Coning PCR products esp

Descargado de http://cshprotocols.cshlp.org/ en UNIV OF GUELPH el 12 de septiembre de 2012 ­ Publicado por Cold Spring
Machine Translated by Google
Harbor Laboratory Press
Estrategias para clonar productos de PCR
Pedro D'Arpa
Protocolo Cold Spring Harb de 2009; doi: 10.1101/pdb.ip68
Alertas por correo electrónico Reciba alertas por correo electrónico gratuitas cuando nuevos artículos citen este artículo; haga clic aquí.
Servicio
Asunto Explore artículos sobre temas similares de Cold Spring Harbor Protocols.
Categorías
Clonación de productos de PCR (9 artículos)
Biología molecular, general (977 artículos)
Plásmidos (104 artículos)
Reacción en cadena de la polimerasa (PCR) (61 artículos)
Reacción en cadena de la polimerasa (PCR), general (136 artículos)
Para suscribirse a los protocolos Cold Spring Harbor,
visite: http://cshprotocols.cshlp.org/subscriptions
Descargado de http://cshprotocols.cshlp.org/ en UNIV OF GUELPH el 12 de septiembre de 2012 ­ Publicado
Machine Translated by Google
por Cold Spring Harbor Laboratory Press
Panel de información
Estrategias para clonar productos de PCR
Pedro D'Arpa
INTRODUCCIÓN
La clonación de fragmentos amplificados por la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) en plásmidos ofrece varias ventajas.
Las bacterias que contienen plásmidos se pueden congelar, proporcionando un suministro listo de material amplificado. Debido
a la variedad de plásmidos disponibles con diferentes promotores y marcadores seleccionables, la clonación también es útil
cuando se van a introducir mutaciones en el fragmento antes de la expresión, o cuando se van a agregar etiquetas de secuencia
codificadas en el vector en marco. La facilidad con la que se pueden agregar secuencias de nucleótidos a los extremos de los
productos de PCR ha llevado al desarrollo de una variedad de estrategias de clonación.
Debido a que dicha clonación suele ser el primer paso para generar un reactivo que se utilizará para lograr un objetivo
experimental específico, la eficiencia del procedimiento de clonación es una consideración importante: las estrategias de
clonación deben ser simples en diseño y ejecución, y requerir un mínimo de pasos enzimáticos. .
Con este objetivo, muchas empresas comercializan y continúan desarrollando kits de reactivos que mejoran la facilidad y rapidez
de la clonación de productos de PCR. Este artículo se centra en algunas estrategias de clonación comunes y eficientes, como
aquellas que utilizan ADN ligasa o topoisomerasa I del virus vaccinia (TOPO), así como técnicas para la recombinación in vitro
e in vivo de productos y vectores de PCR que tienen extremos dúplex homólogos. También se cubre la producción de productos
de PCR lineal con elementos funcionales definidos en 5' y 3', que permiten la expresión directa de células de mamíferos o la
transcripción/traducción in vitro. Presentamos una descripción general de estas estrategias, su base molecular y sus ventajas y
desventajas para aplicaciones específicas.
INFORMACIÓN RELACIONADA
Hay protocolos específicos disponibles para la purificación de productos de PCR en preparación para la clonación (Sambrook y
Russell 2006a), la eliminación de oligonucleótidos y el exceso de dNTP del ADN amplificado mediante ultrafiltración (Sambrook
y Russell 2006b), la clonación de extremos romos de productos de PCR (Sambrook y Russell 2006c). ), clonación de productos
de PCR en vectores T (Sambrook y Russell 2006d), clonación de productos de PCR mediante la adición de sitios de restricción
a los extremos del ADN amplificado (Sambrook y Russell 2006e) e ingeniería genética con PCR (Sambrook y Russell 2006f).
Detalles técnicos adicionales están disponibles en la literatura del fabricante o en los manuales de protocolo.
La elección de la estrategia de clonación del producto de PCR depende a menudo de la aplicación posterior. Cuando se
clona con el fin de sintetizar el ácido nucleico o la proteína codificada por el producto de la PCR, el ADN debe clonarse en el
vector en la orientación adecuada con respecto al promotor. Esto normalmente se logra agregando diferentes secuencias
terminales al producto de la PCR a través de las colas del cebador. En otras aplicaciones, como la clonación directa de ADN
genómico, no se requiere la clonación direccional.
La calidad de los extremos de un producto de PCR es esencial para el éxito de su clonación. La eficacia de acoplamiento
de la síntesis de cebadores oligonucleotídicos suele ser ~98%­99% y, por lo tanto, entre 39%­63% de un oligonucleótido de 50
unidades se trunca en el extremo 5' antes de la purificación (Life Technologies 1999). Los métodos de purificación posteriores
se diferencian por su capacidad para eliminar productos truncados.
Por lo tanto, para determinadas aplicaciones, especialmente cuando se utilizan cebadores más largos, puede ser necesaria la
purificación por cromatografía líquida de alto rendimiento (HPLC) o electroforesis en gel de poliacrilamida (PAGE).
(Consulte la literatura del fabricante para determinar el nivel de pureza requerido para cada método).
Adaptado de PCR Primer, 2.ª edición (eds. Dieffenbach y Dveksler).
CSHL Press, Cold Spring Harbor, Nueva York, EE. UU., 2003.
Citar como: Protocolo Cold Spring Harb; 2009; doi:10.1101/pdb.ip68
© 2009 Prensa del laboratorio Cold Spring Harbor
www.cshprotocols.org
1
vol. 4, número 8, agosto de 2009
Descargado de http://cshprotocols.cshlp.org/ en UNIV OF GUELPH el 12 de septiembre de 2012 ­ Publicado
Machine Translated by Google
por Cold Spring Harbor Laboratory Press
CLONACIÓN DEPENDIENTE DE LIGASE
ADN ligasa
Uno de los métodos más comunes para clonar productos de PCR utiliza ADN ligasa para unir covalentemente un extremo
dúplex de ADN que tiene un 5' fosfato a un dúplex que tiene un 3' hidroxilo (OH) (p. ej., los producidos mediante escisión con
enzimas de restricción). La reacción se produce a través de un intermediario fosfo­AMP y ocurre solo cuando el 5' fosfato y el 3'
OH se yuxtaponen adecuadamente mediante pares de bases de salientes o si ambas moléculas tienen extremos romos. Sin
embargo, los productos de PCR normalmente se generan utilizando cebadores de oligonucleótidos sintéticos que carecen de
5'fosfatos. Estos productos se pueden ligar directamente en un vector que tiene fosfatos terminales 5', como en el caso de
ciertos tipos de TA y vectores de clonación de extremos romos (ver más abajo). Alternativamente, los productos de PCR que
tienen fosfatos terminales 5' (producidos mediante amplificación con cebadores quinasos o mediante tratamiento con quinasas
o escisión con enzimas de restricción del producto de PCR) se pueden ligar a vectores sin fosfatos 5' que resultan del tratamiento
con fosfatasa. El tratamiento con fosfatasa del vector se utiliza en estrategias en las que los extremos del vector son compatibles
para la ligación (por ejemplo, un vector cortado con una única enzima de restricción) para evitar la recircularización sin inserción
del producto de la PCR.
