ANALISIS Y RECOLECCION DE MUESTRAS-1

DETERMINACION POST-MORTEM DE COCAÍNA Y
BENZOILECGONINA EN UNA MUESTRA DE HIGADO
Presentado por
EDNA XIMENA RODRIGUEZ FLORES
PROYECTO ESTANCIA I
Ingeniería en Biotecnología
REALIZADO EN LA EMPRESA
FISCALIA GENERAL DEL ESTADO DE DURANGO
ASESOR ACADEMICO: Mtra. Maria De Lourdes Jaritas Alvarado
ASESOR EXTERNO: Q.F.B. Manuela Jaziel Bravo Diaz
GOMEZ PALACIO ,DGO
SEPTIEMBRE,2022
1
INTRODUCCION
La cocaína es una de las drogas de abuso más populares y por tanto rutinariamente
investigada en el Laboratorio de Toxicología Forense. Los cuerpos de los fallecidos por
sobredosis de cocaína generalmente no están disponibles de manera inmediata. En
muchos casos, el cadáver puede estar en un avanzado estado de descomposición,
carente o deficiente de sangre para un análisis toxicológico. Si se quiere valorar que la
defunción fue por sobredosis de cocaína, hay que tener presente que cualquier muestra
biológica es susceptible de un examen toxicológico. Por lo que, es factible contemplar
una muestra de vísceras tal como el hígado.
Es necesario implementar la técnica adecuada para realizar la investigación toxicológica
de una matriz biológica (hígado), de la cual se extraiga y determine cualitativa y
cuantitativamente cocaína y su metabolito más representativo, la benzoilecgonina.
Por lo tanto, es muy importante identificar selectivamente la presencia de esta droga y
su metabolito en una muestra tisular, donde se descompone más lentamente. El análisis
de cocaína en hígado no es tan habitual en la práctica pero su detección en ciertos casos
puede ser de gran utilidad, empleando métodos como la extracción en fase sólida y
posterior determinación por cromatografía de líquidos acoplada con masas. Shimomura
y col. 31 Han publicado estudios de detección y cuantificación de cocaína y sus
metabolitos en muestras post-mortem de fluidos y tejidos con buenos resultados. De la
misma forma se han realizado evaluaciones de los métodos de extracción, obteniéndose
resultados satisfactorios con la extracción en fase sólida.
2
INDICE
CAPITULO I . ANTECEDENTES …………………………
A. Historia de la empresa ……………………………
i.
Misión
ii.
Visión
iii.
Objetivos de la empresa ………………………..
iv.
Filosofía
6
7
8
B. Planteamiento del problema
C. Objetivo general del proyecto…………………………
9
D. Objetivos específicos
E. Propuesta de solución
F. Justificación
G. Alcance y limitaciones
H. Metodología ……………………………………………..
10
I. Narrativa por capitulo
CAPITULO II .MARCO TEORICO……………………………….
13
Toxicología ………………………………………………
14
1.1 Definición
1.2 Clasificación
1.3 Grado de Toxicidad
TOXICOLOGÍA FORENSE...………………………….……………… 17
2.1 Definición
2.2 Campo de Estudio
2.3 Tipo de Muestra
3
2.4 Recolección y Almacenamiento de Muestras
2.5 Cadena de Custodia
CAPITULO llI. DESARROLLO ……………………………………. 27
TOXICOLOGÍA DE LA COCAÍNA……………………………………. 32
4.1 Características fisicoquímicas de la cocaína
4.2 Farmacocinética de la cocaína
4.3 Metabolismo de la cocaína
4.4 Metabolismo de acción de la cocaína
4.5 Acciones farmacéutica de la cocaína…
5. ANÁLISIS DE COCAÍNA………………………………………………. 38
5.1 Características generales de técnicas de determinación
5.1.1Técnicas Cromatografícas
5.1.2 Identificación y cuantificación mediante cromatografía
6. COMPARACIÓN DE DIFERENTES MÉTODOS DE
IDENTIFICACIÓN Y CUANTIFICACIÓN DE COCAÍNA Y
BENZOÍLECGONINA
EN
UNA
MUESTRA
DE
HÍGADO
POSTMORTEM……………………………………………………………… 50
CAPITULO IV………………………………………………………………
58
Resultados………………………………………...………….….… 59
CAPITULO .V CONCLUSIONES ……………………………………63
Conclusiones………………………………………….……...…… 64
4
REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS…..………….……………… 65
5
Capitulo I.
Antecedentes
6
A. Historia de la empresa
El Ministerio Público tiene su origen en el derecho español, que preveía la existencia de
funcionarios denominados fiscales, encargados de promover justicia y perseguir a los
delincuentes. Esta figura trascendió al México Independiente y fue retomada por las
Constituciones Políticas de 1824, 1836 y 1843 en las cuales se establecía a los fiscales
como parte de los organismos judiciales encargados de la defensa de los intereses
tributarios, la persecución de los delitos y la acusación en el proceso penal, así como de
la asesoría de los tribunales, a fin de vigilar la correcta administración de justicia. Los
fiscales eran electos por el Congreso. La Constitución de 1857 conservó la figura del
fiscal y además estableció un Procurador General como integrante de la Suprema Corte
de
Justicia.
Para 1917, la Carta Magna consideró la figura del Ministerio Público de la Federación en
su artículo 102, cuyos funcionarios serían nombrados y removidos libremente por el
Titular del Ejecutivo Federal, mismos que eran presididos por un Procurador General,
quien intervenía personalmente en todos los negocios en que la Federación fuese parte;
en los casos de diplomáticos y cónsules generales y en aquéllos que se llegaren a
suscitar entre dos o más Estados, entre un Estado y la Federación o entre los poderes
de un mismo Estado. Así mismo, el Procurador General de la República tenía el carácter
de consejero jurídico del Gobierno.
i. Misión
La Fiscalía General del estado de durango es la institución de procuración de justicia
penal, independiente e imparcial, que procura el acceso a la justicia conforme a
derecho, para que se esclarezcan los hechos denunciados, mediante mecanismos
alternativos de solución de controversias o un debido proceso, y en su caso, se
declare la existencia del delito, se castigue al culpable, se realice la reparación del
daño y se proteja al inocente.
ii. Visión
Es una institución del Estado de México, autónoma, integrada por personal
7
profesional y especializado, con capacidades adecuadas para satisfacer las
demandas de procuración de justicia de la ciudadanía, tanto en la atención y
resolución de la conflictividad social, como para la investigación científica de los
delitos en un marco de respeto a los derechos humanos, y la presentación de
argumentaciones jurídicas sólidas ante los tribunales, por las que se obtengan
resoluciones judiciales que sean realmente útiles para abatir la impunidad y hacer
efectiva la protección del inocente y la reparación del daño.
iii.Objetivos de la empresa
Instrumentar los mecanismos que permitan a la Fiscalía General de justicia del
Estado de México velar por la legalidad y por el respeto a los derechos los
ciudadanos en la esfera de su competencia, para asegurar a la sociedad
mexiquense la debida protección de su integridad física y patrimonial mediante la
pronta, expedita y debida procuración e impartición de justicia.
iv. Filosofía
“Garantizar a la ciudadanía el acceso a una justicia pronta, expedita y gratuita
buscando la excelencia en los servicios que se otorgan, mediante la mejora continua
de los procesos de trabajo y la capacitación permanente de los servidores púlicos.”
B. Planteamiento del problema
Se realizó la revisión bibliográfica que abordó la problemática que presenta la
determinación de cocaína en una muestra de hígado, como alternativa a las
muestras biológicas encontradas en un probable delito como indicio en el lugar de
los hechos, como son la sangre, orina, semen, entre otras.En el lugar del hecho
normalmente se encuentra muestras de sangre y orina, pero en diversas situaciones
no siempre es obtenida en la cantidad mínima necesaria para una investigación
toxicológica.
C. Objetivo general del proyecto
8
Revisar bibliográficamente la metodología empleada para la determinación y
cuantificación de cocaína y susmetabolito benzoilecgonina en una muestra de
hígado post-mortem.
D. Objetivos específicos
•
Mostrar la metodología de extracción de cocaína y sus metabolitos en una
muestra de hígado post-mortem, con base a la revisión bibliográfica.
•
Presentar la metodología de análisis instrumental para la determinación de
cocaína y su metabolito benzoilecgonina en una muestra de hígado
postmortem, con base a la revisión bibliográfica.
E. Propuesta de solución
por ende es indispensable la sustitución de estas muestras empleando una matriz
alternativa como lo es el hígado, en la cual se podría encontrar en mayor cantidad
los diferentes tóxicos y aunado a ello se puede obtener mayor concentración para
la determinación de cocaína y sus metabolitos.
F. Justificación
La cocaína es una de las drogas de abuso más populares y por tanto rutinariamente
investigada en el Laboratorio de Toxicología Forense. Los cuerpos de los fallecidos
por sobredosis de cocaína generalmente no están disponibles de manera inmediata.
En muchos casos, el cadáver puede estar en un avanzado estado de
descomposición, carente o deficiente de sangre para un análisis toxicológico. Si se
quiere valorar que la defunción fue por sobredosis de cocaína, hay que tener
presente que cualquier muestra biológica es susceptible de un examen toxicológico.
G. Alcances y Limitaciones
En el presente trabajo se abarcaron las metodologías más comúnmente aplicadas a
la determinación en estudios forenses de drogas, como:cromatografía de líquidos
de alta resolución, cromatografía de gases así como cromatografía de gases
9
acoplada a espectrómetro de masas.
Una de sus limitaciones es que no cuenta con un liquido de alta resolucion para
realizar la cromotografia.
H.
Metodología
Actividad 1 semana (20/09) plantamiento del problema
Actividad 2 semana (27/09) Recoleccion de muestras de sangre y orina al obsiso
Actividad 3 semana (04/10) Analisis de muestra de sangre y orina
Actividad 4 semana (18/10) Analisis de la Droga
Actividad 5 semana (08/11) procedimiento analítico toxicológico
Actividad 6 semana (15/11) cromotografia fase solida
Acttividad 7 semana (21/11) Rsultados
I. NARRATIVA POR CAPITULO
Capítulo I: Antecedentes
Se dará a conocer al lector sobre el lugar donde se realizó el proyecto " fiscalia del estado
de durango”, así como el problema que se plantea en él y los objetivos por los cuales se
llevó a cabo la realización de este proyecto, contando también un poco acerca de los
antecedentes de la empresa
Capítulo II: Marco teorico
Se garantiza de donde viene la idea y el material que se necesitara para llevar a cabo
este proyecto, mostrando claramente la metodolgia utilizada en el desarrollo de la
determinación en estudios forenses de drogas .
