CoA, que a su vez puede incorporarse al ciclo de Krebs, mientras que el FADH y el NADH se emplean directamente en la fosforilación oxidativa para la síntesis de ATP. 2 En la fosforilación oxidativa interviene una serie de transportadores electrónicos formados por grandes complejos enzimáticos que están localizados en la membrana mitocondrial interna. Desde el punto de vista cuantitativo y en comparación con la glucólisis y el ciclo de Krebs, la fosforilación oxidativa es la principal fuente de ATP en organismos aeróbicos. Así, en la oxidación de una molécula de glucosa hasta CO y H O, la fosforilación oxidativa 2 genera 26 de las 36 moléculas de ATP producidas. 470 2 A grandes rasgos, en la fosforilación oxidativa se pueden distinguir dos partes: en la primera se acopla el flujo de electrones desde el NADH y el FADH hacia el O a través de complejos proteicos localizados en la membrana 2 2 mitocondrial interna con el bombeo de protones hacia el espacio intermembrana. Este bombeo de protones da lugar a un gradiente eléctrico transmembrana que genera una fuerza protón-motriz. En la segunda parte de la fosforilación oxidativa, el complejo enzimático de la ATP sintasa aprovecha la energía del gradiente de protones que vuelven a la matriz mitocondrial para catalizar la síntesis de ATP a partir de ADP y Pi. Desde el NADH al O , la cadena de transporte electrónico (cadena respiratoria), comprende tres bombas de 2 protones: el complejo de la NADH deshidrogenasa (complejo I), la citocromo c reductasa (complejo III) y la citocromo c oxidasa (complejo IV). El FADH es generado en el ciclo de Krebs en la oxidación del succinato a fumarato, reacción 2 catalizada por la succinato deshidrogenasa. Esta enzima forma parte del complejo II (asociado también a la membrana mitocondrial interna), presenta FAD como grupo prostético y transfiere los electrones directamente al complejo III, pero, a diferencia de la NADH deshidrogenasa (complejo I), no bombea protones (fig. 11-9). Hay otras dos enzimas, la glicerol fosfato deshidrogenasa y la acil-CoA deshidrogenasa de ácidos grasos (ruta de la β-oxidación), que también transfieren sus electrones a la cadena de transporte desde el FADH (evadiendo así el complejo I) y que tampoco 2 bombean protones. Los electrones se trasladan de un complejo al siguiente mediante unas moléculas transportadoras especiales. El primero de estos transportadores es la coenzima Q, que actúa entre la NADH deshidrogenasa (complejo I) y la citocromo c reductasa (complejo III). La coenzima Q, también llamada ubiquinona, es una quinona hidrófoba que difunde rápidamente por el interior de la membrana mitocondrial interna, y que puede encontrarse en distintos estados de oxidación. En las quinonas, las reacciones de transferencia de electrones están acopladas a la unión y liberación de protones, siendo esta una propiedad clave para el transporte de protones a través de membranas. En el estado oxidado (Q), la coenzima Q presenta dos grupos ceto. La adición de un protón y un electrón genera la forma semiquinona (QH•), y la adición de un segundo protón y electrón da lugar al ubiquinol (QH ). La semiquinona puede 2 perder un protón, dando lugar al radical aniónico de la semiquinona (Q• ) (fig. 11-10). El segundo transportador es el – citocromo c, una pequeña proteína hidrófila de 13 kDa dotada de un grupo prostético hemo cuyo átomo de hierro se oxida (Fe ) o reduce (Fe ) alternativamente durante su participación en la cadena de transporte electrónico. El 3+ 2+ citocromo c transfiere electrones del complejo III (citocromo c reductasa) al complejo IV (citocromo c oxidasa). FIGURA 11-9 Cadena de transporte electrónico mitocondrial. 471 FIGURA 11-10 Estados de oxidación de las quinonas. El primer paso de la cadena de transporte electrónico en los mamíferos es catalizado, por lo tanto, por la NADH deshidrogenasa. Esta enzima es parte del complejo I, el más grande de la cadena respiratoria (está formado por 46 subunidades diferentes, siete de las cuales están codificadas por el genoma mitocondrial). El complejo I posee como cofactores una molécula de mononucleótido de flavina (FMN) y una molécula de fosfopantoteína, así como ocho centros sulfoférricos binucleares (Fe S ) y tetranucleares (Fe S ) diferentes. Los grupos sulfoférricos se anclan a las 2 2 4 4 cadenas polipeptídicas por grupos tiol de restos de cisteína. Los electrones son transferidos desde el NADH al FMN, y de este a los centros sulfoférricos hasta la coenzima Q. Este proceso lleva acoplado el bombeo de cuatro protones desde la matriz mitocondrial hasta el espacio intermembrana. El mecanismo que coordina la transferencia de electrones y la translocación de protones a nivel del complejo I no está todavía claro en sus detalles moleculares. Como se mencionó anteriormente, existe una segunda ruta de acceso a la cadena respiratoria a partir de deshidrogenasas dependientes de FAD, cuyo representante más importante es la succinato deshidrogenasa o complejo II (v. fig. 11-9). En este caso los electrones del FADH son también transferidos a través de varios centros 2 sulfoférricos a la coenzima Q, que es, por lo tanto, el transportador de electrones común de los complejos I y II a la citocromo c reductasa o complejo III (fig. 11-11). FIGURA 11-11 El complejo III y el ciclo Q. M, membrana; MI, membrana interna. 472 La segunda bomba de protones de la cadena respiratoria es la citocromo c reductasa, la cual toma los electrones de la coenzima Q y los transfiere al citocromo c soluble en el espacio intermembrana. Esta reacción está asociada al bombeo de cuatro protones desde la matriz mitocondrial al espacio intermembrana. La citocromo c reductasa es un homodímero formado por 11 subunidades diferentes; entre ellas destacan una proteína sulfoférrica con un centro Fe S , conocida como proteína Rieske, y los citocromos c y b. Este último posee dos grupos hemos y está codificado 2 2 1 por el genoma mitocondrial. El mecanismo que media la transferencia de electrones desde la coenzima Q hasta el citocromo c y el transporte de protones a través de la membrana se denomina ciclo Q, en el que dos electrones se transfieren al citocromo c y cuatro protones se translocan al espacio intermembrana. Dos moléculas QH se unen de 2 manera consecutiva al complejo, cediendo cada una dos protones y dos electrones. Los protones se liberarán al espacio intermembrana, y los electrones se desplazarán por el complejo a diferentes destinos. Uno de ellos pasa primero al centro Fe S y después al citocromo c , desde donde se transfiere a una molécula de citocromo c oxidado. El 2 2 1 citocromo c que ha captado este electrón difunde en el espacio intermembrana hacia el complejo IV. El segundo electrón viaja por los dos grupos hemo del citocromo b hasta una molécula de coenzima Q oxidada (Q) que se reduce a un anión semiquinona (Q• ). Este anión radical incorpora entonces dos protones del lado de la matriz, dando lugar a – QH y contribuyendo a la generación del gradiente de protones (v. fig. 11-11). En el ciclo Q, por lo tanto, se oxidan dos 2 moléculas de QH para formar Q, y posteriormente una molécula Q se reduce a QH . Este proceso tan complejo 2 2 permite la transferencia de electrones desde un transportador de dos electrones (QH ) a un transportador de un 2 electrón (el citocromo c). El complejo IV transfiere cuatro electrones desde el citocromo c al O , el aceptor final que es reducido a H O en un 2 2 proceso acoplado a la translocación de protones a través de la membrana interna (fig. 11-12). Este complejo está formado por 13 subunidades con una masa total de 200 kDa, siendo las tres de mayor tamaño las que están codificadas por el genoma mitocondrial. La subunidad I, la más grande, contiene dos grupos hemo (a y a ) unidos de 3 manera no covalente y un átomo de cobre (Cu ), que junto al hemo a forma un centro binuclear implicado en la B 3 transferencia de electrones desde el hemo a hasta el O . La subunidad II posee un dominio orientado hacia el espacio 2 intermembrana, donde se une el citocromo c reducido y contiene dos átomos de cobre (Cu ). Los centros de cobre A alternan entre las formas reducidas (Cu ) y oxidadas (Cu ), según acepten o donen electrones. + 2+ 473 FIGURA 11-12 Complejo IV del sistema de transporte electrónico mitocondrial. Los electrones del citocromo c reducido son transferidos al átomo de cobre Cu de la subunidad II, y de aquí al A hemo a de la subunidad I. Posteriormente, y todavía dentro de la subunidad I, los electrones se transfieren al centro binuclear constituido por el Cu y el hemo a , donde tiene lugar la transferencia final de estos electrones a la molécula B 3 de oxígeno. Inicialmente dos electrones son transferidos al O para formar un derivado peróxido (O ). La adición de 2 –2 dos electrones más y dos protones rompe el puente peróxido, y la reacción con otros dos protones permite la liberación de dos moléculas de H O, restaurándose la enzima en su forma inicial completamente oxidada (v. fig. 112 12). Los cuatro protones implicados en esta reacción son tomados exclusivamente de la matriz mitocondrial, contribuyendo así directamente al gradiente de protones. Además de estos cuatro protones implicados en la formación de dos moléculas de H O, se sabe que el complejo IV también bombea al espacio intermembrana otros 2 cuatro protones a través de dos canales presentes en la subunidad I. Como hemos comentado con anterioridad, la energía liberada durante la transferencia de electrones al O a lo largo 2 de la cadena de transporte electrónico se emplea para translocar protones a través de la membrana interna mitocondrial. Esto hace que el espacio intermembrana sea más ácido que la matriz, y que la cara externa de la membrana interna posea más carga positiva, mientras que la cara interna es más negativa. De esta manera se establece 474 un gradiente de carga y de protones (gradiente electroquímico), y el retorno de estos protones a la matriz para igualar su distribución aportará la energía requerida para la síntesis de ATP. El transporte electrónico y la síntesis de ATP están estrechamente acoplados, de manera que los electrones solo fluyen a lo largo de la cadena respiratoria si a la vez el ADP se convierte en ATP. La síntesis de ATP se lleva a cabo por el complejo V, un gran complejo proteico de más de 500 kDa formado por dos grandes dominios: F y F (fig. 11-13). El dominio F está compuesto por cinco subunidades diferentes (α β γδɛ), 1 O 1 3 3 dos de ellas codificadas por el genoma mitocondrial, y se encuentra orientado hacia el espacio de la matriz. La subunidad β de este dominio presenta sitios de unión para ADP y ATP, y posee la actividad catalítica ATP sintasa. El domino F es una estructura integral de membrana que contiene el conducto de protones del complejo. F está O O formado por 10 subunidades c insertadas en la membrana formando un anillo, y una subunidad a en la periferia del anillo. Los dominios F y F están conectados mediante un tallo central compuesto por subunidades de F (γɛ) y una 1 O 1 columna externa formada por una subunidad a, dos subunidades b y la subunidad δ. Se puede considerar que la enzima está compuesta por una parte móvil que gira, el anillo c y el tallo γɛ, así como una parte estacionaria compuesta por el resto de la molécula. El paso de protones tiene lugar a nivel del dominio F gracias a la interacción O de la subunidad a con las subunidades c. En este proceso se induce la rotación del anillo c, que en su movimiento arrastra a la subunidad γ. La rotación de la subunidad γ, localizada en el centro del hexámero α β , provoca cambios 3 3 de conformación en las subunidades β que facilitan la conversión del ADP y el Pi en ATP, además de la liberación del ATP sintetizado. FIGURA 11-13 Estructura de la ATP sintasa. OSCP, proteína que confiere sensibilidad a la oligomicina. 475 Como hemos visto, la síntesis de ATP tiene lugar en la matriz mitocondrial; sin embargo, la utilización de esta molécula, así como la formación del ADP, ocurren principalmente en compartimentos celulares biosintéticamente activos, como el citoplasma. No obstante, debido a su carga negativa, los nucleótidos no pueden cruzar libremente la membrana mitocondrial interna. Esta situación se resuelve con la participación de un sistema de transporte específico a cargo de la ATP-ADP translocasa. Este transportador es una proteína de 30 kDa muy abundante (15% del contenido proteico de la membrana mitocondrial interna), que contiene un único centro de unión para nucleótidos orientado alternativamente hacia la matriz o el espacio intermembrana. La ATP-ADP translocasa realiza el transporte de nucleótidos de manera acoplada; así se exporta una molécula de ATP de la matriz y se importa una molécula de ADP desde el espacio intermembrana. El ATP puede fluir hacia el citosol por los poros de porina de la membrana mitocondrial externa. A pesar de que ambos nucleótidos se unen con igual afinidad a la translocasa, el transporte de ATP hacia el exterior y del ADP al interior de la matriz se ve favorecido. Esto se explica por la diferencia de carga entre el ATP (4 ) y el ADP (3 ), de manera que el intercambio de un ATP por un ADP resulta en el movimiento neto de – – una carga negativa fuera de la matriz, lo cual equivale a la importación de un protón. El potencial de membrana establecido durante la transferencia de electrones es positivo en la superficie externa de la membrana mitocondrial interna, lo cual favorece la salida del ATP, que tiene mayor carga negativa que el ADP. El intercambio ATP/ADP es, por lo tanto, energéticamente costoso, hasta el punto de que una cuarta parte del rendimiento energético de la cadena respiratoria se consume para regenerar el potencial de membrana perdido en este intercambio. El fosfato necesario para la síntesis de ATP es también transportado desde el citoplasma. Este proceso también depende energéticamente del gradiente osmótico de protones. 476 Especies reactivas de oxígeno y defensa antioxidante mitocondrial La mayoría de las reacciones de oxidación que ocurren en el metabolismo celular resultan en la transferencia de electrones a aceptores como el NAD y el FAD , los cuales son, como hemos visto anteriormente, oxidados en la cadena + + de transporte electrónico en la mitocondria. El aceptor final de estos electrones es la molécula de oxígeno, que es reducida de manera secuencial por la citocromo c oxidasa. Si bien la transferencia de cuatro electrones a una molécula de O da lugar a productos inocuos (dos moléculas de H O), la propia estructura del O permite la generación de 2 2 2 formas parcialmente reducidas que pueden resultar peligrosas para la célula, conocidas colectivamente como radicales libres de oxígeno. La transferencia de un electrón al O resulta en la producción del anión superóxido (O ), y 2 –2 la adición de un electrón más genera peróxido de hidrógeno (H O ). El peróxido de hidrógeno no es un radical libre per 2 2 se, pero en presencia de Fe o Cu puede convertirse, mediante las reacciones de Fenton o de Haber-Weiss, en el radical 2+ + hidroxilo (OH•), que es indudablemente el más peligroso por su capacidad de generar otros radicales tóxicos. Si bien la citocromo c oxidasa es particularmente eficiente para no liberar intermediarios parcialmente reducidos al retener fuertemente al O entre los iones Fe y Cu del centro binuclear, pequeñas cantidades de radicales libres se liberan 2 inevitablemente durante las reacciones de transferencia de electrones. Uno de los puntos en la cadena de transporte electrónico donde se producen radicales libres con mayor facilidad es a partir de la semiquinona generada durante la reducción de la ubiquinona por los complejos I y II. Esta semiquinona puede transferir un electrón al O para formar 2 O. –2 Las especies reactivas de oxígeno pueden causar daño a la mayoría de las macromoléculas que forman las células. Por ejemplo, los fosfolípidos de las membranas pueden sufrir los denominados procesos de peroxidación lipídica, una reacción en cadena en la que los ácidos grasos poliinsaturados son atacados por el radical OH•, generándose peróxidos lipídicos. Esta lesión de las membranas altera su permeabilidad causando, por ejemplo, graves alteraciones en la distribución de iones y, por lo tanto, en la función celular. Por otra parte, ciertos aminoácidos constituyentes de las proteínas (como la metionina, la cisteína, la prolina, la histidina y la arginina) son también susceptibles de ser atacados por estos radicales de oxígeno. Estas reacciones pueden llevar a la fragmentación y formación de agregados proteicos que igualmente suponen un riesgo para la viabilidad celular. La consecuencia más grave de la formación de especies reactivas de oxígeno es, sin embargo, su capacidad de dañar el material genético tanto nuclear como mitocondrial. Los radicales OH• pueden producir roturas de las cadenas de ADN y mutaciones, siendo el ADNmt más susceptible que el ADN genómico a este tipo de lesión. Esto se debe a que el ADNmt está más próximo que el ADN genómico al lugar de producción de radicales libres, pero también a que carece de la protección conferida por las histonas, y a la ausencia de la maquinaria de reparación del ADN que se encuentra en el núcleo. Como veremos más adelante, las lesiones del ADNmt pueden resultar en la disminución de la capacidad de producción de ATP, y dar lugar así a las denominadas enfermedades mitocondriales. 