UNIVERSIDAD DE SANTIAGO DE CHILE
FACULTAD DE QUÍMICA Y BIOLOGÍA
LABORATORIO DE BIOLOGÍA Y BIOQUÍMICA
CARRERA DE LICENCIATURA QUÍMICA
LABORATORIO 1: SEPARACIÓN DE PROTEÍNAS POR CROMATOGRAFÍA DE
EXCLUSIÓN MOLECULAR
INTRODUCCIÓN:
Para el correcto estudio de macromoléculas es esencial la eliminación de contaminantes que pueden intervenir en
la caracterización (purificación). Los contaminantes pueden ser de disRnta naturaleza a la macromolécula a
estudiar (contaminación de DNA en una muestra de proteína) o de naturaleza similar (contaminación de proteínas
en una muestra de proteína).
En el caso parRcular de las proteínas, éstas se purifican mediante procedimientos de fraccionamiento, los cuales
se basan en sus propiedades fisicoquímicas como tamaño, carga, hidrofobicidad, punto isoeléctrico y afinidad por
otras moléculas. La idea es separar progresivamente, mediante una serie de pasos independientes, la proteína de
interés de los otros componentes de la mezcla. Generalmente se uRlizan métodos cromatográficos de columna,
los que se componen de una fase estacionaria consistente en una matriz sólida porosa (celulosa, agarosa,
sepharosa, etc.) conocida como resina, que es empacada de forma uniforme en una columna. Esta resina puede
ser derivaRzada mediante la unión covalente de moléculas, lo que permite darle nuevas propiedades. Según la
derivaRzación realizada la resina puede ser uRlizada en uno de los disRntos Rpos de cromatogra]a usados en la
purificación de proteínas (Tabla 1). La proteína para purificar es introducida a la fase estacionaria en una fase móvil
que no debe interferir con los ensayos posteriores ni con el proceso de purificación. La fase móvil es usada también
para la elución de la proteína de interés y contaminantes que interaccionaron con la fase estacionaria (tener en
cuenta que la interacción con la fase estacionaria es la que determina la separación). Para eluir una proteína que
interacciona con una resina se pueden uRlizar la elución isocrá-ca o la elución en gradiente
OBJETIVO: Se espera que el alumno logre separar la proteína fosfatasa ácida de germen de trigo contenida en una
mezcla, mediante cromatogra]a de exclusión molecular (filtración en gel) en resina Sephadex G-75.
Tabla 1. Métodos cromatográficos para purificación de proteínas.*
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*Adaptado de: Jadhao M. (2015) Immobilized Metal affinity-chromatography. Techniques for protein
purificaHon according to specific properHes. Pag 2. En: hKp://www.slideshare.net/mahendrajadhao/immobilized-metalaffinitychromatography
*Adaptado de Panchal H. (2009) Protein PurificaHon. Liquid chromatography techniques advantages and disadvantages. Pag 16. En:
hKp://www.slideshare.net/swamihetal/protein-purificaHon-hjp
REFERENCIAS
Lodish H. et al. (2006) Biología Celular y Molecular. Capítulo 3: Estructura y función de las proteínas. 3.6
Purificación, detección y caracterización de las proteínas. Editorial Panamericana. 5°edición Pag 86-97.
Varcárcel M., Gómez A. (1988) Técnicas analíRcas de separación. Capítulo 17. Cromatogra]a líquida en columna
(IV). Exclusión. Editorial Reverté, Córdova, ArgenRna. Pág 573-594.
PROCEDIMIENTO EXPERIMENTAL:
Empaquetamiento de la resina:
1. Colocar lana de vidrio en el fondo de una columna de vidrio, para así evitar la pérdida de resina.
2. Mientras tanto hidratar el Sephadex G-75 en el buffer a uRlizar. Su grupo debe elegir entre Tris- HCl 50 mM pH
7,4 o buffer fosfato de sodio 50 mM pH 7,4.
3. Cierre la llave de paso y agregue buffer hasta la mitad de la columna.
4. Abra levemente la llave de paso y agregue suavemente la resina hidratada. Notará que la resina sedimentará
en el fondo de la columna. Cuide de no generar burbujas durante el empaquetamiento.