10
Capítulo III. Desarrollo
Antes de realizar el analisis se deben seguir una serie de pasos para poder llegar a
determinar porque estaremos realizando estudios forenses de drogas , que se necesita
para ello y como es que se pone en práctica cada material y sustancia mencionada para
dar un buen resultado de los análisis a realizar.
Capítulo IV. Resultados
La solución dada a este proyecto se realizó con la ayuda de las normas vigentes que hay
y dando a su vez un buen uso del analisis de muestras al momento de incorporarlo en la
empresa, llevando a cabo varias semanas de análisis para llegar a saber dónde se
encontraba una falla y darle solución para llegar a tener un buen resultado.
Capítulo V. Conclusiones y recomendaciones
Por último se encuentran las conclusiones que se lograron durante la realización del
proyecto y dando a su vez un par de recomendaciones para futuras generaciones que
deseen continuar con algo aún más innovador.
11
Capitulo II.
Marco teorico
12
TOXICOLOGÍA
1.1. Definición
Puede ser definida como la ciencia de los venenos o de las sustancias tóxicas, sus
efectos, antídotos y detección; o bien como señala la Organización Mundial de la Salud
" disciplina que estudia los efectos nocivos de los agentes químicos y de los agentes
físicos (agentes tóxicos) en los sistemas biológicos y que establece además, la magnitud
del daño en función de la exposición de los organismos vivosa dichos agentes. Se ocupa
de la naturaleza y de los mecanismos de las lesionesy de la evaluación de los diversos
cambios biológicos producidos por los agentes nocivos", de la misma forma hay que
definir los siguientes conceptos.
Tóxico: Cualquier sustancia o elemento xenobiótico que ingerido, inhalado,aplicado,
inyectado o absorbido, es capaz por sus propiedades físicas o químicas de provocar
alteraciones orgánicas o funcionales y hasta la muerte.
Estupefaciente: Droga que actúa a nivel del SNC y además producen dependencia y
tolerancia.
Psicoactivo: Todo lo que actúe a nivel del SNC estimulándolo o deprimiéndolo.
Dependencia física: Son las manifestaciones corporales que se presentan cuando se
retira la administración de una sustancia a la que el cuerpo está acostumbrado.
1.2. Clasificación
El fenómeno de incremento en el uso de sustancias químicas para muchos propósitos, y
en lo que concierne, a la presencia de contaminantes químicos y tóxicos en el aire, agua,
alimentos y otras partes del ambiente, han motivado que esta rama del conocimiento
pueda ser clasificada o dividida en las siguientes
áreas de toxicologia:
• Clínica
• Ocupacional
• Ambiental
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• Forense
Toxicología clínica
Estudia los efectos esperados o inusuales de una droga terapéutica (medicamentos) que
se aplica en pacientes; donde se observa la condición de los mismos y el progreso que
tienen estas sustancias en el tratamiento de padecimientos o enfermedades.
Toxicología ocupacional
En la última mitad del siglo diecinueve y durante el siglo pasado, el conocimiento de los
efectos de la actividad laboral en ciertas industrias incurrieron en la manifestación de
serias enfermedades y decesos ocasionados por la exposición a químicos peligrosos y
agentes tóxicos bajo condiciones inseguras de trabajo; este es el campo de acción de la
toxicología ocupacional, cuya disciplina aborda el estudio de los efectos nocivos sobre la
salud del trabajador producidos por los contaminantes del ambiente laboral.
Toxicología ambiental
La toxicología ambiental es aquella que concierne con los efectos dañinos de las
sustancias químicas o agentes tóxicos que están presentes en el aire, agua, suelo,
alimentos u otros factores ambientales y a los cuales están expuestos tanto el hombre
como animales domésticos, peces, vida silvestre y otros elementos de la biota. Es decir
se aboca al estudio de los efectos adversos de los agentes
ambientales sobre los organismos vivos.
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Toxicología forense
Es la rama de la toxicología que estudia los métodos de investigación médico-legal en
los casos de envenenamiento y muerte.4
1.3. Grado de toxicidad
Toxicidad es la propiedad de una molécula o compuesto químico que es capaz de
producir una lesión o efecto nocivo sobre los organismos vivos. Estos dañospueden ser
causados por las circunstancias particulares de exposición. Por lo tanto una subdivisión
de la toxicidad puede ser hecha sobre la base de la duración a la exposición:
Exposición aguda
Se produce por una exposición de corta duración en el cual el agente químico o físico es
absorbido rápidamente, ya sea en una o varias dosis, en un período no mayor de 24
horas; los efectos aparecen de manera inmediata.
Exposición subaguda
Se produce ante exposiciones frecuentes o repetidas durante varios días o semanas; los
efectos aparecen en forma relativamente retardada.
Exposición crónica
Se produce con exposiciones repetidas a bajas dosis durante largo tiempo. Los efectos
se manifiestan porque el agente tóxico se acumula en el organismo, es decir, la cantidad
eliminada es menor que la absorbida; o bien, porque los efectos producidos por la
exposiciones repetidas se suman. Además la toxicidad también puede seccionarse sobre
el contexto del sitio de acción en que tiene su efecto:
Efectos locales: Refiere a la acción que toma lugar en el punto o área de contacto. El
sitio puede ser la piel, membrana mucosa de los ojos, nariz, boca, o cualquier otra parte
del sistema respiratorio o gastrointestinal.
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Efectos sistémicos: Se refiere a un sitio de acción que puede estar muy ajeno al lugar
de contacto y se asume que la absorción se ha llevado a cabo. Es decir, tras la absorción
y distribución de la sustancia tóxica, a través de la sangre, se aloja en un órgano blanco
o bien es manifiesta su acción en todo el organismo.
TOXICOLOGÍA FORENSE
Muchas sustancias toxicas no generan ninguna lesión característica, de tal manera que
si se sospecha alguna reacción tóxica, la investigación visual no sería suficiente para
llegar a una conclusión.
2.1. Definición
Es la rama de la toxicología que estudia los métodos de investigación médico-legal en
los casos de envenenamiento y muerte.
Tiene como funciones:
• Identificación de un agente lesivo
• La identificación de sustancias que produzcan una alteración psíquica pasajera o
permanente
• El determinar una intoxicación como circunstancia calificadora de un delito
• El determinar una intoxicación como delito
• El establecer una intoxicación como estado peligroso
2.2. Campo de estudio
Cuando esta área de las ciencias biológicas se emplea para esclarecer asuntos de orden
jurídico, ayudando a la aplicación de la ley, hablamos de toxicología forense. Se trata de
una disciplina donde la toxicología y la química examinan los aspectos médico-legales
de las investigaciones post-mortem a fin de esclarecer las causas y circunstancias de un
deceso.
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Como todo estudio científico se basa en la colección y posterior análisis de los datos, por
el método cartesiano, se van eliminando posibilidades hasta concluir con un agente
etiológico. Entre los instrumentos modernos de trabajo en el laboratorio forense se
incluyen el espectrofotómetro de absorción atómica y el cromatógrafo de gas
computarizado.
2.3. Tipo de muestra
Las muestras biológicas en toxicología forense incluyen sangre, orina, semen, riñón,
cerebro, hígado, bilis, contenidos gástricos, intestino, bazo, pulmón, huesos y más
recientemente cabello, uñas, saliva y sudor. También son fundamentales encasos de
agresión sexual, las muestras de contenido vaginal y/o rectal, así como las prendas
íntimas más cercanas o en contacto con estos fluidos, pues permiten situar al
sospechoso en el lugar del hecho e identificarlo, a través de la realización de diversos
estudios.
La selección apropiada, la recolección y la remisión de muestras biológicas y de otro tipo
para el análisis toxicológico son de importancia fundamental para la producción de
resultados significativos precisos, así como, para la interpretación subsecuente de los
mismos.
La estabilidad de las diferentes muestras es muy variable. Hay muestras estables, que
no requieren ningún tipo de conservación, como las uñas y los pelos, las hay más o
menos inestables, que requieren algún tipo de conservación, como el humor vítreo, la
orina o el contenido gástrico, y las hay muy inestables, que exigen una toma rápida (muy
cercana a la hora de la muerte) o métodos específicos de preservación, como la sangre
y los tejidos.
2.4. Recolección y almacenamiento de muestras Sangre.
Los análisis de sangre son los únicos que permiten extrapolar los valores
correspondientes al momento en que se recogieron las muestras, hasta el momento del
accidente o del incidente, pudiéndose así establecer una hipótesis sobre la concentración
17
de la droga en sangre en el momento que nos interesa ydeducir, como consecuencia, el
posible grado de afectación del individuo en elmomento del incidente.
Para la toma de muestra se desinfectará la piel con alcohol, excepto en el caso
dedeterminación de alcoholemia, donde se recurrirá a la solución jabonosa,
aguaoxigenada o solución de lugol. Ante la sospecha de una intoxicación de
origendesconocido se deberá recoger la muestra de sangre en dos tubos, uno de
elloscon anticoagulante (fluoruro de sodio al 1 por ciento, que también es preservador
antibacteriano) y el otro sin anticoagulante. El volumen mínimo
recomendable en cada caso será de 10 mL (tomar 20 mL de sangre con una jeringa y
dividir el contenido en ambos tubos).
Los recipientes que se envían deben ser tubos de polipropileno o similar con cierre
hermético, de tapa rosca y sellado con cinta adhesiva. Es preferible utilizar material
nuevo o virgen, para evitar contaminaciones pues muchas veces quedan restos de
medicamentos u otras sustancias que no se extraen con lavado, provocando confusiones
en el ulterior estudio analítico al obtener la muestra no debe quedar espacio vacío en el
recipiente, es decir, se debe evitar la formación de una cámara de aire, que produce
pérdidas importantes no sólo de etanol sino de cualquier otro tóxico volátil, para evitar
ésto, el recipiente debe ser llenado al ras, bien tapado y si es posible sellado.
La conservación de la muestra se hará en hielera a 4°C. Las muestras deben rotularse y
sellarse correctamente en frente de la persona sometida a examen (si se trata de
paciente vivo), con datos apropiados mínimos y legibles, que correspondan al hecho
(identificación de la víctima o imputado, juzgado o fiscalía interviniente, fecha, hora de
toma de muestra y número de causa), que no den lugar a confusión, utilizando
marcadores de tinta indeleble, iniciando inmediatamente la cadena de custodia.