477 Para contrarrestar los efectos nocivos de los radicales libres de oxígeno las células poseen una serie de estrategias de defensa. La más importante es la enzima superóxido dismutasa, de la que existen dos isoenzimas intracelulares: una mitocondrial dependiente de manganeso y otra citosólica dependiente de cobre y zinc (cationes presentes en sus centros activos). La forma oxidada de la enzima se reduce por el O formando O (fig. 11-14). Seguidamente, la forma –2 2 reducida de la enzima reacciona con un segundo O y dos protones para producir H O y regenerar la forma oxidada –2 2 2 de la enzima (v. fig. 11-14). A su vez, el H O producido por la superóxido dismutasa es eliminado por otra enzima 2 2 llamada catalasa. La catalasa es una proteína que contiene un grupo hemo y que, como veremos más adelante, se localiza preferentemente en los peroxisomas, aunque también está presente en la mitocondria y el citoplasma. La catalasa convierte el H O en O y H O. Finalmente, el H O y los peróxidos lipídicos pueden ser también neutralizados 2 2 2 2 2 2 por la glutatión peroxidasa. Esta proteína es una selenoenzima, localizada tanto en el citoplasma como en las mitocondrias, que emplea el grupo sulfhidrilo del glutatión (GSH) como donante de hidrógeno. En el proceso de reducción de los peróxidos, el GSH se oxida a su forma disulfuro (GSSG). Otra enzima, la glutatión reductasa, regenera la forma reducida del GSH, empleando NADPH producido a partir de la glucosa en la ruta de las pentosas fosfato. FIGURA 11-14 Mecanismo de la superóxido dismutasa. 478 Patologías relacionadas con la mitocondria Se consideran enfermedades mitocondriales aquellas en las que la afectación de la función mitocondrial, principalmente la capacidad respiratoria y de síntesis de ATP, es la primera causa de la patología. Las enfermedades mitocondriales pueden ser causadas por mutaciones en el ADNmt, adquiridas o heredadas, o en genes nucleares que codifican componentes de la mitocondria. Una idea de la incidencia de este tipo de enfermedades la da la estimación de que aproximadamente 1 de cada 4.000 niños en EE. UU. desarrollará una enfermedad mitocondrial hacia los 10 años de edad. Como se ha indicado previamente, el ADNmt puede experimentar mutaciones con más facilidad que el ADN genómico. Como también mencionamos, la herencia del ADNmt es diferente a la del ADN nuclear. Mientras que en el ADN nuclear cada copia del genoma proviene de uno de los progenitores, el ADNmt es heredado exclusivamente de la madre. Cada mitocondria contiene varias copias de ADNmt, y durante la división celular las moléculas de ADNmt se separan al azar entre las mitocondrias hijas y, posteriormente, entre las células hijas. Cuando no hay mutaciones en el ADNmt todas las células tendrán el mismo ADNmt; es decir, estas células son homoplásmicas. Sin embargo, en las células pueden aparecer moléculas de ADNmt mutadas que coexisten con ADNmt normal, dando lugar a la situación conocida como heteroplasmia. A lo largo de diferentes divisiones celulares la segregación al azar del ADNmt normal y mutado entre mitocondrias y células hijas puede dar lugar a distintas situaciones: homoplasmia para el ADNmt normal, heteroplasmia y homoplasmia para el ADNmt mutado (v. fig. 11-2). La manifestación clínica de la enfermedad mitocondrial y el grado de afectación patológica dependerá, por lo tanto, del porcentaje de ADNmt defectuoso presente en la célula. Esto significa que las enfermedades mitocondriales se manifiestan cuando el defecto en la capacidad de producir ATP debido a la presencia de ADNmt mutado no puede ser compensado por las moléculas de ADNmt normal presentes en la mitocondria; es decir, cuando se cruza el umbral mínimo de producción de energía para mantener la función celular. Todos estos hechos explican que las enfermedades mitocondriales se manifiesten principalmente en los órganos con mayor requerimiento energético y que, como veremos más adelante, constituyan un grupo muy heterogéneo de patologías. Las enfermedades mitocondriales se producen en su mayoría por mutaciones puntuales en el ADNmt que son heredadas por vía materna. Sin embargo, en algunos casos se detectan otro tipo de aberraciones, como deleciones o duplicaciones, que no son heredadas por vía materna, y se piensa que aparecen en fases tempranas del desarrollo embrionario. Por otra parte, cada vez se describen más enfermedades mitocondriales que obedecen a una herencia mendeliana, lo que indica que su origen radica en mutaciones del ADN nuclear. Estas mutaciones pueden afectar a proteínas implicadas en la biogénesis mitocondrial, cuya alteración acaba produciendo también aberraciones en el ADNmt. También pueden sufrir mutaciones genes nucleares que codifican subunidades de los complejos respiratorios, afectando a su función o a su entrada en la mitocondria. En estos casos se produciría un déficit en la respiración mitocondrial sin afectar al ADNmt. 479 Las consecuencias patológicas de las enfermedades mitocondriales pueden ser muy diversas. La distribución del ADNmt defectivo puede variar de un órgano a otro, y cada mutación puede interaccionar de manera distinta con el fondo genético de cada individuo. Así, la mutación que en una persona produce una enfermedad hepática, en otra puede afectar al cerebro. Las enfermedades mitocondriales son más severas cuando las mitocondrias defectivas se acumulan en las células del sistema nervioso central, el músculo, el corazón, los islotes pancreáticos, el hígado o los riñones; es decir, aquellos tejidos que emplean más energía que otros. La gravedad de la afectación se ve condicionada por el tipo de mutación y el grado de heteroplasmia. Para su estudio, las enfermedades mitocondriales se pueden clasificar en dos grandes grupos: aquellas producidas por mutaciones presentes en el ADNmt (mutaciones puntuales y deleciones) o enfermedades que se originan por alteraciones del ADN nuclear (mutaciones de genes nucleares que controlan el genoma mitocondrial o mutaciones de genes nucleares que participan directamente en la respiración). Entre las enfermedades debidas a mutaciones puntuales del ADNmt encontramos la neuropatía óptica hereditaria de Leber (LHON), caracterizada por la pérdida total de la visión, siendo la primera enfermedad que fue asociada a una mutación en el ADNmt heredada por vía materna. Se han descrito tres mutaciones (producidas en los nucleótidos 3460, 11778 y 14484) que, sin necesidad de otras alteraciones, desencadenan la enfermedad, pero los mecanismos detallados de su patología se desconocen. Otro ejemplo de enfermedad asociada a mutaciones puntuales, en este caso en el gen del ARNt (nucleótidos 8344 y 8356), Lys es la epilepsia mioclónica con fibras rojas rotas (MERRF). La presencia de un ARNt mutado produce defectos en la Lys síntesis de proteínas mitocondriales, lo cual se refleja en un déficit de la actividad de los complejos respiratorios. La MERRF se caracteriza por la aparición de convulsiones generalizadas y la degeneración del tejido muscular, que presenta «fibras rojas rotas» y acúmulos de mitocondrias; estas aparecen teñidas de color rojo púrpura con el tricrómico de Gomori, y representan una respuesta proliferativa compensatoria (fig. 11-15). Los pacientes pueden presentar demencia, sordera, neuropatía y miocardiopatía, entre otras manifestaciones clínicas. En personas jóvenes se requiere la presencia de más del 95% del ADNmt mutado para que se desarrolle un fenotipo. El síndrome de encefalomiopatía mitocondrial con acidosis láctica (MELAS) se caracteriza por la aparición de accidentes cerebrovasculares, demencia y convulsiones. El MELAS también se ha asociado a mutaciones en genes que codifican ARNt, aunque la mutación más común ocurre en el nucleótido 3243, en la región 3’ del gen del ARNr 16S. 480 FIGURA 11-15 «Fibras rojas rotas»: técnica de Gomori. Los depósitos anormales de mitocondrias aparecen de color rojo en el subsarcolema y en el espacio intermiofibrilar (flecha). (Procedente de Smeitink J, van den Heuvel L, DiMauro S. The genetics and pathology of oxidative phosphorylation. Nat Rev Genet 2001;2:342-52.) Las deleciones del ADNmt se sospecha que ocurren durante el proceso de replicación. En general, en un paciente se detecta un solo tipo de deleción, aunque existen familias en las que se encuentran deleciones múltiples. La magnitud de las deleciones es variable, pero puede alcanzar a la mitad del ADNmt. La deleción más común, presente hasta en un 50% de los casos, afecta a una región de 4.997 nucleótidos, que incluye entre otros genes una subunidad de la ATPasa. Todas las deleciones producen una disminución del material genético mitocondrial, que incluye, además de subunidades de la ATPasa, varios ARNt, genes que codifican componentes de la cadena respiratoria y, en algunos casos, genes de los ARNr. Estas alteraciones resultan en una capacidad reducida para responder a las necesidades energéticas de las células. Además, se ha observado que el porcentaje de moléculas de ADNmt que presentan deleciones aumenta con la edad, lo que se ha atribuido a la mayor velocidad de replicación de las moléculas de ADN mutadas, las cuales son más pequeñas. Se han descrito más de 100 deleciones diferentes, y sus manifestaciones clínicas son distintas en niños y adultos. En los niños la enfermedad es más progresiva y multiorgánica, mientras que en adultos suelen ser alteraciones neuromusculares que progresan más despacio. Existen también enfermedades producidas por alteraciones de genes nucleares implicados en el control del genoma mitocondrial. Un ejemplo de este tipo de enfermedades son las que se asocian a una reducción del número de copias del ADNmt. Se han descrito tres fenotipos para esta clase de enfermedad: la hepatopatía infantil mortal, la miopatía congénita y la miopatía infantil. Esta alteración en el número de copias del ADNmt presenta un patrón de herencia mendeliana autosómica recesiva y, como era de esperar, las células afectadas presentan una reducción en la actividad de la cadena respiratoria. Aunque no se puede descartar la implicación de otros genes nucleares, se ha descrito que el defecto puede residir en una alteración del factor de transcripción mitocondrial (mtTFA), el cual es necesario para regular el número de copias del ADNmt en la embriogénesis. Finalmente, se han descrito cuadros clínicos con herencia mendeliana en los que hay una profunda afectación de la actividad respiratoria mitocondrial y, sin embargo, no hay alteraciones en el ADNmt. La enfermedad mejor 481 caracterizada es el síndrome de Leigh, la patología mitocondrial más frecuente en niños. Estos pacientes presentan una encefalopatía necrosante, con profundas alteraciones neurológicas y respiratorias. Aunque en algunos casos pueden presentarse mutaciones en el ADNmt, la forma más frecuente presenta una reducción de la actividad de la citocromo c oxidasa sin que existan mutaciones en los genes nucleares que codifican esta enzima. Parece que la mutación se encuentra en un gen nuclear cuyo producto está implicado en el ensamblaje del complejo citocromo c oxidasa. Actualmente no se dispone de tratamientos específicos para las enfermedades mitocondriales. La administración de vitaminas, como las del complejo B, coenzima Q, L-carnitina, o antioxidantes como la vitamina E, vitamina C o el ácido lipoico, pueden ayudar a reducir los síntomas, y a retrasar o a prevenir la progresión de la enfermedad. 482 Peroxisomas. Estructura y participación en el metabolismo oxidativo Los peroxisomas son orgánulos intracelulares que se localizan en el citoplasma de las células eucarióticas y están definidos por una membrana lipídica que contiene una matriz formada por proteínas solubles (fig. 11-16). Son abundantes en órganos del cuerpo humano como el hígado, el riñón y los pulmones. FIGURA 11-16 Micrografía electrónica de un peroxisoma de hepatocito. (Reproducida a partir de Don W. Fawcett. The Cell. Philadelphia: Saunders, 1981.) Estos orgánulos, generados a partir del retículo endoplasmático, pueden observarse por medio del microscopio electrónico o mediante técnicas citoquímicas específicas, como la diaminobencidina y H O , que reaccionan con la 2 2 catalasa (una enzima que abunda en su interior y que se considera un marcador universal de peroxisomas). Similares a los lisosomas, los peroxisomas son pequeñas estructuras esféricas, que también adoptan formas elongadas o pequeñas redes tubulares frecuentemente asociadas a gotas de grasa. Poseen un diámetro variable de entre 0,3 y 1,5 μm. Morfológicamente también conviene destacar que dentro del peroxisoma se halla el denominado cristaloide, que corresponde normalmente a precipitados cristalinos de la enzima urato oxidasa. Los peroxisomas desempeñan funciones esenciales en el metabolismo lipídico, y participan tanto en reacciones catabólicas (oxidación de ácidos grasos de cadena larga) como anabólicas (síntesis de plasmalógenos y ácidos biliares). Los peroxisomas no contienen material genético y, por lo tanto, los más de 50 tipos diferentes de proteínas que se localizan en su interior son codificados en el núcleo, traducidos en el retículo endoplasmático y posteriormente importados al peroxisoma por sistemas de transporte específico. El transporte de proteínas a los peroxisomas presenta algunas diferencias importantes con los sistemas de transporte mitocondrial anteriormente descritos. En primer lugar, las proteínas que serán transportadas a los peroxisomas generalmente poseen una secuencia señal en su extremo C-terminal, que les permite ser reconocidas y formar complejos con receptores solubles en el citoplasma. 