En las reacciones de clonación, la ADN ligasa debe unir ambos extremos de un producto de PCR lineal a un vector lineal
para formar una molécula recombinante circular. Como se analizó anteriormente, esto se puede lograr si el producto de la PCR,
el vector o ambos tienen fosfatos 5' terminales. Cuando tanto el inserto como el vector tienen fosfatos terminales 5', la molécula
recombinante puede ser circular cerrada; cuando sólo uno de los ADN reactivos tiene un fosfato terminal, se produce una
forma circular doblemente mellada. Ambos tipos de recombinantes transforman Escherichia coli y comúnmente se utilizan
estrategias de clonación que producen ambos tipos.
Clonación direccional de un producto de PCR que tiene terminales no compatibles
En esta estrategia, los extremos del producto de PCR tienen diferentes sitios de escisión de enzimas de restricción que se
agregan al ADN de interés a través de las colas de los cebadores de PCR oligonucleotídicos sintéticos. (Ninguno de los sitios
de restricción debe estar presente dentro de la secuencia que se va a amplificar). Después de la PCR, aproximadamente una
décima parte de la mezcla de reacción debe someterse a electroforesis en un gel de agarosa para comprobar si se ha obtenido
el tamaño esperado. Luego, el producto de la PCR generalmente se purifica a partir de la mezcla de PCR usando un kit de
membrana de sílice (p. ej., QIAquick, QIAGEN; NucleoSpin, Clontech) y luego se corta con enzimas de restricción, se purifica
en gel y se coloca en una mezcla de reacción de ligasa con un vector que tiene Extremos compatibles. Debido a que tanto el
producto de la PCR como el vector se cortan con enzimas de restricción, tanto el inserto como el vector contienen 5' fosfatos en
ambos extremos y, por lo tanto, se pueden producir recombinantes circulares cerrados.
En las ligaduras de "extremos pegajosos", los salientes se hibridan a una temperatura de ligadura de 16 °C, estabilizando la
yuxtaposición del 5' fosfato y 3' OH y proporcionando una eficiencia de ligación mejorada en comparación con la clonación de
"extremos romos".
Se prefieren las ligaduras de extremos adhesivos con un vector que tiene extremos no compatibles porque se evita la
autoligación, que puede provocar una gran cantidad de colonias erróneas. Sin embargo, existen dificultades a la hora de ejecutar
esta estrategia de forma eficaz. El corte incompleto en uno de los sitios de restricción en el vector puede dar como resultado un
vector escindido individualmente con extremos pegajosos compatibles que pueden unirse durante la reacción de ligación,
produciendo un fondo alto inaceptable de colonias sin el producto de PCR insertado. De manera similar, el corte parcial del
producto de la PCR, aunque es menos perjudicial que el corte parcial del vector, puede afectar negativamente a la eficiencia de
la clonación como resultado de una estimación errónea de la cantidad molar del inserto doblemente cortado y porque los
intermedios que consisten en un vector unido a un corte simple Los productos de PCR son callejones sin salida.
La presencia de cebadores truncados en 5' también puede dar como resultado un corte del producto de PCR en un solo
extremo, que puede ligarse al vector para producir un producto sin salida.
El corte de los productos de PCR también puede ser incompleto si los sitios de restricción están demasiado cerca de los
extremos (Zimmermann et al. 1998). Debido a que la eficiencia de escisión aumenta a medida que aumenta el número de
nucleótidos que flanquean el sitio de reconocimiento de la enzima de restricción, es útil agregar más (se requieren hasta seis)
en lugar de menos nucleótidos a los extremos de los sitios de restricción flanqueantes de un cebador de PCR y diseñar
estrategias de clonación utilizando enzimas que cortan eficientemente cerca de los extremos (ver, por ejemplo, http://
www.neb.com/nebecomm/tech_reference/restriction_enzymes/cleavage_olignucleótidos.asp). Además, es importante utilizar
cantidades suficientes de enzimas de restricción y tiempos de corte más prolongados.
Un fondo elevado de colonias equivocadas también puede deberse al arrastre del plásmido superenrollado que se utilizó
como plantilla para la PCR. Pequeñas cantidades de plantilla de PCR superenrollada pueden comigrar (y así copurificarse) con
el producto de PCR lineal. Es más probable que esto ocurra si el producto de PCR es grande o si la preparación de plásmido
contiene un nivel bajo de plásmidos eliminados (es decir, no detectables).
www.cshprotocols.org
2
Protocolos de Cold Spring Harbor
Descargado de http://cshprotocols.cshlp.org/ en UNIV OF GUELPH el 12 de septiembre de 2012 ­ Publicado
Machine Translated by Google
por Cold Spring Harbor Laboratory Press
mediante tinción con bromuro de etidio) que conservan el origen de replicación y el marcador seleccionable y, por lo
tanto, pueden transformar E. coli. Una solución a este problema es cortar la plantilla antes de realizar la PCR para
producir fragmentos que no se puedan autoligar fácilmente y que tengan extremos diferentes a los del producto de la
PCR (y, por supuesto, usar enzimas que no corten dentro del inserto). Otra forma de evitar este problema es utilizar una
plantilla que contenga un gen de resistencia a los antibióticos diferente al utilizado para seleccionar los recombinantes.
Algunos vectores tienen dos marcadores seleccionables (p. ej., pCR­Blunt II­TOPO contiene genes de resistencia a
kanamicina y zeocina). Por lo tanto, si el plásmido plantilla de PCR contiene un gen de resistencia a kanamicina, se
puede usar zeocina para seleccionar los recombinantes correctos.