Orina. Este tipo de muestra es idónea para realizar un estudio de búsqueda rápida en el
caso de no conocer el origen de la intoxicación ya que todo medicamento o droga es
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excretado en mayor o menor parte por vía renal, ya sea en forma de compuesto
inalterado o en forma de diversos metabolitos.
Generalmente, se emplea en la detección de consumo de sustancias ilícitas en
trabajadores o en casos de dopaje en el deporte. Sin embargo, un resultado positivo solo
indicará el consumo de la sustancia detectada, independientemente del nivel obtenido.
Las ventajas de esta muestra es que la concentración del analito puede ser mayor que
en sangre, además la orina está exenta de proteínas, con lo cual se tienen menos
interferencias, y es una muestra abundante, fácil de recolectar y de conservar.
Durante el proceso de recolección, algunos individuos tratan de falsificar la muestra
mediante el agregado de diferentes sustancias como por ejemplo: sales, disolventes,
sustancias enmascarantes.
Con el fin de asegurar la autenticidad de la muestra, la persona efectuará la micción ante
la presencia directa del responsable del proceso, y se evaluará el aspecto de la muestra.
También se practicarán pruebas para controles de temperatura, el pH y densidad
urinaria, que permitan detectar la adulteración de la muestra.
Se deberá recoger un volumen de orina no inferior a 30 mL, en un frasco de toma de
muestra de polipropileno o similar con cierre hermético, de tapa rosca y sellado con cinta
adhesiva, es conveniente conservarla a -20ºC, pero se acepta la refrigeración a 4ºC, si
el análisis se practica dentro de las 24 a 48 horas. Durante el proceso de recolección,
algunos individuos tratan de falsificar la muestra mediante el agregado de diferentes
sustancias como por ejemplo: sales, disolventes, sustancias enmascarantes.
Con el fin de asegurar la autenticidad de la muestra, la persona efectuará la micción ante
la presencia directa del responsable del proceso, y se evaluará el aspecto de la muestra.
También se practicarán pruebas para controles de temperatura, el pH y densidad
urinaria, quepermitan detectar la adulteración de la muestra.
Se deberá recoger un volumen de orina no inferior a 30 mL, en un frasco de toma de
muestra de polipropileno o similar con cierre hermético, de tapa rosca y sellado con cinta
adhesiva, es conveniente conservarla a -20ºC, pero se acepta la refrigeración a 4ºC, si
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el análisis se practica dentro de las 24 a 48 horas posteriores a la toma de muestra. No
agregar ninguna sustancia como conservante.
Contenido vaginal, rectal y/o bucal.
Este tipo de muestra es fundamental en casos de agresión sexual, toda vez que permiten
no solo tipificar el delito, sino también identificar al sospechoso en caso de
un resultado positivo, para la detección de espermatozoides en estos fluidos corporales,
a través de la realización de un estudio comparativo de ADN.
Este examen que tiene merito probatorio se lleva a cabo en las Unidades de Biología
Molecular y Genética. Para la toma de muestra el médico responsablerealizará un lavado
vaginal, rectal o bucal utilizando 10 mL de suero fisiológico estéril, usando para ello una
jeringa desechable de un volumen aproximado de 20 mL.
El contenido total de la jeringa obtenido después del lavado, se depositará en tubos de
polipropileno o similar con cierre hermético, de tapa rosca y sellados con cinta adhesiva.
Aunque se han utilizado torundas estériles para la realización de este procedimiento, los
resultados obtenidos son significativamente menos eficientes, por lo que se prefiere la
utilización de lavado con suero fisiológico. Las muestras así obtenidas, deberán ser
remitidas en cajas aisladas y refrigeradas, dentro de las 24 horas posteriores a la toma
de muestra.
Pelo. El análisis de pelo tradicionalmente se ha utilizado para la determinación de
metales pesados como el arsénico, el cual se deposita en la raíz y a lo largo delcabello
en la medida de su crecimiento. Posteriormente, se han realizado en estamatriz distintas
determinaciones de drogas, tales como heroína, morfina, lidocaína, además de
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contaminantes como hidrocarburos aromáticos policíclicos, y recientemente se
desarrolló un método para determinar escopolamina.
La ventaja del uso de esta matriz, es que permite la detección de las sustancias en una
muy amplia franja de tiempo si la comparamos con otras muestras biológicas, como
sangre y orina, que lo permiten en unas horas o pocos días.
Además es una muestra muy fácil de obtener, se toma aprox. 1 cm de mechón lo más
próximo al cuero cabelludo, en el caso de vello pubiano o axilar se obtiene al ras de la
piel, dicha muestra deberá ser colocada en sobre de papel a temperatura ambiente
Muestras requeridas en una toxicológica general sistemática.
Existen casos en que no hay sospechas o pistas acerca de lo que se quiere investigar
en el cadáver, por lo que debe realizarse una sistemática toxicológica
general, para lo cual es preciso remitir al laboratorio las siguientes muestras postmortem:
Un frasco bocal con estómago y su contenido, además de vómitos y lavado gástrico.
• Un frasco seco con sangre limpia (aprox. 100 mL), algunos protocolos recomiendan 10
mL como mínimo.
• Un frasco con orina (el máximo volumen posible) o en su defecto pared de la vejiga. Un
frasco bocal con aprox. 100 g de riñón, esta cantidad deberá aumentarse ante la
sospecha de intoxicación por mercurio, cadmio, manganeso, fósforo, etc.
• Un frasco bocal con aprox. 100 g de hígado y vesícula biliar, necesarios para la
investigación de tóxicos orgánicos y metálicos. Además, un frasco bocal con aprox. 500
g de cerebro especialmente indicado en intoxicaciones por disolventes orgánicos,
productos de limpieza en seco, anestésicos y plaguicidas orgánicos fosforado y
clorados.
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• Humor vítreo: todo lo que se disponga.
• Cuando se sospeche de intoxicaciones por arsénico, plomo, berilio, talio, estroncio,
uranio, y flúor deberán remitirse muestras de uñas, cabellos o huesos
2.5. Cadena de custodia
Procedimiento de control que se aplica al indicio material, ya sea vestigio, huella, medio
de comisión, objeto material o producto relacionado con el delito, desde la localización
por parte de una autoridad, policía o Agente del Ministerio Público, hasta que la autoridad
competente ordene su conclusión, según se trate de la averiguación previa o el proceso
penal.
La Cadena de custodia, juega un papel importante en el proceso penal sobre los
elementos materiales del delito y la evidencia física. Su importancia radica en que éstas
pueden probar la comisión de un delito, relacionar al sospechoso con lavíctima o con la
escena del crimen, establecer las personas asociadas con el delito, corroborar el
testimonio de una víctima, definir el modo de operación de agresor y relacionar casos
entre sí o exonerar a un inocente. Además, es más confiable y objetiva que la prueba
testimonial.
Principios de la cadena de custodia.
La cadena de custodia al iniciarse en la escena del delito en donde se descubran,
recauden o encuentren los elementos materiales probatorios y evidencia física, se rige
con los siguientes principios:
• El control de todas las etapas desde la recolección o incorporación de los elementos
materiales, evidencias y bienes incautados hasta su destino final, así como del actuar
de los responsables de la custodia de aquellos.
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• La preservación de los elementos materiales y evidencias, así como de los bienes
incautados para garantizar su inalterabilidad, evitar confusiones o daño de su estado
original, así como un indebido tratamiento o incorrectoalmacenamiento.
• La seguridad de los elementos materiales y evidencias así como de los bienes
incautados con el empleo de medios y técnicas adecuadas de custodia y
almacenamiento en ambientes idóneos, de acuerdo a su
naturaleza.
• La mínima intervención de funcionarios y personas responsables en cada uno de los
procedimientos, registrando siempre su identificación.
• La descripción detallada de las características de los elementos materiales y evidencias
además de los bienes incautados o incorporados en la investigación de un hecho
punible, del medio en el que se hallaron, de las técnicas utilizadas, de las pericias, de
las modificaciones o alteraciones que se generen en aquellos entre otros.
Dichos principios, son importantes para efecto de demostrar que los elementos
materiales
probatorios
y
la
evidencia
física
han
sido
detectados,
fijados,
recogidos,obtenidos y embalados técnicamente, observando lo prescrito por la
Constitución Política de los Estados Unidos Mexicanos, el Código Federal de
Procedimientos Penales y los Tratados Internacionales sobre derechos humanos
vigentes.
Procedimiento de la cadena de custodia
La cadena de custodia debe de ser constante en todos los procedimientos que se usan
en la técnica criminalística, en la medicina legal, en las ciencias forenses y no únicamente
unas reglas que se utilizan al explorar la escena de los homicidios, como se piensa
usualmente. En todo caso, las escenas del delito son tan diversas como la misma
tipicidad del código penal lo permite, por lo que en cada escena del delito los niveles a
adoptar son los siguientes:
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• Primer nivel: Cuando se produce un hecho delictuoso, por lo general losprimeros en
constituirse al lugar de la escena del delito son los efectivos policiales locales, los
mismos que verificarán y confirmarán la noticia criminal para que procedan a comunicar
al Ministerio Público para que seconstituya al lugar de la escena del delito
conjuntamente con efectivos especializados, y procedan a asegurar y fijar el área a ser
aislada y acordonarán el lugar utilizando una barrera física (cuerdas, cintas, etc.). A fin
de evitar la pérdida o alteración de los elementos materiales o evidencias físicas que se
puedan encontrar.
• Segundo nivel: Cuando llegan a la escena del delito, el Ministerio Público y los
efectivos especializados, solicitarán información previa de la persona que dio a conocer
el hecho y realizarán un registro cronológico de todo lo que van hacer para
proceder a la búsqueda de los elementos materiales y evidencias físicas utilizando un
método de búsqueda dependiendo de las características del lugar y circunstancias de la
escena del delito, quienes registrarán la información obtenida de todas sus actividades.
• Tercer nivel: Una vez encontrados los elementos materiales y evidencias físicas en la
escena del delito se procederá a perennizarlo antes, durante y después de recolectar,
embalar, rotular y etiquetar por medio de fotografía, video o topográficamente de forma
adecuada clasificándolo de acuerdo a su clase, naturaleza y estado, observando las
condiciones de bioseguridad y protección como por ejemplo uso de guantes, tapabocas,
gorros, gafas, caretas y equipos, entre otros, según la naturaleza del elemento material
o evidencia física que se hayan encontrado o aportado, pero observando las
condiciones de preservación y seguridad que garanticen la integridad, continuidad,
autenticidad, identidad y registro, de acuerdo a su clase y naturaleza.