483 Estos receptores dirigirán a los complejos hacia la superficie del peroxisoma, donde interaccionan con proteínas de anclaje y la maquinaria de transporte, siendo translocadas a la matriz de este orgánulo en un proceso dependiente de ATP. Este sistema tiene la particularidad de que es capaz de transportar proteínas completamente plegadas, incluso complejos oligoméricos, al interior del peroxisoma. Los mecanismos por los que los metabolitos y cofactores enzimáticos circulan entre el citoplasma y la matriz de los peroxisomas no son del todo conocidos, en parte por la dificultad de aislar estos orgánulos manteniendo sus propiedades intactas. Se ha propuesto que la membrana del peroxisoma presenta una permeabilidad selectiva a las moléculas pequeñas. Por ejemplo, metabolitos pequeños como el urato pueden atravesarla libremente por canales, mientras que otros metabolitos más voluminosos, como los nucleótidos de adenina o los ácidos grasos esterificados con CoA, poseen transportadores específicos. Sin embargo, aún no se han identificado transportadores para los cofactores, que desempeñan un papel esencial en el metabolismo oxidativo de los peroxisomas, como el NADH y el NADPH, por lo que se ha sugerido que existe un pool de estos cofactores que es específico de los peroxisomas. Una de las funciones metabólicas fundamentales de los peroxisomas son las reacciones de β-oxidación. Estas reacciones, como vimos anteriormente, también ocurren en las mitocondrias, las cuales son capaces de oxidar ácidos grasos de cadena larga e intermedia provenientes de la dieta. Sin embargo, los ácidos grasos de cadena muy larga solamente se oxidan en los peroxisomas. En contraste con la mitocondria, el sistema de β-oxidación de los peroxisomas no es capaz de degradar completamente los ácidos grasos, al carecer de la cadena de transporte electrónico y del ciclo de Krebs. Por lo tanto, para su completa oxidación a CO y H O, productos de la β-oxidación 2 2 peroxisómica como el acetil-CoA, propionil-CoA y ésteres acil-CoA de cadena media deben ser transportados a la mitocondria. En cambio, los peroxisomas son capaces de oxidar compuestos más complejos que los oxidados en la mitocondria, como ácidos grasos dicarboxílicos de cadena larga, leucotrienos, prostaglandinas, precursores de ácidos biliares y determinados ácidos grasos mono- y poliinsaturados. Por lo tanto la β-oxidación en los peroxisomas cataboliza una serie de ácidos grasos y derivados que no pueden ser procesados en la mitocondria, desempeñando así un papel esencial en la destoxificación de compuestos cuya acumulación puede ser lesiva para la célula. Como se mencionó previamente, los peroxisomas también pueden participar en procesos biosintéticos complejos, como la producción de plasmalógenos. Los plasmalógenos son fosfolípidos con un sustituyente éter alquílico sobre el carbono 1 del glicerol, y cuyas cabezas polares más comunes son la etanolamina y la colina. Estos lípidos son muy abundantes en determinados tejidos como el cardiovascular, el nervioso o las células del sistema inmunitario. Aunque su función no es completamente conocida, se ha propuesto que estos lípidos podrían actuar como protectores frente a las especies reactivas de oxígeno y como moduladores de las propiedades físicas de las membranas, al mismo tiempo que participan en mecanismos de señalización celular. Los primeros pasos de su síntesis tienen lugar en los peroxisomas, en donde la dihidroxiacetona fosfato (DHAP) es primero esterificada en el carbono 1 con un acil-CoA de cadena larga mediante la acción de la DHAP aciltransferasa (una proteína integral de la membrana del peroxisoma). Posteriormente el grupo acilo es reemplazado por un alcohol de cadena larga, que proviene del citosol, en una 484 reacción catalizada por la alquil-DHAP sintasa presente en el peroxisoma. El tercer paso en la síntesis de los plasmalógenos es catalizado por una acil/alquil-DHAP reductasa, que se localiza en la membrana de los peroxisomas y del retículo endoplasmático, orgánulo donde tienen lugar el resto de los pasos de la síntesis de estos lípidos complejos. En las mitocondrias, el primer paso en la β-oxidación de los ácidos grasos es catalizado por acil-CoA deshidrogenasas dependientes de FAD, las cuales donan los electrones generados en la oxidación a la cadena respiratoria. Sin embargo, la ausencia de cadena respiratoria en los peroxisomas hace que estos electrones producidos por las deshidrogenasas dependientes de FAD presentes en estos orgánulos sean transferidos directamente al O , 2 produciéndose H O . La β-oxidación en los peroxisomas es, por lo tanto, menos eficiente que en las mitocondrias en 2 2 términos de producción de ATP. Sin embargo, en los peroxisomas la energía química liberada en las reacciones de oxidación se disipa en forma de calor, contribuyendo así a la termogénesis. Se ha estimado que aproximadamente el 35% de todo el H O producido en el hígado de rata proviene de la 2 2 actividad de las oxidasas peroxisómicas, las cuales son también responsables de un 20% del consumo de O . Este 2 ambiente es proclive a la formación de especies reactivas de oxígeno, como el radical OH• o el anión superóxido, O , –2 por lo que los peroxisomas están dotados de eficientes sistemas antioxidantes. El más importante es la catalasa, enzima mencionada con anterioridad que es capaz de eliminar el H O de manera muy eficiente convirtiéndolo en H O 2 2 2 y O . Además, esta enzima también puede metabolizar otros sustratos como el etanol, metanol, fenol y nitritos gracias 2 a su actividad peroxidasa, en una reacción en la que también se consume H O . Otras enzimas antioxidantes presentes 2 2 en los peroxisomas son las ya mencionadas glutatión peroxidasa y superóxido dismutasa, así como la peroxirredoxina (esta última con capacidad también de eliminar el H O ). 2 2 Una característica de los peroxisomas es que pueden adaptarse rápidamente a estímulos metabólicos y ambientales modificando con rapidez su número y tamaño. Los lípidos son potentes inductores de la proliferación de los peroxisomas. En mamíferos este efecto es mediado por el receptor activador de la proliferación de los peroxisomas α (PPARα), un receptor nuclear activado por ligandos de naturaleza lipídica que regula la expresión de genes asociados al metabolismo lipídico, incluidos los genes peroxisómicos. La reducción selectiva del número de peroxisomas se lleva a cabo mediante un proceso de autofagia altamente coordinado denominado pexofagia. Este proceso y los genes implicados en él se han caracterizado con detalle en eucariotas unicelulares, aunque ya se dispone de evidencias que muestran su existencia e importancia en mamíferos. Mutaciones en genes implicados en la biogénesis de los peroxisomas pueden causar un amplio espectro de cuadros clínicos severos englobados en el llamado síndrome de Zellweger. Los pacientes afectados por esta enfermedad, también conocida como síndrome cerebrohepatorrenal, presentan retraso mental, sordera, visión defectuosa, hepatomegalia y quistes renales, entre otras anomalías, y su muerte se produce en el primer año de vida. Esta afectación multiorgánica es reflejo de la presencia de peroxisomas defectuosos en todas las células del organismo, en 485 las cuales se ve comprometida la capacidad de llevar a cabo la β-oxidación de ácidos grasos de cadena muy larga y de sintetizar plasmalógenos. Los genes cuyas mutaciones se han asociado a este síndrome pertenecen a la familia de las peroxinas (PEX), que codifican proteínas implicadas en el ensamblaje de peroxisomas funcionales. El defecto más común se observa en el gen PEX1, deficiente en alrededor del 80% de los pacientes, que está implicado en el proceso de transporte de proteínas de la matriz peroxisómica desde el citoplasma al orgánulo. Las enfermedades asociadas a defectos en la biogénesis de los peroxisomas fueron el primer caso descrito de malformaciones congénitas resultantes de un error metabólico, ilustrando así la importancia de las rutas metabólicas en el desarrollo. La enfermedad peroxisómica más frecuente es la adrenoleucodistrofia, enfermedad genética con herencia ligada al cromosoma X que produce una desmielinización intensa y la muerte prematura en niños. Esta afección ocasiona la acumulación de ácidos grasos de cadena muy larga en el sistema nervioso, en las glándulas suprarrenales y en los testículos. El gen responsable de la enfermedad es ABCD1, que se localiza en una región denominada Xq28 y codifica para la proteína ALDP, un transportador dotado de un dominio de unión al ATP (ATP-binding cassette) localizado en la membrana de los peroxisomas. La deficiencia en ALDP asociada a mutaciones puntuales impide la β-oxidación de los ácidos grasos de cadena muy larga facilitando su acumulación en el plasma y los tejidos. Lecturas recomendadas Brenner D, Mak TW. Mitochondrial cell death effectors. Curr Opin Cell Biol. 2009;21(6):871–877. Brites P, Waterham HR, Wanders RJ. Functions and biosynthesis of plasmalogens in health and disease. Biochim Biophys Acta. 2004;1636(2-3):219–231. Hock MB, Kralli A. Transcriptional control of mitochondrial biogenesis and function. Annu Rev Physiol. 2009;71:177–203. Koopman WJ, Willems PH, Smeitink JA. Monogenic mitochondrial disorders. N Engl J Med. 2012;366(12):1132–1141. Nunnari J, Suomalainen A. Mitochondria: in sickness and in health. Cell. 2012;148(6):1145–1159. Nuttall JM, Motley A, Hettema EH. Peroxisome biogenesis: recent advances. Curr Opin Cell Biol. 2011;23(4):421–446. Rucktäschel R, Girzalsky W, Erdmann R. Protein import machineries of peroxisomes. Biochim Biophys Acta. 2011;1808(3):892–900. Schapira AH. Mitochondrial diseases. Lancet. 2012;379(9828):1825–1834. Schmidt O, Pfanner N, Meisinger C. Mitochondrial protein import: from proteomics to functional mechanisms. Nat Rev Mol Cell Biol. 2010;11(9):655–667. Shimozawa N. Molecular and clinical findings and diagnostic flowchart of peroxisomal diseases. Brain Dev. 2011;33(9):770–776. 486 Van der Laan M, Hutu DP, Rehling P. On the mechanism of preprotein import by the mitochondrial presequence translocase. Biochim Biophys Acta. 2010;1803(6):732–739. Preguntas de autoevaluación 1. Una característica importante de la membrana mitocondrial externa es: a. Es impermeable al agua y a la glucosa en condiciones normales. b. La proporción proteína/lípido es mayor que la de la membrana mitocondrial interna. c. La proporción proteína/lípido de la membrana es menor que la de la membrana plasmática. d. Tiene mayor cantidad de enzimas que la membrana mitocondrial interna. e. Contiene una proteína formadora de canales denominada porina. Respuesta correcta: e. 2. Señale cuál de las siguientes afirmaciones sobre la síntesis y el transporte de las proteínas mitocondriales es correcta: a. El 90% de las proteínas mitocondriales se sintetizan en la matriz mitocondrial. b. El transporte de las proteínas a la matriz mitocondrial consume energía derivada del potencial de la membrana y el ATP. c. Todas las proteínas que serán transportadas al interior de la mitocondria contienen una señal de localización en el extremo N-terminal. d. Los ribosomas mitocondriales son iguales a los citosólicos en su estructura y función. e. La mayoría de los polipéptidos de los complejos respiratorios son codificados por el genoma mitocondrial. Respuesta correcta: b. 3. Respecto al genoma mitocondrial, indique cuál de las siguientes afirmaciones es falsa: a. La tasa de mutación del ADNmt es muy superior a la del ADN genómico. b. Cada mitocondria posee una única molécula de ADN. c. El ADNmt humano contiene 16.569 pares de bases y codifica 37 genes. d. Las dos cadenas del ADNmt están casi completamente ocupadas por genes. 487 e. El ADNmt se hereda exclusivamente de la madre. Respuesta correcta: b. 4. Respecto al ciclo de Krebs, ¿cuál de las siguientes afirmaciones es correcta?: a. Las enzimas que participan en este ciclo se encuentran localizadas en la membrana interna de la mitocondria. b. Este ciclo solamente está implicado en procesos catabólicos. c. En este ciclo se producen NADH y FADH , que serán empleados posteriormente en la cadena de transporte 2 electrónico mitocondrial. d. Los intermediarios del ciclo de Krebs son utilizados en las denominadas reacciones anapleróticas para la síntesis de macromoléculas. e. Ninguna de las afirmaciones anteriores es correcta. Respuesta correcta: c. 5. ¿Cuál de las siguientes afirmaciones sobre la β-oxidación de ácidos grasos es correcta?: a. Es un proceso citosólico de síntesis. b. A diferencia del ciclo de Krebs, no genera FADH . 2 c. Se lleva a cabo en la matriz mitocondrial. d. Es un proceso de síntesis peroxisómico. e. Ninguna es correcta. Respuesta correcta: c. 6. Señale cuál de estas afirmaciones es falsa: a. El balance entre la supervivencia y la muerte celular depende del tipo de proteínas BCL-2 que se expresan en la membrana de la mitocondria. b. Durante la apoptosis la mitocondria importa todas las proteínas celulares. c. Las proteínas BAX y BAK participan en la apertura de poros en la membrana externa de la mitocondria. d. La liberación de citocromo c por la mitocondria es parte fundamental de la vía intrínseca de la apoptosis. e. La muerte celular por apoptosis depende de la activación de caspasas efectoras. Respuesta correcta: b. 7. Señale cuál de estas afirmaciones sobre los peroxisomas es falsa: 488 a. Los peroxisomas son orgánulos generados a partir del retículo endoplasmático. b. Los peroxisomas participan en la oxidación de ácidos grasos de cadena larga y en la síntesis de plasmalógenos. c. El contenido de peroxisomas en una célula no varía en ninguna circunstancia. d. La ausencia de cadena respiratoria en los peroxisomas hace que los electrones producidos en la β-oxidación de los ácidos grasos sean transferidos al O , produciéndose abundante H O . 2 2 2 e. Los peroxisomas desempeñan un papel esencial en el metabolismo de la glucosa. Respuesta correcta: c. 8. En relación con las patologías mitocondriales, señale qué afirmación no es correcta: a. Las enfermedades mitocondriales afectan principalmente a los órganos con mayor requerimiento energético. b. La heteroplasmia consiste en la presencia de mitocondrias normales y mutadas en una misma célula. c. El reparto de mitocondrias en las células hijas se realiza al azar durante la segregación mitótica. d. Las enfermedades mitocondriales pueden reflejar la presencia de mutaciones tanto en el ADNmt como en el ADN genómico. e. Todas las enfermedades mitocondriales se transmiten según una herencia mendeliana. Respuesta correcta: e. 9. Señale cuál de las siguientes afirmaciones sobre la cadena transportadora de electrones de la mitocondria es verdadera: a. Los electrones que se transportan por la cadena transportadora de electrones van siempre unidos al H . + b. El ATP sintetizado en la matriz mitocondrial difunde pasivamente al citosol para ser utilizado en diferentes reacciones metabólicas. c. El complejo de citocromos de la mitocondria se inicia en el citocromo a y termina en el c. d. El FADH producido en el ciclo de Krebs se convierte en FAD y cede los electrones del H, que entran en la cadena 2 transportadora de electrones. e. La energía liberada durante la transferencia de electrones al oxígeno se emplea directamente para la síntesis de ATP. Respuesta correcta: d. 10. Señale cuál de las siguientes afirmaciones no es correcta: 489 a. La tasa de mutación del ADNmt es más elevada que la del ADN genómico, al estar expuesto a un mayor estrés oxidativo. b. La tasa de mutación del ADNmt es más elevada que la del ADN genómico debido a la ausencia de un sistema de reparación del ADN. c. La tasa de mutación del ADNmt es más elevada que la del ADN genómico debido a la ausencia de proteínas empaquetadoras como las histonas. d. La tasa de mutación del ADNmt es más elevada que la del ADN genómico debido a la ausencia de factores de transcripción en la mitocondria. e. Todas las afirmaciones anteriores son correctas. Respuesta correcta: d. 490 CAPÍTULO 12 491 El citoesqueleto Alfonso Calvo José J. Abad Luis Montuenga Objetivos de aprendizaje • Conocer la estructura de los microtúbulos, microfilamentos y filamentos intermedios del citoesqueleto. • Comprender el dinamismo de los microtúbulos y los microfilamentos. • Entender el papel de las proteínas asociadas a microtúbulos y microfilamentos en la regulación de sus funciones y en su dinamismo o estabilidad. • Relacionar algunas patologías humanas con alteraciones en la estructura del citoesqueleto. 492 Introducción El citoesqueleto está constituido por una red de polímeros proteicos que proporcionan soporte estructural a la célula, posicionan los orgánulos en el citoplasma y están implicados en funciones tan importantes como el movimiento y la división celular, o el transporte de vesículas. Como se verá más adelante, el citoesqueleto posee un alto dinamismo, ya que los polímeros que lo componen están en constante proceso de formación y destrucción. Los principales elementos del citoesqueleto son tres: 1. Microtúbulos. 2. Microfilamentos. 3. Filamentos intermedios. Cada uno de estos tres tipos de estructuras tiene una composición específica, así como una distribución en el citoplasma y una función determinadas. Los microtúbulos están compuestos principalmente por la proteína tubulina y forman cilindros de 25 nm de diámetro. La actina (junto con otras proteínas asociadas) constituye los microfilamentos, que poseen un diámetro de 7 nm. Los filamentos intermedios, cuyo diámetro es de 8-12 nm, pueden estar formados por una gran variedad de proteínas, específicas de cada tipo celular. La presencia de citoesqueleto es un rasgo típico de las células eucariotas, ya que no se encuentra en organismos procariotas. 493 Microtúbulos Estructura de los microtúbulos. Tubulogénesis in vitro e inestabilidad dinámica Los microtúbulos son largas estructuras cilíndricas huecas cuyo diámetro exterior mide 25 nm, siendo su diámetro interior de unos 14 nm. La pared del microtúbulo está formada por 13 protofilamentos compuestos por heterodímeros de dos proteínas: la α- y la β-tubulina (fig. 12-1). Los microtúbulos se ensamblan mediante adición longitudinal y reversible de estos heterodímeros. Los procesos de polimerización y despolimerización se pueden estudiar in vitro, en microtúbulos aislados de la célula. Si se añade α- y β-tubulina monomérica en concentraciones suficientes, GTP y Mg +2 y se trabaja con una temperatura adecuada (fisiológica), se consigue una polimerización espontánea de los microtúbulos. Estos experimentos (llamados de tubulogénesis in vitro) han sido muy importantes para entender cómo funciona la dinámica de los microtúbulos. FIGURA 12-1 A. Inmunofluorescencia para detectar tubulina en células en cultivo. B. Estructura de un microtúbulo. El dibujo muestra la pared del microtúbulo, que contiene 13 unidades de tubulina (alternando la α- y la β-tubulina). (B, ilustración de: A. Calvo.) En las primeras fases de la polimerización, el ensamblaje se produce por adición de heterodímeros de α-/β-tubulina libre en el medio, que da lugar a oligómeros que constituyen un núcleo inicial de formación del microtúbulo. Este proceso se le llama nucleación (fig. 12-2). Posteriormente, la unión de nuevos heterodímeros de α-/β-tubulina a ambos lados del núcleo provoca la elongación. El proceso de nucleación es relativamente lento comparado con el de elongación, que tiene lugar a gran velocidad. Finalmente se llega a un estado de equilibrio, en el que el microtúbulo se mantiene con una longitud más o menos constante porque la concentración de tubulina libre en el medio disminuye, hasta llegar a ser un factor limitante para la reacción de polimerización. Esta es una fase de meseta, en la que las tasas de adición y eliminación de tubulina en el microtúbulo son semejantes. En efecto, las unidades de α- y βtubulina también se pueden desprender de los microtúbulos, por lo que estos se encuentran en un constante proceso de formación/destrucción. Los experimentos in vitro han demostrado que el crecimiento de un microtúbulo tiene lugar preferentemente por uno de los extremos (al que se denomina extremo «más»), mientras que al otro extremo se le denomina extremo «menos». Por ello se dice que los microtúbulos presentan polaridad. En el extremo (–) de los microtúbulos queda situada la α-tubulina, mientras que en el extremo (+) se sitúa la β-tubulina (fig. 12-3). 