Clonación dependiente de ligasa no direccional: clonación con extremos adhesivos utilizando un vector de corte único y un
Producto de PCR compatible con terminales idénticos
Cuando sólo está disponible un único sitio de restricción en un vector de clonación, normalmente se utiliza un paso
adicional, el tratamiento con fosfatasa alcalina del vector, para reducir la autoligación del vector. Aunque esta estrategia
puede tener éxito, es más propensa al fracaso. La clonación con extremos adhesivos no compatibles es el método
preferido y debe utilizarse siempre que sea posible.
Clonación no direccional dependiente de ligasa: clonación de extremos romos
Cualquier ADN con un extremo romo puede unirse a cualquier otro ADN con un extremo romo, independientemente de
la secuencia de nucleótidos, siempre que uno tenga un 5' fosfato y el otro un 3' OH. Los productos de PCR generados
con polimerasas correctoras (es decir, aquellos que tienen actividad exonucleasa 3′→5′) son en su mayoría romos (Lohff
y Cease 1992) y pueden ligarse directamente a un vector de extremos romos. Sin embargo, la clonación de extremos
romos no estabiliza la yuxtaposición del 5' fosfato con el 3' OH, como lo proporciona el recocido de salientes en la
clonación de extremos pegajosos. En comparación con la clonación con extremos adhesivos, la clonación con extremos
romos es menos eficiente y requiere concentraciones de ligasa 10 veces mayores. El potencial del vector para
autoligarse (y, por tanto, la necesidad de eliminar los grupos fosfato con fosfatasa alcalina) también reduce la eficiencia.
Se puede lograr una gran mejora en la eficiencia de la clonación de extremos romos realizando la reacción de
ligación en presencia de la enzima de restricción utilizada para linealizar el vector. En esta estrategia, los vectores
autoligados se vuelven a abrir continuamente, lo que impulsa la reacción hacia el producto deseado.
Los kits de clonación PCR­Script (Stratagene), por ejemplo, utilizan el cortador de ocho bases SrfI de corte romo. En
este sistema, ninguno de los extremos del producto de la PCR puede tener la secuencia 5′­GCCC­3' (el medio sitio de
SrfI) y el sitio de escisión de SrfI no puede estar presente dentro de la región amplificada. Stratagene ofrece vectores
con sitios de cebador de secuenciación y promotores de ARN polimerasa que flanquean el inserto, y un vector para la
expresión en mamíferos a través de un promotor de citomegalovirus.
Clonación no direccional dependiente de ligasa: clonación TA
Los productos de PCR generados con una polimerasa sin corrección de pruebas contienen protuberancias de
deoxadenosina (dA) y se pueden clonar directamente (es decir, sin pasos enzimáticos posteriores a la PCR) en
vectores que tienen protuberancias de desoxitimidina (dT). Se pueden generar vectores para este propósito cortando
dos sitios de restricción diferentes, dejando un saliente 3' dT en cada extremo del vector linealizado (las hebras
rebajadas tienen fosfatos 5') (Mead et al. 1991). Alternativamente, se puede agregar dT con una polimerasa no
correctora en presencia del desoxinucleótido trifosfato dTTP. Los vectores no pueden volver a ligarse porque dT no
puede emparejarse con dT. Hay varios vectores de clonación TA disponibles comercialmente y se suministran en forma
linealizada con salientes 3' dT. La estrategia de clonación de TA es eficiente. Los productos de la PCR carecen de
5'fosfatos y, por tanto, no se ligan entre sí. Las polimerasas sin corrección de pruebas, como Taq , generalmente
añaden un saliente de dA, aunque el nucleótido añadido depende del nucleótido anterior; las mayores eficiencias de
clonación se han obtenido utilizando cebadores de PCR con un dA 5′­terminal (Hu 1993).
Para una adición eficaz de dA salientes al producto de PCR, se recomienda un paso de extensión final de 10 min a 72
°C.
CLONACIÓN TOPÓ
En el método de clonación TOPO, se utiliza la topoisomerasa I del virus vaccinia (TOPO) en lugar de la ADN ligasa para
unir moléculas de ADN (Fig. 1; Shuman 1994). Vaccinia TOPO reconoce específicamente la secuencia dúplex 5′­(C/
T)CCTTNNN­3′ y se escinde después del 3′ dT en una hebra (ver flecha, Fig. 1B). Este intermedio escindido consta de
Tyr­274 de la topoisomerasa I (TOPO) unido covalentemente al dT mediante un enlace fosfodiéster 3' [es decir, (C/
T)CCTT­3′­TOPO], y un 5' OH libre en el otro. lado del descanso
www.cshprotocols.org
3
Protocolos de Cold Spring Harbor
Descargado de http://cshprotocols.cshlp.org/ en UNIV OF GUELPH el 12 de septiembre de 2012 ­ Publicado
Machine Translated by Google
por Cold Spring Harbor Laboratory Press
FIGURA 1. Producción de fragmentos de ADN activados
por TOPO. (A) El virus vaccinia TOPO con el OH de
Tyr­274 se muestra con un fragmento de ADN que contiene
un sitio de escisión de TOPO. (B) TOPO se escinde
después del segundo dT y se une al ADN mediante un
enlace fosfotirosilo 3', dejando un 5' OH libre en el otro
lado. (C) Cuando el sitio de escisión está ubicado cerca del
extremo 3' del ADN dúplex, el OH­5'­NNN monocatenario
se disocia y la molécula activada por TOPO puede
combinarse con un dúplex de ADN heterólogo que tiene un
extremo 5' complementario. sobresalir. (D) La reacción de
escisión puede revertirse si el 5′ OH libre ataca el enlace
fosfotirosilo, religando el ADN y liberando TOPO. (Adaptado
de Invitrogen 2002b, con permiso de Invitrogen, parte de Life Technologies © 2002.)
(OH­5′­NNN). Este 5′ OH puede atacar el enlace fosfotirosilo entre el ADN y TOPO, lo que resulta en la religación
del ADN y la liberación de TOPO (es decir, una inversión de la reacción de escisión) (Fig.
1D). Sin embargo, si el 5′­(C/T)CCTT­3′ está ubicado cerca del extremo 3′, el OH­5′­NNN monocatenario se disocia
del dúplex como resultado de un emparejamiento de bases insuficiente, dejando a TOPO unido covalentemente al
extremo 3′ del dúplex. Se dice que esta molécula de TOPO­ADN está "activada" porque es altamente susceptible al
ataque del 5′­OH de un ADN dúplex heterólogo que tiene una protuberancia 5' complementaria (Fig. 1C). Debido a
que se requiere un 5' OH libre para atacar el enlace fosfotirosilo entre el vector y TOPO, los productos de PCR que
se van a clonar deben contener 5' OH y, por lo tanto, no deben estar fosforilados; Para la PCR se deben utilizar
cebadores no fosforilados y los productos no deben estar quinasados.