• Cuarto nivel: Una vez obtenidos los elementos materiales y evidencias físicas el
Ministerio Público determinará la remisión a los correspondientes laboratorios para que
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sea analizado en los laboratorios criminalísticos, quienes realizarán los estudios o
análisis solicitados y emitirán el informe pericial, pero en caso que no requiera de
análisis o estudio inmediato se procederá a enviarlo al almacén de evidencias, pero en
uno u otro caso se deberá prever para que quede un remanente con la finalidad de que
en el futuro puedan constatar ciertos análisis o estudios sobre dichos elementos
materiales o evidencias físicas y todo personal que se encuentre en contacto con los
elementos materiales y evidencias físicas deberá de señalar en el formato de cadena
de custodia el lugar, la fecha y la hora.
Este procedimiento se sigue debido a que este sistema de cadena de custodia, debe
nacer a la luz del proceso penal en sus diferentes fases, y quedar establecidas a las
pautas que deberán seguir las personas que reglamenten, desarrollen, apliquen y
controlen el sistema de cadena de custodia.
25
Capitulo III.
Desarrollo
26
DROGAS DE ABUSO
3.1. Definiciones
• Droga
1. Los términos drug (en inglés) y drogue (en francés) se utilizan indistintamente para
definir fármacos de prescripción como sustancias psicoactivas sin utilidad
terapéutica. Según la Organización Mundial de la Salud, droga es “toda sustancia
que, introducida en un organismo vivo, pueda modificar una o varias de sus
funciones” (OMS, 1969). Esta definición es poco útil e inexacta, ya que engloba
fármacos de prescripción, sustancia psicoactiva, muchas plantas, sustancias
químicas o tóxicas para el organismo.
2. Toda sustancia que, introducida en el organismo por cualquier vía de
administración, produce una alteración de algún modo, del natural funcionamiento
del sistema nervioso central del individuo, alteraciones de conducta, y es además,
susceptible de crear dependencia.
3. Toda aquella sustancia que produce dependencia y que se emplean
voluntariamente para provocarse determinadas sensaciones o estados síquicos no
justificados terapéuticamente.
4. En farmacología, una droga es toda materia prima de origen biológico que directa
o indirectamente sirve para la elaboración de medicamentos, y se llama principio
activo a la sustancia responsable de la actividad farmacológica de la droga. Puede
ser todo vegetal o animal entero, órgano o parte del mismo, o producto obtenido
de ellos por diversos métodos que poseen una composición química o sustancias
químicas que proporcionan una acción farmacológica útil en terapéutica.
5. El término droga de abuso define mejor lo que coloquialmente entendemos como
droga: “sustancia de uso no médico con efectos psicoactivos (capaz de producir
cambios en la percepción, el estado de ánimo, la conciencia y el comportamiento)
y susceptibles de ser auto administradas”.
27
3.2. Clasificación
Las drogas se pueden clasificar en legales e ilegales; entre las primeras se incluyen
alcohol, tabaco (con algunas restricciones legales), los fármacos de prescripción
médica, ciertos disolventes de uso doméstico o industrial; y el resto de ellas son
ilegales.
Existen varias clasificaciones de las sustancias adictivas de acuerdo a su estructura
y propiedad química y a los efectos que producen en el SNC. De éstas existen varias
versiones; una clasificación de utilidad práctica es la de NIDA. Clasificado por el
efecto estimulante o depresor.
Los depresores (Tabla 1) (alcohol, sedantes, narcóticos y ansiolíticos,
cannabis, así como disolventes volátiles) reprimen todas las estructuras
presinápticas neuronales con la consecuente disminución de la cantidad de
neurotransmisor liberado por el impulso nervioso, lo cual produce además una
disminución de la función de los respectivos receptores postsinápticos. El
alcohol al igual que otros depresores como los barbitúricos y las
benzodiazepinas producen una estimulaciónde la transmisión inhibitoria.
28
El grupo de los narcóticos incluye al opio, morfina, heroína, meperidina,
codeína, difenoxilato, fentanilo, nalbufina, propoxifeno y la metadona.
Los estimulantes o simpaticomiméticos (Tabla 2) (cocaína, amfetaminas y
metamfetaminas, alucinógenos, y estimulantes menores donde se clasifica a
las xantinas) ejercen un bloqueo sobre la inhibición o una excitación de las
neuronas en forma directa. Sus mecanismos de acción son variados y pueden
explicarse
por afectación
fisiológica;
por
ejemplo,
aumento
de
la
despolarización neuronal, incremento de la cantidad de neurotransmisores
disponibles, alargamiento de la acción de los neurotransmisores, debilitamiento
de la membrana neuronal o reducción del tiempo de recuperación sináptica.
29
TOXICOLOGÍA DE LA COCAÍNA
4.1
Características fisicoquímicas de la cocaína
Características del analito
•
Nombres comunes: Coca, escamas, nieve, polvo blanco, pase, C, niña
blanca, polvo feliz, oro en polvo, terrón de azúcar, blow, candy.
•
Nombre (IUPAC) sistemático:(1R,2R,3S,5S)-3-(benzoiloxi)-8-metil-8-
azabiciclo[3.2.1]octano-2-carboxilato de metilo.
•
Estructura
30
•
Fórmula condensada: C17H21NO4
•
Peso mol: 303.35 g/mol
•
Propiedades fisicoquímicas
•
Cristales incoloros o blancos o polvo blanco
•
Punto de fusión: 98.0 °C
•
Solubilidad: 1 g en 600 mL de agua, 1 g en 270 mL de agua a 80°C, 1 g en
6.5 mL de etanol, 1 g en 0.7 mL de cloroformo y 1 g en 3.5 mL de éter también poco
soluble en acetona, acetato de etilo y disulfuro de carbono.
•
Constante de disociación: pKa 8.6
•
Coeficiente de partición: Log P (octanol/agua), 2.3.
4.1 Farmacocinética de la cocaína
La cocaína (COC) es una base débil con un pKa de 8.6. En su forma básica,
tanto en sangre como en el humo del tabaco que llega a los pulmones, la
cocaína atraviesa las membranas celulares de forma rápida y eficaz.
Atraviesa la barrera hematoencefálica: esnifada o administrada por vía
intravenosase encuentran niveles de cocaína en el cerebro en 30 segundos,
31
mientras que fumada sólo tarda 5 segundos en tener efectos centrales.
Absorción: La cantidad relativa de cocaína que se absorbe a nivel sistémico
depende fundamentalmente de la vía de administración.
El pico plasmático se produce normalmente a los 60 minutos después de la
administración nasal u oral; aunque como en otros parámetros de la cinética
de la cocaína, la variabilidad individual es muy grande, con intervalos de 30 a
120 minutos. La biodisponibilidad nasal u oral es de un 30-40 por ciento,
aunque la variabilidad es mayor para la vía oral.
Al igual que ocurre con la nicotina del tabaco, la biodisponibilidad de la cocaína
fumada varía entre un 10 a 20 por ciento, siendo el porcentaje menor la más
común.
Las concentraciones máximas venosas y arteriales después de las diferentes
administraciones varían enormemente. No sólo depende de las dosis y de las
vías de administración sino también de la frecuencia de las inyecciones. El
rango de lasdosis de cocaína normalmente varían entre 0.2 a 3 o 4 mg/Kg,
dependiendo de la vía de administración, sin embargo las concentraciones
plasmáticas máximas varían en un rango entre 50 a 2000 ng/mL o mayor
dependiendo de la vía de administración y de la frecuencia de las inyecciones.
Distribución: La cocaína después de ser administrada, es distribuida
ampliamente por todo el organismo. El volumen de distribución varía entre 1.5
a 2 L/Kg (57 por ciento vía oral y aproximadamente 70 por ciento fumada).
4.2 Metabolismo de la cocaína
La cocaína es rápidamente metabolizada, generalmente por hidrólisis
enzimática para producir benzoilecgonina (BZ), Ester metílico de la ecgonina
(EME) y posteriormente ecgonina (EC) (Figura 1).
En un 1-5% se excreta por la orina sin cambios
32
La hidrólisis a benzoilecgonina se produce en un 45 por ciento, de una dosis
administrada esta hidrólisis se realiza por las Hidrolasas hepáticas; porcentaje
similar a la hidrólisis del EME. Ninguno de los dos metabolitos poseen actividad
biológica significativa en humanos. El nitroxido de norcocaína y otros radicales
libresson metabolitos potencialmente activos, pero se producen en pequeñas
cantidadesque generalmente no representan cantidades farmacológicamente
significativas enclínica humana
. Cuando la cocaína se fuma, la droga se piroliza a una serie de compuestos
químicos dependiendo de la temperatura. El principal metabolito es la
Metilecgonidina (MED).
La benzoilecgonina es el metabolito que se detecta en orina, y el más utilizado
para monitorizar las intoxicaciones. Puede ser detectada en orina 3-4 días
después del último consumo y por supuesto dependerá de la cantidad de
cocaína consumida y del valor de corte que se establezca o de la sensibilidad
de la prueba.
La vía de administración también influye en la cantidad de BZ que se detecta
en plasma y que se eliminará a través de la orina. En general, se puede decir
que las
33
máximas concentraciones y la mayor área bajo la curva se produce después
de administraciones nasales u orales. Cuando la cocaína se fuma, aunque los
efectos que se producen son mucho más intensos y precoces, la cantidad
absorbida es menor y por tanto las concentraciones de BZ en plasma son
también menores, estose puede observar en la (Figura 2), donde se observa
gráficamente este comportamiento.
Figura 2. Niveles plasmáticos de benzoilecgonina, dependientes de la
vía deadministración.
Eliminación: El aclaramiento de la cocaína es muy rápido, variando entre 20 a
30 mL/min/Kg. La semivida plasmática es, de nuevo, variable con intervalos de
1 a 1.5 horas. La benzoilecgonina presenta una semivida plasmática de 6-8
horas y el Estermetílico de Ecgonina de 3-8 horas.
4.3 Mecanismo de acción de la cocaína
La cocaína se comporta como una amina simpaticomimética de acción
indirecta, esdecir, es capaz de remedar las acciones de las catecolaminas no
actuando directamente sobre los receptores adrenérgicos o dopaminérgicos,
sino aumentando la disponibilidad del neurotransmisor en la hendidura
34
sináptica
La cocaína es un inhibidor de los procesos de recaptación tipo I (recaptación
de noradrenalina y dopamina desde el intersticio sináptico a la terminal
presináptica) (Figura 3); lo que facilita la acumulación de noradrenalina o
dopamina en la hendidura sináptica.