494 FIGURA 12-2 Proceso de tubulogénesis in vitro, en el que se muestran las fases de nucleación, elongación y equilibrio. FIGURA 12-3 Dinámica de polimerización/despolimerización de los microtúbulos. A. Los dímeros de α-/β-tubulina-GTP se añaden en el extremo (+), pero la β-tubulina-GTP pasa a β-tubulina-GDP, que es más inestable. B. La formación de un casquete de tubulina-GTP protege el extremo (+), favoreciendo su rápida polimerización. Si la concentración de tubulina-GTP disminuye, se pierde el casquete y se produce una abrupta destrucción del microtúbulo. C. Intercambio rotatorio (treadmilling) en los microtúbulos. (Ilustraciones de: A. Calvo.) La polaridad se explica molecularmente porque la concentración necesaria para que las moléculas de tubulina se adhieran al polímero es diferente a ambos lados del microtúbulo. En el extremo (+) la concentración crítica para que tenga lugar la adición al microtúbulo es menor que la concentración del extremo (–); es decir, que se necesita menos concentración de tubulina libre en el extremo (+) para que se produzca la polimerización, por lo que este extremo crece con más facilidad que el (–) en condiciones limitantes. Se sabe que para que tenga lugar la polimerización, el heterodímero de α-/β-tubulina tiene que estar unido a GTP (tanto la subunidad α como la β). La incorporación de heterodímeros tiene lugar de modo polar, es decir, en el extremo (+) del microtúbulo. Según se van añadiendo los heterodímeros, el GTP de la β-tubulina (pero no el de la α-tubulina) se disocia a GPD + Pi, poco después de la adición. Cuando la β-tubulina contiene GTP es estable, pero cuando está unida a GDP pierde estabilidad y tiende a desprenderse, lo que favorece la despolimerización. Si se da una situación en la cual la concentración crítica de tubulina libre es mayor que la necesaria para que se produzca la polimerización en el extremo (+), pero menor que la necesaria para que haya polimerización en el extremo (–), el microtúbulo crecerá por el extremo (+), pero perderá unidades por el extremo (–). A este fenómeno se le llama intercambio rotatorio (treadmilling en inglés), porque las moléculas de tubulina que se añaden en el extremo (+) se pierden posteriormente por el extremo (–) (v. fig. 12-3). Aparte del fenómeno de intercambio rotatorio, los experimentos in vitro han mostrado otro comportamiento de los microtúbulos aislados: el extremo (+) de los microtúbulos alterna entre fases de rápido crecimiento y fases de 495 acortamiento súbito. La interpretación de este fenómeno no está del todo clara, pero se sugirió el modelo de inestabilidad dinámica para intentar explicarlo (v. fig. 12-3). En este modelo, la concentración de α-/β-tubulina-GTP libre en el medio es fundamental para explicar el comportamiento inestable de los microtúbulos. En los experimentos in vitro, cuando en el medio se encuentran concentraciones elevadas de GTP-tubulina, estas se añaden con gran rapidez por el lado (+) del microtúbulo, formando un «casquete» de GTP-tubulina que protege de la degradación y favorece la adición de nuevas moléculas de GTP-tubulina. En cambio, si la concentración de GTP-tubulina disminuye en el medio, la velocidad de hidrólisis del GTP (que da lugar a GDP-tubulina + Pi) es mayor que la velocidad de incorporación de GTP-tubulina, por lo que desaparece el «casquete» protector; de este modo, el extremo (+) se vuelve inestable y sufre entonces una destrucción brusca (y, por lo tanto, una despolimerización). Así, un mismo microtúbulo puede alternar entre fases de polimerización y fases de despolimerización. La fase de despolimerización brusca se llama «catástrofe» del microtúbulo, y la vuelta al crecimiento, «rescate». Tubulogénesis in vivo. Funciones de los microtúbulos en la célula Los procesos de crecimiento/acortamiento de los microtúbulos ocurren también en la célula, pero no espontáneamente sino mediante un control altamente regulado. El comportamiento dinámico de los microtúbulos en la célula (especialmente durante la mitosis) es mucho más rápido que el que tiene lugar experimentalmente en microtúbulos aislados in vitro. La génesis de nuevos microtúbulos en el citoplasma celular depende de los centros organizadores de microtúbulos (MTOC, del inglés microtubules organizing centers) (fig. 12-4), regiones muy características de las células que actúan como lugares de nucleación de los microtúbulos. Los MTOC incluyen estructuras celulares como los centríolos y los cuerpos basales de cilios y flagelos (v. más adelante). 496 FIGURA 12-4 Los centros organizadores de microtúbulos (MTOC) organizan la polimerización de los microtúbulos en el interior celular. (Ilustración de: A. Calvo.) En los MTOC se encuentra un tipo de tubulina especial, la γ-tubulina, cuya presencia es esencial para la tubulogénesis en el citoplasma celular. El extremo (–) del microtúbulo se sitúa junto al MTOC, mientras que el extremo (+) se va alejando radialmente del MTOC, hacia la periferia celular, al ir incorporando nuevas unidades de tubulina, lo que alarga el microtúbulo por el extremo (+). De modo similar a la tubulogénesis in vitro, la disociación de GTP en GDP + Pi en la β-tubulina debilita la estabilidad de microtúbulo, que tiende entonces a despolimerizarse. Esto da lugar al fenómeno de la inestabilidad dinámica, que también ocurre in vivo. Mediante técnicas de videomicroscopía se puede observar que los microtúbulos de la célula alternan también entre fases de crecimiento y decrecimiento rápido, al igual que ocurría in vitro. Pero, a diferencia de lo que acontece con los microtúbulos aislados, la célula posee un conjunto de proteínas estabilizadoras que impiden que la polimerización/despolimerización tenga lugar solo en función de las concentraciones disponibles de GTP-tubulina libre en el medio. Por ejemplo, en los axones de las neuronas, en los axonemas de cilios y flagelos, o en los centríolos (v. «Agrupaciones complejas de microtúbulos») los microtúbulos son altamente estables y forman estructuras celulares muy perdurables. Los microtúbulos participan en numerosas actividades celulares y su correcto funcionamiento es crítico para el mantenimiento de la fisiología celular. Las principales funciones de los microtúbulos celulares son: • Contribuyen al establecimiento de la forma particular de cada tipo de célula. • Participan en el movimiento celular. • Permiten el transporte de vesículas y orgánulos a lo largo de citoplasma y el mantenimiento de orgánulos en determinadas localizaciones celulares. 497 • Participan en los procesos de endocitosis y exocitosis. • Tienen un papel esencial en el movimiento de los cromosomas y cromátidas durante la mitosis y la meiosis. • Constituyen los centríolos celulares. • Forman el axonema de cilios y flagelos. Agentes y fármacos que modifican la formación de microtúbulos Algunos compuestos modifican la estabilidad de los microtúbulos, variando su proceso normal de polimerización/despolimerización. Muchos de estos compuestos se descubrieron mediante análisis de productos naturales para un posible uso terapéutico. El taxol es una sustancia extraída de la corteza del tejo (Taxus baccata) que aumenta la estabilidad de los microtúbulos, haciendo que se vuelvan demasiado rígidos e impidiendo que desarrollen sus funciones adecuadamente. Se ha comprobado que el taxol inhibe la despolimerización de los microtúbulos, impidiendo así su dinamismo durante la mitosis, lo que conduce a las células a la muerte por apoptosis. Esta propiedad se ha aprovechado para tratar diversos tipos de cáncer (como, p. ej., el de mama, ovario, pulmón o los sarcomas), ya que las células tumorales poseen una alta capacidad de división. Actualmente se han desarrollado variantes del taxol, mediante modificaciones químicas, que poseen mayor actividad antitumoral (p. ej., paclitaxel, docetaxel). Los taxanos (nombre genérico que reciben el taxol y sus derivados) pueden producir efectos secundarios negativos como la neurotoxicidad, probablemente por la afectación del transporte vesicular de las neuronas, que depende en gran parte de los microtúbulos. La colchicina, agente que se extrae de la planta Colchicum autumnale, impide la polimerización de los microtúbulos, al unirse a las unidades de tubulina libres en el citoplasma y evitar así que se incorporen al microtúbulo. Este compuesto detiene la mitosis en metafase (en la que los cromosomas poseen un grado máximo de compactación), y es un agente muy empleado en el diagnóstico citogenético de enfermedades, ya que se utiliza para preparar el cariotipo celular (v. capítulo 7). La colchicina se emplea poco para el tratamiento del cáncer (está indicada, p. ej., para el tratamiento de algunos tumores cutáneos), ya que parece tener un rango de acción muy limitado; se ha utilizado para el tratamiento de la gota y otras enfermedades que cursan con procesos inflamatorios, como la enfermedad de Behçet (una patología caracterizada por inflamación de los vasos sanguíneos). El efecto antiinflamatorio de la colchicina se debe a su capacidad de evitar el reclutamiento de leucocitos al sitio de inflamación, ya que la alteración de la dinámica de los microtúbulos afecta también a la forma y a la capacidad de movimiento de las células. En estas enfermedades se produce un infiltrado leucocitario en el sitio de inflamación, por lo que la inhibición de la migración de estas células reduce el proceso inflamatorio, mejorando así la sintomatología de los pacientes. Algunos alcaloides extraídos de plantas herbáceas del género Vinca, como la vincristina o la vinblastina, poseen una acción similar a la colchicina, ya que su afinidad por los sitios de unión del GTP en las tubulinas impide el 498 dinamismo normal de los microtúbulos. Estas sustancias se introdujeron en la práctica clínica hace más de 40 años para el tratamiento de neoplasias hematológicas. Posteriormente, algunos derivados de estas moléculas se han empleado contra tumores sólidos. También se ha descrito neurotoxicidad asociada al uso de alcaloides derivados de la vinca. Proteínas asociadas a los microtúbulos Las proteínas asociadas a los microtúbulos (MAP, del inglés microtubule associated proteins) tienen la capacidad de unirse a estos y modificar sus condiciones normales de polimerización/despolimerización; de asociarlos en haces, redes, etc.; o de permitir el movimiento de orgánulos. Existen dos tipos de MAP: 1. Motoras: son proteínas que consumen energía para desplazarse a lo largo de los microtúbulos con el fin de llevar vesículas u orgánulos a distintos lugares del citoplasma. 2. No motoras: desarrollan funciones estructurales, como la formación de haces y redes, la estabilización de microtúbulos, etc. Las MAP motoras pertenecen a la familia de las quinesinas y dineínas. Los microtúbulos establemente polimerizados constituyen auténticos rieles sobre los cuales se pueden desplazar vesículas y orgánulos celulares con la ayuda de MAP motoras (fig. 12-5). Los movimientos de vesículas han sido muy estudiados en neuronas. Las vesículas se generan en el soma celular y son desplazadas hasta las terminales nerviosas (lugar donde actúan), debiendo recorrer a veces muy largas distancias, incluso centímetros. FIGURA 12-5 La dineína y la quinesina permiten el movimiento de vesículas a través de los microtúbulos. La quinesina las transporta desde el extremo (–) al (+), y la dineína en sentido opuesto. (Ilustración de: A. Calvo.) Las quinesinas son una familia de proteínas motoras, identificadas por primera vez en el axón gigante del calamar, que se desplazan desde el extremo (–) hasta el extremo (+) de los microtúbulos. En el caso de neuronas, este 499 movimiento tiene lugar desde el soma hacia el terminal nervioso. Las quinesinas son polipéptidos que se asocian entre sí para formar una estructura en forma de horquilla, con un tallo y dos prolongaciones a modo de «pies». Utilizando la energía proporcionada por la hidrólisis de ATP, un «pie» de la molécula experimenta un cambio conformacional y se desplaza hacia delante, contactando con el microtúbulo unos nanómetros más allá de donde estaba situado, mientras que el otro «pie» queda libre. Este segundo «pie» realiza el mismo movimiento momentos después, dejando al primero libre, de tal modo que la molécula se mueve como si estuviera andando sobre el microtúbulo. La dineína comprende también una familia de proteínas constituidas por varios polipéptidos, con capacidad de moverse desde el extremo (+) al extremo (–) de los microtúbulos; es decir, en sentido opuesto al movimiento de la quinesina. Al igual que las quinesinas, las dineínas pueden desplazar vesículas y orgánulos a través de los microtúbulos. En el segundo grupo de MAP, sin función motora, se incluyen proteínas que participan en el mantenimiento estructural de grupos de microtúbulos, o en su desestructuración y disociación. Existen numerosas proteínas pertenecientes a este grupo de MAP, muchas de las cuales se han identificado también en neuronas. Una de estas proteínas es tau (τ), una MAP de bajo peso molecular que se asocia a los microtúbulos de los axones neuronales, confiriéndoles estabilidad y permitiendo que se agrupen en haces paralelos. La proteína τ está muy involucrada en el desarrollo de diversas enfermedades, llamadas taupatías, entre las que se encuentra la enfermedad de Alzheimer. Por razones desconocidas, esta proteína puede sufrir hiperfosforilación anormal que favorece su agregación, formándose entonces placas neuríticas u ovillos de degeneración neurofibrilar, característicos de esta enfermedad. La formación de estos agregados interfiere con el mecanismo de transporte neuronal de vesículas, lo que provoca la muerte de la neurona por apoptosis. Las áreas donde hay más degeneración neuronal son el hipocampo y las zonas adyacentes del lóbulo temporal, ambas de gran importancia en la función de la memoria. El Alzheimer no es la única enfermedad en la que se han encontrado ovillos de degeneración neurofibrilar: se han descrito también en la parálisis supranuclear progresiva o en la demencia frontotemporal. Agrupaciones complejas de microtúbulos Los microtúbulos se pueden agrupar entre sí para formar estructuras complejas, especializadas en la realización de determinadas funciones celulares. Los microtúbulos se agrupan para ello en parejas o tríos adosados en paralelo denominados dobletes o tripletes, respectivamente (fig. 12-6), que se asocian entre sí posteriormente para formar estructuras celulares más complejas como los centríolos, cilios y flagelos. 500 FIGURA 12-6 A. Los microtúbulos se pueden agrupar formando dobletes y tripletes. B. Estructura de un centríolo. C. Imagen de un centríolo observado al microscopio electrónico. (C, reproducida a partir de: Burrell MA et al. Atlas de ultraestructura celular. 2.