5. ConRnúe el proceso hasta generar una columna empaquetada de aproximadamente 10 cm.
6. Equilibre la columna con 10 volúmenes de columna (VC) del buffer a uRlizar.
Separación cromatográfica:
1.
De la llave de paso y deje 2-3 Cm de buffer sobre el límite de la resina.
2.
Agregue Azul Dextrano 1 mg/mL, 0,5 % del VC.
3.
Eluya isocráRcamente con buffer y calcule el volumen al cual el Azul Dextrano sale completamente de la
columna (Volumen vacío [V0]).
4.
Repita el paso 1 y agregue 2% del VC de una mezcla de Fosfatasa Ácida de germen de trigo (2 mg/mL),
Albúmina sérica de bovino (2 mg/mL) y Citocromo C (1 mg/mL). Guarde una alícuota de 50 μL de la mezcla
de proteínas.
5.
Eluya isocráRcamente y colecte fracciones de 1 mL en tubos eppendorf.
Preparación del cromatograma:
1. Mida la absorbancia a 280 y 550 nm de las fracciones colectadas, uRlizando la fase móvil como blanco.
2. Grafique Abs vs número de fracción.
3. Guarde las fracciones que consRtuyan los peaks.
MATERIALES Y REACTIVOS
• Lana de vidrio
• Columna de vidrio
• Sephadex G-75
• Tris-HCl 50mM ph7,4
• Buffer fosfato de sodio 50 mM pH 7,4
• Azul Dextrano 1mg/mL
• Fosfatasa Ácida de Gérmen de trigo 2mg/mL
• Albúmina sérica de bovino 2 mg/mL
• Citocromo C 1 mg/mL
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LABORATORIO DE BIOLOGÍA Y BIOQUÍMICA
CARRERA DE QUÍMICA
LABORATORIO 2: DETERMINACIÓN DE LA CONCENTRACIÓN DE PROTEÍNAS
POR EL MÉTODO DE BRADFORD
INTRODUCCIÓN:
Existen diversos métodos para determinar la concentración de proteínas de una muestra. Estos se basan
principalmente en absorbancia y en reacción o unión de colorantes. Todos ellos Renen pros y contras por lo cual
la elección del método de cuanRficación dependerá de la matriz en la cual estén contenidas las proteínas, de la
canRdad de muestra disponible, la sensibilidad del método, el costo, etc.
Métodos basados en absorbancia:
El método de cuanRficación de proteínas más simple se basa en la absorción de aminoácidos aromáRcos
(principalmente Trp y Tyr) a 280 nm. Sin embargo, este método no es lo suficientemente sensible para muestras
que posean baja concentración de proteínas, ya que detecta entre 20 a 3000 μg.
Además, los ácidos nucleicos son un gran interferente, dado que también absorben a 280 nm. Las proteínas
también pueden ser cuanRficadas a 205 nm dada la absorción del enlace pepudico. ¿Qué ventajas podría tener
este método comparado al de absorción a 280 nm?
Métodos basados en colorantes:
Existen muchos métodos de cuanRficación basados en colorantes, pero actualmente los más uRlizados son el
método de Bradford y el método del ácido bicisconínico (BCA). Este úlRmo se basa en el mismo principio que el
método de Biuret y Lowry, pero el Cu+ generado es quelado por el reacRvo ácido bicisconínico generando un
complejo coloreado que es medido a 562 nm. Este método es el que presenta menor número de interferentes y
es el más sensible (0,2 a 50 μg).
El método de Bradford se basa en la unión del colorante Azul de Coomassie G-250 a las proteínas. El colorante
existe en tres estados: CaRónico (Rojo), Neutro (Verde) y Aniónico (Azul). En medio ácido este se encuentra
predominantemente en estado caRónico, pero al unirse a proteínas el estado aniónico es estabilizado y detectado
a 595 nm. El colorante se une a residuos de carga posiRva, principalmente a Arg. Este método es muy sensible (1
a 50 μg) y económico, pero posee muchos interferentes como detergentes y flavonoides que desplazan el
equilibrio a la forma aniónica.