Al aumentar la disponibilidad de dopamina se produce un aumento de euforia.
Si el consumo de cocaína se hace crónico se producirán cambios en la
disponibilidad dedopamina. El transportador de la recaptación de dopamina es
necesario para que se produzca la acción farmacológica de la cocaína ya que
al hacerse estudios en ratones deficientes en este transportador la cocaína no
ejerce efectos conductualesni bioquímicos
. El exceso de noradrenalina es el responsable de la mayoría de los efectos y
complicaciones agudas de la cocaína como pueden ser el aumento de la
presión arterial, dilatación pupilar, sudoración, etc.
Además la cocaína bloquea la recaptación de serotonina. Estos efectos sobre
la neurotransmisión catecolaminérgica y serotoninérigica constituyen la base
de su dependencia.
35
• Elevación del estado de ánimo
• Disminución de apetito y sensación de fatiga
• Insomnio
• Hiperactividad motora y verbal.
ANÁLISIS DE COCAÍNA
5.1 Características generales de técnicas de determinación
El procedimiento analítico toxicológico incluye usualmente dos pasos.
El primero consiste en realizar un análisis preliminar que permite identificar las
muestras negativas, que no contienen el analito o alguno de sus metabolitos
de las drogas u otros tóxicos que pudieran estar presentes en la muestra
(pruebas de screening conocidas como pruebas rápidas). El segundo paso
involucra la confirmación de la identidad de las sustancias presentes en las
muestras positivas.
Las pruebas rápidas proveen sólo resultados preliminares y tienen
poder dedecisión. Indican claramente la ausencia de una droga, es decir, no
informan falsos negativos. Sin embargo, un resultado positivo debe ser
confirmado por otro método específico. Siempre debe realizarse al mismo
tiempo que se analiza la muestra un control positivo y uno negativo.
Un control negativo (blanco) ayuda a evitar los falsos positivos (por
ejemplo contaminación con reactivos o material de vidrio con el analito en
cuestión o la presencia de componentes de la muestra). Igualmente, la
inclusión de un control positivo sirve para asegurar que los reactivos han sido
preparados en forma correctay han mantenido su estabilidad.
Un resultado sospechoso falso positivo debe ser repetido usando
material de vidrio correctamente lavado y enjuagado finalmente con agua
bidestilada. En toda circunstancia los ensayos de comprobación deben
realizarse sobre una nueva alícuota de la muestra, lo cual implica que en el
36
momento de decidir que ensayos van a realizarse debe considerarse reservar
un volumen adecuado para confirmar el resultado.
La mayoría de estos tóxicos sufren profundos cambios metabólicos en
el organismo y en consecuencia, pueden aparecer en los fluidos o tejidos en su
formaoriginal o como productos de biotransformación (metabolitos), libres o
conjugados
con
diferentes
compuestos
(ácido
glucurónico,
sulfatos,
aminoácidos, etc.). Las propiedades fisicoquímicas del tóxico y sus metabolitos
pueden ser muy distintas, aveces incluso entre los metabolitos de un mismo
compuesto. Ello determina una excreción característica según los casos y la
conveniencia de realizar la investigación en una u otra matriz (orina, sangre,
bilis, etc.).
Frecuentemente, el compuesto que será analizado está presente en un
tejidoo un fluido biológico, unido a proteínas u otros constituyentes celulares.
En este caso, puede ser necesario separar el tóxico (el compuesto madre o sus
metabolitos)del resto de los componentes de la matriz, a modo de obtenerlo en
cantidad y pureza suficientes para permitir su identificación y cuantificación,
utilizando diferentes métodos de análisis (Figura 4)
37
5.1.1 Técnicas Cromatografícas
La búsqueda de drogas en Toxicología mediante técnicas cromatografícas, como
CCD, CCDAR, CL, CLAR y CG, etc. se caracterizan porque antes de aplicarlas es
necesario separar las drogas de la matriz en la que se encuentran inmersas
mediante alguna técnica de extracción. En la práctica esto se logra siguiendo una
serie de pasos, como los que se describen a continuación.
1-
Preparación de la muestra: es un paso crucial en los análisis. Involucra la
homogenización de la muestra, ajustes de pH, pesaje, procedimientos de hidrólisis
(ácida, básica o enzimática), precipitación, centrifugación, etc. de modo tal que se
facilite el aislamiento de la sustancia de interés.
2-
Aislamiento del analito: se puede llevar a cabo mediante extracción líquido-
líquido (en tubos, en ampollas de decantación) o extracción en fase sólida (CEFS)
de acuerdo a las disponibilidades dellaboratorio. En este paso se remueve el
analito de su matriz original para obtenerlo en la mayor concentración posible,
estabilizarlo (ya que en su matriz original puede degradarse química o
enzimáticamente) y eliminar interferencias.
3-
Concentración del extracto: el objetivo de este paso es colocar el analito en
el menor volumen posible para aumentar la sensibilidad del análisis. Se deben
usar condiciones controladas, idealmente una temperatura menor de
40ºC y corriente de nitrógeno. Durante las operaciones antes
mencionadas se debe tener sumo cuidado para evitar pérdidas por
volatilización, oxidación o absorción en los precipitados, ya que
frecuentemente los productos a identificar están presentes en
concentraciones menores del µ/mL. Las pérdidas por volatilización de
sustancias básicas como amfetaminas puede prevenirse cuidando la
temperatura y salificando el extracto con ácido clorhídrico al 1 por ciento
en metanol.
38
1- Identificación del analito: existen diferentes niveles de complejidad
dependiendo de las técnicas que se utilicen para su identificación. Así
existe un nivel primario de pruebas rápidas que utiliza técnicas como
CCD, Espectrofotometría UV, inmunoensayos, además de reacciones
de coloración para la orientación, etc. Un nivel secundario involucra
técnicas tales como CG y CLAR, como para la determinación de una
droga en particular y un nivel terciario que utiliza la CG/MS o CLAR/MS.
2- 5- Cuantificación del analito: una vez identificado el analito la
cuantificacióndel mismo se puede realizar por una técnica directa, bien
ajustada y utilizando patrones de referencia puros para el análisis. Esta
técnica directa generalmente es espectrometría demasas acoplada a
una técnica de cromatografía de gas-líquido o líquido-líquido.
5.1.2 Identificación y cuantificación mediante cromatografía
Según la IUPAC, la cromatografía es un método usado para la separación de
los componentes de una muestra, mediante su distribución en dos fases:
estacionaria (FE) y móvil (FM). La fase estacionaria puede ser un sólido o un
líquido retenido sobre un soporte sólido. La fase móvil puede ser un gas o
líquido (o un fluido supercrítico). Con base a la FM los sistemas
cromatográficos se dividen en
: • de Fase Gaseosa, internacionalmente CG y
• de Fase Líquida, denominados CL
El principio común a todas ellas es el siguiente: un fluido FM circula a través
de la fase estacionaria y cuando una mezcla de sustancias se introduce en el
sistema seproduce una serie de equilibrios de distribución entre las dos fases,
generalmente de distinta magnitud para cada componente de la mezcla, por lo
que cada uno de ellos se desplazará con diferente velocidad (dependiendo de
39
sus solubilidades, valores de pKa, capacidad de formar puentes de hidrógeno,
etc.) a lo largo del sistema. La cromatografía en fase líquida puede llevarse a
cabo en columna, donde la mezcla a separar se desplaza en una dirección
preferencial sobre las otras dos obien, puede tratarse de una técnica planar,
cuando dicho movimiento se realiza sobre un plano donde prevalecen dos
direcciones sobre la tercera. De este modo la
CLAR es un procedimiento en columna, mientras que las técnicas de CCD o
CCDAR, son procedimientos planares.
Cromatografía en capa delgada (CCD)
La CCD es una de las técnicas más ampliamente usadas para la separación
e identificación de drogas. Permite en ciertos casos también, determinar
semicuantitativamente los compuestos de una muestra. Se trata de un
procedimiento no destructivo de los componentes a investigar, accesible a la
mayoría de los laboratorios por su simplicidad y bajo costo. Las muestras a 46
investigar pueden consistir en soluciones, sólidos disueltos o extractos
obtenidos enlos procedimientos de aislamiento. La técnica de CCD involucra
diferentes pasos, denominados: preparación de la placa, aplicación de la
muestra, corrida de la placa y ubicación de las manchas. Aunque pueden
prepararse en el laboratorio, en la actualidad se usan placas comerciales. Las
FE están constituidas por partículas irregulares con poros en su interior. Estos
rellenos se extienden uniformemente en una capa delgada de 250 µm (las más
usadas), 200 µm, 150 µm o 100 µm sobre un soporte de vidrio de 2 mm, sobre
un folio de aluminio de 0.2 mm o sobre un folio de poliéster de 0.5 mm de
espesor. Las placas suelen tener un tamaño de 20 cm x 20 cm pudiendo
cortarse del tamaño elegido (particularmente los folios con una tijera). Existen
varios tipos de FE que se diferencian en su porosidad, espesor, granulometría.
Se describen a continuación las más utilizadas.
Gel de silice: se trata de ácido silícico hidratado y por lo tanto débilmente
ácido. Las placas tienen una distribución uniforme de tamaño de partícula,
40
normalmente de 20 µm de diámetro. La adherencia a la placa se logra
mezclando un agente de unión con la FE. Cuando se usa sulfato de calcio (yeso)
como “adhesivo”, las placasse denominan Gel de sílice. Las placas más fuertes
usan un adherente orgánico. Las placas pueden almacenarse una sobre otra
ya que la capa adsorbente es muydura.
• Alúmina: (óxido de aluminio). Es un adsorbente débilmente básico. Tiene
menosaplicaciones que el gel de sílice y necesita ser activado para obtener
buenas separaciones.
• Kieselgur: se trata de ácido silícico amorfo existente en la Naturaleza.
Proviene de los esqueletos de diatomeas (algas microscópicas) y por ello se
denomina frecuentemente “tierra de diatomeas”. Posee menos propiedades
adsortivas que lasílica.
• Celulosa: usa procesos de partición para la separación. Las placas de
celulosa generalmente corren mucho más lentamente que las placas de sílica
del mismo espesor. Para procedimientos de adsorción, las capas deben tener
la mayor actividad posible en los poros. Para ello se someten placas y folios en
el momento de su fabricación, a la acción de unos 110ºC en estufas secadoras
continuas, desalojando de este modo humedad, gases y contaminantes
orgánicos. Para
procedimientos de partición en cambio, las capas se inactivan química o
físicamente en
sus
poros,
impregnándolas
con
diferentes
reactivos
hidrofobizantes. Los componentes se separarán de acuerdo a su solubilidad
en los hidrofobizantes anclados.