ª ed. Navarra: EUNSA; 2011; A, ilustración de: A. Calvo.) Centríolos Estructura El centríolo (v. fig. 12-6) está formado por nueve tripletes de microtúbulos dispuestos en una estructura cilíndrica, que recuerda a un barril hueco. Se caracteriza por tener una estructura de tipo 9 + 0; es decir, que su pared está 3 formada por nueve tripletes de microtúbulos periféricos y no posee microtúbulos en la parte central. Los microtúbulos de cada triplete se denominan A (correspondiente a un cilindro completo de 13 protofilamentos), B y C (cilindros contiguos al A, pero incompletos, ya que constan solo de 10 protofilamentos). Cada triplete se une al triplete contiguo mediante una serie de proyecciones proteicas constituidas por una proteína asociada llamada nexina, que forma como peldaños de una escalera que recorren toda la longitud del microtúbulo A de cada triplete y lo unen al microtúbulo C del triplete vecino. Las células en interfase poseen un par de centríolos (en posición perpendicular uno con respecto al otro) localizados normalmente en una parte central de la célula, por lo que a estas estructuras se les llama centrosomas. A la pareja de centríolos se le denomina también diplosoma. En células en mitosis los centríolos se han duplicado y cada una de las 501 parejas aparece como una estructura radial (correspondiente a microtúbulos que emergen de los centríolos) situada en cada uno de los polos de la célula; estas estructuras reciben el nombre de astrosferas. Rodeando a los centríolos se encuentra el material pericentriolar, que contiene γ-tubulina, encargada de nuclear los microtúbulos durante su crecimiento. Los microtúbulos se generan en el material pericentriolar y crecen alejándose hacia el citoplasma. El extremo (–) del microtúbulo corresponde, por lo tanto, a la zona que está junto al material pericentriolar, y el (+), al extremo que crece hacia el citoplasma. Papel de los centríolos en la organización del huso mitótico Los centríolos organizan los microtúbulos que van a formar el huso mitótico, el cual permite el desplazamiento de los cromosomas y las cromátidas durante la división celular. Para ello, al igual que los cromosomas, los centríolos se duplican en la etapa S de la interfase. Al inicio de la profase los centríolos inician la formación de los microtúbulos mitóticos y se destruyen los microtúbulos interfásicos. Esta es una fase de un alto dinamismo, donde se forman y se destruyen microtúbulos a gran velocidad. La formación del huso mitótico implica la estabilización de microtúbulos que emergen de los centrosomas, los cuales se pueden clasificar en tres tipos: 1. Microtúbulos cinetocóricos: se unen por su extremo (+) al cinetocoro de los cromosomas, lo cual estabiliza los microtúbulos. 2. Microtúbulos polares: emergen de los centrosomas pero no contactan con los cromosomas, sino que se estabilizan al contactar con otros microtúbulos antiparalelos que crecen a partir del centrosoma del polo opuesto. 3. Microtúbulos astrales (o del áster): parten del centrosoma y se extienden hacia la periferia celular, en dirección opuesta al centro del huso. Durante la metafase, los microtúbulos sitúan a los cromosomas condensados en la placa metafásica, y en la anafase las cromátidas hermanas se separan, desplazándose hacia los polos opuestos del huso. El movimiento de las cromátidas hacia los polos depende de la dinámica de polimerización/despolimerización de los microtúbulos en la anafase. Se pueden distinguir dos etapas en la anafase: anafase A y anafase B, en las que intervienen distintos tipos de microtúbulos y proteínas asociadas a los microtúbulos para llevar a cabo la migración de las cromátidas (fig. 12-7). En la anafase A (o anafase temprana), los microtúbulos cinetocóricos se van acortando, arrastrando tras de sí a la cromátida a la que estaban unidos. Esto ocurre porque hay una eliminación progresiva de unidades de tubulina del extremo (+) que estaban ancladas en el cinetocoro. Al mismo tiempo, se produce una actividad de proteínas motoras unidas al cinetocoro, que avanzan hacia el centrosoma al cual se dirige la cromátida, a la vez que se van perdiendo unidades de tubulina, lo que conlleva el acortamiento de microtúbulos y el arrastre de la cromátida hacia el polo (v. fig. 12-7). 502 FIGURA 12-7 La dinámica de microtúbulos desempeña un papel esencial durante los movimientos de los cromosomas y las cromátidas en la mitosis. A. En la anafase A las cromátidas se mueven hacia los polos; en la anafase B se produce una separación de los polos. B. La despolimerización de los microtúbulos en los cinetocoros de las cromátidas y la acción de las proteínas motoras permiten que las cromátidas migren hacia los polos. C. La polimerización de los microtúbulos, junto con su separación (por las proteínas motoras), provoca el alejamiento de los polos en la anafase B. (Ilustraciones de: A. Calvo y C. Bravo.) En la anafase B (o anafase tardía) los polos del huso se separan entre sí. En este proceso participan los microtúbulos polares antiparalelos, que contactan entre sí por medio de proteínas motoras, formando como peldaños de una escalera. Las proteínas motoras desplazan los microtúbulos polares antiparalelos en sentidos opuestos, causando la separación de los polos. La adición de unidades de tubulina en los extremos (+) de estos microtúbulos, junto con la actuación de las proteínas motoras, permite un alargamiento de los microtúbulos y la separación progresiva de los polos (v. fig. 12-7). El otro tipo de microtúbulos del huso (los del áster) también participa en el alejamiento de los polos: las proteínas motoras ancladas en el córtex celular se unen al extremo (+) de los microtúbulos y los desplazan hacia la periferia celular; a la vez, se eliminan unidades de tubulina de este extremo. El efecto resultante es un arrastre de los polos del huso hacia el córtex celular, alejándose entre sí. Cilios Los cilios son proyecciones celulares cilíndricas de unos 0,25 μm de ancho y aproximadamente 5 μm de longitud, situados en la superficie libre de las células; están formados por un eje de nueve dobletes de microtúbulos periféricos que quedan rodeando a dos microtúbulos centrales. Esta estructura se denomina axonema, y está rodeada por la membrana plasmática. Existen dos tipos de cilios, que se diferencian por la estructura del axonema y por la función que desempeñan: a) los cilios móviles (figs. 12-8 y 12-9), y b) los cilios inmóviles, también llamados cilios primarios. Tradicionalmente, los cilios con un axonema cuya estructura interna de microtúbulos es como la descrita, es decir, de tipo 9 + 2 (nueve dobletes de microtúbulos periféricos y dos centrales), se llaman también «móviles», mientras que los 2 del tipo 9 + 0 (sin el par central de microtúbulos) se llaman «inmóviles» o «cilios primarios». Los cilios inmóviles 9 + 0 2 2 503 se encuentran normalmente como cilios únicos (un cilio por cada célula) y actúan como antenas que recogen señales extracelulares para transmitirlas al interior celular. De todos modos, esta clasificación tiene sus excepciones; por ejemplo, hay cilios del tipo 9 + 0 en el nódulo primitivo del embrión que tienen una motilidad giratoria. También hay 2 cilios inmóviles del tipo 9 + 2 que carecen de brazos de dineína (proteína motora del cilio), y que pueden ser 2 encontrados en órganos sensores como el oído interno y el epitelio olfatorio. FIGURA 12-8 Estructura de un cilio móvil. Las secciones transversales al nivel del tallo y del cuerpo basal muestran su diferente estructura interna. (Ilustración de: A. Calvo.) 504 FIGURA 12-9 A. Imagen de microscopía electrónica de transmisión de un corte transversal del tallo de un cilio donde se observa la estructura característica 92 + 2 del axonema. B. Imagen de microscopía electrónica de transmisión de un corte longitudinal de cilios. Se aprecian el tallo (T), el cuerpo basal (CB) y las raíces (R). (Procedentes de: Vázquez J, López J. Citología práctica. Navarra: EUNSA, 1991.) Los cilios con función motora se encuentran habitualmente dispuestos en grandes grupos en la superficie apical de las células de algunos epitelios, como el traqueal y bronquial, donde participan en el desplazamiento del moco para arrastrar material particulado, bacterias, etc. (que han entrado con el aire inspirado) hacia la parte más alta del tracto 505 respiratorio. Otras células que presentan cilios móviles son las células epiteliales de las trompas uterinas (trompas de Falopio). Estructura y función motora de los cilios móviles Estructura En los cilios motores se pueden diferenciar tres partes (v. fig. 12-8): Tallo Es la parte más larga del cilio y se extiende hacia el exterior celular. Posee un axonema de tipo 9 + 2, rodeado por 2 membrana plasmática. Cada doblete de la pared del axonema está formado por un microtúbulo completo A y otro incompleto B. Los microtúbulos del par central, denominados singletes, no están unidos entre sí y son ambos completos (tienen, por lo tanto, 13 protofilamentos cada uno). Los dobletes adyacentes de la pared del microtúbulo están conectados por nexina, de modo semejante a lo que ocurría en el centríolo. Desde los nueve dobletes del axonema parten hacia el centro unas estructuras proteicas llamadas espinas o brazos radiales. Además, de cada microtúbulo A de los dobletes periféricos se extienden dos brazos de dineína (uno externo y otro interno) hacia el microtúbulo B del doblete contiguo, en el sentido de las agujas del reloj (v. fig. 12-9). La dineína es la proteína responsable de generar el movimiento ciliar utilizando la energía que le proporciona la hidrólisis de ATP, ya que tiene capacidad ATPasa. Cuerpo basal Se localiza en la base del tallo ciliar y corresponde al centríolo que organizó el axonema del cilio. Su estructura es 9 + 0 3 (idéntica a la del centríolo). Raíces ciliares Son estructuras fibrosas, no formadas por microtúbulos, que se extienden hacia el citoplasma para dar sujeción al cilio. Estas raíces contienen actina y al microscopio electrónico poseen un patrón estriado. 506 Función Los cilios motores tienen un tipo de movimiento llamado «batido ciliar», que es extraordinariamente rápido: unos 30 batidos por segundo. El movimiento se puede resumir en dos fases: en una primera fase se produce un golpe fuerte y rápido que curva el cilio, lo que implica un gasto energético y constituye un golpe efectivo; en una segunda fase (más lenta), se produce un movimiento hacia su postura vertical sin gasto de energía, llamado golpe de recuperación (fig. 12-10). Para que las células ciliadas (p. ej., las del epitelio respiratorio) realicen su función correctamente es fundamental que todos los cilios batan de modo coordinado (al mismo tiempo y en el mismo sentido). Esto se consigue mediante un acoplamiento eléctrico de las células que componen el epitelio, que permite el flujo directo de iones y pequeños mensajeros intracelulares, a través de uniones gap (v. capítulo 6). Entre las muchas alteraciones que produce el tabaco en el aparato respiratorio se encuentra la disminución del movimiento ciliar, lo que impide que se desplacen el moco, el polvo, los microorganismos, etc. El humo del tabaco daña las células epiteliales disminuyendo el movimiento de los cilios, por lo que facilita la aparición de infecciones y otras patologías respiratorias. FIGURA 12-10 Esquema del movimiento de cilios y flagelos. Estructura y función sensora de los cilios primarios (inmóviles) Como hemos indicado, además de las células ciliadas, hay otras muchas células del organismo que tienen un solo cilio inmóvil. El axonema de este cilio, llamado cilio primario, posee normalmente una estructura 9 + 0 (fig. 12-11) y está 2 especializado en el control de las respuestas sensoriales de la célula. Las proteínas estructurales del cilio no son propiamente las responsables de la señalización, sino otras proteínas especializadas en estas funciones. Así, la membrana plasmática que forma los cilios primarios es rica en receptores de canal: policistinas, receptores asociados a proteínas G, receptores de la familia hedgehog y receptores de tipo tirosina quinasa (v. capítulo 13); estos receptores pueden unirse a diferentes tipos de ligandos. Aunque los mecanismos de transmisión intracelular de señales mediados por los cilios primarios no son bien conocidos, se piensa que tienen lugar a través de segundos mensajeros que provocan cambios en la fisiología celular. Las señales olfatorias dependen del correcto funcionamiento de los 507 cilios inmóviles de neuronas modificadas del epitelio olfatorio. Las ciliopatías en este epitelio pueden causar anosmia (ausencia o disminución de la capacidad olfativa), como ocurre, por ejemplo, en los pacientes con síndrome de BardetBiedl. Este síndrome se caracteriza por degeneración retiniana, anosmia, retraso mental, presencia de riñones poliquísticos, hipertensión e hipercolesterolemia, lo que lleva a la muerte prematura de los pacientes. Esta enfermedad se ha asociado a mutaciones en una familia de proteínas denominadas BBS1 (del inglés, Bardet-Biedl Syndrome), cuya función se relaciona con la transmisión de señales intracelulares a través de los cilios. Los ratones knock out para algunos genes BBS también poseen anosmia. FIGURA 12-11 Cilios primarios o inmóviles. A. Imagen de microscopía de fluorescencia de células renales en cultivo. Las flechas indican el cilio primario de cada una de las células (en verde intenso, el tallo ciliar; en rojo, el cuerpo basal; el color azul revela la presencia de los núcleos celulares). B. Imagen de microscopía electrónica de transmisión de un corte longitudinal de un cilio primario (también se observan microvellosidades, de una longitud mucho menor que la del cilio). C. Representación de un cilio primario y comparación de su estructura con la de un cilio móvil. (C, ilustración de: A. Calvo.) Los cilios situados en las células del nódulo primitivo del embrión en fase de gastrulación (días 13 al 19 del desarrollo) parecen tener un papel determinante en la distribución asimétrica de órganos unilaterales como el corazón, el estómago, el hígado o el bazo (fig. 12-12). Un paso crucial en el desarrollo embrionario es la determinación de la bilateralidad, proceso extremadamente complejo en el que se piensa que los cilios de las células del nódulo primitivo juegan un papel importante. Si se traza una línea vertical que atraviesa el axonema de un cilio móvil, se observa que existe una diferencia entre el lado derecho y el izquierdo, ya que los brazos de dineína quedan situados hacia la derecha (v. fig. 12-12). Se piensa que los cilios motores de las células del nódulo primitivo del embrión generan un movimiento en el sentido izquierda- derecha, arrastrando fluido hacia las células situadas en el borde derecho del nódulo. Estas células poseen cilios primarios que captan el aumento de flujo e incrementan la concentración de calcio intracelular. En cambio, las células del lado izquierdo no reciben ese flujo y los niveles de calcio permanecen bajos. Esta diferencia en la señalización determinaría una expresión diferencial de genes a un lado y a otro del embrión, lo que conduciría a la correcta colocación de los órganos unilaterales. 508 FIGURA 12-12 El correcto funcionamiento de los cilios primarios parece desempeñar un papel esencial en la determinación de la posición de órganos unilaterales durante el desarrollo embrionario. A. Dibujo del nódulo primitivo del embrión. B. La posición de la dineína en el doblete de microtúbulos permite diferenciar entre un lado «derecho» y otro «izquierdo». C. Modelo para explicar la diferente señalización intracelular que reciben las células en el lado derecho e izquierdo del nódulo primitivo, lo cual podría determinar el posicionamiento de los órganos unilaterales. Si este sistema de control falla, se pueden producir alteraciones en la lateralidad de estos órganos, dando lugar al llamado situs inversus, caracterizado por la presencia de órganos como el corazón, el estómago, el hígado o el bazo en el lado opuesto en el que están en una persona normal (fig. 12-13). FIGURA 12-13 Incorrecta disposición de órganos como el corazón, el estómago, el bazo y el hígado en pacientes con situs inversus. Flagelos Los flagelos son estructuras con función motora característicos de los espermatozoides, que permiten su desplazamiento a través del tracto genital femenino. Los espermatozoides están formados por la cabeza (que contiene el material genético) y la cola, en la que se distinguen tres partes: la pieza intermedia (con mitocondrias que proporcionan el ATP necesario para el movimiento), la pieza principal y la pieza final. El eje motor del espermatozoide contiene un axonema de estructura 9 + 2 que recorre toda la cola. Rodeando al axonema en la pieza 2 509 intermedia y principal se encuentran las fibras densas: complejos proteicos que proporcionan soporte, manteniendo así intacta la estructura del espermatozoide durante los movimientos ondulantes que permiten su desplazamiento (v. fig. 12-10). La alteración morfológica de los flagelos puede ocasionar enfermedades reproductivas debidas a la falta de motilidad espermática. La astenospermia (también llamada astenozoospermia) se caracteriza por una pérdida o disminución de la motilidad del 50% o más en los espermatozoides del semen. Esta patología puede tener diversas causas, una de las cuales consiste en las anomalías estructurales del axonema del espermatozoide. Ciliogénesis La formación de cilios se denomina ciliogénesis y se inicia con la multiplicación de los centríolos y la migración hacia la membrana plasmática. Los centríolos se disponen de modo perpendicular a la misma y constituyen así el cuerpo basal, que actúa como centro de nucleación de tubulinas. Los microtúbulos A y B del cuerpo basal crecen hacia la periferia celular formando el axonema del tallo ciliar (que queda rodeado de membrana plasmática), mientras que el microtúbulo C del cuerpo basal no crece. En células epiteliales ciliadas el proceso de ciliogénesis puede ir precedido de una invaginación de la membrana plasmática apical, por la que se forma una hendidura de ciliogénesis, alrededor de la cual se alinearían los cuerpos basales que darán lugar a múltiples cilios (fig. 12-14). En una fase posterior, la membrana se situaría en su posición normal, una vez que los cilios se han formado mediante elongación de los cuerpos basales. En otros casos se forma una verdadera vacuola citoplasmática (vacuola ciliar), alrededor de la cual tiene lugar el proceso de ciliogénesis, que posteriormente se dirige a la membrana plasmática apical y se fusiona con ella, quedando los cilios hacia el exterior celular. FIGURA 12-14 Proceso de ciliogénesis. La formación de cilios en células ciliadas implica la migración de los centríolos, que se sitúan perpendicularmente a la membrana plasmática. La nucleación de microtúbulos por parte del centríolo da lugar a la formación del axonema del cilio. En la imagen, los números corresponden a cilios en fases sucesivas de crecimiento. (C, reproducida a partir de: Don W. Fawcett. The Cell. Philadelphia: Saunders Company, 1981.) 