Además, los fragmentos de restricción deben tratarse con fosfatasa alcalina antes de la clonación TOPO para
generar extremos 5'­OH libres.
La clonación TOPO es particularmente eficiente porque no requiere digestión de restricción posterior a la PCR
y el vector no puede circular sin un inserto. La reacción TOPO es rápida y requiere solo 5 minutos para la mayoría
de las aplicaciones. Además, no se requiere purificación en gel si se obtiene un único producto de PCR dominante,
aunque se recomienda para productos de PCR >1 kb porque la clonación TOPO es muy eficiente para fragmentos
pequeños que pueden contaminar ciertas PCR (Invitrogen 2002a). Se obtiene una mayor eficiencia mediante
estrategias de selección positivas (p. ej., pruebas azul/blanca) y negativas (p. ej., alteración del gen letal ccdB de E.
coli ) . Algunos vectores de clonación contienen dos marcadores de resistencia, de modo que se puede utilizar un
marcador distinto del marcador de la plantilla para seleccionar recombinantes. Esto puede eliminar los fondos
elevados causados por colonias que contienen el plásmido utilizado como plantilla para generar el producto de PCR.
Invitrogen produce vectores de clonación (enviados como plásmidos linealizados con TOPO unido
covalentemente a los extremos 3') que pueden usarse para clonación roma, TA y direccional. Contienen una
variedad de elementos funcionales de ADN adecuados para una amplia gama de aplicaciones. Además, los insertos
de PCR clonados con TOPO en el sistema pENTR de Invitrogen se pueden transferir mediante una reacción in vitro
de un solo paso utilizando proteínas de recombinación de fagos λ (es decir, el método Gateway) en la orientación
deseada en una gran cantidad de vectores de destino.
Clonación TOPO TA
Al igual que con los vectores TA utilizados para la clonación dependiente de ligasa, los vectores de clonación TOPO
TA tienen extremos con salientes 3' dT únicos y se usan para clonar productos de PCR que tienen un dA 3' saliente
único producido por la actividad transferasa terminal no dependiente de la plantilla de las polimerasas. como Taq,
que carecen de revisión. Tal como lo suministra Invitrogen, los extremos 3' de estos vectores están vinculados a
vaccinia TOPO. Se evita el autocierre del vector porque el dT que sobresale en 5' de un extremo no puede
emparejarse con el dT que sobresale en 3' del otro extremo, lo que impide que el OH 5' de una hebra ataque el
enlace fosfotirosilo en el otro extremo. Sin embargo, los productos de PCR con proyecciones dA pueden emparejarse
con las proyecciones dT, yuxtaponiendo los grupos 5′­OH y permitiendo que el producto ataque los enlaces
fosfotirosilo del vector (Fig. 2). Los productos de PCR amplificados con mezclas de polimerasas (Taq más una
polimerasa correctora) deben contener un exceso de 10 veces de Taq para garantizar la presencia de protuberancias
de 3′­dA en el producto de PCR (Invitrogen 2002a). Los productos de PCR amplificados únicamente con una
polimerasa de corrección carecen de estos salientes, que deben agregarse en una reacción posterior a la
amplificación utilizando la polimerasa Taq .
www.cshprotocols.org
4
Protocolos de Cold Spring Harbor
Descargado de http://cshprotocols.cshlp.org/ en UNIV OF GUELPH el 12 de septiembre de 2012 ­ Publicado
Machine Translated by Google
por Cold Spring Harbor Laboratory Press
FIGURA 2. Clonación de TOPO TA. La actividad transferasa terminal no dependiente de
la plantilla de la polimerasa Taq agrega un solo dA a los extremos 3' de los productos de
PCR. El vector de clonación lineal TOPO TA contiene residuos 3′­dT sobresalientes
y está "activado por TOPO" (es decir, TOPO se une a través de un enlace fosfotirosilo 3'),
lo que le permite ligarse eficientemente con productos de PCR que tienen un solo 3'­dA.
voladizos a ambos lados. El 5′ OH de cada extremo del producto de PCR puede atacar
el enlace fosfotirosilo entre el ADN del vector y TOPO, resultando ambos
en la liberación de moléculas TOPO y la producción de un doble mellado,
Molécula circular recombinante (no mostrada). (Reproducido de Invitrogen
2002a, con permiso de Invitrogen, parte de Life Technologies © 2002.)
Clonación de punta roma TOPO
Al igual que con la clonación convencional mediada por ligasa de fragmentos de ADN de extremos romos, la recircularización del
El vector es un problema potencial. En la clonación TOPO, el 5′ OH de cada extremo romo no está estéricamente impedido
de atacar el enlace fosfotirosilo en el otro extremo, permitiendo que el vector recircularizado carezca
el inserto que se va a producir. Para superar esto, Invitrogen ha diseñado vectores de clonación TOPO en
cuya ligadura del inserto altera el gen letal ccdB de E. coli (que es tóxico porque atrapa la girasa)
(Van Melderen 2002). Por lo tanto, las células que tienen plásmidos que se autoligan sin un inserto mueren cuando
chapado.
Clonación direccional TOPO
Los vectores de clonación TOPO para la clonación direccional tienen un extremo romo y otro con un extremo 5' de 4 pb.
protrusión (GTGG). El producto de la PCR se puede clonar direccionalmente en el vector añadiendo cuatro bases.
al cebador directo que son complementarios a la protuberancia del vector (es decir, CACC). el vector
La protuberancia invade el producto de PCR de extremos romos y se hibrida con las bases añadidas. Esto orienta el
Producto de PCR correctamente y posiciona su 5′ OH para atacar el enlace fosfotirosilo (Fig. 3). Correcto
La orientación se obtiene en >90% de los clones recombinantes (Invitrogen 2002a).