OBJETIVO: En el prácRco anterior se determinaron las fracciones que componían los peaks de proteínas, en este
prácRco se determinará la concentración de proteínas de estas fracciones mediante el método de bradford.
REFERENCIAS
Lodish H. et al. (2006) Biología Celular y Molecular. Capítulo 3: Estructura y función de las proteínas. 3.6
Purificación, detección y caracterización de las proteínas. Editorial Panamericana. 5° edición Pag 86-97.
Bradford M. M. (1976) A rapid and sensiRve method for the quanRtaRon of microgram quanRRes of protein
uRlizing the principle of protein-dye binding. Anal Biochem. 72: 248-254.
PROCEDIMIENTO EXPERIMENTAL:
Elaboración de curva de calibración: Se uRlizará una solución estándar de BSA 1 mg/mL.
1. Disponga de 10 tubos los cuales contendrán 0, 2, 4, 6, 8, 10, 20, 30, 40 y 50 μg de BSA.
2. Lleve a 50 μL de volumen final con agua desRlada.
3. Agregue 950 μL de reacRvo de Bradford 1X y mezcle con micropipeta.
4. Incube 5 min a temperatura ambiente.
5. Mida la absorbancia a 595 nm.
6. Grafique los datos (Abs vs canRdad de proteína) y calcule la ecuación de la recta del rango lineal.
CuanRficación de la concentración de proteínas de las fracciones proveniente del laboratorio 1:
1. Agregue 10 μL de cada fracción a un tubo eppendorf que conRene 40 μL de agua desRlada.
2. Agregue 950 μL de reacRvo de Bradford, mezcle e incube 5 min.
3. Mida la absorbancia a 595 nm.
4. Calcule la concentración de proteínas uRlizando la ecuación de la recta. *
* Recuerde que los valores de absorbancia obtenidos deben estar dentro del rango lineal de la curva de calibración,
de no ser así ¿Cuáles son las probables soluciones?
MATERIALES Y REACTIVOS
•
•
Stock BSA 1mg/mL
eppendorf
•
•
•
Tubos con 0, 2, 4, 6, 8, 10, 20, 30, 40 y 50 μg de BSA.
Agua DesRlada
ReacRvo de Bradford
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LABORATORIO DE BIOLOGÍA Y BIOQUÍMICA
CARRERA DE QUÍMICA
LABORATORIO 3: SEPARACIÓN ELECTROFORÉTICA DE PROTEÍNAS EN
GELES DE POLIACRILAMIDA EN CONDICIONES DESNATURANTES
INTRODUCCIÓN:
El termino electroforesis se refiere al movimiento de moléculas con carga en un campo eléctrico. Este principio es
uRlizado para separar macromoléculas como proteínas, DNA y RNA. La electroforesis es principalmente un método
analí-co más que prepara-vo, que permite visualizar el número de proteínas (asumiendo que una banda
corresponde a una proteína) y así determinar la pureza de la muestra. La electroforesis de proteínas se puede
realizar tanto en condiciones na-vas como en condiciones desnaturantes ¿Cuál es la diferencias entre ellas?. La
electroforesis de proteínas se realiza principalmente uRlizando la poliacrilamida como matriz. Este gel, al igual que
la agarosa, posee poros cuyo tamaño puede ser regulado. Estos poros permiten la separación de las moléculas en
base a su tamaño, reteniendo más el paso de las moléculas grandes comparadas a las pequeñas. Esta matriz se
genera gracias a la polimerización por radicales libres de la acrilamida y N, N’ - meRlenbisacrilamida, la cual es
iniciada por la descomposición del persulfato de amonio (genera radicales libres).
Se pueden uRlizar dos Rpos de sistemas de buffer; sistema con-nuo: El sistema completo (gel, reservorio y
muestra) conRene un solo buffer; sistema discon-nuo: El gel está separado en dos secciones las cuales poseen
disRnto pH y disRnto tamaño de poro. En este sistema se aumenta la resolución debido a un efecto de
“apilamiento” en el gel concentrador (Figura 1). InvesRgue como ocurre esto.