• Cromatografía en capa fina bidimensional
Si fuera necesario separar varios componentes de una mezcla de polaridad
muy distinta resulta difícil elegir una FM adecuada, que permita una buena
resolución detodos los componentes. Por ejemplo, dados los compuestos A, B,
C y D, tras la corrida con una FM de baja polaridad puede suceder que A y B
41
presenten un Rf muy próximos. Mientras que C y D presenten Rf muy bien
definidos. Si se eligiera como FM un disolvente más polar se logrará la
separación de A y B pero probablemente C y D corran próximos al frente del
disolvente. Una solución sería cambiar la fase estacionaria (emplear celulosa,
por ejemplo). O bien, se puede recurrir a una cromatografía bidimensional. En
este caso la placa es eluida en una FM de baja polaridad, de modo que se
separen C y D. Luego se seca la placa y se cambia el disolvente (mayor
polaridad) pero también la dirección de elución (giro de90º).
• Ventaja: se amplía el campo de polaridades.
• Desventajas: sólo se siembra una muestra por placa y se requiere el doble
de tiempo porque son 2 corridas. (la segunda más lenta que la primera por la
mayor polaridad del disolvente que será retenido en los poros).
En la práctica, se suele llevar a cabo este tipo de CCD para la separación de
Aflatoxinas (micotoxinas producidas por hongos del género Aspergillus),
aprovechando el sencillo revelado mediante luz UV después de cada corrida.
• Cromatografía en Capa Delgada de Alta Resolución (CCDAR)
En comparación con las placas de gel de silice de CCD, las placas de CCDAR
tienenpartículas mucho más pequeñas y distribuidas en un estrecho rango de
tamaño (27 µm). Además el espesor de la capa es más delgado (190 µm). Estas
características hacen que las corridas en CCDAR sean más rápidas y más
reproducibles. Además permiten obtener una mayor resolución y una
disminución del límite de detección. Son especialmente útiles para los trabajos
de cuantificación.
Las dos cromatografías tanto CCD como CCDAR tiene sus ventajas en su
empleo.A continuación se presentan las diferencias entre estas dos técnicas
(Tabla 3).
42
• Cromatografía Gases (CG)
La cromatografía gaseosa permite no sólo separar, sino también identificar y
cuantificar cada uno de los componentes de una muestra, debido al riguroso
control a que se somete cada una de las variables que intervienen en el
proceso. En este sistema la fase móvil es un gas (gas acarreador o portador)
pudiendo ser su fase estacionaria un sólido o un líquido adsorbidos sobre un
soporte inerte que no seanvolátiles a la temperatura de trabajo.
Presenta como requisitos que las sustancias a analizar (gases, líquidos o
sólidos) sean volátiles a la temperatura de trabajo (o puedan prepararse sus
derivados volátiles mediante el uso de reactivos “derivatizantes” adecuados),
que no se descompongan a altas temperaturas y posean bajo peso molecular.
En caso que la sustancia o molécula a analizar no sea volátil se preparan
derivadosvolátiles empleando reactivos que en el cromatógrafo la muestra se
vaporicé en el inyector que está a temperatura elevada, donde una corriente de
gas portador inertey de alta pureza lo arrastra por la columna. Allí tiene lugar el
proceso de separaciónbajo condiciones controladas de temperatura para luego
pasar por un detector, cuyaeñal es registrada en un cromatograma. (Figura 6)
43
Como se observa en el esquema anterior los cromatógrafos
gaseososcontienen esencialmente:
1. Una fuente de gas comprimido: proporciona la FM (gas portador o
gasacarreador) cuya finalidad es arrastrar los componentes volátiles de la
muestra.Los gases más usados son: hidrógeno, helio, nitrógeno y argón.
2. Un regulador de presión o flujo del gas portador: cuya función
es mantener constante el flujo del mismo durante todo el proceso para
obtenerresultados reproducibles.
3. Un Inyector: es un dispositivo que permite la introducción de la
muestra en la corriente del gas portador y transformarla rápida y
uniformemente al estado gaseoso. Existe cierta variedad de diseño según el
tipo de muestra que se trata de analizar. El más común es el inyector de
líquidos, que puede utilizarse para sólidos (en disolución) y gases (mediante
jeringas especiales). Se trata de una cámara situada a la entrada de la columna
y calentada independientemente de ésta (a temperatura superior al punto
deebullición del componente menos volátil de la muestra); suele tener una
membrana de caucho a través de la cual se introduce la muestra, con la ayuda
44
de una microjeringa hipodérmica.
1. Una Columna Cromatográfica: es un tubo de vidrio o metal (acero inoxidable,
cobre, aluminio, etc.) cuya longitud oscila entre 1 y 200 m, su diámetro interior
puede ser desde 0.1 a 50 mm, según el tipo de columna. La separación dela
mezcla se realiza en ella, siendo por tanto, la parte más importante del equipo.
Actualmente se pueden utilizar tres tipos de columnas: empacadas,
intermedias y capilares. En términos generales las columnas empacadas
tienen 2- 4 m por 1/4 a 1/8 pulgada de diámetro interno. Pueden ser de vidrio
o metálicas. Las columnas capilares tienen un diámetro interno menor de 1
mm y una longitud de 2 a 100 m. Pueden ser de acero inoxidable, vidrio
borosilicato o de sílice fundida y contienen la fase estacionaria sobre la pared
de la columna quedando la parte central vacía.Con las columnas capilares se
pueden obtener resoluciones semejantes a las columnas empacadas pero en
menor tiempo. Las fases estacionarias empleadas con mayor frecuencia,
debido a su universalidad, son las relativamente no polares de silicona, como
metilsilicona o 2-5 por ciento de fenilmetilsilicona. También, se ha propuesto
el uso de algunas fases moderadamente polares como 14 por ciento de
cianopropil metilsilicona.
2. El horno: en su interior se sitúa la columna, debe poseer una buena
regulación de temperatura. Para mejorar la separación el calentamiento del
hornose realiza de forma programada, pudiendo consistir en una única rampa
de temperatura o en dos y hasta cuatro rampas.
3. El detector: es un dispositivo que permite medir de una manera
continua una propiedad física del gas portador, que se modifica ampliamente con
la presencia de muy pequeñas concentraciones de la sustancia a analizar
(conductividad térmica, corriente de ionización, afinidad electrónica, etc.).
Genera una señal eléctrica proporcional al contenido de cada componente de
la muestra. Los más usados en Toxicología son el detector de ionización de
llama (FID), el detector de captura electrónica (ECD) y el detector de nitrógenofósforo (NPD). El NPD es específico y sensible para los compuestos que
45
contienen átomos de Nitrógeno (N) o Fosforo (P) en su molécula, como las
drogas de abuso y medicamentos, ya que la mayoría contiene átomos de N,
así como en el análisis de plaguicidas organofosforados y carbamatos que
contengan átomos de N y/o P. El ECD, es de gran utilidad para el análisis de
compuestos electronegativos con átomos de halógenos o grupos nitro o
carboxilo, como es el caso de los pesticidas organoclorados y piretroides, y el
FID es sensible a compuestos orgánicos que contengan uniones C-H en sus
moléculas, una de sus características es que pueden analizarse muestras
acuosas, ya que no detecta al agua.
4. Sistema electrónico de amplificación y medida de la señal eléctrica
enviada por el detector y registrador de la misma. Un cromatograma está
compuesto por unaserie de picos. Cada pico determina la presencia de por lo
menos una sustancia, y el área por debajo del mismo es proporcional a la
cantidad de dicha sustancia en la muestra inyectada. Para identificar una
sustancia se usa un parámetro llamado tiempo de retención (tr) que es
constante para cada sustancia en determinadas
condiciones, y se define como el tiempo transcurrido entre la inyección
de la muestra y el momento en que se detecta su mayor concentración
(ápice del pico). También puede usarse el tiempo de retención relativo,
que es el tiempo que tarda en eluir una sustancia de la columna, con
respecto al tiempo que tarda una sustancia “x” en el mismo sistema.
Este valor permite corregir posibles variaciones del (tr) durante el
desarrollo del programa cromatográfico. Existen parámetros más
exactos aún como los índices de Kovatz, que permiten estandarizar el
comportamiento de las sustancias en un determinado sistema.
cromatográfico.
Antes de la aplicación de la GC y de la GC/MS, se recurre
frecuentemente a la derivatización de los grupos funcionales polares. El
objeto de esta reacción es aumentar la volatilidad, aumentar la
estabilidad térmica o disminuir el límite de detección debido a la mejora
46
en la simetría del pico, además de eliminar las llamadas colas en los
cromatogramas. Se mejora considerablemente la separación de
sustancias conteniendo grupos funcionales tales como –COOH, -NH, NH2, -OH. Para que la derivatización sea exitosa, debe ser cuantitativa
y formarse un solo derivado en forma rápida y reproducible. Los
procedimientos más utilizados son la acilación, la metilación y la
sililación
Cromatografía Líquida de Alta Resolución (CLAR)
Como se mencionó anteriormente, en este sistema cromatográfico la
fase móvil es un líquido. Se puede utilizar para la separación de
cualquier compuesto orgánico ya que la técnica por CLAR no está
limitada por la volatilidad ni la estabilidad térmica del analito. Se aplica,
por ejemplo, para la separación, identificación y/o cuantificación de
productos farmacéuticos, extractos vegetales, proteínas, ácidos
nucléicos, polisacáridos, pigmentos, metabolitos animales o humanos,
etc. Los principales componentes de un cromatógrafo líquido son la fase
móvil contenida en un reservorio, la cual llega a la bomba que suministra
un flujo continuo y constante y alcanza la columna, pasando
previamente por la válvula de inyección. La FM atraviesa la columna
que finalmente llega al detector, luego de lo cual pasa por una válvula
que permite su colectado o bien su descarga. (Figura 7)
47
6COMPARACIÓN DE DIFERENTES MÉTODOS DE IDENTIFICACIÓN Y
CUANTIFICACIÓN DE COCAÍNA Y BENZOÍLECGONINA EN UNA
MUESTRADE HÍGADO POST-MORTEM
Los análisis toxicológicos de muestras post-mortem dan un panorama más
amplio de las posibles causas de muerte de un sujeto, por este motivo en el
trabajo realizado por Cingolani y col. se reportó la detección y cuantificación de
COC y su metabolito BZ en muestras de hígado conservadas en formaldehído
así como de las soluciones de formaldehido en las que se preservaron las
muestras. Se trabajócon cuatro muestras provenientes de consumidores de
COC las cuales se separaron en dos porciones en cada caso, una de las cuales
se analizó inmediatamente y la otra se preservó en solución de formaldehido
(10 por ciento a un pH=7) por cuatro semanas antes de su análisis, las
determinaciones se llevaron a cabo por cromatografía de gases acoplada a
espectrometría de masas.