FIGURA 3. Clonación TOPO direccional. Un vector lineal (es decir, pENTR de Invitrogen) se muestra como dos moléculas de ADN
independientes unidas a TOPO: un extremo (izquierda) tiene una protuberancia 5′­GTGG; el otro extremo (derecha) es romo. La inserción
direccional del producto de la PCR se produce mediante la complementariedad entre la protuberancia del vector y las cuatro bases (CACC) añadidas.
al terminal 5′ del cebador directo del producto de PCR dúplex. La protuberancia del vector accede al producto a través de una hebra.
invasión. El recocido de estos pares de bases yuxtapone el 5′ OH en el producto de la PCR para atacar el enlace fosfotirosilo. El
El otro extremo del producto de PCR es romo y su 5′ OH no tiene impedimentos para atacar el enlace fosfotirosilo en
el lado romo del vector. (Reproducido de Invitrogen 2002a, con permiso de Invitrogen, parte de Life
Tecnologías © 2002.)
www.cshprotocols.org
5
Protocolos de Cold Spring Harbor
Descargado de http://cshprotocols.cshlp.org/ en UNIV OF GUELPH el 12 de septiembre de 2012 ­ Publicado
Machine Translated by Google
por Cold Spring Harbor Laboratory Press
PRODUCCIÓN DE CONSTRUCCIONES LINEALES CON FUNCIONALIDAD DEFINIDA 5′ Y 3′
ELEMENTOS QUE SE UTILIZAN DIRECTAMENTE PARA LA EXPRESIÓN DE CÉLULAS DE MAMÍFERO O EN
TRANSCRIPCIÓN/TRADUCCIÓN VITRO
Utilizando los sistemas TOPO Tools (Invitrogen) o TAP Express (Genlantis), se pueden producir construcciones
lineales en un solo día. En determinadas circunstancias, esto podría ser preferible a crear clones de plásmidos,
especialmente en situaciones de alto rendimiento.
Herramientas TOPO
El kit de elementos TOPO Tools PCMV/TetO 5′ (Invitrogen) permite la unión mediada por TOPO de elementos
funcionales (como promotores, etiquetas y regiones terminadoras) al ADN amplificado por PCR. Después de agregar
los elementos funcionales 5' y 3', la construcción se amplifica por PCR y el producto lineal se usa directamente para
la transcripción in vitro (sonda de ARN y antisentido) y la transcripción/traducción (análisis de proteínas).
El producto también puede transfectarse para expresión in vivo y análisis de proteínas (por ejemplo, en análisis de
interacción proteína­proteína mediante coprecipitación y sistemas de dos híbridos de mamíferos).
Para crear construcciones que tengan elementos funcionales específicos del lado 5' y del lado 3', se incorporan
diferentes secuencias de 11 pb en los cebadores para amplificar un ADN de interés (Fig. 4). Esto crea un producto
de PCR que tiene un extremo complementario a un elemento funcional adaptado a 5′­TOPO y el otro extremo
complementario a un elemento adaptado a 3′­TOPO. Las seis bases terminales de las secuencias de 11 bases 5'
de los cebadores complementan la secuencia saliente 5' del elemento funcional adaptado a TOPO, mientras que
las cinco bases internas comprenden la secuencia de reconocimiento de TOPO. La escisión de las secuencias de
reconocimiento en el producto de la PCR crea extremos con un TOPO unido a 3'­fosfotirosilo y un saliente de seis
bases en 5' complementario al saliente de un elemento funcional 5' o 3'. Por lo tanto, ambos extremos del producto
de PCR y ambos elementos funcionales tienen TOPO unido a la cadena 3' y un saliente de seis bases en la cadena
5' que termina con un OH. Cuando el saliente de 6 pb del producto de la PCR se hibrida con el saliente de 6 pb de
un elemento funcional, cada 5' OH ataca el enlace fosfotirosilo de la otra molécula. Ambas hebras del elemento
funcional se ligan a ambas hebras del producto de PCR y se liberan dos moléculas de TOPO en cada lado funcional.
Esto contrasta con la clonación TOPO estándar, en la que solo una hebra en cada lado del inserto se liga al
vector, produciendo la forma circular doblemente mellada cuando se transforma. La adición de elementos funcionales
es direccional porque se agregan diferentes secuencias de 6 nt a cada extremo del
FIGURA 4. Herramientas TOPO ( elemento PCMV/TetO 5′) para producir construcciones de ADN lineal con elementos
funcionales 5′ y 3′ definidos. (A) Se muestran los elementos funcionales 5' y 3' y el producto de PCR al que se van a agregar.
Se añaden diferentes secuencias de 11 pb (en negrita) a los extremos del producto de PCR mediante cebadores directos e
inversos. (B) TOPO escinde el producto de la PCR, creando salientes activados por TOPO (y la liberación de 6 meros
monocatenarios) complementarios a los salientes de los elementos funcionales activados por TOPO. (C) El recocido de los
salientes yuxtapone el 5′ OH de cada uno para atacar el enlace fosfotirosilo del otro, ligando ambas hebras de cada elemento
funcional a ambas hebras del producto de PCR, liberando dos moléculas TOPO y creando una plantilla recombinante lineal para directo. uso in vitro e in
(Reproducido de Invitrogen 2002b, con autorización de Invitrogen, parte de Life Technologies © 2002.)
www.cshprotocols.org
6
Protocolos de Cold Spring Harbor
Descargado de http://cshprotocols.cshlp.org/ en UNIV OF GUELPH el 12 de septiembre de 2012 ­ Publicado
Machine Translated by Google
por Cold Spring Harbor Laboratory Press
cebadores incorporados al producto de PCR. Esto tiene la ventaja de permitir que se agreguen diferentes
elementos funcionales 5' (tales como promotores) y elementos funcionales 3' (por ejemplo, epítopos, etiquetas
de purificación, secuencias de poliadenilación) a los lados apropiados del producto de PCR en una sola reacción.
Después de agregar los elementos funcionales, se usa otra ronda de PCR para producir suficiente construcción
lineal para reacciones in vitro o transfección in vivo. En general, la producción de la construcción requiere un paso
de PCR para agregar diferentes lados de 11 pb al gen de interés, una reacción TOPO para agregar
simultáneamente los elementos funcionales del lado 5' y del lado 3', y otra ronda de PCR para la amplificación.
Estos pasos se pueden realizar en menos de un día, en comparación con los varios días que a menudo se
requieren para ligar el inserto con el vector, transformar y probar las colonias para detectar los recombinantes
correctos (Invitrogen 2002b). Una ventaja importante del sistema es su adaptabilidad al análisis de alto rendimiento
de múltiples ADN de interés. Se recomienda la purificación por HPLC de los cebadores de PCR para garantizar
que sean completos.