Figura 1. Esquema de Electroforesis.* Se observa secuencialmente la situación en (a) al principio de la
electroforesis, (b) durante el proceso de apilamiento ('stacking') y (c) durante la separación en el gel resoluRvo.
*Adaptado de: Velez A. (úlHma revisión 2017) Cursos: Lab. Fisiología Celular. Electroforesis de proteínas en geles de piliacrilamida. En:
hKp://www.uprm.edu/biology/profs/velez/poli.htm
REFERENCIAS
Lodish H. et al. (2006) Biología Celular y Molecular. Capítulo 3: Estructura y función de las proteínas. 3.6
Purificación, detección y caracterización de las proteínas. Editorial Panamericana. 5°edición Pag 86-97.
Voet D., Voet J. (2004) Bioquímica. Capítulo 6: Técnicas de purificación de proteínas y ácidos nucleicos. Sección 4:
Electroforesis. Editorial Panamericana. 3° ediciíon. Pag 152-159.
OBJETIVO: En este prácRco se evaluará el grado de pureza de las fracciones colectadas y cuanRficadas en los
prácRcos anteriores.
PROCEDIMIENTO EXPERIMENTAL:
El gel a preparar está formado por un gel separador (inferior) y un gel concentrador (superior). Para la preparación
de éstos realice las siguientes mezclas:
Preparación del Gel:
1. Prepare las siguientes soluciones, agregue el TEMED solo cuando se le sea indicado por el profesor y/o
ayudante.
Gel Separador (5 mL poliacrilamida 10%):
• H2O 1,9 mL
• 30% mezcla Acrilamida 1,7 mL
• 1,5 M Tris (pH 8,8) 1,3 mL
• 10% SDS 0,05 mL
• 10 % Persulfato de Amonio 0,05 mL
• TEMED 0,002 mL
Gel Concentrador (2 mL poliacrilamida 5%):
• H2O 1,4 mL
• 30% mezcla Acrilamida 0,33 mL
• 1,0 M Tris (pH 6,8) 0,25 mL
• 10% SDS 0,02 mL
• 10 % Persulfato de Amonio 0,02 mL
• TEMED 0,002 mL
2. Limpie los vidrios con agua y etanol según como lo indica el profesor y/o ayudante.
3. Arme el sistema según lo indicado por el profesor y/o ayudante.
4.
5.
6.
7.
8.
9.
Agregue TEMED a la solución de Gel separador y vierta entre los vidrios hasta llegar a ¾ de la capacidad.
Vierta suavemente etanol 96 % sobre la solución del gel separador.
Espere hasta que haya polimerizado.
Saque con cuidado el etanol y lave con agua desRlada.
Agregue TEMED a la solución de Gel concentrador y vierta en sobre el Gel separador.
Ponga la peineta entre los vidrios.
10. Espere hasta que haya polimerizado el Gel concentrador y reitre suavemente la peineta.
Preparación de las muestras:
Se cargarán 5 μg de las fracciones que representaRvas de los peaks de elución. Un estándar de peso molecular y
1 μg de BSA.
1. Calcule el volumen necesario para cargar en cada pocillo 5 μg de proteínas. (Para esto divida la canRdad a
agregar por la concentración, en μg/μL, de la fracción).
2. Lleve a 15 μL con agua y agregue 3 μL de buffer de carga.
3. Caliente su muestra a 90 – 100 °C por 5 min.
Separación de las muestras por electroforesis:
1. Coloque el gel en la cámara electroforéRca y agregue el buffer de corrida (25 mM Tris, 250 mM glicina, 0,1% SDS
pH 8,3).
2. Con una jeringa Hamilton o una micropipeta p20 tome la muestra y deposítela suavemente en el pocillo. Siga
las instrucciones del profesor y/o ayudante.
3. Agregue 5 μL de estándar de peso molecular.
4. Conecte la cámara y realice la electroforesis a 150 V.
5. Detenga la separación cuando el frente de migración llegado al extremo inferior del gel.
6. El gel será teñido con Azul de Coomassie en ácido acéRco y metanol.
7. El ayudante y/o profesor le enviará la fotogra]a del gel. Usted deberá calcular el peso molecular relaRvo de
todas las muestras.