Por otro lado, en el trabajo realizado por Buddha y col. 32 se reportaron las
determinaciones de COC y BZ en muestras de tejidos y fluidos provenientes
de fumadores de crack. Los análisis se realizaron mediante cromatografía de
gases acoplada a espectrometría de masas.
En estos dos estudios se determinó la presencia de COC y BZ mediante las
siguientes metodologías
. En el primer estudio los análisis toxicológicos se realizaron en muestras
pertenecientes de tejidos de hígado fijados en formol y soluciones de formalina
(10por ciento a un pH=7) en el que las muestras fueron preservadas. Estos
materialesbiológicos provenían de cuatro casos de muerte de consumidores de
cocaína, paracada caso, en el momento de la autopsia, se tomó una muestra de
hígado se separóen dos proporciones: la primera se analizó inmediatamente,
la segunda fue puestaen formol. Las muestras de tejido fueron conservadas
en soluciones de formalina durante cuatro semanas antes del análisis. El tejido
se peso antes y después de la fijación en formol, el cual no resultó ser
sensiblemente modificados por la preservación.
48
Los reactivos químicos son de grado analítico certificados individualmente
hidróxidode sodio (Merck, Darmstadt, Alemania), metanol (Carlo Erba, Milán,
Italia), ácido clorhídrico (Carlo Erba), hidróxido de amonio (Sigma, St. Louis,
MO), diclorometano (Baker, Phillipsburg, Nueva Jersey), alcohol isopropílico
(Sigma), Nmetil-N- trimetilsilil-trifluoroacetamida (MSTFA) (Sigma), cocaína
(Alltech, Los Alamos, CA),benzoilecgonina (Alltech), y escopolamina (Sigma).
El equipo utilizado para el análisis, incluye un homogeneizador (Ultra Turrax,
Ica Labor Technik, Milan, Italy), sonificador (modelo 1210, Bramson, Danbury,
CT), centrífuga (modelo 4218, ALC, Milán, Italia) y vortex mixer (Falc, Bergamo,
Italia), EFS 24, Varian, Bergon op Zoom, Países Bajos, baño de temperatura
(Carlo Erba baño termostático), y GC-MS (Instrumentos Fisons, Milán, Italia).
Preparación de las muestras Tejidos. Cinco gramos de tejidos frescos y cinco
gramos de tejidos fijados con formalina, los dos de fuentes de la autopsia,
fueron molidos por separado y homogeneizados en agua destilada (1:1) y se
sonificó durante 7-8 horas. 1 mL de ácido clorhídrico 0.1 M fue agregado a las
soluciones homogeneizadas, seguido por el ácido sulfosalicílico para
desproteinización. Las soluciones fueron centrifugadas, y el pH del
sobrenadante fue ajustado a pH=6, consulfato de amonio e hidróxido de sodio
(8 por ciento en agua). Se añadió 1 mL de solución de escopolamina (1 mg/L
en agua) como estándares internos (IS) y 2 mL de buffer de fosfatos 0.1 M
(pH=6), y las soluciones fueron centrifugadas antes de la siguiente fase de
extracción.
Cinco mililitros de solución de formalina se extrajeron de las muestras. Las
soluciones se evaporaron a sequedad a temperatura ambiente. Cinco mililitros
de agua destilada se añadieron al residuo. Se añadió 1 mL de la solución de
escopolamina (1 mg/L en agua), como IS y 2 mL de buffer de fosfatos 0.1 M
(pH= 6), y las soluciones fueron centrifugadas antes de la siguiente fase de la
extracción.
49
Extracción en fase
Las columnas fueron acondicionadas de forma secuencial con 2 mL de metanol
y 2mL de buffer de fosfato 0.1 M a pH=7.
Aplicación de la muestra: Las muestras fueron extraídas lentamente a través
de las columnas usando vacío (al menos por 2 minutos)
Lavado de columna: Las columnas se lavaron secuencialmente con 2 mL de
agua,3 mL de ácido clorhídrico 0.1 N y 2 mL de metanol y luego secadas
durante 5 minutos mediante vacío total.
La elución de cocaína. Los analitos se eluyeron dos veces con 1 mL de una
solución de diclorometano y alcohol isopropílico en proporción (8:2) con un 2
por ciento de hidróxido de amónio, elaborado todos los días; los eluidos fueron
transferidos a tubos silanizados graduados de 3 mL y se evaporó a sequedad
en un baño de agua a temperatura de 50ºC bajo una corriente lenta de
nitrógeno.
Derivatización Los extractos se reconstituyeron con 50 µL de MSTFA y se
incubaron durante 15 minutos a 75ºC en tubos de ensaye silanizados
Análisis CG-MS
Las condiciones siguientes fueron aplicadas: fue utilizada una columna capilar
recubierta (sílice fundida de 30 m x 0.32 mm), el gas portador fue helio a un
flujo mínimo de 1.5 mL/minuto. El programa de temperatura se inició a 100ºC y
el primerincremento fue de 40ºC/minuto hasta una temperatura de 180ºC, el
segundo incremento fue de 10ºC/min hasta 310ºC. El volumen de inyección fue
de 1µL (modosplitless). Para el espectrómetro de masas se utilizó el método de
impacto eléctricoa 70 eV. Los espectros de masas fueron registrados en un
rango de 70-500 m/z.
El diagrama de flujo para esta metodología se muestra en la (Figura 12).
50
En el segundo estudio revisado, los análisis que se realizaron fueron en
muestras de 15 casos de muerte de fumadores de crack. Las muestras
provenían de la división Toxicológica Forense de las Fuerzas Armadas. Las
muestras se analizaronpreviamente por inmunoensayo de las que se informo
dieron positivo para la COC y BZ.
Los productos químicos, reactivos y suministros que fueron utilizados son:
Ndesmetil-N-[2H3]
metilcocaina
(d3-COC),
BZ,
N-desmetil-
N-[2H3]
metilbenzoilecgonina (d3-BZ), N-desmetil-N-[2H3] metilecgonina (d3-CE),
ecgonina, MED (Ester metílico de la anhidroecgonina) y ED (anhidroecgonina)
los cuales fueron adquiridos de Radian International. COC (base libre) la cual
se adquirio de Sigma Chemical, y dimetilformamida (DMF), dimetilformamida
dipropil acetal (DMF-DPA), y dimetilformamida dimetilacetal, se adquirieron de
Aldrich Chemical. Para la EFS, se emplearon columnas que contienen una
base de sílice C8 y SO3H (ácido sulfónico) 200 mg y un vaso de extracción de
la cámara fueron adquiridos de Tecnologías Químicas. Reactivación viales, bis
(trimetilsilil)
trifluoroacetamida
(BSTFA),
trifluoroacetamida
(MTBSTFA)
y
que
N-metil-N-(terc-butildimetilsilil)
contiene
1
por
ciento
51
tertbutildimetilclorosilano (TBDMCS) fueron adquiridos de Pierce. Todos los
disolventes y los reactivos fueron de análisis o gradoCLAR. La acetona se secó
sobre tamices moleculares (3Å, 8.12 de malla) por lo menos 24 horas.
Los instrumentos que fueron empleados son: CG-MS de marca HewlettPackard enel que el sistema consistía en un cromatógrafo de gases HP 5890
Serie II Plus y un espectrómetro de masas modelo 5972 cuadrupolo de
detección selectiva. Una impresora HP 18593B, inyector automático el cual se
utiliza para inyectar las muestras en el CG-MS
Preparación de muestras para la determinación de COC, BZ y MED
El hígado. Para cada muestra y control un 1 g de tejido (tejido negativo para
el control) se pesó en tubos de plástico de fondo plano y se almacenaron
congelados.Los controles fueron preparados en concentraciones de 100, 50 y
20 ng/g de tejidomediante la adición de COC (100 µL de 1.0, 0.5 y 0.2 mg/L),
BZ (100 µL de 1.0, 0.5y 0.2 mg/L), MED (100 µL de 1.0, 0.5 y 0.2 mg/L) en tres
tubos vacíos de vidrio. Losestándares internos (100 µL de 0.5 mg/L d3-COC,
100 µL de 0.5 mg/L d3-BZ, de 50µL de 0.68 mg/L d3-MED, y 100 µL de 0.5 mg/L
d3-ED) se añadieron a los tubos decontrol y tubos de centrifugación que se
utilizaron posteriormente para el análisis demuestras, NaF (200 mL, 10 g/L) se
añadió a los tejidos de los tubos de plástico. Lostejidos fueron descongelados,
y homogeneizados con 1 mL de tampón fosfato 0.1 mol/L (pH=6.0), y se
vertieron en los tubos de vidrio correspondiente que contienenla droga y los
estándares internos de control y los estándares internos sólo para lasmuestras.
Dos mililitros de tampón de fosfatos 0.1 mol/L (pH=6.0), se añadió a el tejido
residual y se homogeneízo de nuevo. El homogeneizado resultante se mezclo
con el homogeneizado inicial.
Después de la homogeneización, los tubos se taparon y se colocaron en un
baño de hielo. El homogeneizado se coloca en un agitador mecánico por 10 a
15segundos y se centrifuga durante 60 minutos a 3834-g (ó Fuerza Centrifuga
Relativa) a 7-10°C. Un conjunto de CEFS fueron colocadas en la cámara
de extracción y acondicionadas con 3 mL cada uno de metanol, agua, y 0.1
52
mol/L de tampón fosfato (pH=6.0), en secuencia, empleando presión reducida
. Un conjunto de tubos de centrífuga de vidrio fueron colocados en la cámara
para recoger la fracción de elución siguiente. Los sobrenadantes de las
muestras homogenizadas de tejido fueron vertidos sobre las columnas y se
deja eluir por gravedad o mediante presión reducida. En la EFS las columnas
se lavaron con 2 mL de agua destilada, 3 mL de ácido clorhídrico 0.1 mol/L y 3
mL de isopropanol, yluego se secaron durante 5 minutos a presión reducida.