Kit de expresión genética rápida TAP Express T7 IVT
En este sistema, se añaden un promotor y un terminador a los lados respectivos de un producto de PCR mediante
dos pasos de PCR. El primer paso amplifica el gen de interés utilizando un cebador del lado 5' con una cola
complementaria al promotor y un cebador del lado 3' con una cola complementaria al terminador. En el segundo
paso, cada cadena del producto de la primera reacción de PCR se convierte en un cebador para la extensión del
promotor o terminador. Esta reacción también incluye un cebador idéntico al extremo 5' del promotor y otro que
es complementario al extremo 3' del terminador. Estos cebadores tienen bases en el extremo 5' modificadas y se
cree que los productos de PCR lineal resultantes muestran una mejor expresión después de la transfección que
los productos de PCR que no tienen bases modificadas en 5'.
CLONACIÓN INDEPENDIENTE DE LIGASA
Uracilo ADN glicosilasa
En el método de la uracilo ADN glicosilasa (UDG) (Nisson et al. 1991; Varshney y van de Sande 1991; Rashtchian
et al. 1992), las colas de cebador específicas se sintetizan con dUMP en lugar de dTMP. Los productos de PCR
resultantes contienen residuos de dUMP en la región del cebador, que son susceptibles a la desglicosilación por
UDG, lo que hace que los residuos de dUMP sean abásicos e incapaces de formar pares de bases. Esto crea
salientes 3' en el producto de PCR que se hibridan con salientes 3' complementarios, que se han diseñado en un
vector suministrado comercialmente. La desglicosilación y la hibridación con el vector ocurren simultáneamente
en una reacción de 30 minutos, que luego se transforma en E. coli, donde se reparan las uniones inserto­vector.
La clonación direccional se logra mediante el uso de diferentes cebadores de PCR del lado 5' y del lado 3' para
crear diferentes salientes 3' en cada lado del producto de la PCR (Fig. 5). Las ventajas del sistema son la
eliminación de las tareas que requieren mucho tiempo asociadas con algunos otros sistemas para clonar
productos de PCR (digestión con endonucleasa de restricción, purificación de productos de PCR, ligación o pulido final).
La desventaja es el número limitado de vectores disponibles que utilizan este sistema de clonación.
Infusión
En el sistema In­Fusion (Clontech), el producto de la PCR se recombina con el vector linealizado de elección en
una reacción in vitro catalizada por una enzima patentada (Fig. 6). La direccionalidad de la clonación se logra
haciendo que cada lado del producto de PCR sea homólogo a cada lado del vector linealizado mediante la adición
de diferentes colas de 15 bases a cada cebador (los salientes de dA no afectan la reacción, por lo que una
lectura de prueba o una no revisión se puede utilizar polimerasa). El vector linealizado y el producto de PCR se
mezclan con la enzima patentada In­Fusion y, en una única reacción de 30 minutos, la enzima cataliza la
alineación y el desplazamiento de la cadena de los extremos homólogos del producto de PCR con el vector,
mientras que un 3 La actividad ′­exonucleasa elimina la región monocatenaria; las mellas se reparan después de
la transformación de E. coli.
Este sistema es simple, requiere solo el diseño de colas de 15 nt para cada cebador y es universalmente
aplicable a cualquier vector y cualquier sitio de restricción dentro de un vector que pueda usarse para la linealización.
No es necesario digerir el producto de la PCR con enzimas de restricción y, cuando se obtiene un único producto
predominante, se requiere una limpieza mínima. El sistema es útil cuando sólo hay un sitio de restricción
disponible para la inserción porque, no obstante, proporciona un método eficaz para la clonación direccional. Para
la clonación de expresión, no se agregan aminoácidos adicionales a la proteína expresada y se pueden agregar
etiquetas de epítopo mediante PCR. El procedimiento es especialmente útil para aplicaciones de alto rendimiento.
www.cshprotocols.org
7
Protocolos de Cold Spring Harbor
Descargado de http://cshprotocols.cshlp.org/ en UNIV OF GUELPH el 12 de septiembre de 2012 ­ Publicado
Machine Translated by Google
por Cold Spring Harbor Laboratory Press
FIGURA 5. UDG para crear salientes monocatenarios en el
producto de PCR para hibridación con salientes
complementarios en el vector; la reparación y unión covalente
de las uniones vector­inserto ocurren in vivo. El método UDG
se basa en la incorporación de residuos de dUMP en lugar
de dTMP en el extremo 5' de cada cebador de amplificación.
(A) El ADN objetivo se amplifica utilizando colas de cebador
sintetizadas con residuos de dUMP en lugar de dTMP; los
productos de PCR resultantes tienen una secuencia que
contiene dUMP en sus extremos 5'. (B) El tratamiento con
UDG del producto de PCR hace que los residuos de dUMP
sean abásicos e incapaces de formar pares de bases, lo
que produce salientes 3'. (C) Los salientes 3' monocatenarios
del producto de PCR se hibridan con salientes 3'
complementarios del vector linealizado suministrado
comercialmente (pAMP1). La creación de colas
monocatenarias en el producto de la PCR (mediante la
desglicosilación de residuos de dUMP mediante UDG) y la
hibridación del producto de la PCR con el vector se producen
en una única reacción de 30 minutos. (Reproducido de
Invitrogen 2002a, con autorización de Invitrogen, parte de Life Technologies © 2002.)
porque, una vez que se dispone de múltiples productos de PCR, todos los pasos posteriores son iguales (es decir,
no se requieren diferentes combinaciones de enzimas de restricción para cortar diferentes productos de PCR). Otra
ventaja es que los vectores linealizados están disponibles en los kits Clontech, y estos vectores están adaptados para
la transferencia directa del inserto a una variedad de otros tipos de plásmidos funcionales mediante recombinación in
vitro basada en Cre­ loxP . Aunque se requieren colas de 15 nt en los cebadores de PCR, estas son más pequeñas
que las colas de más de 25 nt requeridas para la clonación Xi (Genlantis) o la clonasa BP (Invitrogen) (ver más abajo).