MATERIALES Y REACTIVOS
•
•
•
•
•
•
•
Agua DesRlada
30% Acrilamida-Bisacrilamida
Tris pH8,8
SDS 10%
Persulfato de Amonio 10%
TEMED
Cámara de electroforesis
•
•
•
Etanol 96%
Estándar de peso molecular
BSA
•
•
•
•
•
Buffer de carga
Baño termoregulado (90-100°C)
Azul de Coomassie
Ácido acéRco
Metanol
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LABORATORIO DE BIOLOGÍA Y BIOQUÍMICA
CARRERA DE QUÍMICA
LABORATORIOS 4 : DETERMINACIÓN DE LAS PROPIEDADES CINÉTICAS DE
LA ENZIMA FOSFATASA ÁCIDA DE GÉRMEN DE TRIGO
INTRODUCCIÓN
Las enzimas son proteínas con un gran poder catalíRco y un alto grado de especificidad por su sustrato. Estas
proteínas poseen gran importancia en todos los procesos bioquímicos. Actuando en forma concertada, catalizan
cientos de reacciones que llevan, entre otros, al metabolismo de nutrientes, las conservación o transformación de
energía o la biosíntesis de macromoléculas.
La reacción más simple que pueden catalizar las enzimas es representada por la ecuación de la Figura 1.
Figura 1. Ecuación básica de reacción de enzimas*. E, S y P representan a la enzima, al sustrato y al producto
respecRvamente, mientras que ES y EP representan los complejos transitorios enzima-sustrato y enzimaproducto. *Adaptado de: Kuby S. (2000) A study of Enzymes. Vol. I Enzyme Catalysis, KineHcs, and Substrate Binding. Chapter 10: KineHcs
of the transient phase or pre-steady-state phase of enzymic reacHons. Editorial CRC, USA, Florida. Pág 377
Para caracterizar el funcionamiento de una enzima, es importante determinar el cómo las condiciones
ambientales, el pH y la temperatura afectan su capacidad catalíRca. En este prácRco se trabajará con la fosfatasa
ácida de germen de trigo, de la que se observa su acción en la Figura 2.
Figura 2. Acción de fosfatasa ácida de germen de trigo**. Se produce la hidrólisis de fosfatos monoésteres
catalizado por la enzima, provocando la libración de fosfato.**Adaptado de: Worthington®Biochemical CorporaHon. Enzyme
Manua, EnzymaHc ReacHon. Phosphatase, Acid. Product Catalog. En: www.worthingon-biochem.com
OBJETIVOS: Determinar las condiciones ópRmas de trabajo de la fosfatasa ácida de germen de trigo, así como los
parámetros cinéRcos de ésta, comparando las acRvidades específicas tanto de la enzima comercial como la
purificada en prácRcos anteriores.
En este ensayo se uRlizará un sustrato de la enzima, el p-nitrofenilfosfato (pNPP). El grado de hidrólisis de éste se
determinará espectrofotométricamente cuanRficando el p-nitrofenol liberado, que en solución alcalina, absorbe
fuertemente a 405 nm (p-nitrofenolato).
REFERENCIAS
Lodish H. et al. (2006) Biología Celular y Molecular. Capítulo3: Estructura y función de las proteínas. 3.3 Las enzimas
y el trabajo químico de las células. Editorial Panamericana. 5° edición. Pag 73-79.
Guija E., Soberón M., Haak-Mares H. (2007) Mecanismo de acción de las fosfatasas ácidas de bajo peso molecular.
An Fac Med Lima 68 (4) 356-362
Se realizará una determinación de las condiciones ópRmas para la acRvidad galacto-hidrolasa de la β-galactosidasa
y se determinarán los parámetros cinéRcos para la β-galactosidasa estudiada. Para este laboratorio se usará un
simulador
de
reacciones
enzimáRcas
disponible
en
la
siguiente
dirección
web:
hÑps://sites.google.com/site/biologydarkow/lactase-enzyme-simulaRon. En base a las indicaciones entregadas en
la guía de laboratorio, los equipos de trabajo determinarán el pH y la temperatura ópRma para la reacción
enzimáRca estudiada. Además, obtendrán VMax y KM.