510 Algunas patologías relacionadas con disfunciones en los cilios Además de las ciliopatías a las que nos hemos referido previamente, nos detenemos ahora en algunas otras enfermedades que se asocian a fallos en la función ciliar. La disquinesia ciliar primaria (PCD, del inglés primary ciliary dyskinesia) es una enfermedad genética autosómica recesiva de escasa incidencia, que se origina por alteraciones en la estructura del axonema de cilios y flagelos. Esta patología puede provocar bronquitis y sinusitis crónica, otitis e infertilidad, como consecuencia de alteraciones en la estructura de los cilios del epitelio del tracto respiratorio, oído, trompa de Falopio, y los espermatozoides. La falta de motilidad de los cilios del aparato respiratorio resulta en un defectuoso desplazamiento del moco, lo que impide la expulsión de microorganismos y, por lo tanto, facilita las infecciones crónicas. La causa más frecuente de PCD es la presencia de mutaciones en el gen de la dineína (proteína motora del axonema). No obstante, se han descrito otras causas, como la ausencia de las espinas radiales o del par central de microtúbulos, o incluso una completa aplasia ciliar (es decir, ausencia total de cilios). En el 50% de los pacientes con disquinesia ciliar se puede encontrar también situs inversus. Cuando la sintomatología afecta al aparato respiratorio y al reproductor, y aparece situs inversus se conoce como síndrome (o tríada) de Kartagener. En el riñón, los cilios primarios están situados en la parte apical de las células epiteliales de los túbulos renales. En un principio se pensó que estos cilios no tenían una función importante en la fisiología renal, pero estudios posteriores demostraron que su alteración puede dar lugar a la aparición de enfermedades como el riñón poliquístico. En situación normal, el arrastre del fluido que circula por los túbulos renales curva los cilios primarios, originándose una señalización intracelular cuya respuesta es la correcta absorción de iones y H O por parte de la célula. En el cilio se 2 localizan las policistinas (codificadas por los genes PDK), proteínas que se relacionan con la función mecanosensorial del cilio renal y con la señalización intracelular. La alteración de la estructura del cilio primario o las mutaciones en las policistinas dan lugar a una disfunción en la señalización intracelular, que causa una proliferación celular anormal y la formación de quistes renales llenos de fluido (fig. 12-15). El riñón poliquístico es una de las enfermedades hereditarias más frecuentes que causa alteración renal progresiva, lo cual origina insuficiencia renal crónica y puede requerir, en una fase más avanzada, diálisis y trasplante renal. 511 FIGURA 12-15 Imagen de un riñón poliquístico, cuyo desarrollo se asocia a defectos en los cilios primarios de los túbulos renales. (Procedente de http://www.shef.ac.uk/bms/research/robson/research.) 512 Microfilamentos de actina y filamentos gruesos de miosina Estructura de los microfilamentos e inestabilidad dinámica Los microfilamentos (filamentos finos o delgados) tienen un diámetro de 7 nm y están constituidos por polímeros de actina que forman una doble cadena helicoidal. La actina puede ser de tipo α, que se encuentra exclusivamente en células musculares; β, localizada en el citoplasma de la mayoría de los tipos celulares no musculares (principalmente en la periferia celular); y γ, cuya localización suele coincidir con la de la actina β. En células no musculares existe una compleja red de microfilamentos en la zona del citoplasma cercana a la membrana plasmática, dando lugar a lo que se denomina córtex celular, que proporciona una cierta rigidez estructural, aunque a la vez permite deformaciones de la membrana plasmática mediante contracción de los microfilamentos. En las células musculares esqueléticas, la actina es muy abundante y se distribuye por todo el citoplasma de modo altamente ordenado formando parte de los sarcómeros (v. más adelante). Las funciones de los microfilamentos son las siguientes: • Son responsables de la contracción del sarcómero de las células musculares esqueléticas. También participan en la contracción de las fibras de músculo liso, aunque en este caso la unidad motora no es un sarcómero organizado. • Intervienen en el mantenimiento de la forma de cada tipo celular. • Participan en los movimientos de las células. • Forman el anillo contráctil en la citocinesis, permitiendo que las células hijas se separen en la fase final de la división celular. • Facilitan el anclaje de células vecinas, ya que forman una red intracelular que se une a las zónulas ocluyentes y a las adherentes. • Forman el sostén de microvellosidades y estereocilios. • Participan en el desplazamiento intracelular de vesículas, de forma similar a como lo hacen los microtúbulos. Para que se lleven a cabo estas funciones, los filamentos de actina interaccionan con proteínas de la familia de la miosina, cuya propiedad más relevante es la capacidad motora (utilizando la energía proporcionada por la hidrólisis de ATP) para desplazar los filamentos de actina. A diferencia de los microtúbulos —formados por heterodímeros—, los microfilamentos están constituidos por monómeros de actina. Las unidades aisladas de actina se denominan actina G (globular), mientras que la actina en forma de filamento se conoce como actina F (filamentosa). Al igual que ocurre con la tubulina, la actina puede 513 polimerizarse o despolimerizarse experimentalmente in vitro (fig. 12-16). La polimerización depende de la concentración de esta proteína en el medio de cultivo y el crecimiento se frena cuando la concentración de actina en el medio es limitante, de modo que no se pueden incorporar más unidades al polímero. FIGURA 12-16 Esquema de la estructura de un filamento fino de actina en el que se muestra su dinámica de polimerización y despolimerización. La actina-ATP se une al filamento por el extremo (+) (llamado «protuberante»), pasando posteriormente a transformarse en actina-ADP, que es menos estable. La actina-ADP tiende a desprenderse del microfilamento en el extremo (–), también llamado «puntiagudo». Los monómeros de actina no son esféricos, sino que se puede distinguir una zona o extremo puntiagudo y un extremo protuberante. La polimerización ocurre de modo que las moléculas quedan orientadas siempre en el mismo sentido, estableciéndose (al igual que ocurría con los microtúbulos) una polaridad en el filamento. El crecimiento del microfilamento se produce fundamentalmente por el extremo protuberante (extremo «más»), mientras que decrece por el extremo puntiagudo (extremo «menos») (v. fig. 12-16). La interpretación molecular que explica por qué los microfilamentos crecen por el extremo (+) y decrecen por el (–) en condiciones experimentales in vitro es semejante a la de los microtúbulos. Las unidades de actina unidas a ATP se incorporan por el extremo protuberante. Pero tras una lenta hidrólisis del ATP en ADP + Pi, la molécula se vuelve menos estable y tiende a desprenderse del microfilamento. El crecimiento o decrecimiento depende entonces de la concentración de actina G disponible en el medio. Los microfilamentos sufren también el fenómeno del intercambio rotatorio, que es más frecuente que el observado en los microtúbulos. Poseen, además, fluctuaciones en longitud, creciendo y decreciendo por el extremo (+), pero estos cambios son más lentos y menos importantes que los observados en microtúbulos, por lo que la inestabilidad dinámica es inferior. Lógicamente, la dinámica de los microfilamentos observada in vitro no tiene lugar de modo incontrolado en la célula, ya que existen numerosos tipos de proteínas que regulan la estabilidad y asociación de los microfilamentos en haces o redes. Las células agrupan los polímeros de microfilamentos para formar haces paralelos o perpendiculares, o intrincadas redes que proporcionan el soporte estructural necesario para el desarrollo de funciones concretas, como, por ejemplo, mantener la forma de las microvellosidades, promover el movimiento celular por medio de lamelipodios y filopodios, o anclarse firmemente a un sustrato (mediante fibras de estrés). La polimerización/despolimerización de la actina también controla la densidad del citoplasma. Si la polimerización da lugar a la formación de redes o mallas densas, se 514 favorece que el citoplasma adquiera mayor consistencia, y se dice que se encuentra en estado gel. El estado opuesto se llama sol, en el que el citoplasma carece de dichas redes y es más fluido. Proteínas unidoras de actina Como se ha mencionado antes, el comportamiento dinámico de los microfilamentos está fuertemente regulado por la célula mediante la actividad de proteínas de diversa naturaleza que reciben el nombre genérico de proteínas unidoras de actina (ABP, del inglés actin-binding proteins) (fig. 12-17). El correcto funcionamiento de estas proteínas es esencial para el mantenimiento de la estructura del citoesqueleto y para que tengan lugar procesos como la endocitosis, la motilidad, la polaridad celular, etc. Entre estas proteínas se pueden destacar: • ADF (actin depolymerizing factor)/cofilina: familia de proteínas que se unen a la ADP-actina G y a la actina F. Estas proteínas favorecen la tasa de disociación de la ADP-actina G en los extremos (–), induciendo la despolimerización de los microfilamentos. Esto origina complejos ADF/cofilina-ADP-actina G libres en el citosol, que no se pueden incorporar de nuevo al microfilamento, ya que la actina está «secuestrada». Para revertir esta situación es necesaria la actividad de la proteína profilina, que estimula el intercambio de ADP por ATP en la actina G, desprendiéndose así del complejo ADF/cofilina y quedando libre para su incorporación al microfilamento por el extremo (+). La ADF/cofilina puede, además, unirse a lo largo de los microfilamentos y fragmentarlos, dando lugar a otros de menor tamaño (v. fig. 12-17). • Gelsolina: es también una proteína fragmentadora de microfilamentos que actúa en presencia de Ca . La +2 gelsolina se une, además, a los extremos (+) de los polímeros de actina, impidiendo así que crezcan (v. fig. 12-17). Se encuentra abundantemente expresada en células con gran motilidad (como los macrófagos) y también en organismos unicelulares como las amebas. • Los filamentos de actina se pueden ramificar formando estructuras en forma de árbol. El complejo proteico Arp2/3, formado por varias proteínas, participa en la nucleación de la actina y en la ramificación de los microfilamentos. La unión de Apr2/3 a la actina favorece el inicio de su polimerización en otra dirección y, por lo tanto, su ramificación (v. fig. 12-17). • Las proteínas Rho, Rac y cdc42 pertenecen a la familia de las llamadas proteínas G pequeñas y poseen la capacidad de unir nucleótidos de guanina. La estimulación de cada una de estas proteínas parece ser importante en la formación de haces de actina con diferentes características. Así, Rho puede contribuir a la formación de fibras de estrés, Rac favorece la formación de lamelipodios, y cdc42 de filopodios. Estas proteínas son importantes, además, para que la célula se mueva correctamente y parecen ser muy relevantes en la invasión de las células tumorales. 515 • Filamina es una proteína que entrecruza los filamentos de actina formando redes ortogonales y participa en el anclaje de la actina a la membrana plasmática (v. fig. 12-17). En ausencia de filamina, el citoplasma tiende a permanecer en estado sol. • WASp (del inglés Wiskott-Aldrich Syndrome protein) promueve la polimerización de la actina en filamentos (v. fig. 12-17). La proteína WASp activa a Arp2/3 para que pueda comenzar la nucleación de los microfilamentos. Algunas mutaciones en WASp son letales, mientras que otras afectan a la funcionalidad de distintos tipos celulares. Las mutaciones que dan lugar al síndrome de Wiskott-Aldrich afectan fundamentalmente al sistema hematopoyético. Este síndrome, de incidencia poco frecuente, cursa con eccema, trombocitopenia, deficiencias en el sistema inmunitario y diarreas sanguinolentas. Su tratamiento puede requerir transfusión de plaquetas o incluso trasplante de médula ósea. • Cortactina: esta proteína se une al complejo Arp2/3 y lo activa; además promueve la polimerización y estabilidad de los microtúbulos, especialmente en la corteza celular. Se ha descrito un aumento de su expresión en distintos tipos de cáncer y células malignas metastásicas con alta capacidad de motilidad e invasión. • Fimbrina y villina: se sitúan en las microvellosidades y organizan los filamentos en haces paralelos (v. fig. 12-17), como se ha descrito en el capítulo 6. • Actinina α: fija filamentos de actina para la formación de haces contráctiles del sarcómero muscular (como se verá más adelante). • CapZ: actúa taponando el extremo (+) de los microfilamentos situados en el sarcómero. Es una de las proteínas tipo capping (encapsuladoras, casquete o tapa) que se unen a los extremos de los microfilamentos para estabilizar su elongación. • Miosina II: participa en el deslizamiento de los filamentos delgados en la contracción del sarcómero. • Miosinas I y V: proteínas motoras que son responsables del arrastre de microfilamentos en células no musculares y del movimiento de vesículas y orgánulos a través de los filamentos de actina. • Espectrina: esta proteína se asocia con los filamentos de actina para formar una red de sostén que ayuda a mantener la forma del eritrocito (v. capítulo 3). • Timosina: se une a las unidades de actina G impidiendo su polimerización espontánea, por lo que promueve que la actina permanezca en su forma monomérica (v. fig. 12-17). 