Sistema de clonasa de puerta de enlace
Este sistema de recombinación específico de sitio in vitro agrega secuencias específicas direccionalmente a los
extremos 5' de los cebadores de PCR. Estas secuencias son homólogas a las secuencias del vector y la recombinación
entre el producto de la PCR y el vector está mediada por recombinasas específicas in vitro. La mezcla de enzimas
Gateway BP Clonase (Invitrogen) se basa en el sistema de recombinación específica del sitio del bacteriófago λ
(Landy 1989) y utiliza la proteína integrasa de recombinación del bacteriófago λ (Int) y la proteína codificada por E.
coli, el factor de integración del huésped (IHF ) . . Las secuencias añadidas al producto de PCR son
www.cshprotocols.org
8
Protocolos de Cold Spring Harbor
Descargado de http://cshprotocols.cshlp.org/ en UNIV OF GUELPH el 12 de septiembre de 2012 ­ Publicado
Machine Translated by Google
por Cold Spring Harbor Laboratory Press
FIGURA 6. Clonación independiente de la ligadura usando In­Fusion
(Clontech). (A) La mezcla de reacción contiene un vector de
elección linealizada mediante un corte de restricción, un producto
de PCR generado con cebadores que contienen extremos 5' de 15
pb homólogos a los extremos del vector lineal (gen), y el
enzima patentada In­Fusion. (B) La enzima cataliza
la alineación y el desplazamiento de las hebras del homólogo
extremos del producto de PCR con el vector, mientras que un 3′­
La actividad exonucleasa elimina regiones monocatenarias. (C)
Las muescas se sellan después de la transformación de E. coli.
secuencias attB de 25 pb (más cuatro G terminales); la direccionalidad es proporcionada por diferentes secuencias attB
(attB1 y attB2) agregados en los lados 5 'y 3' del producto de PCR, respectivamente (Fig. 7). (Estos attB
Las secuencias también se pueden agregar clonando el producto de PCR entre dos sitios attB en un vector mediante escisión/
ligación de restricción tradicional, o mediante clonación TOPO direccional.) Recombinación in vitro posterior de las secuencias
attB que flanquean el producto de PCR con las secuencias attP que flanquean el gen ccdB
(un marcador de selección negativa) (Bernard y Couturier 1992) en el vector "donante" provoca la escisión de
el gen ccdB y la inserción del producto de la PCR para generar un clon de “entrada”. Esta entrada recombinante
El clon está flanqueado por secuencias attL de ~ 100 pb , que resultan de la recombinación de attB con attP, y
por tanto, no se utiliza para la expresión de proteínas. En cambio, el producto de PCR original se puede transferir desde este
clon de entrada en una variedad de vectores de expresión usando otra reacción de recombinación in vitro (mediada por la
mezcla de enzimas Gateway LR Clonase) en la que el producto de PCR flanqueado por attL se recombina con
attR en el vector de expresión "destino". Esto produce un clon de expresión en el que el producto de PCR está nuevamente
flanqueado por sitios attB de 25 pb . El sistema Clonase no se ve afectado por los voladizos de 3′­dA, por lo que
Se puede utilizar una polimerasa correctora o no correctora, y la digestión con restricción
no se requieren enzimas ni ligación. La recombinación se puede lograr en tan solo 1 h. Una posible desventaja del sistema es
que el péptido codificado por la secuencia attB (8 aminoácidos) es
añadido a la proteína expresada. Sin embargo, la inserción de una secuencia de escisión de proteasa (por ejemplo, proteasa
TEV) puede permitir la eliminación de péptidos amino terminales de la proteína expresada.
RECOMBINACIÓN EN VIVO
Sistema de clonación de alta velocidad Xi­Clone
En el sistema de clonación de alta velocidad Xi­Clone (Genlantis), se genera un producto de PCR utilizando cebadores de PCR.
que tienen colas de nucleótidos de 28­32 nt de longitud que son homólogas a los extremos de un vector linealizado.
Estas dos moléculas lineales luego se transforman juntas en una recombinasa positiva patentada.
cepa de E. coli (SmartCells), donde se recombinan in vivo, produciendo un plásmido circular. Lineal
www.cshprotocols.org
9
Protocolos de Cold Spring Harbor
Descargado de http://cshprotocols.cshlp.org/ en UNIV OF GUELPH el 12 de septiembre de 2012 ­ Publicado
Machine Translated by Google
por Cold Spring Harbor Laboratory Press
FIGURA 7. Clonación de productos de PCR mediante recombinación in vitro utilizando el sistema Gateway (Invitrogen). (A) La
secuencia diana (gen) se amplifica mediante PCR con cebadores que contienen las secuencias attB de 25 pb (+ 4 G terminales). BP
Clonasa cataliza la recombinación entre los sitios attB del producto de PCR y los sitios attP del vector donante. El gen ccdB de E.
coli en el vector donante se reemplaza con el producto de la PCR para crear un clon de entrada en el que el producto de la PCR está
flanqueado por las secuencias attL creadas por la recombinación. (B) A partir de la construcción del clon de entrada, el producto de
la PCR se puede transferir a una variedad de vectores de expresión mediante recombinación in vitro con el vector de destino,
mediada por LR Clonasa (una mezcla de proteínas integrasa y escisionasa del fago λ, y E. coli­ IHF codificado), para producir un clon de expresión.
(Reproducido de Invitrogen 2002a, con autorización de Invitrogen, parte de Life Technologies © 2002.)
los vectores están disponibles comercialmente; Alternativamente, los kits de Genlantis incluyen los materiales necesarios
para adaptar cualquier vector elegido para la clonación Xi, así como instrucciones sobre el diseño de cebadores. El uso
de este sistema puede ahorrar un tiempo considerable porque no se requieren digestión ni ligadura de restricción.
Además, no se añaden aminoácidos adicionales a las proteínas expresadas. La principal desventaja de la técnica es la
necesidad de agregar más de 25 nt a los cebadores de PCR, lo que aumenta el gasto del procedimiento; Los nucleótidos
adicionales también pueden ser una fuente potencial de dificultades de amplificación.
RESUMEN Y PERSPECTIVA
La clonación de productos de PCR suele ser el primer paso para generar un reactivo para un experimento, y se han
desarrollado nuevas técnicas independientes de la ligasa para aumentar la eficiencia de este procedimiento.
Los métodos tradicionales implican la digestión de restricción del producto de la PCR y el vector para hacer que sus
extremos sean compatibles, lo que permite la producción mediada por ligasa del recombinante deseado. Estos métodos,
aunque eficaces, requieren múltiples pasos enzimáticos posteriores a la PCR y son menos aplicables a la clonación de
alto rendimiento. Además, la presencia de sitios de restricción dentro del producto de la PCR puede limitar las estrategias
que se pueden utilizar posteriormente. Sin embargo, los métodos tradicionales continúan utilizándose ampliamente por
razones históricas, porque están probados y son verdaderos y porque la mayoría de los laboratorios de biología
molecular tienen grandes inventarios de enzimas de restricción.