El MED, COC y BZ se eluyeron con 3 mL de una mezcla (9:1:0.2 en volumen)
de diclorometano- metanolNH3 acuoso (14.8 mol/L).
Las soluciones se evaporaron a sequedad bajo corriente de nitrógeno a
temperatura ambiente para minimizar la pérdida de MED. Los extractos se
disolvieron en 50 µL de acetona seca, se transfirieron en viales al muestreador
automático, y se realizaron las pruebas del MED y COC por separados
mediante CG-MS. Después de que las pruebas de MED y de COC se realizaron,
las muestrasfueron analizadas para BZ como el derivado de propilo, utilizando
otroprocedimiento de CG-MS
Derivatización
Después del análisis de COC y MED de la solución de acetona, se añadió
DMFDPA (20 µL) a los viales. Los contenidos se mezclaron y los viales se
vuelven a tapar. Elanálisis se realizó para propil-BZ.
Análisis CG-MS
Las muestras fueron introducidas en volúmenes de 1 a 4 µL en el auto inyector.
El análisis CG se realizó con una columna DB-5MS columna capilar [5:95
fenilmetilsiloxano; 15 m X 0.25 mm (i.d.); Científico J & W] o una ZB-5 [5 por
cientode fenil polisiloxano; 15 m X 0.25 mm (i.d.); Phenomenex] a 10 psi con
flujo de helioa 78 presión constante. El detector de masas fue operado en el
modo de ionizaciónde electrones a 70 eV, con una temperatura de la fuente de
200-250°C. El voltaje del multiplicador de electrones del detector se fijó en 200700 V por encima de autoajuste, y el tiempo detección del monitor de iones fue
53
de 50 ms.
CG-MS para el MED. El análisis se realizó en inyector y temperaturas lineales
de transferencia de 140 y 280°C, respectivamente. La temperatura del horno
se inició a 90°C (que tuvo lugar durante 1 minuto) y aumentó de 20°C/minuto
hasta llegar a 140°C esta última temperatura tuvo una duración de 2 minutos.
El CG se inició en modo splitless, se purga el puerto del inyector y se enciende
después de 0.3 minutos. El control de iones fue de 181, 166 y 152 m/z para
MED y 184 y 155 m/z para el d3-MED. Se utilizaron para cuantificación los
Iones 152 y 155 m/z. Porque COC, BZ, y MED se extrajeron juntas, las
temperaturas del inyector se mantuvieron ≤ 140°C para evitar la posible
formación de MED de cualquier COC presentes en la muestra. Después de
cada inyección, 2-3 µL de acetona se inyecto como un blancode disolvente.
CG-MS para la COC. El análisis se realizó en inyector y temperaturas lineales
de transferencia de 280 y 270°C, respectivamente. La temperatura del horno
se inició a 170°C (que tuvo lugar durante 0.5 minutos) y aumentó a 270°C a
30°C/minuto (realizado por 2.7 minutos). El CG se inició en modo splitless, se
purgo el puerto delinyector y se encendió después de 0.3 minutos. Los iones
fueron monitoreados a 303, 272, y 182 m/z para COC y 306 y 185 m/z de la
d3-COC. Se utilizaron para cuantificación los Iones 303 y 306 m/z. Después de
cada inyección, 3 µL de acetonase inyectaron como un blanco de disolvente.
CG-MS para propilo BZ. El análisis se realizó en el inyector y la temperatura de
transferencia de la línea de 280 y 270°C, respectivamente. La temperatura del
hornose inició a 170°C (que tuvo lugar durante 0.5 minutos) y aumentó de 30
°C/min hastallegar a 270°C teniendo una duración de 2.7 minutos. El CG se
inició en el modo splitless, se purga el puerto del inyector y se enciende
después de 0.3 min. Los iones fueron monitoreados 331, 272, y 210 m/z para
BZ y 334 y 213 m/z de d3-BZ.Se utilizaron para la cuantificación los Iones 331
y 334 m/z. Después de cada inyección, 3µL de MTBSTFA que contiene 1 por
ciento de TBDMCS fue administrada como un blanco de disolvente.
El diagrama de flujo para esta metodología se muestra en la (Figura 13)
54
En las dos metodologías presentadas anteriormente se observan grandes
diferencias tanto en disolventes empleados así como en la derivatización, los
rendimientos de la determinación de COC y BZ son presentados por separado
paracada metodología. Los resultados obtenidos por los métodos utilizados se
presentan, comparando cada uno de los rendimientos obtenidos al determinar
COC y BZ.
55
Capitulo IV.
Resultados
56
5.1.1 Resultados
En el primer estudio el análisis principalmente detecta y cuantifica
benzoilecgoninaen todos los materiales estudiados. La cocaína fue detectada
sólo en un caso en tejido fresco, pero nunca en tejidos fijados en formalina o
en soluciones de formaldehído. La cocaína y benzoilecgonina fueron
identificados al comparar los tiempos de retención con el del patrón interno que
es escopolamina y el espectro de masas de cocaína y benzoilecgonina
estándar (cocaína, 182, 82, 303, y 272 m/z;benzoilecgonina-TMS 82, 240, 361,
y 346 m/z).
La cuantificación se llevó a cabo mediante el control de la abundancia relativa
del ion 182 m/z (de cocaína), 82 m/z (iones de benzoilecgonina-TMS), y 138
m/z (los iones de la escopolamina-TMS, IS). Los resultados de la cuantificación
para las muestras de hígado fijados con formalina y para las soluciones de
formalina en lasque estos tejidos fueron conservados se enumeran en la (Tabla
4).
Tabla 4. CUANTIFICACIÓN DE COC Y BZ EN TEJIDOS DE HÍGADO
ALMOMENTO DE LA AUTOPSIA, TEJIDOS DE HÍGADO FIJADOS Y
SOLUCIONES DE FORMALINA DE LOS TEJIDOS FIJADOS.
Los valores cuantitativos de cocaína y benzoilecgonina obtenido en los tejidos
fijados y desde los mismos tejidos en el momento de la autopsia eran muy
diferentes, debido a que los umbrales de detección son redistribuidos a partir
de tejidos en la solución de formalina. En muchos casos, las concentraciones
de benzoilecgonina en las soluciones de formol en la que el hígado fue
57
conservado
Las mejores tasas de recuperación fueron encontradas en soluciones de
formalina resultando en un 84.47 por ciento. La suma total de las tasas de
recuperación en soluciones de formalina y tejidos fijados 12.31 por ciento, nos
da un total del 96.78 por ciento, siendo este comparable con el porcentaje
obtenido al cálculo de la eficiencia del método el cual fue del 97.78 por ciento,
e indica que la cocaína y benzoilecgonina tienen una buena estabilidad. Este
valor puede ser útil en la evaluación cuantitativa de los casos.
Tabla 5. NIVELES MEDIOS CUANTITATIVOS PARA LA BZ (CANTIDADES)
Y LATASA DE RECUPERACIÓN DESPUÉS DE CUATRO SEMANAS
Los espectros obtenidos mediante este estudio son los que a continuación se
muestran, utilizando las condiciones de impacto eléctrico de 70 eV. Los
espectros de masas fueron registrados en un rango de 70-500. (Figura 14)
58
El espectro obtenido en este estudio es comparable con el reportado en la
literatura33 (Figura 15
Los resultados obtenidos en el segundo estudio donde se determinó la
presencia de COC y BZ también se identifico la presencia de MED como
metabolito representativo de la vía de administración de COC, en muestras de
tejido hepático.
Dado que MED es un producto pirolítico de COC. Condiciones adecuadas de
análisis por CG-MS son necesarias para evitar la producción de MED como
derivadode COC.
Más del 90 por ciento de COC, BZ, y MED fueron retenidos en las columnas
empleadas.
Para eluir MED, COC, y BZ se empleó, diclorometano-metanol-amoniaco en
proporción de 9:1:0.2 en volumen, esta mezcla se prefirió utilizar sobre la
generalmente empleada diclorobutano-isopropanol-amoniaco, dado que la
MED esvolátil y se pierde fácilmente durante la evaporación de isopropanol.
La MED se analizó en el extracto de COC y BZ por separado en un CG a una
temperatura ≤140°C. Se evitaron temperaturas más altas para minimizar la
formación de derivados de MED. Para garantizar que los derivados no se
formaran
59
durante el análisis, un control que contiene COC, BZ y MED en 1, 5 y 5 mg/L,
respectivamente, fue probado. No se detectó MED en virtud de la extracción y
el análisis GC-MS descrito. Se inyectó COC por separado antes de la
derivatización de BZ porque los agentes de alquilación contienen una pequeña
cantidad de agente de metilación como impureza. En el experimento, DMFDPA, DMFdiisopropilamida,o DMF-dietilamida con sólo BZ produjo una
pequeña cantidad de COC como subproducto (＜1 por ciento). Aunque MED
y COC fueron inyectados bajo dos condiciones diferentes (temperaturas de
inyección 140 y 280°C, respectivamente),las muestras podrían ser analizadas
en lotes de inyección mediante el uso de un autoinyector con dos ajustes de
CG-MS.
Las concentraciones obtenidas de COC, BZ y MED en las muestras de Hígado
semuestran en la (Tabla 6). Se observa que en las 15 muestras analizadas se
determinó cualitativamente y cuantitativamente la presencia de BZ, de éstas
en un80 por ciento, de las muestras se detectó COC y un 33 por ciento de MED.
60
Capitulo v .
Conclusiones
61
Conclusiones
De los trabajos revisados se puede concluir que el hígado es una buena matriz
biológica de análisis para la determinación del metabolito de COC. Dado que se
puede observar que en la determinación de BZ se obtienen muy buenos
resultados a su cuantificación en soluciones de formalina en las que las muestras
de hígado se conservaron siendo éste un porcentaje aproximado del 85 por ciento
de recuperación. La particularidad del segundo trabajo examinado, en el que
también se tuvieron muy buenos resultados a la cuantificación de BZ
observándose un 100 por ciento de determinación en el número de muestras
positivas a la cuantificación de este metabolito.
En cinco muestras se pudieron determinar MED el cual es un indicativo de la vía
de administración, dado a la reacción de pirolisis de COC, que nos indica que la
vía de administración fue fumada. Se puede tomar como base para la
determinación de BZ ambos estudios dado que en los dos se cumple el principal
objetivo, que es el determinar que el consumo de COC tuvo relación con el hecho
de un ilícito en base al análisis de muestras post-mortem de hígado.
62
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