516 FIGURA 12-17 Esquema de diferentes modos en los que se pueden organizar los microfilamentos tras interactuar con proteínas que modifican la polimerización/despolimerización de actina. Agentes que modifican la polimerización/despolimerización de los microfilamentos Algunos fármacos y agentes tóxicos son capaces de alterar la dinámica normal de los microfilamentos. La faloidina es una toxina aislada del hongo venenoso Amanita phalloides, que actúa estabilizando anormalmente los microfilamentos de actina, impidiendo así su normal dinámica de formación/destrucción. Sin embargo, la potente toxicidad de A. phalloides no se debe a la faloidina, ya que esta casi no es absorbida por el intestino, y solamente causa gastroenteritis. La toxicidad de A. phalloides, como se comentó en el capítulo 8, se debe fundamentalmente a la toxina α-amanitina, que inhibe la actividad de la ARN polimerasa II y causa fallos hepáticos, renales y encefalopatía. La citocalasina D, una micotoxina de tipo alcaloide, bloquea la polimerización de los microfilamentos al unirse sus extremos (+). Utilización de la actina de la célula huésped por microorganismos Determinados microorganismos pueden aprovecharse de la actina celular del huésped para moverse en el citoplasma e invadir otras células vecinas. Es el caso de la bacteria Lysteria monocytogenes, que causa listeriosis. Esta enfermedad es una zoonosis bacteriana poco frecuente pero muy grave, que puede ocasionar la muerte hasta en el 40% de las personas de riesgo infectadas (ancianos y niños). La infección se puede originar por ingestión de alimentos poco 517 tratados como leche, verduras, quesos, etc. Lysteria es un bacilo que se une a la cadherina E de las células del epitelio del tubo digestivo, se incorpora en una vesícula de endocitosis y posteriormente queda libre en el citoplasma. La bacteria es capaz entonces de polimerizar la actina G utilizando los complejos Arp2/3 para formar un haz de actina (llamado cola de cometa) que permite a la bacteria recorrer el citoplasma. El bacilo se coloca perpendicularmente a la membrana plasmática y las colas de actina hacen protruir esta membrana hacia la célula huésped contigua, facilitando así su invasión. De este modo, Lysteria puede introducirse en una célula vecina, quedando rodeada por una doble membrana que digerirá posteriormente (fig. 12-18). FIGURA 12-18 Utilización del mecanismo de polimerización de la actina por microorganismos para infectar a la célula huésped. A. Imagen de microscopía de fluorescencia de las colas de actina (flechas) formadas por Lysteria monocytogenes, que se desplaza por el citoplasma celular. La bacteria aparece en esta imagen de color rojo, la actina en verde y los núcleos celulares en color azul. B. Esquema de la formación de colas de actina por Lysteria monocytogenes e invasión de una célula vecina. C. Pedestales de actina formados por la bacteria Escherichia coli. (a): microscopía electrónica de barrido; (b y c): microscopía electrónica de transmisión que muestra dos cepas distintas; (d): esquema del proceso de formación del pedestal. (A, procedente de: http://www.ibmc.up.pt/research/researchgroups/molecular-microbiology; C, procedente de: Campellone KG. FEBS J 2010;277:2390-2402.) Otra bacteria capaz de manipular la polimerización de actina en la célula huésped para infectar es Escherichia coli, una enterobacteria que causa infecciones intestinales. La interacción de la bacteria con proteínas de la membrana apical de los enterocitos activa una cascada de señalización intracelular que favorece la formación de actina F en posición perpendicular a la membrana apical, deformándola y constituyendo lo que se conoce como «pedestal», cuya formación parece facilitar la movilidad de la bacteria a lo largo de la membrana y evitar la fagocitosis (v. fig. 12-18). Aparte de las bacterias citadas, hay otras muchas que perturban la dinámica normal de los microfilamentos para infectar a sus células huésped y moverse a través del citoplasma. La miosina. Formación de filamentos gruesos 518 La miosina es una proteína ubicua, encontrada abundantemente en las células musculares lisas y estriadas, que interactúa con la actina para realizar diferentes funciones motoras, incluidas la contracción muscular, el transporte de vesículas a través del citoplasma, etc. El genoma humano contiene 40 genes de miosina distintos. Como característica general, las diferentes miosinas poseen tres dominios diferentes: a) un dominio globular (cabeza) con capacidad motora; b) una zona intermedia o cuello, y c) una cola, cuya estructura varía en los diferentes tipos de miosina. El primer tipo de miosina que se descubrió fue la miosina II, que se aisló del músculo esquelético. La miosina II está formada por dos proteínas idénticas enroscadas entre sí; por lo tanto, en la molécula de miosina II se distinguen dos cabezas globulares (dominios motores) y dos polipéptidos idénticos alargados entrecruzados entre sí de forma helicoidal para formar la cola de la molécula (fig. 12-19). Las cabezas de la miosina II incluyen el extremo N-terminal de la proteína, mientras que en la cola queda situado el extremo C-terminal. FIGURA 12-19 A. Representación de las moléculas de miosina I, II y V. B. Imagen de microscopía electrónica de transmisión que muestra la interacción actina-miosina in vitro. Las moléculas de actina-miosina se unen de forma polarizada dando lugar a una hilera de puntas de flecha. (B, prodecente de: Waller GS, et al. J Biol Chem 1995;270:15348-52.) La propiedad fundamental de la miosina es la capacidad de utilizar energía (ATP) mediante su actividad ATPasa localizada en la cabeza globular. La hidrólisis de ATP genera la energía suficiente para provocar un cambio conformacional en la proteína; si la miosina está unida a la actina se produce entonces un desplazamiento de los filamentos de actina, que es el fundamento de la contracción del músculo liso y estriado. La interacción entre la miosina y la actina se ha estudiado experimentalmente. Las cabezas globulares se pueden separar de las colas mediante tratamiento enzimático con papaína, comprobándose así que solo las cabezas tienen actividad ATPasa, esencial para la actividad motora de esta proteína. Si estas cabezas motoras se añaden in vitro junto a actina F y se observan al microscopio electrónico, se puede ver que la miosina se une espontáneamente a la actina formando unas estructuras de disposición regular que recuerdan a una hilera de puntas de flechas, todas situadas en la misma dirección (v. fig. 12-19). La punta de la flecha queda situada hacia el extremo (–) del filamento de actina, mientras que 519 el extremo «barbado» (el de crecimiento) queda hacia el (+). Por lo tanto, existe también una polaridad en la interacción de estos filamentos, lo cual es importante, como se verá más adelante, para la contracción muscular. En el músculo estriado, las moléculas de miosina II se asocian entre sí para formar un filamento grueso de 15 nm de espesor y 1,6 μm de longitud, que incluye 300-400 moléculas entrelazadas entre sí longitudinalmente. Las moléculas de miosina se agrupan de modo escalonado y dejando las cabezas globulares hacia el exterior del filamento. Cada filamento grueso posee por tanto un ramillete de moléculas de miosina con las cabezas hacia un extremo del filamento y otro ramillete antiparalelo orientado hacia el otro extremo (fig. 12-20). FIGURA 12-20 A. Electronografía del sarcómero. B. La contracción muscular implica una reducción de la longitud de los sarcómeros de las fibras musculares, mediante un acercamiento de los filamentos de actina hacia el centro del sarcómero. (A, modificada de: Ottenheijm et al. Respir Res 2008;9:12.) Aparte de la miosina II, se ha estudiado la estructura y función de otros miembros de la familia de las miosinas, como la miosina I o la V. La miosina I se dispone en forma sencilla, con una sola cola y una sola cabeza (v. fig. 12-19). Este tipo de miosina no forma filamentos complejos, sino que cada molécula individual puede interaccionar con un filamento de actina y moverse a través de él (con gasto de ATP) para transportar vesículas hacia el lado (+) del filamento. La miosina I también forma parte de las proteínas que componen las microvellosidades (v. capítulo 6), donde su actividad motora puede arrastrar los filamentos de actina, provocando el movimiento de la microvellosidad. La miosina V posee dos cabezas y dos colas, pero el enrollamiento de las colas es solo parcial. Esta proteína contribuye también al desplazamiento de vesículas y orgánulos en el citoplasma celular; por ejemplo, intervienen en la transferencia de gránulos de melanina desde el melanocito al queratinocito. En la enfermedad de Griscelli se produce una despigmentación de la piel debida a una mutación en la miosina V, que impide la transferencia de melanina a los queratinocitos. Estructura del sarcómero en el músculo esquelético y contracción muscular La contracción muscular es la función mejor conocida y más representativa de la interacción entre los filamentos de actina y miosina. Las células musculares esqueléticas, cardíacas y lisas basan su mecanismo de contracción en esta interacción molecular. El músculo esquelético es de tipo estriado y es responsable del movimiento voluntario. La actina y la miosina son proteínas muy abundantes en este tipo de músculo, donde (como vamos a ver), se disponen de 520 modo altamente organizado, permitiendo así la contracción eficaz del mismo. Los músculos esqueléticos están formados por fibras musculares: células multinucleadas que contienen en el citoplasma numerosas miofibrillas. Estas están constituidas a su vez por unidades repetitivas de sarcómeros, que son las estructuras motoras del músculo basadas en filamentos de actina y miosina. Los sarcómeros contienen un entramado altamente organizado de filamentos finos de actina y filamentos gruesos de miosina (v. más adelante), aparte de un conjunto de proteínas que contribuyen al mantenimiento de la organización estructural del sarcómero. Al microscopio electrónico se puede observar que las miofibrillas del músculo esquelético presentan un patrón de bandas claras y oscuras. Las bandas oscuras se denominan A (de anisotrópicas con luz polarizada), mientras que las claras se llaman I (de isotrópicas) (v. fig. 12-20). En las bandas claras (I) existe en realidad una zona oscura situada en posición central, a la que se denomina disco o línea Z. El sarcómero se define como la unidad comprendida entre dos discos Z, lo que corresponde aproximadamente a 2,5 μm de longitud en situación de relajación. La contracción muscular implica una reducción de la longitud del sarcómero de aproximadamente 0,4 μm. En la banda oscura (A), también se puede observar una zona algo más clara situada en el centro, llamada zona H. En las bandas A se sitúan los filamentos gruesos de miosina. Los microfilamentos de actina se disponen paralelos a los de miosina, rodeándolos en las zonas periféricas, donde se sitúan las cabezas de miosina, lo cual permite la interacción entre ambos filamentos. Estos filamentos están formados por actina F junto a una multitud de proteínas que se asocian al filamento. La tropomiosina, que se enrolla como un fino cordón sobre el polímero de actina y el complejo de la troponina (que se engarza entre los huecos de la hélice de actina) juegan un papel clave en la contracción del sarcómero (v. más adelante). Durante la contracción muscular, las bandas A no varían de longitud, a diferencia de las bandas I, que se acortan cuando la actina se desplaza sobre la miosina. La contracción se produce porque los filamentos de miosina, utilizando la energía proporcionada por la hidrólisis de ATP, arrastran a los filamentos de actina, acortando así la distancia entre dos discos Z consecutivos (v. fig. 12-20). Este proceso, que tiene lugar a la vez en todos los sarcómeros de la miofibrilla, tiene como resultado la contracción de la fibra muscular; la contracción simultánea de las diferentes fibras musculares da lugar a la contracción del músculo entero. La interacción entre la miosina y la actina es el evento molecular clave en el proceso de contracción. El arrastre de los filamentos de actina implica que las cabezas de miosina (que contactan con los filamentos de actina) ejercen un movimiento de tipo bisagra por el cual desplazan a estos filamentos. Como hemos indicado, el proceso de empuje requiere el gasto de ATP, que se hidroliza por la actividad ATPasa de la cabeza de miosina y tiene lugar en una serie de pasos cíclicos que se detallan a continuación (fig. 12-21): 1. Inicialmente, la cabeza de miosina contacta débilmente con la actina. En este estado, la miosina lleva unidas ADP + Pi. En una etapa posterior, se pierde el Pi (paso 1), quedando la miosina más fuertemente unida al filamento de actina (estado de «pregolpe»). Esta modificación da lugar a un cambio conformacional en la miosina, que libera el ADP y 521 provoca el movimiento de tipo bisagra (paso 2) que desplaza al microfilamento 10 nm hacia el centro del sarcómero (estado de «posgolpe»), con lo que tiene lugar la contracción muscular. 2. Entonces el ATP se une a la cabeza de la miosina, lo que provoca otro cambio en la conformación de la miosina que hace que se libere de la actina (paso 3). El ATP se disocia entonces en ADP y Pi (paso 4) y la energía obtenida de esta disociación hace que la miosina contacte de nuevo con la actina en una posición distinta a la original (paso 5) y comience otro ciclo. FIGURA 12-21 A. Modelo del ciclo del ATP en la contracción muscular. Los diferentes pasos están explicados en el texto. B. La contracción muscular implica la unión de Ca+2 a TnC, de tal modo que la tropomiosina no impida la interacción actina-miosina. C. Representación de un filamento longitudinal de actina que muestra su interacción con la tropomiosina y la troponina. (A, J. Spudich, Nature [1994] 372:515-518 McMillan Magazines, Ltd.; B, W.M. Becker et al. The World of the Cell 4. ª Ed. San Francisco, CA, Addison Wesley Longman 2000 © Addison Wesley Longman Inc.; C, Modificado de Mathews C, Van Holde K, Ahem K. Bioquímica, 3.ª ed. Madrid: Addison Wesley; 2002.) Este proceso se repite varias veces durante la contracción en cada una de las moléculas que componen el filamento grueso de miosina, hasta que la unidad sarcomérica disminuye de tamaño. Regulación de la contracción muscular por el Ca+2 El proceso de contracción muscular depende de las concentraciones intracelulares de Ca citoplasmático en la célula +2 muscular. En situación de reposo, la miosina no contacta directamente con la actina porque la tropomiosina está impidiendo estéricamente la interacción (v. fig. 12-21). Para que la tropomiosina se desplace, permitiendo el contacto actina-miosina, la porción TnC del complejo proteico de la troponina debe unirse al Ca (v. fig. 12-21). Esta unión +2 provoca un arrastre de la tropomiosina, que permite que la cabeza de miosina se una a la actina. En estado de relajación, las concentraciones de Ca en el citoplasma son bajas ( +2 522 ∼10 mM), por lo que la tropomiosina bloquea los −4 sitios de unión de la actina-miosina. Pero durante la contracción se elevan los niveles de Ca citoplasmático (> 10 +2 −3 mM); la miosina interactúa con la actina y se produce el desplazamiento de los filamentos. Por lo tanto, la concentración de Ca en el citoplasma es un factor clave para la contracción y debe estar altamente regulada en la +2 célula. En condiciones de reposo, el Ca permanece secuestrado en el retículo sarcoplásmico (el nombre que recibe el +2 retículo endoplasmático liso de la fibra muscular) y se libera cuando este catión es necesario para ejercer funciones de señalización que inicien la contracción. La contracción del músculo esquelético tiene lugar cuando el sistema nervioso envía una señal que se transmitirá mediante el potencial de acción hasta el lugar en el que la neurona contacta con el músculo, denominado unión neuromuscular (fig. 12-22). Los terminales axónicos vierten el neurotransmisor acetilcolina en la unión neuromuscular, que es reconocida por receptores específicos en la membrana muscular (llamada sarcolema). Esta unión hace que se abran los canales de Na , provocando la despolarización de la membrana (paso 1), que se propaga + rápidamente a toda la célula a través de unas invaginaciones de la membrana a las que se denomina túbulos T (transversales con respecto a la orientación de las microfibrillas) (paso 2). En paralelo a cada túbulo T se sitúan dos túbulos de retículo sarcoplásmico, formando las llamadas tríadas del sarcómero. La despolarización de la membrana en los túbulos T, que están en estrecho contacto con el retículo sarcoplásmico, provocan la apertura de los canales de Ca de la membrana del retículo, y la liberación de este catión hacia el citosol (paso 3). Como se ha comentado antes, +2 esto permite la interacción actina-miosina y ocasiona la contracción muscular (pasos 4-7). Una vez finalizada la contracción, los iones Ca retornan al interior del retículo sarcoplásmico gracias a la actividad de una bomba ATPasa +2 que lo transporta en contra de gradiente, con gasto de ATP (paso 8). FIGURA 12-22 Acontecimientos que tienen lugar desde que se produce la liberación de acetilcolina (Ach) en la unión neuromuscular hasta que la miosina arrastra a la actina en la contracción muscular. Los diferentes pasos están explicados en el texto. Interacción entre actina y miosina en células no esqueléticas 523 En el músculo cardíaco también existe estriación y un sistema de sarcómeros, aunque posee diferencias histológicas y funcionales con respecto al músculo esquelético. En el músculo cardíaco el núcleo de la célula está situado en posición central, a diferencia de los núcleos periféricos de la fibra muscular esquelética. Además, existen unas estructuras llamadas discos intercalares: complejos especializados de unión entre células cardíacas vecinas. Por lo tanto, las fibras musculares cardíacas corresponden a células individuales, mientras que las del músculo esquelético provienen de la fusión de varias células, y dan lugar a fibras multinucleadas. La contracción en el músculo cardíaco tiene lugar de modo involuntario y está regulada por un sistema de marcapasos. Los discos intercalares permiten el acoplamiento eléctrico entre las células musculares, lo que da lugar a una contracción muy sincronizada. Las fibras del nódulo sinoauricular, las del nódulo