Debido a su eficiencia, se están adoptando cada vez más métodos más nuevos independientes de la ligasa,
incluida la clonación TOPO y la recombinación in vitro. Estos métodos son más susceptibles a la clonación de alto
rendimiento y ofrecen la capacidad de insertar el producto de la PCR en cualquier sitio de restricción de un plásmido
que pueda usarse para la linealización; la presencia de sitios de restricción dentro del producto de PCR no es limitante
porque el producto no se digiere. Lo más importante es que estos métodos pueden ser más eficientes que los métodos
tradicionales porque requieren menos pasos enzimáticos.
Los vectores activados por TOPO (Invitrogen) cuentan con topoisomerasa I de vaccinia unida covalentemente
mediante un enlace fosfotirosilo a cada extremo 3' y se utilizan para ligar productos de PCR directamente sin restricción
de digestión. La clonación de productos de PCR en vectores TOPO es muy eficaz y hay una variedad de vectores
disponibles para clonar productos de PCR que tienen extremos romos o salientes dT. También está disponible la
clonación direccional y, una vez clonado direccionalmente en el llamado vector de “entrada”, el producto de la PCR se
puede transferir eficientemente mediante recombinación in vitro a una variedad de vectores de “destino” para su expresión.
Otros métodos implican añadir extremos (15­32 pb) al producto de la PCR que se utilizan para la recombinación
independiente de la ligasa con el vector in vitro (Clontech o Invitrogen). El sistema In­Fusion (Clontech) utiliza una
enzima patentada para recombinar productos de PCR con extremos homólogos a los extremos de cualquier vector
linealizado; no es necesario añadir bases adicionales al producto de PCR más allá de la región de homología con el
vector. También hay vectores disponibles que pueden transferir productos de PCR clonados de esta manera a una
variedad de sistemas de expresión mediante reacciones de recombinación in vitro adicionales.
www.cshprotocols.org
10
Protocolos de Cold Spring Harbor
Descargado de http://cshprotocols.cshlp.org/ en UNIV OF GUELPH el 12 de septiembre de 2012 ­ Publicado
Machine Translated by Google
por Cold Spring Harbor Laboratory Press
REFERENCIAS
Bernard P, Couturier M. 1992. La destrucción celular por la proteína CcdB del plásmido F
ADN amplificado por reacción: aplicación a la clonación genómica y de ADNc. Bioquímica
implica el envenenamiento de complejos de ADN­topoisomerasa II.
anal 206: 91–97.
J Mol Biol 226: 735–745.
Sambrook J, Russell DW. 2006a. Purificación de productos de PCR en preparación para la
Hu G. 1993. Adición catalizada por ADN polimerasa de nucleótidos adicionales sin plantilla al
clonación. Protocolo Cold Spring Harb doi: 10.1101/pdb.prot3825.
extremo 3 'de un fragmento de ADN. ADN celular Biol 12: 763–770.
Sambrook J, Russell DW. 2006b. Eliminación de oligonucleótidos y exceso de dNTP del ADN
Invitrogeno. 2002a. Kits de clonación TOPO direccional pENTR (versión B, 9 de julio de 2002,
amplificado mediante ultrafiltración. Protocolo Cold Spring Harb : 10.1101/pdb.prot3826.
25­0434). Invitrogen Life Technologies, Inc, Rockville,
Sambrook J, Russell DW. 2006c. Clonación por extremos romos de productos de PCR.
MARYLAND.
Invitrogeno. 2002b. Tecnología de herramientas TOPO. Para generar construcciones
Protocolo Cold Spring Harb : 10.1101/pdb.prot3830.
funcionales que contienen sus productos de PCR y una selección de elementos
Sambrook J, Russell DW. 2006d. Clonación de productos de PCR en vectores T.
adaptados a TOPO (versión B, 072501, 25­0413). Invitrogen Life Technologies, Inc,
Protocolo Cold Spring Harb : 10.1101/pdb.prot3834.
Rockville, MD.
Sambrook J, Russell DW. 2006e. Clonación de productos de PCR mediante la adición de sitios
Landy A. 1989. Aspectos dinámicos, estructurales y regulatorios de la recombinación específica
de restricción a los extremos del ADN amplificado. Protocolo Cold Spring Harb : 10.1101/
del sitio lambda. Annu Rev Biochem 58: 913­949.
pdb.prot3835.
Sambrook J, Russell DW. 2006 y siguientes. Ingeniería genética con PCR. Protocolo Cold
Tecnologías de la vida. 1999. Consejos útiles para imprimaciones personalizadas. Enfoque 21:
69–71.
Spring Harb : 10.1101/pdb.prot3836.
Shuman S. 1994. Enfoque novedoso para la clonación molecular y la síntesis de polinucleótidos
Lohff CJ, Cese KB. 1992. La PCR que utiliza una polimerasa termoestable con actividad
utilizando la ADN topoisomerasa de vaccinia. J. Biol Chem. 269: 32678–32684.
exonucleasa de 3' a 5' genera productos romos adecuados para la clonación directa.
Ácidos nucleicos Res 20: 144.
Van Melderen L. 2002. Interacciones moleculares del veneno CcdB con su objetivo bacteriano,
Mead DA, Pey NK, Herrnstadt C, Marcil RA, Smith LM. 1991.
la ADN girasa. Int J Med Microbiol 291:
537–544.
Un método universal para la clonación directa de ácido nucleico amplificado por PCR. Bio/
Tecnología 9: 657–663.
Varshney U, van de Sande JH. 1991. Especificidades y cinética de la escisión de uracilo de
Nisson PE, Rashtchian A, Watkins PC. 1991. Clonación rápida y eficiente de productos Alu­
oligómeros de ADN que contienen uracilo mediante uracilo ADN glicosilasa de Escherichia
PCR utilizando uracilo ADN glicosilasa.
coli . Bioquímica 30: 4055–4061.
Métodos de PCR Aplicación 1: 120–123.
Zimmermann K, Schogl D, Mannhalter JW. 1998. Digestión de sitios de reconocimiento de
Rashtchian A, Buchman GW, Schuster DM, Berninger MS. 1992.
endonucleasas de restricción terminales en productos de PCR.
Clonación de la cadena de polimerasa mediada por uracilo ADN glicosilasa
www.cshprotocols.org
BioTécnicas 24: 582–584.
11
Protocolos de Cold Spring Harbor