auriculoventricular y las de la red de Purkinje (células musculares cardíacas especializadas que se sitúan entre las fibras cardíacas) se encargan de transmitir los impulsos eléctricos que estimulan la contracción. El funcionamiento básico de la contracción del músculo cardíaco es semejante al descrito para el músculo esquelético y también está regulado por el Ca . +2 El músculo liso no posee estriación; se encuentra en las vísceras y los vasos sanguíneos y está formado por células fusiformes unidas entre sí por contactos de unión. Estas células pueden sintetizar matriz extracelular y poseen capacidad contráctil, pero la contracción es rítmica, involuntaria y más lenta que la de las fibras estriadas. A diferencia de las células musculares estriadas, no presentan estructuras sarcoméricas. La capacidad contráctil es debida a un conjunto de haces de microfilamentos de actina, filamentos gruesos de miosina (de tipo II) y filamentos intermedios de tipo vimentina y desmina (v. más adelante) anclados en unas estructuras llamadascuerpos densos, que se encuentran en diferentes puntos del citoplasma celular, junto a la membrana (fig. 12-23). Los cuerpos densos contienen como componente mayoritario α-actinina, proteína con capacidad de unir actina. Los cuerpos densos y los filamentos de actina forman redes interconectadas entre sí que recorren la célula de lado a lado. Mediante interacciones actina-miosina, las redes de microfilamentos se estrechan provocando la contracción celular. Las células musculares lisas están conectadas entre sí mediante uniones de tipo gap (v. capítulo 6), lo que permite una contracción coordinada. FIGURA 12-23 Esquema de la contracción muscular en células de músculo liso. 524 En el proceso de contracción se encuentran algunas diferencias con respecto a las fibras estriadas (fig. 12-24). La contracción de las células musculares lisas depende también de la elevación de los niveles de Ca citoplasmático, pero +2 en este caso el Ca proviene mayoritariamente del exterior celular, más que del retículo sarcoplásmico. La elevación +2 del Ca se produce como consecuencia de una estimulación nerviosa u hormonal de la célula muscular. Estas células +2 no contienen troponina (pero sí tropomiosina), por lo que utilizan un sistema de activación de la contracción distinto al de las fibras estriadas. La quinasa de las cadenas ligeras de miosina (MLCK, del inglés myosin light chain kinase) posee un papel semejante en estas células al de la troponina en la célula muscular estriada (v. fig. 12-24). Cuando se elevan los niveles de Ca se produce una unión entre el Ca y la proteína calmodulina, formando el complejo Ca +2 +2 +2 calmodulina, que activa a su vez a la MLCK. Esta proteína quinasa se encarga de fosforilar la cadena ligera de la miosina (MLC, del inglés myosin Light chain), favoreciendo el ensamblaje de los filamentos de miosina y permitiendo que interactúe de modo directo con la actina y se produzca la secuencia de acontecimientos explicada para las fibras musculares estriadas para que tenga lugar la contracción (v. fig. 12-24). Cuando disminuye la concentración de Ca en +2 el citoplasma, la MLCK se inactiva y una fosfatasa elimina el fosfato de las cadenas ligeras de la miosina. Esto provoca relajación muscular, ya que la miosina no fosforilada no puede interactuar con la actina. FIGURA 12-24 A. Señalización intracelular que regula la contracción muscular en células de músculo liso. La proteína MLCK fosforila a las MLC, lo cual permite la interacción de la miosina con la actina. B. En las células de músculo liso, las moléculas de miosina II se agrupan de modo antiparalelo formando filamentos (normalmente de 15-20 unidades), que, tras ser fosforilados, conectan con los filamentos de actina y causan su desplazamiento. MLC, cadena ligera de la miosina (myosin light chain); MLCK, quinasa de la cadena ligera de la miosina (myosin light chain kinase); REL, retículo endoplasmático liso. (Ilustración de: A. Calvo.) En células no musculares también existe una interacción entre moléculas de actina y miosina que es fundamental para el regular los cambios de forma celular, el movimiento, la citocinesis, el transporte de vesículas y la posición de los orgánulos en el citoplasma, etc. El entramado de microfilamentos es menos desarrollado que el de las células 525 musculares lisas, pero la dinámica de unión actina-miosina y su regulación por el sistema Ca -calmodulina y MLCK +2 es parecido. Migración celular basada en interacciones actina-miosina y movimiento ameboide Las interacciones actina-miosina son necesarias para el movimiento de las células y, por lo tanto, para la migración celular durante el desarrollo embrionario, la metástasis, los movimientos de diapédesis de los leucocitos, etc. Para ello, las células emiten prolongaciones citoplasmáticas llamadas lamelipodios y filopodios. Los lamelipodios forman láminas extensas, mientras que los filopodios consisten en prolongaciones puntiagudas. La migración celular en un sustrato conlleva los siguientes procesos (fig. 12-25): 1. Las células se fijan al sustrato mediante fibras de estrés (v. capítulo 6), donde los filamentos de actina quedan conectados a moléculas transmembrana de integrina, que son las moléculas que contactan directamente con el sustrato. El primer paso en el movimiento celular implica la creación del lamelipodio o filopodio en la zona hacia la que se dirige la célula. Para ello, los filamentos de actina crecen en dirección a la membrana plasmática que está en proceso de extensión (en el sentido del movimiento) mediante la incorporación de actina G. Los extremos (+) de los filamentos se sitúan junto a la membrana, de tal modo que la adición de unidades de actina sobre el filamento empuja la membrana para crear el filopodio o lamelipodio. A medida que la membrana se expande hacia adelante, la miosina arrastra los filamentos de actina hacia la parte trasera de la célula, a la vez que se van incorporando los monómeros de actina G en la parte delantera. 2. Posteriormente tiene lugar una unión de lamelipodio o filopodio al sustrato, para lo cual se deben crear nuevas estructuras de unión. A la vez, las fibras de estrés de la parte trasera de la célula se deben desestructurar, para que se permita el avance; para ello, la miosina arrastra filamentos de actina situados en la zona trasera de la célula hacia la zona delantera, retrayéndose entonces el citoplasma y permitiendo el avance del cuerpo celular. En estos movimientos se produce una actividad motora de la miosina sobre la actina, de modo semejante a lo que ocurre en la contracción muscular. 3. Por último, tiene lugar la desunión de la célula por la parte trasera durante el avance. Las interacciones de actinamiosina hacen que el cuerpo celular se desplace hacia delante, y las uniones de fijación al sustrato que quedan en la zona trasera de la célula se desprenden para que se complete el movimiento. Este último proceso requiere la separación de integrinas del sustrato. 526 FIGURA 12-25 A. Movimiento secuencial de células sobre un sustrato mediante la emisión de lamelipodios y filopodios. B. La formación del lamelipodio (y filopodio) implica una adición de monómeros de actina en los filamentos de actina de la zona de avance, a la vez que la miosina desplaza el filamento hacia la parte trasera de la célula y se crean estructuras de unión al sustrato en la zona delantera. El movimiento ameboide es un tipo de movimiento que está restringido a algunas células, como, por ejemplo, los leucocitos y las amebas, e implica la formación de seudópodos (proyecciones celulares temporales con forma de dedo de guante, utilizadas también en la fagocitosis). La formación de seudópodos tiene lugar mediante un mecanismo diferente al explicado para los movimientos a través de filopodios y lamelipodios, ya que se basa en principios de gelificación-solificación del citoplasma (es decir, transición desde una forma gel rígida a una sol más fluida). Cuando una célula avanza con este tipo de movimiento, el citoplasma fluye hacia adelante y se gelifica en la punta del seudópodo. Por la parte de atrás, donde estaba inicialmente gelificado, el avance requiere una licuación del gel, para permitir el desplazamiento de la parte trasera de la célula hacia adelante. Estos cambios están mediados por la proteína gelsolina. Los cambios de gelificación, como se explicó anteriormente, implican modificaciones en la polimerización-despolimerización de los microfilamentos de actina. Algunas patologías relacionadas con anomalías estructurales de los microfilamentos La contracción muscular puede alterarse por numerosas causas, algunas de las cuales tienen su origen en defectos estructurales originados como consecuencia de mutaciones en proteínas sarcoméricas, mientras que otras se producen por alteraciones en los neurotransmisores, en las mitocondrias que proporcionan ATP a las fibras, etc. Nos centraremos en comentar brevemente las distrofias musculares de Duchenne y Becker, ejemplos de enfermedades causadas por desestructuración del sarcómero. Las distrofias musculares son un conjunto de patologías congénitas caracterizadas por debilidad, atrofia muscular y cambios degenerativos en el músculo. La distrofia muscular de Duchenne es una enfermedad genética recesiva ligada al cromosoma X, que se produce por mutaciones en el gen de la distrofina, una proteína responsable de la estabilización del sarcómero que une los filamentos de actina al 527 sarcoplasma. Los varones con una mutación en dicho gen sufren la enfermedad, mientras que las mujeres pueden ser portadoras, pero no desarrollan normalmente sintomatología. Como en el resto de enfermedades ligadas al sexo, solo las mujeres con las dos copias del cromosoma X inactivadas (cosa que es muy infrecuente) desarrollarían la enfermedad. El resultado de la mutación en la distrofina es que el sarcómero muscular queda parcialmente desorganizado y los músculos degeneran y pierden fuerza de modo progresivo. Los síntomas aparecen en la infancia y progresan con la edad, pudiendo ocasionar una pérdida de movilidad y deformaciones en el esqueleto. Los pacientes pueden mostrar cardiomiopatía por afectación de la estructura del miocardio y dificultades respiratorias, que incluso pueden ocasionar la muerte. Además del efecto mecánico, la ausencia de distrofina altera el metabolismo de la célula muscular, al modificarse una serie de cascadas de señalización intracelular y aumentar el estrés oxidativo en la célula, por mecanismos que todavía no son bien conocidos. Todos estos acontecimientos terminan por causar la muerte de fibras musculares, que son reemplazadas por tejido conjuntivo y adiposo. Esta enfermedad no tiene cura y el tratamiento es sintomático: antiinflamatorios, actividad física suave, uso de aparatos ortopédicos, etc. La distrofia muscular de Becker también se produce por mutaciones en el gen de la distrofina, pero en esta enfermedad hay una cierta cantidad de proteína funcional, a diferencia de lo que ocurre en la distrofia muscular de Duchenne. Por lo tanto, las manifestaciones clínicas son menos severas. 528 Filamentos intermedios Estructura y ensamblaje Los filamentos intermedios poseen un diámetro de 8-12 nm (un grosor intermedio entre los microfilamentos de actina y los microtúbulos) y constituyen polímeros de gran estabilidad estructural que participan en el mantenimiento del citoesqueleto y en la resistencia frente a tensiones mecánicas. Los filamentos intermedios tienen una serie de características morfofuncionales que los diferencian de los microtúbulos y microfilamentos: • A diferencia de los microtúbulos (constituidos por tubulina) y microfilamentos (que son polímeros de actina), los filamentos intermedios están formados por proteínas diversas que dan lugar a los diferentes grupos de filamentos. • Las proteínas que constituyen los filamentos intermedios son filamentosas y no globulares. • No presentan polaridad; es decir, no poseen extremos (+) ni (–), ni tienen una dinámica de polimerizacióndespolimerización como la de los microtúbulos o microfilamentos. • No precisan de ATP o GTP para su polimerización. • No poseen función motora, sino principalmente estructural. Se han identificado más de 50 proteínas distintas que pueden formar parte de los filamentos intermedios, las cuales se han agrupado en seis clases, dependiendo de su secuencia de aminoácidos y de su estructura proteica, así como de su expresión en diferentes tipos celulares. Algunos filamentos intermedios son específicos de las células epiteliales (citoqueratinas, pertenecientes a las clases I y II), mientras que otros se expresan en células de origen mesenquimal (como la vimentina o la desmina, incluidas en la clase III). La proteína ácida neurofibrilar glial es característica de las células gliales del sistema nervioso (perteneciente también a la clase III), mientras que otros filamentos intermedios son típicos de neuronas (neurofilamentos, clase IV). Los filamentos que componen las láminas nucleares (formados por las láminas A, B y C y presentes en casi todos los tipos celulares) constituyen la clase V y la nestina (que se expresa en el sistema nervioso en desarrollo) pertenece a la clase VI. A pesar de que existen diferencias en peso molecular y en secuencia de aminoácidos, las distintas proteínas de los filamentos intermedios poseen una organización estructural similar. Los monómeros (unidades básicas) de estos filamentos son proteínas filamentosas con un rango de peso molecular comprendido entre 40 y 210 kDa, con un largo dominio central en hélice α formado aproximadamente por 310 aminoácidos, flanqueado por un dominio NH y otro 2 COOH (fig. 12-26). Estas unidades monoméricas se asocian entre sí en sucesivos grados de complejidad hasta formar el filamento. El punto de partida es la formación de dímeros (generalmente homodímeros), con dos unidades 529 proteicas del mismo tipo enrolladas una sobre la otra a modo de cuerda, quedando sus extremos NH y COOH2– terminales en el mismo extremo. En el caso de las queratinas, en cambio, se forma un heterodímero de un filamento de tipo I y otro de tipo II (queratinas ácidas y queratinas básicas). FIGURA 12-26 Asociación de las proteínas que constituyen los filamentos intermedios. (Ilustración de: A. Calvo.) Posteriormente, dos homodímeros se asocian entre sí de modo antiparalelo (con sus extremos NH y COOH en 2 lados opuestos) y desplazados ligeramente uno del otro, dando lugar a un tetrámero. Los tetrámeros se unen entre sí por sus extremos para formar una estructura que se llama protofilamento. La unión de ocho protofilamentos es lo que constituye propiamente el filamento intermedio de 8-12 nm que puede visualizarse al microscopio electrónico. El ensamblaje y desensamblaje de los filamentos intermedios está regulado por fosforilación; así, la adición de fosfato en los filamentos de las láminas nucleares por el complejo Cdk1-ciclina B provoca la desestructuración de estos filamentos. Los filamentos intermedios forman una amplia red en el citoplasma que se extiende desde la zona perinuclear (donde son más abundantes) hacia la periferia. Estos filamentos ayudan a fijar el núcleo celular en la posición característica en la que se encuentra en cada tipo de célula. Las redes de filamentos intermedios están interconectadas con los microtúbulos, microfilamentos y proteínas de la membrana plasmática (como las integrinas) y de la membrana nuclear. Un tipo de filamento de queratina de las células epiteliales (denominado tonofilamento) se ancla a desmosomas y hemidesmosomas. La plectina es un ejemplo de proteína que se une a las integrinas presentes en los hemidesmosomas y a los filamentos intermedios, lo que permite el agarre de dichos filamentos a la membrana plasmática. La plectina se expresa abundantemente en células de epitelios (fundamentalmente en la piel) y células musculares y nerviosas. Papel de los filamentos intermedios en el diagnóstico diferencial Como se ha mencionado con anterioridad, los diferentes tipos celulares presentan una distribución característica de filamentos intermedios. Las queratinas (también llamadas citoqueratinas [CK]), típicamente expresadas en células 530 epiteliales, constituyen una familia de filamentos intermedios que incluye más de 20 miembros, cuyos pesos moleculares varían entre 40 y 70 kDa. Se clasifican en dos grandes grupos: ácidas (o de tipo I, con menor peso molecular) y básicas (de tipo II, con mayor peso molecular). Cada tipo de epitelio contiene un patrón específico de CK; por ejemplo, los epitelios simples, como el del tubo digestivo, presentan citoqueratinas de tipo 7, 8, 18 y 19. En cambio, los epitelios queratinizados, como el de la epidermis, expresan las citoqueratinas 1, 2, 4-6, 9-11 y 16. Incluso los d